DK175604B1 - Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid - Google Patents
Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid Download PDFInfo
- Publication number
- DK175604B1 DK175604B1 DK198700509A DK50987A DK175604B1 DK 175604 B1 DK175604 B1 DK 175604B1 DK 198700509 A DK198700509 A DK 198700509A DK 50987 A DK50987 A DK 50987A DK 175604 B1 DK175604 B1 DK 175604B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- polypeptide
- plasminogen activator
- amino acid
- plasmid
- terminal
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
i DK 175604 B1
OPFINDELSENS BAGGRUND
1. Opfindelsens område 5 Den foreliggende opfindelse angår hybride.plasminogenaktivatorlignende poly-peptider og en fremgangsmåde til fremstilling deraf under anvendelse af genetisk manipulation. De hybride plasminogenaktivatorlignende polypeptider ifølge opfindelsen kan anvendes til forebyggelse og behandling af forskellige typer cardiovas-culære lidelser eller sygdomme.
10 2. Beskrivelse af beslægtet teknik
Plasminogenaktivatoren hydrolyserer på begrænset måde det inaktive enzym plasminogen, som findes i plasma, for at omdanne det til det aktive enzym plas-15 min. Plasminet kan hydrolysere fibrinkoageler, der genereres i et blodkar, og fører til lyse af en thrombus, dvs. fibrinolyse. Da plasminet hurtigt inaktiveres in vivo af en plasmininhibitor, som findes i plasma, anvendes en plasminogenaktivator klinisk som thrombolytisk middel.
20 Som plasminogenaktivator anvendes for tiden klinisk urokinase isoleret fra human urin. Urokinase har imidlertid den ulempe, at når den administreres i stor mængde, kan den medføre systemisk hæmorhagi. Den systemiske hæmorhagi afhænger af forholdet mellem plasminogenaktivatorens fibrinogennedbrydende aktivitet og fibrinnedbrydende aktivitet. Den systemiske hæmorhagi afhænger med andre ord 25 af plasminogenaktivatorens affinitet over for fibrin. Der er derfor gjort forsøg på at fremstille urokinase med affinitet over for fibrin.
På den anden side har vævsplasminogenaktivator en høj affinitet over for fibrin og er derfor blevet overvejet som erstatning for urokinase. Imidlertid har vævsplas-30 minogenaktivatoren en enzymaktivitet, der er lavere end urokinasens enzymaktivitet, og den er mindre stabil i blodet.
Der er derfor behov for en ny type plasminogenaktivator med en tilfredsstillende affinitet over for fibrin og en tilstrækkelig enzymaktivitet samt en tilfredsstillende 35 stabilitet in vivo.
--— ——
I DK 175604 B1 I
I I
KORT BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN I
Den foreliggende opfindelse angår således hybride plasminogenaktivatorlignende I
5 polypeptider, som omfatter et polypeptidområde, som er ansvarligt for affinitet I
over for fibrin, og som stammer fra vævsplasminogenaktivator, og et polypeptid- I
område, som er ansvarligt for enzymaktivitet, og som stammer fra prourokinase. - I
Den foreliggende opfindelse angår også et gensystem, som anvendes til fremstil- I
10 ling af det ovennævnte polypeptid, herunder DNA-segmenter, der koder for poly- I
peptidet, plasmider, som indeholder DNA-segmentet, og mikroorganismer, der er I
transformeret fned plasmidet. I
Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af det hybride 15 plasminogenaktivatorlignende polypeptid, ved hvilken den ovennævnte mikro-
I organisme dyrkes, og polypeptidet isoleres fra det dyrkede produkt. I
KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGEN
I 20 Fig. 1-1 til 1-5 viser en nucleotidsekvens af en cDNA-indsætning, som koder for I human vævs-plasminogenaktivator i plasmidet pDPA3, og en tilsvarende amino- syresekvens i en åben læseramme, som er indeholdt i cDNA-indsætningen. 1 I aminosyresekvensen betegner den del af sekvensen, som er vist med små bog- staver, en indledningssekvens, og den del af sekvensen, som er vist med store 25 bogstaver, betegner vævsplasminogenaktivatorens aminosyresekvens.
Fig. 2-1 til 2-5 viser nudeotidsekvensen af en cDNA-indsætning, der koder for human prourokinase i plasmidet pKU22, og den tilsvarende aminosyresekvens i den åbne læseramme, som er indeholdt i cDNA-indsætningen. I aminosyre-30 sekvensen betegner den del af sekvensen, der er vist med små bogstaver, en indledningssekvens, og den del af sekvensen, der er vist med store bogstaver, betegner aminosyresekvensen af human prourokinase.
Fig. 3 viser skematisk udførelsesformer for det hybride polypeptid ifølge opfindel-35 sen.
DK 175604 B1 I
Fig. 4 er et flowdiagram, der viser konstruktionen af plasmider, som indeholder et
gen, der koder for human prourokinase. I
5 Fig. 5 er et flowdiagram, der viser konstruktionen af plasmider, som indeholder et I
gen, der koder for et hybridt polypeptid ifølge opfindelsen. I
Fig. 6 viser konstruktionen af plasmidet pKYU22 ud fra plasmiderne pPE3 og I
pKYU21. I
Fig. 7 viser plasmidet pPE3's restriktionsendonucleasekort. I
Fig. 8 viser konstruktionen af plasmidet pKMUl ud fra plasmidet pKYU22 og et I
syntetisk oligodeoxyribonucleotid. I
Fig. 9 viser konstruktionen af plasmidet pMUT4L. I
I Fig. 10 viser konstruktionen af enkeltstrenget fag DNA, som indeholder en 1200 I
I bp-indsætning fra plasmidet pKYU22 og fag M13mp8 RF DNA. I
I 20 I Fig. 11 viser en fremgangsmåde til indføring af en punktmutation under anvendel- I se af en primer.
I Fig. 12 viser konstruktionen af plasmidet pMUT4Lpm3 ud fra mutant fag M13 dob- I 25 beltstrenget DNA (pm3) og plasmidet pMUT4L.
I Fig. 13 viser konstruktionen af plasmidet pDPAT2 ud fra plasmiderne pYTU3, I pDPA3 og pK12.
I 30 Fig. 14 viser konstruktionen af plasmidet pHAOO ud fra plasmiderne pDPAT2 og I pMUT4L (der også betegnes pPE3p), og konstruktionen af plasmidet pHA03 ud fra I plasmiderne pDPAT2 og pMUT4Lpm3 (der også betegnes pPE3pm3).
I DK 175604 B1
I I
Fig. 15 viser konstruktionen af plasmidet pHA20 ud fra plasmiderne pDPAT2 og I
B pHAOO og konstruktionen af plasmidet pHA23 ud fra plasmiderne pDPAT2 og I
I pHA03. I
I 5 Fig. 16 viser konstruktionen af plasmidet pHA13 ud fra plasmidet pHA23. I
I Fig. 17 viser et resultat af elektroforese, hvor et ekspressionsprodukt fra Esche- I
I richia coli JMl03/pHA03 (bane 2) sammenlignes med et ekspressionsprodukt fra E. I
I coli JM103/pPE3 (pMUT4L), der danner nativ human prourokinase (UK) (bane 1), I
I 10 og et ekspressionsprodukt fra E. coli JM103/pDPAT2, der danner nativ humant I
I vævsplasminogenaktivator (t-PA) (bane 3). I denne figur viser A en komposition I
af proteiner farvet med Coomassie Blue; B viser produkter, der er reaktive med et I
anti-urokinaseantistof fremkaldt ved en enzymfarvningsmetode; og C viser produk- I
I ter, der er reaktive med et anti-vævsplasminogenaktivatorantistof fremkaldt ved I
15 en enzymfarvningsmetode. I
Fig. 18-1 til 18-4 viser elueringsprofiler fra affinitetschromatografi, der viser for- I
skellige typer plasminogenaktivatorers fibrinaffinitet. I
B 20 Rg. 19 viser konstruktionen af plasmidet pMUT9Lpml ud fra plasmiderne pMUT4L I
og pMUT4pml. I
B Fig. 20 viser konstruktionen af plasmidet pHA21L ud fra plasmiderne pHA20 og I
I pMUT9Lpml og plasmidet pHA24L ud fra plasmiderne pHA20 og pMUT4Lpm4. I
I 25 I
I Fig. 21 viser konstruktionen af plasmidet pHAHL ud fra plasmiderne pHA21L og I
I pMUT9Lpml. I
I Fig. 22 viser konstruktionen af plasmidet pHAOlL ud fra plasmidet pHA21L I
I 30 I
I Fig. 23 viser SDS polyacrylamidgelelektroforese af en uopløselig fraktion (bane 2) I
I og supernatant (bane 1) af et ekspressionsprodukt fra plasmidet pHA24L. I
I 35 5 DK 175604 B1 BESKRIVELSE AF DEN FORETRUKNE UDFØRELSESFORM A. Hybridt Dlasminooenaktivatorlianende polvpeptid 5 Det hybride plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge opfindelsen omfatter en polypeptidregion, som er ansvarlig for fibrinaffinitet, og som stammer fra vævs-plasminogenaktivator, og et polypeptidområde, som er ansvarligt for enzymaktivitet, og som stammer fra prourokinase.
10 Vævsplasminogenaktivatoren er et protein, som omfatter et polypeptid på ca.
500 aminosyrer, og som ved sin N-terminale halvdel indbefatter et polypeptidområde, som er ansvarligt for fibrinaffiniteten. Det hybride plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge opfindelsen omfatter som sin N-terminale del et polypeptidområde, som er ansvarligt for fibrinaffiniteten. Denne del af det her om* 15 handlede polypeptid stammer fra et nativt vævsplasminogenaktivatorpolypeptid.
Dette betyder, at denne del af det her omhandlede polypeptid kan være et helt polypeptid af den native vævsplasminogenaktivator eller en del deraf, som er ansvarlig for dens fibrinaffinitet, eller en modifikation deraf. Denne modifikation udføres ved tilføjelse af én eller flere aminosyrer til den native form eller sletning af 20 én eller flere aminosyrer fra den native form eller erstatning af én eller flere aminosyrer i den native form, idet den native forms fibrinaffinitet i det væsentlige bibeholdes. Når der anvendes en del af det native vævsplasminogenaktivatorpoly-peptid som det område, som er ansvarligt for fibrinaffiniteten, kan denne dels længde variere mellem vide rammer i det omfang, at fibrinaffiniteten bibeholdes.
25
Fx har nærværende opfindere fremstillet hybride polypeptider, der som den N-terminale halvdel indeholder ca. to kringler, der består af en aminosyresekvens fra den N-terminale første serin til den 219. glycin i humant vævsplasminogenaktivator beregnet ud fra den N-terminale serin som vist i fig. 1-1 til 1-3; ca. 1 30 kringle bestående af en aminosyresekvens fra den 128. serin til den 219. glycin beregnet ud fra den N-terminale serin som den første aminosyre som vist i fig. 1-2 til 1-3; eller ca. halvdelen af en kringle bestående af en aminosyresekvens fra den 161. methionin til den 219. glycin beregnet ud fra den N-terminale serin som den første aminosyre som vist i fig. 1-2 til 1-3. Disse polypeptider blev derefter testet 35 for deres fibrinaffinitet, og det blev bekræftet, at alle disse polypeptider har fibrin-
I DK 175604 B1 I
I I
affinitet. Derfor kan det her omhandlede hybride polypeptids fibrinaffinitetsomri-de I
være et hvilket" som helst polypeptidområde fra vævsplasminogenaktivatoren, der I
I indeholder et område, som er ansvarligt for fibrinaffiniteten. Fig. 1-1 til 1-5 viser I
I en nudeotidsekvens, der koder for humant vævsplasminogenaktivator, og en til- I
I 5 svarende aminosyresekvens, der anvendes som fibrinaffinitetsområdet i det her I
I omhandlede hybride polypeptid, hvor den første serin, den 128. serin, den 161. I
I methionin og den 219. glydn er vist med pile. I
Prourokinase er et protein, som omfatter et polypeptid bestående af 411 aminosy- I
10 rer fra den N-terminale serin til den C-terminale leudn, og som i sin C-terminale I
halvdel omfatter et polypeptidområde, som er ansvarligt for enzymaktivitet. De I
hybride plasminogenaktivatorlignende polypeptider ifølge opfindelsen omfatter som I
deres C-terminale halvdel et polypeptidområde, som er ansvarligt for enzymaktivi- I
tet. Denne del af det her omhandlede polypeptid stammer fra et prourokinasepoly- I
15 peptid. Dvs. denne del af det her omhandlede polypeptid kan være hele polypep- I
tidet for den native prourokinase eller en del deraf, som er ansvarlig for dens en- I
I zymaktivitet, eller en modifikation deraf. Denne modifikation udføres ved tilføjelse I
af én eller flere aminosyrer til den native form, eller sletning af én eller flere ami- I
I nosyrer fra den native form eller erstatning af én eller flere aminosyrer i den native I
20 form, idet enzymaktiviteten i det væsentlige bibeholdes. Nar en del af prouroki- I
nasepolypeptidet anvendes som det område, som er ansvarligt for enzymaktivi- I
I teten, kan denne dels længde variere inden for vide grænser forudsat, at enzymak- I
tiviteten bibeholdes. I
I 25 Fx har nærværende opfindere under hensyntagen til, hvad der er bekvemt for gen- I manipulation, fremstillet hybride polypeptider, der som den C-terminafe halvdel indeholderen aminosyresekvens fra den 150. glutamin til den C-terminale 411.
leucin beregnet ud fra den N-terminale serin som den første aminosyre som vist i I fig. 2-2 til 2-4, eller en aminosyresekvens fra den 132. alanin til den C-terminale I 30 411. leucin beregnet ud fra den N-terminale serin som den første aminosyre som I vist i fig. 2-2 til 2-4. Disse hybride polypeptider blev derefter testet for enzymak- I tivitet, og det blev bekræftet, at disse polypeptider har enzymaktivitet.
I Prourokinase, som er en inaktiv form, aktiveres ved spaltning af polypeptidet mel- I 35 lem det 158. lysin og det 159. isoleucin til dannelse af aktiv urokinase, og den ak-
DK 175604 B1 I
tive urokinase nedbrydes temmelig hurtigt. Det forventes derfor, at et hybridt plas- I
minogenaktivatorlignende polypeptid, der er vanskeligt at spalte i den ovennævnte I
stilling, bevares in vivo. Nærværende opfindere fremstillede et hybridt plasmi- I
nogenlignende polypeptid, hvor det 157. phenylalanin, der er vist i fig. 2-2, ud- I
5 skiftes med en sur aminosyre såsom asparaginsyre eller glutaminsyre, og det blev I
bekræftet, at sådanne polypeptider har forøget modstandsdygtighed mod proteaser I
såsom plasmin, thrombin og trypsin. I en foretrukken udførelsesform for polypep- I
I tidet ifølge opfindelsen er det 157. phenylalanin derfor udskiftet med en sur amino- I
I syre såsom asparaginsyre eller glutaminsyre. Fig. 2-1 til 2-5 viser en nucleotid- I
I 10 sekvens, der koder for human prourokinase, og en tilsvarende aminosyresekvens, I
I der er anvendt i enzymaktivitetsområdet af det her omhandlede hybride polypep- I
I tid, hvor det 132. alanin, 150. glutamin og 157. phenylalanin er vist med pile. I
I 1 en foretrukken udførelsesform omfatter det hybride plasminogenaktivatorlignende I
I 15 polypeptid ifølge opfindelsen derfor et N-terminalt område svarende til et N-termi- I
I nalt område fra humant vævsplasminogenaktivator indeholdende et polypeptidom- I
I råde, der er ansvarligt for dets fibrinaffinitet, og et C-terminalt område svarende til I
I det C-terminale område af human prourokinase indeholdende et polypeptidområde, I
I som er ansvarligt for dets enzymaktivitet, hvor det 157. phenyl-alanin vist i fig. 2-2 I
I 20 eventuelt er erstattet med asparaginsyre eller glutaminsyre. I prourokinasen er I
I peptidbindingen mellem det 135. lysin og 136. lysin følsom over for trypsintypepro- I
teaser såsom plasmin. For at forhindre spaltning af peptidbindingen er den 135.
aminosyre lysin derfor i en foretrukken udførelsesform for opfindelsen erstattet M med en aminosyre, som ikke er en basisk aminosyre. Som aminosyre, der ikke er I 25 en basisk aminosyre, kan der anvendes en hvilken som helst neutral aminosyre I eller sur aminosyre, som ikke negativt påvirker det ønskede polypeptids fysiolo- I giske egenskaber, fx alanin, asparagin, asparaginsyre, glutamin, glutaminsyre, H phenylalanin, glycin, isoleucin, leucin, methionin, serin, threonin, valin, tryptophan, ty rosin og prolin. Udførelsesformer for de her omhandlede hybride polypeptider er I 30 vist i fig. 3.
B. Gensvstemer I Den foreliggende opfindelse angår også gensystemer til fremstilling af det oven- I 35 nævnte hybride plasminogenaktivatorlignende polypeptid, herunder gensegmen- I DK 175604 B1 ter, der koder for de hybride polypeptider, plasmider, som indeholder sådanne gensegmenter, og mikroorganismer transformeret med sådanne plasmider.
Gen, som koder for det hybride polypeptid
Det gen, der koder for det ovennævnte hybride plasminogenaktivatorlignende poly- peptid, består af kodoneter, som kan udtrykkes i en værtsmikroorganisme, der er valgt til genekspression, såsom E coli. For bekvemt at kunne konstruere genet fremstilles det fortrinsvis ved at binde en relevant del af cDNA, der stammer fra 10 mRNA, som koder for human vævsplasminogenaktivator, til en relevant del af cDNA, som stammer fra mRNA, der koder for human prourokinase. Fig. 1-1 til 1-5 viser cDNA, der koder for human vævsplasminogenaktivator, sammen med den tilsvarende aminosyresekvens; og fig. 2-1 til 2-5 viser cDNA, der koder for human prourokinase, sammen med den tilsvarende aminosyresekvens.
I 15
Plasmid
Selv om plasmider, der fungerer i gær eller dyreceller, kan anvendes til ekspres- I sion af det hybride plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge opfindelsen, I 20 foretrækkes anvendelsen af et plasmid, der ud over det nævnte kodende område I indeholder et ekspressionskontrolområde, som er nødvendigt til ekspression af I generne i mikroorganismer, især E. coli, og det område, som er nødvendigt for I replikation i E coli. Som ekspressionskontrolområde kan der vilkårligt anvendes et hvilket som helst system, som er anvendeligt til ekspression af det fremmede gen i 25 E. coli. Fx anvendes der som promotor/-operatorsystemer tac, Pu, lacUV5, PR, og Ipp. Især foretrækkes tac-promotor/-operatoren, PL-promotor/-operatoren og trp-promotor/-operatoren. Som eksempel på SD-sekvenser kan anvendes SD-sekvensen fra metapyrocatekasegenet (C230SD) (reference 1) og lacSD.
30 Værtsmikrooroanisme
Selv om dyreceller og sådanne mikroorganismer som bakterier og gær kan anvendes som værter ti) indføring af disse plasmider, foretrækkes anvendelsen af bakterier, især E coli.
35
DK 175604 B1 I
Som vært E. coli ifølge opfindelsen kan der anvendes ikke-enterositiske ikke- I
toxiske E. coli-stammer såsom dem, der stammer fra E. coli K-12, fx DM83, DM103, I
DM105, RB791, SM32, N99, RR1, W3110 og χ1776. I
5 Konstruktion af oensvstemer I
Et eksempel på fremgangsmåden til konstruktion af de her omhandlede gener I
omfatter følgende trin:
10 1) Et gen, som koder for en vævsplasminogenaktivator, præpareres, og der fås et I
DNA-fragment, som koder for et polypeptidområde med affinitet over for fibrin, I 2) et gen, der koder for prourokinase, præpareres, og der fås et DNA-fragment, I som koder for et polypeptidområde med enzymaktivitet, og I 15 I 3) de i trin 1) og 2) vundne DNA-fragmenter sammenføjes i et hensigtsmæssigt I plasmid, hvorved der konstrueres et gen, som koder for det hybride plasminogen- I aktivatorlignende polypeptid.
I 20 1 tilfælde, hvor det 157. phenylalanin er erstattet med en sur aminosyre såsom I asparaginsyre eller glutaminsyre, omdannes i trin 2) et kodon, der koder for det I 157. phenylalanin, til et kodon, som koder for asparaginsyre eller glutaminsyre.
I Som kilde til et DNA-område, der koder for et polypeptidområde med enzymakti- I 25 vitet, konstrueres plasmidet pMUT4L (der også betegnes pPE3), som indeholder et I gen, der koder for en nativ human prourokinase, og plasmidet pMUT4Lpm3 (der I også betegnes pPE3pm3), som indeholder et gen, der koder for et stabiliseret I humant prourokinaselignende polypeptid, hvor den 157. aminosyre er en sur I aminosyre, i henhold til det i fig. 4 viste flowdiagram. Detaljerede konstruktions- I 30 processer for disse plasmider er beskrevet i sammenligningseksempel 4-15.
I Som kilde til DNA-område, der koder for et polypeptidområde med fibrinaffinitet, I konstrueres plasmidet pDPA3, der indeholder et gen, som koder for en humant I vævsplasminogenaktivator i henhold til processer, som er detaljeret beskrevet i I 35 sammenligningseksempel 1-3.
I DK 175604 B1 I 10
Plasmider, der indeholder et gen, som koder for det hybride plasminogenaktiva- torlignende polypeptid ifølge opfindelsen, kan konstrueres ud fra de ovennævnte I plasmider pDPA3, pMUT4L (pPE3) og pMUT4Lpm3 (pPE3pm3) og vektorplasmider- S ne pYTU3 og pK12.
Plasmidet pYTU3 indeholder PL-promotoren og C230 SD-sekvensen og blev kon- strueret som beskrevet i japansk offentliggørelsesskrift nr. 61-158787, og E. coli HB101/pYTU3 indeholdende plasmidet pYTU3 blev deponeret i Fermentation 10 Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1- chome, Yatabe-cho, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, Japan) (F.R.I.), den li. december 1984 som FERM P-7992. Plasmidet pK12 indeholder tac-promotor/-operatoren
og C230 SD-sekvensen og blev konstrueret som beskrevet i japansk offentlig- I
I gørelsesskrift nr. 61-158787, og E. coli JM102/pK12 indeholdende plasmidet pK12 15 blev deponeret i F.R.I. den 11. december 1984 som FERM P-7996.
Plasmidet pDPAT2 konstrueret i eksempel 1 indeholder et gen, der koder for moden I humant vævsplasminogenaktivator under kontrol af tac-promotor/-operatoren og C230 SD-sekvensen, og kan udtrykke den modne humane vævsplasminogenakti- I 20 vator eller anvendes som kilde til et genomrade, der koder for et polypeptid med fibrinaffinitet, til konstruktion af plasmider ifølge opfindelsen som beskrevet ne- I denfor. E. coli JM103/pDPAT2 indeholdende plasmidet pDPAT2 blev deponeret i I Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Gesellschaft flir Biotechnologische
Forschung mbH (DSM) i henhold til Budapest-traktaten den 28. december 1985 I 25 under deponeringsnummeret DSM 3629.
Plasmidet pHAOO konstrueret i eksempel 2 indeholder et gen, der koder for et I hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid (HAOO), der som sin N-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 161. methionin til den 219. glycin fra 30 en human vævsplasminogenaktivator beregnet fra den N-terminale serin som den første aminosyre og omfatter som sin C-terminale halvdel et polypeptidområde fra den 150. glutamin til den 411. C-terminale leucin i human prourokinase beregnet fra den N-terminale serin som den første aminosyre, under kontrol af tac-promo-toren og C230 SD-sekvensen, og kan udtrykke det ovennævnte hybride polypep-35 tid i E. coli. E. coli JMl03/pHA00 indeholdende plasmidet pHAOO blev deponeret i 11 DK 175604 B1 DSM i'henhold til Budapest-traktaten den 28. december 1985 under deponeringsnummeret DSM3628.
Plasmidet pHA03 konstrueret i eksempel 3 indeholder et gen, der koder for et 5 hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid, der som sin N-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 161. methionin til 219. glycin fra human vævsplasminogenaktivator beregnet fra den N-terminale serin som den første aminosyre, og som sin C-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 150. glutamin til den 411. N-terminale leucin fra human prourokinase beregnet fra 10 den N-terminale serin som den første aminosyre, idet den 157. phenylalanin er erstattet med asparaginsyre, under kontrol af tac-promotor/-operatoren og C230 SD-sekvensen, og som kan udtrykke det ovennævnte hybride polypeptid i E. coli. E. coli JM103/pHA03 indeholdende plasmidet pHA03 blev deponeret i DSM den 28. december 1985 i henhold til Budapest-traktaten under deponeringsnummeret 15 DSM3627.
Plasmidet pHA20 konstrueret i eksempel 4 indeholder et gen, der koder for et hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid (HA20), der som sin N-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den N-terminale serin som aminosyre 1 20 til den 219. glycin fra human vævsplasminogenaktivator, og der som sin C-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 150. glutamin til den 411. C-terminale leucin fra human prourokinase beregnet fra den N-terminale serin som den første aminosyre, under kontrol af tac-promotor/-operatoren og C230 SD-sekvensen, og som kan udtrykke det ovennævnte hybride polypeptid i E. coli. E.
25 coli JM103/pHA20 indeholdende plasmidet pHA20 blev i henhold til Budapest-traktaten deponeret den 28. december 1985 i DSM under deponeringsnummeret DSM3626.
Plasmidet pHA23 konstrueret i eksempel 5 indeholder et gen, der koder for et 30 hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid (HA23), der som sin N-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den N-terminale serin som aminosyre 1 til den 219. glycin fra human vævsplasminogenaktivator, og der som sin C-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 150. glutamin til den 411. C-terminale leucin fra human prourokinase beregnet fra den N-terminale serin som
I DK 175604 B1 I
I 12 I
I den første aminosyre, idet den 157. phenytalanin er erstattet med asparaginsyre, I
I under kontrol af tac-promotoren og C230 SD-sekvensen, og som kan udtrykke det I
I ovennævnte hybride polypeptid i £ coli. £ coli JM103/pHA23 indeholdende plas- I
I midet pHA23 blev i henhold til Budapest-traktaten deponeret den 28. december I
I 5 1985 i DSM under deponeringsnummeret DSM3625. I
I Plasmidet pHA13 konstrueret i eksempel 6 indeholder et gen, der koder for et I
I hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid, der som sin N-terminale halvdel I
I omfatter et polypeptidområde fra den 128. serin til den 219. glycin fra human I
I 10 vævsplasminogenaktivator beregnet fra den N-terminale serin som den første ami- I
I nosyre, og der som sin C-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den I
I 150. glutamin til den 411. C-terminale leucin fra human prourokinase beregnet fra I
den N-terminale serin som den første aminosyre, idet den 157. phenylalanin er er- I
I stattet med asparaginsyre, under kontrol af tac-promotor/-operatoren og C230 SD- I
I 15 sekvensen, og som kan udtrykke det ovennævnte hybride polypeptid. I
Plasmidet pHA21L konstrueret i eksempel 11 indeholder et gen, der koder for et I
I hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid (HPA21L), der som sin N-termi- I
I nåle halvdel omfatter et polypeptidområde fra den N-terminale serin som amino- I
20 syre 1 til den 215. cystein fra human vævsplasminogenaktivator beregnet fra den I
I N-terminale serin som den første aminosyre, og der som sin C-terminale halvdel I
I omfatter et polypeptidområde fra den 132. alanin til den 411. C-terminale leucin I
I fra human prourokinase beregnet fra den N-terminale serin som den første amino- I
I syre, idet den 135. lysin er erstattet med glutamin, under kontrol af tac-promotor/ I
I 25 -operatoren og C230 SD-sekvensen, og som kan udtrykke det ovennævnte hybride I
I polypeptid i £ coli. £ coli JM103/pHA21L indeholdende plasmidet pHA21L blev den I
I 6. januar 1987 deponeret i henhold til Budapest-traktaten i DSM under depone- I
I ringsnummeret DSM3951. I
I 30 Plasmidet pHA24L konstrueret i eksempel 12 indeholder et gen, der koder for et I
I hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid (HPA24L), der som sin N-termi- I
I nåle halvdel omfatter et polypeptidområde fra den N-terminale serin som amino- I
I syre 1 til den 215. cystein fra human vævsplasminogenaktivator, og der som sin C- I
I terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 132. alanin til den 411. I
13 DK 175604 B1 C-terminale leucin fra human prourokinase beregnet fra den N-terminale serin som den første aminosyre, under kontrol af tac-promotor/-operatoren og C230 SD-se-kvensen, idet den 135. lysin er erstattet med glutamin, og den 157. phenylalanin er erstattet med asparaginsyre, og kan udtrykke det ovennævnte hybride poly-5 peptid i E. coli. E. coli JM103/pHA24L indeholdende plasmidet pHA24L blev den 6. januar 1987 deponeret i henhold til Budapest-traktaten i DSM under deponeringsnummeret DSM3952.
Plasmidet pHAHL konstrueret i eksempel 13 indeholder et gen, der koder for et 10 hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid (HPA11L), der som sin N-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 128. serin til den 215. cystein fra human vævsplasminogenaktivator, og der som sin C-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 132. alanin til den 411. C-terminale leucin fra human prourokinase beregnet fra den N-terminale serin som den første aminosyre, 15 idet det 135. lysin er erstattet med glutamin, under kontrol af tac-promotoren og C230 SD-sekvensen, og kan udtrykke det ovennævnte hybride polypeptid i E. coli.
Plasmidet pHA14L konstrueret i eksempel 14 indeholder et gen, der koder for et hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid (HPA14L), der som sin N-termi-20 nåle halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 128. serin til den 215. cystein fra human vævsplasminogenaktivator beregnet fra den N-terminale serin som den første aminosyre, og der som sin C-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 132. alanin til den 411. C-terminale leucin fra human prourokinase beregnet fra den N-terminale serin som den første aminosyre, idet det 135. lysin er er-25 stattet med glutamin, og det 157. phenylalanin er erstattet med asparaginsyre, under kontrol af tac-promotor/-operatoren og C230 SD-sekvensen, og kan udtrykke det ovennævnte hybride polypeptid.
Plasmidet pHAOlL konstrueret i eksempel 15 indeholder et gen, der koder for et 30 hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid (HPA01L), dersom sin N-termi-nale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 161. methionin til den 215. cystein fra human vævsplasminogenaktivator beregnet fra den N-terminale serin som den første aminosyre, og der som sin C-terminale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 132. alanin til den 411. C-terminale leucin fra human pro-35 urokinase beregnet fra den N-terminale serin som den første aminosyre, idet det
I DK 175604 B1 I
I
I 135. lysin er erstattet med glutamin under kontrol af tac-promotor/-operatoren og I
I C230 SD-sekvensen, og kan udtrykke det ovennævnte hybride polypeptid i E. coli. I
I Plasmidet pHA04L konstrueret i eksempel 16 indeholder et gen, der koder for et
I 5 hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid (HPA04L), der som sin N-ter- I
I minale halvdel omfatter et polypeptidområde fra den 161. methionin til den 215. I
I cystein fra human vævsplasminogenaktivator beregnet fra den N-terminale serin I
I som den første aminosyre, og der som sin C-terminale halvdel omfatter et poly- I
I peptidområde fra den 132. alanin til den 411. C-terminale leucin fra human pro- I
I 10 urokinase beregnet ud fra den N-terminale serin som den første aminosyre, idet I
I det 135. lysin er erstattet med glutamin, og det 157. phenylalanin er erstattet med I
I asparaginsyre, under kontrol af tac-promotor/-operatoren og C230 SD-sekvensen,
I og kan udtrykke det ovennævnte hybride polypeptid i E. coli. I
I 15 D. Genekspression oo oprensning af hybride polvpeptider I
I E. coli transformeret med de ovennævnte plasmider dyrkes i fx L-medium beriget
I med 100 ng/ml ampicillin, og når cellekoncentrationen når en absorbans på 0,3-0,6 I
I ved 550 nm, sættes 1 mM af induceren isopropyl-p-D-thiogalactopyranosid til me- I
I 20 diet, og dyrkningen udføres i yderligere adskillige timer for at akkumulere det hy- I
I bride polypeptid i de dyrkede celler. I
I En hvilken som helst konventionel procedure, der anvendes til isolering og op- I
I rensning af et polypeptid, som er akkumuleret i celler, kan anvendes for at isolere I
I 25 og oprense det omhandlede hybride polypeptid. Fx indsamles dyrkede celler, og de I
I indsamlede celler sprænges ved hjælp af en hvilken som helst konventionel meto- I
I de, og de sprængte celler centrifugeres, således at der dannes et bundfald. Målpo- I
I lypeptidet isoleres i bundfaldet. Dernæst behandles bundfaldet med guanidin- hydrochlorid for at opløse målpolypeptidet. Målpolypeptidet oprenses derefter ved
I 30 en hensigtsmæssig kombination af konventionelle procedurer til oprensning af I
I protein såsom væskechromatografi, ionbytningschromatografi, affinitetschroma- I
tografi og lignende. Én udførelsesform for isolering og oprensning af det hybride I
I polypeptid ifølge opfindelsen er beskrevet i eksempel 7. I
I 35 I
15 DK 175604 B1 E. Det hybride polvpeptids egenskaber 1) Analyse ved elektroforese 5 Prøver af de ovenfor fremstillede ekspressionsprodukter underkastes en SDS-polyacrylamidgelelektroforese, og gelen farves med Coomassie Blue. Et eksempel på et resultat er vist i fig. 17A. I fig. 17A viser bane 1, 2 og 3 resultaterne af ekspressionsprodukter, som fås fra E. coli JM103/pPE3, E. coli JM103/pHA03 og E. coli JM101/pDPAT2.
10 2) Immunologisk bekræftelse
Dernæst blev reaktiviteten af de produkter, der var separeret ved den ovenstående elektroforese, med et anti-vævsplasminogenaktivatorantiserum eller med et 15 anti-urokinaseantiserum testet på et nitrocellulosepapir, og man fik de i fig. 17 B og C viste reaktionsmønstre. Som det fremgår af figuren, blev det bekræftet, at det hybride polypeptid HA03 ifølge opfindelsen er reaktivt med begge de ovennævnte antisera.
20 Man fik tilsvarende resultater med andre hybride polypeptider.
3) Affinitet over for fibrin
Fibrinaffinitetssøjler blev fremstillet, og en prøve af ekspressionsproduktet blev 25 anbragt på søjlen, og eluering blev udført først med Tris-HCI-buffer (A) og derefter med Tris-HCI-buffer indeholdende 2M KSCN (B). Eluatet blev fraktioneret, og fraktionerne elueret med (A) blev betegnet som ikke-adsorberede fraktioner, og fraktioner elueret med (B) blev betegnet som adsorberede fraktioner. Hver af de således vundne fraktioner blev testet for plasminogenaktiverende virkning på en fibrin-30 plade indeholdende plasminogen. Resultaterne er vist i fig. 18-1 til 18-4. Medens en kommercielt tilgængelig urokinase (UK) blev elueret i ikke-adsorberede fraktioner, fremgår det af disse Figurer, at hybride polypeptider ifølge opfindelsen og en kommercielt tilgængelig vævsplasminogenaktivator (TPA) blev elueret i de adsorberede fraktioner. Det er derfor klart, at det hybride polypeptid ifølge opfindelsen 35 har det samme niveau af fibrinaffinitet som nativ vævsplasminogenaktivator.
I DK 175604 B1 I
I 16 I
I 4) Måling af Km-værdi på det syntetiske substrat S-2288 I
I For at bekræfte det her omhandlede hybride polypeptids enzymaktivitet blev Km- I
5 værdierne for et ekspressionsprodukt HA03 fra plasmidet pHA03 og et ekspressi- I
I onsprodukt HA20 fra plasmidet pHA20 efter aktivering med plasmin, hvilke eks- I
I pressionsprodukter er repræsentative for hybride polypeptider, der som deres fi- I
I brinaffinitetsområde indeholder ca. to kringler eller ca. en halv kringle af polypep- I
tidet, og som deres enzymaktivitetsområde indeholder et enzymaktivitetsområde I
I 10 fra nativ human prourokinase eller et tilsvarende område, hvor det 157. phenyl- I
I alanin er erstattet med asparaginsyre, sammenlignet med Km-værdien for en kom- I
I mercielt tilgængelig urokinase. Km-Værdierne for de tre polypeptider var ens, 2,0 x I
I ΙΟ"4 mol/l. Det blev derfor bekræftet, at de hybride polypeptider ifølge opfindelsen I
I efter aktivering har det samme enzymaktivitetsniveau som nativ urokinase. I
I 15 I
5) Stabilitet mod plasmin og thrombin I
I Blandt de hybride polypeptider ifølge opfindelsen er de, hvor det 157. phenylala- I
I nin er erstattet med asparaginsyre, dvs. de hybride polypeptider HA03, HA13 og I
I 20 HA23, vanskelige at inaktivere med thrombin og aktiveres af plasmin ved en lave- I
I re hastighed. I
I Det fremgår af ovennævnte beskrivelse, at de hybride plasminogenaktivatorlig- I
I nende polypeptider ifølge opfindelsen udviser fibrinaffinitet i samme niveau som en I
I 25 vævsplasminogenaktivator, og når de aktiveres, udviser de en enzymaktivitet i I
I samme niveau som urokinase. Endvidere er de hybride plasminogenaktivatorlig- I
nende polypeptider, hvor det 157. phenylalanin er erstattet med en sur aminosy- I
I re, stabile mod plasmin, thrombin og andre proteaser og forventes derfor, når de I
administreres in vivo, at udvise en længerevarende fibrinolytisk aktivitet. I
I 30 I
Plasminogenaktivatorer med disse egenskaber er hidtil ukendte, og de her om- I
handlede plasminogenaktivatorlignende polypeptider tilhører en ny type. I
35 I
17 DK 175604 B1
Eksempler
Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående, ikke-begrænsende referenceeksempler og eksempler.
5
Referenceeksempel 1. Isolering af polv A* RNA
Celler fra den humane faryngale cancercellelinje Detroit 562 blev dyrket i et modificeret Eagle’s medium beriget med 10% føtalt kalveserum, 0,1 mM ikke-essenti-10 elle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat og 0,1% lactalbumin på en plast-plade i nærværelse af carbondioxid i en koncentration på 5%. Nar cellerne nåede konflu-ent tilstand, blev mediet fjernet, og 2 ml hver af en denatureret opløsning (6M guanidiniumthiocyanat, 5 mM natriumcitrat, 0,5% sarcosin og 0,1M 2-mercapto-ethanol) sattes til plastpladen med en diameter på 9 cm for at denaturere det cells lulære materiale for at få en ekstrakt. Som beskrevet af Chirgwin et al. (reference 2) blev den således vundne ekstrakt overlejret på en 5,7M CsCI-opløsning, og det hele blev centrifugeret for at isolere RNA. Typisk blev 12 mg RNA isoleret fra 60 plastplader.
20 Derefter blev poly A+ RNA isoleret ved oligo dT-cellulosechromatografi (reference 3) . Der vandtes ca. 600 pg af en RNA-præparation.
Referenceeksempel 2. Fremstilling af et cDNA-bibliotek 25 cDNA blev syntetiseret som beskrevet af Okayama og Berg (reference 4). Dvs., at 2 pg af en vektorprimer og 3 pg af det ovennævnte poly A+ RNA blev blandet, og cDNA-forlængelsesreaktionen blev udført ved 37°C i 40 minutter under anvendelse af 12 enheder revers transkriptase. Derefter blev der som beskrevet i litteraturen tilsat oligo dC, spaltet med HindUl, sammenføjet og cycliseret med et linker-DNA, 30 og RNA-strengen blev fjernet. Den således fremstillede færdige reaktionsblanding blev lagret som et cDNA-bibliotek ved -20°C. Denne præparation kan optøs umiddelbart før brug til transformation af E. coli. Typisk vandtes ca. 100.000 transfor-manter under anvendelse af E. coli %1776 som kompetente celler ud fra den ovennævnte reaktionsblanding.
35
I DK 175604 B1 I
I 18 I
I Referenceeksempel 3. Screening I
I For ud fra de ovennævnte transformanter at isolere kloner, der indeholder et plas- I
I mid, som bærer et gen kodende for et plasminogenaktivatorlignende protein, blev I
I 5 syntetiske DNA-fragmenter anvendt som probe. DNA-fragmenterne har følgende I
I nucleotidsekvens I
I Probe I I
I 10
I 5’ 3’ I
I AATCGGGCATGGATTTCCTG og I
I Probe il I
I 5' 3' I
I gcccccgcacaggaaccg. I
I 15 I
I 20 Disse nucleotidsekvenser er komplementære med delsekvenser af cDNA, der koder I
for en melanomaplasminogenaktivator beskrevet af Pennica (reference 6; Probe I: I
I nucleotidnr. 154-173; Probe II: nucleotidnr. 1099-1116 i referencen). I
I Disse fragmenter blev mærket med 32Ρ-γ-ΑΤΡ ved deres 5'-ende. De mærkede pro- I
I 25 ber blev hybridiseret med de transformerede E. coli dyrket på et nitrocellulosefilter I
I og denatureret med en base på filteret i en hybridiseringsbuffer inde-holdende 900 I
I mM NaCI, 90 mM natriumcitrat, 10 x Denhart’s opløsning (reference 7) ved 45°C i I
I 20 timer. Derefter blev nitrocellulosefilteret vasket i en opløsning af 300 mM NaCI I
I og 30 mM natriumcitrat, og filtreret blev anbragt i kontakt med en røntgenfilm for I
30 at få et autoradiogram, og hybridiseringspositive kloner blev detekteret. Under I
I anvendelse af en blanding af proberne I og II blev der isoleret over ti hybridise- I
I ringspositive kloner ud fra ca. 50.000 kloner. Af disse hybridiseringspositive kloner I
I hybridiserede én klon E. coli χ 1776 (pDPA3) med begge prober. Plasmid pDPA3 I
I vandtes fra denne klon i henhold til konventionelle metoder. I
I 35 I
19 DK 175604 B1 E. coli χ1776 (pDPA3) indeholdende plasmidet pDPA3 blev deponeret i FRI den 8. november 1984 under deponeringsnummeret FERM P-7931.
Et restriktionsendonucleasekort over plasmidet pDPA3 er vist i fig. 13. I figuren 5 betegner det sorte område cDNA-indsætningen. Denne cDNA-indsætning blev sekventeret ved den Maxam og Gilbert (reference 8) beskrevne metode, og resultaterne deraf er vist i fig. 1-1 til 1-5. cDNA-sekvensen består af 2459 basepar fraregnet den poly A-sekvens, som Findes ved 3'-terminalen. Af disse koder 1548 bp for 516 aminosyrer. Dette kodende område omfatter ud over en sekvens, der 10 koder for moden plasminogenaktivator (nucleotid nr. 261-1703), en opstrøms-præprosekvens (nucleotid nr. 156-260). Opstrøms for det kodende område er der et 5'-ikke-kodende område (nucleotid nr. 1-155), og et 3'-ikke-kodende område (nucleotid nr. 1704-2459) nedstrøms for det kodende område.
15 Referenceeksempel 4. Præparation af mRNA
mRNA blev præpareret ved den af J.M. Chirgwin et al. (reference 2) beskrevne metode under anvendelse af guanidinthiocyanat.
20 20 g nyrevævsceller frosset ved -80°C blev knust i en Waring-blender i flydende nitrogen og suspenderet i 80 ml af en 5M guanidinthiocyanatopløsning (5M guanidinthiocyanat, 0,5% natrium-N-lauroylsarcosin, 25 mM natriumtartrat, 0,1M mer-captoethanol og 0,1% antiskumnings-middel A. Suspensionen blev homogeniseret med en Teflon-homogenisator, og nucleinsyren blev udtaget ved hjælp af en 20G 25 1/2 injektionskanyle. 24 ml af denne opløsning blev overlejret på 12 ml 5,7M CsCI, og efter centrifugering i en Beckman-centrifuge med en SW28-rotor i 24 timer ved 15°C og 25.000 omdr./min. blev det hele rå RNA isoleret.
Det totale rå RNA blev opløst i en 2% kaliumacetatopløsning, og der tilsattes det 30 dobbelte volumen ethanol. Blandingen lodes henstå natten over ved -20°C og blev centrifugeret for at isolere et bundfald.
Poly(A)+ RNA blev isoleret og oprenset ved oligo(dT)cellulosesøjle-chromatografi som beskrevet af H. Aviv et al. (reference 3). 10 g nyrevævsceller gav ca. 3 mg af 35 det totale RNA, hvoraf 2-3% var poly(A)+ RNA.
I DK 175604 B1 I
I 20 I
I Referenceeksempel 5. Konstruktion af et cDNA-bibliotek fl) I
I 5 cDNA-Syntese blev udført under anvendelse af 40 ug af det i fremstilling 4 vundne I
I poly(A)+ RIMA. Reaktionen blev udført under anvendelse af 40 pg oligo(dT)i2-i8Som I
I primer med 40 enheder revers transkriptase i 2 timer ved 42°C for at syntetisere I
I den første streng, og efter fjernelse af skabelon-mRNA'et ved basisk behandling I
I blev syntesen af den anden streng udført med 100 enheder E coli DNA-polymerase I
I io I-Klenow-fragment. Efter eliminering af hårnåleløkken med Sl-nuclease, blev I
I (dC)io-2o-strengen bundet til 3'-enden af det dobbeltstrengede cDNA ved hjælp af I
I terminal deoxynudeotidyltransferase, og der vandtes ca. 400 ng (dC)-halet cDNA. I
Dette materiale blev sammenføjet med 800 ng kommercielt tilgængelig (dG)-halet I
I 15 pBR322 (Pstl-sted) (New England Nuclear Inc.)( og E coli χ1776 blev transforme- I
I ret ved Hanahan’s metode (reference 9). Herved vandtes et cDNA-bibliotek (I) be- I
stående af ca. 2 x 105 tetracyclinresistente og ampicillinfølsomme transformanter. I
Størrelsen af cDNA-indsætningsfragmenterne blev bestemt ved den hurtige isole- I
I 20 ringsmetode (reference 10) under anvendelse af basiske lyseprocedurer på disse I
I transformanter. I
I Referenceeksem pel 6. Fremstilling af syntetiske DNA-oliaomerer til anvendelse som I
I cDNA-bibliotek-screeninosprober I
I .25 I
Nedenstående 16 forskellige DNA-oligomerer bestående af 14 nucleotider, som er I
komplementære med det mRNA, som svarer til human urokinases aminosyre- I
sekvens: Asn169, Gin, Pro, Trp, Phe173, beskrevet af G J. Steffens et al. (reference I
11) og Gunzler et al. (reference 12), blev syntetiseret ved phosphotriestermeto- I
30 den: I
35 21 DK 175604 B1
AACCAAGGTTGATT
AACCAAGGTTGGTT
AACCAGGGTTGATT
' . AACCACGGTTGATT
5 AACCACGGTTGGTT
AACCATGGTTGATT
AACCATGGTTGGTT
AACCAAGGCTGATT
AACCAAGGCTGGTT
10 AACCAGGGCTGATT
AACCAGGGCTGGTT
AACCACGGCTGATT
AACCACGGCTGGTT
AACCATGGCTGATT
AACCATGGCTGGTT
15 AACCAGGGTTGGTT.
I Disse 16 forskellige DNA-oligomerer betegnes i det følgende som UK-probe I.
I Til anvendelse som bekræftende prober blev følgende 8 forskellige DNA-oligomerer I 20 bestående af 14 nucleotider, som er komplementære med det mRNA, som svarer I til Met238, Try, Asn, Asp, Pro287, syntetiseret på tilsvarende måde: I 25 5’ GGATCATTATACAT 3’
I GGATCGTTATACAT
I GGATCGTTGTACAT
I GGATCATTGTACAT
I GGGT CATT AT ACAT
I 30 GGGTCGTTATACAT
I GGGTCGTTGTACAT
I GGGT CATTGT ACAT.
I 35 I DK 175604 B1
I 22 I
I Disse 8 forskellige DNA-oligomerer betegnes i det følgende som UK-probe Π. I
Under anvendelse af T4-polynucleotidkinase blev 200 ng af hver af UK-proberne I I
5 og II radioaktivt mærket ved 5-enden med 3000 Ci/-mmol 32Ρ-γ-ΑΤΡ til fremstil- I
ling af prober til kolonihybridisering. I
Referenceeksempel 7. Screening af cDNA-biblioteket 10 (1) Screening
Et autoklaveret nitrocellulosefilter (0,45 pm, type TM-2 fremstillet af Toyo Roshi
Co.) blev anbragt på et LB-agarmedium indeholdende 15 ng/ml tetracyclin, og me- diet blev inokuleret med de i fremstilling 5 fremstillede transformanter, således at
I 15 ca, 2000 transformantkolonier fik lov at vokse. Efter 8 timers inkubation ved 37°C
H blev kolonierne kopieret på to nitrocellulosefiltre, som blev inkuberet i yderli-gere 3 timer ved 37°C. De oprindelige nitrocellulosefiltre blev anvendt som masterfilter, medens de to andre filtre blev overført til LB-agarmedier indehol-dende 15 pg/ml tetracyclin og 100 ng/ml chloramphenicol, og blev underkastet inkubation natten I 20 over ved 37°C. I overensstemmelse med Grunstein Hogness' modificerede metode I (reference 13) blev filtrene derefter placeret over 0,5M NaOH og 1,5M NaCI i 3 mi- I nutter for at forårsage kolonilyse og DNA-denaturering, og efter neutralisering over I 0,5M Tris-HCI (pH 7,6) og 1,5M NaCI blev filtrene lufttørret og bagt i 2 timer ved I 80°C.
I 25 I Efter vask af filtrene i 4 x SSC i 30 minutter hver ved 60°C, blev præhybridisering ' I udført i 4 x SSC, 10 x Denhardt og 50 pg/ml denatureret E. coli-DNA i 1 time ved
I 60°C, og efter tilsætning af 0,1 mM ATP og den radioaktivt mærkede UK-probe I
I (ca. 107 cpm/filter) blev hybridisering udført i 16 timer ved 37°C. Efter vask 6-8 I 30 gange i 4 x SSC ved 39°C blev filtrene lufttørret og screenet for transformanter, I som hybridiserede med UK-probe I, hvilket gav 21 kandidatkloner fra 8 x 104 kolo- nier. Plasmider fra disse kloner betegnes i det følgende som plasmideme pKYUl- I pKYU21.
23 DK 175604 B1
De vundne 21 kandidatkloner blev behandlet på samme måde som beskrevet ovenfor, og der vandtes kloner, der hybridiserede med UK-probe II. Plasmideme i disse kloner betegnes i det følgende som plasmid pKYU21 (fig. 6).
5 (2) Egenskaber ved pKYU21 plasmid DNA
Efter spaltning af pKYU21 plasmid DNA med forskellige restriktionsendonudeaser og subkloning deraf til M13mp8 ved Maxam-Gilberts metode (reference 8) blev bestemmelsen af nudeotidsekvensen udført ved hjælp af dideoxykædetermine-10 ringsmetoden (reference 14). Ved sammenligning af denne sekvens med den velkendte aminosyresekvens af urokinase blev det bekræftet, at selv om cDNA'et indeholder hele det kodende område for lavmolekylær urokinase, mangler et ca. 100 bp langt DNA-fragment i 5'-endeområdet af det kodende område for højmolekylær urokinase.
15
Referenceeksempel 8. Konstruktion af cDNA-bibliotek ΠΠ ved primerforlængelsesreaktion
"N
Baseret på den i afsnit (2) i fremstilling 7 bestemte nudeotidsekvens blev følgen-20 de DNA-oligomer 5' CTGAAGAGCATCAGA 3’ I bestående af 15 nucleotider, der er komplementære til den mRNA-sekvens, der I 25 svarer til 89Ser, Asp, Ala, Leu, Glu93, syntetiseret ved phosphotriestermetoden.
I Under anvendelse af 100 μg poly(A)+ RNA som skabelon og ved at gå frem som I beskrevet af Agarwall et al. (reference 15) eller som beskrevet af Steward et al.
I (reference 16) blev den første cDNA-streng syntetiseret under anvendelse af 100 I 30 enheder revers transkriptase sammen med 1 pg 5' 32P-mærket primer efterfulgt af I syntese af den anden streng med 100 enheder E. coli DNA-polymerase I-Klenow- I fragment. Derefter blev det enkeltstrengede DNA spaltet med SI-nuclease, og ved I 3*-enden blev der tilføjet en (dC)n-streng under anvendelse af terminal deoxynu- I cleotidyltransferase. Efter sammenføjning af denne dC-halede indsætning (cDNA)
I DK 175604 B1 I
I I
I og en dG-halet vektor (pBR322) blev E. coli *1776 transformeret, hvorved vandtes I
I et cDNA-blbliotek (II) bestående af ca. 5 x 104 transformanter. I
I Referenceeksempel 9. Screening af cDNA-bibliotek fin I
I I
De i fremstilling 8 vundne transformanter blev underkastet hybridisering på samme I
I måde som beskrevet i afsnit (1) i fremstilling 7.1 dette tilfælde blev der som probe I
I anvendt et 150 bp Pstl-Bgfll 5'-spaltningsfragment fra pKYU21 radioaktivt mærket I
ved nick-trans-lationsmetoden (reference 9) under anvendelse af 32P-a-dCTP (3000 I
10 Ci/mol). Hybridiseringen blev udført ved 60°C. I
Filteret blev lufttørret efter vask to eller tre gange med 2 x SSC ved 60°C, og klo- I
ner, der hybridiserede med proben, blev fundet ved autoradiografi. Der vandtes 8 I
, positive kloner ud af ca. 3 x 104 kloner. Plasmiderne i disse kloner betegnes her- I
15 efter som plasmiderne pPEl-pPE8. Ved spaltning af disse plasmid-DNA'er med I
I restriktionsenzymet Pstl blev det bekræftet, at plasmidet pPE3 (fig. 7) indeholder I
I en ca. 420 bp lang cDNA-indsætning. I
I De fragmenter, der blev vundet ved spaltning af plasmid pPE3 DMA med restrikti- I
20 onsendonucleasen Pstl, blev subklonet ind i M13mp8, og bestemmelse af basese- I
I kvensen blev udført ved dideoxy-kædetermineringsmetoden (reference 14). Det I
I blev herved bekræftet, at cDNA’et ikke alene indeholder et tilstrækkeligt langt ko- I
I dende område i 5'-endedelen af prourokinasegenet, men også et 66 bp langt 5‘- I
I ikke-translateret område opstrøms for translationsinitieringskodonet ATG (fig. 2-1 I
I 25 til 2-5). I
Referenceeksempel 10. Konstruktion af prourokinasegenet ffia. 61 I
I 5 ug DNA fra plasmidet pKYU21, som indeholdt hele det kodende område for lav- I
I 30 molekylær urokinase, blev spaltet med 10 enheder af hver af restriktionsendo- I
I nudeaserne 8g/II og Hindlll, hvorefter de blev elektroelueret, hvilket gav et ca. I
I 5,7 Kbp DNA-fragment, medens DNA fra plasmidet pKYU21 blev spaltet med 10 I
I enheder af hver af BglII og Ncol og derefter elueret, hvilket gav et 66 bp langt I
I DNA-fragment. Derefter blev 5 pg DNA fra det i fremstilling 6 vundne plasmid pPE3 I
I 35 spaltet med 10 enheder af hver af Ncol og Hindlll, hvilket gav et ca. 1,1 Kbp DNA- I
25 DK 175604 B1 fragment. Disse tre forskellige DNA- fragmenter blev gentagne gange ekstraheret med phenol/chloroform og udfældet med 2 volumen ethanol for at oprense og isolere bundfaldet. Disse tre forskellige DNA-fragmenter blev ligeret sammen med T4-DNA-ligase til transformation i E. coli χ1776. De resulterende transformanter blev 5 screenet ved en hurtig isoleringsmetode under anvendelse af den basiske lyseprocedure, og der vandtes en klon, som bar plasmidet pKYU22, som indeholder hele genet for prourokinase.
Klonen E. coli χ1776/ρΚΥϋ22 blev deponeret den 11. januar 1985 i F.R.I. under 10 deponeringsnummeret FERM P-8041, og den 22. januar 1986 overgik den til international deponering i henhold til Budapest-traktatens bestemmelser under deponeringsnummeret FERM BP-968.
Referenceeksempel 11. Nucleotidsekvensbestemmelse af plasmid PKYU22-15 indsætninasstedet
Nucleotidsekvensen ved plasmid pKYU22's indsætningssted blev bestemt ved Ma-xam-Gilberts metode og dideoxy-kædetermineringsmetoden efter subkloning til I M13mp8. Resultatet er vist i fig. 2-1 til 2-5.
I 20 I Det fremgår af disse figurer, at indsætningen består af et 66 bp langt 5'-ikke- I kodende område, en indledningssekvens ATG(Met)-GGC(Gly), et prourokina- I sekodende område AGC(Ser)-CTC(Lev), en translationsstopkodonet TGA(XXX), og I en 3'-ikke-translationskodonet nedstrøms for stopkodonet.
I 25 I Referenceeksempel 12. Syntese af et orourokinaseoen. som er modificeret i 5'- I endeområdet (fig. 8) I Kodoner fra 5'-terminalområdet af nativt cDNA, der koder for prourokinase, blev I 30 udskiftet for at muliggøre effektiv ekspression af prourokinasegenet i E. coli under I SD-sekvensen for C230-genet, der stammer fra Pseudomonas putida; der blev I anbragt en translationsstartkodonet ATG(Met) ved siden af og opstrøms for ko- I donet for den første aminosyre (Ser), således at prourokinase kunne udtrykkes I direkte; der anbragtes et restriktionsenzymgenkendelsessted Aatll, så det støder I 35 op til det kodende område nær en SD-sekvens i ekspressionsvektoren. Til dette
I DK 175604 B1 I
I 26 I
I formål blev en dobbeltstrenget DNA-oligofner vist i fig. 8 syntetiseret ved phos- I
photriester-metoden. Dette dobbeltstrengede syntetiske DNA har et Aattl-sted i I
I den ene ende til indsætning deraf i en vektor, og et Tagl-sted i den anden ende til I
I sammenføjning med prourokinasegenet. I
5 I
Følgende tre enkeltstrengede DNA-oligomerer omfattende 29, 15 og 20 nudeotider I
I blev syntetiseret ved phosphotriestermetoden: I
I 5’ CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCGT 3' I
ίο I
3’ TGCAGTACTC6TTGC 5’ I
I 3’ TCGAGGTGGTCCAAGGCAGC 5' I
I Derefter blev 1 μ9 af hver af de syntetiske DNA-oligomerer opvarmet i 2 minutter I
15 ved 95°C, phosphoryleret ved 5’-enden med T4-polynucleotidkinase og oprenset I
I under anvendelse af en Sep Pak (C18)-søjle (Waters). Efter tørring blev det opren- I
I sede materiale opløst i 50 μΙ 20 mM Tris-HCI (pH 7,6) og 10 mM MgCI2og sammen- I
I føjet ved opvarmning i 2 minutter ved 95°C og langsom afkøling til stuetemperatur, I
I hvorefter opløsningen blev holdt natten over ved 12°C, hvilket gav følgende dob- I
I 20 beltstrengede DNA: I
I 5· CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCGT 3‘ I
I 3' TGCAGTACTCGTTGCTCGAGGTGCTCCAAGGCAGC I
I Aat 11 Betl BetNl Tegl I
I 25 I
I På den anden side blev 5 pg DNA fra plasmidet pKYU22 spaltet med restriktions- I
I endonucleaserne Bgfll og Aatll, hvorefter der blev isoleret et ca. 5,7 Kb langt DNA- I
I fragment ved elektroeluering. 5 pg DNA fra det samme plasmid pKYU22 blev tillige I
I 30 spaltet med restriktionsendonucleaserne Pstl og BgfU, og der vandtes et ca. 400 I
I bp langt DNA-fragment ved elektroeluering. Dette fragment blev på ny spaltet med I
I restriktionsendonucleasen Taql, og et ca. 260 bp langt DNA-fragment blev isoleret I
I ved elektroeluering. De to forskellige DNA-fragmenter blev isoleret og oprenset ved I
I phenol/chloroformekstraktion og udfældning med 2 volumen ethanol. I
I 35 I
27 DK 175604 B1
Disse to forskellige DNA-fragmenter og den ovennævnte dobbeltstrengede syntetiske DNA-oligomer blev ligeret sammen under anvendelse af T4 DNA-Mgase, og ligationsproduktet blev anvendt til transformation af E. coli χ1776. Derefter blev transformanterne screenet ved en hurtig isolationsmetode og basiske lyseproce-S durer, og der vandtes en klon Escherichia coli χ1776/ρΚΜυΐ, som bar plasmidet pKMUl, som indeholder et modificeret prourokinasegén. Klonen E. coli χ1776/ρΚΜΙΙ1 blev deponeret i F.R.I. den 11. januar 1985 under nr. FERM P-8040.
Referenceeksempel 13. Konstruktion af plasmidet dMUT4L (fio. 9) 10
Ekspressionsplasmidet pMUT4L, som indeholder et humant prourokinasegen uden nogen punktmutation, blev konstrueret ud fra det ovennævnte plasmid pKMUl og ekspressionsvektoren pTCMl. E. coli JM103/pTCMl indeholdende plasmidet pTCMl blev den 17. august 1984 deponeret i F.R.I. under nummeret FERM P-7779.
15 5 μg af det i fremstilling 12 fremstillede plasmid pKMUl blev spaltet med 10 enheder af restriktionsendonucleasen AatU, og spaltningsproduktet blev isoleret efter behandling med kalvetarmsphosphatase (CIP). 5 ug af plasmidet pTCMl blev på den anden side spaltet med 10 enheder af restriktionsendonucleasen Aatll, og et 20 ca. 500 bp langt DNA-fragment blev isoleret ved elektroeluering. Disse to forskellige DNA-fragmenter blev oprenset ved gentagnephenol/chloroformekstrak-tioner og ethanoludfældninger.
Begge disse DNA-fragmenter blev sammenføjet under anvendelse af T4 DNA-ligase 25 og derefter transformeret ind i E. coli JM103. Transformanterne blev screenet ved den hurtige isoleringsmetode ved den basiske lyseprocedure, og der vandtes en klon, som bar plasmidet pMUTIL, i hvilket tac-promotor/-operatoren og C230 SD-sekvensen har den normale orientering i forhold til prourokinasegenet.
30 Dernæst blev 5 μg af plasmidet pKK223-3 (reference 17, 18 og 19) spaltet med 10 enheder af restriktionsendonucleasen HindUl, og spaltningsproduktet blev behandlet med kalvetarmsphosphatase (P.L.Biochemicals).
1 μg af det ovenfor vundne plasmid pMUTIL blev pi den anden side spaltet med 4 35 enheder af restriktionsendonucleasen Dral, og spaltningsfragmentet og 1 μg 5'-
I DK 175604 B1 I
I 28 I
I phosphoryleret H/odW-linker (dCAAGCTTG) blev ligeret med T4 DNA-ligase. I
I Spaltning blev udført under anvendelse af 12 enheder af restriktionsendonuclea- I
I sen Hindlll, og spaltningsproduktet blev opløst i 0,15M NaCI. Opløsningen blev I
ekstraheret med et lige så stort volumen phenol/chloroform, og DNA'et blev ud- I
I 5 fældet ved tilsætning af 2 volumen ethanol. Bundfaldet blev indsamlet ved 16.000 I
I omdr./min. ved 4°C og tørret. I
Det resulterende pMUTIL-spaltningsfragment og /-//ndlll-spaltningsfragmentet fra I
I det ovennævnte pKK223-3 blev ligeret under anvendelse af T4 DNA-ligase og I
10 transformeret ind i E. coli JM103. Transformanterne blev screenet ved den basiske I
I lyseprocedure, og der vandtes en klon E. coli JM103/pMUT2L indeholdende plas- I
I midet MUT2L. I
I 5 pg af plasmidet pMUT2L blev spaltet med 10 enheder af hver af restriktions- I
I 15 endonucleaserne Sphl og Tth 1111, og efter ekstraktion med phenol/chloroform I
I blev DNA’et udfældet med ethanol. Det således isolerede DNA blev gjort stump- I
I endet under anvendelse af T4-polymerase i nærværelse af 0,1 mM dGTP, dCTP,, I
I dATP og TTP, og blev gjort cirkulært med T4-DNA-ligase. DNA'et blev transfor- I
meret ind i E. coli JM103, og kolonierne lodes danne sig på LB-agarmedium inde- I
20 holdende 50 pg/ml ampicillin. Transformanterne blev screenet ved den basiske I
I lyseprocedure (reference 10), og der vandtes en klon E. coli JM103/pMUT4L. I
I Referenceeksempel 14. Indføring af en specifik basesubstitutionsmutation i ko- I
donet for aminosyre 157 under anvendelse af fao M13.
I 25 (1) Fremstilling af enkeltstrenoet skabelon-DNA ffio. 10¾ I 1 pg dobbeltstrenget DNA fra henholdsvis plasmidet pKYU22 og fagen M13mp8
I blev spaltet i 20 μΙ af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM
I 30 MgCl2, 7 mM β-mercaptoethanol og 50 mM NaCI i 1 time ved 37°C under anven- I delse af 5 enheder Pstl. De respektive DNA-fragmenter blev isoleret efter behand- I ling med phenol og udfældning med ethanol. En blanding af disse to forskellige I DNA-fragmenter blev underkastet ligation i 20 μΙ af en opløsning indeholdende
I 66 mM Tris-HCI (pH 7,5), 5 mM MgCI2, 5 mM DTT og 1 mM ATP i 16 timer ved 12QC
I 35 under anvendelse af T4 DNA-ligase. Transformation ind i E. coli JM103 blev udført 29 DK 175604 B1 under anvendelse af reaktionsblandingen som beskrevet af Messing et al. (reference 19), og transformanterne blev udpladet i blød agar indeholdende 0,02% X-gal og 1 mM IPTG. Pladerne blev inkuberet natten over ved 37°C. Der blev fremstillet enkeltstrenget DNA ud fra hvide plaques dannet af rekombinanten.
5
Under anvendelse af noget af det resulterende enkeltstrengede DNA som skabelon blev basesekvensen bestemt under anvendelse af dideoxyproceduren som beskrevet af Messing et al. (reference 20), og sekvensen af det klonede enkeltstrengede DNA blev bekræftet. Den kodende streng og den komplementære streng blev vun-10 det som vist i fig. 10.
(2) Indføring af en specifik basesubstitutionsmutation (fig. 111
Under anvendelse af det resulterende rekombinante M13 fag enkeltstrengede DNA 15 (der er klonet en komplementær streng til urokinasegenet) som skabelon blev indføring af steddirrigeret mutagenese udført med et andet oligonucleotidmutagen.
I dette tilfælde blev følgende syntetiske oligonudeotid 5' GGCCCCGCGATAAGATTA 3’ 20 anvendt som primer. Selv om dette oligonudeotid på 18 baser er komplementært med urokinasegenet i det enkeltstrengede skabelon DNA, er to baser blevet udskiftet, således at kodonet TTT, der angiver phenylalanin, er blevet ændret til kodonet GAT, som angiver asparaginsyre 25
Under anvendelse af ovennævnte oligonudeotid som primer blev dobbeltstrenget DNA syntetiseret in vitro. Dvs., at 2 pmol 5’-phosphoryleret primer blev sat til 0,5 pmol af det enkeltstrengede skabelon DNA, og blandingen blev inkuberet i 10 μΙ af en opløsning indeholdende 7 mM Tris-HCI (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 20 mM NaCI og 30 7 mM MgCI2 i 20 minutter ved 60eC efterfulgt af yderligere inkubation i 20 minutter ved 23°C. Derefter blev der til reaktionsblandingen sat 0,5 mM af hver af dATP, dGTP, dTTP og dCTP i et samlet volumen af 20 μΙ, hvortil sattes 2 enheder DNA-polymerase-Klenow-fragment. Blandingen blev inkuberet i 20 minutter ved 23°C, og efter tilsætning af 1 μΙ 10 mM ATP og 1 enhed T4 DNA-ligase blev blandingen 35 inkuberet natten over ved 12°C. Som beskrevet af Messing et al. reference 20) blev
I DK 175604 B1 I
I 30 I
ovennævnte reaktionsblanding direkte transformeret ind i E coli JM103. Der I
I vandtes således ca. 10.000 fagplaques pr. μΙ af denne reaktionsblanding. I
I Efter overførsel af de resulterende plaques fra et blødt agarmedium til et nitro- I
5 cellulosefilter som beskrevet af Benton og Davies et al. (reference 21) blev filteret I
I bagt i vakuum i 2 timer ved 80°C. Nitrocellulosefilteret blev hybridiseret med pri- I
meroligonucleotidet mærket med 32P som probe i en blanding af 6 x SSC og 10 x I
Denhardt natten over ved 37°C. Filteret blev derefter vasket i 6 x 5SC ved 52°C, og I
muterede fagplaques, som frembragte positive signaler, blev isoleret autoradio- I
10 grafisk. Ud fra den muterede fag vandtes der muteret fag DNA af den dobbelt- I
H strengede type (pm3). Under anvendelse af det muterede fag DNA som skabelon i
I henhold til dideoxymetoden blev det muterede DNA's nucleotidsekvens bestemt, og I
I forekomsten af den ønskede enkeltbasesubstitutionsmutation blev bekræftet. I
15 Det er desuden muligt at udskifte kodonet TTT, der angiver phenylalanin i stilling 157, med kodonet GAA, der angiver Glu, under anvendelse af følgende oligonu- I cleotid I 5’GGCCCCGCGAAAAGATTA 3' 20 som et mutagen.
I Referenceeksempel 15. Konstruktion af olasmidet pMUT4Lpm3 ffio. 12) 25 Ekspressionsplasmidet pMUT4Lpm3, hvor det humane urokinasestrukturgen med den ovennævnte punktmutation var blevet indsat nedstrøms for E coli tac-pro- motoren, blev konstrueret på følgende måde:
Efter fuldstændig spaltning af 10 pg muteret dobbeltstrenget M13 DNA (pm3) med I 30 Pstl blev der isoleret et fragment på ca. 1,2 Kbp. På den anden side blev 10 pg af plasmidet pMUT4L delvis spaltet med Pstl, og der blev isoleret et fragment på ca.
I 4,6 Kbp, hvorfra et fragment på ca. 1,2 Kbp var blevet elimineret.
I Hvert af de to ovenstående fragmenter blev isoleret ved behandling med phenol og I 35 udfældning med ethanol, hvorefter bundfaldene blev blandet. Blandingen blev 31 DK 175604 B1 underkastet ligeringsreaktion natten over ved 12DC under anvendelse af T4 DNA-ligase, og reaktionsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli HB101. Transformanterne blev derefter screenet ved basisk lyseprocedure, og der vandtes en klon indeholdende plasmidet pMUT4Lpm3. Escherichia coli xl776/pMUT4Lpm3, 5 der bærer plasmidet pMUT4Lpm3, blev den 11. juli 1985 deponeret i F.R.l. under nr. FERM P-8341 og blev overført til international deponering den 22. januar 1986 under nr. FERM BP-971 i henhold til Buda pest-traktatens bestemmelser.
Referenceeksempel 16. Konstruktion af plasmidet pMUT4Lpml 1°
Den muterede dobbeltstrengede fag M13RFpml, som indeholdt et DNA-fragment, hvor kodonet AAA for det 135. lysin er muteret til kodonet CAA for glutamin, blev vundet ved den samme fremgangsmåde som beskrevet i Referenceeksempel 14 med undtagelse af, at der anvendtes følgende syntetiske oligonucleotid: 15 5’GATGGA£AAAAGCCC3
Det således vundne muterede DNA's DNA-sekvens blev bestemt ved dideoxy-metoden under anvendelse af det muterede fag DNA som skabelon og blev be-20 kræftet at indeholde den ønskede punktmutation.
Dernæst blev pMUT4Lpml konstrueret ud fra fagen M13RFpml og plasmidet pMUT4L i henhold til samme metode, som er beskrevet i Referenceeksempel 15.
25 Referenceeksempel 17. Konstruktion af plasmidet pMUT4Lpm4
En muteret dobbeltstrenget fag, som indeholdt et DNA-fragment, hvor kodonet AAA for det 135. lysin er muteret til kodonet for glutamin, vandtes på tilsvarende måde som beskrevet i Referenceeksempel 14 med undtagelse af, at der anvendtes 30 følgende syntetiske oligonucleotid: 5'GATGGACAAAAGCCC3*
Ud fra den således vundne muterede fag vandtes en enkeltstrenget fag som be-35 skrevet i Referenceeksempel 14. Under anvendelse af den enkeltstrengede fag som
I DK 175604 B1 I
I 32 I
I skabelon blev kodonet i I I for det 157. phenylalanin derefter muteret til kodonet I
I GAT for asparaginsyre som beskrevet ovenfor med undtagelse af, at der anvendtes I
følgende syntetiske oligonucleotid: I
I 5 5'GGCCCCGCGATAAGATTA3' I
hvilket gav en muteret dobbeltstrenget fag M13RFpm4, som indeholdt et DNA- I
fragment, hvor kodonet AAA for det 135. lysin er muteret til kodonet CAA for gluta- min, og kodonet for det 157. phenylalanin er muteret til kodonet for asparaginsyre.
H 10
Herefter blev plasmidet pMUT4Lpm4 konstrueret som beskrevet i Referenceeksem- pel 15 ud fra den således vundne dobbeltmuterede fag M13RFpm4 og plasmidet I pMUT4L.
I 15 Referenceeksemoel 18. Konstruktion af plasmidet pMUT9Lpml (fia. 19) 5 μg af det i Referenceeksempel 13 konstruerede plasmid pMUT4L blev spaltet med
I 50 enheder Seal og 100 enheder Aatll i 100 μΙ af en buffer indeholdende 10 mM
I Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 125 mM NaCI, 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 20 6 timer. Reaktionsblandingen blev derefter underkastet elektroforese på en 0,7% I agarosegel, og der blev isoleret et DNA-fragment på ca. 5500 bp på konventionel I måde. På den anden side blev 10 pg af det samme plasmid pMUT4L spaltet med
50 enheder Aatll og 50 enheder Smal i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM
I Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 60 mM KCI, 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 6 25 timer. Reaktionsblandingen blev derefter underkastet elektroforese på en 2,0% agarosegel, og der blev isoleret et DNA-fragment på 55 bp på konventionel måde.
I De to således vundne DNA-fragmenter blev omsat med 5 enheder T4 DNA-ligase i
I 10 μΙ af en buffer indeholdende 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM MgCI2, 10 mM
I DTT og 1 mM ATP ved 12°C i 15 timer. Reaktionsblandingen blev anvendt til trans- I 30 formation af E. coli JM103 på konventionel måde, og således vundne ampicillin- resistente transformanter blev screenet for en koloni, der indeholdt plasmidet pMUT8L vist i fig. 19, og ud fra den udvalgte koloni blev plasmidet pMUT8L isoleret I på sædvanlig måde.
33 DK 175604 B1
5 ug af det således vundne plasmid pMUT8L blev spaltet med 50 enheder Hindlll i 100 μΙ af en buffer indeholdende 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCl2 og 60 mM NaCI ved 37°C i 2 timer. Efter phenolekstraktion og ethanoludfældning af reaktionsblandingen blev bundfaldet behandlet med én enhed Klenow-fragment i 20 μΙ 5 af en buffer indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7,2), 10 mM MgCI2, 0,1 mM DTT og 80 μΜ dNTPer ved 22°C i 30 minutter. Efter phenolekstraktion og ethanoludfældning af reaktionsblandingen blev bundfaldet behandlet med 5 enheder T4 DNA-ligase i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 1 μg Pstl-linker og 66 mM Tris-HCI (pH
7,6), 6,6 mM MgCI2, 10 mM DTT og 1 mM ATP ved 12°C i 2 timer. Efter phenol-10 ekstraktion og ethanoludfældning af reaktionsblandingen blev bundfaldet spaltet med 50 enheder PstI i 100 μΙ af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH
7,5), 10 mM MgCI2 og 100 mM NaCI ved 37°C i 2 timer. Reaktionsblandingen blev I derefter underkastet elektroforese på en 0,7% agarosegel, og der blev på sæd- I vanlig måde isoleret et DNA-fragment på ca. 4300 bp.
I 15 I På den anden side blev 5 pg af det i Referenceeksempel 16 konstruerede plasmid I pMUT4Lpml spaltet med 50 enheder PstI i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt I 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM MgCI2 og 100 mM NaCI ved 37°C i 2 timer.
I Reaktionsblandingen blev derefter underkastet elektroforese på en 0,7% aga- I 20 rosegel, og der blev på kendt måde isoleret et DNA-fragment på ca. 1200 bp.
I De således vundne to DNA-fragmenter blev blandet og ligeret under anvendelse af
I 5 enheder T4 DNA-ligase i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 66 mM Tris-HCI (pH
I 7,6), 6,6 mM MgCI2, 10 mM DTT og 10 mM ATP i 15 timer ved 12°C. Reaktions- I 25 blandingen blev anvendt til transformation af E. coli JM103 på sædvanlig måde, og I de således vundne ampicillinresistente transformanter blev screenet for en koloni I indeholdende plasmidet pMUT9Lpml, og plasmidet pMUT9Lpml blev isoleret på I sædvanlig måde.
I 30 Eksempel 1. Konstruktion af plasmidet oDPAT2 I 50 μg af plasmidet pDPA3 blev spaltet med 75 enheder Bgfll i 200 μΙ af en buffer, I som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 100 mM NaCI og 7 mM β- I mercaptoethanol ved 37°C i 4 timer. Efter ethanoludfældning blev bundfaldet
I 35 omsat med 5 enheder Klenow-fragment i 50 μΙ af en buffer, som indeholdt 50 mM
I DK 175604 B1 I
I I
I Tris-HCI (pH 7,2), 10 mM MgCI2, 0,1 mM DTTog 80 μΜ dNTP ved 22°C i 30 I
I minutter. Reaktionsbiandingen blev underkastet elektroforese på en 0,7% I
agarosegel, og der blev på sædvanlig måde isoleret et DNA-fragment på ca. I
I 1800 bp. Dette DNA-fragment betegnes DNA-fragment (A). . I
I 5 I
På den anden side blev 10 pg af plasmidet pYTU3 spaltet med 20 enheder Sall i 50 I
I μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 150 mM NaCI, I
0,2 mM EDTA og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 4 timer. Efter ethanoludfæld- I
ning blev bundfaldet behandlet med 2 enheder Klenow-fragment i 20 μΙ af en buf- I
H 10 fer, som indeholdt 50 mM Tris-HCI (pH 7,2), 10 mM MgCI2, 0,1 mM DTT, 80 μΜ I
dNTP ved 22°C i 30 minutter. Efter ethanoludfældning blev bundfaldet behandlet I
med 1 enhed alkalisk phosphatase (fra bovin tarm) i 20 μΙ af en buffer, som inde- I
I holdt 50 mM Tris-HCI (pH 9,0), 1 mM MgCI2, 0,1 mM ZnCI2, 1 mM spermidin ved I
H 37°C i 30 minutter. Der udførtes phenolbehandling og ethanoludfældning. Bund- I 15 faldet blev opløst i 20 μΙ af en opløsning, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5) I og 1 mM EDTA. Opløsningen indeholder 0,5 pg/μΙ DNA. 5 pg af dette DNA og 5 pg af det ovenfor beskrevne DNA-fragment (A) blev behandlet med 10 enheder T4
I DNA-ligase i 30 μΙ af en buffer, som indeholdt 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM
I MgCI2, 10 mM DTT og 1 mM ATP ved 15°C i 15 timer. Efter ethanoludfældning blev
I 20 bundfaldet spaltet med 15 enheder dal i 30 μΙ af en buffer, som indeholdt 6 mM
I Tris-HCI (pH 7,9), 6 mM MgCI2 og 50 mM NaCI ved 37°C i 4 timer. Efter ethanol- I udfældning blev bundfaldet spaltet med 15 enheder BamHl i 30 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 7 mM MgCI2, 100 mM NaCI og 2 mM β- I mercaptoethanol ved 37°C i 4 timer. Efter at DNA’et i reaktionsblandingen var 25 blevet udfældet med ethanol, blev bundfaldet behandlet med 2 enheder Klenow- I fragment i 30 μΙ af en buffer, som indeholdt 50 mM Tris-HCI (pH 7,2), 10 mM | I MgCI2, 0,1 mM DTT og 80 μΜ dNTP ved 22°C i 30 minutter. Reaktionsblandingen I blev underkastet 0,7% agarosegelelektroforese, og der blev på sædvanlig måde isoleret et DNA-fragment på ca. 2000 bp. Dette DNA-fragment fik betegnelsen I 30 DNA-fragment (B).
I På den anden side blev 2 pg af plasmidet pK12 spaltet med 10 enheder Sall i 20 μΙ I af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 150 mM NaCI, I 0,2 mM EDTA og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 4 timer. Efter ethanoludfæld- I 35 ning blev bundfaldet behandlet med 20 enheder Klenow-fragment i 20 μΙ af en 35 DK 175604 B1 buffer, som indeholdt 50 mM Tris-HCI (pH 7,2), 10 mM MgCI2, 0,1 mM DTT og 80 μΜ dNTP ved 22°C i 30 minutter. Efter ethanoludfældning blev bundfaldet behandlet med 1 enhed alkalisk phosphatase (bovin tarm) i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 50 mM Tris-HCI (pH 9,0), 1 mM MgCI2, 0,1 mM ZnCI2 og 1 mM spermidin 5 ved 37°C i 30 minutter. Efter phenolbehandling foretoges ethanolud-fældning.
Bundfaldet blev opløst i 20 μΙ af en opløsning, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH
7,5) og 1 mM EDTA. Denne opløsning indeholdt 0,1 μ9/μΙ DNA. 1 μg af dette DNA og 1 μg af det ovennævnte DNA-fragment (B) blev omsat med 1,5 enheder T4 DNA-ligase i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM 10 MgCI2, 10 mM DTT og 1 mM ATP ved 15°C i 15 timer. Reaktionsblandingen blev anvendt til transformation af E. coli JM103 på sædvanlig måde, og vundne ampi-cillinresistente transformanter blev screenet for kolonier, som indeholdt plasmidet pDPAT2, der er vist i fig. 13, og plasmidet blev isoleret på sædvanlig måde.
I 15 Eksempel 2. Konstruktion af plasmidet pHAOO
I 5 pg af plasmidet pPE3 (det samme som pMUT4L) blev spaltet med 10 enheder I Pvul i 50 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 7 mM MgCI2, 150 I mM KCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 5 timer. Efter ethanoludfældning I 20 blev bundfaldet spaltet med 10 enheder EcoRI i 50 μΙ af en buffer, som indeholdt
I Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 100 mM NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C
I i 2 timer. Reaktionsblandingen blev underkastet elektroforese på en 1,2% agaro- I segel, og der blev på sædvanlig måde isoleret et DNA-fragment på ca. 2000 bp.
I Det således isolerede DNA-fragment fik betegnelsen DNA-fragment (A).
I 25 I Derefter blev 10 pg af plasmidet pPE3 spaltet med 15 enheder Pvul i 50 μΙ af en
I buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 7 mM MgCI2, 150 mM KCI og 7 mM
I β-mercaptoethanol ved 37°C i 5 timer. Efter ethanoludfældning blev bundfaldet
I spaltet med 15 enheder BamHl i 50 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI
I 30 (pH 8,0), 7 mM MgCI2, 100 mM NaCI og 2 mM β-mercaptoethanol ved 30°C i 3 ti- I mer. Reaktionsblandingen blev underkastet elektroforese på en 1,2% agarosegel, I og der blev isoleret DNA-fragmenter på ca. 2300 bp og ca. 1346 bp i henhold til I konventionelle metoder. Det således isolerede DNA-fragment på ca. 2300 bp fik I betegnelsen DNA-fragment (B). 2 pg af det ovenfor isolerede DNA-fragment på ca.
I 35 1346 bp blev spaltet med 5 enheder Ban i 30 μΙ af en buffer, som indeholdt 20 mM
I DK 175604 B1 I
I 36 I
I Tris-HCI (pH 8,5), 7 mM MgCI2 og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 8 timer. I
Reaktionsblandingen blev underkastet elektroforese på en 1,2% agarosegel, og der I
blev på sædvanlig måde isoleret et DNA-fragment på ca. 750 bp. Dette DNA- I
H fragment fik betegnelsen DNA-fragment (C). I
I I
H På den anden side blev 10 pg af det i eksempel 1 konstruerede plasmid pDPAT2 I
H spaltet med 15 enheder EcoRI i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 50 mM Tris-HCI I
I (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 100 mM NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 3 ti- I
mer. Reaktionsblandingen blev underkastet elektroforese på en 1,2% agarosegel, I
10 og der blev på sædvanlig måde isoleret et DNA-fragment på ca. 472 bp. 2 pg af det I
således vundne DNA blev spaltet med 1 enhed Haelll i 50 μΙ af en buffer, som in- I
I deholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 60 mM NaCI og 7 mM β-mercapto- I
I ethanol ved 37°C i 30 minutter. Reaktionsblandingen blev underkastet elektrofo- I
rese på en 5% polyacrylamidgel, og der blev på sædvanlig måde isoleret et DNA- I
I 15 fragment på ca. 180 bp. 1 pg af dette DNA-fragment og 1 pg af det ovennævnte I
I DNA-fragment (C) blev omsat med én enhed T4 DNA-ligase i 20 pi af en buffer, I
I som indeholdt 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM MgCI2, 10 mM DTT og 1 mM ATP I
ved 15°C i 12 timer. Reaktionsblandingen blev underkastet elektroforese på en I
1,2% agarosegel, og der blev på sædvanlig måde isoleret et DNA-fragment på ca. I
I 20 931 bp. 1 pg af dette DNA-fragment, 1 pg af DNA-fragment (A) og 1 pg af DNA- I
I fragment (B) blev ligeret med 2 enheder T4 DNA-ligase i 20 pi af en buffer, som I
I indeholdt 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM MgCI2, 10 mM DTT og 1 mM ATP ved
I 15°C i 12 timer. Reaktionsblandingen blev anvendt til transformation af E. coli I
I JM103, og resulterende ampicillinresistente transformanter blev screenet for kolo- I
I 25 nier, som indeholdt plasmidet pHAOO vist i fig. 14, og plasmidet blev isoleret på I
I sædvanlig måde. I
I Eksempel 3. Konstruktion af plasmidet pHA03 I
35
I 30 Plasmidet pHA03 blev konstrueret i henhold til den i eksempel 2 beskrevne pro- I
I cedure med undtagelse af, at plasmidet pPE3pm3 (det samme som pMUT4Lpm3) I
I blev anvendt i stedet for plasmidet pPE3 (fig. 14). I
37 DK 175604 B1 EKSEMPEL 4. Konstruktion af plasmidet pHA20 5 ug af det i eksempel 2 fremstillede plasmid pHAOO blev spaltet med 7 enheder PstI i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM MgCI2 og 5 50 mM (NH4)2S04 ved 37°C i 4 timer. Reaktionsblandingen blev underkastet etha-noludfældning, og bundfaldet blev derefter spaltet med 10 enheder Seal i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 125 mM NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 8 timer. Reaktionsblandingen blev under-kastet elektroforese på en 1,2% agarosegel, og der blev på sædvanlig måde isoleret et 10 DNA-fragment på ca. 1100 bp. Dette DNA-fragment fik betegnelsen DNA-fragment (A).
5 pg af plasmidet pHAOO blev spaltet med 7 enheder Pstl i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 20 mM Tris-HCI (pH 7,6), 10 mM MgCI2 og 50 mM (NH4)2S04 ved 37°C i 4 15 timer. Reaktionsblandingen blev underkastet ethanoludfældning, og bundfaldet blev derefter spaltet med 10 enheder EcoRI i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 100 mM NaCI og 9 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 3 timer. Efter ethanoludfældning blev bundfaldet underkastet elektroforese på en 0,7% agarosegel, og der blev på sædvanlig måde isoleret et DNA-fragment 20 på ca. 3500 bp. Dette DNA-fragment fik betegnelsen DNA-fragment (B).
På den anden side blev 15 pg af det i eksempel 1 konstruerede plasmid pDPAT2 spaltet med 20 enheder Bglll i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 100 mM NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 4 ti-25 mer. Efter ethanoludfældning blev bundfaldet spaltet med 25 enheder Seal i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 125 mM NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 10 timer. Reaktionsblandingen blev underkastet elektroforese på en 1,2% agarosegel, og et DNA-fragment på ca. 625 bp blev isoleret på sædvanlig måde. Dette DNA-fragment fik betegnelsen DNA-fragment 30 (C).
10 μς af plasmidet pDPAT2 blev spaltet med 15 enheder Bglll i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 100 mM NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 4 timer. Efter ethanoludfældning blev bundfaldet spal-35 tet med 10 enheder EcoRl i 50 μΙ af en buffer, som indeholdt 50 mM Tris-HCI (pH
I DK 175604 B1 I
I 38 I
I 7,5), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 3 timer. I
Reaktionsblandingen blev underkastet elektroforese på en 5% polyacrylamidgel, og I
I et DNA-fragment på ca. 150 bp blev isoleret i henhold til standardmetoder. Dette I
DNA-fragment blev betegnet DNA-fragment (D). I
I I
I 1 pg af DNA-fragment (A), 1 pg af DNA-fragment (B), 1 pg af DNA-fragment (C) og I
1 pg af DNA-fragment (D), der alle er beskrevet ovenfor, blev ligeret med 4 enhe- I
der T4 DNA-ligase i 30 pi af en buffer, som indeholdt 66 mM Tric-HCI (pH 7,5), 6,6 I
I mM MgCI2, 10 mM DTT og 1 mM ATP ved 15°C i 16 timer. Reaktionsblandingen blev I
I 10 anvendt til transformation af E. coli JM103 i henhold til sædvanlige metoder, og re- I
I suiterende ampicillinresistente transformanter blev screenet for kolonier, som inde- I
I holdt plasmidet pHA20 vist i fig. 15, og plasmidet blev isoleret på sædvanlig mide. I
I Eksempel 5. Konstruktion af plasmidet pHA23 I
I I
I Plasmidet pHA23 blev konstrueret på samme måde som beskrevet i eksempel 4 I
I bortset fra, at det i eksempel 3 konstruerede plasmid pHA03 blev anvendt i stedet I
I for plasmidet pHAOO, der anvendtes til konstruktion af plasmidet pHA20 (fig. 15). I
I 20 Eksempel 6. Konstruktion af plasmidet oHA13 I
I 25 pg af det i eksempel 5 konstruerede plasmid pHA23 blev spaltet med 30 en- I
heder Bgfll i 200 pi af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM I
I MgCI2, 100 mM NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 4 timer. Efter ethanol- I
I 25 udfældning blev bundfaldet behandlet med 4 enheder Klenow-fragment i 50 pi af en buffer, som indeholdt 50 mM Tris-HCI (pH 7,2), 10 mM MgCI2, 0,1 mM DTT og I 80 pm dNTP ved 22°C i 30 minutter. Efter phenolbehandling blev der foretaget I ethanoludfældning. Bundfaldet blev spaltet med 30 enheder Pstl i 100 pi af en buf- I fer, som indeholdt 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM MgCI2 og 50 mM (NH^SQ, 30 ved 37°C i 4 timer. Reaktionsblandingen blev underkastet elektroforese på en 0,7% agarosegel, og der blev på sædvanlig måde isoleret et DNA-fragment på ca. 3500 I bp, som fik betegnelsen DNA-fragment (A), og et DNA-fragment på ca. 1700 bp, I som fik betegnelsen DNA-fragment (B).
DK 175604 B1 39 I 7 pg af DNA-fragmentet (B) blev spaltet med 10 enheder Æsal i 50 μΙ af en buffer, I som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 10 mM MgCI2, 50 mM NaCI og 7 mM β- I mercaptoethanol ved 37°C i 6 timer. Reaktionsblandingen blev underkastet I elektroforese på en 1,2% agarosegel, og der blev på sædvanlig måde isoleret et I 5 DNA-fragment på ca. 1100 bp, som fik betegnelsen DNA-fragment (C), og et DNA- I fragment på ca. 626 bp, som blev betegnet som DNA-fragment (D).
I 2 pg af DNA-fragment (D) blev spaltet med 5 enheder DdeI i 20 μΙ af en buffer, I som indeholdt 100 mM Tris-HCI (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 100 mM NaCI og 7 mM β-
I 10 mercaptoethanol ved 37°C i 8 timer. Efter ethanoludfældning blev bundfaldet Βει handlet med 1 enhed Klenow-fragment i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 50 mM
I Tris-HCI (pH 7,2), 10 mM MgCI2, 0,1 mM DTT og 80 μΜ dNTP ved 22'C i 30 minut- I ter. Efter phenolbehandling blev der foretaget ethanoludfældning. Bundfaldet blev I underkastet elektroforese på en 5% polyacrylamidgel, og der blev isoleret et DNA- I 15 fragment på ca. 241 bp på sædvanlig måde. 1 pg af dette DNA-fragment, 0,5 pg I DNA-fragment (A) og 0,5 pg DNA-fragment (C) blev ligeret med 3 enheder T4
I DNA-ligase i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM
I MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP ved 15°C i 15 timer. Reaktionsblandingen blev I anvendt til transformation af E. coli JM103, og resulterende ampicillinresistente I 20 transformanter blev screenet for kolonier, der indeholdt plasmidet pHA13 vist i fig.
I 16, og plasmidet blev isoleret på sædvanlig måde.
I Eksempel 7. Ekspression oa ekstraktion af genprodukt I 25 (a) E. coli JMl03/pDPAT2, JM103/pHA00, JM103/pHA03, JM103/pHA20, I JM103/pHA23 og JM103/pHA13, der blev fremstillet i eksempel 1-5, og E. coli I JM103/pMUT4L, der blev fremstillet i Referenceeksempel 15, blev dyrket i 100 ml I LB-medium beriget med 100 pg/ml ampicillin ved 37°C under omrystning. Da kul- I turmediets ODeoo nåede 0,6, sattes isopropyl-p,D-thiogalactopyranosid til mediet i I 30 en slutkoncentration på 1 mM, og dyrkningen fortsattes i yderligere 5 timer. Dyrk- I ningsvæsken blev derefter overført til et isbad. Den afkølede væske blev centrifu- I geret ved 3000 omdr./min. i 10 minutter ved 4°C for at indsamle cellerne, der der- I efter blev suspenderet i 50 ml af en buffer, som indeholdt 50 mM Tris-HCI (pH 7,5) I og 100 mM NaCI. Suspensionen blev derefter centrifugeret for at indsamle cellerne, I 35 der blev resuspenderet i 10 ml af den samme buffer. Derefter blev cellerne
I DK 175604 B1 I
I 40 I
I sprængt ved sonikering, og de sprængte celler blev centrifugeret ved 15.000 I
omdr./min. i 10 minutter ved 4°C, hvilket gav et bundfald. I
(b) Hvert af de i trin (a) fremstillede bundfald blev suspenderet i 10 ml af en I
5 buffer, som indeholdt 7,5M guanidin-hydrochlorid og 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), og I
suspensionen lodes henstå ved stuetemperatur i 90 minutter. Dernæst blev sus- I
pensionen centrifugeret ved 10.000 omdr./min. i 10 minutter, og supernatanten I
blev fortyndet til 5 ml af en opløsning, som indeholdt 1M guanidin-hydrochlorid, I
0,05M Tris-HCI (pH 7,5), 2 mM reduceret glutathion og 0,2 mM oxideret glutathion, I
10 og inkuberet natten over ved stuetemperatur. Derefter blev opløsningen dialyseret I
mod 100 volumen af en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCI (pH 7,4) og 0,4M
NaCI ved 4°C i 4 timer og derefter 100 volumen af en opløsning indeholdende 10 I
I mM Tris-HCI (pH 7,4) og 0,1M NaCI i 2 timer, hvorved vandtes en ekstrakt. I
15 Eksempel 8 I
I Hvert bundfald vundet fra hver transformant i eksempel 7(a) i en mængde svaren-
I de til 1 ml dyrkningsvæske tilsattes 20 μΙ af en prøveopløsning inde-holdende 3M
urinstof, 0,08M dithiothreitol og 1% SDS, og blandingen blev opvarmet ved 95°C i I 20 5 minutter. Det varmebehandlede produkt blev centrifugeret for at eliminere uoplø- seligt stof, og 8 μΙ af den således vundne supernatant blev anbragt på en SDS-po- I lyacrylamidgradientgel (Nature, 292, 1981, s. 128), og elektroforese blev udført I ved 50 V natten over. Efter elektroforese blev gelen farvet ved at neddyppe den i et farvebad bestående af 1% Coomassie Blue, 10% eddikesyre, 25% isopropanol 25 og vand i 1,5 time, hvorefter den blev neddyppet i en affarvende opløsning bestå- ende af 10% eddikesyre, 10% isopropanol og vand i 2 timer efterfulgt af en opløs- I ning bestående af 5% methanol og 7% eddikesyre og vand i 2 timer. Et eksempel på et således vundet gelmønster er vist i fig. 17A. I fig. 17A blev en prøve af et I ekspressionsprodukt fra E. coli JM103/pHA03, der danner et hybridt plasminogen- I 30 aktivatorlignende polypeptid ifølge opfindelsen (HA03) (bane 2), sammenlignet I med en prøve af et ekspressionsprodukt fra E. coli 3M103/pPE3 (pMUT4L) (bane 1), I der danner dativ human prourokinase (UK), og en prøve af et ekspressionsprodukt I fra E. coli 3M103/pDPAT2, der danner nativ human vævsplasminogenaktivator (t- I PA) (bane 3), ved elektroforese.
I 35 41 DK 175604 B1 p| den anden side blev hver af de ovenfor beskrevne prøver underkastet den samme SDS-polyacrylamidgradientgelelektroforese som beskrevet ovenfor, og separerede proteiner på gelen blev derefter overført til et nitrocellulosefilter, og filteret blev underkastet et enzymimmunoassay (EIA) (S. Tabe, Saibo Kogaku, 2, 1983, s.
5 1061). Dvs., at efter at proteinerne på SDS-polyacrylamidgelen var blevet overført til et nitrocellulosefilter for at forhindre uspecifik adsorption, blev nitrocellulosefilteret neddyppet i en opløsning af 3% gelatine i TBS (20 mM Tris-HCI, pH 7,5 og 500 mM NaCI), hvorefter filteret blev neddyppet i 2 timer i en opløsning, som indeholdt anti-vævsplasminogenaktivator-antiserum fra en kanin, der var immuniseret 10 med vævsplasminogenaktivator. Filteret blev vasket grundigt med TBS-opløsning og derefter gennemvædet med en opløsning, som indeholdt et peberrodsperoxi-dasemærket anti-kanin-antistof IgG (ged) i 1 time. Efter grundig vask blev filteret neddyppet i en fremkalderopløsning, som indeholdt 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 500 mM NaCI, 0,06% 4-chlor-l-naphthol og 0,015% H202 i 5 minutter. Et eksempel på 15 de vundne resultater er vist i Fig. 17C. Den samme procedure som beskrevet ovenfor blev anvendt med et anti-urokinaseantiserum. Et eksempel på de vundne resultater er vist i fig. 17B.
Ud fra sammenligningen af de i fig. 17A, B og C viste mønstre fremgår det, at det 20 hybride polypeptid ifølge opfindelsen er immunreaktivt med både antiserum mod vævsplasminogenaktivator og antiserum mod urokinase.
Eksempel 9. Fremstilling af fibrinaffinitets-Sepharosesøile 25 3 g fibrinogen (Daiichi Kagaku Yakuhin Kogyo, Japan, type 2, plasminogenfrit) blev opløst i 100 ml af en bindingsbuffer, som indeholdt 0,1M NaHC03 (pH 8,3) og 0,5M NaCI. Opløsningen blev centrifugeret ved 10.000 x g i 10 minutter for at eli-minere uopløselige materialer, og supernatanten blev anvendt til efterfølgende re-aktion.
30 2 g CNBr-aktiveret Sepharose 4B (Pharmacia) blev kvældet med 30 ml 1M HCI til dannelse af ca. 7 ml bærer. Det således vundne bærerpræparat blev anbragt på et G3-glasfilter og vasket Fire gange med 25 ml 1 mM HCI. Endvidere blev bæreren vasket med 20 ml af bindingsbufferen, og den vaskede bærer blev suspenderet i 20 ml af den samme buffer. Umiddelbart efter fremstillingen blev suspensionen sat 35 til den ovennævnte fibrinogenopløsning, og blandingen blev omsat ved stuetempe-
I DK 175604 B1 I
I 42 I
ratur i 2 timer under omrøring. Efter reaktionen blev supernatanten fjernet. Det I
resterende materiale tilsattes 50 ml 0,2M glycin (pH 8,0), og blandingen blev I
I omrørt ved stuetemperatur i 2 timer for at inaktivere resterende aktive grupper. I
I Efter fjernelse af supernatanten blev restmaterialet vasket fem gange med på skift I
I 5 20 ml hver af en 0,2M glycinopløsning (pH 8,0) og en acetatbuffer, som indeholdt I
I 0,1M natriumacetat (pH 5,0) og 0,5M NaCI, pi et glasfilter, hvorved man fik ca. I
I 7 ml af en fibrinogenbundet bærer. Denne bærer blev fyldt i en søjle med en dia- I
I meter på 16 mm og en højde på 70 mm. I
I 10 300 enheder bovint thrombin (Mochida Seiyaku, Japan) blev opløst i 3ml destilleret I
I vand, og opløsningen blev gradvis hældt igennem den ovenfor fremstillede søjle i 2 I
I timer for at omdanne det til bæreren bundne fibrinogen til fibrin. Søjlen blev der- I
I efter ækvilibreret med 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 0,02M Tris-HCI (pH 7,5), I
I 0,15M NaCI og 0,05% Triton X-100. I
I 15 I
I Eksempel 10 I
I Den i eksempel 7 (b) fremstillede ekstrakt blev i en mængde svarende til 5 ug af I
I ekspressionsproduktet indstillet til 100 μΙ slutteligt væskevolumen indeholdende I
I 20 0,02M Tris-HCI (pH 7,5), 0,15M NaCI og 0,05% Triton X-100. Den således frem- I
I stillede opløsning blev hældt igennem den i eksempel 9 fremstillede søjle ved en I
I strømningshastighed på 0,5 ml/minut, hvilket tillod omsætning af ekspressions- I
I produktet i den anvendte opløsning med det til bæreren i søjlen bundne fibrin. I
I Derefter blev søjlen vasket med 40 ml af en buffer, som indeholdt 0,02M Tris-HCI I
I 25 (pH 7,4), 0,15M NaCI og 0,05% Triton X-100, ved den ovennævnte strømnings- I
I hastighed. Derefter blev søjlen elueret med en elueringsbuffer, som indeholdt 2M I
I KSCN, 0,02M Tris-HCI (pH 7,4) og 0,05% Triton X-100. Under den ovennævnte I
I vask og eluering blev al udstrømmende væske fraktioneret i portioner på 2 ml I
I under anvendelse af en fraktionsindsamler. Hver fraktion blev målt for plasmino- I
I 30 genaktivatoraktivitet ved fibrinolytisk aktivitet på en plasminogenholdig fibrinplade. I
I Fibrinolytisk aktivitet blev målt som følger: En opløsning af 0,1 g Fibrinogen (Daiichi I
I Kagaku Yakuhin, Japan; fibrinogen type 1) opløst i 5 ml 0,06M phosphatbuffer og I
I en opløsning af 0,025 g agarose (Sigma) opløst i 5 ml af den samme buffer blev I
I 35 blandet. Til blandingen sattes bovint thrombin (Mochida Seiyaku, Japan) i en I
43 DK 175604 B1 slutkoncentration på 3 NIH enheder/ml (1 mM), og efter omrøring blev blandingen hældt ud på en petriskål med en indre diameter på 8,5 cm til fremstilling af en fibrinplade. 10 μΙ af hver af prøverne blev dryppet ud på fibrinpladen, og pladen blev inkuberet ved 37°C i 14 timer. Diametre af udvik-lede lysecirkler blev målt. I 5 henhold til denne fremgangsmåde blev standardprøver med kendte enheder fremstillet ud fra kommerciel urokinase fra urin (UK) dryppet på fibrinpladen, og pladen blev inkuberet ved 37°C i 14 timer, og diametrene af de udviklede lysecirkler blev målt. Ud fra disse målinger blev der optegnet en kalibre-ringskurve for aktivitet versus lysecirklens diameter. Aktiviteten i testprøven blev opnået ved at sammen-10 ligne målingerne af lyse-cirkeldiametrene fra testprøver med kalibreringskurven.
Fraktioner, som blev elueret af vaskebufferen, som ikke indeholdt KSCN, blev betegnet som ikke-adsorberede fraktioner, hvorimod fraktioner, der var elueret med elueringsbufferen, som indeholdt 2M KSCN, blev betegnet som adsorberede 15 fraktioner. Elueringsprofiler for hver prøve er vist i fig. 18-2 til 18-4. Som kontroller blev en kommercielt tilgængelig vævsplasminogenaktivator (TPA), en kommercielt tilgængelig urokinase fra urin (UK) og rekombinant TPA (DPAT2) fra E. coli behandlet ved samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, og kontrolelue-ringsprofilerne er vist i fig. 18-1.
20
Det fremgår af disse figurer, at medens den kommercielt tilgængelige urokinase (UK) ikke adsorberes til en fibrin-Sepharosebærer, er hybride plasminogenaktiva-torlignende polypeptider ifølge opfindelsen, hvilke indeholder det hele eller en del af et kringleområde, som er ansvarligt for human vævsplasminogenaktivators 25 affinitet over for fibrin, samt en rekombinant vævsplasminogenaktivator dannet af E. coli og en kommercielt tilgængelig vævsplasminogenaktivator i stand til at binde til en fibrin-Sepharosebærer.
Eksempel 11. Km-Bestemmelse under anvendelse af syntetisk substrat S-2288 30
S-2288 (Kabi) blev opløst i en reaktionsbuffer, som indeholdt 0,1M Tris-HCI (pH
8,0), 0,01% Triton X-100 og 0,5M NaCI, og der blev derefter fremstillet opløsninger, som indeholdt henholdsvis 0,1 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM og 1 mM
S-2288.
35
I DK 175604 B1 I
I 44 I
I De i eksempel 7(b) fremstillede ekstrakter HA03 og HA20 og en opløsning af I
I kommercielt tilgængelig urokinase (UK), hver især 10 μΙ, blev fortyndet med I
I reaktionsbufferen til et slutvolumen på 400 μΙ. Til disse prøver sattes 2 μΙ af en I
I opløsning af 1 mg/ml plasmin (Sigma), og reaktionsblandingerne lodes henstå ved I
I 5 37°C i 1 time i en inkubator. Derefter blev reaktionsblandingerne omgående over- I
I ført til isvand og hver især tilsat 2 μΙ af en opløsning af 5 mg/ml sojabønnetryp- I
I sininhibitor (Sigma) for at standse reaktionen med plasmin. For hver test-prøve I
I blev der fremstillet fem reaktionsblandinger, og til hver reaktionsblanding sattes I
den ovennævnte S-2288-opløsning med forskellig koncentration. Disse reaktions- I
I 10 blandinger lodes henstå ved 37°C i 1 time i en inkubator. Derefter blev reaktions- I
I blandingen omgåendeoverført til et isbad og hver især tilsat 50 μΙ 10% eddikesyre- I
opløsning for at standse reaktionen. Som kontrol blev den samme procedure som I
I beskrevet ovenfor udført under anvendelse af 400 μΙ af reaktionsbufferen i stedet I
I for 400 μΙ af testprøven. I
I 15 I
I For hver reaktionsblanding blev absorbans ved 405 nm målt, og for hver prøve I
I blev forskellen mellem prøveabsorbans og kontrolabsorbans, dvs. A-værdi, opnå- I
I et. Reaktionshastigheden var v = A/60, derfor 1/v = 60/A, hvor "60” betyder, at I
I reaktionen blev udført i 60 minutter. Der blev tegnet en Lineweaver-Burk-reciprok I
I 20 ”plot"-graf ved at afbilde 1/v-værdien på en ordinatakse og 1/s-værdien på en I
abscisseakse, idet s betegner en koncentration (M) af et substrat i reaktions- I
I blandingen. Ud fra grafen blev der opnået de i nedenstående tabel viste Km- I
I værdier. I
I 25 TABEL I
Prøve Målt Km-værdi Km-værdi fra Kabi S-2288 I
(mol/l) data-ark (mol/l) I
HA03 2,0 x 10'4 I
30 -4 I
HA20 2,0 x 10 I
Kommerciel UK 2,0 x 10 4 2,0 x 10 4 I
35 I
i 45 DK 175604 B1
Det fremgår af tabellen, at det hybride polypeptid HA03 bestående af et polypeptidområde fra 161. Met til 219. Gly svarende til ca. en halv kringle af human vævs-5 plasminogenaktivator og et polypeptidområde fra den 150. Gin til den 411. Leu fra human prourokinase, idet det 157. Phe er erstattet med Asp, og det omhandlede hybride polypeptid HA20 bestående af et polypeptidområde fra den første Ser til den 219. Gly, inklusive et helt kringleområde fra human vævsplasminogenakti-vator, og et polypeptidområde fra den 150. Gin til den 411. Leu fra human prouro-10 kinase har samme Km-værdi som kommercielt tilgængelig urokinase.
Dette betyder, at det område, der er ansvarligt for det her omhandlede hybride polypeptids enzymaktivitet, udviser den samme egenskab som den tilsvarende del i nativ urokinase uanset længden af det område, som er ansvarligt for fibrinaffinitet, 15 og som stammer fra vævsplasminogenaktivatoren, og uanset tilstedeværelsen eller fraværelsen af punktmutation i en serinproteaseregion, dvs. den 157. aminosyre.
Eksempel 12. Konstruktion af plasmidet PHA21L ffia. 201 20 10 ug af det i eksempel 4 konstruerede plasmid pHA20 blev spaltet med 100 enheder BglII og 96 enheder PstI i 200 μΙ af en buffer, som indeholdt 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM MgCI2 og 100 μΜ NaCl ved 37°C i 2 timer. Reaktionsblandingen blev underkastet elektroforese på en 0,7% agarosegel, og et DNA-fragment på ca.
3400 bp blev isoleret på sædvanlig måde. Dette DNA-fragment fik betegnelsen 25 DNA-fragment (E).
Endvidere blev 5 pg af det samme plasmid pHA20 spaltet med 100 enheder Bgfll og 120 enheder Seal i 200 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 125 mM NaCl og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 4 timer.
30 Reaktionsblandingen blev derefter underkastet elektroforese på en 0,7% agarosegel, og et DNA-fragment på ca. 630 bp blev isoleret på sædvanlig måde. Dette DNA-fragment fik betegnelsen DNA-fragment (F).
På den anden side blev 5 μg af det i Referenceeksempel 18 fremstillede plasmid 35 pMUT9Lpml spaltet med 30 enheder PstI i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 200
I DK 175604 B1 I
I 46
I mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM MgCI2 og 100 mM NaCI ved 37°C i 2 timer. Reakti- I
I onsblandingen blev derefter underkastet elektroforese på en 0,7% agarosegel, og I
I et DNA-fragment på ca. 1200 bp blev isoleret på sædvanlig måde. Dette DIMA- I
I fragment blev delvis spaltet med 40 enheder Fspl i 100 μΙ af en buffer, som inde- I
i 5 holdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 10 mM MgCI2, 50 mM NaCI og 10 mM β-mercapto- I
I ethanol ved 37°C i 10 minutter. Reaktionsblandingen blev derefter underkastet I
I elektroforese på en 1,2% agarosegel, og et DNA-fragment på ca. 1100 bp blev I
I isoleret på sædvanlig måde. Dette DNA-fragment fik betegnelsen DNA-fragment
I (G)' I
I 10 I Følgende to oligonucleotider:
I 5’ ACTGTGATGTGCCCTCCTGCACAGGAA 3* I
I 3’ TGACACTACACGGGAGGACGTGTCC 5’ I
I I
I blev syntetiseret ved phosphitmetoden. 1 pg af hvert af disse syntetiske oligonu- I
I cleotider blev blandet i 30 μΙ af en opløsning indeholdende 50 μΜ Tris-HCI (pH 7,6), I
I 10 mM MgCld23/4 og 10 mM β-mercaptoethanol, opvarmet ved 70°C i 5 minutter og I derefter afkølet på is. Reaktionsblandingen tilsattes 20 enheder T4 polynucleotidki-
I 20 nase og blev inkuberet ved 37°C i 1 time for at phosphorylere 5'-enden på oligonu- I
I cleotiderne. Reaktionsblandingen blev opvarmet ved 70°C i 2 minutter og lodes I
I derefter henstå ved stuetemperatur i 5 minutter for at sammenføje de to synte- I
I tiske oligonucleotider. Efter ethanoludfældning af det sammenføjede produkt blev I
I bundfaldet blandet med ovenstående DNA-fragment (F) og ligeret med 5 enheder I
I 25 T4 DNA-ligase i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM I
I MgCI2, 10 mM DTT og 10 mM ATP ved 12°C i 15 timer. Efter phenolekstraktion og I
I ethanoludfældning af reaktionsblandingen blev reaktionsblandingen spaltet med 10 I
I enheder Fspl og 20 enheder Bgfll i 50 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris- I
I HCI (pH 7,4), 10 mM MgCI2, 50 mM NaCI og 10 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 4 I
I 30 timer. Reaktions-blandingen blev underkastet elektroforese på en 1,0% agarose- I
I gel, og et DNA-fragment på ca. 650 bp blev isoleret på sædvanlig måde. Dette I
I DNA-fragment blev betegnet som DNA-fragment (Η). I
I DNA-Fragmenterne (E), (G) og (H), der alle var fremstillet som beskrevet ovenfor, I
I 35 blev blandet og ligeret med 5 enheder T4 DNA-ligase i 20 μΙ af en buffer, som inde- I
47 DK 175604 B1 holdt 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM MgCI2, 10 mM DTT og 10 mM ATP ved 12°C i 15 timer. Reaktionsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli JM103 i henhold til sædvanlige metoder, og således vundne ampicillinresistente trans-formanter blev screenet for en koloni, som indeholdt plasmidet pHA21L, og plas-S midet pHA21L blev isoleret på sædvanlig måde.
Eksempel 13. Konstruktion af plasmidet dHA24L
5 pg af det i Referenceeksempel 17 fremstillede plasmid pMUT4Lpm4 blev spaltet 10 med 50 enheder Pstl i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM MgCI2 og 100 μΜ NaCI ved 37°C i 2 timer. Reaktionsblandingen.blev underkastet elektroforese på en 0,7% agarosegel, og et DNA-fragment på ca. 1200 bp blev isoleret på sædvanlig måde. DNA-fragmentet blev delvis spaltet med 40 enheder Fspl i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 10 mM 15 MgCI2, 50 mM NaCI og 10 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 10 minutter. Blandingen blev derefter underkastet elektroforese på en 1,2% agarosegel, og et DNA-fragment på ca. 1100 bp blev isoleret på sædvanlig måde. Dette DNA-fragment blev betegnet som DNA-fragment (I).
20 På den anden side blev DNA-fragmenterne (E) og (G) fremstillet som beskrevet i eksempel 12. Disse DNA-fragmenter (E), (G) og (I) blev blandet og ligeret med T4 DNA-ligase i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM MgCI2, 10 mM DTT og 10 mM ATP ved 12°C i 15 timer. Reaktionsblandingen blev anvendt til transformation af E. coli JM103 på sædvanlig måde, og ampicillinresi-25 stente transformanter blev screenet for en koloni, som indeholdt plasmidet pHA24L vist i fig. 20, og plasmidet pHA24L blev isoleret pi sædvanlig måde.
Eksempel 14. Konstruktion af plasmidet oHAHL
30 5 μg af det i eksempel 12 fremstillede plasmid pHA21L blev spaltet med 50 enheder Seal og 50 enheder Pstl i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 125 mM NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 6 timer. Reaktionsblandingen blev underkastet elektroforese på en 1,0% agarosegel, og et DNA-fragment på ca. 1100 bp blev isoleret på sædvanlig måde. Dette DNA-35 fragment fik betegnelsen DNA-fragment (J).
j
^_________I
DK 175604 B1 I
Desuden blev 10 ug af det samme plasmid pHA21L spaltet med 100 enheder DdeI i I
200 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 150 mM I
NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 15 timer. Reaktionsblandingen blev I
5 derefter underkastet elektroforese på en 4,0% agarosegel, og et DNA-fragment på I
ca. 330 bp blev isoleret pi sædvanlig måde. Dette DNA-fragment fik betegnelsen I
DNA-fragment (K). I
De følgende to oligonucleotider: I
5' ATGAAGAGGTGACGTCATGTC 3’ I
3' TACTTCTCCACTGCAGTACAGACT 5' I
blev syntetiseret ved phosphitmetoden. 2 pg af hvert af disse to syntetiske oligo- I
15 nucleotider blev blandet, og phosphorylering af 5'-enden og sammenføjning blev I
udført som beskrevet i eksempel 12. Efter ethanoludfældning af de sammenføjede I
oligonucleotider blev bundfaldet blandet med det ovenfor fremstillede DNA-frag- I
ment (K), og ligationen blev udført som beskrevet i eksempel 12. Efter ethanolud- I
fældning blev bundfaldet spaltet med 100 enheder Seal og 100 enheder Aatll i I
20 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 μΜ Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 125 mM I
NaCI og 7 mM 2-mercaptoethanol ved 37°C i 15 timer. Reaktionsblandingen blev I
underkastet elektroforese på en 4,0% agarosegel, og et DNA-fragment på ca.
250 bp blev isoleret på sædvanlig måde. Dette DNA-fragment fik betegnelsen DNA- I
fragment (L). Endvidere blev 5 pg af det i Referenceeksempel 18 konstruerede I
25 plasmid pMUT9Lpml spaltet med 50 enheder /lattl og 50 enheder Pstl i 100 μΙ af I
en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 60 mM KCI og I
7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 4 timer. Reaktionsblandingen blev derefter I
underkastet elektroforese på en 0,7% agarosegel, og et DNA-fragment på ca. I
3000 bp blev isoleret på sædvanlig måde. Dette DNA-fragment fik betegnelsen I
30 DNA-fragment (Μ). I
DNA-fragmenterne (J), (L) og (M), dier alle var fremstillet som beskrevet ovenfor, I
blev blandet og ligeret med 5 enheder T4 DNA-ligase i 20 μΙ af en buffer, som in- I
deholdt 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM MgCI2, 10 mM DTT og 10 mM ATP ved I
35 12°C i 15 timer. Reaktionsblandingen blev anvendt til transformation af E. coli I
49 DK 175604 B1 JM103 på sædvanlig måde, og ampicillinresistente transformanter blev screenet for en koloni, der indeholdt plasmidet pHAHL vist i fig. 21, og plasmidet pHAHL blev isoleret i henhold til standardmetoder.
5 Eksempel 15. Konstruktion af plasmidet pHA14L
5 Mg af det i eksempel 13 konstruerede plasmid pHA24L blev spaltet med 50 enheder Seal og 50 enheder Pstl i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 125 mM NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 6 ti-10 mer. Reaktionsblandingen blev derefter underkastet elektroforese på en 1,0% aga-rosegel, og et DNA-fragment på ca. 1100 bp blev isoleret i henhold til standardmetoder. Dette DNA-fragment fik betegnelsen DNA-fragment (N).
Desuden blev DNA-fragmenterne (L) og (M) fremstillet som beskrevet i eksempel 15 14. Disse DNA-fragmenter (L), (M) og (N) blev blandet og ligeret med 5 enheder T4 DNA-ligase i 20 μΙ af en buffer, som indeholdt 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM MgCI2, 10 mM DTT og 10 mM ATP ved 12°C 15 timer. Reaktionsblandingen blev anvendt til transformation af E. coli JM103, og ampicillinresistente transformanter blev screenet for en koloni indeholdende plasmidet pHA14L, og plasmidet pHA14L 20 blev isoleret i henhold til sædvanlige metoder.
Eksempel 16. Konstruktion af plasmidet dHAOIL ffia. 22) 5 pg af det i eksempel 12 konstruerede plasmid pHA21L blev spaltet med 50 en-25 heder EcoRI og 50 enheder Pstl i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM MgCI2 og 100 mM NaCI ved 37°C i 4 timer. Reaktionsblandingen blev underkastet elektroforese på en 0,7% agarosegel, og et DNA-fragment på ca. 3300 bp blev isoleret i henhold til sædvanlige metoder. Dette DNA-fragment fik betegnelsen DNA-fragment (O).
30 5 pg af det samme plasmid pHA21L blev spaltet med 50 enheder Seal og 50 enheder Pstl i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 7 mM MgCI2, 125 mM NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 15 timer. Reaktionsblandingen blev derefter underkastet elektroforese på en 0,7% agarosegel, og et
50 I
DK 175604 B1 I
DNA-fragment på ca. 100 bp blev isoleret i henhold til kendte metoder. Dette DNA- I
fragment fik betegnelsen DNA-fragment (P). I
Endvidere blev 10 μρ af det samme plasmid pHA21L spaltet med 50 enheder EcoRI I
5 og 50 enheder Seal i 100 μΙ af en buffer, som indeholdt 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), I
7 mM MgCI2, 125 μΜ NaCI og 7 mM β-mercaptoethanol ved 37°C i 15 timer. Reak- I
tionsblandingen blev derefter underkastet elektroforese på en 2,0% agarosegel, og I
et DNA-fragment pi ca. 150 bp blev isoleret i henhold til kendte metoder. Dette I
DNA-fragment fik betegnelsen DNA-fragment (Q). I
10 I
DNA-fra g menterne (O), (P) og (Q), der alle var fremstillet som beskrevet ovenfor,
blev blandet og ligeret med 5 enheder T4 DNA-ligase i 20 μΙ af en buffer, som inde- I
holdt 66 mM Tris-HCI (pH 7,6), 6,6 mM MgCI2, 10 mM DTT og 10 mM ATP ved 12°C I
i 15 timer. Reaktionsblandingen blev anvendt til transformation af E coli JM103, og
15 ampicillinresistente transformanter blev screenet for en koloni, der indeholdt plas- I
midet pHAOlL vist i fig. 22, og plasmidet pHAOlL blev isoleret på sædvanlig måde. I
Eksempel 17. Konstruktion af plasmidet PHA04L ~ I
20 Plasmidet pHA04L blev konstrueret som beskrevet i eksempel 16 med undtagelse I
af, at det i eksempel 13 konstruerede plasmid pHA24L blev anvendt i stedet for
plasmidet pHA21L. I
Eksempel 18. Ekspression og ekstraktion af det hybride olasminooenaktivator- I
25 lionende polvpeotid PHA24L I
Det i eksempel 13 konstruerede plasmid pHA24L blev anvendt til transformation af I
E coli KY1436 i henhold til standardmetoder, og den således vundne transformant I
blev dyrket ved 30°C natten over under omrystning i 5 ml af et L-medium beriget I
30 med 50 μς/ιτιΙ ampicillin i et reagensglas. 2 ml af dyrkningsvæsken blev inokuleret · I
til 1 liter af et L-medium beriget med 50 pg/ml ampicillin i en 5-liters konisk kolbe,
og dyrkningen blev udført ved 30°C på et luftrysteapparat ved 250 omdr./min. Da I
væskens absorbans ved 60 nm (OD6oo) nåede 0,4, blev kulturen overført til en in- I
kubator ved 37°C, og dyrkningen blev udført ved 37°C i yderligere 5 timer under I
51 DK 175604 B1 omrystning til ekspression af et hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid HPA24L-gen.
En del af dyrkningsvæsken svarende til S OD6oo blev overført til plastcentrifugerør 5 og centrifugeret for at indsamle cellerne. Cellerne blev suspenderet i 1,0 ml af en buffer, som indeholdt 0,1M NaCI og 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), og suspensionen blev sonikeret for at sprænge cellerne. Den sonikerede suspension blev derefter centrifugeret til isolering af den uopløselige fraktion. En mængde af den uopløselige fraktion svarende til 1 OD6oo blev underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese 10 på sædvanlig måde. Resultatet er vist i fig. 23, hvor bane 2 viser proteinsammensætningen fra den uopløselige fraktion, og bane 1 viser proteinsammensætningen i supernatanten.
Desuden blev en mængde af den uopløselige fraktion svarende til 4 OD600 suspen-15 deret i 160 μΙ af en opløsning indeholdende 6M guanidin-hydrochlorid og 25 mM Tris-HCI (pH 8,0), og suspensionen lodes henstå ved stuetemperatur i 30 minutter. Suspensionen blev derefter indstillet til en slutkoncentration på 50 mM Tris-HCI (pH
8,0), 1M guanidin-hydrochlorid, 2 mM reduceret glutathion, 0,2 mM oxideret glutathion, 1 mM EDTA og 0,01% Tween 80 og lodes henstå i 15 timer ved stue-20 temperatur til dannelse af en råekstrakt.
Eksempel 19. Bestemmelse af aktivitet i HPA24L-råekstrakt under anvendelse af syntetisk substrat S-2444 25 10 μΙ af den i eksempel 18 fremstillede HPA24L råekstrakt sattes til en buffer, som indeholdt 0,1M Tris-HCI (pH 8,0) og 0,01% Triton X-100 til et samlet volumen på 99 μΙ. Til blandingen sattes 1 μΙ af en 1 μg/μl plasminopløsning, og der hele blev inkuberet ved 37°C i 15 minutter og derefter tilsat 1 μΙ sojabønnetrypsininhibitor-opløsning. Blandingen blev fuldstændigt blandet. Blandingen tilsattes derefter 0,7 30 ml af en buffer, som indeholdt 2 mM syntetisk substrat X-2444 og 0,1M Tris-HCI (pH 8,0) og 0,01% Triton X-100, og blandingen blev inkuberet ved 37°C i 30 minutter, hvorefter der tilsattes 100 μΙ iseddike for at standse reaktionen.
Reaktionsblandingens absorbans blev målt ved 405 nm. Enzymaktivitet i reak-35 tionsblandingen blev beregnet i henhold til formlen:
DK 175604 B1 I
International enhed (I.U.) = (OD40S/of395) x s,S, I
og der vandtes ca. 120 I.U. enzymaktivitet. I
Eksempel 20. Ekspression oq ekstraktion af andre hybride plasminooenaktivator- I
Manende ppivpeotider H
Der anvendtes samme metode som beskrevet i eksempel 18 og 19 for H
10 plasmiderne pHA21L, pHAHL, pHA14L, pHAOlL og pHA04L, og der H
blev opnået tilsvarende resultater som dem, der er beskrevet i eksempel 18 og 19. H
53 DK 175604 B1
Bibliog rafi 1) Japansk offentliggprelsesskrift hr. 60-241889.
2) J.M. Chirgwin, A.E. Przybyla, R.J. MacDonald og W.J. Rutter, Biochemistry, 18, 1979, s. 5294-5299.
3) H. Aviv og P. Leder, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 1972, s. 1408-1412.
4) H. Okayama og P. Berg, Molec. Cell Biol.,. 2, 1982, s. 101-170.
5) M.V. Norgard, Gene, 3, 1978, s. 279-292.
6) D. Pennica, Nature, 301, 1983, s. 214-221.
7) D.T. Denhart, Biochem. Biophys. Res. Commun., 23, 1966, s.
643-646.
8) A.M. Max am og W. Gilbert, Methods Enzymol., 65, 1980, s.
499-560.
9) T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook, i Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
1982, s. 254.
10) H.C. Birnboim og J. Doly, Nucl. Acids Res., 7, 1979, s.
1513-1523.
11) G.J. Steffens, W.A. Gtienzler, F. Getting, E. Frankus og L.
Flohé, Z. . Hoppe-Seyler's Physiol. Chem., 363, 1982, s. 1043-1058.
12) W.A. Gtienzler, supra, 1982, s. 1055.
13) M. Grunstein og D.S. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72, 1975, s. 3961-3965.
14) J. Messing, R. Grec og P.H. Seeburg, Nucl. Acids Res., 9, 1981, s. 309-321.
15) K.L. Agarwall, J. Brun stedt og B.E. Noyes, J. Biol. Chem., 256, 1981, s. 1023-1028.
16) A.G. Stewart, H. Richards, S. Roberts, J. Marwick, K. Edwards, I. Bell, J. Smith og R. Derbyshire, Nuc. Acids Res., 11, 1983, s. 6597-6609.
17) J. Brousius, A. Ullrich, M.A. Raker, A. Grey, T.J. Dull, R.R. Gutell og H.F. Noller, Plasmid, 6, 1981, s. 112-118.
18) J. Brousius, Gene, 27, 1984, s. 151-160.
19) J. Brousius, Gene, 27, 1984, s. 161-172.
I DK 175604 B1 I
I 54 I
I 20) J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 1983, s. 20-78.
I 21) W.D. Benton og R.W. Davis, Science, 196, 1977, s. 180-182. I
Claims (21)
1. Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid, kendetegnet ved, at det omfatter et polypeptidområde, som er ansvarligt 5 for en fibrinaffinitet, som stammer fra et vævsplasminogenaktivatorpolypeptid, bundet med en peptidbinding til et polypeptidområde, der er ansvarligt for en enzymaktivitet, som stammer fra et prourokinasepolypeptid, hvor det hybride plasminogenaktivatorlignende polypeptid, efter aktivering, udviser både en fibrinaffinitet og en enzymaktivitet. 10
2. Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det polypeptidområde, som er ansvarligt for fibrin-affiniteten, består af ca. to kringler af et N-terminalt område fra et humant vævs-plasminogenaktivatorpolypeptid. 15
3. Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at de ca. to kringler er et polypeptidområde fra en N-terminal første serin til en 215. cystein eller en 219. glycin i et humant vævs-plasminogenaktivatorpolypeptid, beregnet fra den første aminosyre. 20
4. Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det polypeptidområde, der er ansvarligt for fibrinaffi-niteten, består af ca. én kringle fra et humant vævsplasminogenaktivatorpolypep-tid. 25
5. Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den ca. ene kringle er et polypeptidområde fra den 128. serin til den 215. cystein eller 219. glycin i en human vævsplasminogenakti-vator, beregnet fra den N-terminale aminosyre serin som den første aminosyre. 30
6. Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det polypeptidområde, som er ansvarligt for fibrinaffi-niteten, består af ca. én halv kringle fra et humant vævsplasminogenaktivator-polypeptid. 35 I 56 I DK 175604 B1 I
7. Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge krav 6, I I kendetegnet ved, at den ca. halve kringle er et polypeptid fra den 161. I I methionin til den 215. cystein eller 219. glycin i et humant vævsplasminogen- I I aktivatorpolypeptid, beregnet fra den N-terminale aminosyre serin som den første I I 5 aminosyre. I
8. Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge krav 1, I I kendetegnet ved, at det polypeptidområde, som er ansvarligt for enzym- I I aktiviteten, består af et C-terminalt enzymaktivitetsområde i et humant prouro- I I 10 kinasepolypeptid. I
9. Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge krav 8, I I kendetegnet ved, at det polypeptidområde, som er ansvarligt for enzym- I I aktiviteten, består af et polypeptidområde fra en 150. glutamin til en 411. leucin i I I 15 et humant prourokinasepolypeptid, beregnet fra den N-terminale aminosyre serin I I som den første aminosyre, idet den 157. phenylalanin eventuelt er erstattet med I I en sur aminosyre. I
10. Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge krav 8, I I 20 kendetegnet ved, at det polypeptidområde, som er ansvarligt for enzym- I I aktiviteten, består af et polypeptidområde fra en 132. alanin til en 411. leucin i en I I human prourokinase, beregnet fra en N-terminal aminosyre serin som den første I I aminosyre, idet den 157. phenylalanin eventuelt er erstattet med en sur amino- I syre, og/eller den 135. aminosyre lysin eventuelt er erstattet med en aminosyre, I I 25 som ikke er en basisk aminosyre. I
11. Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid ifølge krav 9 eller 10 I I kendetegnet ved, at den sure aminosyre er asparaginsyre, og den amino- I I syre, der ikke er en basisk aminosyre, er glutamin. I I 30 I
12. DNA-segment, som koder for det hybride plasminogenaktivatorlignende poly- I I peptid ifølge krav 1, hvor den DNA-del, der koder for det polypeptidområde, som er I I ansvarligt for fibrinaffiniteten, findes i den 5'-terminale side, og den DNA-del, der I I koder for det polypeptidområde, som er ansvarligt for enzymaktiviteten, findes i I I 35 den 3'-terminale side af DNA-segmentet. I DK 175604 B1
13. DNA-segment ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det DNA-område, der koder for det polypeptidområde, som er ansvarligt for fibrinaffmiteten, er en tilsvarende cDNA-del, der svarer til 5 mRNA, som stammer fra celler fra en human faryngal cancercellelinje Detroit 562.
14. DNA-segment ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det DNA-område, som koder for det polypeptidområde, der er ansvarligt for enzymaktiviteten, er en tilsvarende del af cDNA, der 10 svarer til mRNA, som stammer fra humane nyrevævsceller.
15. DNA-segment ifølge krav 14, kendetegnet ved, at et kodon, som koder for den 157. phenylalanin, er muteret til et kodon, som koder for en sur aminosyre, og/eller et kodon, der koder 15 for 135. lysin, er muteret til et kodon, som koder for en aminosyre, som ikke er en basisk aminosyre.
16. Plasmid, som indeholder DNA-segmentet ifølge krav 12, og som er i stand til at udtrykke polypeptidet. 20
17. Plasmid ifølge krav 16, som indeholder en tac-promotor/-operator og Shine-Dalgarno-sekvensen i det methapyrocatechasegen, der stammer fra Pseudomonas outida.
18. Plasmid ifølge krav 17, som er et plasmid pHAOO, deponeret under DSM3628, pHA03, deponeret under DSM3627, pHA20, deponeret under DSM3626, pHA23, deponeret under DSM3625, pH21L, deponeret under DSM3951, pHA24L, deponeret under DSM3952; pHA13, som indeholder et gen, der koder for et hybridt plasminogenaktivator-30 lignende polypeptid, hviket polypeptid, i den N-terminale halvdel, omfatter et polypeptidområde fra 128. serin til 219. glycin i den humane vævsplasminogenakti-vator, beregnet fra den N-terminale serin som den første aminosyre og, som den C-terminale halvdel deraf, et polypeptidområde fra 150. glutamin til 411. C-termi-nale leucin i human prourokinase, beregnet fra N-terminal serin som den første 35 aminosyre, hvor 157. phenylalanin er erstattet med asparaginsyre, under regu- DK 175604 B1 I lering af tac-promotoren/-operatoren og Shine-Dalgarno-sekvensen i det methapyrocatechasegen, der stammer fra Pseudomonas putida og kan udtrykke I det ovenfor nævnte hybride polypeptid, og som har den struktur, der er vist i fig. I 16; I 5 pHallL, der indeholder et gen, som koder for et hybridt plasminogenaktivator- I lignende polypeptid, der, som den N-terminale halvdel, omfatter et polypeptid- I område fra 128. serin til 215. cystein i human vævsplasminogenaktivator og, som I den C-terminale halvdel, et polypeptidområde fra 132. alanin til 411. C-terminale leucin i human prourokinase, beregnet fra N-terminal serin som den første amino- I 10 syre, hvor 135. lysin er erstattet med glutamin, under regulering af tac-promoto- I ren og Shine-Dalgarno-sekvensen i det methapyrocatechasegen, der stammer fra I Pseudomonas putida og kan udtrykke ovennævnte hybride polypeptid, og som har I den struktur, der er vist i fig. 21; pHAOlL indeholder et gen, der koder for et hybridt plasminogenaktivatorlignende I 15 polypeptid, der, som den N-terminale halvdel, omfatter et polypeptidområde fra I 161. methionin til 215. cystein i human vævsplasminogenaktivator beregnet fra N- I terminal serin som den første aminosyre og, som den C-terminale halvdel deraf, et I polypeptidområde fra 132. alanin til 411. N-terminale leucin i human prouorkinase, I beregnet fra N-terminal serin som den første aminosyre, hvor 135. lysin er erstat- I 20 tet med glutamin, under regulering af tac-promotoren/-operatoren og Shine- I Dalgarno-sekvensen i det methapyrocatechasegen, der stammer fra Pseudomonas I putida og kan udtrykke det ovenfor nævnte hybride polypeptid, og som har den I struktur, der er vist i fig. 22; I pHA14L, som er identisk med plasmidét pHAHL bortset fra, at kodonet for 157. I 25 phenylalanin er erstattet med kodonet for asparaginsyre; I eller I pHA04L, som er identisk med plasmidét pHAOlL bortset fra, at kodonet for 157. I phenylalanin er erstattet med kodonet for asparaginsyre. I
19. Escherichia coli transformeret med et plasmid ifølge krav 16. I
20. Fremgangsmåde til fremstilling af et hybridt plasminogenaktivatorlignende I polypeptid ifølge krav 1, hvilken fremgangsmåde omfatter dyrkning af E, coli ifølge I krav 19 samt isolering af polypeptidet fra et dyrket produkt. I
35 I
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1773486 | 1986-01-31 | ||
JP1773486 | 1986-01-31 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK50987D0 DK50987D0 (da) | 1987-01-30 |
DK50987A DK50987A (da) | 1987-08-01 |
DK175604B1 true DK175604B1 (da) | 2004-12-20 |
Family
ID=11951975
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK198700509A DK175604B1 (da) | 1986-01-31 | 1987-01-30 | Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0231883B1 (da) |
JP (1) | JP2589687B2 (da) |
DE (1) | DE3781420T2 (da) |
DK (1) | DK175604B1 (da) |
ES (1) | ES2043610T3 (da) |
SU (1) | SU1732814A3 (da) |
WO (1) | WO1987004720A1 (da) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4916071A (en) * | 1985-08-14 | 1990-04-10 | American Home Products Corporation | Poly-kringle plasminogen activator |
US5242819A (en) * | 1986-12-05 | 1993-09-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA molecules encoding hybrid proteins of tissue plasminogen activator and urokinase |
US5580559A (en) * | 1986-12-05 | 1996-12-03 | Ciba-Geigy Corporation | Hybrid plasminogen activator |
FI100106B (fi) * | 1986-12-05 | 1997-09-30 | Novartis Ag | Menetelmä plasminogeenin yksisäikeisen yhdistelmäaktivaattorin valmist amiseksi |
ZA879286B (en) * | 1986-12-16 | 1988-10-26 | Smith Kline Rit | New plasminogen activators |
WO1988005081A2 (en) * | 1986-12-30 | 1988-07-14 | Cetus Corporation | Novel plasminogen activator |
NL8700013A (nl) * | 1987-01-06 | 1988-08-01 | Leuven Res & Dev Vzw | Hybride plasminogeenactivatoren met verbeterde trombolytische eigenschappen en geneesmiddelen die deze plasminogeenactivatoren bevatten. |
NL8701021A (nl) * | 1987-04-29 | 1988-11-16 | Stichting Centraal Lab | Humane t-pa(u-pa) substitutie-mutant eiwitten, daarvoor coderend recombinant dna, getransfecteerde gastheercellen, bereiding van de mutant eiwitten, en farmaceutische preparaten. |
JP2561122B2 (ja) * | 1988-04-13 | 1996-12-04 | 寳酒造株式会社 | 機能性ポリペプチド |
JPH07143877A (ja) * | 1993-10-01 | 1995-06-06 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 新規なt−PA類似体 |
WO2021200922A1 (ja) * | 2020-03-31 | 2021-10-07 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | フィブリンクロットを溶解させることに適した融合タンパク質および当該融合タンパク質を含む医薬組成物 |
WO2023195535A1 (ja) * | 2022-04-08 | 2023-10-12 | 株式会社凜研究所 | フィブリンに結合する抗体および当該抗体を含むフィブリン溶解性タンパク質および当該タンパク質を含む医薬製剤 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GR79202B (da) * | 1982-05-05 | 1984-10-22 | Genentech Inc | |
GB8314362D0 (en) * | 1983-05-24 | 1983-06-29 | Celltech Ltd | Polypeptide and protein products |
JPS60136520A (ja) * | 1983-12-23 | 1985-07-20 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | フイブリン吸着性ウロキナ−ゼ複合体 |
GB8334498D0 (en) * | 1983-12-24 | 1984-02-01 | Beecham Group Plc | Compounds |
-
1987
- 1987-01-29 DE DE8787101209T patent/DE3781420T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-29 ES ES87101209T patent/ES2043610T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-29 EP EP87101209A patent/EP0231883B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-30 JP JP62018626A patent/JP2589687B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1987-01-30 WO PCT/JP1987/000065 patent/WO1987004720A1/en unknown
- 1987-01-30 DK DK198700509A patent/DK175604B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-01-30 SU SU874028997A patent/SU1732814A3/ru active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SU1732814A3 (ru) | 1992-05-07 |
JP2589687B2 (ja) | 1997-03-12 |
DK50987D0 (da) | 1987-01-30 |
DK50987A (da) | 1987-08-01 |
DE3781420T2 (de) | 1993-02-25 |
DE3781420D1 (de) | 1992-10-08 |
EP0231883A1 (en) | 1987-08-12 |
ES2043610T3 (es) | 1994-01-01 |
WO1987004720A1 (en) | 1987-08-13 |
EP0231883B1 (en) | 1992-09-02 |
JPS62272975A (ja) | 1987-11-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5147643A (en) | DNA sequences encoding human t-PA substituted at position 275 or at positions 275 and 277 and pharmaceutical compositions | |
FI88932C (fi) | Framstaellning av funktionellt maenskligt urokinasprotein | |
EP0405285B1 (en) | Novel plasminogen activator | |
KR0148575B1 (ko) | 효소원 또는 피브린 특이성을 갖는 조직 플라스미노겐 활성제 | |
JP2610783B2 (ja) | ポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およびそれを含有するベクター | |
DK175604B1 (da) | Hybridt plasminogenaktivatorlignende polypeptid | |
NO175158B (no) | Fremstilling av human livmorsvevplasminogenaktivator med rekombinant-DNA | |
EP0200451A1 (en) | Protease resistant urokinase composition, its production and use | |
PT96854A (pt) | Processo para a prparacao de vectores compostos para a expressao de formas zinogenias da proteina c humana | |
US7157596B2 (en) | Inhibitors of serine protease activity of matriptase or MTSP1 | |
DK175483B1 (da) | Enkeltkædehybridplasminogenaktivator, DNA-sekvens, som koder derfor, hybridvektor indeholdende DNA-sekvensen, eukaryotisk værtscelle transformeret med hybridvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af enkeltkædehybridplasminogenaktivatoren,...... | |
US5073494A (en) | Human tissue plasminogen activator substituted at position 275 or at positions 275 and 277 | |
EP0210279B1 (en) | Stabilized human prourokinase | |
PT96853A (pt) | Processo para a preparacao de vectores e compostos para a expressao de mutantes de glicosilacao da proteina c humana | |
CA1300534C (en) | Human pancreatic elastase | |
WO1989001513A1 (en) | Fast-acting prourokinase | |
US5204255A (en) | Hybrid tissue plasminogen activator/urokinase polypeptides | |
EP0440709B1 (en) | Thrombolytic agents with modified kringle domains | |
JPH02283282A (ja) | 尿プラスミノーゲン活性化因子の変異体、それらの製造および使用 | |
JP2736795B2 (ja) | 速効性プロウロキナーゼ | |
BG60507B2 (bg) | човешки тъканен плазминогенен активатор | |
JPH0552189B2 (da) | ||
IE861054L (en) | Protease resistant single-chain urokinase |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |