KR100270283B1 - 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제를 암호화하는 dna 분자 및 이를 이용하여 이종 단백질을 제조하는 방법 - Google Patents
이염기성 프로세싱 엔도프로테아제를 암호화하는 dna 분자 및 이를 이용하여 이종 단백질을 제조하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 변형되고, 소포체(ER)내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"를 암호화하는 DNA 분자 및 형질전환된 숙주내에서 이종 폴리펩타이드의 정확한 프로세싱을 위한 상기의 소포체내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 변형되고, 소포체에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제(dibasic processing endoprotease)"를 암호화하는 신규한 DNA 분자 및 형질전환된 숙주내에서 이종 폴리펩타이드의 정확한 프로세싱을 위한 상기의 소포체에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 용도에 관한 것이다.
빠르게 발전하는 생명공학 산업에 있어서 약제학적으로 적용가능하거나 효소적으로 활성인 단백질의 제조는 가장 중심 분야이다. 재조합 DNA 기술이 개발된 이래로, 많은 중요한 이종 단백질이 이를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 적합한 발현 벡터로 형질전환된 진핵 숙주 세포로부터 생산되고 분비되었다. 진핵 세포 발현 시스템에서 분비형 단백질을 생성하는데 있어서의 주요 문제점중의 하나는 잘못 폴딩(malfolding)되어 생물학적으로 불활성인 산물을 피하는 것이다.
현재, 진핵 세포로부터 분비되도록 예정된 단백질은 조면 소포체막(rough endoplasmic reticulum membrane ; rough ER membrane)에 위치된 효소인 시그날 펩티다제에 의해 절단되는 시그날 서열의 존재에 기인하여 소포체 (ER)로 전위(translocate)된다고 일반적으로 받아들여지고 있다. 이어서, 이 단백질은 ER로부터 골지체로 이동되고 골지체 기원한 분비 소포를 경유하여 세포 표면으로 이동된다[참조: S. Pfeffer and J. Rothman, Ann. Rev. Biochem. 56: 829-52, 1987]. 정확히 프로세싱되고 정확히 폴딩된 단백질을 생성하는데 있어서의 또 다른 주요단계는, 골지체 및 분비 소포에서 프로단백질을 성숙한 형태로 전환시키는 것이다. 프로단백질의 절단은 소위 이염기성 부위, 즉 2개 이상의 염기성 아미노산으로 이루어진 모티프(motif)에서 일어난다. 이러한 프로세싱은 골지체에 위치하고 있는 효소, 소위 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"에 의해 촉매된다.
단백질 전구체의 프로세싱에 관여하는 상이한 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제, 예를 들어 포유동물의 프로테아제인 푸린, PC2, PC1 및 PC3, 및 효모 YAP3 유전자의 산물 및 효모 yscF(또한 KEX2 유전자 산물로도 불리운다: 본 명세서에서는 KEX2p로 언급된다)는 공지되어 있다.
KEX2p는 효모 교배 페로몬 α-인자의 성숙에 관여한다 [참조: J. Kurjan and I. Hershkowitz, Cell 30: 933-943, 1982]. α-인자는 세포 표면으로 이동되는 동안 프로세싱되는 165개의 아미노산 전구체로서 생성된다. 제1 단계에서는, 19개 아미노산 시그날 서열(프레-서열)이 시그날 펩티다제에 의해 절단된다. 이어서, 이 전구체는 글리코실화되어 66개의 아미노산 프로서열이 KEX2p에 의해 절단되는 골지체로 이동한다. α-인자 프레 프로-서열은 또한 α-인자 "리더(leader)" 서열로도 공지되어 있다. 골지체내의 제 2의 프로테아제, 즉 KEX1 유전자 생성물은 단백질의 최종적인 성숙에 관여한다.
KEX2p는 KEX2 유전자에 의해 암호화되며 N-말단의 촉매 도메인, Ser/Thr가 풍부한 도메인, 막-스패닝 도메인(membrane-spanning domain) 및 골지체에 국재화(Golgi localization)하는데 관련되는, C-말단 테일로 이루어진다. Ser/Thr이 풍부한 도메인, 막-스패닝 도메인 및 C-말단 테일을 포함하나, 200개의 C-말단 아미노산이 결핍된 돌연변이체 KEX2p 효소는 KEX2p 프로테아제 작용, 즉 Lys-Arg 또는 Arg-Arg와 같은 염기성 아미노산 쌍의 C-말단면에서의 절단 작용을 지닌다[참조: Fuller et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci 86, 1434-1438; Fuller et al., 1989, Science 246, 482-485].
효모 α-인자 리더 서열과 같은 리더 서열은 진핵 세포에서 분비형 이종 단백질의 생성에 널리 사용된다. 그러나, 많은 경우, 단백질, 특히 저분자량 단백질의 경우에 있어서의 잘못된 폴딩 및 응집에 의해 상당량의 생물학적 불활성 단백질이 생성되므로 많은 어려움이 있다.
놀랍게도, 숙주 세포가 소포체(ER)내에서 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제" 활성을 갖는 경우, 생물학적으로 불활성인 잘못 폴딩된 단백질에 대해 생물학적으로 활성인 정확하게 폴딩된 이종 단백질이 숙주 세포내에서 높은 비율로 생성된다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 목적은 ER내에 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"를 갖는 숙주 세포를 사용함을 포함하는, 이종의 생물학적 활성 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제" 변이체를 암호화하는 유전자를 사용한 형질전환에 의해서 ER내에 위치된 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제" 변이체를 갖는 숙주 세포를 제공하고, 또한 이러한 유전자를 포함하는 DNA 분자를 제공하며, 이러한 DNA 분자 및 이러한 숙주 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
[이종 단백질의 제조방법]
본 발명은 ER내에 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제" 활성을 갖는 숙주 세포를 사용함을 포함하는, 프로단백질로부터 숙주 세포내에서 유리된 이종의 생물학적 활성 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 의미내에서 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제" 활성은, 예를 들어 Arg-Arg, Arg-Lys, Lys-Arg 또는 Lys-Lys와 같은 2개의 염기성 아미노산의 모티프에 특이적인 엔도프로테아제의 활성이며, 여기에서 엔도프로테아제는 원래 골지체에 위치하고, 프로단백질 또는 폴리단백질의 프로세싱에 천연적으로 관여한다.
용어 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"는 예를 들어 푸린, PC2, PC1, PC3와 같은 포유동물 기원의 진핵세포 효소[참조: Barr, Cell 66:1-3, 1991), 바람직하게는 YAP3 엔도프로테아제와 같이 효모로부터 기원한 효소[참조: Egel-Mitani et al., Yeast 6:127- 137 (1990)], 및 가장 바람직하게는 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 엔도프로테아제 KEX2p를 포함한다.
본 발명의 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 생물학적 활성 변이체는 골지체에만 제한된 것이 아니고, ER 보유 시그날(ER retention signal)의 존재, 즉 ER내의 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 보유에 적합한 구조에 기인하여 ER내에도 위치한다. 천연적으로 존재하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"는 막 앵커(anchor), 즉 소수성의 막-스패닝 서열에 의해서 골지체 또는 분비 소포의 막에 부착된다. ER 보유 시그날은 단백질, 즉 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 C-말단에 결합되어야만 프로테아제를 ER내에 위치시킨다. 이러한 융합 단백질은 프로테아제 및 ER 보유 시그날로 이루어지며 이하에서 "ER내에 위치하는 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"로 명명한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, ER 보유 시그날은 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제의 가용성 형태, 즉 세포막에 부착되지 않은 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 변이체의 C-말단에 부착된다. 이러한 가용성 형태는 소수성의 막-스패닝 서열이 결여되어 있으나 여전히 통상적인 효소의 "이염기성 프로세싱" 작용을 보유한다.
본 발명에 유용한 가용성의 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 바람직한 예는 가용성 에스. 세레비지애 KEX2p, 즉 영역 Tyr679내지 Met699에 위치하는 소수성의 막-스패닝 서열이 결여된 KEX2p 변이체이다{814개 잔기의 에스. 세레비지애 KEX2p의 아미노산 서열은 문헌[참조: K. Mizuno et al., Biochem. Biophys, Res. Commun. 156, 246-254 (1988)]에 공지되어 있다}. 특히, 본 발명에 따른 가용성 KEX2p 엔도프로테아제에서, 막 결합 부위는 선택적으로 제거된다. 따라서, 예를 들어 700번 아미노산(Lys)으로 시작하는 C-말단이 여전히 존재하거나, 막 결합 부위를 포함한 전체 C 말단, 즉 C-말단으로부터 136 내지 약 200개의 아미노산이 제거된다. 이러한 가용성의 KEX2p 단백질은 예를 들어 문헌[참조: 유럽 특허 제 327,377호 또는 문헌[참조: R.S. Fuller et al., Proc. Natl, Acad. Sci USA 86, 1434-1438 (1989)]에 기술되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 가용성의 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"는 서열 목록에 서열 동정 번호 1로 나타낸 서열을 갖는 가용성 KEX2p이며 이하에서는 KEX2ps로 언급된다.
ER-보유 시그날은 ER내에서 폴리펩타이드의 위치를 결정하는 구조이다. ER내의 위치는 ER막에 대한 특이적 부착 또는 골지체와 ER사이의 구획으로부터 ER 루멘내로 폴리펩타이드의 재이동에 의한 가용성 단백질의 골지체로의 이동방지를 기초로 할 수 있다. 본 발명에 바람직하게 사용되는 ER 보유 시그날은 후자 유형, 즉 가용성 단백질이 골지체로 이동하는 것을 방지하는 유형에 속한다.
이러한 ER 보유 시그날의 바람직한 예는 포유동물 세포에서 작용성인 소위 KDEL 서열(서열 동정 번호 3)이다. 보다 바람직한 것은 효모 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)내에서 작용성인 DDEL 서열(서열 동정 번호 4)이고 가장 바람직한 것은 에스. 세레비지애 및 케이. 락티스(K. lactis)내에서 작용성인 HDEL 서열(서열 동정 번호 2)이다.
"ER내에 위치하는 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 바람직한 형태는 예를 들어, 포유동물 세포의 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"[예: 푸린, PC1, PC2 또는 PC3(참조: P. J. Barr. supra)], 또는 바람직하게는 이의 가용성 변이체, 또는 에스. 세레비지애 KEX2p(이는 포유동물 세포에서 작용성인 것으로 공지되어 있다), 또는 바람직하게는 이의 가용성 변이체에 부착된 ER-보유 시그날 KDEL 서열을 포함한다. 이러한 "ER내에 위치하는 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제", 예를 들어, 푸린KDEL, PC1KDEL, PC2KDEL, PC3KDEL 또는 KEX2pKDEL 효소가 이종 단백질의 발현을 위한 유전자로 형질전환된 포유동물 숙주 세포내에서 생성되는 경우, 정확히 폴딩된 분비형 이종 단백질이 보다 높은 비율로 생성된다.
보다 바람직하게는, DDEL 보유 시그날을 케이. 락티스 KEX2p 동족체 또는 바람직하게는 이의 가용성 변이체, 또는 에스. 세레비지애 KEX2p 또는 바람직하게는 이의 가용성 변이체, 특히 KEX2ps에 융합시킨다. 에스. 세레비지애 KEX2p는 또한 케이. 락티스에서 작용성이다. 케이. 락티스 숙주 세포에서 생성된 이러한 KEX2pDDEL은 정확히 폴딩된, 분비형 이종 단백질이 보다 높은 고비율로 발현되도록 한다.
가장 바람직하게는, HDEL 보유 시그날을 에스. 세레비지애 KEX2p, 또는 바람직하게는 이의 가용성 변이체, 특히 KEX2ps에 융합시킨다. 케이. 락티스, 또는 보다 바람직하게는 에스. 세레비지애 숙주 세포내에서 생성된 이러한 KEX2pHDEL 단백질은 정확히 폴딩된, 분비형 이종단백질이 보다 높은 비율로 발현되도록 한다.
"ER내에 위치하는 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"가 생성되는 숙주세포를 제조하기 위해서는, 숙주 세포를 "ER내에 위치하는 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"를 암호화하는 발현 카세트로 형질전환시켜야 한다. 형질전환된 숙주 세포는 염색체상에 내인성의 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제에 대한 완전한 내인성 유전자를 여전히 포함할 수 있으며 즉, 에스. 세레비지애 시스템의 경우, KEX2pHDEL로 형질전환될 숙주 세포는 KEX2+세포, 예를들면, 균주 AB110일 수 있다. 그러나, 상응하는 내인성의 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자는 또한 파괴될 수도 있는데, 즉 에스. 세레비지애 시스템의 경우 숙주 세포는 Kex2-세포, 예를들어, 균주 AB110 kex2-일 수 있다.
숙주 세포를 형질전환시키기 위해서는, "ER내에 위치하는 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"를 암호화하는 발현 카세트의 복제 및 발현용으로 제공된 하이브리드 벡터가 사용된다. 이들 하이브리드 벡터는 염색체외적으로 유지되는 벡터이거나 숙주 게놈내에 통합되는 벡터이므로, 이러한 발현 카세트로 안정하게 형질전환된 세포가 생성된다. 적합한 염색체외적으로 유지되는 벡터 및 또한 포유동물 세포 또는 효모 세포의 형질전환을 숙주 게놈내로 통합시키는 벡터는 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
하이브리드 벡터는 바이러스, 플라스미드 또는 염색체 DNA, 예를 들어 SV40, 포진-바이러스, 유두종 바이러스, 레트로바이러스 또는 배큘로바이러스의 유도체, 또는 효모 플라스미드(예: 효모 2μ 플라스미드)의 유도체와 같은 유전공학 분야에서 유용한 모든 벡터로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 클로닝된 DNA를 통합시키고 발현시키기 위해서는 수개의 가능한 벡터 시스템이 이용가능하다. 원칙적으로, 선택된 숙주내에서 본 발명의 발현 카세트내에 포함된 목적하는 폴리펩타이드 유전자를 복제하고/하거나 발현하는 모든 벡터가 적합하다. 이 벡터는 형질전환을 위해 선택한 숙주 세포에 따라 선택된다. 이와같은 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 세포(포유동물 세포내에서 작용성인 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"가 사용되는 경우), 또는 보다 바람직하게는 효모 세포(효모 세포내에서 작용성인 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"가 사용되는 경우)이다. 원칙적으로, 본 발명의 염색체외적으로 유지되는 하이브리드 벡터는 ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 발현용 발현 카세트, 및 복제 기원 또는 자발적인 복제 서열을 포함한다.
복제 오리진(origin) 또는 자발적인 복제 서열(염색체 외적인 성분에 대해 자발적으로 복제하는 능력을 부여하는 DNA 성분)은, 예를 들어, 포유동물 벡터의 경우에는, 시미안 바이러스(SV40) 또는 다른 바이러스 원으로부터 기원한 외인성 오리진을 포함하도록 벡터를 작제하거나, 숙주 세포 염색체 기작에 의해 제공된다.
본 발명의 하이브리드 벡터는 형질전환되고, 선별되어 클로닝되는 숙주에 따라 선별 마커를 포함할 수 있다. 마커의 표현형적 발현에 기인하여 형질전환체의 선별을 용이하게 하는 어떠한 마커 유전자도 사용될 수 있다. 적합한 마커는 특히 예를 들어 테트라사이클린 또는 암피실린에 대한 항생제 내성을 나타내는 마커, 또는 숙주 병변을 보완하는 유전자이다. 또한, 형질전환될 숙주가 마커에 의해 발현된 생성물에 대해 영양 요구성인 경우 자발적인 복제 단편과 결합된 구조 유전자를 마커로서 사용할 수 있다.
본 발명의 하이브리드 벡터를 제조하는데 적합한 벡터, 즉 ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"를 제조하기 위한 발현 카세트를 포함하는 벡터는, 에스. 세레비지애내에서의 복제 및 발현에 적합하고 효모-복제 오리진 및 효모용 선별 유전자 마커를 포함하는 벡터이다. 효모 복제 오리진, 예를 들어 염색체성 자발적 복제 단편(ARS)을 포함하는 하이브리드 벡터는 형질전환후에 효모 세포내에 염색체외적으로 보유되고 체세포 분열동안 자발적으로 복제된다. 또한, 효모 2μ 플라스미드 DNA에 상동인 서열을 포함하거나 ARS 및 염색체 센트로미어(centromere)의 서열(예: CEN4)을 포함하는 하이브리드 벡터를 사용할 수 있다. 완전하거나 부분적인 에스. 세레비지애 2μ 플라스미드 서열을 포함하는 2μ 기본 플라스미드가 바람직하다. 효모용으로 적합한 마커 유전자는 특히 숙주에 항생제 내성을 부여하는 유전자, 또는 영양 요구성 효모 돌연변이체의 경우 숙주 병변을 보완하는 유전자이다. 상응하는 유전자는, 예를 들어 항생제 사이클로헥스이미드에 대한 내성을 제공하거나, 영양 요구성 효모 돌연변이체에 자가 영양성을 제공하는 유전자, 예를 들어 URA3, LEU2, HIS3 또는 TRP1 유전자이다.
바람직하게, 하이브리드 벡터는 추가로 세균 숙주, 특히 이. 콜라이에 대한 복제 오리진 및 마커 유전자를 포함하므로, 하이브리드 벡터 및 이의 전구체의 작제 및 클로닝을 이. 콜라이에서 수행할 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 양태에서는, 에스. 세레비지애의 Kex2-균주를 가용성 KEX2pHDEL의 발현용 발현 카세트를 포함하는 염색체외적으로 유지되는 플라스미드 또는 통합 플라스미드로 형질전환시킨다.
ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 발현을 위한 "발현 카세트"는 이러한 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 DNA 서열을 의미하며, 프로모터 및 구조 유전자와 경우에 따라, 전사 터미네이터 및 임의의 전사 인핸서, 리보소옴 결합 부위 및/또는 추가의 조절 서열을 포함한다.
이러한 발현 카세트는 상응하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제" 유전자, 이종 조절 성분 또는 이들의 혼합물, 즉, 예를 들어 동종 프로모터 및 이종 터미네이터 영역과 천연적으로 연결된 조절 성분들을 포함할 수 있다.
숙주 세포의 특성에 따라, 광범위한 프로모터 서열들이 사용될 수 있다. 해독개시용 서열은 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열이다. 전사의 개시 및 종결과 mRNA를 안정화하는데 필요한 서열은, 예를 들어 발현 숙주로부터의 바이러스성 또는 진핵성 cDNA의 비암호화 5'-영역 및 3'-영역 각각으로부터 통상적으로 이용가능하다.
상기와 같은 프로모터의 예는, 즉, 효모 TRP1-, ADHI-, ADHII-, CYC1, GAL1/10, CUP1, PHO3- 또는 PHO5-프로모터, 또는 열 쇼크 단백질로부터의 프로모터, 또는 해당 프로모터(glycolytic promoter){예: 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAP) 프로모터[5' 트렁케이트된(truncated) GAP 포함] 또는 에놀라제, 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK), 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈이소머라제, 및 글루코키나제 유전자의 프로모터}, 추가로 α-인자 프로모터 및 하이브리드 프로모터(예: 하이브리드 PHO5-GAP 또는 ADH2-GAP 프로모터 또는 열 쇼크 성분을 사용하는 하이브리드 프로모터)이다.
포유동물 세포에서의 발현에 적합한 프로모터는, 예를 들어 바이러스(예: SV40, 라우스가계 육종 바이러스, 아데노 바이러스 2, 소 유두종 바이러스, 파포바 바이러스, 사이토메갈로 바이러스)로 부터 기원한 프로모터, 또는 포유동물 세포로부터 기원한 프로모터(예: 액틴, 콜라겐, 미오신 또는 β-글로빈 유전자의 프로모터)이다. 효모 프로모터는 인핸서 서열[예: 효모 상부 활성화 서열(UAS)]과 결합될 수 있으며 포유동물 세포에서 활성인 프로모터는 바이러스 또는 세포성 인핸서(예: 사이토메갈로 바이러스 IE 인핸서, SV40 인핸서, 면역글로블린 유전자 인핸서 등)과 결합될 수 있다.
인핸서는, 예를 들어 시미안 바이러스, 폴리오마 바이러스, 소 유두종 바이러스 또는 몰로니 육종 바이러스와 같은 바이러스로부터 기원한 전사-자극 DNA 서열, 또는 게놈성 오리진의 전사-자극 DNA 서열이다. 인핸서 서열은 또한 피사룸 폴리세팔룸(Physarum polycephalum)의 염색체외 리보좀 DNA로부터 유도될 수 있거나, 효모 산 포스파타제 PHO5 유전자, 또는 효모 PHO5, TRP 또는 PHO5-GAPDH 하이브리드 또는 기타 프로모터로부터의 상부 활성화 부위일 수 있다.
ER내에 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제" 활성을 갖는 본 발명의 숙주 세포는 정확히 프로세싱된 이종 단백질의 제조에 유용하다. 이러한 목적상, 목적하는 이종 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 위한 발현 카세트도 또한 당연히 숙주 세포내로 도입된다. 이러한 발현 카세트를 "생성 유전자"라 칭한다.
이러한 생성 유전자는 프로모터 영역, 시그날 펩티다제에 의해 분해될 수 있는 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열, "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"에 의해 목적하는 이종 유전자 생성물로부터 분해될 수 있는 프로-서열을 암호화하는 DNA 서열, 목적하는 이종 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 서열 및/또는 전사 터미네이터 영역 및 임의로 전사 인핸서, 리보소옴 결합 부위 및/또는 추가의 조절 서열을 포함한다. 시그날 펩타이드에 대한 암호화 영역, 프로-서열 및 이종 단백질은 "프레임 방향으로(in frame)" 부착된다(즉, 시그날 펩타이드는 프로-서열의 N-말단에 공유적으로 결합된 구조 유전자의 해독 이후에 해독되며, 프로-서열은 이종 단백질의 N-말단에 공유적으로 결합된 유전자의 해독 이후에 해독된다).
프로-서열은 분자 샤페론(chaperone), 즉 시스 또는 트랜스 형태로 적합한 구조를 형성하는데 영향을 미칠 수 있는 폴리펩타이드로서 작용할 수 있는 단편들의 랜덤 게놈성 라이브러리로 부터의 서열일 수 있다. 바람직하게는, 막 전위를 가능케하는 랜덤 서열이다. 특히, α-인자 프로서열이 바람직하다.
"이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 발현을 위한 상술된 발현 카세트에와 같이, 숙주 세포의 특성에 따라 각종 조절 서열이 사용될 수 있다. 예를 들어, 강력하면서도 동시에 잘 조절되는 프로모터가 가장 유용하다. 해독 개시를 위한 서열은 예를 들어 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarne seguence)이다. 전사의 개시 및 종결과 mRNA의 안정화에 필요한 서열은 통상, 예를 들어 발현 숙주로부터의 바이러스 또는 진핵성 cDNA의 각각 비암호화 5'-영역 및 3'-영역으로부터 입수가능하다.
본 발명의 의미상 시그날 펩타이드는 목적하는 펩타이드가 ER로 전위되도록 지시하는 프레서열, 즉 α-인자 시그날 서열이다. 추가의 시그날 서열이 문헌으로부터 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌[참조: von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14, 4683(1986)]에 편집된 것들이다.
적합한 프로모터에 대한 예는 상기한 것, 즉 효모 TRP1-, ADH1-, ADHII-, CYC1, GAL1/10, CUP1, PHO3- 또는 PHO5-프로모터, 또는 열 쇼크 단백질로부터의 프로모터, 또는 해당 프로모터[예: 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAP) 프로모터(5' 트렁케이트된 GAP 포함) 또는 에놀라제, 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제 유전자의 프로모터], 추가로 α-인자 프로모터 및 하이브리드 프로모터[예: 하이브리드 PHO5-GAP 또는 ADH2-GAP 프로모터 또는 열 쇼크 성분을 이용한 하이브리드 프로모터] 또는 진핵성 바이러스로부터 기원한 프로모터(예: SV40, 라우수가계 육종 바이러스, 아데노 바이러스 2, 소 유두종 바이러스, 파포바바이러스, 사이토메갈로바이러스 기원한 프로모터) 또는 포유동물 세로로부터 기원한 프로모터(예; 액틴, 콜라겐, 미오신 또는 β-글로빈 유전자의 프로모터)이다. 진핵성 프로모터는 예를 들어 효모 상부의 활성화 서열(UAS)과 같은 인핸싱 서열 또는 예를 들어 사이토메갈로 바이러스 IE 인핸서, SV40 인핸서, 면역글로블린 유전자 인핸서 등과 같은 바이러스성 또는 세포성 인핸서와 결합될 수 있다.
ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제" 및 생성 유전자를 암호화하는 발현 카세트는 동일하거나 상이한 유형의 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들은 이종 단백질의 전구체 및 이를 프로세싱하는 ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"의 협조된 발현을 가능케하는 유도성 프로모터에 의해 모두 조절될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제", 바람직하게는 YAP3pHDEL, 보다 바람직하게는 KEX2pHDEL, 또는 가장 바람직하게는 KEX2pHDEL을 포함하는 에스. 세레비지애 세포내에서의 발현에 적합한 생성 유전자는 효모 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"에 의해 전구체로부터 분해될 수 있는 효모 프로-서열을 암호화하는 DNA 서열, 바람직하게는 에스. 세레비지애 α-인자 리서 서열 및 목적하는 이종 단백질을 암호화하는 하부의 DNA 서열로 이루어진 구조적 융합 유전자(이러한 융합 유전자는 효모에서 전사 및 해독을 조절하는 발현 조절 서열의 조절하에 있다)를 포함한다.
이종 단백질은 원핵세포 또는 특히 진핵세포, 특히 고등 진핵세포, 예를 들어 포유동물(동물 및 사람 포함)세포의 단백질 및 생물학적 관심 대상의 단백질일 수 있으며, 예를 들면 영양물 생산 및 화학 또는 분자 생물학에서의 효소 반응을 수행하는데 사용될 수 있는 효소, 또는 사람 및 동물 질환의 치료 또는 이의 예방에 유용하고 가치있는 단백질, 예를 들어 호르몬; 면역조절, 항-바이러스 및 항 종양 특성을 갖는 폴리펩타이드; 항체; 바이러스 항원; 혈액 응고 인자; 피브린 분해제; 성장조절인자; 추가로 식료품 등이다.
이러한 단백질의 예는, 호르몬(예: 세크레틴, 티모신, 렐락신, 칼시토닌, 황체화 호르몬, 상피소체 호르몬, 아드레노코르티코트로핀, 멜라노사이트-자극 호르몬, β-리포트로핀, 우로가스트론, 인슐린), 성장인자[예: 표피 성장인자(EGF), 인슐린-형 성장인자(IGF)(예: IGF-1 및 IGF-2), 유방 세포 성장인자, 신경 성장인자, 신경교로부터 기원한 신경 세포 성장인자, 혈소판에서 기원한 성장인자(PDGF) 또는 형질전환 성장인자(TGF)(예: TGF β), 성장 호르몬(예: 사람 또는 소 성장 호르몬), 인터루킨(예: 인터루킨-1 또는 -2), 사람 대식세포 이주 억제 인자(MIF), 인터페론[예: 사람 α-인터페론(예: 인터페론-αA, αB, αD 또는 αF), β-인터페론, γ-인터페론 또는 하이브리드 인터페론(예: αA-αD- 또는 αB-αD-하이브리드 인터페론, 특히 하이브리드 인터페론 BDBB)], 프로테이나제 억제제(예: α1-안티트립신, SLPI 등), 간염 바이러스 항원(예: B형 간염 바이러스 표면 또는 코어 항원 또는 A형 간염 바이러스 항원, 또는 A형과 B형이 아닌 간염 바이러스 항원), 플라스미노겐 활성인자(예: 조직 플라스미노겐 활성인자 또는 우로키나제), 하이브리드 플라스미노겐 활성인자(예: K2tuPA), 진드기 항응고 펩타이드(TAP), 종양 괴사 인자, 소마토스타틴, 레닌, 면역글로블린(예: 경쇄 및/또는 중쇄의 면역글로블린 D, E 또는 G, 또는 사람-마우스 하이브리드 면역글로블린), 면역글로블린 결합 인자(예: 면역 글로블린 E 결합 인자), 사람 칼시토닌-관련된 펩타이드, 혈액 응고 인자(예: 인자 IX 또는 VIIIc), 혈소판 인자 4, 에리트로포이에틴, 에글린(예: 에글린 C), 데설파토히루딘(예: 데설파토히루딘 변이체 HV1, HV2 또는 PA), 코르티코스타틴, 에키스타틴, 시스타틴, 사람 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 바이러스성 티미딘 키나제, β-락타마제 또는 글루코스 이소머라제이다. 사람 α-인터페론(예: 인터페론 αB), 또는 하이브리드 인터페론, 특히 하이브리드 인터페론 BDBB(참조: 유럽 특허 제 205,404호), 사람 조직 플라스미노겐 활성인자(t-PA), 사람 일본쇄 우로키나제-형 플라스미노겐 활성인자(scu-PA), 하이브리드 플라스미노겐 활성인자 K2tuPA(참조: 유럽 특허 제277, 313호), 사람 칼시토닌, 데설파토히루딘(예: 변이체 HV1)이 바람직하며, 인슐린-관련된 단백질(예: 인슐린, 렐락신)이 보다 바람직하고, 인슐린-형성장 인자 II가 보다 더 바람직하며, 특히 인슐린-형 성장 인자 I이 가장 바람직하다. 단백질 표면에 노출되어 단백질 분해적 분해가 이루어질 수 있는 한쌍의 염기성 아미노산(예: Arg-Arg, Lys-Arg, Lys-Lys 및 Arg-Lys)를 포함하는 단백질은, 본 발명에 따른 방법에 적합하지 않으므로 돌연변이시켜 하나의 연속적인 염기성 아미노산이 생물학적 활성에 영향을 미치지 않으면서 다른 비-염기성 아미노산으로 대체되도록 한다.
생성 유전자는 ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"를 암호화하는 유전자와 동일한 벡터 분자상에 반드시 위치될 필요가 없다. 이러한 경우, ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"는 염색체외적으로 유지되는 벡터상에 위치하며, 생성 유전자가 동일한 벡터 분자상에 위치되는 경우 유리할 수 있다.
생성 유전자의 발현에 적합한 발현 벡터는, 예를들어 ER-위치된 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제의 발현에 적합한 것으로 상술된 것들, 즉, 예를 들어 바이러스, 플라스미드 또는 염색체 DNA[예: SV40, 포진-바이러스, 유두종 바이러스, 레트로바이러스 또는 배큘로바이러스의 유도체, 또는 효모 플라스미드(예: 효모 2μ 플라스미드)의 유도체]로부터 유전 공학 분야에서 유용한 모든 벡터로부터 기원한 벡터이다. 에스. 세레비지애에서의 복원 및 발현을 위한 벡터가 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 하이브리드 벡터는 또한 복제 오리진 및 세균 숙주, 특히 이. 콜라이용 마커 유전자를 포함하므로, 하이브리드 벡터 및 이의 전구체의 작제 및 클로닝을 이.콜라이에서 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 ER내에서 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제" 활성을 갖는 숙주 세포의 사용을 포함한 이종의 생물학적 활성 단백질의 제조 방법은 (a) ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 하이브리드 벡터 및 생성 유전자를 암호화하는 하이브리드 벡터를 사용하여 적합한 숙주 세포를 형질전환시키거나, (b) ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제" 및 생성 유전자를 암호화하는 발현 카세트 모두를 포함하는 하이브리드 벡터로 적합한 숙주 세포를 형질전환시키거나, 또는 (c) ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"를 암호화하는 유전자로 안정하게 형질전환된 적합한 숙주 세포를 생성 유전자를 암호화하는 하이브리드 벡터로 형질전환시키는 단계, 형질전환된 숙주 세포를 ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제" 및 생성 유전자를 암호화하는 유전자가 발현되는 조건하에서 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 통상의 방법에 따라 목적하는 이종 폴리펩타이드를 분리시킴을 포함한다.
본 발명은 바람직하게는 효모 균주, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 균주(예: AB110 또는 AB110 kex2-) 및 ER내에 위치하는 효모 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제", 예를들어 YAP3DDEL 또는 바람직하게는 YAP3HDEL 또는 보다 바람직하게는, KEX2pHDEL, 가장 바람직하게는 KEX2psHDEL이 인슐린-형 단백질, 바람직하게는 IGF-2 및 보다 바람직하게는, IGF-1(이는 α-인자 리더 서열을 포함하는 전구체로서 생성된다)의 제조에 사용되는 방법에 관한 것이다.
형질전환은 예를 들어 문헌[참조: Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1919 (1978)]에 기술된 방법에 따라서, 당해 분야에 공지된 방법으로 수행한다. 이 방법은 3개의 단계로 분류될 수 있다:
(1) 효모 세포 벽 또는 이의 일부분의 제거.
(2) "세포벽이 제거된(naked)" 효모 세포[스페로플라스트(spheroplast)]를 PEG(폴리에틸렌글리콜) 및 Ca2+이온의 존재하에서 발현 벡터로 처리.
(3) 세포벽의 재생 및 한천의 고체층에서 형질전환된 세포의 선택.
형질전환된 숙주 세포는 당해 분야에 공지된 방법으로 탄소, 질소 및 무기염의 동화원을 함유하는 액체 배지중에서 배양한다. 다양한 탄소원이 본 발명에 따라 형질전환된 효모 세포의 배양에 사용될 수 있다. 바람직한 탄소원의 예는 자체로서 사용되거나 적합한 혼합물로 사용될 수 있는, 동화성 탄수화물(예: 글루코즈, 말토즈, 만니톨 또는 락토즈) 또는 아세테이트이다. 적합한 질소원의 예는 자체로서 사용되거나 적합한 혼합물로 사용될 수 있는, 아미노산(예: 카사미노산), 펩타이드 및 단백질, 및 이의 분해 산물(예: 트립톤, 펩톤 또는 고기 추출물), 효모 추출물, 맥아 추출물, 및 또한 암모늄 염(예: 염화암모늄), 황산염 또는 질산염이다. 사용될 수 있는 무기염은 예를 들면 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 황산염, 염화물, 인산염 및 탄산염이다. 더우기 배지는, 예를 들면 성장-촉진 물질, 예를 들어 미량 원소(예: 철, 아연, 망간 등) 및 바람직하게는 발현 플라스미드를 상실한 세포의 성장을 방지하고 선별 압력을 가하는 물질을 포함한다. 따라서, 예를 들면 필수아미노산에 대해 영양 요구성인 효모 균주를 숙주 미생물로서 사용하는 경우, 플라스미드는 바람직하게는 숙주의 결점을 보완하는 효소를 암호화하는 유전자를 포함한다. 효모 균주의 배양은 상기한 아미노산이 결핍된 최소 배지내에서 수행한다.
배양은 당해 분야에 공지된 방법으로 수행한다. 온도, 배지의 pH 값 및 발효 시간과 같은 배양 조건은, 본 발명에 따라 제조되는 이종 단백질이 최대역가로 수득되도록 선택한다. 따라서, 효모 균주는 본 발명의 단백질이 최대 수율로 수득될 때까지, 약 20 내지 40℃, 바람직하게는 약 30℃ 및 5 내지 8의 pH 값, 바람직하게는 약 pH 7에서, 약 4 내지 약 96시간 동안 진탕 또는 교반시키면서 액침 배양으로 호기성 조건하에서 배양하는 것이 바람직하다. 배양 배지는 선별 압력이 가해지고 유전 마커를 포함하는 하이브리드 벡터 DNA를 여전히 포함하는 세포만이 생존하는 방식으로 선택한다. 따라서, 예를 들어 하이브리드 벡터가 상응하는 항생제 내성 유전자를 포함하는 경우 배지에 항생제를 가한다.
세포 밀도가 충분한 값에 도달했을 때 배양을 중단시키고, 산물을 포함하는 배지를 세포로부터 분리시키며 이 세포는 신선한 배지를 제공하여 연속 생산하는데 사용할 수 있다. 단백질은 또한 세포내, 특히 주변 세포질 영역내에 축적될 수도 있다. 후자의 경우, 목적하는 단백질을 회수하기 위한 제1 단계는, 세포 내부로부터 단백질을 방출시키는 것으로 이루어진다. 먼저, 세포 벽을 글루코시다제로 효소 분해시켜 제거하거나, 달리는 세포벽을 생성된 단백질이 방출되도록 세포벽을 손상시키는 화학제(즉, 티올 시약 또는 EDTA)로 처리하여 제거시킨다. 수득되는 혼합물은 통상의 방법으로, 예를 들면 폴리에틸렌이민의 처리, 황산암모늄을 사용한 단백질의 침전, 겔 전기 영동, 투석, 크로마토그래피, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피(이종 단백질이 다수의 산성 또는 염기성 아미노산을 포함하는 경우 특히 바람직하다), 크기-배출 크로마토그래피, HPLC 또는 역상 HPLC, 적합한 세파덱스(SephadexR) 컬럼상에서의 분자 사이징(molecular sizing) 등에 의해 대부분의 비단백질성 물질이 제거됨으로써, 이종 단백질 양이 풍부하게 된다. 미리-정제된 산물의 최종 정제는, 예를 들면 친화성 크로마토그패피(예: 항체 친화성 크로마토그래피, 특히 당해 분야에 공지된 통상의 방법으로 불용성 매트릭스에 고정된 항체를 사용하는 모노클로날 항체 친화성 크로마토그래피)로 수행한다.
[재조합 DNA 분자]
본 발명은 또한 상기 정의한 바와 같이 ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"용의 발현 카세트를 암호화하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 재조합 DNA 분자를 포함하는 하이브리드 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 바람직하게는 KEX2p, 바람직하게는 가용성 KEX2p 변이체, 가장 바람직하게는 서열 목록에 서열 동정 번호 1로 나타나 있는 KEX2ps에 대한 암호화 영역 및 ER 보유 시그날, 바람직하게는 서열 목록에 서열 동정 번호 2로 나타나 있는 HDEL 서열에 대한 암호화 영역을 포함하는 재조합 DNA 분자 또는 하이브리드 벡터에 관한 것이다. ER 보유 시그날에 대한 암호화 서열은 바람직하게는 KEX2p 암호화 영역의 하부 방향으로 위치한다. C-말단에 부착된 HDEL을 갖는 KEX2p를 본원에서는 KEX2pHDEL로 명명하며, 상응하는 구조 유전자는 KEX2HDEL이다.
상술된 바와 같이, 몇몇 가용성 KEX2p 변이체가 문헌에 공지되어 있다. 본 발명에 따른 추가의 결실 돌연변이체를 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 이러한 결실 돌연변이체를 암호화하는 상응하는 DNA를 제조하고, 이를 발현 조절 서열의 조절하의 적합한 벡터 DNA에 삽입시키고, 형성된 발현 벡터로 적합한 숙주 미생물을 형질전환시키며, 적합한 배양 배지내에서 형질전환된 숙주 미생물을 배양하고 생성된 돌연변이체를 분리시켜 제조할 수 있다. 상기 돌연변이체를 암호화하는 DNA는, 예를 들어 KEX2p를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드를 취하여 (1) 이를 막 결합 부위를 암호화하는 DNA 영역의 3' 또는 이영역내에서 분해하는 제한 효소(예; EcoRI, BstXI 또는 NarI)로 분해시키고, 분해된 DNA를 적합한 엔도뉴클레아제(예: Bal31)로 분해시켜, 상기 DNA 영역을 제거하고 평활 말단 연결 등으로 선형화된 플라스미드를 재환형화시키거나, (2) (예를 들어 부위-지시된 돌연변이유발로) 막 결합 부위를 암호화하는 DNA 영역에 대해 하나의 제한 부위 5' 및 하나의 제한 부위 3'(예: PvuII 및 NarI 또는 EcoRI; 3' 제한 부위는 또한 KEX2 유전자의 해독 정지 시그날에 인접한 플라스미드 DNA내에 위치할 수도 있다)를 선택하거나 생성시키고, 이 플라스미드를 상기 제한 부위를 인지하는 2개의 제한 효소로 분해시키며 선형화된 플라스미드를 평활 말단 연결 등으로 재환형화시키거나, 또는 (3) 막 결합 부위를 암호화하는 DNA 영역을 루프-아웃 돌연변이 유발(loop-out mutagenesis)에 의해 결실시키거나 또는 (4) C-말단부를 KEX2의 경우에는 PvuII로 분해시켜 완전히 결실시키고 선형화된 플라스미드를 평활 말단 연결 등으로 재환형화시켜 제조할 수 있다. KEX2의 DNA 서열은 공지되어 있으며[참조: K. Mizumo et al., 상기 참조] 적합한 돌연변이유발원성 올리고뉴클레오타이드는 용이하게 고안될 수 있고 M13 클로닝 시스템을 적용하는 상기 DNA 영역을 결실시키는데 사용할 수 있다. 돌연변이된 KEX2 유전자를 효모 ER 보유 시그날을 암호화하는 DNA 서열과 연결시키는 공정은 조심스럽게 다루어져야 한다. 이러한 DNA 서열은 합성 링커 DNA를 통해 목적하는 위치에 도입될 수 있거나, 인접한 벡터 DNA에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이된 KEX2 유전자는 이의 3' 말단에 상기 정의된 HDEL 서열을 암호화하는 코돈을 포함한다. 모든 이들 방법은 통상의 기술을 이용한다.
본 발명의 범위내에는 또한 서열 동정 번호 1 및 2를 갖는 DNA 서열에 대한 유전적 코드의 의미내에서 변성된 DNA 서열, 즉 뉴클레오타이드가 교체되더라도 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자가 포함된다. 이러한 변성된 DNA 서열은, 예를 들어 새로운 제한 효소 분해 부위를 포함할 수 있다.
[숙주 균주]
본 발명의 또 다른 양상은 ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 본 발명의 하이브리드 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 효모, 보다 바람직하게는 케이. 락티스 및 가장 바람직하게는 에스. 세레비지애 세포를 포함한다. 본 발명은 또한 ER내에 위치하는 "이염기성 프로세싱 엔도프로테아제"를 암호화하는 발현 카세트로 안정하게 형질전환된, 즉 염색체내에 통합된 재조합 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
KEX2HDEL을 암호화하는 발현 카세트의 통합에 적합한 숙주는, 예를 들어 효모, 바람직하게는 에스. 세레비지애의 kex2-돌연변이체이다. 형질전환된 숙주 세포를 재조하는 방법은, 숙주 세포를 구성적 또는 유도성 프로모터, 바람직하게는 상기 정의된 프로모터 또는 KEX2 유전자의 프로모터의 조절하에 있는 KEX2pHDEL 발현 카세트로 이루어진 통합 벡터로 형질전환시키고, 안정하게 형질전환된 세포를 선별하는 것을 특징으로 한다. 적합한 통합성 형질전환은 당해 기술분야의 기술수준에 속하며 포유동물 세포에 대해 보고된 공정[참조: P.L. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417 (1987) 또는 in F.L. Graham et al., Virology 52:456-467 (1973)] 및 에스 세레비지애 세포에 대해 보고된 공정[참조: R. Rothstein, Methods Enzymol. 194:281- 302 (1991)]에 따라 수행할 수 있다.
본 발명은 특히 하기 실시예에서 기술되는 바와 같이, 재조합 DNA 분자, 하이브리드 벡터, 형질전환된 숙주, 단백질 및 이를 제조하는 방법 및 생물학적으로 활성인 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이나 이로써 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
[실시예 1]
가용성 KEX2p 변이체를 암호화하는 축소된 KEX2 유전자의 작제
가용성 KEX2p 프로테아제 활성을 갖게 하기 위해서, 600bp가 결여되고, C-말단의 200개 아미노산을 암호화하는 돌연변이체 KEX2 유전자를 작제한다. 트렁케이트된 유전자는 -1 내지 -502에 달하는 KEX2 프로모터의 조절하에 있다. 해독은 pUC18의 폴리링커로부터 기원하는 정지 코돈(TAA)에서 종결된다.
상세히 설명하면, 플라스미드 pUC19[제조원: Boehringer Mannheim GmbH, FRG]를 Hind III로 완전히 분해하고, 2686bp 단편을 분리한다. 말단을 채우고, 단편을 재연결시킨다. 연결 혼합물의 분취량을 칼슘-처리된, 형질전환 컴피던트(competent) 이. 콜라이 JM101[제조원: Invitrogen, San Diego, USA] 세포에 가한다. 12개의 형질전환된 암피실린 내성 이. 콜라이 형질전환체를 100μg/ml 임피실린의 존재하에서 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 제조하고 Hind III 및 BamHI으로 분해시켜 분석한다. Hind III 부위가 결여된 플라스미드를 pUC19woH라 칭한다.
3207bp BalI-AhaIII KEX2 단편(효모의 전체 게놈 DNA로부터 수득 가능)의 양 말단에 BamHI 링커를 제공하고 이어서 BamHI으로 완전히 분해시킨다. 플라스미드 pUC19woH를 BamHI으로 완전히 절단시키고, 선형의 2690bp 단편을 분리시킨 후, 상술된 BamHI KEX2 단편에 연결시킨다. 연결 혼합물의 분취량을 이. 콜라이 JM101 세포내로 형질전환시킨다. 12개의 형질전환된, 암피실린 내성 콜로니를 암피실린(100μg/㎖) 함유 LB 배지중에서 성장시키고, 플라스미드 DNA를 추출한 후 BamHI으로 분해시켜 분석한다. 예측되는 제한 단편을 갖는 하나의 클론을 선별하여 pKS301b(DSM 6628로 기탁됨)로 명명한다.
플라스미드 pDP34(DSM 4473으로 기탁됨)과 본질적으로 상응하는 2μm 효모 벡터 pAB24를 BamHI으로 완전히 절단시키고, 선형 pAB24 단편을 분리시킨다. 플라스미드 pKS301b를 BamHI으로 분해시키고, 완전한 KEX2 유전자를 함유하는 단편을 분리시킨 후, 선형화된 효모 벡터 pAB24에 연결시킨다. 연결 혼합물의 분취량을 이. 콜라이 JM101내로 형질전환시키고 12개의 양성 클론의 플라스미드 DNA를 BamHI으로 분해하여 조사한다. 예측된 제한 단편을 갖는 하나의 클론을 pAB226으로 언급한다.
플라스미드 pKS301b를 SphI, PvuII 및 ScaI으로 완전히 분해한다. -502 내지 +1843의 KEX2 서열을 포함하는 2.37kb의 SphI-PvuII 단편 및 pUC19 폴리링커의 일부를 분리시킨다. 플라스미드 pUC18[제조원: Boehringer Mannheim, FRG]를 SphI 및 SmaI으로 완전히 절단시킨다. 2660bp의 SphI-SmaI pUC18 단편을 SphI/SphI 및 PvuII/SmaI 연결에 의해 2.37kb의 SphI-PvuII KEX2 단편에 연결시킨다. PvuII/SmaI 연결로 7개의 추가의 C-말단 아미노산-(-G-V-P-S-S-N-S)을 암호화 하고 정지 코돈(TAA)이 이어지는 pUC18 서열내에 ORF에 대한 614개 아미노산을 암호화하는 KEX2 ORF의 융합물이 생성된다. 연결 혼합물의 분취량을 이. 콜라이 JM101내로 형질전환시키다. 플라스미드 DNA를 암피실린 내성 이. 콜라이 형질전환체로부터 분리시키고, SphI 및 EcoRI 뿐만 아니라 HindIII로 분해하여 분석한다. 예측된 제한 양상을 갖는 하나의 클론을 p18kexp로 언급한다. 서열 동정 번호 1하의 서열 리스트에 KEX2에서 기원한 DNA를 갖는 가용성 KEX2ps를 암호화하는 ORF가 나타나 있다.
플라스미드 p18kexp를 PvuII, SalI 및 ScaI으로 완전히 분해시킨다. -502 내지 +1843에 달하는 KEX2 서열을 포함하는 2552bp의 SalI-PvuII 단편 및 pUC18 서열의 206bp를 분리시킨다. 플라스미드 pDP34를 BamHI으로 분해시키고, 선형화된 플라스미드의 말단들을 채운다. T4 폴리머라제를 불활성화시킨 후, 선형화되고 채워진(filled-in) 플라스미드를 SalI으로 절단하고 11.78bp 단편을 분리시킨다. pDP34 BamHI*-SalI 단편(BamHI*: 채워진 BamHI)을 SalI/SalI 및 BamHI*/PvuII 연결에 의해 2552bp의 SalI-PvuII 단편에 연결시킨다. 연결 혼합물의 분취량을 형질전환 컴피턴트 이. 콜라이 JM101 세포내로 형질전환시킨다. 플라스미드 DNA를 암피실린 내성 세포로부터 추출하고 SalI, NcoI, SmaI, XbaI, EcoRI으로 제한 분석한다. 예측된 제한 단편을 갖는 하나의 클론을 pDPkexp로 언급한다.
[실시예 2]
pDPkexpHDEL의 작제
플라스미드 p18kexp(참조: 실시예 1)는 pUC18의 폴리 링커 영역내로 삽입된 가용성 KEX2p(KEX2ps)를 암호화하는 트렁케이트된 KEX2 유전자로 이루어진다. p18kexp내의 KEX2ps의 C-말단을 암호화하는 DNA 서열에 이어서 Asp718 및 EcoRI부위(참조: 서열 동정 번호 1)가 뒤따른다. 이 플라스미드를 Asp718 및 EcoRI으로 분해시키고 HDEL 서열 및 2개의 정지 코돈을 암호화하는, 서열 동정 번호 11 및 12를 갖는 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드와 연결시켜, 연결 생성물 p18kexpHDEL을 수득한다. 플라스미드 p18kexp 및 p18kexpHDEL은 SacI 또는 SfuI 분해에 의해 구별될 수 있다. 폴리링커 삽입 영역을 p18kexpHDEL내에서 서열 분석한다.
플라스미드 p18kexpHDEL을 SalI, PvuII 및 ScaI으로 절단하고, 2572bp SalI-PvuII 단편을 분리시킨다.
플라스미드 pDP34를 BamHI으로 분해시키고, 점성 말단을 클레노우 폴리머라제로 채운후, 폴리머라제를 페놀/클로로포름 및 클로로포름 추출에 이어서 에탄올 침전으로 파괴한다. pDP34 단편중에 채워진 BamHI 절단물을 SalI으로 분해시키고, 11780bp SalI-BamHI*(BamHI*: BamHI 부위에 채워진 것)을 분리시킨다.
p18kexpHDEL로부터 분리된 2572bp의 SalI-PvuII 단편을 11780bp SalI-BamHI*pDP 34 단편에 연결한다. SalI/SalI 및 PvuII/BamHI*의 연결로 플라스미드 pDPkexpHDEL이 생성된다.
[실시예 3]
IGF-1 발현 카세트를 포함하는 효모 벡터의 작제
플라스미드 pDP34는 완전한 2μ 서열, 효모용 선별 마커로서 효모 게놈성 URA3 및 dLEU2 서열 및 이. 콜라이에서의 선별 및 증식용 pBR322 서열을 포함하는 이. 콜라이-에스. 세레비지애 셔틀 벡터이다[참조: A. Hinnen, B. Meyhack and J. Heim, in Yeast genetic engineering[참조; P.J. Barr, A.J. Bracke ＆ P. Valenzuela, eds., pp. 193-213 (1989), Butterworth Publishers, Stoneham]. pBR322의 276bp SalI-BamHI 단편[제조원; Boehringer Mannheim GmbH, 독일]을 SalI 및 BamHI으로 분해시킨 후 분리된 선형 벡터에 연결시킨다. 분취량의 연결 혼합물을 칼슘-처리된 형질전환 컴피턴트 이. 콜라이 HB101 세포[제조원: Invitrogen, San Diego, USA]에 가한다. 4개의 형질전환된 암피실린 내성 이. 콜라이 형질전환체를 100μg/ml 암피실린의 존재하에 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 제조하고, SalI-BamHI으로 분해하여 분석한다. 예측된 제한 단편을 갖는 하나의 플라스미드를 pDP34A로 언급한다. 효모에서의 발현을 위한, 사람 인슐린-형 성장인자-1(IGF-1) 유전자 발현 카세트를, pDP34A의 BamHI 부위내로 연결시킨다. 발현 카세트의 DNA 서열
이 서열 동정 번호 5하에 나타나 있다. 이는 BamHI-분해성 링커, 이어서 약 400bp 단편의 에스. 세레비지애 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH) 프로모터, 이어서 α- 인자 전구체의 처음 85개 아미노산을 암호화하는 에스. 세레비지애 α-인자 리더 서열[참조: J. Kurjan et al., Cell 30: 933-943, 1982], 바로 이어서 화학적으로 합성된 IGF-1 유전자 [참조: G.T. Mullenbach, A.L. Choo, M. S. Urdea, P.J. Barr, J.P. Merryweather, A.J. Brake 및 P. Valenzuela, Fed. Proc. 42, 434 (abstr.)(1983)], 약 275bp 에스. 세레비지애 α- 인자 터미네이터[αFT; Kurian et al., Cell 30: 933-943, 1982] 및 제 2의 BamHI-분해성 링커로 이루어진다. 분취량의 연결 혼합물을 이. 콜라이 HB101내로 형질전환시킨다. 6개의 독립적인 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 SalI 및 BamHI으로 분석한다. SalI-BamHI 단편에 대해 3' 배향된 발현 카세트의 프로모터를 갖는 하나의 클론을 pDP34A/GAPDH-αFL-IGF1-αFT로 명명한다.
[실시예 4]
2개의 돌연변이된 α-인자 리더 서열의 작제
400bp GAPDH 프로모터, 255bp αFL 서열, 216bp의 화학적으로 합성된 IGF-1 유전자(IGF-1 유전자 및 2개의 정지 코돈) 및 275bp αFT로 이루어진 1146bp BamHI 단편을, pDP34A/GAPDH-αFL-IGF1- αFT로부터 방출시킨다(참조: 실시예 3). 이를 파아지 벡터 M13mp18(제조원; Boehringer Mannheim GmbH, 독일)의 BamHI 분해되고, 세균 알칼리성 포스파타제(제조원; Gibco-BRL, Basel, 스위스) 처리된 복제 형(RF)에 연결시킨다. 분취량의 결합 혼합물을 이. 콜라이 JM101내로 형질전환시킨다. 6개 플라크로부터의 플라스미드 DNA를 EcoRI, BamHI 및 BamHI-SalI으로 분석한다. 적합한 제한 단편 및 벡터의 EcoRI 부위에 바로 인접한 프로모터를 갖는 하나의 RF 클론을 선별하고 이를 mp18/BamHI/GAPDH-αFL-IGF1-αFT로 명명한다. 서열 동정 번호 6의 돌연변이유발원성 올리고데속시리보뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 2개의-프라이머 프로토콜[참조: M.J. Zoller 및 M. Smith, Meth. in Enzymol. 154, 328-350 (1987)]을 이용한 부위-지시된 돌연변이유발로 아미노산 Ala20이 Asp20으로 변화되고 Pro21이 Leu21로 변화된 αFL의 새로운 서열을 수득한다. 방사선 표시된 돌연변이유발원성 프라이머로 하이브리드화한 후 하나의 양성 클론으로부터 수득된 일본쇄 DNA를 서열분석하여 [참조: F. Sanger, S. Nicklen 및 A.R. Coulsen, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467 (1977)] 목적한 돌연변이를 확인한다. 돌연변이된 αFL 서열을 αFLMut2로 명명하며, 수득된 파아지는 mp18/BamHI/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT로 명명한다.
서열 동정 번호 7,8,9 및 10을 갖는 4개의 돌연변이유발원성 올리고데속시리보뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 부위-지시된 돌연변이유발로 하기와 같이 아미노산이 교체된 αFL 서열을 수득한다:
Ala13→Asn13, Gln32→Asn32, Pro34→Thr34, Gly40→Asn40, Lys76→Asn76및 Glu78→Thr78.
일본쇄 DNA 주형에 대한 DNA 서열 분석으로 모든 돌연변이를 확인한다.
돌연변이된 αFL 서열을 αFLG1G2G3G5라 칭하고 파아지를 mp18/BamHI/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT로 언급한다.
[실시예 5]
GAPDH-αFL-IGF1-αFT, GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT 및 GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT를 포함하는 효모 벡터의 작제
벡터 pDP34A(참조: 실시예 3)에 유일한 BglII 부위를 생성하기 위해서, 플라스미드 DNA를 SacI으로 완전히 분해시키고, 3' 돌출부(overhang)를 T4 DNA 폴리머라제(제조원; New England BioLabs, Beverly, MA, USA)로 평평하게 한다. 선형화된, 평활-말단 벡터 pDP34A를 BglII 링커(제조원; Boehringer Mannheim GmbH, 독일)에 연결시킨다. 링커 연결 후, 벡터 DNA를 BglII로 분해시킨 후, 재연결시킨다. 이. 콜라이 HB101에서의 재연결된 혼합물 분취량의 형질전환 후 수득된 6개의 암피실린 내성 형질전환체의 플라스미드 DNA를 제한효소 BglII-SalI 및 BglII-ScaI으로 분석한다. ScaI 부위대신에 BglII 부위가 생성된 것을 확인하는, 예측된 제한 단편을 갖는 하나의 클론을 pDP34B로 명명한다.
pDP34B를 BamHI으로 완전히 분해시키고, 세균 알카리성 포스파타제로 처리한다. 이러한 선형화된 벡터 DNA를 사용하여 pDP34A/GAPDH-αFL-IGF1-αFT(참조: 실시예 3), mp18/BamHI/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT(참조: 실시예 4) 및 mp18/BamHI/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT(참조: 실시예 4)로부터 수득된 1146bp BamHI 단편을 아클로닝한다. 연결후, 3개의 연결 혼합물 각각으로부터의 분취량을 이. 콜라이 HB101내로 형질전환시킨다. 3개의 연결물 각각으로부터의 각각 4개의 형질전환체의 플라스미드 DNA를 SalI으로 분석하여 SalI-BamHI pBR322 단편에 대한 BamHI 단편의 배향을 측정한다. 프로모터의 5' 말단에 pBR322 DNA를 갖는, 1147bp 단편을 생성하는 플라스미드를 선택하여 pDP34B/BamHI/GAPDH-αFL-IGF1-αFT, pDP34B/BamHI/ GAPDH-αFLMut2-IGFI-αFT 및 pDP34B/BamHI/GAPDH-α FLG1G2G3G5-IGF1-αFT로 명명한다.
[실시예 6]
동일한 플라스미드에 야생형 α-인자 리더 분비 시그날과 함께 KEX2p 및 IGF-1에 대한 발현 카세트를 포함하는 효모 벡터의 작제
효모 벡터 pDP34B(실시예 5)를 BalII로 완전히 분해하고 세균 알카리성 포스파타제로 처리한다. 플라스미드 pKS301b(실시예 1)을 BamHI으로 분해하고, 완전한 KEX2 유전자를 포함하는 약 3210bp 단편을 분리시킨 후, 선형화된 벡터 pDP34B에 연결시킨다. 분취량의 연결 혼합물을 이. 콜라이 HB101내로 형질전환시키고, 4개의 형질전환체의 플라스미드 DNA를 BamHI 및 BglII로 제한 분석하여 시험한다. 예측된 제한 단편을 갖는 하나의 클론이 pDP34B/KEX2로 공지되어 있다.
pDP34B/KEX2를 BamHI으로 완전히 분해하고, 세균 알카리성 포스파타제로 처리한다.
pDP34A/GAPDH-αFL-IGF1-αFT(실시예 3)로부터 분리된 IGF-1 발현 카세트를 포함하는 1146bp BamHI 단편을 선형화된 벡터 pDP34B/KEX2에 연결시킨다. 형질전환시킨 후, 4개 클론의 플라스미드 DNA를 SalI 및 BamHI-BglII로 분석한다. IGF-1 카세트에 대해 반대 배향으로 KEX2 유전자와 pBR322 SalI- BamHI 단편에 대해 IGF-1 발현 카세트 3'중에 프로모터를 갖는, 하나의 클론을 선택하여 pDP34B/KEX2/GAPDH-αFL-IGF1-αFT로 명명한다.
[실시예 7]
동일한 플라스미드상에 야생형 α-인자 리더 분비 시그날과 함께 KEX2ps및 IGF-1에 대한 발현 카세트를 포함하는 효모 벡터의 작제
플라스미드 pDPkexp(실시예 1)를 SmaI으로 분해시킨 후, BamHI 링커[제조원; Boehringer Mannheim, 독일]를 가하고, 이어서 BamHI 및 ScaI으로 분해시켜 약 2560bp BamHI 단편을 분리한다. 이를 선형화된 pDP34B에 연결시킨다. BamHI 및 BamHI-BgIII를 갖는 형질전환체의 플라스미드 DNA를 분석하여 pDP34B/kexp로 불리우는 예측된 제한 단편을 갖는 하나의 클론을 수득한다.
IGF-1 발현 카세트를 실시예 6에서와 동일한 방법으로 pDP34B/kexp의 BamHI 부위에 아클로닝한다. SalI 및 BamHI- BglII로 제한 분석하여 pBR322 SalI-BamHI 단편에 대해 IGF-1 발현 카세트 3'의 프로모터 및 IGF-1 카세트에 대해 반대 배향으로 가용성 KEX2를 갖는 상이한 클론을 수득한다. 하나의 이러한 클론을 선택하여 pDP34B/kexp/GAPDH-αFL-IGF1-αFT로 명명한다.
[실시예 8]
동일한 플라스미드상에 야생형 α-인자 리더 분비 시그날과 함께 KEX2psHDEL 및 IGF-1에 대한 발현 카세트를 포함하는 효모 벡터의 작제
pDPkexpHDEL(참조: 실시예 2)를 BamHI으로 분해하고, 약 2580bp 길이의 단편을 분리한 후, 이를 선형화된 pDP34B에 연결시킨다. 이. 콜라이 HB101 형질전환체의 플라스미드 DNA를 BamHI-BglII로 분석한다. 예측된 제한 단편을 갖는 하나의 클론을 pDP34B/kexpHDEL로 명명한다.
IGF-1 발현 카세트를 실시예 6에서와 동일한 방법으로 pDP34B/kexpHDEL의 BamHI 부위에 아클로닝한다. 암피실린 내성 이. 콜라이 HB101 형질전환체의 플라스미드 DNA를 SalI 및 BamHI-BglII로 분석한다. pBR322 SalI-BamHI 단편에 대해 IGF-1 발현 카세트 3'의 프로모터 및 IGF-1 카세트에 대해 반대 배향으로 가용성 KEX2HDEL을 갖는 하나의 클론을 pDP34B/kex2pHDEL/GAPDH-αFL-IGF1-αFT로 언급한다.
[실시예 9]
플라스미드 pDP34B/KEX2/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT, pDP34B/kexp/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT, pDP34B/kexpHDEL/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT, pDP34B/KEX2/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT, pDP34B/kexp/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT 및 pDP34B/kexpHDEL/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT의 작제
이들 플라스미드는 실시예 6, 7 및 8에서 상세히 기술된 공정과 유사한 방법으로 작제한다. 발현 카세트, GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT의 BamHI 단편 및 GAPDH-αFLG1G2G3G5를 pDP34B/BamHI/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT(참조: 실시예 5) 및 pDP34B/BamHI/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT(참조: 실시예 5)로 부터 분리시키고 KEX2, 또는 가용성 KEX2 또는 가용성 KEX2HDEL 유전자를 이미 포함하는 효모 벡터에 아클로닝시킨다.
[실시예 10]
효모 균주 AB110의 kex2-돌연변이체의 작제
pKS301b(실시예 1)를 KEX2 유전자내의 유일한 BglII 부위에서 절단시킨다. 플라스미드 YEp13[참조: J. Broach et al., Gene 8, 121-133 (1979)]로부터의 약 2920bp BglII 단편을 선형화된 벡터 pKS301b에 연결시킨다. 분취량의 연결 혼합물을 이. 콜라이 HB101내로 형질전환시킨다. 12개의 암피실린 내성 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 HindIII-EcoRI으로 분석한다. 예측된 단편을 갖는 하나의 클론을 pUC19/kex2:: LEU2로 언급한다. 이 플라스미드는 작용적 LEU2 유전자에 의해 파괴된 KEX2 유전자의 암호화 서열을 갖는다.
pUC19/kex2:: LEU2를 BamHI으로 분해시켜 선형 kex2:: LEU2 단편을 방출시킨다. 효모 균주 AB110을, 선형화된 DNA를 사용한 형질전환(실시예 11)에 사용한다. 형질전환체를 루이신 자가 영양에 대해 선별한다. 4개의 LEU2+형질전환체의 게놈 DNA를 EcoRI-HindIII로 분해한다. KEX2의 게놈성 카피가 LEU2 유전자에 의해 파괴되는지를 확인하기 위해서, 서던 블롯 분석을 수행한다. 예측된 제한 단편을 갖는 하나의 효모 형질전환체를 AB110kex2-로 명명한다.
[실시예 11]
에스. 세레비지애 균주 AB110 및 AB110kex2-의 형질전환
효모 형질전환을 문헌[참조: Klebe et al., Gene 25, 333-341 (1983)]에 기술된 바와 같이 수행한다.
에스 세레비지애 AB110을 하기의 플라스미드로 형질전환시키고(참조: 실시예 12) 형질전환체를 하기와 같이 명명한다:
플라스미드 형질전환체 명
pDP34B/GAPDH-αFL-IGF1-αFT(실시예 5) yIG 1
pDP34B/KEX2/GAPDH-αFL-IGF1-αFT(실시예 6) yIG 2
pDP34B/KEX2HDEL/GAPDH-αFL-IGF1-αFT(실시예 8) yIG 3
pDP34B/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT(실시예 5) yIG 4
pDP34B/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT(실시예 5) yIG 5
각각의 형질전환체의 3개의 콜로니를 선택하여 추가의 번호로 명명한다(즉, yIG 1-1, yIG 1-2, yIG 1-3).
에스. 세레비지애 AB110 kex2-(참조: 실시예 10)을 하기의 플라스미드로 형질전환시키고 형질전환체를 하기와 같이 명명한다:
플라스미드 형질전환체 명
pDP34B/GAPDH-αFL-IGF1-αFT(실시예 5) yIG 6
pDP34B/KEX2/GAPDH-αFL-IGF1-αFT(실시예 6) yIG 7
pDP34B/KEX2/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT(실시예 9) yIG 8
pDP34B/kexp/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT(실시예 9) yIG 9
pDP34B/kexpHDEL/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT(실시예 9) yIG 10
pDP34B/KEX2/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT(실시예 9) yIG 11
pDP34B/kexp/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT(실시예 9) yIG 12
pDP34B/kexpHDEL/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT(실시예 9) yIG 13
각각의 형질전환체의 3개의 콜로니를 선택하고 추가의 번호로 명명한다(즉, yIG 6-1, yIG 6-2, yIG 6-3).
[실시예 12]
진탕-플라스크 배양물내에서 효모 형질전환체의 성장 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 웨스턴 블롯에 의한 IGF-1 단백질의 정량/정성적 측정
에스. 세레비지애 AB110(Mat α, his 4-580, leu2, ura3-52, pcp 4-3[cir。]) 이 문헌[참조: P.J. Barr et al., J. Biol. Chem. 263, 16471-16478 (1988)]에 기술되어 있다. 6.5g/ℓ 효모 추출물, 4.5g/ℓ 카사미노산 및 30g/l 글루코즈를 함유하는 농축 배지를 비-선별 예비-배양 배지로서 사용한다. IGF-1을 30g/ℓ 글루코즈, 8.5g/ℓ 카사미노산 및 필수 아미노산으로 보충된 1.7g/ℓ 효모 질소 염기를 함유하는 우라실-선별 배지인 주요 배지에서 발현시킨다. 효모 형질전환체(참조: 실시예 11)를 예비-배양 배지 20ml 용적중에서 24시간 동안 및 주요 배지 80ml 용적중에서 72시간 동안 180회전/분의 회전 진탕기상에서 30℃로 성장시킨다.
분취량의 세포를 하베스트하고, 배양 배지내에 분지된, 활성 단량체 IGF-1 분자를 HPLC 및 ELISA로 측정한다[참조: K. Steube et al., Eur. J. Biochem. 198, 651-657 (1991)].
분취량의 성장 배지를 13000xg에서 2분 동안 원심분리시킨다. 세포를 3 x 램믈리(Laemmli) 완충액[6% SDS, 0.15M Tris pH 6.8, 6mM EDTA, 30% 글리세롤, 0.05% 브로모페놀 블루]중에 재현탁시키고, 유리 비드와 함께 격렬하게 진탕시켜 분해시킨 후 비등 수욕중에서 3분 동안 샘플을 배양한다. 세포 용해물로부터의 단백질을 15% 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE로 분리시킨다[참조: U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)]. 단백질을 반-건조 블롯터[제조원; Sartorius GmbH, 독일]를 사용하여 니트로셀룰로즈 여과기상에 전기 블롯팅한다. 이동된 단백질을 바이오 래드 면역 검정 키트[Bio-Rad, Richmond, CA, USA]에 의해 제공된 공정에 따라 항-IGF-1 항체로 검출한다.
[실시예 13]
형질전환체 yIG1, yIG6 및 yIG7로부터 HPLC 및 웨스턴 블롯에 의해 분비된 IGF-1 단백질(들) 및 세포내 IGF-1 단백질(들)의 비교
효모 균주 AB110(형질전환체, yIG1-1, yIG 1-2 및 yIG 1-3) 및 AB110 kex2-(형질전환체, yIG 6-1, yIG 6-2 및 yIG 6-3)중의 플라스미드 pDP34B/GAPDH-αFL-IGF1-αFT(참조: 실시예 5)의 형질전환체들로부터의 분비된 IGF-1을 HPLC로 비교하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다:
형질전환체 yIG 6-1, yIG 6-2 및 yIG 6-3으로부터의 세포내 단백질의 웨스턴 블롯 분석은 αFL이 프로세싱되지 않은 경우의 IGF-1을 나타낸다.
이 결과는 성숙한 IGF-1이 염색체상에 KEX2의 작용적 카피가 결여된 효모 균주로부터 배지중으로 분비되지 않는다는 것을 의미한다. KEX2의 작용성 카피물이 효모 균주 AB110 kex2-(형질전환체 yIG 7-1, yIG 7-2 및 yIG 7-3)내로 플라스미드 [예: pDP34/KEX2/GAPDH-αFL-IGF1-αFT(참조: 실시예 6)]상에 재도입되는 경우, 분비된 IGF-1이 다시 관측된다.
[실시예 14]
형질전환체, yIG1, yIG2 및 yIG3로부터 분비된 IGF-1 단백질의 HPLC 및 ELISA에 의한 비교
HPLC로 상층액중에서 활성인, 단량체성 IGF-1의 양을 측정한다. ELISA로 상층액중의 IGF-1형 종의 총량을 측정한다. ELISA는 단량체 이외에도, 분자간 디설파이드 브릿지된 이량체 및 다량체, 잘못 폴딩된 IGF-1, 산화된 IGF-1 및 기타 분자들의 양을 정량한다. 표 2는 IGF-1 및 KEX2p를 공 발현하는 형질전환체(yIG1 및 yIG2), 및 IGF-1 및 가용성 KEX2HDELp을 공동 발현하는 형질전환체(yIG3)로부터 분비된 IGF-1의 HPLC 역가 및 ELISA 값의 비교를 나타낸다. 그 결과가 표 2에 나타나 있다:
이들 결과는 3개의 형질전환체 각각으로부터의 3개의 개개 균주로부터 수득된 평균 값이다. 가용성 KEX2HDEL의 공발현은, 단량체 이외의 분자 형성이 극적으로 감소된다는 것을 나타낸다.
[실시예 15]
형질전환체, yIG1, yIG4, yIG8, yIG9 및 yIG10으로부터 분비된 IGF-1 단백질의 HPLC 분석에 의한 비교
돌연변이된 리더 서열 αFLMut2는 균주 AB110내에 IGF-1의 분비를 허용하지 않는다. 글리코실화되고, 프로세싱되지 않은 αFL-IGF-1 분자가 세포내부에 축적된다. 글리코실화(단지 코어-글리코실화만이 관측된다)의 특성으로부터, 이들 분자가 αFL 서열내 돌연변이에 의해서 소포체를 통과하지 않는다는 것이 확실하다. AB110 kex2-내에서, KEX2 효소의 3가지 상이한 형태, KEX2 효소, 가용성 KEX2 및 가용성 KEX2HDEL과 함께, αFLMut2 분비 시그날을 사용한 IGF-1의 공 발현은, 가용성 KEX2HDEL 단백질이 다른 2개와는 상이하다는 것을 나타낸다.
형질전환체 yIG1, yIG4, yIG8, yIG9 및 yIG10으로부터의 세포내 IGF-1-형 단백질의 웨스턴 블롯 분석은, 단지 가용성 KEX2HDEL 단백질만이 세포내 수거물로부터 성숙한 IGF-1을 방출시킨다는 것을 나타낸다.
[실시예 16]
형질전환체, yIG1, yIG5, yIG11, yIG12 및 yIG13으로 부터 분비된 IGF-1 단백질의 HPLC 분석
돌연변이된 리서 서열 αFLG1G2G3G5는 균주 AB110내에서 IGF-1의 분비를 불충분하게 한다. 글리코실화되지 않고, 프로세싱되지 않은 αFL-IGF-1 분자가 세포내에 축적된다. 이는, 이들 분자가 αFL의 시그날 서열을 상실하고 있다는 것을 나타내며, ER내로의 전위가 일어난다는 것을 의미한다. 그러나, ER내로의 유입은 αFL의 프로영역내에서 3개의 가능한 서열 (Asn-X-Ser/Thr)의 글리코실화를 야기시키지 않는다. AB110 kex2-내에서 KEX2 효소의 3가지 상이한 형태(KEX2, 가용성 KEX2 및 가용성 KEX2HDEL)와 IGF-1의 공발현은 yIG13에서 발현된 가용성 KEX2HDEL 단백질이 세포내 수거물로부터 더욱 성숙한 IGF-1을 방출시킨다는 점에서 유일하다는 사실을 나타낸다.
[실시예 17]
효모 형질전환체, yIG1, yIG5 및 yIG13으로부터 단량체성 IGF-1의 분비 역학을 연구하기 위한 시간 경과 실험
골지체 대신에 ER내에서 IGF-1으로부터 αFL의 프로영역의 방출은 상이한 싯점에서 분비된 단량체 IGF-1의 총량에 영향을 미칠 수 있다. 프로영역은 ER로부터 골지체로 프로세싱되지 않은 IGF-1 단백질의 수송을 용이하게 하는 역활을 한다. 이러한 가능성에 비준하여, yIG1, yIG5 및 yIG13 으로부터 개개의 균주를 진탕 플라스크에서 성장시키고, 효모 배양물로부터의 상층액 분취량을 40, 48, 60 및 72시간 후에 취하여 단량체성 IGF-1의 분비를 HPLC로 측정한다. 3개의 형질전환체 yIG1, yIG5 및 yIG13 각각에 속하는, 3개의 개개의 균주(예: yIG 1-1, yIG 1-2, yIG 1-3 및 yIG 5-1, yIG 5-2와 yIG 5-3, 및 yIG 13-1, yIG 13-2와 yIG 13-3)로부터 구한 평균 값을 표 3에 나타내었다.
[실시예 18]
가용성 KEX2HDEL 단백질을 사용한 이량체 형태의 상당한 감소를 나타내는 분비된 IGF-1의 웨스턴 블롯 분석
yIG1 및 yIG13(실시예 17)의 상층액을 비-환원 및 환원 조건하에서 웨스턴 블롯에 의해 분석한다.
40, 48 및 60 시간째에서는 가용성 KEX2HDEL 단백질의 사용에 의한 분자간 디설파이드 브릿지된 IGF-1 분자의 형성이 관측되지 않았다. 단지 72시간째에 이량체성 IGF-1의 무시가능한 양(블롯상에서 거의 가시화되지 않는 양)을 볼 수 있었다. 그러나, KEX2p를 발현하는 균주는 매싯점에서 이량체를 나타낸다. 이들 이량체는 디티오트레이톨(DTT)에 의해 감소될 수 있는데 이러한 사실은 이량체가 실제로 디설파이드 결합되었음을 의미한다.
[기탁된 미생물]
하기 미생물 균주는 부다페스트 조약하에 DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig)에 기탁되었다:
에스케리키아 콜라이 JM109/pDP34 : 1988년 3월 14일 기탁, 기탁번호 DSM 4473.
에스케리키아 콜라이 JM101/pKS301b : 1990년 6월 25일 기탁, 기탁번호 DSM 6028.
[서열 리스트]
서열 동정 번호 1
서열 타입 : 상응하는 폴리펩타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드
서열 길이 : 1866개 염기쌍
쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
공급원 : 효모 게놈성 DNA
직접적인 실험원 : 이. 콜라이 JM101/pKS301b(DSM6028)
특징 : 가용성 KEX2에 대한 1 내지 1866번 암호화 영역
서열 동정 번호 2
서열 타입 : 상응하는 펩타이드를 갖는 DNA
서열 길이 : 12개 염기쌍
쇄형 : 이본쇄
형태 : 선형
공급원 : 효모 게놈성 DNA
직접적인 실험원 : 합성
특징 : ER 보유 시그날 HDEL에 대한 암호화 영역
서열 동정 번호 3
서열 타입 : 펩타이드
서열 길이 : 4개 아미노산
형태 : 선형
공급원 : 케이. 락티스
특징 : ER 보유 시그날 DDEL
Asp Asp Glu Leu
서열 동정 번호 4
서열 타입 : 펩타이드
서열 길이 : 4개 아미노산
형태 : 선형
공급원 : 포유동물 세포
특징 : ER 보유 시그날 KDEL
Lys Asp Glu Leu
서열 동정 번호 5
서열 타입 : 상응하는 폴리펩타이드를 갖는 DNA
서열 길이 : 1179개 염기쌍
형태 : 선형
쇄형 : 이본쇄
최초 실험원 : pDP34A/GAPDH-αFL-IGF1-αFT
특징 : 효모에서 IGF-1을 발현하기 위한 발현 카세트
1 내지 6번 : BamHI 제한 부위
6 내지 404번 : 에스. 세레비지애 GAPDH 프로모터
405 내지 659번 : 에스. 세레비지애 α-인자 리더
660 내지 869번 : IGF-1 암호화 영역
870 내지 876번 : 2개의 정지 코돈을 암호화하는 링커
877 내지 1152번 : 에스. 세레비지애 α-인자 터미네이터
1153 내지 1158번 : BamHI 제한 부위
서열 동정 번호 6
서열 타입 : DNA
서열 길이 : 31
쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
공급원 : 합성 올리고뉴클레오타이드
직접적인 실험원 : 합성
특징 : 돌연변이유발원성 올리고데속시리보뉴클레오타이드 프라이머
서열 동정 번호 7
서열 타입 : DNA
서열 길이 : 25개 염기
쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
공급원 : 합성 올리고뉴클레오타이드
직접적인 실험원 : 합성
특징 : 돌연변이유발원성 올리고데속시리보뉴클레오타이드 프라이머
서열 동정 번호 8
서열 타입 : DNA
서열 길이 : 28개 염기
쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
공급원 : 합성 올리고뉴클레오타이드
직접적인 실험원 : 합성
특징 : 돌연변이유발원성 올리고데속시리보뉴클레오타이드 프라이머
서열 동정 번호 9
서열 타입 : DNA
서열 길이 : 21개 염기
쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
공급원 : 합성 올리고뉴클레오타이드
직접적인 실험원 : 합성
특징 : 돌연변이유발원성 올리고데속시리보뉴클레오타이드 프라이머
서열 동정 번호 10
서열 타입 : DNA
서열 길이 : 30개 염기
쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
공급원 : 합성 올리고뉴클레오타이드
직접적인 실험원 : 합성
특징 : 돌연변이유발원성 올리고데속시리보뉴클레오타이드 프라이머
서열 동정 번호 11
서열 타입 : DNA
서열 길이 : 30개 염기
쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
공급원 : 합성 올리고뉴클레오타이드
직접적인 실험원 : 합성
특징 : "HDEL" 및 2개의 정지 코돈을 암호화하는 올리고데속시리보뉴클레오타이드; SfuI 부위 포함.
서열 동정 번호 12
서열 타입 : DNA
서열 길이 : 30개 염기
쇄형 : 일본쇄
형태 : 선형
공급원 : 합성 올리고뉴클레오타이드
직접적인 실험원 : 합성
특징 : 서열 동정 번호 11의 올리고뉴클레오타이드를 암호화하는 HDEL과 하이브리드화하는 올리고데속시리보뉴클레오타이드; SfuI 부위 포함.
Claims (13)
- 프로서열(pro-sequence)을 포함하는 단백질의 프로형(pro-form), 및 상기 프로서열을 제거할 수 있고 KDEL(서열 동정 번호 4), DDEL(서열 동정 번호 3) 및 HDEL(서열 동정 번호 2)로 이루어진 그룹중에서 선택된 소포체 보유 시그날(Endoplasmic Reticulum retention signal)에 융합되어 있는, 푸린, PC1, PC2, PC3, YAP3 및 KEX2p로 이루어진 그룹중에서 선택된 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제 둘다를 포함하는 하이브리드 벡터로 사람을 제외한 포유동물 세포, 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하는 효모 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; 및 형질전환된 상기 숙주 세포를 배양하여 이종 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 상기 숙주 세포내에서 이종 단백질을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 이종 단백질 및 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제가 별개의 벡터에 암호화되어 있는 방법.
- 제2항에 있어서, 숙주 세포가 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제를 포함하는 플라스미드로 영구 형질전환되고 연속해서 이종 단백질을 포함하는 플라스미드로 추가로 형질전환되는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 효모 세포이고 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제가 KEX2 및 YAP3로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로-서열이 효모(알파)-인자 프로-서열인 방법.
- KDEL(서열 동정 번호 4), DDEL(서열 동정 번호 3) 및 HDEL(서열 동정 번호 2)로 이루어진 그룹중에서 선택된 소포체 보유 시그날에 융합되어 있는, 푸린, PC1, PC2, PC3, YAP3 및 KEX2p로 이루어진 그룹중에서 선택된 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자.
- 제6항에 있어서, 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제가 가용성인 제조합 DNA 분자.
- 제6항에 있어서, 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제가 C-말단 연장부 HDEL을 갖는 KEX2, 서열 동정 번호 1의 아미노산 서열 및 C-말단 연장부 HDEL을 갖는 가용성 KEX2, 및 C-말단 연장부 HDEL을 갖는 YAP3으로 이루어진 그룹중에서 선택된 재조합 DNA 분자.
- 제6항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 하이브리드 벡터.
- 사람을 제외한 포유동물 세포, 및 클루이베로마이세스 락티스 및 사카로마이세스 세레비지애를 포함하는 효모 세포로 이루어진 그룹중에서 선택되고 제10항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제10항에 있어서, 안정하게 형질전환된 숙주 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 단백질이 생물학적 활성 단백질인 방법.
- 제12항에 있어서, 생물학적 활성 단백질이 인슐린 관련 단백질인 방법.
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