BRPI0809248A2 - Lisil oxidase - Google Patents

Description

LISIL OXIDASES Campo da invenção

A presente invenção relaciona-se a novas lisil oxidases.

Fundamento da invenção

Lisil oxidases

Amina oxidases formam uma família heterogênea de enzimas que catalisam a oxidação de substratos de amina primária a aldeídos reativos. As enzimas são subdivididas 10 em dois grupos com base na natureza de seu cofator. Flavina adenina dinucleotídeo (FAD) é o cofator de tais enzimas como monoamina oxidase A e B e de uma forma intracelular de poliamina oxidase (Csiszar, Progr. Nucl Ac Res and Mol Biol (2001), 70, 1-32). Um segundo grupo de amina oxidases 15 contém uma quinona, uma cadeia lateral de tirosina modificada, utilizada como cofator (Wang e cols., Science

(1996) 273, 1078-1084). As enzimas lisil oxidases (LOX) pertencem a essa subfamxlia de amina oxidases.

Amina oxidases catalisam a desaminação oxidativa de aminas primárias, secundárias e terciárias aos aldeídos correspondentes, com a subseqüente redução de O2 para H2O2 como ilustrado abaixo

RCH2NH3+ + O2 -* RCHO + NH4+ + H2O2

As aminas encontradas em mamíferos estão nos dois 25 grupos acima mencionados, monoamina oxidases dependentes de flavina (MAOs) e cobre amina oxidases que contêm quinona (CuAOs) (Duff e cols., Biochem (2003) 42, 15148-15157). MAOs são encontradas exclusivamente da membrana mitocondrial externa de virtualmente todos os tipos de 3 0 células e estão envolvidas na degradação de aminas >rimárias, secundárias e terciárias e na oxidação de vários íeurotransmissores. Acredita-se que as MAOs funcionem itravés de uma única transferência de elétrons ou através de um mecanismo de catalisação through a concerted 5 covalent, que envolve o cofator FAD (Duff e cols., Biochem (2003) 42, 15148-15157 e referências aqui citadas). CuAOs que contêm quinona parecem estar envolvidas exclusivamente em uma desaminação oxidativa das aminas primárias. Essas enzimas podem ser subdivididas em duas classes, com base no 10 tipo de cofator de quinona presente no sítio ativo: topa quinona (TPQ) ou lisil tirosilquinona (LTQ). Enzimas da última classe, conhecidas como lisil oxidases, são conhecidas por estarem associadas à formação do tecido conjuntivo através de catalisação da desaminação crucial da 15 cadeia lateral de peptidil lisina que inicia o entrecruzamento de resíduos de lisina em colágeno e elastina (Csiszar, Progr. Nucl Ac Res and Mol Biol (2001) , 70, 1-32) . Embora a biogenênese do LTQ-fator tenha ainda que ser examinada, a biogênese da TPQ tem sido 20 extensivamente estudada, por exemplo, com o uso de múltiplas estruturas em cristal aprisionadas (Duff e cols., Biochem (2003) 42, 15148-15157 ). A conversão de um resíduo de tirosina a TPQ requer apenas a enzima apo não processada, cobre e oxigênio molecular. A tirosina que é 25 modificada está presente na seqüência de consenso de sítio ativo conservada Asn-Tyr-Asp/Glu (Mu e cols., J Biol Chem (1992) 267, 7979-7982).

A catálise por CuAOs prossegue através de um mecanismo de ping-pong (Wilmot e cols., Science (1999) 286, 1724- 1728). A etapa chave é a conversão da quinonaimina inicial ι quinoaldimina, facilitada por abstradção de próton a >artir do carbono alfa do substrato por um aspartato ibsolutamente conservado que age como uma base geral. A hidrolase causa a liberação de produto do aldeído, gerando 5 um Cu (II)-aminoresorcinol em equilíbrio com Cu(I)semiquinona, que subseqüentemente reage com dioxigênio para produzir H2O2 e uma iminoquinona. A última é então hidrolisada, liberando NH4+ e devolvendo o cofator ao seu estado de repouso.

CuAOs que contêm TPQ são distribuídas amplamente na

natureza e foram purificadas a partir de mamíferos, plantas e microorganismos. Elas estão envolvidas na oxidação de várias mono- e diaminas alifáticas de cadeia curta a longa, incluindo várias aminas aromáticas (Duff e cols., Biochem 15 (2003) 42, 15148-15157). Em microorganismos, elas têm um papel nutricional na utilização de aminas primárias como a única fonte de nitrogênio ou carbono. 0 papel das amina oxidases em organismos superiores não é tão claro. Vários papéis são propostos para essas enzimas em plantas e 20 mamíferos como o de cicatrização de ferimentos, redução da concentração de aminas tóxicas, crescimento celular, sinalização e adesão.

A indução de metaloproteínas por íons de metal tem sido observada em uma ampla escala de tecidos animais e 25 organismos microbianos (Rayton & Harris, J Biol Chem (1979) 254, 621-626). Esse princípio foi muito usado por Haywood and Large (Biochem J (1981) 199, 187-201) para ajudar a induzir a expressão de amina oxidases microbianas durante o crescimento em meio que contém aminas como as únicas fontes 30 de nitrogênio. Eles foram capazes de induzir a expressão de luas amina oxidases em Candida boidinii. A presença de duas imina oxidases parece ser comum em leveduras (Kuchar & )ooley, J Inorg Biochem (2001) 83, 193-204). Elas purificam as enzimas correspondentes e mostraram que diferiam na especificidade de substrato. As enzimas foram denominadas metilamina oxidase e benzilamina oxidase. Posteriormente, foi mostrado em uma abordagem similar que a levedura Pichia pastoris também contém duas amina oxidases (Green e cols., Biochem J (1983) 211, 481-493). A benzilamina oxidase foi também caracterizada por Tur & Lerch (FEBS Letters (1988) 23 8, 74-76) . Eles demonstraram que a oxidase contém um grupo quinona, um átomo de cobre, e que a enzima tem uma ampla especificidade de substrato. Com o uso da lisina, peptídeos modelo, elastina e colágeno como substratos, eles mostraram que a oxidase tem atividade substancial de lisiloxidase. Com base em estudos de inibição com βaminopropionitril, eles sugeriram que a enzima é uma cobre lisil-oxidase (E.C. 1.4.3.13). A enzima tem sido referida desde então como lisil oxidase. Dove e cols. (FEBS Letters (1996) 398, 231-234) mostraram que essa cobre lisil oxidase contém TPQ como um cofator, que a distingue de lisil oxidases que são todas de mamífero e contêm LTQ como cofator. A enzima foi clonada, seqüenciada e também caracterizada por Kuchar & Dooley (J Inorg Biochem (2001) 83, 193-204). Eles foram capazes de superexpressar a enzima intracelular a 10 mg por litro, tornando-a a primeira lisil oxidase que foi superexpressa de forma bem-sucedida. Eles confirmaram a presença de 1 íon de cobre por molécula da enzima e a presença de cofator TPQ. Eles também estenderam o trabalho sobre a especificidade do substrato da enzima, iostrando que ele é de certa forma similar às oxidases de mamífero e é capaz de oxidar resíduos de lisina em jeptídeos. A lisil oxidase de Pichia pastoris tem, no entanto, uma especificidade de substrato muito mais ampla comparada às enzimas de mamífero (Kuchar & Dooley, J Inorg Biochem (2001) 83, 193-204). A enzima mostra, ao contrário, baixa homologia de seqüência a outras amina oxidases. A maior homologia foi com diamina oxidase de rim humano (50% de similaridade, 30% de identidade). A comparação de seqüência com outras amina oxidases mostrou que apenas 2 9 resíduos eram absolutamente conservados, incluindo aqueles na seqüência de consenso de TPQ (Thr-Xxx-Xxx-Asn-TyrGlu/Asp-Tyr, em que Xxx é qualquer um dos vinte aminoácidos naturais) e as três histidinas que fazem complexo com o átomo de cobre.

As estruturas tridimensionais foram determinadas de cinco amina oxidases, que se originam de Escherichia coli (Parsons e cols., Estrutura (1995) 3, 1171-1184), Pisum savitum (Kumar e cols., Estrutura (1996) 4, 943-955), 20 Hansenula polimorpha (Li e cols., Estrutura (1998) 6, 293- 307), Arthrobacter globiformis (Wilce e cols., Biochemistry

(1997) 36, 16.116-16.133) e Piehia pastoris (Duff e cols., Biochem (2003) 42, 15148-15157; Duff e cols., Acta crystallogr D Biol crystallogr (2006) 62, 1073-1084). A 25 enzima de Piehia é a única que é uma lisil oxidase. Suas estruturas são similares, mostrando quatro domínios estruturais denominados Dl, D2, D3 e D4, respectivamente. O domínio Dl foi observado apenas na enzima de E coli, mas acredita-se que exista na enzima de Piehia também. 0 sítio 30 ativo está localizado no domínio de núcleo grande D4, os lomínios menores D3 e D2 são N-terminais ao domínio D4. As ;nzimas são cristalizadas como dímeros. Não usual é a iresença de uma cavidade preenchida com grande solvente, referida como lago, no interior do dímero entre os dois 5 domínios D4. 0 sítio de cobre em cada subunidade backs onto the Iake com o cofator de TPQ se apoiando no lado distai do átomo de cobre. Um canal longo e estreito conecta a TPQ ao solvente externo (Duff e cols., Biochem (2003) 42, 15148- 15157). Esse canal ao sítio ativo é particularmente amplo 10 na enzima de Pichia em que ele contém em sua entrada uma seqüência de resíduos ácidos Asp-Asp-Glu-Thr-Glu-Glu. Acredita-se que esses resíduos facilitem a entrada do grupo amino de lisina carregado via interações eletrostáticas. Na parte mais inferior do canal, ele torna-se mais 15 hidrofóbico, facilitando a desprotonação dos grupos lisina à forma de amina neutra que pode subseqüentemente ser oxidada no sítio ativo. 0 sítio ativo compreende um átomo de cobre coordenado por três histidinas (res nr 528, 530 e 694) e pelo 04 de TPQ (res nr 478) . A posição de Asp398 no 20 sítio ativo é consistente com o papel proposto desse resíduo como a base catalítica totalmente conservada.

Por vários anos, a lisil oxidase de Pichia pastoris foi a única lisil oxidase microbiana conhecida. No entanto, EPl 466 97 9 descreve o achado de uma amina oxidase derivada 25 de Aspergillus oryzae que é denominada lisil oxidase. 0 genoma de Aspergillus oryzae foi usado pelos inventores para rastrear as lisil oxidases, e eles descrevem o achado de um gene que eles caracterizam como altamente homólogo ao gene conhecido de Pichia pastoris. Não é claro a partir da 30 descrição da patente o que é considerado altamente lomólogo. Nós fizemos um alinhamento de seqüência das leqüências dè Pichia pastoris e Aspergillus oryzae e lescobrimos surpreendentemente apenas 35% de identidade, que geralmente não é considerado como uma homologia alta.

Percentagens de 60%, preferivelmente 70%, mais preferivelmente 80% e maiores devem ser consideradas homologia alta. Além disso, a lisil oxidase de Aspergillus oryzae difere inesperadamente em várias posições importantes de outras lisil oxidases e amina oxidases: por 10 exemplo, posição 164 da proteína anotada do gene de Asperillus oryzae descrito em EP 1 466 979 (Id. de Seq. N°:2) é uma alanina, enquanto em todas as outras amina e lisil oxidases descritas essa posição é uma prolina altamente conservada. Adicionalmente, a posição 78 nessa 15 proteína anotada é uma metionina, enquanto leucina é altamente conservada em amina oxidases nessa posição. Além disso, a proteína descrita em EP 1 4 66 97 9 contém uma inserção extra de 2 aminoácidos depois do resíduo 109 quando comparada a lisil oxidase de mamífero e de Pichia. 20 Ademais, a posição 499 na proteína descrita em EP 1 466 979 é uma treonina, embora essa posição seja sempre um resíduo hidrofóbico em outras amina oxidases. As posições conservadas em proteínas estão freqüentemente associadas com a função primária de uma enzima, e não podem ser 25 modificadas sem mudar a atividade catalítica da enzima. É notável que nessa lisil oxidase em particular vários de tais resíduos conservados são modificados, e espera-se que eles tenham um efeito sobre a atividade da enzima.

0 gene foi clonado em Aspergillus nidulans por meio de integração aleatória do gene no genoma. Os requerentes .ndicam que, em vez de A. nidulans, outras cepas também >odem ser usadas como Aspergillus niger e Aspergillus iryzae. Surpreendentemente, é descrito em EPl 466 97 9 que a atividade de lisil oxidase pode ser medida no fluido de cultura de alguns transformantes quando esse gene foi superexpresso, em contraste à enzima Pichia pastoris que é uma enzima intracelular. Aparentemente, a lisil oxidase de Aspergillus oryzae é uma enzima secretada. A presença da enzima foi estabelecida por meio de medições de atividade. Para a caracterização de lisil oxidases (E.C. 1.4.3.13) e sua distinção de lisina oxidases (E.C. 1.4.3.14), o uso de substratos correto é de crucial importância. 0 ensaio descrito para lisil oxidases em EPl 466 979 (exemplo 11 naquela patente) usa lisina como o único substrato. Esse aminoácido tem dois grupos amino livres, um no átomo Ca e um na cadeia lateral de lisina no átomo Ce. Lisil oxidases apenas oxidam o último e deixam o outro grupo não modificado. Isso pode ser determinado pelo uso de substratos de lisina em que o grupo α-amino é bloqueado por, por exemplo, acetilação. Tais substratos são essenciais para a identificação adequada de lisil oxidases, e são muito comumente usados na caracterização de tais enzimas (veja, por exemplo, Kuchar & Dooley1 J Inorg Biochem (2001) 83, 193-204). Uma vez que tais substratos não são usados em EPl 466 979, não é possível concluir a partir dos dados fornecidos em EPl 466 979 que a atividade da enzima encontrada é de fato atividade de lisil oxidase. A enzima pode ser uma lisina oxidase (E.C. 1.4.3.14; Llisina: oxigênio 2-oxidorredutase) e não uma lisil oxidase 3 0 (E.C. 1.4.3.13, proteína-L-lisina: oxigênio 6- •xidorredutase). Além disso, a atividade medida foi >astante baixa, sendo apenas algumas vezes a atividade de iase da cepa não transformada (EPl 466 979, exemplo 11) . Para clarificar esse assunto, nós tentamos superexpressar a proteína de Id. de Seq. N°: 2 (EP 1 466 979) em Aspergillus niger (exemplo 1 do atual pedido) . De acordo com EPl 466 979, Aspergillus niger é um organismo de expressão preferido pára a lisil oxidase. Nós não fomos capazes de isolar ou demonstrar uma lisil oxidase ativa a partir do fluido de cultura de todos os transformantes testados. Em vista dos argumentos acima discutidos, em combinação com o trabalho experimental descrito nos exemplos 1 e 2 do atual pedido, é improvável que EPl 4 66 97 9 tenha descrito a identificação de uma lisil oxidase funcional. EPl 466 97 9 também não descreveu qualquer tentativa de purificar a enzima, mas, ao contrário, são realizadas medições da atividade com sobrenadantes de fermentação brutos que podem conter várias atividades não especificadas da enzima. Adicionalmente, nem todos os transformantes descritos em EP 1 466 979 mostraram atividade aumentada comparados à cepa não transformada. É, portanto, duvidoso se a seqüência de proteínas descrita em EP 1 466 979 é, de fato, correta e codifica para uma lisil oxidase funcional. A atividade da oxidase que foi medida em alguns dos transformantes em EP 1 466 979 deve, assim, não ser devida à superexpressão do gene descrito, mas deve ser causada pela presença de atividade de base de amina oxidase. É surpreendente que no meio da cepa de referência uma quantidade considerável de arginina seja adicionada (EPl 466 97 9, exemplo 11) . É 3 0 conhecido que as amina oxidases podem ser inibidas por :ompostos que contêm guanidina, como arginina (Kuchar & )ooley, J Inorg Biochem (2001) 83, 193-204), e a arginina :ontém tal grupo guanidina. No caso de a cepa vazia produzir baixas quantidades de atividade de amina oxidase,

5 essa pode ser inibida pela arginina que está presente no meio. Se esse for o caso, a cepa vazia deve ser testada em um ambiente que não foi um bom controle uma vez que o valor de base deve ser artificialmente diminuído. Naquela situação, essa pode ser a razão para a baixa atividade 10 relatada dos transformantes, que mostrou apenas algumas vezes a atividade de base. Essa baixa atividade deve ser a atividade de base regular observada na ausência de arginina.

A partir do acima, está claro que as lisil oxidases 15 são conhecidas, mas nenhuma lisil oxidase foi produzida de modo extracelular. A lisil oxidase de Pichia é uma enzima intracelular e é apenas produzida em níveis de 10 mg/ml (Kuchar & Dooley, J Inorg Biochem (2001) 193-204) . Além disso, a enzima tem que ser liberada a partir da célula, o

2 0 que torna o processamento da enzima em uma escala industrial complicado e não atrativo. Uma vez que outras lisil oxidases não foram superproduzidas a níveis de expressão economicamente interessantes, há ainda uma necessidade por uma lisil oxidase extracelular que possa 25 ser produzida em grandes quantidades (gramas por litro).

De um ponto de vista econômico, existe uma clara necessidade por um meio melhorado de produção de lisil oxidases em altas quantidades e em uma forma relativamente pura, comparada à pouca produtividade da enzima de Pichia pastoris e da enzima de Aspergillus oryzae. Um modo >referido de fazer isso é por meio da superprodução de tal .isil oxidase com o uso de técnicas de DNA recombinante. Um iodo particularmente preferido de fazer isso é por meio da superprodução de uma lisil oxidase derivada de fungo e um 5 modo mais preferido de fazer isso é por meio da superprodução de uma lisil oxidase derivada de Aspergillus. Para permitir a última via de produção informação única de seqüência de uma lisil oxidase derivada de Aspergillus é essencial. Mais preferível, a seqüência de nucleotídeos 10 inteira do gene de codificação tem que ser disponível.

Um meio melhorado de produção da lisil oxidase secretada recém identificada em altas quantidades e em uma forma relativamente pura é por meio da superprodução da enzima codificada por Aspergillus com o uso de técnicas de 15 DNA recombinante. Um modo preferido de fazer isso é por meio da superprodução de tal lisil oxidase secretada em um microorganismo hospedeiro de grau alimentício. Microorganismos de grau alimentício conhecidos incluem Aspergilli, Trichoderma, Streptomyces, Bacilli e leveduras

2 0 como Saccharomyces e Kluyveromyces. Um modo ainda mais

preferido de fazer isso é por meio da superprodução da lisil oxidase derivada de Aspergillus secretada em um fungo de grau alimentício como Aspergillus. Mais preferida é a superprodução da lisil oxidase secretada em um fungo de 25 grau alimentício em que o uso de códon do gene que codifica lisil oxidase foi otimizado para o hospedeiro de expressão de grau alimentício usado. Em geral, para permitir as últimas vias de otimização, informação única de seqüência de uma lisil oxidase secretada é desejável. Mais

3 0 preferível, a seqüência de nucleotídeos inteira do gene que :odifica lisil oxidase tem que ser disponível. Uma vez que > gene que codifica uma lisil oxidase secretada é :ransformado em um hospedeiro preferido, cepas selecionadas podem ser usadas para fermentação e isolação da proteína de lisil oxidase secretada a partir do caldo de fermentação.

Uma vez que a nova enzima torne-se disponível em grandes quantidades e em uma forma relativamente pura, proteínas alimentares ou hidrolisadas com melhor textura são produzidas em uma forma de grau alimentício e econômica.

Enzimas que podem catalisar a formação de entrecruzamento de proteínas covalentes são raras. Um exemplo é a classe de proteína sulfidril oxidases, que podem catalisar a formação de pontes de dissulfeto entre as 15 proteínas. A aplicabilidade dessas enzimas é, no entanto, limitada primariamente por causa da ocorrência limitada de grupos sulfidril livres em proteínas. Especialmente as proteínas alimentares são freqüentemente submetidas a condições de oxidação durante o processamento (por exemplo, 20 durante a secagem), o que leva freqüentemente à oxidação de grupos tiol disponíveis. Em algumas aplicações, no entanto, como em pães, a formação de ponte de dissulfeto e reorganização (reshuffling) de ponte de dissulfeto é de alta relevância para a formação adequada de textura.

Outra classe bem conhecida de enzimas de reticulação

de proteína é transglutaminase, que pode catalisar a formação de uma reticulação covalente entre as proteínas por meio de um resíduo de lisina e glutamina. Transglutaminase (E.C. 2.3.2.13) catalisa uma reação de transferência de acil em que os grupos γ-carboxamida de ■esíduos de glutamina ligados a peptídeo são os doadores de lcíI. Transglutaminase microbiana, derivada de Itreptoverticillium mobaraense, é comercialmente disponível sob o nome comercial Activa TG (Ajinomoto, Japan) , mas também transglutaminase derivada de sangue é comercialmente disponível (nome comercial: Harimex). A transglutaminase tem sido usada para catalisar a reticulação de proteínas do soro, proteínas da soja, proteínas do trigo, miosina da carne, caseína e actomiosina bruta refinadas a partir de carne de aves mecanicamente desossada, (Zhu e cols., Appl Microbiol Biotechnol (1995) 44, 277-282). O uso de transglutaminase também foi descrito para produtos de peixe, substitutos de carne e alternativos (processados), produtos de queijo, arroz cozido, macarrão, iogurte e produtos laticínios (congelados). Exemplos de aplicações de transglutaminase são descritos nas seguintes patentes: JP09206006 (arroz cozido), JP09154512 (macarrão), JP092060031 (peixe), JP08224063 (proteína de gelação), JP08112071 (Tofu), JP08056597 (boa crocrância depois da fritura), JP07184554 (sorvete), WO 9520662 A (ostra japonesa), JP06261712 (caranguejo), EP 610649 (iogurte), JP06153827 (arroz), W09319610 (leite), JP02131537 (queijo). Freqüentemente, o objetivo é o de modificar a textura do alimento, mas ela também é usada para, por exemplo, aumentar o rendimento de queijo. Uma desvantagem da transglutaminase (microbiana) é sua estabilidade em calor relativamente alta, o que torna a sua inativação completa difícil sob condições regulares de processamento de alimentos, como pasteurização, esterilização ou tratamento 3 0 por calor extremamente elevado. A 70°C, a inativação da ;nzima requer 15 minutos e a 750C ainda 5 minutos (folha de .nformação do produto Activa TGi Ajinomoto). Os tempos íormais de pasteurização são 15-30 segundos a 72°C, que é muito mais curto que o tempo necessário para a inativação 5 de transglutaminase. A inativação da enzima transglutaminase é necessária por questão de regulamentos de alimentos. Aquecimento longo em temperaturas elevadas é indesejado para várias aplicações alimentares porque ele leva à formação de sabores e cores indesejados que 10 resultam, por exemplo, das reações de Maillard. Várias outras classes de enzima foram descritas como úteis para obter agentes de reticulação de proteína, incluindo lipoxigenoase, proteína disulfetoisomerase, fenoloxidase, peroxidases, proteína dissulfeto redutases, e tirosina 15 oxidases. Exemplos de substratos para as enzimas de reticulação de proteína incluem todas as proteínas derivadas de fontes animais ou de plantas, por exemplo, gelatina, proteínas do leite como soro e caseína, proteína da soja, proteína do trigo, gluten, proteína do milho,

2 0 proteína da ervilha e colãgeno.

Umas poucas patentes descrevem o uso de lisil oxidases. JP02245166 e JP04094670 descrevem o uso de lisil oxidase para modificar proteína de peixe para pasta de peixe. DE1940069 descreve a manufatura de uma proteína 25 reticulada que reveste para substâncias ativas em que a lisil oxidase é usada para obter reticulação de proteína. JP007825 descreve a preparação de material de moldagem de folha de proteína em que a lisil oxidase é mencionada como uma forma possível para reticulação de proteínas. 30 W0200307728 descreve a preparação de gêneros alimentícios >ara vegetarianos a partir de proteína fúngica ;nzimaticamente reticulada, em que a transglutaminase, >roteína dissulfeto isomerase, sulfidril oxidase, várias polifenil oxidases, lisiloxidase, peroxidase e lipoxigenase 5 são mencionadas como possíveis enzimas de reticulação ou proteína fúngica. W02004105485 descreve a preparação de partículas de liberação lenta em que o uso possível de lisil oxidase para reticulação de proteína é mencionado. Esses exemplos demonstram e sustentam o uso industrial de 10 uma lisil oxidase.

Sumário da invenção

Constatou-se, de modo surpreendente, que uma única combinação de 5 porções de seqüência de aminoácidos é capaz de identificar nova classe de lisil oxidases microbianas 15 excretadas com propriedades únicas. A classe de lisil oxidases da invenção é única porque elas são excretadas e porque elas têm uma preferência por grupos amino nos resíduos de lisil em peptídeos ou proteínas sobre grupos amino em substratos de baixo peso molecular como benzil

2 0 amina e triptamina.

Além disso, a presente invenção fornece:

(I) Lisil oxidases de Aspergillus nidulans, Cryptococcus neoformans, Podospora anserina e Fusarium graminearum;

(2) Lisil oxidases que contêm a seguinte porção de

aminoácidos (resíduos entre colchetes indicam degeneração permitida naquele ponto, os aminoácidos estão em código de

1 letra): I-H-D-[NS]-L-S-G-S-M-H-D-H-V-[IL]-N-F-K (Id. de Seq. N0:11)

(3) uma seqüência de DNA que codifica uma lisil >xidase de (1) ou (2) ;

(4) um vetor de expressão que compreende uma seqüência de DNA de (3) ;

(5) uma célula hospedeira que compreende um vetor de

expressão de (4); e

(6) um processo para a identificação de novas enzimas de textura e de melhoria de rendimento que compreende rastreamento e seqüência de aminoácidos para a presença da porção de (2).

(7) um processo para preparar intermediários reativos

de proteína que possam ser ativados por uma etapa de aquecimento para formar um gel de proteína.

As lisil oxidases da invenção são capazes de catalisar a desaminação oxidativa de grupos lisil em uma proteína ou 15 peptídeo aos aldeídos correspondentes, com a subseqüente redução de O2 a H2O2, e são vantajosamente usadas na preparação de alimentos, ração ou produtos nutracêuticos, ou produtos intermediários destes.

Portanto, a presente invenção fornece uma lisil oxidase que é capaz de catalisar a desaminação oxidativa de grupos lisil em uma proteína ou peptídeo aos aldeídos correspondentes, com a subseqüente redução de O2 a H2O2 segundo a qual a lisil oxidase

(a) mostra uma proporção entre atividade de lisil 25 oxidase para Ac-Gly-Lys-OMe e atividade de lisil oxidase para benzilamina de pelo menos 1.1, preferivelmente pelo menos 1.3, mais preferivelmente de pelo menos 1.4, segundo a qual as atividades são determinadas a 37 0C e um pH de 7,0; e.

(b) tem uma atividade ótima em uma temperatura entre 0 ϊ 60 °C,

e ο uso preferido desta na preparação de alimento, ração ou produtos nutracêuticos, ou produtos intermediários destes.

De acordo com outro aspecto, a invenção fornece uma

lisil oxidase que é capaz de catalisar a desaminação oxidativa de grupos lisil em uma proteína ou peptídeo aos aldeídos correspondentes, com a subseqüente redução de O2 a H2O2 segundo a qual a lisil oxidase compreende a seguinte 10 porção de aminoácidos (resíduos entre colchetes indicam degeneração permitida naquele ponto, os aminoácidos estão em código de 1 letra):

IHD [NS] LSGSMHDHV [IL] NFK

e o uso preferido destes na preparação de alimento, ração ou produtos nutracêuticos, ou produtos intermediários destes.

Em outro aspecto da invenção, é fornecido um polipeptídeo que tem atividade de lisil oxidase, selecionado do grupo que consiste em:

(a) um polipeptídeo que tem uma seqüência de

aminoácidos que tem pelo menos 60% de identidade de seqüência de aminoácidos com a seqüência de aminoácidos inteira de qualquer uma de Id. de Seq. N°: 1 a 4;

(b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de baixo rigor com (i) a seqüência de ácidos nucléicos de Id. de Seq. N°:

6 ou (ii) uma seqüência de ácidos nucléicos complementar à seqüência de ácidos nucléicos de Id. de Seq. N°: 6.

A lisil oxidase é vantajosamente usada para a

3 0 preparação de um alimento ou ração ou um nutracêutico ou jara a preparação de um produto intermediário para a ^reparação de um alimento ou ração ou um nutracêutico.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecido um método para a produção de lisil oxidase que 5 compreende o cultivo de uma célula hospedeira que compreende uma construção de ácido nucléico que compreende um polinucleotídeo que codifica a lisil oxidase que compreende a seqüência de aminoácido:

-IHD [NS] LSGSMHDHV [IL] N F K;

sob condições adequadas para produção da lisil

oxidase; e recuperação da lisil oxidase.

A presente invenção também se relaciona a um processo para a identificação de novas lisil oxidases que compreende o rastreamento de uma seqüência de aminoácidos para a presença da seqüência de aminoácidos:

-IHD [NS] LSGSMHDHV [IL] N F K.

Além disso, a invenção fornece um processo para modificar uma ração ou produto alimentício que contém a proteína ou peptídeo, o referido método compreendendo a 20 modificação da ração ou produto alimentício por contato dele com uma lisil oxidase da invenção ou uma composição de enzima de lisil oxidase da invenção.

0 código de uma letra de aminoácidos aqui usado é comumente conhecido na técnica e pode ser encontrado em Sambrook, e cols. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

2 a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Um aspecto da presente invenção é a superexpressão de lisil oxidase secretada quando as seqüências da presente invenção são usadas. Além disso, nós fornecemos uma porção Ie seqüência que pode ser usada para identificar e selecionar lisil oxidases secretadas ativas a partir de liferentes fungos. Com o uso dessa abordagem, nós fomos capazes de selecionar e expressar lisil oxidases de 5 Aspergillus nidulans, Fusarium graminearum, Podospora anserina e Cryptococcus neoformans.

As lisil oxidases da invenção serão inativadas durante processos de pasteurização regularmente usados na indústria alimentícia.

0 tratamento de pasteurização pode ser realizado em

uma temperatura de pelo menos 75°C, preferivelmente pelo menos 80°C. Em uma modalidade, o tratamento por calor é conduzido em uma temperatura entre 75°C e 14 5°C, em uma modalidade preferida o tratamento por calor é conduzido em 15 uma temperatura entre 75°C e 12O0C, em uma modalidade mais preferida o tratamento por calor é conduzido em uma temperatura entre 75°C e IOO0C, em uma modalidade ainda mais preferida o tratamento por calor é realizado entre 80°C e 90°C. A duração do tratamento por calor pode ser 20 qualquer tempo adequado para atingir a desativação da lisil oxidase. Em uma modalidade, a duração do tratamento por calor é entre 1 segundo e 3 0 minutos. Em uma modalidade o tratamento por calor é conduzido a 750C a 90°C graus por 5 segundos a 30 minutos, em outra modalidade o tratamento por 25 calor é conduzido a 80°C a 90°C por 2 segundos a 30 minutos, ainda em outra modalidade o tratamento por calor é conduzido a 80°C a 14 5°C de 1 segundo a 2 0 minutos. 0 tratamento por calor pode ser conduzido por qualquer método conhecido na técnica.

3 0 De acordo com outro aspecto da invenção, a enzima da .nvenção, quando incubada com proteínas, leva à modificação ia textura dos géis da proteína. A modificação é obtida em ím novo processo de duas etapas. Na primeira etapa, a proteína é tratada com a lisil oxidase. A reticulação é 5 obtida em uma segunda etapa em que a proteína é aquecida a pelo menos 75°C, preferivelmente 8O0C. Antes da reticulação, a proteína pode ser opcionalmente ultrafiltrada, ou seca sob condições de temperatura que não levam a reticulação substancial (<1%) da proteína. As

temperaturas de secagem são preferivelmente abaixo de 60°C, mais preferivelmente abaixo de 50°C, e mais preferivelmente abaixo de 4O0C. O tratamento por calor pode coincidir com o tratamento por calor usado para inativar a enzima. A proteína reticulada resultante pode ser usada como um

ingrediente em alimento e ração e melhorar sua textura.

De acordo com outro aspecto da invenção, a enzima da invenção, quando incubada com proteínas, leva à modificação na textura dos géis da proteína.

A presente invenção também fornece um processo para a

2 0 preparação de um aldeído reativo em uma proteína ou

peptídeo que compreende a desaminação oxidativa de lisilamina da proteína ou peptídeo por uma lisil oxidase e preferivelmente concentração e/ou secagem da proteína ou peptídeo que contém os aldeídos reativos.

Além disso, a presente invenção fornece um processo

para a preparação de uma proteína ou peptídeo reticulado que compreende o tratamento, preferivelmente por aquecimento, da proteína ou peptídeo que compreende aldeídos reativos, para a reticulação da proteína ou

3 0 peptídeo. De acordo com outro aspecto da invenção, a proteína ou >eptídeo que compreende aldeídos reativos formados por uma iesaminação oxidativa de lisil-amina da proteína, e que está preferivelmente em forma seca.

Descrição detalhada da invenção

Um "peptídeo" ou "oligopeptídeo" é aqui definido como uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos que são ligados através de ligações de peptídeo. Os termos "peptídeo" e "oligopeptídeo" são considerados sinônimos (como é 10 comumente reconhecido) e cada termo pode ser usado de modo intercambiável como o contexto requer.

Um "polipeptídeo" é aqui definido como uma cadeia que compreende mais de 30 resíduos de aminoácido. Todas as fórmulas ou seqüências de (oligo)peptídeo e polipeptídeo 15 nesta especificação são escritas da esquerda para a direita na direção do terminal amino para o terminal carboxi-, de acordo com a prática comum. O código de uma letra de aminoácidos aqui usado é comumente conhecido na técnica e pode ser encontrado em Sambrook, e cols.. (Molecular 20 Cloning: A Laboratory Manual, 2nd,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Por proteína do leite, entende-se leite, leite desnatado, leite com teor O de gordura, butter milk, 25 iogurte, leite em pó dissolvido em água até a concentração desejada da proteína, caseínaato dissolvido em água até a concentração desejada da proteína opcionalmente contendo proteínas do soro, uma solução de glicomacropeptídeo (GMP) de kapa-caseína, ou uma combinação destes.

3 0 Por hidrolisado, entende-se o produto que é formado >ela hidrólise da proteína (ou hidrolisado de proteína ou >roteína hidrolisada), o hidrolisado- solúvel em ácido sendo

i fração solúvel do hidrolisado da proteína que é também aqui descrito como peptídeo solúvel que contém composição ou composição que compreende peptídeos solúveis, ou uma mistura de um hidrolisado de proteína e um hidrolisado solúvel em ácido.

O termo nutracêutico como aqui usado denota a utilidade tanto no campo nutricional quanto no farmacêutico 10 de aplicação. Assim, novas composições nutracêuticas que compreendem a composição da invenção podem ter uso como suplemento para alimentos e bebidas e como formulações farmacêuticas ou medicamentos para aplicação enteral ou parenteral que podem ser formulações sólidas como cápsulas 15 ou comprimidos, ou formulações líquidas, como soluções, suspensões ou emulsões.

Substratos adequados para a reticulação de acordo com a invenção são proteínas, peptídeos, hidrolisados, proteínas modificadas ou peptídeos e outros compostos que

2 0 tenham uma funcionalidade de amina.

As enzimas de reticulação que são acima descritas estabelecem ligações covalentes entre as moléculas da proteína. A enzima transglutaminase catalisa a formação de ligação diretamente com o uso de resíduos de glutamina e 25 lisina. Os efeitos da ação de transglutaminase são freqüentemente imediatamente visíveis, por exemplo, como um aumento na viscosidade ou uma melhor textura (veja, por exemplo, Technical Information by Ajinomoto: Activa®WM, Das enzym mit biss; Thought TNO newletter, TNO Research

3 0 Institute, Netherlands, No 25, outubro de 1998, página 3) e Lão são necessárias etapas de processamento adicionais para >bter as reticulações. Outras estratégias de reticulação inzimática com o uso, por exemplo, de sulfidriloxidase ou hidrogenoperóxido, que geram enzimas também levam à 5 reticulação de proteína sem requerer etapas adicionais de processamento. 0 mesmo é reivindicado para lisil oxidases, que geram uma função de aldeído reativo por sua ação sobre os resíduos de lisina nas proteínas, e aplicação dessas proteínas modificadas foi descrita, por exemplo, em EP 10 0988859. Neste pedido de patente, o uso de lisil oxidase para obter reticulação de proteína é descrito. Os autores indicam especificamente que a proteína modificada deve ser tratada em temperaturas abaixo de 80°C, preferivelmente abaixo de 60°C. Aparentemente, o tratamento por calor não é 15 necessário para obter ligação de proteína. Soluções de proteínas reticuladas freqüentemente mostram viscosidade aumentada e capacidade de ligação em água aumentada, comparadas às proteínas não reticuladas sob condições similares. Isso é uma desvantagem quando as proteínas

2 0 reticuladas precisam ser adicionalmente processadas antes

do envio delas a partir do fornecedor de ingredientes para os usuários como fabricantes de alimentos. A proteína reticulada é de manuseio e processamento mais difíceis (por exemplo, filtração) por causa da alta viscosidade da 25 solução que contém a proteína reticulada; outras etapas de processamento como, por exemplo, secagem, tornam-se mais difíceis e caras quando ocorre o manuseio de proteínas reticuladas. O processo de secagem das proteínas reticuladas demanda mais energia, comparado àquele das

3 0 proteínas não reticuladas, uma vez que elas têm melhor :apacidade de ligação ã água. Seria de interesse quando .ntermediários de proteína reativa podem ser preparados a >artir do substrato de proteína inicial que são facilmente cruzados na aplicação quando desejado. Seria evitada a 5 formação de preparações viscosas e de alta ligação à água no local da produção dos ingredientes, evitando custos excessivos de operação e manuseio. Intermediários de proteína reativa requerem a modificação (funcionalização) dos substratos iniciais da proteína. Neste pedido de 10 patente, nós mostramos que, surpreendentemente, as proteínas modificadas com a lisil oxidases descrita neste pedido têm características de tais intermediários de proteína reativa. Proteínas como proteínas do soro e caseína que são modificadas com lisil oxidase não mostram 15 viscosidade aumentada. Quando as proteínas funcionalizadas são subseqüentemente aquecidas, os intermediários de proteína reativa formam reticulações de proteína, levando à viscosidade aumentada de soluções de proteína e textura aumentada.

Várias lisil oxidases foram descritas na literatura,

como acima indicado. A maioria delas é de origem em mamífero, e não foi superexpressa em altos níveis devido às suas características de pouca solubilidade (Kuchar & Dooley, J Inorg Biochem (2001) 83, 193-204) . Também a lisil 25 oxidase de Pichia pastoris é pouco expressa (10 mg/L, Kuchar & Dooley, J Inorg Biochem (2001) 83, 193-204), e essa enzima é também produzida de modo intracelular. EP 1 466 979 descreve uma suposta lisil oxidase, mas nós argumentamos acima por que acreditamos que essa não seja 30 uma lisil oxidase. Além disso, nós demonstramos no exemplo . que a clonagem e a expressão da lisil oxidase descrita em !P 1 466 979 (Id. de Seq. N°: 2 naquela patente) não levam

l produção de atividade de lisil oxidase.

Nós descobrimos de modo surpreendente que os polipeptídeos que contêm a porção de seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 11 codificam para lisil oxidases fúngicas ativas que são secretadas a partir da célula no meio de cultura. Nós fornecemos quatro exemplos de tais lisil oxidases. A seqüência de lisil oxidase ZGR é obtida de Aspergillus nidulans (Id. de Seq. N°: 1 e 6 que codificam para a seqüência de aminoácidos e um gene sintético que codifica essa proteína respectivamente); lisil oxidase ZGT é obtida de Cryptococcus neoformans (Id. de Seq. N°: 2 e 7 que codificam para a seqüência de aminoácidos e um gene sintético que codifica essa proteína respectivamente); lisil oxidase GLOl é obtida de Fusarium graminearum (Id. de Seq. N°: 3 e 8 que codificam para a seqüência de aminoácidos e a seqüência de DNA genômico que codifica essa proteína respectivamente) ; lisil oxidase ZGY é obtida de Podospora anserina (Id. de Seq. N°: 4 e 9 que codificam para a seqüência de aminoácidos e um gene sintético que codifica essa proteína respectivamente). Surpreendentemente, um polipeptídeo que é altamente homólogo a essas quatro proteínas, mas que não continha a porção de seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°:ll, também foi produzido, mas não mostrou a atividade enzimática desejada, em contraste às quatro proteínas que continham a porção de seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N0:11. Essa amina oxidase GL02 é obtida de Fusarium graminearum (Id. de Seq. N°: 5 e 10 que codificam para a seqüência de aminoácidos e a seqüência de DNA genômico que :odifica essa proteína respectivamente). As quatro lisil >xidases que foram identificadas com o uso da porção de seqüência de aminoácidos Id. de Seq. N°:11 tiveram maior 5 preferência pelos substratos de lisina, e lisil oxidases que são desprovidas da porção Id. de Seq. N0:11 tiveram um menor espectro de atividade preferido. Aparentemente, a pesquisa com a porção de aminoácido Id. de Seq. N°: 11 identifica especificamente as lisil oxidases com mais 10 atividade preferida sobre substratos de lisina, e é portanto uma nova ferramenta importante na identificação de lisil oxidases úteis.

A porção Id. de Seq. N°: 11 está localizada no centro ativo da lisil oxidase, quando ele é sobreposto na estrutura da proteína conhecida da lisil oxidase de Pichia pastoris (Duff e cols.. (2003) Biochemistry 42, 15148- 15157). As duas histidinas nesse porção correspondem a H528 e H530 da proteína lisil oxidase de Pichia pastoris. Essas duas histidinas estão envolvidas na ligação do átomo de cobre no sítio ativo da enzima. É muito bem concebível que diferenças nesse porção de aminoácido levem a mudanças próximas ou no centro ativo da enzima, e, portanto, têm um efeito sobre a atividade ou especificidade de substrato da enzima. Nós propomos que com o uso dessa porção uma pessoa habilitada na técnica pode identificar lisil oxidases fúngicas ativas que são úteis para a aplicação em alimentos e rações.

A capacidade das enzimas da invenção de oxidar resíduos de lisil em peptídeos é de interesse para aplicações industriais. Ainda mais vantajoso é que as iresentes enzimas são capazes de oxidar resíduos de lisil m proteínas. Lisil oxidases que têm uma maior preferência ior resíduos de lisil em proteínas e peptídeos comparados a substratos de baixo peso molecular como lisina ou benzil 5 amina livre são, portanto, preferidos na indústria. Essa preferência de substrato é um parâmetro vantajoso importante para a seleção de lisil oxidases para uso industrial.

Nós mostramos nesta invenção que é, de fato, possível 10 superexpressar lisil oxidases secretadas com a especificidade de substrato adequada quando as seqüências corretas são usadas. Além disso, nós fornecemos uma porção de seqüência que pode ser usado para identificar e selecionar lisil oxidases secretadas ativas a partir de 15 diferentes fungos. Com o uso dessa abordagem, nós fomos capazes de selecionar e expressar lisil oxidases de Aspergillus nidulans, Fusarium graminearum, Podospora anserina e Cryptococcus neoformans.

Lisil-oxidases catalisam a desaminação oxidativa de grupos lisil em proteínas:

R1-(CH2)4-NH2 + O2 -* R1-(CH2)3-CHO + H2O2 + NH3

Nessa reação, R1 é a cadeia de proteína da qual o resíduo de lisina é parte. 0 aldeído reativo pode reagir com um grupo amino livre de um segundo resíduo de lisina:

R1-(CH2)3-CHO + R2-(CH2)4-NH2 - R1-(CH2)3-NH-(CH2)4-R2 +

H2O

Desse modo, uma ligação covalente entre duas moléculas de proteína é formada. Em vez de com um segundo resíduo de lisina, o aldeído reativo também pode reagir com grupos

3 0 amina disponíveis diferentes daqueles dos resíduos de >roteína lisina para formar uma ligação covalente. A ■eticulação de proteínas e especialmente útil na lodificação da textura de alimentos. Alimentos são materiais muiti-componentes com estruturas complexas e texturas que são apreciadas pelos consumidores. Uma grande tarefa da moderna tecnologia de alimentos é a geração de novas estruturas projetadas a partir de uma escala limitada de ingredientes que tenham características de sabor e textura aceitáveis (Dickinson, Trends Food Sci technol (1997) 8, 334-339) . As proteínas são uma das classes principais de blocos de construção que são disponíveis para a tecnologia de alimentos para conferir atributos de textura semi-sólida, e a reticulação e agregação de moléculas de proteína em redes tridimensionais (géis) é um dos mecanismos mais importantes para o desenvolvimento de estruturas com propriedades mecânicas desejadas. Entre as várias texturas tradicionais de alimentos que são baseadas predominantemente em géis de proteína, estão aquelas de queijo, iogurte, salsicha, tofu (queijo de soja) e surimi (gel de carne de peixe). Várias interações têm um papel na formação do gel, como forças hidrofóbicas, interações eletrostáticas, ligações de hidrogênio e interações covalentes. A última leva a reticulações permanentes na rede de gel. As propriedades visco-elásticas e de fratura de um gel de alimento, e, portanto, sua textura como percebido pelos consumidores, são dependentes do equilíbrio entre as forças de estabilização do gel, incluindo as interações covalentes. Uma vez que as lisil-oxidases podem ser usadas para a formação de ligações covalentes intramoleculares, elas são úteis para a modificação da :extura de alimentos. Nós descobrimos que a enzima, quando .ncubada com protèínas, leva à modificação na textura dos féis da proteína. Além disso, há uma necessidade industrial por proteína que reticula enzima que seja inativada durante 5 os processos de pasteurização regularmente usados na indústria de alimentos. Nós mostramos que as lisil oxidases da presente invenção preenchem os critérios de instabilidade em calor.

Um polipeptídeo da invenção que tem atividade de lisil 10 oxidase pode estar em uma forma isolada. Como aqui definido, um polipeptídeo isolado é um polipeptídeo endogenamente produzido ou recombinante que é essencialmente livre de outros polipeptídeos não lisil oxidase, e é tipicamente pelo menos cerca de 20% puro, 15 preferivelmente pelo menos cerca de 40% puro, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% puro, mais preferivelmente cerca de 90% puro, e mais preferivelmente cerca de 95% puro, como determinado por SDS-PAGE. O 20 polipeptídeo pode ser isolado por centrifugação e métodos cromatográficos, ou qualquer outra técnica conhecida na prática para obtenção de proteínas puras a partir de soluções brutas. Será entendido que o polipeptídeo pode ser misturado com veículos ou diluentes que não interferem com 25 o objetivo pretendido do polipeptídeo, e assim o polipeptídeo nessa forma ainda será considerado como isolado. Eles geralmente compreenderão o polipeptídeo em uma preparação em que mais de 20%, por exemplo, mais de 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% ou 99%, em peso das proteínas

3 0 na preparação é um polipeptídeo da invenção. Preferivelmente, o polipeptídeo da invenção é obtido a >artir de um microorganismo qüè 'pôssui um gene que codifica Lma enzima com atividade de lisil oxidase. Mais preferivelmente o polipeptídeo da invenção é secretado a partir desse microorganismo. Ainda mais preferivelmente, o microorganismo é um fungo, principalmente um fungo filamentoso. Organismos doadores preferidos são, portanto, do gênero Fusarium, como aqueles da espécie Fusarium graminearum, do gênero Aspergillus, como aqueles da espécie Aspergillus nidulans, do gênero Cryptococcus, como aqueles da espécie Cryptococcus neoformans, ou do gênero Podospora, como aqueles da espécie Podospora anserina.

Em uma primeira modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado que tem uma seqüência de aminoácidos que tem um grau de identidade de seqüência de aminoácidos aos aminoácidos 1 a 817 de Id. de Seq. N0:1 (ou seja, o polipeptídeo) de pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 4 0%, preferivelmente pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 6 0%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, e mais preferivelmente pelo menos 97%, e que tem atividade de lisil oxidase.

Para os objetivos da presente invenção, o grau de identidade entre duas ou mais seqüência de aminoácidos é determinado por programa de pesquisa de base de dados de proteína BLAST P (Altschul e cols.., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402) com a matriz Blosum 62 e um limiar esperado de 10.

Um polipeptídeo da invenção pode compreender a leqüência de aminoácidos apresentada em Id. de Seq. N0:1 ou Lma seqüência substancialmente homóloga, ou um fragmento da leqüência que tem atividade de lisil oxidase. Em geral, a seqüência de aminoácidos de ocorrência natural mostrada em Id. de Seq. N0:1 é preferida.

0 polipeptídeo da invenção também pode compreender uma variante de ocorrência natural ou homólogo de espécie do polipeptídeo de Id. de Seq. N0:1.

Uma variante é um polipeptídeo que ocorre 10 naturalmente, por exemplo, em células de fungos, bacterianas, de levedura ou de planta, a variante tendo atividade de lisil oxidase e uma seqüência substancialmente similar à proteína de Id. de Seq. N0:1. 0 termo "variantes" refere-se aos polipeptídeos que têm o mesmo caráter 15 essencial ou funcionalidade biológica básica como a lisil oxidase de Id. de Seq. N°: 1, e inclui variantes alélicas. Preferivelmente, um polipeptídeo variante tem pelo menos o mesmo nível de atividade de lisil oxidase como o polipeptídeo de Id. de Seq. N°: 1. Variantes incluem

2 0 variantes alélicas da mesma cepa como o polipeptídeo de Id. de Seq. N°: 1 ou de uma cepa diferente do mesmo gênero ou espécie.

De modo similar, uma espécie homóloga da proteína da invenção é uma proteína equivalente de seqüência similar que é uma lisil oxidase e ocorre naturalmente em outra espécie. Exemplos de espécies homólogas do polipeptídeo de Id. de Seq. N°: 1 são listados em Id. de Seq. N°: 2, 3 e 4.

Variantes e espécies homólogas podem ser isoladas com o uso dos procedimentos aqui descritos que foram usados para isolar o polipeptídeo de Id. de Seq. N°: Ie realizar ais procedimentos em uma fonte celular adequada, por ixemplo, uma célula bacteriana, de levedura, fungo ou >lanta. Também é possível usar um marcador da invenção para marcar bibliotecas feitas de células de levedura, 5 bacterianas, de fungo ou planta para obter clones que expressam variantes ou espécies homólogas do polipeptídeo de Id. de Seq. N°: I. Os métodos que podem ser usados para isolar variantes e espécies homólogas de um gene conhecido são extensivamente descritos na literatura, e conhecidos 10 por aqueles habilitados na técnica. Esses genes podem ser manipulados por técnicas convencionais para gerar um polipeptídeo da invenção que assim pode ser produzido por técnicas recombinantes ou sintéticas conhecidas.

A seqüência do polipeptídeo de Id. de Seq. N°: 1 e de 15 variantes e espécies homólogas também pode ser modificada para fornecer polipeptídeos da invenção. Substituições de aminoácidos podem ser feitas, por exemplo, a partir de 1, 2 ou 3 a 10, 2 0 ou 3 0 substituições. 0 mesmo número de deleções e inserções também pode ser feito. Essas mudanças 20 podem ser feitas fora de regiões críticas para a função do polipeptídeo, uma vez que tal polipeptídeo modificado irá reter sua atividade de lisil oxidase.

Os polipeptídeos da invenção incluem fragmentos dos polipeptídeos de comprimento total acima mencionados e de 25 variantes destes, incluindo fragmentos da seqüência apresentada em Id. de Seq. N°: I. Tais fragmentos irão tipicamente reter atividade como uma lisil oxidase. Os fragmentos podem ser de pelo menos 50, 100 ou 200 aminoácidos de comprimento ou podem ter menos esse número 3 0 de aminoácidos em relação à seqüência de comprimento total iostrada em Id. de Seq. N°: 1.

Os polipeptídeos da invenção podem, se necessário, ser >roduzidos por meios sintéticos, embora sejam comumente feitos de modo recombinante como abaixo descrito. Os 5 polipeptídeos sintéticos podem ser modificados, por exemplo, pela adição de resíduos de histidina ou um tag T7 para ajudar a sua identificação ou purificação, ou pela adição de uma seqüência de sinal para promover sua secreção a partir de uma célula.

Portanto, as seqüências variantes podem compreender

aquelas derivadas de cepas de Aspergillus diferentes da cepa da qual o polipeptídeo de Id. de Seq. N°: 1 foi isolado. Variantes podem ser identificadas de outras cepas de Aspergillus por procura de atividade de lisil oxidase e 15 clonagem e seqüenciamento como aqui descrito. As variantes podem incluir a deleção, modificação ou adição de aminoácidos únicos ou grupos de aminoácidos na seqüência da proteína, desde que o peptídeo mantenha a funcionalidade biológica básica da lisil oxidase de Id. de Seq. N°: 1.

As substituições de aminoácido podem ser feitas, por

exemplo, a partir de 1, 2 ou de 3 a 10, 2 0 ou 3 0 substituições. 0 polipeptídeo modificado reterá geralmente a atividade como uma lisil oxidase. Substituições conservadoras podem ser feitas; tais substituições são bem conhecidas na técnica.

Seqüências de polipeptídeo mais curtas estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, um peptídeo de pelo menos 50 aminoácidos ou até 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 800 aminoácidos de comprimento é considerado como 3 0 dentro do escopo da invenção desde que ele demonstre a :uncionalidade biológica básica da lisil oxidase de Id. de íeq. N°: I. Em particular, mas não exclusivamente, esse Lspecto da invenção engloba a situação em que a proteína é um fragmento da seqüência de proteína completa.

A presente invenção também se relaciona a um

polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade de lisil oxidase, o referido polinucleotídeo compreende

(a) uma seqüência de polinucleotídeos que codifica aminoácido Id. de Seq. N0:1, e

(b) uma seqüência de polinucleotídeos que codifica aminoácido Id. de Seq. N°:2, e

(c) uma seqüência de polinucleotídeos que codifica aminoácido Id. de Seq. N°:3, e

(d) uma seqüência de polinucleotídeos que codifica

aminoácido Id. de Seq. N0:4.

Para a presente invenção, os polipeptídeos que contêm as seqüências de consenso de lisil oxidase de Id. de Seq. N°: 11 pertencem à invenção. Para a presente invenção é especialmente relevante que a proteína de interesse seja ativamente secretada no meio de crescimento. As proteínas secretadas são normalmente originalmente sintetizadas como pré-proteínas e a pré-seqüência (seqüência de sinal) é subseqüentemente removida durante o processo de secreção. O processo de secreção é basicamente similar em procariotas e eucariotas: a pré-proteína ativamente secretada é presa através da membrana, a seqüência de sinal é removida por uma peptidase de sinal específica, e a proteína madura é (re)-dobrada. Também para a seqüência de sinal, uma 3 0 estrutura geral pode ser reconhecida. As seqüências de iinal para secreção são localizadas no terminal amino da iré-proteína, e têm geralmente comprimento de 15-30 .minoácidos. O terminal amino contém preferivelmente aminoácidos positivamente carregados, e preferivelmente 5 nenhum aminoácido ácido. Acredita-se que essa região positivamente carregada interaja com os grupos principais negativamente carregados dos fosfolipídeos da membrana. Essa região é seguida por uma região de núcleo hidrofóbica, que transpõe a membrana. Essa região tem geralmente 10-20 10 aminoácidos de comprimento e consiste principalmente de aminoácidos hidrofóbicos. Os aminoácidos carregados não são normalmente presentes nessa região. A região que transpõe a membrana é seguida pelo sitio de reconhecimento para peptidase de sinal. O sítio de reconhecimento consiste em 15 aminoácidos com a preferência para pequeno-X-pequeno. Os aminoácidos pequenos podem ser alanina, glicina, serina ou cisteína. X pode ser qualquer aminoácido. Com o uso de tais regras, foi escrito um algoritmo que é capaz de reconhecer tais seqüências de sinal a partir de eucariotas e 20 procariotas (Bendtsen, Nielsen, von Heijne and Brunak. (2004) J. Mol. Biol., 340:783-795) . 0 program SignalP para calcular e reconhecer seqüências de sinal em proteínas é geralmente disponível

(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).

É relevante para a presente invenção que as seqüências

de sinal possam ser reconhecidas a partir da seqüência de proteína deduzida de um gene seqüenciado. Se um gene codifica uma proteína em que uma seqüência de sinal é prevista com o uso do programa SignalP, a chance de que essa proteína seja secretada é alta. Preferivelmente, o >bjetivo desta invenção é, portanto, o de fornecer um novo létodo para encontrar novas proteínas que tenham atividade Ie lisil oxidase com o uso de consenso de Id. de Seq. N°: 11, em combinação com a presença de uma seqüência de sinal detectada pelo programa SignalP.

Em uma segunda modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado que tem atividade de lisil oxidase, e é codificado por polinucleotídeos que hibridizam ou são capazes de hibridizar sob condições de baixo rigor, mais 10 preferivelmente, condições de médio rigor, e mais preferivelmente condições de alto rigor, com (i) a seqüência de ácidos nucléicos de Id. de Seq. N0 :6, ou (ii) um fragmento de ácido nucléico que compreende pelo menos uma porção de Id. de Seq. N0 :6, ou (iii) tendo bases que 15 diferem das bases de Id. de Seq. N0 :6; ou (iv) com um filamento de ácido nucléico complementar a Id. de Seq. N°: 6.

O termo "capaz de hibridizar" significa que o polinucleotídeo alvo da invenção pode hibridizar ao ácido nucléico usado como um marcador (por exemplo, a seqüência de nucleotídeos apresentada em Id. de Seq. N°: 6, ou um fragmento desta, ou o complemento de Id. de Seq. N° : 6, ou um fragmento desta) em um nível significativamente acima do de base. A invenção também inclui os polinucleotídeos que codificam a lisil oxidase da invenção, bem como as seqüências de nucleotídeos que são complementares a eles. A seqüência de nucleotídeos pode ser RNA ou DNA, incluindo DNA genômico, DNA sintético ou cDNA. Preferivelmente, a seqüência de nucleotídeos é DNA e, mais preferivelmente, 3 0 uma seqüência de DNA sintética. Tipicamente, um iolinucleotideo da invenção compreende uma seqüência iontigua de nucleotídeos que é capaz de hibridizar sob :ondições seletivas à seqüência codificadora ou ao complemento da seqüência codificadora de Id. de Seq. N°: 6.

Tais nucleotídeos podem ser sintetizados de acordo com métodos bem conhecido na técnica.

Um polinucleotídeo da invenção pode hibridizar à seqüência codificadora ou ao complemento da seqüência codificadora de Id. de Seq. N°: 6 em um nível 10 significativamente acima do de base. A hibridização de base pode ocorrer, por exemplo, por causa de outros cDNAs presentes em uma biblioteca de cDNA. 0 nível do sinal gerado pela interação entre um polinucleotídeo da invenção e a seqüência codificadora ou complemento da seqüência 15 codificadora de Id. de Seq. N0: 6 é tipicamente pelo menos de 10 vezes, preferivelmente pelo menos 20 vezes, mais preferivelmente pelo menos 50 vezes, e ainda mais preferivelmente pelo menos 100 vezes tão intenso quanto as interações entre outros polinucleotídeos e a seqüência 20 codificadora de Id. de Seq. N°: 6. A intensidade de interação pode ser medida, por exemplo, por radiomarcação do marcador, por exemplo, com 32P. A hibridização seletiva pode ser tipicamente realizada com o uso de condições de baixo rigor (0,3 M de cloreto de sódio e 0,03 M de citrato 25 de sódio a cerca de 40°C), médio rigor (por exemplo, 0,3 M de cloreto de sódio e 0,03 M de citrato de sódio a cerca de 50°C) ou de alto rigor (por exemplo, 0,3 M de cloreto de sódio e 0,03 M de citrato de sódio a cerca de 60°C).

Um polinucleotídeo da invenção também inclui genes sintéticos que podem codificar para o polipeptídeo de Id. Ie Seq. N°: I, Id. de Seq. N°: 2, Id. de Seq. N°: 3 ou Id. Ie Seq. N°: 4 ou variantes destes. É algumas vezes >referível adaptar o uso de códon de um gene à tendência preferida em um hospedeiro de produção. Técnicas para 5 desenhar e construir genes sintéticos são geralmente disponíveis (ou seja, http://www.dnatwopointo.com/). Modificações

Os polinucleotídeos da invenção podem compreender DNA ou RNA. Eles podem ser de filamento único ou duplo. Eles 10 também podem ser polinucleotídeos que incluem neles nucleotídeos sintéticos ou modificados que incluem ácidos nucléicos de peptídeo. Inúmeros diferentes tipos de modificações aos polinucleotídeos são conhecidos na técnica. Esses incluem uma estrutura de metilfosfonato e 15 fosforotioato, e a adição de cadeias de acridina ou polilisina nas extremidades 3' e/ou 5' da molécula. Para os objetivos da presente invenção, deve-se entender que os polinucleotídeos aqui descritos podem ser modificados por qualquer método disponível na técnica.

Deve-se entender que as pessoas habilitadas podem, com

o uso de técnicas rotineiras, fazer substituições de nucleotídeos que não afetam a seqüência de polipeptídeos codificada pelos polinucleotídeos da invenção para refletir o uso de códon de qualquer organismo hospedeiro particular em que os polipeptídeos da invenção devam ser expressos.

A seqüência codificadora de Id. de Seq. N°: 6 pode ser modificada por substituições de nucleotídeos, por exemplo, de 1, 2 ou 3 a 10, 25, 50, 100, ou mais substituições. 0 polinucleotídeo de Id. de Seq. N0 : 6 pode ser alternativamente ou adicionalmente modificado por uma ou iais inserções e/ou deleções e/ou por uma extensão em cada 'U em ambas as extremidades. 0 polinucleotídeo modificado eralmente codifica um polipeptídeo que tem atividade de lisil oxidase. As substituições degeneradas podem ser 5 feitas e/ou substituições podem ser feitas que resultam em uma substituição conservadora de aminoácido quando a seqüência modificada é traduzida, por exemplo, como discutido com referência ao último polipeptídeos.

Homólogos

Uma seqüência de nucleotídeos que é capaz de

hibridizar seletivamente ao complemento da seqüência de DNA codificadora de Id. de Seq. N0: 6 é incluída na invenção e terá geralmente pelo menos 50% ou 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de seqüência à seqüência codificadora de Id. de Seq. N°: 6 por uma região de pelo menos 60, preferivelmente pelo menos 100, mais preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos contíguos ou mais preferivelmente pelo comprimento total de Id. de Seq. N0:6. Ao mesmo modo, um nucleotídeo que codifica uma lisil oxidase ativa e que é capaz de hibridizar seletivamente a um fragmento de um complemento da seqüência codificadora de DNA de Id. de Seq. N0: 6 é também abrangido pela invenção. Qualquer combinação dos graus de identidade acima mencionados e tamanhos mínimos pode ser usada para definir os polinucleotídeos da invenção, com as combinações de mais alto rigor (ou seja, mais identidade por maiores durações) sendo preferidas. Portanto, por exemplo, um polinucleotídeo que é pelo menos 80% ou 90% idêntico sobre 60, preferivelmente sobre 100 nucleotídeos, forma um aspecto da .nvenção, assim como um polinucleotídeo que é pelo menos >0% idêntico sobre 200 nucleotídeos.

Os algoritmos BLASTP e BLAST N podem ser usados para calcular a identidade de seqüência ou para alinhar seqüências (como identificação de seqüências equivalentes ou correspondentes, por exemplo, em suas configurações padrão).

O programa para a realização de análise BLAST é publicamente disponível através do "National Center for 10 Biotechnology Information" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Esse algoritmo envolve primeiramente a identificação de par de seqüência de alta pontuação (HSPs) por identificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência em questão que combina ou satisfaz alguns pontos T do limiar de valor 15 positivo quando alinhados com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência da base de dados. T é referido como o limiar de pontuação de palavra vizinha. Esses acertos de palavras vizinhas iniciais agem como sementes para o início de pesquisas para encontrar HSPs que os

2 0 contêm. Os acertos de palavras são estendidos em ambas as direções junto a cada seqüência na medida em que a pontuação do alinhamento cumulativo possa ser aumentada. Extensões para os acertos de palavras em cada direção são impedidas quando: a pontuação do alinhamento cumulativo cai 25 pela quantidade X de seu valor máximo atingido; a pontuação cumulativa vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de pontuação negativa; ou a extremidade de cada seqüência é atingida. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e 30 velocidade do alinhamento. 0 programa BLASTN de comparação ie DNA-DNA usa como padrões um comprimento de palavra (W) ie 11, expectativa (E) de 10, è uma comparação de ambos os iilamentos. O programa BLASTP para comparação de proteínaproteína usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 5 3, a matriz de pontuação BLOSUM62, uma penalidade de existência de gap de 11 com uma penalidade de extensão de gap de 1, e uma expectativa (E) de 10.

O algoritmo BLAST realiza uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências. Uma medição de 10 similaridade gerada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N))i que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma combinação entre duas seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos deva ocorrer por acaso. Por exemplo, a seqüência é considerada similar a 15 outra seqüência se a menor probabilidade de soma em comparação da primeira seqüência à segunda seqüência é menor que cerca de 1, preferivelmente menor que cerca de

0,1, mais preferivelmente menor que cerca de 0,01, e ainda mais preferivelmente menor que cerca de 0,001.

Iniciadores e marcadores

Os polinucleotídeos da invenção incluem e podem ser usados como iniciadores, por exemplo, como iniciadores de reação de cadeia de polimerase (PCR), como iniciadores para reações de amplificação alternativa, ou como marcadores, 25 por exemplo, rotulados com um marcador por meios convencionais com o uso de marcadores radioativos ou não radioativos, ou os polinucleotídeos podem ser clonados em vetores. Tais iniciadores, marcadores e outros fragmentos serão pelo menos de 15, por exemplo, pelo menos 20, 25, 3 0 3 0 ou 4 0 nucleotídeos de comprimento. Eles serão tipicamente ie até 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 ou 300 nucleotídeos de :omprimento, ou até alguns nucleotídeos (como 5 ou 10 íucleotídeos) curtos da seqüência codificadora de Id. de Seq. N0:6.

Em geral, os iniciadores serão produzidos por meios

sintéticos, que envolvem uma produção em etapas da seqüência de ácidos nucléicos desejada, um nucleotídeo por vez. As técnicas e protocolos para a realização disso são prontamente disponíveis na técnica. Polinucleotídeos mais 10 longos serão geralmente produzidos com o uso de meios recombinantes, por exemplo, com o uso de técnicas de clonagem por PCR. Isso envolverá a confecção de um par de iniciadores (tipicamente de cerca de 15-30 nucleotídeos) para amplificar a região desejada da lisil oxidase a ser 15 clonada, fazendo contato dos iniciadores com mRNA, cDNA ou DNA genômico obtido a partir de célula de levedura, bacteriana, planta, procariótica ou fúngica,

preferivelmente de uma cepa de Aspergillus, realizando uma reação de cadeia de polimerase sob condições adequadas para 20 a amplificação da região desejada, isolação do fragmento amplificado (por exemplo, por purificação da mistura de reação em um gel de agarose) e recuperação do DNA amplificado. Os iniciadores podem ser desenhados para conter sítios de reconhecimento de enzima de restrição 25 adequados de modo que o DNA amplificado possa ser clonado em um vetor de clonagem adequado.

Alternativamente, podem ser construídos genes sintéticos que englobam a região codificadora da lisil oxidase secretada ou variantes desta. Polinucleotídeos que 3 0 são alterados em várias posições, mas ainda codificam a iesma proteína, podem ser convenientemente desenhados e :onstruídos com o uso dessas técnicas. Isso tem a vantagem Ie que o uso de códon pode ser adaptado ao hospedeiro de expressão preferido, e assim a produtividade da proteína 5 nesse hospedeiro pode ser melhorada. Além disso, a seqüência de polinucleotídeos de um gene pode ser modificada para melhorar a estabilidade do mRNA ou turnover reduzido. Isso pode levar a uma melhor expressão da proteína desejada ou variantes desta. Adicionalmente, a 10 seqüência de polinucleotídeos pode ser modificada em um gene sintético de modo que as mutações sejam feitas na seqüência de proteína que tem um efeito positivo sobre a eficiência de secreção, estabilidade, vulnerabilidade proteolítica, temperatura ótima, atividade específica ou 15 outras propriedades relevantes para produção industrial ou aplicação da proteína. As companhias que fornecem serviços para construção de genes sintéticos e otimizam o uso de códon são geralmente disponíveis.

Tais técnicas podem ser usadas para obter toda ou

2 0 parte dos polinucleotídeos que codificam as seqüências de

lisil oxidase aqui descritas. Regiões de íntrons, promotor e trailer estão dentro do escopo da invenção e também podem ser obtidas em uma maneira análoga (por exemplo, por meio recombinante, PCR ou técnicas de clonagem), iniciando com 25 DNA genômico de uma célula fúngica, de levedura, bacteriana, planta ou procariótica.

Os polinucleotídeos ou iniciadores podem carregar um marcador de revelação. Marcadores adequados incluem radioisótopos como 32P ou 35S, marcadores fluorescentes,

3 0 marcador de enzima, ou outros marcadores de proteína como iiotina. Tais marcadores podem ser adicionados aos >olinucleotícleõs ou iniciadores da invenção e podem ser letectados com o uso de técnicas conhecidas por pessoas habilitadas na. técnica.

Os Polinucleotídeos ou iniciadores (ou fragmentos

destes) marcados ou não marcados podem ser usados em testes com base em ácido nucléico para a detecção ou seqüenciamento de uma lisil oxidase ou uma variante desta em uma amostra de fungo. Tais testes de detecção

compreenderão geralmente fazer o contato de uma amostra de fungo suspeita de conter o DNA de interesse com um marcador que compreende um polinucleotídeo ou iniciador da invenção sob condições de hibridização, e detecção de qualquer duplex formada entre o marcador e ácido nucléico na

amostra. A detecção pode ser realizada com o uso de técnicas como PCR ou por imobilização do marcador em um suporte sólido, removendo qualquer ácido nucléico na amostra que não seja hibridizado ao marcador, e então detecção de qualquer ácido nucléico que seja hibridizado ao

2 0 marcador. Alternativamente, a amostra de ácido nucléico

pode ser imobilizada em um suporte sólido, o marcador hibridizado e a quantidade de marcador ligado a tal suporte depois da remoção de qualquer marcador não ligado detectada.

Os marcadores da invenção podem ser embalados

convenientemente na forma de um kit de teste em um recipiente adequado. Em tais kits o marcador pode ser ligado a um suporte sólido em que o formato do ensaio para o qual o kit é desenhado requer tal ligação. O kit também

3 0 pode conter reagentes adequados para o tratamento da Lmostra a ser marcada, para a hibridização do marcador ao Lcido nucléico na amostra, reagentes de controle, .nstruções e outros. Os marcadores e polinucleotídeos da invenção também podem ser usados em microensaio.

Preferivelmente, o polinucleotídeo da invenção é

obtido a partir do mesmo organismo que o polipeptídeo, como um fungo, em particular um fungo do gênero Aspergillus. Produção de polinucleotídeos

Polinucleotídeos que não têm 100% de identidade com Id. de Seq. N0 : 6 mas estão dentro do escopo da invenção podem ser obtidos de inúmeras formas. Portanto, variantes da seqüência de lisil oxidase aqui descrita podem ser obtidas, por exemplo, por marcação de bibliotecas de DNA genômico feitas a partir de uma escala de organismos, como aqueles discutidos como fontes dos polipeptídeos da invenção. Além disso, outros homólogos fúngicos, de planta ou procarióticos da lisil oxidase podem ser obtidos e tais homólogos e fragmentos desses em geral serão capazes de hibridizar a Id. de Seq. N°: 6. Tais seqüências podem ser obtidas por marcação de bibliotecas de cDNA ou bibliotecas de DNA genômico de outra espécie, e marcação de tais bibliotecas com marcadores que compreendem toda ou parte de Id. de Seq. N°: 6 sob condições de baixo, médio a alto rigor (como anteriormente descrito). Os marcadores de ácido nucléico que compreendem toda ou parte de Id. de Seq. N°: 6 podem ser usados para marcar cDNA ou bibliotecas genômicas a partir de outra espécie, como aquelas descritas como fontes para os polipeptídeos da invenção.

Espécies homólogas também podem ser obtidas com o uso 3 0 de PCR de degeneração, que usa iniciadores desenhados para lirecionar seqüências nas variantes e homólogos quie :odificam seqüências cie aminoácidos conservadas. Os .niciadores podem conter uma ou mais posições degeneradas e serão usados em condições de alto rigor menores que aquelas 5 usadas para clonar seqüências com iniciadores únicos de seqüência contra seqüências conhecidas. Um modo preferível de obter espécies homólogas de lisil oxidase é desenhar iniciadores que visam seqüências que codificam as seqüências de consenso descritas em Id. de Seq. N°: 11.

Alternativamente, tais polinucleotídeos podem ser

obtidos por mutagênese direcionada a sítio das seqüências de lisil oxidase ou variantes dessas. Isso pode ser útil quando, por exemplo, são necessárias mudanças de códon silenciosas a seqüências para otimizar preferências de 15 códon para uma célula hospedeira particular em que as seqüências de polinucleotídeos estão sendo expressas. Outras mudanças de seqüência podem ser feitas para introduzir sítios de reconhecimento de enzima de restrição, ou para alterar a propriedade ou função dos polipeptídeos 20 codificados pelo polinucleotídeos.

A invenção inclui polinucleotídeos de duplo filamento que compreendem um polinucleotídeo da invenção e seu complemento.

A presente invenção também fornece polinucleotídeos 25 que codificam os polipeptídeos da invenção acima descritos. Uma vez que tais polinucleotídeos serão úteis como seqüências para a produção de polipeptídeos recombinantes da invenção, não é necessário que eles sejam capazes de hibridizar à seqüência de Id. de Seq. N°: 6, embora isso 3 0 seja geralmente desejável, salvo indicação em contrário, ;ais polinucleotídeos podem ser rotulados, usados, e feitos :omo descrito se desejado. iOlinucleotideos Recombinantes.

A invenção também fornece vetores que compreendem um 5 polinucleotídeo da invenção, incluindo vetores de clonagem e de expressão, e em outro aspecto métodos de crescimento, transformação ou transfecção de tais vetores em uma célula hospedeira adequada, por exemplo, sob condições em que ocorre a expressão de um polipeptídeo, ou codificação de 10 uma seqüência da invenção. Também são fornecidas células hospedeiras que compreendem um polinucleotídeo ou vetor da invenção em que o polinucleotídeo é heterólogo ao genoma da célula hospedeira. 0 termo "heterólogo", comumente com relação à célula hospedeira, significa que o 15 polinucleotídeo não ocorre naturalmente no genoma da célula hospedeira ou que o polipeptídeo não é naturalmente produzido por aquela célula. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula de levedura, por exemplo, uma célula de levedura do gênero Kluyveromyces, Pichia,

2 0 Hansenula ou Saccharomyces ou uma célula de fungo

filamentoso, por exemplo do gênero Aspergillus, Triehoderma ou Fusarium.

Vetores

0 vetor em que o cassete de expressão da invenção é 25 inserido pode ser qualquer vetor que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor dependerá freqüentemente da célula hospedeira em que ele será introduzido. Portanto, o vetor pode ser um vetor autonomicamente replicante, ou

3 0 seja, um vetor que existe como uma entidade ixtracromossômica, replicação que é independente de •eplicação crómossômica, como um plasmídeo.

Llternativamente, o vetor pode ser um que quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e se replica junto com o cromossomo(s) em que ele foi integrado.

Preferivelmente, quando um polinucleotídeo da invenção está em um vetor ele é operacionalmente ligado a uma seqüência reguladora que é capaz de fornecer a expressão da 10 seqüência codificadora pela célula hospedeira, ou seja, o vetor é um vetor de expressão. O termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que permite que eles funcionem em sua maneira pretendida. Uma seqüência 15 reguladora como um promotor, intensificador ou outro sinal de regulação de expressão "operacionalmente ligado" a uma seqüência codificadora é posicionada de tal forma que a expressão da seqüência codificadora é realizada sob condições de produção.

2 0 Os vetores podem, por exemplo, no caso de vetores de

plasmídeo, cosmídeo, vírus ou fago, ser fornecidos com uma origem de replicação, opcionalmente um promotor para a expressão do polinucleotídeo e opcionalmente um intensificador e/ou um regulador do promotor. Uma seqüência 25 terminadora pode ser presente, como pode ser uma seqüência de poliadenilação. Os vetores podem conter um ou mais genes de marcador selecionável, por exemplo, um gene de resistência à ampicilina no caso de um plasmídeo bacteriano ou um gene de resistência à neomicina para um

3 0 vetor de mamífero. Vetores podem ser usados in vitro, por ;xemplo para a produção de RNA ou podem ser usados para :ransfectar ou transformar uma célula hospedeira.

A seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo é preferivelmente introduzida em um hospedeiro adequado como parte de uma construção de expressão em que a seqüência de DNA é operacionalmente ligada a sinais de expressão que são capazes de direcionar a expressão da seqüência de DNA nas células hospedeiras. Para a transformação do hospedeiro adequado com a construção de expressão são disponíveis procedimentos de transformação que são bem conhecidos pelas pessoas habilitadas. A construção de expressão pode ser usada para transformação do hospedeiro como parte de um vetor que carrega um marcador selecionável, ou a construção de expressão é co-transformada como uma molécula separada junto com o vetor que carrega um marcador selecionável. Os vetores podem conter um ou mais genes de marcador selecionável.

Marcadores selecionáveis preferidos incluem, sem limitação, aqueles que complementam um defeito na célula hospedeira ou conferem resistência a um fármaco. Eles incluem, por exemplo, genes de marcador versáteis que podem ser usados para a transformação da maioria de fungos filamentosos e eleveduras como genes de acetamidase ou cDNAs (os genes amdS, niaD, facA ou cDNAs de A.nidulans, A.oryzae, ou A.niger) , ou genes que fornecem resistência a antibióticos como G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, fleomicina ou resistência a benomil (benA). Alternativamente, marcadores de seleção específicos podem ser usados como marcadores auxotróficos que requerem cepas de hospedeiro mutante correspondentes: por exemplo, URA3 de S.cerevisiae ou genes análogos de outras leveduras), >yrG ou pyrA (de A.nidulans ou A.niger) , argB (de

i. nidulans ou A.niger) ou trpC. Em uma modalidade preferida o marcador de seleção é deletado da célula hospedeira 5 transformada depois introdução da construção de expressão de modo a obter células hospedeiras transformadas capazes de produzir o polipeptídeo que é livre de genes de marcador de seleção.

Outros marcadores incluem ATP sintetase subunidade 9 10 (oliC), orotidina-5'-fosfato-descarboxilase (pvrA), o gene de resistência bacteriana G418 (útil em levedura, mas não em fungos filamentosos), o gene de resistência à ampicilina (E. coli), o gene de resistência à neomicina (Bacillus) e o gene uidA de E. coli, que codificam para glucuronidase 15 (GUS). Os vetores podem ser usados in vitro, por exemplo, para a produção de RNA ou para transfectar ou transformar uma célula hospedeira.

Para a maioria dos fungos filamentosos e leveduras, a construção de expressão é preferivelmente integrada no genoma da célula hospedeira para obter transformantes estáveis. No entanto, para certas leveduras, são também disponíveis sistemas de vetor epissomal adequados em que a construção de expressão pode ser incorporada para expressão estável e de alto nível. Exemplos desses incluem vetores derivados de plasmídeos de 2 pm, CEN e pKDl de Saccharomyces e Kluyveromyces, respectivamente, ou vetores que contêm uma seqüência AMA (por exemplo, AMAl de Aspergillus) . Quando as construções de expressão são integradas nos genomas da célula hospedeira, as construções 3 0 são integradas em lócus aleatórios no genoma, ou em lócus lIvo predeterminados com o uso de recombinação homóloga, em :ujo caso o lócus alvo compreende preferivelmente um gene Lltamente expresso. Um gene altamente expresso é um gene cujo mRNA pode representar pelo menos 0,01% (p/p) do mRNA 5 celular total, por exemplo, sob condições induzidas, ou alternativamente, um gene cujo produto do gene pode representar pelo menos 0,2% (p/p) da proteína celular total, ou, no caso de um produto de gene secretado, pode ser secretado a um nível de pelo menos 0,05 g/l.

Uma construção de expressão para uma dada célula

hospedeira pode conter comumente os seguintes elementos operacionalmente ligados uns aos outros em ordem consecutiva da extremidade 51 para a extremidade 31 em relação ao filamento de codificação da seqüência que 15 codifica o polipeptídeo do primeiro aspecto: (1) uma seqüência promotora capaz de direcionar a transcrição da seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo na célula hospedeira dada, (2) preferivelmente, uma região 5' não traduzida (líder), (3) opcionalmente, uma seqüência de 20 sinal capaz de direcionar a secreção do polipeptídeo a partir da célula hospedeira dada no meio de cultura, (4) a seqüência de DNA que codifica uma forma matura e preferivelmente ativa do polipeptídeo, e preferivelmente também (5) uma região de terminação de transcrição 25 (terminadora) capaz de terminar a transcrição abaixo da seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo.

Abaixo da seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo, a construção de expressão contém preferivelmente uma região não traduzida 31 que contém um 3 0 ou mais sítios de terminação de transcrição, também referidos como terminador. A origem do terminador é menos :rítica. 0 terminador pode, por exemplo, ser nativo a uma seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo. No entanto, preferivelmente um terminador bacteriano é usado em células 5 hospedeiras de bactéria, um terminador de leveduras é usado em células hospedeiras de leveduras e um terminador de fungo filamentoso é usado em células hospedeiras de fungo filamentoso. Mais preferivelmente, o terminador é endógeno à célula hospedeira em que a seqüência de DNA que codifica 10 o polipeptídeo é expressa.

Melhor expressão do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da invenção também pode ser conseguida pela seleção de regiões reguladoras heterólogas, por exemplo, promotor, seqüência de sinal e regiões terminadoras, que 15 servem para aumentar a expressão e, se desejado, níveis de secreção da proteína de interesse do hospedeiro de expressão escolhido e/ou para fornecer o controle indutível da expressão do polipeptídeo da invenção.

Excluindo o promotor nativo para o gene que codifica o 20 polipeptídeo da invenção, outros promotores podem ser usados para direcionar a expressão do polipeptídeo da invenção. 0 promotor pode ser selecionado por sua eficiência no direcionamento da expressão do polipeptídeo da invenção no hospedeiro de expressão desejado.

Promotores/intensificadores e outros sinais de

regulação de expressão podem ser selecionados para serem compatíveis com a célula hospedeira para a qual o vetor de expressão é designado. Por exemplo promotores procarióticos podem ser usados, em particular aqueles adequados para uso em cepas de E.coli. Quando a expressão dos polipeptídeos da .nvenção é realizada em células de mamífero, promotores de lamífero podem ser usados. Promotores específicos para :ecido, por exemplo, promotores específicos para

hepatócito, também podem ser usados. Promotores virais 5 também podem ser usados, por exemplo, a repetição de terminal longo de vírus da leucemia de murídeo Moloney (MMLV LTR) , o promotor LTR de vírus do sarcoma rous (RSV) , o promotor SV40, o promotor IE de citomegalovírus humano (CMV), promotores do vírus herpes simples ou promotores de 10 adenovírus.

Promotores adequados de leveduras incluem os promotores GAL4 e ADH de S. cerevisiae e o promotor nmtl e adh de S. pombe. Promotores de mamífero incluem o promotor de metalotioneina que pode ser induzido em resposta a 15 metais pesados como cádmio. Promotores virais como o promotor de antígeno T grande SV4 0 ou promotores de adenovírus também podem ser usados. Todos esses promotores são facilmente disponíveis na técnica.

Promotores de mamífero, como promotores de β-actina, podem ser usados. Promotores específicos para tecido, em particular promotores específicos para célula endotelial ou neuronal (por exemplo os promotores DDAHI e DDAHII), são especialmente preferidos. Promotores virais também podem ser usados, por exemplo, a repetição de terminal longo de vírus da leucemia de murídeo Moloney (MMLV LTR), o promotor LTR de vírus do sarcoma rous (RSV) , o promotor SV40, o promotor IE de citomegalovírus humano (CMV), adenovírus, promotores HSV (como os promotores IE de HSV) , ou promotores de HPV, particularmente a região reguladora 3 0 acima de HPV (URR). Promotores virias são prontamente lisponíveis na técnica.

Podem ser usados vários promotores que são capazes de lirecionar a transcrição nas células hospedeiras da invenção. Preferivelmente a seqüência do promotor é 5 derivada de um gene altamente expresso como previamente definido. Exemplos de genes altamente expressos preferidos dos quais os promotores são preferivelmente derivados e/ou que são compreendidos em lócus alvo preferidos predeterminados para a integração de construções de 10 expressão, incluem, sem limitação, os genes que codificam enzimas glicolíticas como triose-fosfato isomerases (TPI), gliceraldeído-fosfato desidrogenases (GAPDH),

fosfoglicerato quinases (PGK), piruvato quinases (PYK), álcool desidrogenases (ADH), bem como genes que codificam amilases, glicoamilases, proteases, xilanases,

celobiohidrolases, β-galactosidases, álcool (metanol) oxidases, fatores de alongamento e proteínas ribossômicas. Exemplos específicos de genes adequados altamente expressos incluem, por exemplo, o gene LAC4 de Kluyveromyces sp. , os 20 genes de metanol oxidase (AOX e MOX) de Hansenula e Pichia, respectivamente, os genes de glicoamilase (glaA) de A.niger e A.awamori, o gene de TAKA-amilase de A.oryzae, o gene gpdA de A.nidulans e os genes de celobiohidrolase de T.reesei.

Exemplos de promotores constitutivos e/ou indutíveis

fortes que são preferidos para uso em hospedeiros de expressão fúngicos são aqueles que são obtidos dos genes fúngicos por promotores de xilanase (xlnA), fitase, ATPsintetase subunidade 9 (oliC), triose fosfato isomerase (tpi), álcool desidrogenase (AdhA), amilase (amy), .miloglicosidase (AG - do gene glaA), acetamidase (amdS) e liceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpd).

Exemplos de promotores de leveduras fortes que podem ser usados incluem aqueles obtidos dos genes por álcool desidrogenase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, lactase, 3-fosfoglicerato quinase, ATPase de membrana plasmática (PMAl) e triosefosfato isomerase.

Exemplos de promotores bacterianos fortes que podem ser usados incluem os promotores de amilase e SPo2 bem como os promotores de genes de protease extracelular.

Promotores adequados para células de planta que podem ser usados incluem promotores de nopaline sintase (nos), octopina sintase (ocs), manopina sintase (mas), subunidade pequena de ribulose (rubisco ssu), histona, actina de arroz, faseolina, vírus mosaico de couve-flor (CMV) 35S e 19S e circovírus.

0 vetor também pode incluir seqüências que flanqueiam o polinucleotídeo gerando RNA que compreende as seqüências homólogas a uma de seqüências genômicas eucarióticas, preferivelmente seqüências genômicas fúngicas, ou seqüências genômicas de leveduras. Isso permitirá a introdução dos polinucleotídeos da invenção no genoma de fungos ou leveduras por recombinação homóloga. Em particular, um vetor de plasmídeo que compreende o cassete de expressão flanqueado pelas seqüências de fungos pode ser usado para preparar um vetor adequado apara liberação dos polinucleotídeos da invenção a uma célula fúngica. Técnicas de transformação que usam esses vetores fúngicos são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

O vetor pode conter um polinucleotídeo da invenção >rientado em uma direção anti-senso para fornecer a irodução de RNA anti-senso. Isso pode ser usado para ■eduzir, se desejado, o níveis de expressão do polipeptídeo.

5 Células hospedeiras e expressão

Em um aspecto adicional a invenção fornece um processo para a preparação de um polipeptídeo da invenção que compreende o cultivo de uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vetor de expressão como acima 10 descrito acima sob condições adequadas para expressão pelo vetor de uma seqüência codificadora que codifica o polipeptídeo, e recuperação do polipeptídeo expresso. Os polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados em um vetor replicável recombinante, como um vetor de expressão. 15 0 vetor pode ser usado para replicar o ácido nucléico em uma célula hospedeira compatível. Assim, em uma modalidade adicional, a invenção fornece um método de confecção de um polinucleotídeo da invenção por introdução de um polinucleotídeo da invenção em um vetor replicável, 20 introdução do vetor em uma célula hospedeira compatível, e crescimento da célula hospedeira sob condições que permitem a replicação do vetor. Células hospedeiras adequadas incluem células de bactérias como E. coli, leveduras, linhagens de células de mamífero e outras linhagens de 25 células eucarióticas, por exemplo células de inseto como células Sf9 e (por exemplo, células de fungos filamentosos.

Preferivelmente o polipeptídeo é produzido como uma proteína secretada em cujo caso a seqüência de DNA que codifica uma forma matura do polipeptídeo na construção de 3 0 expressão pode ser operacionalmente ligada a uma seqüência Ie DNA que codifica a seqüência de sinal. No caso em que o rene que codifica a proteína secretada tem na cepa de tipo íelvagem uma seqüência de sinal preferivelmente a seqüência de sinal usada será nativa (homóloga) à seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo. Alternativamente a seqüência de sinal é estranha (heteróloga) à seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo, em cujo caso a seqüência de sinal é preferivelmente endógena à célula hospedeira em que a seqüência de DNA é expressa. Exemplos de seqüências de sinal adequadas para células hospedeiras de leveduras são as seqüências de sinal derivadas de genes MFalpha de leveduras. De modo similar, uma seqüência de sinal adequado para células hospedeiras de fungo filamentoso é, por exemplo, uma seqüência de sinal derivada de um gene de amiloglicosidase de fungo filamentoso (AG), por exemplo, o gene glaA de A. niger. Essa seqüência de sinal pode ser usada em combinação com o promotor de amiloglicosidase (também chamada (glico) amilase), bem como em combinação com oputros promotores. Seqüências de sinal híbridas também podem ser usadas no contexto da presente invenção.

Seqüências líderes de secreção heteróloga preferidas são aquelas que se originam do gene de amiloglicosidase fúngica (AG) (glaA - ambas versões de 18 e 24 aminoácido por exemplo, de Aspergillus), o gene MFalpha (leveduras por 25 exemplo, Saccharomyces e Kluyveromyces) ou o gene de alfaamilase (Bacillus).

Os vetores podem ser transformados ou transfectados em uma célula hospedeira adequada como acima descrito para fornecer a expressão de um polipeptídeo da invenção. Esse 3 0 processo pode compreender o cultivo da célula hospedeira transformada com um vetor de expressão como acima descrito sob condições adequadas para expressão do polipeptídeo, e >pcionalmente recuperação do polipeptídeo expresso.

Um aspecto adicional da invenção fornece, portanto,

células hospedeiras transformadas ou transfectadas ou que compreendem um polinucleotídeo ou vetor da invenção. Preferivelmente o polinucleotídeo é carregado em um vetor que permite a replicação e expressão do polinucleotídeo. As células serão escolhidas para serem compatíveis com o 10 referido vetor e podem ser, por exemplo, procarióticas (por exemplo, células de bactérias), ou eucarióticas fúngicas, leveduras ou planta.

A invenção engloba processos para a produção de um polipeptídeo da invenção por meio de expressão recombinante 15 de uma seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo. Para esse objetivo a seqüência de DNA da invenção pode ser usada para amplificação de gene e/ou troca de sinais de expressão, como promotores, seqüências de sinal de secreção, para permitir a produção econômica do 20 polipeptídeo em uma célula hospedeira homóloga ou heteróloga adequada. Uma célula hospedeira homóloga é aqui definida como uma célula hospedeira que é da mesma espécie ou que é uma variante na mesma espécie que a espécie da qual a seqüência de DNA é derivada.

Células hospedeiras adequadas são preferivelmente

microorganismos procarióticos como bactérias, ou mais preferivelmente organismos eucarióticos, por exemplo, fungos, como leveduras ou fungos filamentosos, ou células de plantas. Em geral, as células de leveduras são 3 0 preferidas sobre as células de fungo filamentoso porque :las são de mais fácil manipulação. No entanto, algumas >roteínas são pouco secretadas a partir de leveduras, ou em ilguns casos não são processadas adequadamente (por exemplo, hiperglicosilação em leveduras). Nesses casos, um 5 organismo hospedeiro de fungo filamentoso deve ser selecionado.

Bactérias do gênero Bacillus são muito adequadas como hospedeiros heterólogos por causa de sua capacidade de secretar proteínas no meio de cultura. Outras bactérias 10 adequadas como hospedeiros são aquelas do gênero Streptomyces e Pseudomonas. Uma célula hospedeira de leveduras preferida para a expressão da seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo é uma do gênero Saccharomyees, Kluyveromyces, Hansenula, Piehia, Yarrowia, ou

Schizosaceharomyees. Mais preferivelmente, uma célula hospedeira de levedura é selecionada do grupo que consiste ns espécies Saccharomyees eerevisiae, Kluyveromyces laetis (também conhecida como Kluyveromyces marxianus var. Iactis), Hansenula polimorpha, Piehia pastoris, Yarrowia 20 lipolitiea e Schizosaceharomyees pombe.

Os mais preferidos para a expressão da seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo são, no entanto, células hospedeiras de fungo filamentoso. As células hospedeiras de fungo filamentoso preferidas são selecionadas do grupo que 25 consiste no gênero Aspergillus, Trichodermaf Fusariumf Disporotrichumf Penicilliumf Acremoniumf Neurosporaf Thermoascus, Myceliophtoraf Sporotrichumf Thielavia e Talaromyces. Mais preferivelmente uma célula hospedeira de fungo filamentoso é da espécie Aspergillus oyzae, 30 Aspergillus sojae ou Aspergillus nidulans ou é de uma :spécie do grupo de Aspergillus niger (como definido por Laper e Fennéll, The Genus Aspergillus, The Williams & filkins Company, Baltimore, pp 293-344, 1965). Esses incluem, sem limitação, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae and Aspergillus ficuum, and also those of the species Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium

alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum e Thielavia terrestris.

Exemplos de hospedeiros de expressão preferidos no escopo da presente invenção são fungos como da espécie Aspergillus (em particular aqueles descritos em EP-A184.438 e EP-A-284.603) e espécies de Trichoderma; bactérias como as espécies de Bacillus (em particular aquelas descritas em EP-A-134.048 e EP-A-253.455), especialmente Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amiloliguefaciens, espécie Pseudomonas; e leveduras como espécies de Kluyveromyces (em particular aquelas descritas em EP-A-096.430 como Kluyveromyces lactis e em EP-A-3 01.670) e espécies de Saccharomyces, como Saccharomyees eerevisiae.

Células hospedeiras de acordo com a invenção incluem células de planta, e a invenção portanto estende-se a organismos transgênicos, como plantas e partes dessas, que contêm uma ou mais células da invenção. As células podem expressar de modo heterólogo o polipeptídeo da invenção ou podem conter de modo heterólogo um ou mais dos jolinucleotídeos da invenção. A planta transgênica (ou feneticamente modificada) pode ter, portanto, (tipicamente ístavelmente) inserida em seu genoma a seqüência que codifica os polipeptídeos da invenção. A transformação de 5 células de planta pode ser realizada com o uso de técnicas conhecidas, por exemplo, com o uso de um plasmídeo Ti ou Ri de Agrobacterium tumefaciens. 0 plasmídeo (or vetor) pode assim conter seqüências necessárias para infectar uma planta, e derivados dos plasmídeos Ti e/ou Ri podem ser 10 empregados.

A célula hospedeira pode superexpressar o polipeptídeo, e técnicas para engenharia de superexpressão são bem conhecidas e podem ser usadas na presente invenção. 0 hospedeiro pode assim ter duas ou mais cópias do polinucleotídeo.

Alternativamente, a infecção direta de uma parte da planta, como uma folha, raiz ou ramo pode ser efetuada. Nessa técnica a planta a ser infectada pode ser ferida, por exemplo, por corte da planta com uma lâmina, perfuração da 20 planta com uma agulha ou esfregando a planta com um abrasivo. 0 ferimento é então inoculado com o Agrobacterium. A planta ou parte da planta pode então crescer em um meio de cultura adequado e se desenvolve em uma planta matura. A regeneração das células transformadas 25 em plantas geneticamente modificadas pode ser realizada pelo uso de técnicas conhecidas, por exemplo, por seleção de galhos transformados com o uso de um antibiótico e por subcultivo dos galhos em um meio que contém os nutrientes adequados, hormônios de planta e outros. Iultura de células hospedeiras e produção recombinante

A invenção também inclui células que foram modificadas >ara expressar a lisil oxidase ou uma variante dessa. Tais células incluem linhagens de células eucarióticas 5 superiores transitórias ou preferivelmente estavelmente modificadas, como células de mamífero ou células de inseto, células eucarióticas inferiores, como células de leveduras e fungo filamentoso ou células procarióticos como células bacterianas.

É também possível para os polipeptídeos da invenção

ser transitoriamente expresso em uma linhagem de células ou em uma membrana, como, por exemplo, em um sistema de expressão de baculovírus. Tais sistemas, que são adaptados para expressar as proteínas de acordo com a invenção, são também incluídos no escopo da presente invenção.

De acordo com a presente invenção, a produção do polipeptídeo da invenção pode ser efetuada pelo cultivo de hospedeiros de expressão microbianos, que foram transformados com um ou mais polinucleotídeos da presente invenção, em um meio de fermentação nutriente convencional.

As células hospedeiras recombinantes de acordo com a invenção podem ser cultivadas com o uso de procedimentos conhecidos na técnica, para cada combinação de um promotor e uma célula hospedeira, as condições de cultura 25 disponíveis que conduzem à expressão da seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo. Após atingir a densidade celular desejada ou título do polipeptídeo o cultivo é interrompido e o polipeptídeo é recuperado com o uso de procedimentos conhecidos.

O meio de fermentação pode compreender um meio de :ultura conhecido que contém uma fonte de carbono (por ixemplo, glicose, maltose, melado etc.), uma fonte de litrogênio (por exemplo, sulfato de amônio, nitrato de amônio, cloreto de amônio etc.), uma fonte de nitrogênio 5 orgânico (por exemplo, extrato de leveduras, extrato de malte, peptona etc.) e fontes de nutriente inorgânico (por exemplo, fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro etc.). Opcionalmente, um indutor (dependente da construção de expressão usada) pode ser incluído ou subseqüentemente 10 adicionado.

A seleção do meio adequado pode ser baseada na escolha do hospedeiro de expressão e/ou baseada nas necessidades reguladoras da construção de expressão. Meios adequados são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, o meio 15 pode, se desejado, conter componentes adicionais que favorecem os hospedeiros de expressão transformados de seus microorganismos potencialmente contaminantes.

A fermentação pode ser realizada por um período de

0,5-30 dias. A fermentação pode ser um processo em lote, 20 contínuo ou alimentado por lote, em uma temperatura adequada na faixa entre 0°C e 45°C e, por exemplo, em um pH de 2 a 10. Condições de fermentação preferidas incluem uma temperatura na faixa entre 200C e 370C e/ou um pH entre 3 e 9. As condições adequadas são comumente selecionadas com 25 base na escolha do hospedeiro de expressão e da proteína a ser expressa.

Depois da fermentação, se necessário, as células podem ser removidas do caldo de fermentação por meio de centrifugação ou filtração. Depois da fermentação ser 3 0 interrompida ou depois da remoção das células, o jolipeptídeo da invenção pode ser então recuperado e, se lesejado, purificado e isolado por meio convencional. A .isil oxidase da invenção pode ser purificada a partir de micélio fúngico ou a partir do caldo de cultura em que a lisil oxidase é liberada pelas células fúngicas cultivadas.

Em uma modalidade preferida o polipeptídeo é produzido a partir de um fungo, mais preferivelmente de um Aspergillus, mais preferivelmente de Aspergillus niger. Modificações

Os polipeptídeos da invenção podem ser quimicamente

modificados, por exemplo, modificados pós-tradução. Por exemplo, eles podem ser glicosilados (uma ou mais vezes) ou compreendem resíduos de aminoácido modificados. Eles também podem ser modificados pela adição de resíduos de histidina 15 para ajudar na sua purificação ou pela adição de uma seqüência de sinal para promover a secreção a partir da células. 0 polipeptídeo pode ter extensões de terminal amino ou carboxil, como um resíduo de metionina aminoterminal, um pequeno peptídeo ligante de até cerca de 20-25 20 resíduos, ou uma extensão pequena que facilita a purificação, como um trato de poli-histidina, um epitopo antigênico ou um domínio de ligação.

Um polipeptídeo da invenção pode ser rotulado com um rótulo de revelação. 0 rótulo de revelação pode ser 25 qualquer rótulo adequado que permita que o polipeptídeo seja detectado. Rótulos adequados incluem radioisótopos, por exemplo, 125I, 35S, enzimas, anticorpos, polinucleotídeos e ligantes como biotina.

Os polipeptídeos podem ser modificados para incluir aminoácidos de ocorrência não natural ou para aumentar a :stabilidade do polipeptídeo. Quando as proteínas ou >eptídeos" são produzidos por meio sintético, tais Lirtinoácidos podem ser introduzidos durante a produção. As proteínas ou peptídeos também podem ser modificados seguindo a produção sintética ou recombinante.

Os polipeptídeos da invenção também podem ser produzidos com o uso de D-aminoácidos. Em tais casos os aminoácidos serão ligados em seqüência reversa na orientação CaN. Isso é convencional na técnica para a produção de tais proteínas ou peptídeos.

Inúmeras modificações de cadeia lateral são conhecidas na técnica e podem ser feitas às cadeias laterais das proteínas ou peptídeos da presente invenção. Tais modificações incluem, por exemplo, modificações dos 15 aminoácidos por alquilação redutiva por reação com um aldeído seguida por redução com NaBH4, amidinação com metilacetimidato ou acilação com anidrido acético.

As seqüências fornecidas pela presente invenção também podem ser usadas como materiais de iniciação para a 20 construção de enzimas de "segunda geração". Lisil oxidases de "segunda geração" são lisil oxidases, alteradas por técnicas de mutagênese (por exemplo, mutagênese direcionada a sítio ou técnicas de embaralhamento de gene), que têm propriedades que diferem daquelas de lisil oxidase de tipo 25 selvagem ou lisil oxidase recombinante como aquelas produzidas pela presente invenção. Por exemplo, sua temperatura ou pH ótimo, atividade específica, afinidade de substrato ou termo-estabilidade podem ser alteradas de modo a serem melhor adequadas para em um processo particular.

Aminoácidos essenciais para a atividade da lisil >xidase da invenção, e preferivelmente submetidos à lubstituição, podem ser identificados de acordo com >rocedimentos conhecidos na técnica, como , mutagênese direcionada a sítio ou mutagênese de rastreamento de 5 alanina. Na última técnica as mutações são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade biológica (por exemplo, atividade de lisil oxidase) para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da 10 molécula. Sítios de interação enzima-substrato também podem ser determinados por análise de estruturas em cristal como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear e cristalografia ou rotulagem de foto-afinidade.

As técnicas de embaralhamento (shuffling) de gene fornecem uma via aleatória de introduzir mutações em uma seqüência de polinucleotídeos. Depois da expressão os isolados com as melhores propriedades são re-isolados, combinados e embaralhados novamente para aumentar a diversidade genética. Por repetição desse procedimento inúmeras vezes, genes que codificam para proteínas rapidamente melhoradas podem ser isolados. Preferivelmente o procedimento de embaralhamento de gene é iniciado com uma família de genes que codifica para proteínas com uma função similar. A família de seqüências de polinucleotídeos fornecida com essa invenção pode ser bem adequada para embaralhamento de gene para melhorar as propriedades de lisil oxidases secretadas.

Alternativamente técnicas de mutagênese e seleção clássicas aleatórias, como, mutagênese com tratamento por

3 0 NTG ou UV, mutagênese, podem ser usadas para melhorar as >ropriedades da proteína. A mutagênese pode ser realizada Liretamente em DNA isolado, ou em células transformadas com > DNA de interesse. Alternativamente, podem ser introduzidas mutações em DNA isolado por inúmeras técnicas 5 que são conhecidas por pessoa habilitada na técnica. Exemplos desses métodos são PCR error-prone, amplificação de DNA de plasmídeo em uma célula hospedeira deficiente em repear etc.

Espera-se que o uso de células hospedeiras de 10 leveduras e de fungo filamentoso forneça modificações póstradução (por exemplo, processamento proteolítico, miristilação, glicosilação, truncagem, e fosforilação de tirosina, serina ou treonina) como pode ser necessário para conferir atividade biológica ótima em produtos de expressão 15 recombinante da invenção.

Preparações

Os polipeptídeos da invenção podem estar em uma forma isolada. Será compreendido que o polipeptídeo pode ser misturado com veículos ou diluentes que não interferirão 20 com o objetivo pretendido do polipeptídeo e ainda serão considerados como isolados. Um polipeptídeo da invenção também pode estar em uma forma substancialmente purificada, em cujo caos ele geralmente compreenderá o polipeptídeo em uma preparação em que mais de 7 0%, por exemplo, mais de 25 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% das proteínas na preparação é um polipeptídeo da invenção.

Os polipeptídeos da invenção podem ser fornecidos em uma forma de modo que eles estejam fora de seu ambiente celular natural. Portanto, eles podem ser substancialmente

3 0 isolados ou purificados, como acima discutido, ou em uma :élula em que eles não ocorrem na natureza, por exemplo, ima célula de outras espécies fúngicas, animais, plantas ou >actérias.

Remoção ou redução de atividade de lisil oxidase

A presente invenção também relaciona-se a métodos para

a produção de uma célula mutante de uma célula parente, que compreende o rompimento ou deleção da seqüência de ácidos nucleicos endógena que codifica o polipeptídeo ou uma seqüência de controle dessa, que resulta na célula mutante produzindo menos do polipeptídeo que a célula parente.

A construção de cepas que têm atividade de lisil oxidase reduzida pode ser convenientemente realizada por modificação ou inativação da seqüência de ácidos nucleicos necessária para a expressão da lisil oxidase na célula. A 15 seqüência de ácidos nucleicos a ser modificada ou inativada pode ser, por exemplo, a seqüência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo ou uma parte dessa essencial para exibir atividade de lisil oxidase, ou a seqüência de ácidos nucleicos pode ter uma função reguladora necessária para a 20 expressão do polipeptídeo a partir da seqüência codificadora da seqüência de ácidos nucleicos. Um exemplo de tal seqüência reguladora ou de controle pode ser uma seqüência de promotor ou uma parte funcional dessa, ou seja, uma parte que é suficiente para afetar a expressão do

2 5 polipeptídeo. Outras seqüências de controle para possível modificação incluem, sem limitação, uma seqüência líder, uma seqüência de poliadenilação, uma seqüência de própeptídeo, uma seqüência de sinal, e uma seqüência de terminação.

A modificação ou inativação da seqüência de ácidos iucleicos pode ser realizada ao submeter a célula a lutagênese e selèção das células em que a capacidade de >rodução de lisil oxidase foi reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser 5 realizada, por exemplo, pelo uso de um agente de metagênese físico ou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado, ou ao submeter a seqüência de DNA a mutagênese de PCR. Além disso, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação desses agentes de metagênese.

Exemplos de um a agente de metagênese físico ou

químico adequado para o presente objetivo incluem irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), 0-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeo.

Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamente realizada por incubação da célula a sofrer metagênese na presença do agente de metagênese de escolha sob condições adequadas, e seleção por células que exibem 20 expressão reduzida ou nenhuma expressão de atividade de lisil oxidase.

A modificação ou inativação d produção de um polipeptídeo da presente invenção pode ser realizada por introdução, substituição, ou remoção de um ou mais 25 nucleotídeos na seqüência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo ou um elemento regulador necessário para a transcrição ou tradução desse. Por exemplo, nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos de modo a resultar na introdução de um códon de parada, a remoção do códon de

3 0 início, ou uma mudança da estrutura de leitura aberta, tal lodificação ou inativação pode ser realizada por mutagênese lirecionada a sítio ou mutagênese por PCR de acordo com létodos conhecido na técnica.

Embora, em princípio, a modificação possa ser realizada in vivo, ou seja, diretamente na célula que expressa a seqüência de ácidos nucleicos a ser modificada, é preferível que a modificação seja realizada in vitro como abaixo exemplificado.

Um exemplo de um modo conveniente para inativar ou reduzir a produção da lisil oxidase por uma célula hospedeira de escolha é baseado em técnicas de substituição de gene ou interrupção de gene. Por exemplo, no método de interrupção de gene, a seqüência de ácidos nucleicos que corresponde ao gene endógeno ou fragmento de gene de interesse sofre metagênese in vitro para produzir uma seqüência de ácidos nucleicos defeituosa que é então transformada na célula hospedeira para produzir um gene defeituoso. Por recombinação homóloga, a seqüência de ácidos nucleicos defeituosa substitui o gene endógeno ou fragmento de gene. Preferivelmente o gene defeituoso ou fragmento de gene também codifica um marcador que pode ser usado para selecionar transf ormantes em que o gene que codifica o polipeptídeo foi modificada ou destruído.

Alternativamente, a modificação ou inativação da seqüência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser realizada por estabelecimento de técnicas anti- senso com o uso da seqüência de nucleotídeos complementar ao seqüência que codifica o polipeptídeo. Mais especificamente, a produção do polipeptídeo por uma célula pode ser reduzida ou eliminada >or introdução de uma seqüência de nucleotídeos :omplementar à seqüência de ácidos nucleicos que codifica o >olipeptídeo. 0 polinucleotídeo anti-senso será então tipicamente transcrito na célula e será capaz de hibridizar ao mRNA que codifica a lisil oxidase. Sob condições que permitem que seqüência de nucleotídeos anti-senso complementar hibridize ao mRNA, a quantidade da lisil oxidase produzida na célula será reduzida ou eliminada.

É preferível que a célula a ser modificada de acordo com os métodos da presente invenção seja de origem microbiana, por exemplo, um cepa fúngica que seja adequada para a produção dos produtos de proteína desejados, homóloga ou heteróloga à célula.

A presente invenção também relaciona-se a uma célula mutante de uma célula parente que compreende um rompimento ou deleção da seqüência de ácidos nucleicos endógena que codifica o polipeptídeo ou uma seqüência de controle desse, que resulta na produção pela célula mutante de menos polipeptídeo que pela célula parente.

As células mutantes deficientes de polipeptídeo assim criadas são particularmente úteis como células hospedeiras para a expressão de polipeptídeos homólogos e/ou heterólogos. Portanto, a presente invenção também relaciona-se a métodos para a produção de um polipeptídeo homólogo ou heterólogo que compreendem (a) o cultivo da célula mutante propício para a produção do polipeptídeo; e

(b) recuperação do polipeptídeo. No presente contexto, o termo "polipeptídeos heterólogos" é aqui definido comos polipeptídeos que não são nativos à célula hospedeira, uma proteína nativa em que foram feitas as modificações para ilterar a seqüência nativa, ou uma proteína nativa cuja ixpressão é quantitativamente alterada como um resultado de ima manipulação da célula hospedeira por técnicas de DNA recombinante.

Em um outro aspecto adicional, a presente invenção

fornece um método para a produção de um produto da proteína essencialmente livre de atividade de lisil oxidase por fermentação da célula que produz tanto o polipeptídeo de lisil oxidase da presente invenção quanto o produto da 10 proteína de interesse. O método compreende a adição de uma quantidade eficaz de um agente capaz de inibir a atividade de lisil oxidase ao caldo de fermentação durante ou depois da fermentação ter sido completada, recuperação do produto de interesse a partir do caldo de fermentação, e 15 opcionalmente promover nova purificação do produto recuperado. Alternativamente, depois do cultivo o caldo de cultura resultante pode ser submetido a um tratamento por pH ou temperatura de modo a reduzir a atividade de lisil oxidase substancialmente, e permitir a recuperação do 20 produto a partir do caldo de cultura. 0 tratamento combinado por pH ou temperatura pode ser realizado em uma preparação de proteína recuperada a partir do caldo de cultura.

Os métodos da presente invenção para a produção de um 25 produto essencialmente livre de lisil oxidase é de particular interesse na produção de polipeptídeos eucarióticos, em particular na produção de proteínas de fungos como enzimas. As células deficientes de lisil oxidase também podem ser usadas para expressar proteínas

3 0 heterólogas de interesse para a indústria de alimentos, ou Le interesse farmacêutico.

'orções de peptídeo pára identificar genes

Uma porção de peptídeo pode ser usado para identificar genes que codificam para proteínas que contêm esse porção de peptídeo. Em vez de uma porção de peptídeo, também uma combinação de dois ou mais porções de peptídeo pode ser usada para identificar genes que codificam para proteínas que contêm as porções de peptídeo. Quando um ou várias porções de peptídeo que codificam para lisil oxidases específicas são identificados, é assim possível identificar genes que codificam para lisil oxidases com o uso de um ou uma combinação de vários desses porções de peptídeo. As lisil oxidases são usadas como um exemplo de como tais genes podem ser identificados, mas os métodos descritos são geralmente aplicáveis. Uma possibilidade é o uso de uma seqüência da porção de Id. de Seq. N0: 11 para uma pesquisa nas seqüências de DNA traduzidas a partir de um banco de dados de DNA ou seqüências de proteína a partir de um banco de dados de seqüência de proteína que usa um programa como Patscan (http://www-unix.mcs.anl.gov/compbio/

PatScan/HTML/) . A seqüência de aminoácidos tem que ser inserida em um formato especial que é descrito no website. Outro método que pode ser realizada é o uso da seqüência da porção de Id. de Seq. N°: 11 para uma pesquisa nas 25 seqüências de DNA traduzidas a partir de um banco de dados de DNA ou seqüências de proteína a partir de um banco de dados de seqüência de proteína com o uso de um programa como http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/. Para esse programa a porção é inserido no campo de pesquisa no chamado formato

3 0 Prosite, e os banco de dados são pesquisados para a iresença da porção na seqüência de proteína ou na seqüência Ie DNA traduzida. Esse método é também descrito no Exemplo dessa invenção, com o uso da porção de aminoácido de Id. de Seq. N°: 11, e é usado para identificar genes de fungos que codificam lisil oxidases úteis. Os genes que são identificados com o uso de um desses métodos podem ser então traduzidos em uma seqüência de proteína com o uso de programas conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e ser inspecionados para a presença de a seqüência de sinal em seu terminal amino. Para a detecção da seqüência de sinal uma pessoa pode usar um programa como SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Na atual

invenção nós descobrimos que a seqüência de proteína que contém tanto as seqüências de consenso quanto uma seqüência 15 de sinal prevista é provavelmente uma lisil oxidase secretada. A partir dessas propriedades combinadas é dada uma grande vantagem para a produção industrial de tal enzima.

Uma outra possibilidade para identificar genes de 20 lisil oxidase que usam porções de peptídeo é o desenho de iniciadores de oligonucleotídeo baseado na retro-tradução da seqüência de aminoácidos da porção de Id. de Seq. N°: 11 em uma seqüência de nucleotídeos com uso de códon preferido do organismo em que uma pessoa deseja identificar um gene 25 de lisil oxidase, e uso desse oligonucleotídeo para hibridização a uma biblioteca de gene, ou em um iniciador de PCR em um conjunto de mRNA transcrito de modo reverso. Com o uso da porção de peptídeo de seqüência Id. de Seq. N°: 11, é também possível isolar genes que codificam lisil

3 0 oxidase quando a seqüência do gene é desconhecida. Foram !escritos métodos na literatura para desenhar iniciadores ie oligonucleotídeo degenerados que podem ser usados para ísse objetivo (Sambrook e cols.. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Além disso, métodos para isolar genes a partir de um organismo, com o uso de um oligonucleotídeo degenerado como marcador ou iniciador foram descritos.

Oligonucleotídeos que codificam para a porção de peptídeo de Id. de Seq. N0 : 11 são úteis para a isolação 10 dos genes que codificam propriedades de lisil oxidase. A degeneração de tal grupo de oligonucleotídeos pode ser diminuída por introdução de bases de inosina (I) em posições em que o nucleotídeo não é conhecido. Adicionalmente, as posições em que ambas bases de citosina 15 (C) e timidina (T) são possíveis podem ser substituídas por uracil (U) , e em posições em que ambas adenina (A) e guanina (G) são possíveis, apenas a guanina pode ser introduzida, para diminuir a degeneração com apenas um pequeno efeito sobre a especificidade do iniciador de 20 oligonucleotídeo. Além disso, para rastreamento da presença de genes que codificam lisil oxidases em organismos dos quais a preferência do códon é conhecida, a degeneração do oligonucleotídeo também pode ser diminuída levando-se a preferência de códon em consideração no desenho do 25 oligonucleotídeo. Uma pessoa habilitada na técnica conhecerá como fazer isso. Além disso, todas as possíveis combinações de iniciadores de oligonucleotídeo, sem degeneração, podem ser sintetizadas separadamente e usadas em experimentos individuais de rastreamento.

Primeiramente, uma biblioteca genômica, de cDNA ou EST ; construída a partir da espécie de interesse em um vetor iniversaí. Métodos' adequados para a construção de >iblioteca são descritos na literatura (Sambrook e cols.. (198 9) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring 5 Harbor Laboratory Press). Segundo, um oligonucleotídeo degenerado acima descrito é usado em uma reação de PCR junto com um oligonucleotídeo universal que inicia no vetor, no limite da inserção de DNA recombinante, em DNA isolado da biblioteca. Estratégias úteis foram descritas na 10 literatura para a isolação de um gene desejado quando apenas um único iniciador de oligonucleotídeo degenerado é disponível (por exemplo, Minambres e cols.. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 272, 477-479; PCR technology (198 9) Ed. H.A. Erlich pp. 99-104, Stockton Press). Em terceiro 15 lugar, o fragmento amplificado por PCR é então rotulado e usado como marcador para o rastreamento da biblioteca por meio convencional. 0 gene de comprimento total pode ser então sub-clonado em um vetor de expressão adequado para superexpressão da lisil oxidase em um organismo hospedeiro

2 0 de produção desejado.

Em uma abordagem diferente, quando nenhuma biblioteca é disponível a partir da espécie que é rastreada para for a presença de um gene que codifica a lisil oxidase, parte do gene pode ser amplificada por PCR com diferentes 25 iniciadores degenerados, ou com 3'-RACE usando um iniciador degenerado único. Para isso, RNA é isolado da espécie de interesse e usado em uma reação 3'-RACE com a utilização de um iniciador degenerado único como iniciador específico de gene. A amplificação de parte de um cDNA an desconhecido

3 0 com o uso de um oligonucleotídeo degenerado e um iniciador iniversal, por 3'-RACE, foi descrita previamente W099/38956) .

O método tradicional para isolar um gene de comprimento total que usa a informação tion de apenas um 5 pequeno peptídeo é a hibridização de um oligonucleotídeo degenerado rotulado em filtros em que uma biblioteca é replicada. Os métodos que descrevem o rastreamento das bibliotecas de gene que usam oligonucleotídeos degenerados, e métodos para calcular ou determinar as condições ótimas 10 de hibridização desses oligonucleotídeos, foram extensivamente descritos na literatura (Sambrook e cols..(1989)). Os oligonucleotídeos acima descritos podem ser usados para esse método para isolar genes que codificam a lisil oxidase a partir de diferentes espécies.

Em uma variação a esse método, uma biblioteca de gene

parcial pode ser construída primeiro. Para isso, DNA é fracionado, depois do que os fragmentos de DNA que contêm o gene que codifica para a lisil oxidase são detectados por hibridização os oligonucleotídeos rotulados acima 20 descritos. Esses fragmentos são isolados e usados na construção de uma biblioteca de gene parcial enriquecida no gene que codifica para a lisil oxidase. Essa biblioteca pode ser então rastreada por meio convencional. Para esse método, DNA genômico é primeiramente digerido com enzimas 25 de restrição antes do fracionamento por eletroforese em gel, enquanto o cDNA pode ser fracionado diretamente.

Um método diferente para isolar o gene que codifica para a lisil oxidase é pelo uso de anticorpos que surgem contra qualquer um dos peptídeos da seqüência de consenso. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Os létodos que descrevem a produção de anticorpos específicos >ara peptídeos pequenos foram extensivamente descritos na .iteratura (Harlow, E and Lane, D (1988) Anticorpos; a laboratory manual, ISBN 0-87969-314. -2).

Bibliotecas de expressão podem ser construídas a

partir da espécie de interesse, por clonagem de cDNA ou DNA genômico em um vetor adequado para expressão da inserção em um hospedeiro conveniente, como E. coli ou leveduras. Vetores de expressão podem ou não ser baseados em fago 10 lambda. Imunodetecção de antígenos produzidos por bibliotecas de expressão, e métodos que descrevem a purificação de clones específicos que expressam o antígeno foram publicados. Com o uso de um anticorpo específico para qualquer um dos peptídeos da porção de consenso, é possível 15 isolar o gene que codifica a lisil oxidase que engloba esse porção, usando esse método.

Em efeito, vários diferentes métodos podem ser usados para isolar um gene que codifica para a lisil oxidase quando a informação descrita nessa invenção é levada em 20 consideração. A vantagem do uso do informação de porção de seqüência de peptídeo sobre os métodos da técnica prévia é a velocidade e relativa facilidade com que um novo gene que codificam para um lisil oxidase ativa pode ser identificado. 0 uso de uma informação de seqüência dá uma 25 indicação do valor de uma nova lisil oxidase na confecção de queijo, ou outras aplicações na indústria alimentícia, sem realizar teste laboriosos de todas as possíveis oxidases em experimentos de aplicação direta.

Nós demonstraremos a invenção nos exemplos abaixo. Nós demonstraremos a identificação, clonagem, produção, •urificação e caracterização bioquímica das novas lisil •xidases. Nós também demonstraremos o uso das lisil •xidases na preparação de alimentos.

Legendas para as figuras Figura 1: Construção de vetores de expressão de lisil

oxidase pGBFINZGR-1, pGBFINZGT-1, pGBFINGLO-1, pGBFINZGY-1 e pGBFINGLO-2. 0 gene de interesse é rotulado como Xxx nessa Figura cujo código pode ser substituído por qualquer um dos códigos da Tabela 1 Figura 2: perfis de SDS-PAGE que mostram expressão de

proteína de lisil oxidases em Aspergillus niger. São feitas amostras a partir de sobrenadantes da cultura e colocadas em SDS-PAGE (10% NUPAGE, Invitrogen). C: controle, cepa de hospedeiro sem plasmídeo transformado. M: proteínas de marcador (116, 66, 45, 35, 25, 18 e 14 kDa), ZGR, ZGT, GLO

1, GLO-2 e ZGY: lisil oxidases superexpressas. As setas indicam a localização de proteína supexpressa.

Figura 3: desenvolvimento de viscosidade de uma solução de soro a 12,5% em 85°C, com ou sem tratamento com lisil oxidases ZGR, ZGT ou GL0-1.

Figura 4. perfis de SDS-PAGE de κ-caseína, α-caseína e uma mistura de k- e α-caseína e o mesmo perfil depois da incubação com lisil oxidase ZGR Seqüências

Id. de Seq. N°: 1: proteína ZGR de Aspergillus nidulans

Id. de Seq. N°: 2: proteína ZGT de Cryptococcus neoformans Id. de Seq. N°: 3: proteína GLOl de Fusarium graminearum Id. de Seq. N°: 4: proteína ZGY de Podospora anserina Id. de Seq. N°: 5: proteína GL02 de Fusarium graminearum Id. de Seq. N° : 6: DNA sintético ZGR de Aspergillus iidulans

:d. de Seq'. 'N0V 7: DNA sintético ZGT de Cryptococcus íeoformans

Id. de Seq. N°: 8: DNA genômico GLOl de Fusarium graminearum

Id. de Seq. N°: 9: DNA sintético ZGY de Podospora anserina Id. de Seq. N°: 10: DNA genômico GL02 de Fusarium graminearum

Id. de Seq. N°: 11: porção de consenso: IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK EXEMPLOS Exemplo 1

Identificação da lisil oxidase suposta que codifica genes em uma seqüência de genoma fúngico

Lisil oxidases secretadas de origem fúngica são

interessantes para produção em grandes quantidades uma vez que elas podem ser usadas em aplicacões de alimentos. Atualmente, a única lisil oxidase secretada descrita a partir de um fungo filamentoso é de Aspergillus oryzae, e é descrita em Id. de Seq. N°: 2 de EP 1466979 Al. Aqui nós tentamos superexpressar essa enzima de Aspergillus oryzae no fungo Aspergillus niger. Surpreendentemente, nenhuma atividade de lisil oxidase pode ser medida no fluido de cultura depois da superexpressão dessa seqüência em Aspergillus niger. Para explicar esse resultados surpreendente, nós examinamos a seqüência de aminoácidos descrita em EP 14 66979 Al mais profundamente. Surpreendentemente, a seqüência da lisil oxidase de Aspergillus oryzae é em alguns aspectos diferente em 3 0 importantes posições da seqüência de outras lisil oxidases ; cobre amina oxidases. A posição 164 da proteína anotada Lo gene de Asperillus oryzae descrito em Id. de Seq. N°: 2 Le EP 14 66979 Al é uma alanina, que em todas as outras amina e lisil oxidases descritas essa posição é altamente 5 conservada para prolina. Adicionalmente a posição 78 nessa proteína é uma metionina, enquanto leucina é altamente conservada em amina oxidases nessa posição. Além disso, a proteína descrita em EP 1466979 Al contém uma inserção extra de 2 aminoácidos depois do resíduo 10 9 quando 10 comparada a lisil oxidase de mamífero e Pichia. Também, a posição 499 na proteína descrita em EP 1466979 Al é uma treonina, enquanto essa posição é sempre um resíduo hidrofóbico em outras amina oxidases, e resíduo. As posições conservadas em proteínas são freqüentemente 15 associadas com a função primária de uma enzima, e não podem ser modificadas sem modificar a atividade catalítica da enzima. É portanto duvidoso se a seqüência de proteína descrita em EP 1466979 Al é de fato correta e codifica para uma lisil oxidase funcional. A atividade da oxidase que foi 20 medida em alguns dos transformantes em EP 1466979 Al pode não ser portanto devida à superexpressão do gene descrito.

Uma vez que a abordagem para superexpressar o gene de EP 14 66979 Al não foi bem-sucedida, nós examinamos cuidadosamente a seqüência de aminoácidos de lisil 25 oxidases, e propomos aqui uma porção de seqüência de aminoácidos que é útil na identificação de lisil oxidases a partir de fungos. A porção que nós propomos como útil para identificar lisil oxidases fúngicas genuínas é:

I-H-D- [NS]-L-S-G-S-M-H-D-H-V- [IL]-N-F-K (Id. de Seq. N0:11) Nesse porção cada aminoácido é representado como lódigos padrão de úma letra IUPAC, e quand mais aminoácidos :ão possíveis em uma única posição, os aminoácidos possíveis estão entre colchetes.

Nós pesquisamos trEMBL (banco de dados de EMBL DNA

traduzido) com porção Id. de Seq. N° : 11 com a opção de pesquisa de padrão em http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/. Esse programa pode pesquisar bases de dados de DNA traduzido ou proteína com uma porção definido como Id. de 10 Seq. N°: 11. Para isso a porção é inserido no campo de pesquisa padrão no chamado formato Prosite, como mostrado acima, e bases de dados individuais são pesquisadas para a presença da porção na seqüência de proteína ou na seqüência de DNA traduzida. Com o uso desse método n' [os fomos 15 capazes de identificar 6 potenciais lisil oxidases de origem fúngica que não foram designadas para essa atividade antes e todas continham a porção Id. de Seq. N°: 11. Os genes que codificam para 4 das 6 novas lisil oxidases potenciais são mencionados na Tabela 1, e se originam de

2 0 Aspergillus nidulans, Cryptococcus neoformans, Fusarium

graminearum e Podospora anserina. Além dessas 4 seqüências, também um segundo gene de Cryptococcus neoformans (Q5KEB2_CRYNE) e um gene de Neurospora crassa (Q7S2 8 6_NEUCR) podem ser encontrado com a porção Id. de 25 Seq. N°:11. As 6 seqüências são todas de fungos de espécies filogeneticamente separadas, sendo de de dois filos separados te Basidiomyeota e Ascomyeota, sugerindo que as porções de proteína são altamente conservados em evolução e codificam para resíduos de aminoácido bioquimicamente

3 0 relevantes. De modo interessante, todas as seqüências de >roteínas deduzidas contêm uma seqüência de sinal suposta 10 terminal amino da proteína, e devem portanto codificar >ara proteínas secretadas.

Para testar se as porções de seqüência são de fato úteis para a identificação de lisil oxidases com atividade relevante, nós clonamos e superexpressamos os genes que codificam para as 4 novas proteínas mencionadas na Tabela

1. como um controle, nós também incluímos um segundo gene de Fusarium graminearum com clara homologia a todas as 10 outras 4 lisil oxidases, mas desprovido da porção de seqüência de aminoácidos. Com o uso desse experimento de controle nós podemos investigar se o uso da porção é de fato útil para a identificação e detecção de novas lisil oxidases relevantes d eorigem fúngica.

Tabela I: Lista com propriedades de enzimas expressas

Organismo Nome do Proteína Códi¬ Porção Expres Acesso doador plasmí- go -são (trEMB deo L) AspergiIlus pGBFINZ Id. de ZGR + + + + Q5B038 nidulans GR-I Seq. N°: _EMENI 1 Cryptoco pGBFINZ Id. de ZGT + + Q55P44 CCUS GT-I Seq. N°: _CRYNE neoformans 2 Fusarium pGBFING Id. de GLOl + + + + Q4HWI1 graminearum LO-I Seq. N°: _GIBZE 3 Podospora pGBFINZ Id. de ZGY + ++ Q8 6ZN4 anserina GY-I Seq. N°: _P0DAN 4 ?usarium pGBFING Id. de GL02 - + + + Q4HWS1 jraminearum LO-2 Seq. N0 : GIBZE 5 Genes sintéticos que podem codificar as proteínas

acima descritas foram feitos por DNA2.0

(http://www.dnatwopointo.com/). É possível produzir sinteticamente qualquer seqüência de gene e usá-la em clonagem e expressão. Os genes sintéticos (Id. de Seq. N°: 6, 7, e 9) foram desenhados com o uso de um algoritmo que adapta a seqüência codificadora a inclinação do códon para genes altamente expressos em Aspergillus niger (WO 06/077258). A exceção a isso foi a seqüência dos dois genes de Fusarium em que a seqüência de DNA genômico foi tomada (Id. de Seq. N°: 8 e 10) . As seqüências de gene usadas codificam para as proteínas mencionadas em Id. de Seq. N0 : 1-5 respectivamente. Os sítios de clonagem PacI e AscI foram introduzidos acima respectivamente abaixo das seqüências codificadoras dessas enzimas, para facilitar o procedimento de clonagem. Os fragmentos que contêm os genes sintéticos de lisil oxidase suposta foram digeridos com PacI e AscI, e o fragmento de Pacl/Ascl que compreende as seqüências codificadoras foi isolado e trocado com o fragmento phyA de Pacl/Ascl em pGBFIN-5 (W0 99/32617) com o uso de métodos padrão de biologia molecular. Os plasmídeos de expressão resultantes foram usados para a expressão dos diferentes genes em Aspergillus niger, e são denominados como descrito na Tabela 1. 0 procedimento de clonagem e a estrutura dos plasmídeos de expressão são mostrados na Figura 1. no lugar do gene sintético Xxx qualquer um dos códigos dos genes mencionados na Tabela 1 podem ser >reenchidos, resultando nos plasmídeos mencionados na ’abela I. As seqüências codificadoras dos genes de .nteresse são clonadas abaixo do promotor glaA de Aspergillus niger, e o gene amdS de Aspergillus nidulans é presente nos plasmídeos de expressão como marcador para seleção em Aspergillus niger.

Exemplo 2

Transformação e superexpressão de lisil oxidases fúngicas por A. niger

Os vetores de expressão pGBFINZGR-1, pGBFINZGT-1, pGBFINGLO-1, pGBFINZGY-1, e pGBFINGLO-2 foram linearizados por digestão com NotI, que remove todas as seqüências derivadas de E. coli do vetor de expressão. O DNA digerido foi purificado com o uso de extração por fenol:clorofórmio:isoamilálcool (24:23:1) e precipitação com etanol. Esses vetores foram usados para transformar Aspergillus niger CBS513.88. u procedimento de transformação de Aspergillus niger é extensivamente descrito em WO 98/46772. Também é descrito como selecionar para transformantes em placas de agar que contêm acetamida, e selecionar integrantes de multicópia direcionados. Preferivelmente, os transformantes de A. niger que contêm múltiplas cópias do cassete de expressão são selecionados para geração adicional de material de amostra. Para os vetores de expressão de lisil oxidase 30 transformantes de A. niger foram purificados para cada plasmídeo transformado; primeiro por plaqueamento de transformantes individuais em placas de meio seletivo seguido por plaqueamento de uma única colônia em placas PDA. Esporos de transformantes individuais foram coletados depois de :rescimento por 1 semana a 3 0 °C. Os esporos foram :stocados refrigerados e foram usados para a inoculação de ieio líquido.

Uma cepa de A. niger que contém múltiplas cópias do cassete de expressão foi usada para a geração de material de amostra por cultivo da cepa em culturas de frasco agitado. Um método útil para o cultivo de cepas de A. niger e separação do micélio do caldo de cultura é descrito em WO 98/46772. 0 meio de cultivo foi CSM-MES (150 g maltose, 60 g Soytone (Difco) , 15 g (NH4)2SO4, I g NaH2PO4-H2O, 1 g MgSO4.7H20, 1 g L-arginina, 80 mg Tween-80, 20 g MES pH 6,2 por litro de meio). Amostras de 5 ml foram feitas nos dias 4-8 da fermentação, centrifugadas por 10 minutos a 5.000 rpm em um "Hereaus labofuge RF" e os sobrenadantes foram estocados a -20°C até análise adicional.

A Figura 2 mostra perfis de expressão de proteína, como determinado por SDS-PAGE (coloração por Coomassie) dos sobrenadantes após cultivo. Claramente, as lisil-oxidases clonadas de Aspergillus nidulans, Cryptococcus neoformans,

2 0 Fusarium graminearum e Podospora anserina mostram excelente superexpressão, mostrando que eles são bem expressos e excretados. Isso é altamente surpreendente e inesperado uma vez que a enzima de Aspergillus oryzae, que é muito mais próxima em relação ao hospedeiro Aspergillus niger, pode

2 5 não ser superexpressa embora tenha sido relatado previamente (EPl 466 979) que essa lisil oxidase de Aspergillus oryzae pode ser expressa em um hospedeiro heterólogo. Os quatro genes de lisil oxidase, dos quais todos organismos doadores são menos relacionados a 30 Aspergillus niger, foram expressos eficientemente nesse iospedeiro. Também, o gene GL02 de Fusarium graminearum foi :ficientemente expresso e secretado a partir de Aspergillus íiger.

Exemplo 3

Purificação da lisil oxidase superexpressa de um sobrenadante de A. niger

Lisil oxidases derivadas de Aspergillus nidulans, Cryptococcus neoformans, Fusarium graminearum e Podospora anserina que foram superexpressas em Aspergillus niger foram cultivadas em maiores quantidades como se segue. Cepas transformadas de A. niger que expressam a lisil oxidase relevante cresceram em um meio de crescimento que cotém por litro: maltose.H20: 4 0 g; Soytone (Difco) : 3 0 g; (NH4)2SO4: 15 g, NaH2PO4-H2O: Ig; MgSO4 ·7Η20: 1, L-arginina: 1 g, Tween-80: 0,08 g, Na-citrato: 70 g. 0 pH foi ajustado para 6,2. Depois de 5-6 dias de crescimento a 3 0 graus C, as células foram mortas pela adição de 3,5 g/l de benzoato de sódio e a incubação foi prolongada por mais 6 horas. Então 10 g/l de CaCl2 e 4 5 g/l auxiliar de filtração (Dicalite BF; Gent, Belgium) foram adicionados ao caldo. O micélio foi removido por uma filtração em tecido inicial, seguida por filtração através de filtros Z-2000 e Z-200 (Pall) . Ultrafiltração foi realizada com o uso de uma célula de ultrafiltração Amicon com uma membrana de 10 kDa até uma redução de volume de 2-4 vezes. A purificação das lisil oxidases foi realizada como se segue:

Lisil oxidase ZGR (derivada de Aspergillus nidulans)

O sobrenadante de cultura concentrado contendo lisil oxidase ZGR foi equilibrado em 2 0 mM Tris.HCl (pH 7,5; tampão Al) a uma condutividade de 1,8 mS/cm ma célula de Lltrafiltráção Amicon. A amostra foi subsequentemente :arregada ém uma coluna Q-Sepharose (5 ml Q-FF Hitrap, 'harmacia) com o uso de uma taxa de fluxo de 5 ml/min. Depois de lavagem com 3 volumes de coluna (cv) de tampão Al 5 a lisil oxidase foi eluída com o uso de um gradiente linear de 20 cv de tampão Al a BI (BI = tampão Al + IM NaCl) . As lisil oxidases que contêm frações, eluindo por volta de 34 0 mM NaCl, foram identificadas por meio de SDS-PAGE, reunidas e transferidas para uma célula de concentração Amicon com 10 uma membrana de 10 kDa para modificar o tampão para 2 5 mM Na-fosfato (pH 6,6; tampão A2) . A amostra foi então aplicada a uma coluna Q-Sepharose (5 ml Q-FF Hitrap, Pharmacia, 5 ml/min), equilibrada em tampão A2. Depois de lavagem com 3 cv tampão A2 lisil oxidase foi eluída em um 15 gradiente linear de 20 cv de tampão A2 para o tampão B2 (B2 = tampão A2 + IM NaCl). As frações que contêm lisil oxidase foram reunidas. A enzima era pelo menos 95% pura, como determinado por SDS-PAGE (coloração com Coomassie).

Lisil oxidase ZGT (derivada de Cryptococcus neoformans)

Lisil oxidase ZGT foi purificada essencialmente como

descrito para ZGR com as seguintes adaptações: tampões Al e Bl estavam em pH 7,1 em vez de pH 7,5. A lisil oxidase eluída na primeira etapa a 33 0 mM NaCl, na segunda coluna ela eluiu a 470 mM NaCl. A proteína era pelo menos 90% 25 pura, como determinado por SDS-PAGE (coloração com Coomassie).

Lisil oxidase GL0-1 (derivada de Fusarium graminearum).

Lisil oxidase GLO-I foi purificada essencialmente como descrito para ZGR com as seguintes adaptações: tampões Al e Bl estavem em pH 7,0 em vez de pH 7,5; tampão A2 continha !O mM Tris.HCl (pH 7,7) e tampão B2 continha 20 mM Tris.HCl [pH 7,7) + IM NaCl. GLO-I eluiu na primeira etapa de >urificação a 90 mM NaCl, na Segunda etapa de purificação ela não ligada à coluna e estava presente no 5 desenvolvimento. A proteína era pelo menos 95% pura, como determinado por SDS-PAGE (coloração com Coomassie).

Lisil oxidase GLO-2 (derivada de Fusarium graminearum)

Lisil oxidase GLO-2 foi purificada essencialmente como descrito para ZGR com as seguintes adaptações: tampões Al e Bl estavam em pH 7,0 em vez de pH 7,5; tampão A2 continha mm Tris.HCl (pH 7,9) e tampão B2 continha 20 mM Tris.HCl (pH 7,9) + I M NaCl. GLO-2 eluiu na primeira etapa de purificação em dois picos em 80 e 200 mM respectivamente, indicando alguma heterogeneidade de proteína. Isso não foi adicionalmente examinado. Ambos picos foram reunidos e usados na Segunda etapa de purificação, em que a enzima eluiu novamente em duas frações a 18 0 e 4 00 mM respectivamente, com a maioria da proteína (-80%) eluindo a 18 0 mM. Essa fração foi reunida e usada para análise adicional.

Lisil oxidase ZGY (derivada de Podospora anserina)

Lisil oxidase ZGY foi purificada essencialmente como descrito para ZGR com as seguintes adaptações. Tampão Al continha 50 mM Na-acetato (pH 5,0) e tampão Bl continha 50 25 mM Na-acetato (pH 5,0) + IM NaCl. Na segunda etapa de purificação, uma coluna de hidroxiapatita foi usada (XK16/20, 3 0 ml, Pharmacia, 2 ml/min). Tampão A2 continha 10 mM Na-fosfato (pH 6,8) e tampão B2 continha 500 mM Nafosfato (pH 6,8). A proteína era pelo menos 95% pura, como 30 determinado por SDS-PAGE (coloração com Coomassie). As concentrações da proteína foram determinadas com o lSO do reagente de Bradford.

Ixemplo 4

Determinação da atividade de lisil oxidases

A atividade enzimática de lisil oxidase em um

substrato de amina resulta na formação de H2O2 e NH3. Ambos produtos da reação podem ser usados para monitorar a atividade da enzima.

Atividade de lisil oxidase que monitora a formação de H2O2.

A atividade de lisil oxidase foi monitorada com o uso

do kit de ensaio Amplex Red Mono-amina oxidase, obtido de Invitrogen. As reações foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. A concentração do substrato na solução do ensaio era de 1 mM, a menos que indicado de 15 outra forma. As reações foram realizadas a 30°C a menos que indicado de outra forma, e a reação foi seguida em tempo com o uso de um leitor de microplaca Genios (TECAN). Para a determinação do pH ótimo da enzima os seguintes tampões foram usados: 25 mM Na-citrato (pH 3,0, pH 6,0), 25 mM Na20 acetato (pH 4,0, pH 5,0), 25 mM Tris.HCl (pH 7,0, pH 8,0) e Tris.Glicina (pH 9,0, pH 10,0).

Atividade de lisil oxidase que monitora a formação de NH3

A atividade de lisil oxidase foi determinada por incubação da enzima (100 microgramas de enzima por ml de 25 solução de ensaio) por 4 horas a 3 7 0C sob leve agitação (500 rpm) em tubos abertos de Eppendorff, em uma solução que contém 10 mM Ac-Gly-Lys-OMe (obtida de Bachem, Alemanha) e 25 mM tampão Na-fosfato (pH 7,0). A formação de NH3 foi detectada com tiras de teste de amônia (obtidas de 3 0 Hach, Alemanha). Em um experimento em branco foi adicionada Lgua em vez da solução da enzima. A formação de uma cor rerde escuro sinaliza a presença de NH3; a ausência de Lmônia produz uma cor amarela.

As lisil oxidases ZGR, ZGT, GLO-1, GLO-2 e ZGY foram testadas para atividade de lisil-oxidase no ensaio "Amplex Red" com o uso dos seguintes substratos (10,0 mM em solução de ensaio): Ac-Gly-Lys-OMe, Ac-Lys-OMe (ambos obtidos from Bachem, Alemanha), benzilamina e p-tiramina (Invitrogen). No caso dos substratos que contêm lisina o único grupo amino livre é aquele na cadeia lateral da lisina uma vez que o grupo alfa-amino é bloqueado. Qualquer atividade nesses substratos portanto, sinaliza inequivocamente atividade de lisil-oxidase. Os resultados são dados abaixo; a atividade é apresentada como % da atividade obtida com o substrato que mostra atividade máxima. Os dados para a enzima de Pichia foram calculados a partir dos valores de kcat/Km publicados Kuchar & Dooley (J Inorg Biochem (2001) 83, 193-204)

Código da Ac-Gly- Ac-Lys-OMe p-Tiramina Benzil¬ enzima Lys-OMe amina ZGR 182 157 122 100 ZGT 208 162 174 100 GL0-1 204 167 96 100 GLO-2 32 87 213 100 ZGY 385 262 239 100 Pichia 95 Não Não 100 pastoris determinado determinado Tabela 1: Atividade de lisil oxidases em vários substratos. A atividade da enzima em benzilamina é mostrada a 100%; as outras atividades são expressas como % dessa atividade. As enzimas devem mostrar clara preferência por Ac-Glyys-OMe como esperado para lisil oxidases. É claro que ZGR, GT, GLO-I e ZGY têm uma surpreendente alta preferência pelo grupo lisil, e a atividade é maior quando o substrato do peptídeo é maior (Ac-Gly-Lys-OMe vs Ac-LysOMe). Surpreendentemente, sua preferência por substratos de lisina é ainda mais forte que aquela da lisil oxidase de Pichia. Quando a lisil oxidase derivada de Pichia ê ainda um pouco mais ativa em benzil amina comparada a Ac-Gly-LysOMe, a ZGR, ZGT, GL0-1 e ZGY têm uma clara preferência pelo substrato de lisil. Também a proteína GLO-2 tem uma clara preferência, como a enzima de Pichia, por pequenos substratos como benzilamina e tiramina. Surpreendentemente, as quarto lisil oxidases que foram identificas com o uso das porções de seqüência de aminoácidos tiveram maior preferência pelos substratos de lisina, e lisil oxidases que são desprovidas de um das porções têm espectro de atividade menos preferido. Aparentemente a pesquisa com a porção de aminoácidos identifica especificamente as lisil oxidases com atividade mais preferido em substratos de lisina, e é portanto uma nova e importante ferramenta na identificação de lisil oxidases úteis. Deve-se observar que as lisil oxidases que são encontradas da porção Id. de Seq. N°: 11 são apenas 40-60% idênticas umas a outras com o uso de BLASTP, mas aparentemente todas têm em comum que a especificidade dessas enzimas é mais direcionada a maior preferência por substratos de lisina. Enzimas com pontuações de homologia similares com o uso de BLASTP mas desprovidas da porção Id. de Seq. N°: 11, como GL02 mas 3 0 também as lisil oxidases de Pichia pastoris e Aspergillus >ryzae, não mostram essa especificidade de substrato.

As enzimas ZGR, ZGT e GLO-I tambem foram testadas em iberação de amônia, usando Ac-Gly-Lys-OMe como o substrato. Em todos os casos a liberação de amônia foi inequivocadamente demonstrada. Esses resultados também confirmam que as enzimas identificadas são lisil oxidases. Exemplo 5

Atividade de lisil oxidases em vários substratos de proteína

Lisil oxidases ZGR, ZGT e GLO-I foram testadas para

atividade em pH 6 nos seguintes substratos de proteína: soro (BiPro de Davisco) , caseína (obtida de rom DMV, Holanda,·), glúten hidrolisado (glúten vital (obtido de Protinax) foi hidrolisado com Fromase 750TL (obtido de DSM, 15 Holanda) por 1 hora a 55°C, pH 4,1. A enzima foi inativada por tratamento com calor a 85°C, 15 minutos e liofilizada). Para objetivos de referência, Ac-Gly-Lys-OMe foi usado sob condições como anteriormente descrito. Os resultados são dados abaixo. A atividade das várias lisil oxidases é 20 qualificada como ++++ (muito ativa, comparável a Ac-GlyLys-OMe), +++ (bem ativa) ++ (moderadamente ativa), + pouco ativa, - não ativa.

Enzima Soro Caseína Glúten Ac-Gly-LysOMe ZGR + ++++ + + + + + + + + ZGT + ++++ + + + + + + GLO-I - +/- + + + + + GLO-2 - - - + Tabela 2: Atividade de ZGR, ZGT e GLO-I em proteínas do

soro, caseína e glúten. Claramente, as lisil oxidases diferem em sua atividade ;ntre elas, e também em sua atividade a várias proteínas. is proteínas do soro são de modificação mais difícil pelas lisil oxidases, enquanto a caseína é o substrato mais 5 acessível para ZGR e ZGT. ZGR é também muito ativa em glúten, em que ZGT é apenas moderadamente ativa. GLO-I é a menos ativa das três lisil oxidases, mostrando nenhuma atividade detectável em proteínas do soro, quase nenhuma atividade em caseína e pouca atividade em proteína de 10 glúten. Todavia, os resultados demonstram claramente que as enzimas são ativas em resíduos de lisina em proteínas, como esperado para lisil oxidases. Como esperado, com base nos resultados do exemplo 4, GLO-2 não mostrou atividade sobre qualquer um dos substratos de proteína.

Exemplo 6

Determinação de perfis de pH e T de lisil oxidases

Os perfis de pH de lisil oxidases foram determinados em uma faixa de pH de 3-8, com o uso de tampões como indicado no exemplo 4. 0 ensaio foi realizado em duas 20 etapas. Primeiro a reação foi realizada no pH adequado durante um período de tempo fixo. Então a solução foi diluída no tampão padrão para o ensaio "Amplex Red" (H2O2) e a taxa inicial foi determinada. 0 registro do perfil de pH foi realizado a 30°C com o uso de benzilamina como o 25 substrato. Os resultados são dados na tabela 3.

Enzima pH ótimo Faixa de pH T-ótima com >8 0% de (0C) atividade máxima ZGR 4,0 3,5-7,0 30 ZGT o 4,5-5,5 <20 in GLO-I 6; 0 5,5-6,5 50 ZGY 9,0 O 40 O H I O 00 Tabela 3. pH e faixa de pH ótimos em que as lisil oxidases mostram >8 0% de atividade máxima.

A tabela mostra que as lisil oxidases têm diferentes pH ótimos, que variam de pH 4 a pH 9. A lisil oxidase com 5 a faixa de pH mais ampla é ZGR (3,5 de pH).

As temperaturas ótima dessas enzimas foram determinadas em seu pH ótimo e são dadas na tabela 3. A enzima GLO-I mostra a mais alta T ótima (50°C) . A ZGR, ZGT e ZGY têm relativamente T ótima baixa ótima, mas em faixas 10 de temperatura bem compatíveis com várias aplicacões em alimentos. A T ótima de ZGT é marcadamente baixa, abaixo de

2 0 0 C.

Exemplo 7

Demonstração de uma estrutura de quinona em lisil oxidases

As lisil oxidases são conhecidas por conter uma

estrutura de quinona em seu sítio ativo. Nós verificamos verified a presença de tal cofator nas lisil oxidases identificadas com o uso do seguinte procedimento. Lisil oxidases ZGR, ZGT e GLO-I foram aplicadas em um SDS-PAGE 20 (10% bis-Tris NuPage, Invitrogen) seguido por Western blotting em papel de nitrocelulose. As quinonas foram visualizadas por coloração do blot com NBT (cloreto de nitro-tetrazólio azul) (0,24 mM em 2M Na-glicinato, pH 10). A presença de uma estrutura de quinona resulta no 25 surgimento de cor roxa no lugar onde a proteína está localizada. ZGR, ZGT e GLO-I mostraram claramente a formação dessa cor roxa. Como controle, uma endo-protease ’Maxiren600, obtida de DSM, Holanda) e uma carboxi>eptidase (Accelerzyme CPG', obtida d eDSM, Holanda) foram .ncluidas. Essas enzimas são conhecidas por não terem grupo quinona, e não mostraram uma cor roxa após coloração com 5 NBT. Esse experimento mostra que as lisil-oxidases ZGR, ZGT e GLO-I contêm uma estrutura de quinona, como esperado para lisil oxidases. A natureza exata da quinona não pode ser derivada desse experimento.

Exemplo 8

Uso de lisil oxidases para modificar a textura de soluções concentradas de soro com calor

Na primeira etapa do processo, WPI (BiPro, Davisco) foi dissolvido em água MilliQ a 10,5% e incubado de um dia para o outro em temperatura ambiente com ZGR, ZGT ou GL0-1 (10 mg de enzima/25 ml de solução) . 0 tratamento com a lisil oxidase não resultou em qualquer mudança significativa na viscosidade da solução de proteína, indicando ausência ou baixos níveis (<1%) de reticulação de proteína. Em um experimento de controle, foi adicionada água em vez da solução de enzima. As soluções foram então transferidas para uma célula de medição de um "Rapid Visco Analyzer" (RVA-4 NewPort Scientific, Australia), equilibrada a 85°C. Nessa segunda etapa do processo, os intermediários reativos, formados durante a primeira etapa do processo reagem sob formação de ligações covalentes. A solução foi lentamente agitada (50 rpm) e a mudança na viscosidade foi seguida. A Figura 5 mostra claramente que no vazio, não ocorreu qualquer mudança na viscosidade indicando nenhuma formação de gel. Em contraste, a adição 3 0 da lisil oxidases resulta em uma aumento significativo na iscosidade. Esse é especialmente pronunciado para ZGR. A ormação de gel ocorre claramente como um resultado do ratamento com a lisil oxidase, evidenciando a reatividade dos substratos da proteína reativa preparados na primeira etapa do processo. Surpreendentemente, até mesmo GLO-I tem efeito embora no exemplo 4 nenhuma atividade dessa lisil oxidase sobre proteína do soro tenha sido observada. A reação no exemplo 4 foi monitorada por apenas alguns minutos, enquanto no exemplo atual a enzima foi deixada em reação com proteína de um dia para o outro. A enzima tem aparentemente baixa atividade em proteínas do soro, mas ainda suficiente para afetar o desenvolvimento de viscosidade após aquecimento, como demonstrado nesse exemplo. É claro que as lisil oxidases são capazes de gerar intermediários de proteína reativa que podem ser usados em uma segunda etapa por aquecimento para modificar a textura de soluções concentradas de soro. As proteínas do soro são presentes como agentes de texturização em vários alimentos; é de interesse industrial a modificação das propriedades de textura de proteínas do soro com lisil oxidase, e é de especial interesse a preparação de intermediários reativos que possam ser subseqüentemente usados para modificar a textura dos alimentos.

Exemplo 9

Uso de lisil oxidase ZGR para melhorar o volume de pão de arroz

480 gramas de farinha de arroz (BL-250, van Sillevoldt, holanda) e 20 gramas de proteína de arroz (Remy Industries, 0400061) foram misturados em um misturador

3 0 Hobart (primeira velocidade: 2 minutos, segunda velocidade:3 minutos) com 475 gramas de água, 22,5 gramas de Koningsgist (Gilde, holanda), 10 gramas de NaCl, 5 gramas de sacarose, 50 gramas biskien (gordura, UniPro, holanda), 20 gramas de goma xantana e 12 ppm Bakezyme P500 5 (DSM, Holanda). As massas foram moldadas à mão, primeira prova por 20 minutos a 38°C, prova final por 40 minutos a 380C (ambas em 85% de umidade relativa). Lisil oxidase ZGR (100 ppm) foi adicionada antes da mistura em um experimento, no experimento de controle nenhuma lisil 10 oxidase foi adicionada. A massa com a lisil oxidase foi julgada como mais desenvolvida. Os pães foram assados (24 0°C, 20 minutos) com o uso de um forno MIWE Combo (Arnstein, Alemanha, vávula fechada). Depois do cozimento,

o pão que continha a a lisil oxidase era mais estável na estrutura e maior em volume.

Exemplo 10

Reticulação de proteínas do leite

Soluções a 3% (p/v) foram preparadas em agua de kcaseína, α-caseína e uma mistura de k- e α-caseína (ambas a 20 0,3% p/v) e incubadas de um dia para o outro a 37°C com lisil oxidase ZGR (0,1 mg/ml ). Subseqüentemente, as amostras foram aquecidas a 85 0C (3 0 minutos) . Foram preparadas amostras de controle em que a lisil oxidase ZGR não foi adicionada. As amostras foram analisadas em SDS25 PAGE (veja a Figura 4) . Claramente, a adição da lisil oxidase resulta na formação de proteínas com peso molecular aumentado, quando comparadas ao controle em que a lisil oxidase não foi adicionada. O tratamento com lisil oxidase ZGR leva a reticulações de proteína covalente, levando aos

3 0 maiores agregados de peso molecular.

Claims (14)

1. Uso de uma lisil oxidase caracterizado pelo fato de que (a) mostra uma relação entre da atividade lisil oxidase para A.c.-Gly-Lys-OMe e da atividade lisil oxidase para o benzylamine pelo menos de 1.1, preferivelmente pelo menos 1.3, melhor pelo menos de 1.4 por meio de que as atividades são determinadas em 37 graus Célsio e em um pH de 7.0; e. (b) tem uma atividade a melhor em uma 10 temperatura entre de 0 e 6 0 graus de celsius, para catalisar o desaminação oxidativa de grupos lisil em uma proteína ou em um peptideo aos aldeídos correspondentes, com a redução subseqüente do 02 a H2O2.

2. Uso de um polipeptídeo que tenha atividade lisil oxidase e que compreenda a seguinte porção do aminoácido (resíduos entre parênteses indica a degeneração permitida nesse ponto, aminoácidos está em código de 1 letra): -IHD [NS] LSGSMHDHV [IL] N-F K, caracterizado pelo fato de para catalisar o desaminação oxidativa de grupos lisil em uma proteína ou em um peptideo aos aldeídos correspondentes, com a redução subseqüente do 02 a H202.

3. Uso de um polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que tenha pelo menos a identidade da seqüência de aminoácido de 60% com a seqüência de aminoácido inteira de qualquer do NO. SEGS. da identificação: 1 a 4.

4. Uso de um polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo fato de que tem uma seqüência de aminoácido que tenha pelo menos 65%, preferivelmente pelo menos 70%, melhor pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, melhor pelo menos 95%, e mesmo melhor pelo menos identidade de aproximadamente 97% com a seqüência de aminoácido inteira de qualquer do NO. SEGS. da identificação: 1 a 4.

5. Uso de um polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende algum das seqüências de aminoácido do NO. SEGS. da identificação·. 1 a 4.

6. Uso de um polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, ou uso de uma lisil oxidase, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou a lisil oxidase são obtidos de um fungo, preferivelmente um aspergilo, melhor dos nidulans do aspergilo, dos neoformans do Cryptococcus, da anserina de Podospora e do graminearum de Fusarium.

7. Uso de um polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, ou uso de uma lisil oxidase, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um alimento ou uma alimentação ou um nutraceutical ou para a preparação de um produto intermediário para a preparação de um alimento ou uma alimentação ou um nutraceutical.

8. Método para a produção de lisil oxidase caracterizado pelo fato de que compreende a cultura de uma pilha de anfitrião que compreende uma construção do ácido nucleico que compreende um polinucleotido que codifica a lisil oxidase que compreende a seqüência de aminoácido: -IHD [NS] LSGSMHDHV [IL] N-F K; sob as circunstâncias apropriadas para a produção da lisil oxidase; e recuperando a lisil oxidase.

9. Processo para identificar lisil oxidase caracterizado pelo fato de que compreende selecionando uma seqüência de aminoácido para a presença das seqüências de aminoácido: -IHD [NS] LSGSMHDHV [IL] N-F K.

10. Processo para modificar um produto alimentício ou alimento que contenha uma proteína, caracterizado pelo fato de que o método compreende modificando o produto alimentício ou alimento contatando o com uma lisil oxidase selecionada de consistir do grupo: I uma lisil oxidase que --(a) mostra uma relação entre da atividade lisil oxidase para A. C.-Gly-Lys-OMe e da atividade lisil oxidase para o benzylamine pelo menos de 1.1, preferivelmente pelo menos 1.3, melhor pelo menos de 1.4 por meio de que as atividades são determinadas em 3 7 graus Célsio e em um pH de 7.0; e, --(b) tem uma atividade a melhor em uma temperatura entre de 0 e 60 graus Célsio; e II uma lisil oxidase que compreenda o seguinte porção do aminoácido (resíduos nos suportes indicam a degeneração permitida nesse ponto, aminoácidos estão em 1 código da letra): -IHD [NS] LSGSMHDHV [IL] N-F K.

11. Processo para a preparação de um aldeído reativo em uma proteína ou em um peptideo caracterizado pelo fato de que compreende o desaminação oxidativa da lisil-amina da proteína ou do peptideo uma lisil oxidase e preferivelmente pela concentração e/ou pela secagem da proteína ou do peptideo que contêm os aldeídos reativos.

12. Processo para a preparação de uma proteína ou de jm peptideo reticulada caracterizado pelo fato de que compreende o aquecimento de uma proteína ou de um peptideo que compreenda aldeídos reativos e se prepare de acordo com o processo da reivindicação 11, à ligação transversal a proteína.

13. Proteína ou peptideo caracterizado pelo fato de que compreende os aldeídos reativos dados forma pelo desaminação oxidativa da lisil-amina da proteína ou do peptideo, e que sejam formulário preferivelmente dentro secado.

14. Alimento, produto alimentício, nutracêutico ou um intermediário para um alimento, produto alimentício, nutracêutico caracterizado pelo fato de que compreende uma proteína ou um peptideo da reivindicação 13.