ES2230541T3 - Nuevos polipeptidos biologicamente activos, su preparacion y composicion farmaceutica que los contiene. - Google Patents
Nuevos polipeptidos biologicamente activos, su preparacion y composicion farmaceutica que los contiene.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVOS POLIPEPTIDOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS, SU PREPARACION Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LOS CONTIENEN.
Description
Nuevos polipéptidos biológicamente activos, su
preparación y composición farmacéutica que los contiene.
La presente invención se relaciona con nuevos
polipéptidos biológicamente activos, con su preparación y con
composiciones farmacéuticas que los contienen.
Más concretamente, la presente invención se
relaciona con polipéptidos recombinantes esencialmente compuestos
por una parte activa derivada de un polipéptido, natural o
artificial, que tiene una actividad terapéutica y que está copulado
a una albúmina o a una variante de la albúmina. Se entiende que la
actividad terapéutica de los polipéptidos de la invención puede ser
directa (tratamiento de enfermedades) o indirecta (y, por ejemplo,
utilizable en la prevención de las enfermedades, en la producción de
vacunas, en técnicas de imagen médica, etc...).
Se entiende en lo que sigue que las variantes de
la albúmina designan cualquier proteína de alta vida media
plasmática obtenida por modificación (mutación, deleción y/o
adición) por técnicas de ingeniería genética de un gen codificante
de un isomorfo dado de la seroalbúmina humana, así como cualquier
macromolécula de alta vida media plasmática obtenida por
modificación in vitro de la proteína codificada por tales
genes. Siendo la albúmina muy polimorfa, se han identificado y
clasificado numerosas variantes naturales [Weitkamp L.R. y col.,
Ann. Hum. Genet. 37 (1973), 219].
El fin de la presente invención es elaborar
proteínas artificiales biológicamente activas y utilizables en el
plano farmacéutico. En efecto, numerosos polipéptidos que poseen una
o varias actividades terapéuticas potenciales no pueden ser
explotados farmacéuticamente. Esto puede tener diferentes razones,
tales como, especialmente, su débil estabilidad in vivo, su
estructura compleja o frágil, la dificultad para producirlos a una
escala industrial aceptable, etc... Incluso, ciertos polipéptidos no
dan los resultados esperados in vivo por problemas de
administración, de acondicionamiento, de farmacocinética, etc...
EP 413.622 divulga la fusión de CD4 soluble con
la albúmina sérica. WO 90/13653 divulga ciertos compuestos
particulares de fusión con la albúmina para los objetivos de una
mayor secreción, en particular. WO 89/02922 divulga la fusión de CD4
soluble a una molécula emparentada desde el punto de vista de su
estructura, a saber, su fusión con una cadena de inmunoglobulinas
(Ig).
La presente invención permite solucionar estos
inconvenientes. La presente invención proporciona, en efecto, nuevas
moléculas que permiten una explotación óptima en el plano
terapéutico de las propiedades biológicas de estos polipéptidos. La
presente invención resulta especialmente de la evidenciación de que
es posible copular genéticamente cualquier estructura activa
derivada de un polipéptido biológicamente activo a una estructura
proteica constituida por albúmina, sin alterar dichas propiedades
biológicas. Resulta igualmente de la evidenciación por la
solicitante de que la seroalbúmina humana permite presentar
eficazmente la estructura activa a sus sitios de interacción y
asegura una estabilidad plasmática elevada del polipéptido de la
invención. Los polipéptidos de la invención permiten también
mantener en el organismo una actividad biológica dada durante un
tiempo prolongado. Permiten también reducir las dosis administradas
y, en ciertos casos, potenciar el efecto terapéutico, por ejemplo
reduciendo los efectos secundarios consecutivos a una administración
más importante. Los polipéptidos de la invención permiten además
generar y utilizar estructuras derivadas de polipéptidos
biológicamente activos muy pequeños y, por lo tanto, muy específicas
de un efecto buscado. Se entiende que los péptidos que tienen una
actividad biológica que presenta un interés terapéutico pueden
también corresponder a secuencias peptídicas no naturales, aisladas,
por ejemplo, a partir de bancos peptídicos aleatorios. Los
polipéptidos de la invención poseen además una distribución
particularmente ventajosa en el organismo, lo que modifica sus
propiedades farmacocinéticas y favorece el desarrollo de su
actividad biológica y su utilización. Además, presentan también la
ventaja de ser débilmente o nada inmunogénicos para el organismo en
el que se utilizan. Finalmente, los polipéptidos de la invención
pueden ser expresados (y preferiblemente segregados) por organismos
recombinantes a niveles que permiten su explotación industrial.
Un objeto de la presente invención se relaciona,
pues, con polipéptidos que llevan una parte activa derivada de un
polipéptido que tiene una actividad terapéutica copulada a una
albúmina o a una variante de la albúmina.
En un modo de realización particular, los
péptidos que poseen una actividad terapéutica no son de origen
humano.
Más concretamente, en las moléculas de la
invención, el polipéptido que tiene una actividad terapéutica es un
polipéptido de origen humano o una variante molecular. Puede
tratarse en todo o en parte de una hormona, de un interferon, de una
interleukina, de eritropoyetina, de G-CSF o de
insulina.
La parte activa de los polipéptidos de la
invención puede estar constituida, por ejemplo, por el polipéptido
que tiene una actividad terapéutica entero o por una estructura
derivada de éste, o también por un polipéptido no natural aislado a
partir de un banco peptídico. En el seno de la presente invención,
se entiende por estructura derivada cualquier polipéptido obtenido
por modificación y que conserve una actividad terapéutica. Por
modificación, se ha de entender cualquier mutación, substitución,
deleción, adición o modificación de naturaleza genética y/o química.
Tales derivados pueden ser generados con fines diferentes, tales
como, especialmente, el de aumentar la afinidad de la molécula por
sus sitios de fijación, el de mejorar sus niveles de producción, el
de aumentar su resistencia a las proteasas, el de aumentar su
eficacia terapéutica o también de reducir sus efectos secundarios, o
el de conferir nuevas propiedades biológicas. A modo de ejemplo, los
polipéptidos quiméricos de la invención poseen propiedades
farmacocinéticas y una actividad biológica utilizable para la
prevención o el tratamiento de enfermedades.
Son polipéptidos de la invención particularmente
ventajosos aquéllos en los cuales la parte activa presenta:
(a) la estructura peptídica entera o
(b) una estructura derivada de (a) por
modificación estructural (mutación, substitución, adición y/o
deleción de uno o varios residuos) y que posee una actividad
terapéutica.
Entre las estructuras de tipo (b), se pueden
citar más concretamente las moléculas en las cuales se han
modificado o suprimido ciertos sitios de N- u
O-glicosilación, las moléculas en las cuales se han
substituido uno o varios residuos o las moléculas en las cuales se
han substituido todos los residuos de cisteína. Se pueden citar
también moléculas obtenidas a partir de (a) por deleción de regiones
que no intervienen o que intervienen poco en la interacción con los
sitios de unión considerados o que expresan una actividad indeseable
y moléculas que llevan con respecto a (a) residuos suplementarios,
tales como, por ejemplo, una metionina N-terminal
y/o una señal de secreción y/o un péptido de unión.
La parte activa de las moléculas de la invención
puede copularse, o bien directamente, o bien por medio de un péptido
artificial a la albúmina. Además, puede constituir tanto el extremo
N-terminal como el extremo
C-terminal de la molécula. Preferiblemente, en las
moléculas de la invención, la parte activa constituye la parte
C-terminal de la quimera. También se entiende que la
parte biológicamente activa puede ser redundante en el seno de la
quimera. En la Figura 1, se da una representación esquemática de las
moléculas de la invención.
Otro objeto de la invención se relaciona con un
procedimiento de preparación de las moléculas quiméricas antes
descritas. Más concretamente, este procedimiento consiste en hacer
expresar por un huésped celular eucariótico o procariótico una
secuencia nucleotídica codificante del polipéptido deseado y recoger
luego el polipéptido producido.
Entre los huéspedes eucarióticos utilizables en
el marco de la presente invención, se pueden citar las células
animales, las levaduras o los hongos. En particular, tratándose de
levaduras, se pueden citar las levaduras del género
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces o
Hansenula. Tratándose de células animales, se pueden citar
las células COS, CHO, C127, etc... Entre los hongos susceptibles de
ser utilizados en la presente invención se pueden citar más
concretamente Aspergillus ssp. o Trichoderma ssp. Como
huéspedes procarióticos, se prefiere utilizar bacterias tales como
Escherichia coli o pertenecientes a los géneros
Corynebacterium, Bacillus o Streptomyces.
Las secuencias nucleotídicas utilizables en el
marco de la presente invención pueden ser preparadas de diferentes
maneras. En general, son obtenidas juntando en fase de lectura las
secuencias codificantes de cada una de las partes funcionales del
polipéptido. Éstas pueden ser aisladas por las técnicas conocidas
por el experto en este campo y, por ejemplo, directamente a partir
de los ARN mensajeros (ARNm) celulares o por reclonación a partir de
un banco de ADN complementario (ADNc), o también puede tratarse de
secuencias nucleotídicas totalmente sintéticas. Se entiende además
que las secuencias nucleotídicas pueden también ser ulteriormente
modificadas, por ejemplo por técnicas de ingeniería genética, para
obtener derivados o variantes de dichas secuencias.
Más preferiblemente, en el procedimiento de la
invención, la secuencia nucleotídica forma parte de un cassette de
expresión que contiene una región de iniciación de la transcripción
(región promotora) que permite, en las células huésped, la expresión
de la secuencia nucleotídica puesta bajo su control y codificante de
los polipéptidos de la invención. Esta región puede proceder de
regiones promotoras de genes fuertemente expresados en la célula
huésped utilizada, siendo la expresión constitutiva o regulable.
Tratándose de levaduras, puede tratarse del promotor del gen de la
fosfoglicerato kinasa (PGK), de la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GPD), de la lactasa (LAC4), de las
enolasas (ENO), de las alcohol deshidrogenasas (ADH),
etc... Tratándose de bacterias, puede tratarse del promotor de los
genes derecho o izquierdo del bacteriófago lambda (P_{L},
P_{R}), o también de los promotores de los genes de los operones
del triptófano (P_{trp}) o lactosa (P_{lac}). Además, esta
región de control puede ser modificada, por ejemplo por mutagénesis
in vitro, por introducción de elementos adicionales de
control o de secuencias sintéticas, o por deleciones o
substituciones de los elementos originales de control. El cassette
de expresión puede también comprender una región de finalización de
la transcripción funcional en el huésped contemplado, situada
inmediatamente secuencia debajo de la secuencia nucleotídica
codificante de un polipéptido de la invención.
En un modo preferido, los polipéptidos de la
invención resultan de la expresión en un huésped eucariótico o
procariótico de una secuencia nucleotídica y de la secreción del
producto de expresión de dicha secuencia en el medio de cultivo. Es,
en efecto, particularmente ventajoso poder obtener por vía
recombinante moléculas directamente en el medio de cultivo. En este
caso, la secuencia nucleotídica codificante de un polipéptido de la
invención va precedida de una secuencia líder (o secuencia señal)
que dirige el polipéptido naciente en las vías de secreción del
huésped utilizado. Esta secuencia líder puede ser la secuencia señal
natural del polipéptido biológicamente activo en el caso en que éste
sea una proteína segregada de forma natural, o la de la estructura
estabilizadora, pero puede también tratarse de cualquier otra
secuencia líder funcional, o de una secuencia líder artificial. La
elección de una u otra de estas secuencias está especialmente guiada
por el huésped utilizado. Como ejemplos de secuencias señal
funcionales se incluyen las de los genes de las feromonas sexuales o
de las toxinas "killer" de levaduras.
Además del cassette de expresión, se pueden
añadir uno o varios marcadores que permitan seleccionar el huésped
recombinante, tales como, por ejemplo, el gen URA3 de la levadura
S. cerevisiae, o genes que confieren resistencia a
antibióticos, como la geneticina (G418) o a cualquier otro compuesto
tóxico, como ciertos iones metálicos.
El conjunto constituido por el cassette de
expresión y por el marcador de selección puede ser introducido
directamente en las células huésped consideradas o insertado
previamente en un vector autorreplicativo funcional. En el primer
caso, se añaden preferiblemente secuencias homólogas a regiones
presentes en el genoma de las células huésped a este conjunto,
colocándose entonces dichas secuencias a cada lado del cassette de
expresión y del gen de selección para aumentar la frecuencia de
integración del conjunto en el genoma del huésped dirigiendo la
integración de las secuencias por recombinación homóloga. En el caso
de que se inserte el cassette de expresión en un sistema
replicativo, un sistema de replicación preferido para las levaduras
del género Kluyveromyces deriva del plásmido pKD1
inicialmente aislado de K. drosophilarum; un sistema
preferido de replicación para las levaduras del género
Saccharomyces deriva del plásmido 2\mu de S.
cerevisiae. Además, este plásmido de expresión puede contener
todo o parte de dichos sistemas de replicación, o puede combinar
elementos derivados del plásmido pKD1, así como del plásmido
2\mu.
Además, los plásmidos de expresión pueden ser
vectores lanzadera entre un huésped bacteriano, tal como
Escherichia coli, y la célula huésped elegida. En este caso,
se requieren un origen de replicación y un marcador de selección que
funcione en el huésped bacteriano. Es también posible colocar sitios
de restricción alrededor de las secuencias bacterianas y únicos
sobre el vector de expresión: esto permite suprimir estas secuencias
por corte y religación in vitro del vector truncado antes de
la transformación de las células huésped, lo que puede dar lugar a
un aumento del número de copias y a una mayor estabilidad de los
plásmidos de expresión en dichos huéspedes. Por ejemplo, tales
sitios de restricción pueden corresponder a secuencias tales como
5'-GGCCNNNNNGGCC-3' (SfiI) o
5'-GCGGCCGC-3' (NotI) en la
medida en que estos sitios son extremadamente raros y están
generalmente ausentes de un vector de expresión.
Después de la construcción de tales vectores o
cassette de expresión, éstos son introducidos en las células huésped
recogidas según las técnicas clásicas descritas en la literatura. A
este respecto, se puede utilizar cualquier método que permita
introducir un ADN extraño en una célula. Puede tratarse,
especialmente, de transformación, electroporación, conjugación o
cualquier otra técnica conocida por el experto en este campo. A modo
de ejemplo para los huéspedes de tipo levadura, se transformaron las
diferentes cepas de Kluyveromyces utilizadas tratando las
células enteras en presencia de acetato de litio y de
polietilenglicol según la técnica descrita por Ito y col. [J.
Bacteriol., 153 (1983), 163]. También se utilizó la técnica
de transformación descrita por Durrens y col. [Curr. Genet.,
18 (1990), 7] utilizando etilenglicol y sulfóxido de
dimetilo. Es también posible transformar las levaduras por
electroporación, según el método descrito por Karube y col. [FEBS
Letters, 182 (1985), 90]. También se describe un protocolo
alternativo con detalle en los ejemplos que se dan a
continuación.
Tras la selección de las células transformadas,
se inoculan las células que expresan dichos polipéptidos y se puede
realizar la recuperación de dichos polipéptidos, ya sea en el curso
del crecimiento celular para los procedimientos "continuos", ya
sea al final del crecimiento para los cultivos "por lotes"
("batch"). Se purifican luego los polipéptidos objeto de la
presente invención a partir del sobrenadante de cultivo en vistas a
su caracterización molecular, farmacocinética y biológica.
Un sistema de expresión preferido de los
polipéptidos de la invención consiste en la utilización de las
levaduras del género Kluyveromyces como célula huésped,
transformadas por ciertos vectores derivados del replicón
extracromosómico pKD1 inicialmente aislado de K. marxianus
var. drosophilarum. Estas levaduras, y en particular K.
lactis y K. fragilis, son generalmente capaces de
replicar dichos vectores de forma estable y poseen además la ventaja
de estar incluidas en la lista de organismos G.R.A.S.
("Generally Recognized as Safe").
Son levaduras privilegiadas preferiblemente cepas industriales del
género Kluyveromyces capaces de replicar de forma estable
dichos plásmidos derivados del plásmido pKD1 y donde se ha insertado
un marcador de selección, así como un cassette de expresión que
permite la secreción a elevados niveles de los polipéptidos de la
invención.
La presente invención se relaciona también con
las secuencias nucleotídicas codificantes de los polipéptidos
quiméricos antes descritos, así como con las células recombinantes,
eucarióticas o procarióticas, que contienen dichas secuencias.
La presente invención se relaciona también con la
aplicación como medicamento de los polipéptidos según la presente
invención. Más concretamente, la invención tiene por objeto
cualquier composición farmacéutica que contenga uno o varios
polipéptidos o secuencias nucleotídicas tales como las antes
descritas. Las secuencias nucleotídicas pueden ser, en efecto,
utilizadas en terapia génica.
La presente invención será más completamente
descrita con ayuda de los ejemplos que se dan a continuación, que
deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.
Figura 1: Esquematización de las quimeras de tipo
SAH-PÉPTIDO (A), de tipo PÉPTIDO-SAH
(B) o de tipo PÉPTIDO-SAH-PÉPTIDO
(C). Abreviaturas utilizadas: M/LP, residuo de metionina iniciador
de la traducción, eventualmente seguido de una secuencia señal de
secreción; SAH, albúmina madura o una de sus variantes moleculares;
PEP, péptido de origen natural o artificial que posee una propiedad
terapéutica dada. La secuencia PEP puede estar presente varias veces
en las moléculas de tipo A, B o C. La flecha negra indica el extremo
N-terminal de la proteína madura.
SEC ID Nº 1: Ejemplos de secuencias nucleotídicas
de un fragmento de restricción HindIII codificante de una
proteína quimérica de tipo
prepro-SAH-PÉPTIDO. Las flechas
negras indican el fin de las regiones "pre" y "pro" de la
SAH. El sitio de restricción MstII está subrayado y el codon
que especifica la finalización de la traducción está en
negrilla.
Figura 3: Mapa de restricción del plásmido pYG105
y estrategia genérica de construcción de los plásmidos de expresión
de las proteínas quiméricas de la presente invención. Abreviaturas
utilizadas: P, promotor de la transcripción; T, finalizador de la
transcripción; IR, secuencias repetidas invertidas del plásmido
pKD1; LP, secuencia señal de secreción; Ap^{r} y Km^{r}
representan, respectivamente, los genes de resistencia a la
ampicilina (E. coli) y al G418 (levaduras).
Figura 4: Ejemplos de secuencias nucleotídicas de
fragmentos de restricción MstII-HindIII derivados del
factor von Willebrand. Representación de la estructura de los
fragmentos MstII-HindIII de los plásmidos pYG1248
(panel A), pYG1214 (panel B), pYG1206 [panel C; en esta quimera
particular, el residuo Leu694 del vWF es también el último residuo
(Leu585) de la SAH] y pYG1223 (panel D); la numeración de los
aminoácidos corresponde a la numeración del vWF maduro según Titani
y col. [Biochemistry 25 (1986), 3171-3184].
Los sitios de restricción MstII y HindIII están
subrayados y el codon de finalización de la traducción está en
negrilla.
SEC ID Nº 2: secuencia nucleotídica del fragmento
de restricción MstII-HindIII del plásmido pYG1248. La
numeración de los aminoácidos (columna de la derecha) corresponde a
la proteína quimérica SAH-vWF470\rightarrow713
madura (829 residuos). Los residuos Thr470, Leu 494, Asp498, Pro502,
Tyr508, Leu694, Pro704 y Pro708 del vWF maduro están subrayados.
Figura 5: Caracterización del material segregado
tras 4 días de cultivo (erlenmeyers) de la cepa CBS 293.91
transformada por los plásmidos pYG1248 (plásmido de expresión de una
quimera de tipo SAH-vWF Thr470\rightarrow Val713)
y pKan707 (plásmido control). En esta experiencia, los resultados de
los paneles A, B y C migraron sobre el mismo gel
(SDS-PAGE 8,5%) y luego fueron tratados por
separado.
A. Coloración con azul de Coomassie; patrón de
peso molecular (banda 2); sobrenadante equivalente a 50 \mul del
cultivo transformado por los plásmidos pKan707 en medio YPL (banda
1) o pYG1248 en medio YPD (banda 3) o YPL (banda 4).
B. Caracterización inmunológica del material
segregado tras la utilización de anticuerpos de ratón dirigidos
contra el vWF humano: misma leyenda que en A, a excepción de la
utilización de patrones biotinilados de peso molecular.
C. Caracterización inmunológica del material
segregado tras la utilización de anticuerpos de conejo dirigidos
contra la albúmina humana: sobrenadante equivalente a 50 \mul del
cultivo transformado por los plásmidos pKan707 en medio YPL (banda
1) o pYG1248 en medio YPD (banda 2) o YPL (banda 3).
Figura 6: Cinética de secreción de una quimera de
la invención por la cepa CBS 293.91 transformada por el plásmido
pYG1206 (SAH-vWF Leu694-Pro708).
A. Coloración con azul de Coomassie; patrón de
peso molecular (banda 1); sobrenadante equivalente a 2,5 \mul de
un cultivo de "alimentación por lotes" en medio YPD después de
24 h (banda 2), 40 h (banda 3) ó 46 h (banda 4) de crecimiento.
B. Caracterización inmunológica del material
segregado tras el uso de anticuerpos de ratón dirigidos contra el
vWF humano: misma leyenda que en A, a excepción del uso de patrones
biotinilados de peso molecular.
Figura 7: Caracterización del material segregado
por K. lactis transformado por los plásmidos pKan707
(plásmido control, banda 2), pYG1206 (banda 3), pYG1214 (banda 4) y
pYG1223 (banda 5); patrón de peso molecular (banda 1). Los depósitos
corresponden a 50 \mul de sobrenadante de un cultivo estacionario
tras crecimiento en medio YPD, migración en un gel al 8,5% de
acrilamida y coloración con azul de Coomassie.
SEC ID Nº 3: Secuencia nucleotídica del fragmento
de restricción MstII-HindIII del plásmido pYG1341
(SAH-UK1\rightarrow135). Se indica el límite del
dominio de tipo EGF (UK1\rightarrow46) presente en el fragmento de
restricción MstII-HindIII del plásmido pYG1340. La
numeración de los aminoácidos corresponde a la proteína quimérica
SAH-UK1\rightarrow
135 madura (720 residuos).
135 madura (720 residuos).
Figura 9: Secreción de las quimeras
SAH-UK1-46 y
SAH-UK1-135 por la cepa CBS 293.91
respectivamente transformada por los plásmidos pYG1343
(SAH-UK1-46) y pYG1345
(SAH-UK1-135) después de 4 días de
crecimiento (medio YPL+G418). Los depósitos (equivalentes a 50
\mul de cultivo) migran en gel de PAGE-SDS al 8,5%
y se colorean con azul de Coomassie: sobrenadante de un clon
transformado con los plásmidos pKan707 (banda 1), pYG1343 (banda 3)
o pYG1345 (banda 4); patrón de peso molecular (banda 2).
SEC ID Nº 4: Secuencia nucleotídica del fragmento
de restricción MstII-HindIII del plásmido pYG1259
(SAH-G-CSF). Se indica el límite de
la parte G-CSF (174 residuos). Los sitios de
restricción ApaI y SstI (SstI) están
subrayados. La numeración de los aminoácidos corresponde a la
proteína quimérica SAH-G-CSF madura
(759 residuos).
SEC ID Nº 5: Secuencia nucleotídica del fragmento
de restricción HindIII del plásmido pYG1301 (quimera
G-CSF-Gly_{4}-SAH).
Las flechas negras indican el final de las regiones "pre" y
"pro" de la SAH. Los sitios de restricción ApaI,
SstI (SacI) y MstII están subrayados. Los
dominios G-CSF (174 residuos) y SAH (585 residuos)
están separados por el ligante sintético GGGG. La numeración de los
aminoácidos corresponde a la proteína quimérica
G-CSF-Gly4-SAH
madura (763 residuos). La secuencia nucleotídica comprendida entre
el codon de finalización de la traducción y el sitio HindIII
proviene del ADN complementario (ADNc) de la SAH, tal como se
describe en la solicitud de patente EP 361.991.
Figura 12: Caracterización del material segregado
después de 4 días de cultivo (erlenmeyers) de la cepa CBS 293.91
transformada por los plásmidos pYG1266 (plásmido de expresión de una
quimera de tipo SAH-G-CSF) y pKan707
(plásmido control). En esta experiencia, los resultados de los
paneles A, B y C migraron sobre el mismo gel
(SDS-PAGE al 8,5%) y luego fueron tratados por
separado.
A. Coloración con azul de Coomassie; patrón de
peso molecular (banda 2); sobrenadante equivalente a 100 \mul del
cultivo transformado con los plásmidos pKan707 en medio YPL (banda
1) o pYG1266 en medio YPD (banda 3) o YPL (banda 4).
B. Caracterización inmunológica del material
segregado tras la utilización de anticuerpos primarios dirigidos
contra el G-CSF humano: misma leyenda que en A.
C. Caracterización inmunológica del material
segregado tras la utilización de anticuerpos primarios dirigidos
contra la albúmina humana: misma leyenda que en A.
Figura 13: Caracterización del material segregado
después de 4 días de cultivo (erlenmeyers en medio YPD) de la cepa
CBS 293.91 transformada con los plásmidos pYG1267 (quimera
SAH-G-CSF), pYG1303 (quimera
G-CSF-Gly_{4}-SAH)
y pYG1352 (quimera
SAH-Gly_{4}-G-CSF)
tras migración sobre gel de SDS-PAGE al 8,5%.
A. Coloración con azul de Coomassie; sobrenadante
equivalente a 100 \mul del cultivo transformado con los plásmidos
pYG1303 (banda 1), pYG1267 (banda 2) o pYG1352 (banda 3); patrón de
peso molecular (banda 4).
B. Caracterización inmunológica del material
segregado tras la utilización de anticuerpos primarios dirigidos
contra el G-CSF humano: misma leyenda que en A.
SEC ID Nº 6: Secuencia nucleotídica del fragmento
de restricción MstII-HindIII del plásmido pYG1382
(SAH-Fv'). Los dominios VH (124 residuos) y VL (107
residuos) del fragmento Fv' están separados por el ligante sintético
(GGGGS)x3. La numeración de los aminoácidos corresponde a la
proteína quimera SAH-Fv' madura (831 residuos).
Figura 15: Secreción de la quimera
SAH-Fv' por la cepa CBS 293.91 transformada con el
plásmido pYG1383 (LAC4) después de 4 días de crecimiento en
erlenmeyers a 28ºC en medio YPD (banda 2) o YPL (banda 3); patrón de
peso molecular (banda 1). Los depósitos, equivalentes a 200 \mul
de cultivo (precipitación con etanol), migran en gel de
PAGE-SDS (8,5%).
A. Coloración del gel con azul de Coomassie.
B. Caracterización inmunológica del material
segregado tras la utilización de anticuerpos primarios dirigidos
contra la SAH.
Figura 16: Determinación de la actividad
antagonista in vitro de la aglutinación de las plaquetas
humanas fijadas con formaldehído: CI_{50} de los híbridos
SAH-vWF694-708,
[SAH-vWF470-713 C471G, C474G] y
[SAH-vWF470-704 C471G C474G] con
respecto al patrón RG12986. La determinación de la inhibición
dosis-dependiente de la aglutinación plaquetaria es
realizada según el método descrito por C. Prior y col.
[Bio/Technology (1992), 10, 66] utilizando un agregómetro que
registra las variaciones de la transmisión óptica bajo agitación a
37ºC en presencia de vWF humano, de botrocetina (8,2 mg/ml) y del
producto a estudiar a diferentes diluciones. Se determina entonces
la concentración del producto que permite inhibir a la mitad
(CI_{50}) la aglutinación del control (en ausencia de
producto).
Figura 17: Actividad sobre la proliferación
celular in vitro de la línea murina NFS60. Se representa la
radiactividad (^{3}H-timidina) incorporada en los
núcleos celulares después de 6 horas de incubación en la ordenada
(cpm); se expresa la cantidad de producto indicada en la abscisa en
molaridad (unidades arbitrarias).
Figura 18: Actividad sobre la granulopoyesis
in vivo en la rata. Se indica el número de neutrófilos (media
de 7 animales) en la ordenada en función del tiempo. Los productos
estudiados son la quimera SAH-G-CSF
(pYG1266, 4 ó 40 mg/rata/día), el G-CSF de
referencia (10 mg/rata/día), la SAH recombinante purificada a partir
de sobrenadante de Kluyveromyces lactis (SAH, 30 mg/rata/día,
véase EP 361.991) o suero fisiológico.
Los métodos clásicamente utilizados en biología
molecular, tales como las extracciones preparatorias de ADN
plasmídico, la centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de
cloruro de cesio, la electroforesis en geles de agarosa o de
acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN por electroelución,
la extracción de proteínas con fenol o
fenol-cloroformo, la precipitación de ADN en medio
salino con etanol o isopropanol, la transformación en Escherichia
coli, etc... son bien conocidas por el experto en la técnica y
están abundantemente descritas en la literatura [Maniatis, T. y
col., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel, F.M. y
col. (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John
Wiley & Sons, New York, 1987].
Las enzimas de restricción fueron proporcionadas
por New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories
(BRL) o Amersham y son utilizadas según las recomendaciones de los
proveedores.
Los plásmidos de tipo pBR322 y pUC y los fagos de
la serie M13 son de origen comercial (Bethesda Research
Laboratories).
Para las ligaciones, los fragmentos de ADN son
separados por su tamaño por electroforesis en geles de agarosa o de
acrilamida, extraídos con fenol o con una mezcla de
fenol/cloroformo, precipitados con etanol y luego incubados en
presencia de la ADN ligasa del fago T4 (Biolabs) según las
recomendaciones del proveedor.
El rellenado de los extremos 5' prominentes es
efectuado mediante el fragmento de Klenow de la ADN Polimerasa I de
E. coli (Biolabs) según las especificaciones del proveedor.
Se efectúa la destrucción de extremos 3' prominentes en presencia de
la ADN Polimerasa del fago T4 (Biolabs) utilizada según las
recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5'
prominentes es efectuada por tratamiento dirigido con la nucleasa
S1.
La mutagénesis dirigida in vitro por
oligodesoxinucleótidos sintéticos es efectuada según el método
desarrollado por Taylor y col. [Nucleic Acids Res., 13
(1985), 8749-8764] utilizando el kit distribuido por
Amersham.
La amplificación enzimática de fragmentos de ADN
por la técnica llamada de PCR
(Polymerase-catalyzed Chain Reaction,
Saiki R.K. y col., Science, 230 (1985),
1350-1354; Mullis, K.B. y Faloona, F.A., Meth.
Enzym., 155 (1987), 335-350] es efectuada
utilizando un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) según
las especificaciones del fabricante.
La verificación de las secuencias nucleotídicas
es efectuada por el método desarrollado por Sanger y col. [Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), 5463-5467]
utilizando el kit distribuido por Amersham.
Las transformaciones de K. lactis con el
ADN de los plásmidos de expresión de las proteínas de la presente
invención son efectuadas por cualquier técnica conocida por el
experto en este campo y un ejemplo de las cuales se da en el
texto.
Salvo indicación en contrario, las cepas
bacterianas utilizadas son E. coli MC1060 (lacIPOZYA,
X74, galU, galK, strA^{r}) o E. coli
TG1 (lac, proA,B, supE, thi,
hsdD5/FtraD36, proA^{+}B^{+},
lacI^{q}, lacZ, M15).
Las cepas de levaduras utilizadas pertenecen a
las levaduras que brotan y, más concretamente, a las levaduras del
género Kluyveromyces. Se han utilizado, en particular, las
cepas K. lactis MW98-8C (a,
uraA, arg, lys, K^{+}, pKD1º) y K.
lactis CBS 293.91; se depositó una muestra de la cepa
MW98-8C el 16 de Septiembre de 1988 en el
Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) de Baarn (Países Bajos),
donde quedó registrada bajo el número CBS 579.88.
Se depositó cepa bacteriana (E. coli)
transformada con el plásmido pET-8c52K el 17 de
Abril de 1990 en la American Type Culture Collection bajo el número
ATCC 68306.
Las cepas de levaduras transformadas con los
plásmidos de expresión codificantes de las proteínas de la presente
invención son cultivadas en erlenmeyers o en fermentadores piloto de
21 (SETRIC, Francia) a 28ºC en medio rico (YPD: 1% de extracto de
levadura, 2% de Bactopeptona, 2% de glucosa; o YPL: 1% de extracto
de levadura, 2% de Bactopeptona, 2% de lactosa) con agitación
constante.
El plásmido pYG404 está descrito en la solicitud
de patente EP 361.991. Este plásmido lleva un fragmento de
restricción HindIII codificante del gen de la
prepro-SAH precedido de los 21 nucleótidos presentes
de forma natural inmediatamente secuencia arriba del ATG iniciador
de la traducción del gen PGK de S. cerevisiae. La
secuencia nucleotídica de este fragmento de restricción está
incluida en la secuencia ID Nº 2. El sitio MstII localizado
en la secuencia codificante, a tres residuos del codon que
especifica el final de la traducción es particularmente útil como
sitio de clonación de un péptido biológicamente activo que se desea
copular en fase de traducción al extremo C de la SAH. En un modo de
realización particular, es útil emplear péptidos cuya secuencia está
codificada por un fragmento de restricción
MstII-HindIII del tipo: 5'-CCTTAGGCTTA
[3xN]_{p} TAAGCTT-3'; la secuencia codificante del
péptido (residuo p) biológicamente activo es [3xN]_{p}. La
ligación de este fragmento con el fragmento de restricción
HindIII-MstII correspondiente a la totalidad del gen
codificante de la SAH, a excepción de los tres aminoácidos más
C-terminales (residuos de
leucina-glicina-leucina) genera un
fragmento de restricción HindIII que lleva un gen híbrido
codificante de una proteína quimérica de tipo
SAH-PÉPTIDO (Figura 1, panel A), inmediatamente
precedido de la región de exportación "prepro" de la SAH. En
otro modo de realización, el péptido biológicamente activo puede
estar presente más de una vez en la quimera.
En un modo de realización particular, las
técnicas combinadas de mutagénesis dirigida y de amplificación por
PCR permiten construir genes híbridos codificantes de una proteína
quimérica resultante de la copulación en la traducción entre un
péptido señal (y, por ejemplo, la región prepro de la SAH), una
secuencia que incluye el péptido biológicamente activo y la forma
madura de la SAH o una de sus variantes moleculares. Estos genes
híbridos están preferiblemente flanqueados en 5' del ATG iniciador
de la traducción y en 3' del codon de finalización de la traducción
por sitios de restricción HindIII y codifican para proteínas
quiméricas de tipo PÉPTIDO-SAH (Figura 1, panel B).
En un modo de realización aún más particular, el péptido
biológicamente activo puede estar presente más de una vez en la
quimera.
Las técnicas combinadas de mutagénesis dirigida y
de amplificación por PCR descritas en los ejemplos 1 y 2 permiten
construir genes híbridos codificantes de una proteína quimérica
resultante de la copulación en la traducción entre la forma madura
de la SAH o una de sus variantes moleculares y un péptido
biológicamente activo copulado en los extremos N- y
C-terminales de la SAH. Estos genes híbridos están
preferiblemente flanqueados en 5' del ATG iniciador de la traducción
y en 3' del codon de finalización de la traducción por sitios de
restricción HindIII y codifican para proteínas quiméricas de
tipo PÉPTIDO-SAH-PÉPTIDO (Figura 1,
panel C), inmediatamente precedidos de la región de exportación
"prepro" de la SAH. En un modo de realización aún más
particular, el péptido biológicamente activo puede estar presente
más de una vez en la quimera.
Las proteínas quiméricas de los ejemplos
precedentes pueden ser expresadas en levaduras a partir de
promotores funcionales, regulables o constitutivos, tales como, por
ejemplo, los presentes en los plásmidos pYG105 (promotor LAC4
de Kluyveromyces lactis), pYG106 (promotor PGK de
Saccharomyces cerevisiae) y pYG536 (promotor PHQ5 de
S. cerevisiae), o de promotores híbridos tales como los
descritos en la solicitud de patente EP 361.991. Los plásmidos
pYG105 y pYG106 son aquí particularmente útiles, ya que permiten la
expresión de los genes codificados por los fragmentos de restricción
HindIII, tales como los descritos en los ejemplos anteriores
y clonados en el sitio HindIII y en la orientación productiva
(definida como la orientación que sitúa la región "prepro" de
la albúmina proximalmente con respecto al promotor de la
transcripción), a partir de promotores funcionales en K.
lactis, regulables (pYG105) o constitutivos (pYG106). El
plásmido pYG105 corresponde al plásmido pKan707 descrito en la
solicitud de patente EP 361.991, en donde el sitio de restricción
HindIII único y localizado en el gen de resistencia a la
geneticina (G418) ha sido destruido por mutagénesis dirigida,
conservando una proteína inalterada (oligodexoxinucleótido
5'-GAAATGCATAAGCTCTTGCCATTCTCACCG-3').
El fragmento SalI-SacI codificante del gen URA3
del plásmido mutado fue luego substituido por un fragmento de
restricción SalI-SacI que llevaba un cassette de
expresión constituido por el promotor LAC4 de K.
lactis (en forma de fragmento SalI-HindIII) y por
el finalizador del gen PGK de S. cerevisiae (en forma
de fragmento HindIII-SacI). El plásmido pYG105 es
mitóticamente muy estable en levaduras Kluyveromyces y se da
un mapa de restricción del mismo en la Figura 3. Los plásmidos
pYG105 y pYG106 no difieren entre sí más que por la naturaleza del
promotor de la transcripción codificado por el fragmento
SalI-HindIII.
Se efectúa la transformación de levaduras
pertenecientes al género Kluyveromyces, y en particular las
cepas MW98-8C y CBS 293.91 de K. lactis, por
ejemplo, por la técnica de tratamiento de las células enteras con
acetato de litio [Ito H. y col., J. Bacteriol., 153 (1983),
163-168], adaptada como sigue. Se realiza el
crecimiento de las células a 28ºC en 50 ml de medio YPD con
agitación y hasta una densidad óptica a 600 nm (DO_{600})
comprendida entre 0,6 y 0,8; se recogen las células por
centrifugación a baja velocidad, se lavan en una solución estéril de
TE (Tris HCl 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM), se resuspenden en
3-4 ml de acetato de litio (0,1 M en TE) para
obtener una densidad celular de aproximadamente 2 x 10^{8}
células/ml y se incuban después a 30ºC durante 1 hora con agitación
moderada. Se incuban alícuotas de 0,1 ml de la suspensión resultante
de células competentes a 30ºC durante 1 hora en presencia de ADN y a
una concentración final del 35% de polietilenglicol (PEG_{4000},
Sigma). Después de un choque térmico de 5 minutos a 42ºC, se lavan
las células dos veces, se resuspenden en 0,2 ml de agua estéril y se
incuban durante 16 horas a 28ºC en 2 ml de medio YPD para permitir
la expresión fenotípica del gen de resistencia al G418 expresado
bajo el control del promotor P_{k1} (véase EP 361.991); se
extienden después 200 \mul de la suspensión celular en placas de
YPD selectivas (G418, 200 \mug/ml). Se ponen a incubar las placas
a 28ºC y los transformantes aparecen después de 2 a 3 días de
crecimiento celular.
Tras selección en medio rico suplementado con
G418, se estudian los clones recombinantes en cuanto a su capacidad
de segregar la forma madura de las proteínas quiméricas. Se incuban
algunos clones correspondientes a la cepa CBS 293.91 ó
MW98-8C transformada con los plásmidos de expresión
de las quimeras entre la SAH y la parte biológicamente activa en
medio YPD o YPL a 28ºC. Se recuperan los sobrenadantes celulares por
centrifugación cuando las células alcanzan la fase estacionaria de
crecimiento, se concentran eventualmente 10 veces por precipitación
durante 30 minutos a -20ºC a una concentración final del 60% de
etanol y se estudian luego tras electroforesis en gel de
SDS-PAGE al 8,5%, ya sea directamente por coloración
del gel con azul de Coomassie, ya sea después de inmunotransferencia
utilizando anticuerpos primarios dirigidos contra la parte
biológicamente activa o un suero policlonal de conejo dirigido
contra la SAH. Después de las experiencias de detección
inmunológica, se incuba primeramente el filtro de nitrocelulosa en
presencia de los anticuerpos primarios específicos, se lava varias
veces, se incuba en presencia de anticuerpos de cabra dirigidos
contra los anticuerpos primarios y se incuba luego en presencia de
un complejo de avidina-peroxidasa utilizando el
"kit ABC" distribuido por Vectastain (Biosys S.A., Compiègne,
Francia). Se revela luego la reacción inmunológica por adición de
tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobenzidina (Prolabo)
en presencia de agua oxigenada según las recomendaciones del
fabricante.
El plásmido pET-8c52K lleva un
fragmento de ADNc del vWF codificante de los residuos 445 a 733 del
vWF humano e incluye, pues, varios determinantes cruciales de la
interacción entre el vWF y las plaquetas por una parte y ciertos
elementos de la membrana basal y del tejido subendotelial por la
otra y, especialmente, los péptidos G10 y D5 antagonistas de la
interacción entre vWF y GP1b [Mori, H. y col., J. Biol. Chem.
263 (1988), 17901-17904]. Esta secuencia
peptídica es idéntica a la secuencia correspondiente descrita por
Titani y col. [Biochemistry, 25 (1986),
3171-3184]. La amplificación de estos determinantes
genéticos puede ser realizada a partir del plásmido
pET-8c52K, por ejemplo por la técnica de
amplificación por PCR, utilizando como cebadores
oligodesoxinucleótidos codificantes de los residuos contiguos
localizados de una y otra parte de la secuencia a amplificar. Los
fragmentos amplificados son luego clonados en vectores del tipo M13
para su verificación por secuenciación utilizando bien los cebadores
universales situados de una y otra parte del multisitio de
clonación, bien oligodesoxinucleótidos específicos de la región
amplificada del gen del vWF cuya secuencia de varios isomorfos es
conocida [Sadler, J.E. y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 82
(1985), 6394-6398; Verweij, C.L. y col., EMBO J.,
5 (1986), 1839-1847;
Shelton-Inloes B.B. y col., Biochemistry, 25
(1986), 3164-3171; Bonthron D. y col., Nucleic Acids
Res., 17 (1986), 7125-7127]. Así, la
amplificación por PCR del plásmido pET-8c52K con los
oligodesoxinucleótidos
5'-CCCGGGATCCCTTAGGCTTAACCTGTGAAGCCTGC-3'
(Sq1969, el sitio MstII está subrayado) y
5'-CCCGGGATCCAAGCTTAGAC-TTGTGCCATGTCG-3'
(Sq2029, el sitio HindIII está subrayado) genera un fragmento
de restricción MstII-HindIII que incluye los residuos
Thr470 a Val713 del vWF (SEC ID Nº 2). La ligación de este fragmento
con el fragmento de restricción HindIII-MstII
correspondiente a la totalidad del gen codificante de la SAH a
excepción de los tres aminoácidos más C-terminales
(véase la SEC ID Nº 1) genera un fragmento de restricción
HindIII que lleva un gen híbrido codificante de una proteína
quimérica de tipo SAH-PÉPTIDO (Figura 1, panel A),
inmediatamente precedido de la región de exportación "prepro"
de la SAH. Este fragmento de restricción es clonado en la
orientación productiva y en el sitio HindIII del plásmido
pYG105, lo que genera el plásmido de expresión pYG1248
(SAH-vWF470-713).
En otro modo de realización, el sitio de ligación
del vWF es un péptido que incluye los residuos Thr470 a Asp498 del
vWF maduro. Esta secuencia incluye el péptido G10
(Cys474-Pro488) descrito por Mori y col. [J. Biol.
Chem., 263 (1988), 17901-17904] y capaz de
antagonizar la interacción del vWF humano con la GP1b de las
plaquetas humanas. La secuencia correspondiente al péptido G10 es
primeramente incluida en un fragmento de restricción
MstII-HindIII (Figura 4, panel B), por ejemplo por
amplificación por PCR del plásmido pET-8c52K con los
oligodesoxinucleótidos Sq1969 y
5'-CCCGGGATCCAAGCTTAGTCC-TCCACATACAG-3'
(Sq1970, el sitio HindIII está subrayado), lo que genera un
fragmento de restricción MstII-HindIII que incluye el
péptido G10 y cuya secuencia es:
5'-CCTTAGGCTTAACCTGTGAAGCCTGCCAGGAGCCGGGAGGCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATGCCCCGG
TGAGCCCCACCACTCTGTATGTGGAGGACTAAGCTT-3' (la secuencia codificante del péptido G10 está en negrilla). La ligación de este fragmento con el fragmento de restricción HindIII-MstII correspondiente a la totalidad del gen codificante de la SAH a excepción de los tres aminoácidos más C-terminales (véase la SEC ID Nº 1) genera un fragmento de restricción HindIII que lleva un gen híbrido codificante de una proteína quimérica de tipo SAH-PÉPTIDO (Figura 1, panel A), inmediatamente precedido de la región de exportación "prepro" de la SAH. Este fragmento de restricción es clonado en la orientación productiva en el sitio HindIII del plásmido pYG105, lo que genera un plásmido de expresión pYG1214.
TGAGCCCCACCACTCTGTATGTGGAGGACTAAGCTT-3' (la secuencia codificante del péptido G10 está en negrilla). La ligación de este fragmento con el fragmento de restricción HindIII-MstII correspondiente a la totalidad del gen codificante de la SAH a excepción de los tres aminoácidos más C-terminales (véase la SEC ID Nº 1) genera un fragmento de restricción HindIII que lleva un gen híbrido codificante de una proteína quimérica de tipo SAH-PÉPTIDO (Figura 1, panel A), inmediatamente precedido de la región de exportación "prepro" de la SAH. Este fragmento de restricción es clonado en la orientación productiva en el sitio HindIII del plásmido pYG105, lo que genera un plásmido de expresión pYG1214.
En otro modo de realización, se conoce el sitio
de unión del vWF a la GP1b directamente con ayuda de
oligodesoxinucleótidos sintéticos, y por ejemplo los
oligodesoxinucleótidos
5'-TTAGGCCTCTGTGACCTTGCCCC
TGAAGCCCCTCCTCCTACTCTGCCCCCCTAAGCTTA-3' y 5'-GATCTAAGCTTAGGGGGGCAGAGTAGGA
GGAGGGGCTTCAGGGGCAAGGTCACAGAGGCC-3'. Estos oligodesoxinucleótidos forman al aparearse un fragmento de restricción MstII-BglII que incluye el fragmento MstII-HindIII (Figura 4, panel C), correspondiente al péptido D5 definido por los residuos Leu694 a Pro708 del vWF. La ligación del fragmento MstII-HindIII con el fragmento de restricción HindIII-MstII correspondiente a la totalidad del gen codificante de la SAH, a excepción de los tres aminoácidos más C-terminales (véase la SEC ID Nº 1), genera un fragmento de restricción HindIII que lleva un gen híbrido codificante de una proteína quimérica de tipo SAH-PÉPTIDO (Figura 1, panel A), inmediatamente precedido de la región de exportación "prepro" de la SAH. Este fragmento de restricción es clonado en la orientación productiva en el sitio HindIII del plásmido pYG105, lo que genera el plásmido de expresión pYG1206.
TGAAGCCCCTCCTCCTACTCTGCCCCCCTAAGCTTA-3' y 5'-GATCTAAGCTTAGGGGGGCAGAGTAGGA
GGAGGGGCTTCAGGGGCAAGGTCACAGAGGCC-3'. Estos oligodesoxinucleótidos forman al aparearse un fragmento de restricción MstII-BglII que incluye el fragmento MstII-HindIII (Figura 4, panel C), correspondiente al péptido D5 definido por los residuos Leu694 a Pro708 del vWF. La ligación del fragmento MstII-HindIII con el fragmento de restricción HindIII-MstII correspondiente a la totalidad del gen codificante de la SAH, a excepción de los tres aminoácidos más C-terminales (véase la SEC ID Nº 1), genera un fragmento de restricción HindIII que lleva un gen híbrido codificante de una proteína quimérica de tipo SAH-PÉPTIDO (Figura 1, panel A), inmediatamente precedido de la región de exportación "prepro" de la SAH. Este fragmento de restricción es clonado en la orientación productiva en el sitio HindIII del plásmido pYG105, lo que genera el plásmido de expresión pYG1206.
Se suprimen variantes útiles del plásmido
pET-8c52K por mutagénesis dirigida entre los
péptidos G10 y D5, por ejemplo de los sitos de fijación al colágeno
y/o a la heparina y/o a la botrocetina y/o a los sulfátidos y/o a la
ristocetina. Un ejemplo es el plásmido pMMB9 suprimido por
mutagénesis dirigida entre los residuos Cys509 e Ile662. La
amplificación por PCR de este plásmido con los
oligodesoxinucleótidos Sq1969 y Sq2029 genera un fragmento de
restricción MstII-HindIII (Figura 4, panel D) que
incluye los residuos Thr470 a Tyr508 y Arg663 a Val713 y, en
particular, los péptidos G10 y D5 del vWF y con deleción, en
particular, de su sitio de fijación al colágeno localizado entre los
residuos Glu542 y Met622 [Roth G.J. y col., Biochemistry 25
(1986), 8357-8361]. La ligación de este fragmento
con el fragmento de restricción HindIII-MstII
correspondiente a la totalidad del gen codificante de la SAH, a
excepción de los tres aminoácidos más C-terminales
(véase la SEC ID Nº 1), genera un fragmento de restricción
HindIII que lleva un gen híbrido codificante de una proteína
quimérica de tipo SAH-PÉPTIDO (Figura 1, panel A),
inmediatamente precedido de la región de exportación "prepro"
de la SAH. Este fragmento de restricción es clonado en la
orientación productiva en el sitio HindIII del plásmido
pYG105, lo que genera el plásmido de expresión pYG1223.
En otros modos de realización, la utilización de
las técnicas combinadas de mutagénesis dirigida y de amplificación
por PCR permite generar a voluntad variantes del fragmento de
restricción MstII-HindIII del panel A de la Figura 4,
pero con deleción de uno o de varios sitios de fijación a los
sulfáticos y/o a la botrocetina y/o a la heparina y/o al colágeno,
y/o substituidas por cualquier residuo implicado en la emergencia de
patologías de tipo IIB asociada al vWF.
En otras variantes útiles del plásmido
pET-8c52K, se introducen mutaciones, por ejemplo por
mutagénesis dirigida, para reemplazar o suprimir todo o parte del
conjunto de las cisteínas presentes en las posiciones 471, 474, 509
y 695 del vWF humano. Son ejemplos particulares los plásmidos p5E y
p7E, donde las cisteínas presentes en las posiciones 471 y 474 por
una parte y en las posiciones 471, 474, 509 y 695 por otra han sido
respectivamente reemplazadas por residuos de glicina. La
amplificación por PCR de estos plásmidos con los
oligodesoxinucleótidos Sq2149
(5'-CCCGGGATCCCTTAGGCTTAACCGGTGAAGCCGGC-3',
el sitio MstII está subrayado) y Sq2029 permite generar
fragmentos de restricción MstII-HindIII que incluyen
los residuos Thr470 a Val713 del vWF natural, a excepción de que al
menos los residuos de cisteína de las posiciones 471 y 474 hayan
sido mutados a residuos de glicina. La ligación de estos fragmentos
con el fragmento de restricción HindIII-MstII
correspondiente a la totalidad del gen codificante de la SAH, a
excepción de los tres aminoácidos más C-terminales
(véase la SEC ID Nº 1), genera un fragmento de restricción
HindIII que lleva un gen híbrido codificante de una proteína
quimérica de tipo SAH-PÉPTIDO (Figura 1, panel A),
inmediatamente precedido de la región de exportación "prepro"
de la SAH. Estos fragmentos de restricción son clonados en la
orientación productiva en el sitio HindIII del plásmido
pYG105, lo que genera los plásmidos de expresión pYG1283 (quimera
SAH-vWF470-713, C471G, C474G) y
pYG1279 (quimera SAH-vWF470-713,
C471G, C474G, C509G, C695G).
Otras mutaciones particularmente útiles
conciernen a al menos un residuo implicado en patologías del tipo
IIB asociadas al vWF (aumento de la afinidad intrínseca del vWF para
la GP1b), como los residuos Arg543, Arg545, Trp550, Val551, Val553,
Pro574 o Arg578, por ejemplo. Las técnicas de recombinación genética
in vitro permiten también introducir a voluntad uno o más
residuos suplementarios en la secuencia del vWF y, por ejemplo, una
metionina supranumeraria entre las posiciones Asp539 y Glu542.
En un modo de realización particular, los sitios
de unión del vWF a los componentes del tejido subendotelial, y por
ejemplo del colágeno, se generan por amplificación por PCR del
plásmido pET-8c52K, por ejemplo con los
oligodesoxinucleótidos Sq2258
(5'-GGATCCTTAGGGCTGTGCAGCAGGCTACTGGACCTGGTC-3',
el sitio MstII está subrayado) y Sq2259
(5'-GAATTCAAGCTTAACAGAGGTAGCTAACGATCTCGTCCC-3',
el sitio HindIII está subrayado), lo que genera un fragmento
de restricción MstII-HindIII codificante de los
residuos Cys509 a Cys695 del vWF natural. También se generan
variantes moleculares de deleción o modificadas que llevan cualquier
combinación deseable entre los sitios de fijación del vWF a los
sulfáticos y/o a la botrocetina y/o a la heparina y/o al colágeno
y/o cualquier residuo responsable de una modificación de la afinidad
del vWF por la GP1b (patologías de tipo II asociadas al vWF). En
otro modo de realización, el dominio capaz de fijarse al colágeno
puede también provenir del fragmento del vWF comprendido entre los
residuos 911 y 1114 y descrito por Pareti y col. [J. Biol. Chem.
(1987), 262: 13835-13841]. La ligación de
estos fragmentos con el fragmento de restricción
HindIII-MstII correspondiente a la totalidad del gen
codificante de la SAN, a excepción de los tres aminoácidos más
C-terminales (véase la SEC ID Nº 1), genera
fragmentos de restricción HindIII que llevan un gen híbrido
codificante de una proteína quimérica de tipo
SAH-PÉPTIDO (Figura 1, panel A), inmediatamente
precedido de la región de exportación "prepro" de la SAH. Estos
fragmentos de restricción son clonados en la orientación productiva
en el sitio HindIII del plásmido pYG105, lo que genera
plásmidos de expresión correspondientes y, por ejemplo, el plásmido
pYG1277 (SAH-vWF509-695).
Las quimeras presentes en los sobrenadantes de
cultivo correspondientes a la cepa CBS 293.91 transformada, por
ejemplo, por los plásmidos de expresión según los ejemplos E.7.1 y
E.7.2, son caracterizadas en un primer tiempo con ayuda de
anticuerpos específicos de la parte SAH y de la parte vWF. Los
resultados de las Figuras 5 a 7 demuestran que la levadura K.
lactis es capaz de segregar proteínas quiméricas entre la SAH y
un fragmento del vWF y que estas quimeras son inmunológicamente
reactivas. Puede ser también deseable purificar algunas de estas
quimeras. Se centrifuga entonces el cultivo (10.000 g, 30 min.), se
pasa el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 mm
(Millipore)y se concentra después por ultracentrifugación
(Amicon) utilizando una membrana cuyo umbral de discriminación se
sitúa a 30 kDa. El concentrado obtenido es entonces dializado contra
una solución de Tris HCl (50 mM, pH 8) y luego purificado en
columna. Por ejemplo, el concentrado correspondiente al sobrenadante
de cultivo de la cepa CBS 293.91 transformada por el plásmido
pYG1206 es purificado por cromatografía de afinidad en
Bleu-Trisacryl (IBF). También se puede emplear una
purificación por cromatografía de intercambio de iones. Por ejemplo,
en el caos de la quimera
SAH-vWF470-713, se dializa el
concentrado obtenido tras la ultrafiltración contra una solución de
Tris HCl (50 mM, pH 8) y se deposita después por fracciones de 20 ml
sobre una columna (5 ml) intercambiadora de cationes (S Fast Flow,
Pharmacia) equilibrada en el mismo tampón. Se lava entonces la
columna varias veces con la solución de Tris HCl (50 mM, pH 8) y se
eluye luego la proteína quimérica de la columna mediante un
gradiente (0 a 1 M) de NaCl. Se juntan entonces las fracciones que
contienen la proteína quimérica y se dializan contra una solución de
Tris HCl 50 mM (pH 8) y se redepositan después sobre una columna S
Fast Flow. Después de eluir de la columna, se juntan las fracciones
que contienen la proteína, se dializan contra agua y se liofilizan
antes de la caracterización: por ejemplo, la secuenciación (Applied
Biosystem) de la proteína
[SAH-vWF470-704 C471G, C474G]
segregada por la levadura CBS 293.91 da la secuencia
N-terminal esperada de la SAH
(Asp-Ala-His...), lo que demuestra
una maduración correcta de la quimera inmediatamente en el extremo C
del doblete de residuos Arg-Arg de la región
"pro" de la SAH (SEC ID Nº 1). El carácter esencialmente
monomérico de las proteínas quiméricas entre SAH y vWF es también
confirmado por su perfil de elución en columna TSK 3000 [Toyo Soda
Company, equilibrada con una solución de cacodilato (pH 7) que
contiene 0,2 M de Na_{2}SO_{4}]: por ejemplo, la quimera
[SAH-vWF 470-704 C471G, C474G] se
comporta en estas condiciones como una proteína de peso molecular
aparente de 95 kDa, demostrando así su carácter monomérico.
Se puede obtener un fragmento correspondiente al
fragmento amino-terminal de la urokinasa (ATF:
dominio de tipo EGF + dominio kringle) a partir del ARN mensajero
correspondiente de las células de determinados carcinomas humanos,
por ejemplo utilizando el kit de RT-PCR distribuido
por Pharmacia. Se da un fragmento de restricción
MstII-HindIII que incluye el ATF de la urokinasa
humana en la SEC ID Nº 3. La ligación del fragmento
HindIII-MstII del plásmido pYG404 con este fragmento
MstII-HindIII permite generar el fragmento
HindIII del plásmido pYG1341, que codifica para una proteína
quimérica en la cual la molécula de SAH está genéticamente copulada
al ATF (SAH-UK1\rightarrow135). De forma similar,
el plásmido pYG1340 contiene un fragmento HindIII codificante
de una quimera compuesta por la SAH inmediatamente seguido de los 46
primeros residuos de la urokinasa humana
(SAH-UK1\rightarrow46, véase la SEC ID Nº 3). La
clonación en la orientación productiva del fragmento de restricción
HindIII del plásmido pYG1340
(SAH-UK1\rightarrow46) en el sitio HindIII
de los plásmidos pYG105 (LAC4) y pYG106 (PGK) genera
los plásmidos de expresión pYG1343 y pYG1342, respectivamente. De
forma similar, la clonación en la orientación productiva del
fragmento de restricción HindIII del plásmido pYG1341
(SAH-UK1\rightarrow135) en el sitio HindIII
de los plásmidos pYG105 (LAC4) y pYG106 (PGK) genera
los plásmidos de expresión pYG1345 y pYG1344, respectivamente.
Tras selección en medio rico suplementado con
G418, se estudian los clones recombinantes en cuanto a su capacidad
para segregar la forma madura de las proteínas quiméricas
SAH-UK. Se incuban algunos clones correspondientes a
la cepa K. lactis CBS 293.91 transformada con los plásmidos
de expresión según el ejemplo E.9.1 en medio completo selectivo a
28ºC. Se estudian entonces los sobrenadantes celulares tras
electroforesis en gel de acrilamida al 8,5%, ya sea directamente por
coloración del gel con azul de Coomassie, ya sea tras
inmunotransferencia utilizando como anticuerpos primarios un suero
policlonal de conejo dirigido contra la albúmina humana o contra la
urokinasa humana. Los resultados de la Figura 9 demuestran que las
proteínas híbridas SAH-UK1\rightarrow46 y
SAH-UK1\rightarrow135 son particularmente bien
segregadas por la levadura Kluyveromyces.
Tras centrifugación de un cultivo de la cepa CBS
293.91 transformada con los plásmidos de expresión según el ejemplo
E.8.1, se pasa el sobrenadante del cultivo a través de un filtro de
0,22 mm (Millipore) y se concentra después por ultracentrifugación
(Amicon) utilizando una membrana cuyo umbral de discriminación se
sitúa a 30 kDa. Se ajusta entonces el concentrado obtenido a Tris
HCl 50 mM a partir de una solución stock de Tris HCl 1 M (pH 7) y se
deposita luego por fracciones de 20 ml sobre una columna (3 ml)
intercambiadora de aniones (D-Zephyr, Sepracor)
equilibrada en el mismo tampón. Se eluye entonces la proteína
quimérica (SAH-UK1\rightarrow46 o
SAH-UK1\rightarrow135) de la columna mediante un
gradiente (0 a 1 M) de NaCl. Se juntan luego las fracciones que
contienen la proteína quimérica, se dializan contra una solución de
Tris HCl 50 mM (pH 6) y se vuelven a depositar sobre una columna
D-Zephyr equilibrada en el mismo tampón. Tras la
elución de la columna, se reúnen las fracciones que contienen la
proteína, se dializan contra agua y se liofilizan antes de la
caracterización de su actividad biológica y especialmente en cuanto
a su aptitud para desplazar la urokinasa de su receptor celular.
Se genera un fragmento de restricción
MstII-HindIII que incluye la forma madura del
G-CSF humano, por ejemplo, según la estrategia
siguiente: se obtiene primeramente un fragmento de restricción
KpnI-HindIII por la técnica de amplificación
enzimática por PCR utilizando los oligodesoxinucleótidos Sq2291
(5'-CAAGGATCCAAGCTTCAGGGC
TGCGCAAGGTGGCGTAG-3', el sitio HindIII está subrayado) y Sq2292 (5'-CGGGGTACCTTAGGCTTAACCCCC
CTGGGCCCTGCCAGC-3', el sitio KpnI está subrayado) como cebadores sobre el plásmido BBG13 que sirve de matriz. El plásmido BBG13 lleva el gen codificante de la forma B (174 aminoácidos) del G-CSF maduro humano, obtenido de British Bio-technology Limited, Oxford, Inglaterra. El producto de amplificación enzimática de aproximadamente 550 nucleótidos es digerido luego por las enzimas de restricción KpnI y HindIII y clonado en el vector pUC19 cortado por las mismas enzimas, lo que genera el plásmido recombinante pYG1255. Este plásmido es la fuente de un fragmento de restricción MstII-HindIII que permite fusionar el G-CSF inmediatamente secuencia debajo de la SAH (quimera SAH-G-CSF) y cuya secuencia nucleotídica se da en la SEC ID Nº 4.
TGCGCAAGGTGGCGTAG-3', el sitio HindIII está subrayado) y Sq2292 (5'-CGGGGTACCTTAGGCTTAACCCCC
CTGGGCCCTGCCAGC-3', el sitio KpnI está subrayado) como cebadores sobre el plásmido BBG13 que sirve de matriz. El plásmido BBG13 lleva el gen codificante de la forma B (174 aminoácidos) del G-CSF maduro humano, obtenido de British Bio-technology Limited, Oxford, Inglaterra. El producto de amplificación enzimática de aproximadamente 550 nucleótidos es digerido luego por las enzimas de restricción KpnI y HindIII y clonado en el vector pUC19 cortado por las mismas enzimas, lo que genera el plásmido recombinante pYG1255. Este plásmido es la fuente de un fragmento de restricción MstII-HindIII que permite fusionar el G-CSF inmediatamente secuencia debajo de la SAH (quimera SAH-G-CSF) y cuya secuencia nucleotídica se da en la SEC ID Nº 4.
Puede ser también deseable insertar un ligante
peptídico entre la parte SAH y G-CSF, por ejemplo
para permitir una mejor presentación funcional de la parte
traductora. Se genera un fragmento de restricción
MstII-HindIII, por ejemplo, por substitución del
fragmento MstII-ApaI del plásmido pYG1255 por los
oligodesoxinucleótidos Sq2742
(5'-TTAGGCTTAGGTGGTGGCGGTACCCCCCTGGGCC-3',
los codones codificantes de los residuos de glicina de este ligante
particular están subrayados) y Sq2741
(5'-CAGGGGGGTACCGCCACCACCTAAGCC-3'),
que forman al aparearse un fragmento MstII-ApaI. El
plásmido así generado lleva, pues, un fragmento de restricción
MstII-HindIII, cuya secuencia es idéntica a la de la
SEC ID Nº 4, a excepción del fragmento MstII-ApaI.
La ligación del fragmento
HindIII-MstII del plásmido pYG404 con el fragmento
MstII-HindIII del plásmido pYG1255 permite generar el
fragmento HindIII del plásmido pYG1259 que codifica para una
proteína quimérica en la que la forma B del G-CSF
maduro se sitúa por copulación genética en fase de traducción en el
extremo C de la molécula de SAH
(SAH-G-CSF).
Se puede generar también un fragmento de
restricción HindIII idéntico, a excepción del fragmento
MstII-ApaI, que codifica para una proteína quimérica
en la que la forma B del G-CSF maduro está situada
por copulación genética en fase de traducción en el extremo C de la
molécula de SAH de un ligante peptídico particular. Por ejemplo,
este ligante está constituido por 4 residuos de glicina en el
fragmento HindIII del plásmido pYG1336 (quimera
SAH-Gly_{4}-G-CSF).
Se clona el fragmento de restricción
HindIII del plásmido pYG1259 en la orientación productiva y
en el sitio de restricción HindIII del plásmido de expresión
pYG105, lo que genera el plásmido de expresión pYG1266
(SAH-G-CSF). En otro ejemplo, la
clonación del fragmento de restricción HindIII del plásmido
pYG1259 en la orientación productiva y en el sitio HindIII
del plásmido pYG106 genera el plásmido pYG1267. Los plásmidos
pYG1266 y pYG1267 son isogénicos entre sí, a excepción del fragmento
de restricción SalI-HindIII codificante del promotor
LAC4 de K. lactis (plásmido pYG1266) o del promotor
PGK de S. cerevisiae (plásmido pYG1267).
En otro ejemplo, la clonación en la orientación
productiva del fragmento de restricción HindIII del plásmido
pYG1336 (quimera
SAH-Gly_{4}-G-CSF)
en el sitio HindIII de los plásmidos pYG105 (LAC4) y
pYG106 (PGK) genera los plásmidos de expresión pYG1351 y
pYG1352, respectivamente.
En un modo de realización particular, las
técnicas combinadas de mutagénesis dirigida y de amplificación por
PCR permiten construir genes híbridos codificantes de una proteína
quimérica resultante de la copulación en la traducción entre un
péptido señal (y, por ejemplo, la región prepro de la SAH), una
secuencia que incluye un gen que tiene una actividad
G-CSF y la forma madura de la SAH o una de sus
variantes moleculares (véase la quimera del panel B, Figura 1).
Estos genes híbridos están preferiblemente flanqueados en 5' del ATG
iniciador de la traducción y en 3' del codon de finalización de la
traducción por sitios de restricción HindIII. Por ejemplo, el
oligodesoxinucleótido Sq2369
[5'-GTTCTACGCCACCTTGCGCAGCCCGGTGGAGGCGGTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGG-
3', los residuos subrayados (eventuales) corresponden en esta quimera particular a un ligante peptídico compuesto por 4 residuos de glicina] permite por mutagénesis dirigida poner en fase de traducción la forma madura del G-CSF humano del plásmido BBG13 inmediatamente secuencia arriba de la forma madura de la SAH, lo que genera el plásmido intermediario A. De forma similar, la utilización del oligodesoxinucleótido Sq2338 [5'-CAGGGAGCTG
GCAGGGCCCAGGGGGGTTCGACGAAACACACCCCTGGAATAAGCCGAGCT-3' (hebra no codificante), los
nucleótidos complementarios a los nucleótidos codificantes de los primeros residuos N-terminales de la forma madura del G-CSF humano están subrayados] permite por mutagénesis dirigida copular en fase de traducción de lectura la región prepro de la SAH inmediatamente secuencia arriba de la forma madura del G-CSF humano, lo que genera el plásmido intermediario B. Se genera luego un fragmento HindIII codificante de una proteína quimérica de tipo PÉPTIDO-SAH (véase la Figura 1, panel B) asociando el fragmento HindIII-SstI del plásmido B (unión de la región prepro de la SAH + fragmento N-terminal del G-CSF maduro) con el fragmento SstI-HindIII del plásmido A [unión G-CSF maduro-(glicina)_{x4}-SAH madura]. El plásmido pYG1301 contiene este fragmento de restricción HindIII particular codificante de la quimera G-CSF-Gly_{4}-SAH fusionada inmediatamente secuencia debajo de la región prepro de la SAH (SEC ID Nº 5). La clonación de este fragmento de restricción HindIII en la orientación productiva y en el sitio HindIII de los plásmidos pYG105 (LAC4) y pYG106 (PGK) genera los plásmidos de expresión pYG1302 y pYG1303, respectivamente.
[5'-GTTCTACGCCACCTTGCGCAGCCCGGTGGAGGCGGTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGG-
3', los residuos subrayados (eventuales) corresponden en esta quimera particular a un ligante peptídico compuesto por 4 residuos de glicina] permite por mutagénesis dirigida poner en fase de traducción la forma madura del G-CSF humano del plásmido BBG13 inmediatamente secuencia arriba de la forma madura de la SAH, lo que genera el plásmido intermediario A. De forma similar, la utilización del oligodesoxinucleótido Sq2338 [5'-CAGGGAGCTG
GCAGGGCCCAGGGGGGTTCGACGAAACACACCCCTGGAATAAGCCGAGCT-3' (hebra no codificante), los
nucleótidos complementarios a los nucleótidos codificantes de los primeros residuos N-terminales de la forma madura del G-CSF humano están subrayados] permite por mutagénesis dirigida copular en fase de traducción de lectura la región prepro de la SAH inmediatamente secuencia arriba de la forma madura del G-CSF humano, lo que genera el plásmido intermediario B. Se genera luego un fragmento HindIII codificante de una proteína quimérica de tipo PÉPTIDO-SAH (véase la Figura 1, panel B) asociando el fragmento HindIII-SstI del plásmido B (unión de la región prepro de la SAH + fragmento N-terminal del G-CSF maduro) con el fragmento SstI-HindIII del plásmido A [unión G-CSF maduro-(glicina)_{x4}-SAH madura]. El plásmido pYG1301 contiene este fragmento de restricción HindIII particular codificante de la quimera G-CSF-Gly_{4}-SAH fusionada inmediatamente secuencia debajo de la región prepro de la SAH (SEC ID Nº 5). La clonación de este fragmento de restricción HindIII en la orientación productiva y en el sitio HindIII de los plásmidos pYG105 (LAC4) y pYG106 (PGK) genera los plásmidos de expresión pYG1302 y pYG1303, respectivamente.
Tras selección en medio rico suplementado en
G418, se estudian los clones recombinantes en cuanto a su capacidad
para segregar la forma madura de las proteínas quiméricas entre SAH
y G-CSF. Se incuban algunos clones correspondientes
a la cepa K. lactis CBS 293.91 transformada con los plásmidos
pYG1266 o pYG1267 (SAH-G-CSF),
pYG1302 o pYG1303
(G-CSF-Gly_{4}-SAH)
o también pYG1351 o pYG1352
(SAH-Gly_{4}-G-CSF)
en medio líquido completo selectivo a 28ºC. Se estudian entonces los
sobrenadantes celulares tras electroforesis en gel de acrilamida al
8,5%, ya sea directamente por coloración del gel con azul de
Coomassie, ya sea después de inmunotransferencia usando como
anticuerpos primarios anticuerpos policlonales de conejo dirigidos
contra el G-CSF humano o un suero policlonal de
conejo dirigido contra la albúmina humana. Los resultados de la
Figura 12 demuestran que la proteína híbrida
SAH-G-CSF es reconocida a la vez por
anticuerpos dirigidos contra la albúmina humana (panel C) y contra
el G-CSF humano (panel B). Los resultados de la
Figura 13 indican que la quimera
SAH-Gly_{4}-G-CSF
(banda 3) es particularmente bien segregada por la levadura
Kluyveromyces, posiblemente porque la presencia del ligante
peptídico entre la parte SAH y la parte G-CSF es más
favorable a un replegamiento independiente de estas 2 partes en el
momento del tránsito de la quimera en la vía secretora. Además, la
fusión N-terminal
(G-CSF-Gly_{4}-SAH)
es también segregada por la levadura Kluyveromyces (Figura
13, banda 1).
Después de centrifugar un cultivo de la cepa CBS
293.91 transformada por los plásmidos de expresión según el ejemplo
E.9.1., se pasa el sobrenadante de cultivo a través de un filtro de
0,22 mm (Millipore) y se concentra luego por ultrafiltración
(Amicon) utilizando una membrana cuyo umbral de discriminación se
sitúa a 30 kDa. Se ajusta entonces el concentrado obtenido a Tris
HCl 50 mM a partir de una solución stock de Tris HCl 1 M (pH 6) y se
deposita después por fracciones de 20 ml sobre una columna (5 ml)
intercambiadora de iones (Q Fast Flow, Pharmacia) equilibrada en el
mismo tampón. Se eluye entonces la proteína quimérica de la columna
mediante un gradiente (0 a 1 M) de NaCl. Se reúnen después las
fracciones que contienen la proteína quimérica y se dializan contra
una solución de Tris HCl 50 mM (pH 6) y se depositan de nuevo sobre
una columna Q Fast Flow (1 ml) equilibrada en el mismo tampón. Tras
la elución de la columna, se juntan las fracciones que contienen la
proteína, se dializan contra agua y se liofilizan antes de la
caracterización: por ejemplo, la secuenciación (Applied Biosystem)
de la proteína SAH-G-CSF segregada
por la levadura CBS 293.91 da la secuencia
N-terminal esperada de la SAH
(Asp-Ala-His...), lo que demuestra
una maduración correcta de la quimera inmediatamente en el extremo C
del doblete de residuos Arg-Arg de la región
"pro" de la SAH (SEC ID Nº 1).
Se puede construir un fragmento Fv' por técnicas
de ingeniería genética que codifica para los fragmentos variables de
las cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina (Ig), unidos
entre sí por un péptido ligante [Bird y col., Science (1988),
242: 423; Huston y col. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci.
85: 5879]. Esquemáticamente, las regiones variables
(aproximadamente 120 residuos) de las cadenas pesadas y ligeras de
una Ig dada son clonadas a partir del ARN mensajero del hibridoma
correspondiente, por ejemplo utilizando el kit de
RT-PCR distribuido por Pharmacia (Mouse ScFv
Module). En una segunda etapa, se copulan genéticamente las regiones
variables por ingeniería genética por medio de un péptido de unión
sintético y, por ejemplo, el ligante (GGGGS)_{x3}. En la
SEC ID Nº 6, se da un fragmento de restricción
MstII-HindIII que incluye el fragmento Fv' de una
inmunoglobulina segregada por un hibridoma murino. La ligación del
fragmento HindIII-MstII del plásmido pYG404 con este
fragmento MstII-HindIII permite generar el fragmento
HindIII del plásmido pYG1382, que codifica para una proteína
quimérica en la cual la molécula de SAH está genéticamente copulada
al fragmento Fv' de la SEC ID Nº 6 (quimera
SAH-Fv'). La clonación en la orientación productiva
del fragmento de restricción HindIII del plásmido pYG1382 en
el sitio HindIII de los plásmidos pYG105 (LAC4) y
pYG106 (PGK) genera los plásmidos de expresión pYG1383 y
pYG1384, respectivamente.
Tras selección en medio rico suplementado en
G418, se estudian los clones recombinantes en cuanto a su capacidad
para segregar la forma madura de la proteína quimérica
SAH-Fv'. Se incuban algunos clones correspondientes
a la cepa K. lactis CBS 293.91 transformada con los plásmidos
pYG1383 o pYG13484 (SAH-Fv') en medio líquido
completo selectivo a 28ºC. Se estudian entonces los sobrenadantes
celulares tras electroforesis en gel de acrilamida al 8,5%, ya sea
directamente por coloración del gel con azul de Coomassie, ya sea
después de inmunotransferencia usando como anticuerpos primarios un
suero policlonal de conejo dirigido contra la albúmina humana o
incubándolo directamente con anticuerpos biotinilados y dirigidos
contra las inmunoglobulinas de origen murino. Los resultados de la
Figura 15 demuestran que la proteína híbrida SAH-Fv'
es reconocida a la vez por anticuerpos dirigidos contra la albúmina
humana (panel C) y por anticuerpos de cabra biotinilados
inmunológicamente reactivos contra inmunoglobulinas de ratón (panel
B).
Se determina la actividad antagonista de los
productos por medición de la inhibición
dosis-dependiente de la aglutinación de las
plaquetas humanas fijadas con paraformaldehído según el método
descrito por Prior y col. [Bio/
Technology (1992), 10: 66]. Se realizan las mediciones en un agregómetro (PAP-4, Bio Data, Horsham, PA, EE.UU.) que registra las variaciones en el tiempo de la transmisión óptica con agitación a 37ºC en presencia de vWF, de botrocetina (8,2 mg/ml) y del producto de ensayo a diferentes diluciones (concentraciones). Para cada medición, se preincuban 400 ml (8x10^{7} plaquetas) de una suspensión de plaquetas humanas estabilizadas con paraformaldehído al 0,5%, resuspendidas luego en [NaCl (137 mM), MgCl_{2} (1 mM), NaH_{2}PO_{4} (0,36 mM), NaHCO_{3} (10 mM), KCl (2,7 mM), glucosa (5,6 mM), SAH (3,5 mg/ml), tampón HEPES (10 mM, pH 7,35)] a 37ºC en la cubeta cilíndrica (8,75 x 50 mm, Wellcome Distriwell, 159 rue Nationale, París) del agregómetro durante 4 min. y luego se añaden 30 ml de la solución del producto de ensayo a diferentes diluciones en vehículo de formulación apirógeno [manitol (50 g/l), ácido cítrico (192 mg/ml), monoclorhidrato de L-lisina (182,6 mg/ml), NaCl (88 mg/l), pH ajustado a 3,5 por adición de NaOH (1M)] o de vehículo de formulación únicamente (ensayo control). Se incuba entonces la suspensión resultante durante 1 min. a 37ºC y se añaden 12,5 ml de vWF humano [American Bioproducts, Parsippany, NJ, EE.UU.; 11% de actividad von Willebrand medida según las recomendaciones de utilización del PAP-4 (Platelet Aggregation Profiler®) con ayuda de plaquetas fijadas con formaldehído (2x10^{5} plaquetas/ml), de plasma humano que contiene de un 0 a un 100% de vWF y de ristocetina (10 mg/ml, véanse las pp. 36-45: vWF Program™)], que se incuba a 37ºC durante 1 min. antes de añadir 12,5 ml de la solución de botrocetina [purificada a partir de veneno liofilizado de Bothrops jararaca (Sigma), según el procedimiento descrito por Sugimoto y col., Biochemistry (1991), 266: 18172]. Se realiza entonces el registro de la lectura de la transmisión en función del tiempo durante 2 min. con agitación con ayuda de una barra imantada (Wellcome Distriwell) colocada en la cuba y bajo una agitación magnética de 1.100 rpm asegurada por el agregómetro. La variación media de la transmisión óptica (n^{3}5 para cada dilución) en el tiempo es, pues, una medida de la aglutinación plaquetaria debida a la presencia de vWF y de botrocetina, en ausencia o presencia de concentraciones variables del producto de ensayo. A partir de tales registros, se determina entonces el % de inhibición de la aglutinación plaquetaria debida a cada concentración de producto y se traza la recta que da el % de inhibición en función de la inversa de la dilución del producto a escala log-log. Se determina entonces la CI_{50} (o concentración de producto que provoca el 50% de inhibición de la aglutinación) sobre esta recta. La Tabla de la Figura 16 compara las CI_{50} de algunas otras quimeras SAH-vWF de la presente invención y demuestra que algunas de ellas son mejores antagonistas de la aglutinación plaquetaria que el producto RG12986 descrito por Prior y col. [Bio/Technology (1992), 10: 66] e incluido en los ensayos como valor patrón. Pruebas idénticas de la inhibición de la aglutinación de las plaquetas humanas en presencia de vWF de plasma de cerdo (Sigma) permiten además demostrar que algunos de los híbridos de la presente invención, y especialmente algunas variantes de tipo IIB, son muy buenos antagonistas de la aglutinación plaquetaria en ausencia de cofactores de tipo botrocetina. El antagonismo independiente de botrocetina de estas quimeras particulares puede ser también demostrado según el protocolo inicialmente descrito por Ware y col. [Proc. Natl. Acad. Sci. (1991), 88: 2946] por desplazamiento del anticuerpo monoclonal ^{125}I-LJ-IB1 (10 mg/ml), un inhibidor competitivo de la fijación del vWF sobre la GP1b plaquetaria [Handa M. y col. (1986), J. Biol. Chem., 261: 12579] después de 30 min. de incubación a 22ºC en presencia de plaquetas frescas (10^{8} plaquetas/ml).
Technology (1992), 10: 66]. Se realizan las mediciones en un agregómetro (PAP-4, Bio Data, Horsham, PA, EE.UU.) que registra las variaciones en el tiempo de la transmisión óptica con agitación a 37ºC en presencia de vWF, de botrocetina (8,2 mg/ml) y del producto de ensayo a diferentes diluciones (concentraciones). Para cada medición, se preincuban 400 ml (8x10^{7} plaquetas) de una suspensión de plaquetas humanas estabilizadas con paraformaldehído al 0,5%, resuspendidas luego en [NaCl (137 mM), MgCl_{2} (1 mM), NaH_{2}PO_{4} (0,36 mM), NaHCO_{3} (10 mM), KCl (2,7 mM), glucosa (5,6 mM), SAH (3,5 mg/ml), tampón HEPES (10 mM, pH 7,35)] a 37ºC en la cubeta cilíndrica (8,75 x 50 mm, Wellcome Distriwell, 159 rue Nationale, París) del agregómetro durante 4 min. y luego se añaden 30 ml de la solución del producto de ensayo a diferentes diluciones en vehículo de formulación apirógeno [manitol (50 g/l), ácido cítrico (192 mg/ml), monoclorhidrato de L-lisina (182,6 mg/ml), NaCl (88 mg/l), pH ajustado a 3,5 por adición de NaOH (1M)] o de vehículo de formulación únicamente (ensayo control). Se incuba entonces la suspensión resultante durante 1 min. a 37ºC y se añaden 12,5 ml de vWF humano [American Bioproducts, Parsippany, NJ, EE.UU.; 11% de actividad von Willebrand medida según las recomendaciones de utilización del PAP-4 (Platelet Aggregation Profiler®) con ayuda de plaquetas fijadas con formaldehído (2x10^{5} plaquetas/ml), de plasma humano que contiene de un 0 a un 100% de vWF y de ristocetina (10 mg/ml, véanse las pp. 36-45: vWF Program™)], que se incuba a 37ºC durante 1 min. antes de añadir 12,5 ml de la solución de botrocetina [purificada a partir de veneno liofilizado de Bothrops jararaca (Sigma), según el procedimiento descrito por Sugimoto y col., Biochemistry (1991), 266: 18172]. Se realiza entonces el registro de la lectura de la transmisión en función del tiempo durante 2 min. con agitación con ayuda de una barra imantada (Wellcome Distriwell) colocada en la cuba y bajo una agitación magnética de 1.100 rpm asegurada por el agregómetro. La variación media de la transmisión óptica (n^{3}5 para cada dilución) en el tiempo es, pues, una medida de la aglutinación plaquetaria debida a la presencia de vWF y de botrocetina, en ausencia o presencia de concentraciones variables del producto de ensayo. A partir de tales registros, se determina entonces el % de inhibición de la aglutinación plaquetaria debida a cada concentración de producto y se traza la recta que da el % de inhibición en función de la inversa de la dilución del producto a escala log-log. Se determina entonces la CI_{50} (o concentración de producto que provoca el 50% de inhibición de la aglutinación) sobre esta recta. La Tabla de la Figura 16 compara las CI_{50} de algunas otras quimeras SAH-vWF de la presente invención y demuestra que algunas de ellas son mejores antagonistas de la aglutinación plaquetaria que el producto RG12986 descrito por Prior y col. [Bio/Technology (1992), 10: 66] e incluido en los ensayos como valor patrón. Pruebas idénticas de la inhibición de la aglutinación de las plaquetas humanas en presencia de vWF de plasma de cerdo (Sigma) permiten además demostrar que algunos de los híbridos de la presente invención, y especialmente algunas variantes de tipo IIB, son muy buenos antagonistas de la aglutinación plaquetaria en ausencia de cofactores de tipo botrocetina. El antagonismo independiente de botrocetina de estas quimeras particulares puede ser también demostrado según el protocolo inicialmente descrito por Ware y col. [Proc. Natl. Acad. Sci. (1991), 88: 2946] por desplazamiento del anticuerpo monoclonal ^{125}I-LJ-IB1 (10 mg/ml), un inhibidor competitivo de la fijación del vWF sobre la GP1b plaquetaria [Handa M. y col. (1986), J. Biol. Chem., 261: 12579] después de 30 min. de incubación a 22ºC en presencia de plaquetas frescas (10^{8} plaquetas/ml).
Se estudian las quimeras purificadas en cuanto a
su capacidad para permitir la proliferación in vitro de la
línea murina dependiente de IL-3 NFS60 mediante
medición de la incorporación de timidina tritiada esencialmente
según el protocolo descrito por Tsuchiya y col. [Proc. Natl. Acad.
Sci. (1986), 83: 7633]. Para cada quimera, se realizan las
medidas entre 3 y 6 veces en una prueba de tres puntos (tres
diluciones del producto) en una zona en la que la relación entre
cantidad de producto activo e incorporación de timidina marcada
(Amersham) es lineal. En cada placa de microtitulación, se incorpora
también la actividad de un producto de referencia constituido por
G-CSF humano recombinante expresado en células de
mamíferos. Los resultados de la Figura 17 demuestran que la quimera
SAH-G-CSF (pYG1266) segregada por la
levadura Kluyveromyces y purificada según el ejemplo E.9.3.
es capaz in vitro de transducir una señal de proliferación
celular para la línea NFS60. En este caso concreto, la actividad
específica (cpm/molaridad) de la quimera es aproximadamente 7 veces
más débil que la del G-CSF de referencia (no
copulado).
Se estudia la actividad de estimulación de las
quimeras SAH/G-CSF sobre la granulopoyesis in
vivo tras inyección subcutánea en la rata
(Sprague-Dawley/CD, 250-300 g,
8-9 semanas) y se compara con la del
G-CSF de referencia expresado a partir de células de
mamífero. Se inyecta cada producto, estudiado a razón de 7 animales,
por vía subcutánea en la región dorsoescapular a razón de 100 ml
durante 7 días consecutivos (D1-D7). Se recogen 500
ml de sangre los días D6-D2 (antes de la 2ª
inyección), D5 (antes de la 5ª inyección) y D8 y se efectúa una
determinación sanguínea. En esta prueba, la actividad específica
(unidades de neutropoyesis/mol inyectada) de la quimera
SAH-G-CSF (pYG1266) es idéntica a la
del G-CSF de referencia (Figura 18). Puesto que esta
quimera particular posee una actividad específica in vitro 7
veces más débil que la del G-CSF de referencia
(Figura 17), se demuestra, por lo tanto, que la copulación genética
del G-CSF a la SAH modifica favorablemente sus
propiedades farmacocinéticas.
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.859 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 26..1855
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS REFERENCIAS: /producto= "Quimera de tipo SAH-péptido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1842..1848
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS REFERENCIAS: /nombre estándar= "Sitio Mst II"
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 750 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..746
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS REFERENCIAS: /producto= "Fragmento C-ter. de la quimera SAH-vWF470"
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 423 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..419
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS REFERENCIAS: /producto= "Fragmento C-ter. de la quimera SAH-UK1-135"
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 541 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..536
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS REFERENCIAS: /producto= "Fragmento C-ter. de la quimera SAH-G-CSF"
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 26..2389
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS REFERENCIAS: /producto= "Quimera G-CSF-Gly_{4}-SAH secuencia debajo de la región prepro de SAH"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_recomb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 620..631
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS REFERENCIAS: /nombre estándar= "Ligante PolyGly"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 106..111
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS REFERENCIAS: /nombre estándar= "Sitio Apa I"
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 756 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..752
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS REFERENCIAS: /producto= "Fragmento C-ter. de la quimera SAH-Fv'"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_recomb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 384..428
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS REFERENCIAS: /nombre estándar= "Ligante sintético"
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: RHÔNE-POULENC RORER S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 20, avenue Raymond ARON
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ANTONY
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 92165
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVOS POLIPÉPTIDOS BIOLÓGICAMENTE ACTIVOS, SU PREPARACIÓN Y COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA QUE LOS CONTIENE.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.859 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 26..1855
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /product= "Quimera de tipo SAH-péptido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1842..1848
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /standard_name: "Sitio Mst II"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 750 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..746
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /product= "Fragmento C-ter de la quimera SAH-vWF470"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 423 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..419
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /product= "Fragmento C-ter de la quimera SAH-UK1-135"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 541 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..536
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /product= "Fragmento C-ter de la quimera SAH-G-CSF"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 26..2389
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /product= "Quimera G-CSF-Gly4-SAH secuencia debajo de la región prepro de SAH"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_recomb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 620..631
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /standard_name: "Ligante PoliGly"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 106..111
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /standard_name: "Sitio Apa I"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 756 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..752
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /product= "Fragmento C-ter de la quimeraSAH-Fv'"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_recomb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 384..428
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /standard_name: "Ligante sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Polipéptido recombinante que lleva una parte
activa derivada de un polipéptido que tiene una actividad
terapéutica genéticamente copulada a una albúmina o a una variante
de la albúmina, donde la variante de la albúmina conserva una alta
vida media plasmática, caracterizado por el hecho de que
dicho polipéptido que tiene una actividad terapéutica es
seleccionado entre hormonas, interferones, interleukinas,
eritropoyetina, G-CSF e insulina.
2. Polipéptido según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el polipéptido que tiene
una actividad terapéutica es un polipéptido de origen humano.
3. Polipéptido según una de las reivindicaciones
1 ó 2, caracterizado por el hecho de que la parte activa
presenta una estructura seleccionada entre:
(a) la estructura peptídica entera o
(b) un fragmento de (a) o una estructura derivada
de (a) por modificación estructural (mutación, substitución, adición
y/o deleción de uno o de varios residuos) y que conserva una
actividad terapéutica.
4. Polipéptido según una de las reivindicaciones
1 a 3, caracterizado por el hecho de que la albúmina o la
variante de la albúmina poseen una estructura seleccionada
entre:
(a) la albúmina madura,
(b) la albúmina,
(c) una estructura derivada de (a) o (b) por
modificación estructural (mutación, substitución, adición y/o
deleción de uno o de varios residuos) y que conserva una alta vida
media plasmática.
5. Polipéptido según una de las reivindicaciones
1 a 4, caracterizado por el hecho de que el polipéptido
contiene una metionina N-terminal.
6. Polipéptido según una de las reivindicaciones
1 a 5, caracterizado por el hecho de que el polipéptido
contiene un péptido de unión.
7. Polipéptido según una de las reivindicaciones
1 a 7, caracterizado por el hecho de que el polipéptido
contiene una señal de secreción.
8. Polipéptido según la reivindicación 7,
caracterizado por el hecho de que la señal de secreción es la
secuencia señal natural del polipéptido biológicamente activo.
9. Polipéptido según una de las reivindicaciones
1 a 8, caracterizado por el hecho de que la parte activa está
copulada al extremo N-terminal de la albúmina.
10. Polipéptido según una de las reivindicaciones
1 a 8, caracterizado por el hecho de que la parte activa está
copulada al extremo C-terminal de la albúmina.
11. Polipéptido según una de las reivindicaciones
1 a 10, caracterizado por el hecho de que la parte activa
está en él representada varias veces.
12. Secuencia nucleotídica codificante de un
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11.
13. Secuencia nucleotídica según la
reivindicación 12, caracterizada por contener una secuencia
codificante de una secuencia líder que permite la secreción del
polipéptido expresado.
14. Cassette de expresión que comprende una
secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 12 ó 13
bajo el control de una región de iniciación de la transcripción y
eventualmente de una región de finalización de la transcripción.
15. Plásmido autorreplicativo que lleva un
cassette de expresión según la reivindicación 14.
16. Célula recombinante eucariótica o
procariótica en la cual se ha insertado una secuencia nucleotídica
según una de las reivindicaciones 12 ó 13 o un cassette de expresión
según la reivindicación 14 o un plásmido según la reivindicación
15.
17. Célula recombinante según la reivindicación
16, caracterizada por tratarse de una levadura, de una célula
animal, de un hongo o de una bacteria.
18. Célula recombinante según la reivindicación
17, caracterizada por tratarse de una levadura.
19. Célula recombinante según la reivindicación
18, caracterizada por tratarse de una levadura del género
Saccharomyces o Kluyveromyces.
20. Procedimiento de preparación de un
polipéptido tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 1
a 11, caracterizado por cultivar una célula recombinante
según una de las reivindicaciones 16 a 19 en condiciones de
expresión y por recuperar el polipéptido producido.
21. Composición farmacéutica consistente en uno o
varios polipéptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11 o preparados por un procedimiento según la reivindicación 20.
22. Composición farmacéutica que incluye una
secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 12 a 14
utilizable en terapia génica.
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