CN102876716B - 特异促进肝细胞cyp2e1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents
特异促进肝细胞cyp2e1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102876716B CN102876716B CN201210366745.0A CN201210366745A CN102876716B CN 102876716 B CN102876716 B CN 102876716B CN 201210366745 A CN201210366745 A CN 201210366745A CN 102876716 B CN102876716 B CN 102876716B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cyp2e1
- sequence
- cyp2e1 gene
- lentiviral
- cdna sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP1-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP2E1基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I酶切位点和EcoR I酶切位点，所述CYP2E1基因cDNA序列包括Xho I酶切位点、CYP2E1基因编码序列和EcoR I酶切位点，所述CYP2E1基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。本发明提供的慢病毒表达载体具有转染效率高、用量少、可特异、持续、高效、稳定地表达CYP2E1基因的优点，可作为有力工具应用于与CYP2E1相关的药物研究与开发。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用。
背景技术
细胞色素P450酶(Cytochrome P450, CYP450)是一类重要的混合功能氧化酶系统，主要分布在生物体的内质网上和线粒体中，参与许多内源性和外源性物质的生物转化过程。CYP2E1属于CYP450家族中的CYP2E亚族，由CYP2E1基因编码，主要存在于肝脏中，约占肝脏CYP酶总量的7%，主要代谢小分子物质。目前，已经确定为CYP2E1的底物有70多种，参与亚硝胺、异烟脐、四氯化碳、氯哇沙宗、醋氨酚、茶碱等化合物的代谢，CYP2E1可使这些药物转化为毒性更强的中间产物。
现有技术中，徐田雪将CYP2E1基因cDNA片段连接到了pFastBac载体上，并将其包装成杆状病毒后感染sf9细胞，得到了能表达CYP2E1基因的sf9细胞，该细胞能够用于体外研究药物代谢，但因不是人源细胞不适用于外源物质对人毒理的相关研究。黄鹤将CYP2E1基因克隆到pYES2/CT载体上，导入酿酒酵母中，从而构建出能表达CYP2E1基因的酿酒酵母，该细胞也是可以用于体外研究药物代谢以及筛选药物，但因非人源细胞也不适用于外源物质对人毒理的相关研究。现有技术中尚无可在人源细胞中持续、稳定且高效表达CYP2E1基因的载体。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，发明人在载体的选择、重组构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将包含Xho I酶切位点和EcoR I酶切位点的CYP2E1基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表达载体的多克隆位点中可成功构建特异促进人源肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体，从而完成本发明。
本发明提供一种特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP1-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP2E1基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I酶切位点和EcoR I酶切位点，所述CYP2E1基因cDNA序列包括Xho I酶切位点、CYP2E1基因编码序列和EcoR I酶切位点，所述CYP2E1基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。
采用上述技术方案，本发明提供的CYP2E1基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表达载体构建得到的慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定地提高CYP2E1基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病药物的研究和开发中。
作为本发明的进一步改进，所述CYP2E1基因编码序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：5’-ACCTCGAGTCATGTCTGCCCTCGGAGTCAC-3’，即SEQ ID NO：1，所述下游引物的序列为：5’-ACGAATTCTCATGAGCGGGGAATGACA-3’，即SEQ ID NO：2。采用上述PCR引物序列，通过PCR可以扩增出CYP2E1基因编码序列，并可成功插入至pLVX-AcGFP1-C1表达载体中持续表达CYP2E1基因，减少了序列合成费用，成本较低。
相应的，本发明还提供特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：
A） CYP2E1基因引物设计：根据CYP2E1基因编码序列，使用Oligo 7分析后选取5’-ACCTCGAGTCATGTCTGCCCTCGGAGTCAC-3’，即SEQ ID NO：1作为上游引物，选取5’-ACGAATTCTCATGAGCGGGGAATGACA-3’，即SEQ ID NO：2作为下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；所述上游引物和所述下游引物无引物二聚体，且退火温度差距较小；
B） CYP2E1基因cDNA序列的获得：用所述上游引物和所述下游引物进行PCR扩增，获得大量CYP2E1基因编码序列，然后将该序列进行加A尾反应后，用T4 DNA连接酶连接到pGM-T载体上得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；用液体LB培养基培养测序鉴定正确的大肠杆菌，并抽提其中带CYP2E1基因cDNA序列的pGM-T载体，用限制性内切酶XhoⅠ酶切回收后再用EcoRⅠ酶切，电泳、切胶回收1499 bp大小的片段，此片段即为CYP2E1基因cDNA序列；
C） 特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒载体的构建和鉴定：提取质粒pLVX-AcGFP1-C1，用限制性内切酶XhoⅠ酶切回收后再用EcoRⅠ酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA ligase将所述CYP2E1基因cDNA序列连接到pLVX-AcGFP1-C1表达载体中，得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；
D） 特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒载体的抽提：将测序结果证实CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液扩增培养，对重组质粒进行抽提，得到特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体。
本发明利用基因工程技术构建特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体，经鉴定构建成功后，包装成病毒感染L-02肝细胞，嘌呤霉素筛选细胞后，使用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分别从mRNA和蛋白水平验证CYP2E1基因表达的变化，实验结果证明本发明提供的CYP2E1基因cDNA序列成功插入至pLVX-AcGFP1-C1表达载体中，能特异、持续、高效、稳定地促进CYP2E1基因高表达。
本发明还提供特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体在制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供的特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，能特异、持续、高效、稳定地促进CYP2E1基因高表达的优点，可作为有力工具应用于与CYP2E1相关的药物研究和开发中；本发明还提供了特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，操作效果好，减少了序列合成费用，成本较低。
附图说明
图1 为pLVX-AcGFP1-C1表达载体的质粒图谱。
图2 为2E1-T载体菌液PCR的结果示意图。
图3 为pLVX-CYP2E1载体菌液PCR的结果示意图。
图4 为pLVX-CYP2E1载体测序结果示意图。
图5 为嘌呤霉素筛选细胞后荧光定量PCR检测结果示意图。
图6 为嘌呤霉素筛选细胞后Western blot检测结果示意图。
图7 为嘌呤霉素筛选细胞连续培养20代后Western blot检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。
L-02肝细胞购自上海生命科学院细胞资源中心，293FT细胞购自Invitrogen公司，Premix PrimeSTAR HS酶、慢病毒表达载体pLVX-AcGFP1-C1、病毒包装辅助试剂盒、Lenti-X GoStix试剂盒均购自Takara公司， RNeasy Mini Kit购自Qiagen 公司，pGM-T载体购自天根公司，Endo-Free Plasmid Mini Kit II购自Omega bio-tek公司。
实施例一 CYP2E1基因引物的设计。
根据CYP2E1基因编码序列（GenBank NM_000773.3），使用Oligo7对其进行分析，寻找上游引物和下游引物（要求尽可能无引物二聚体且退火温度差距较小），然后在上游引物和下游引物的5’端分别加入保护碱基与酶切位点Xho I和EcoR I，设计得到的引物序列如表1所示。设计的PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例二 特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒载体的构建。
将合成的引物稀释后，用Premix PrimeSTAR HS酶对CYP2E1基因的编码序列进行扩增，电泳回收后然后将其进行加A尾反应后，用T4 DNA连接酶连接到pGM-T载体上得到连接产物（2E1-T载体），将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，于37℃培养12 h，同时设置阴性对照组1（将感受态细胞均匀涂布在不含氨苄青霉素的平板上）、阴性对照组2（将感受态细胞均匀涂布在含100 μg/ml氨苄青霉素的平板上）、阳性对照组1（将双酶切空载体的连接产物均匀涂布在含100 μg/ml氨苄青霉素的平板上）、阳性对照组2（将空载体均匀涂布在含100 μg/mL氨苄青霉素的平板上）。实验组长出了单菌落，阴性对照组1长出了菌落；阴性对照组2、阳性对照组1、阳性对照组2没长出菌落。
从实验组中挑取8个单菌落培养保存后，各取0.5 μL培养液，用CYP2E1基因的引物进行PCR扩增来初步鉴定。结果如图2所示，表明8个单菌落的培养液均能成功扩增出CYP2E1基因，接着将重组载体送至上海生工公司测序。
取测序结果正确的菌，置于液体LB培养基中培养14 h，然后提取2E1-T载体，将2E1-T载体和pLVX-AcGFP1-C1载体先用Xho I酶进行酶切，电泳回收后再用EcoR I酶进行酶切，再进行电泳回收，最后将回收产物用T4 DNA连接酶连接，再次转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，于37℃培养12 h，同时设置阴性对照组1（将感受态细胞均匀涂布在不含氨苄青霉素的平板上）、阴性对照组2（将感受态细胞均匀涂布在含100 μg/mL氨苄青霉素的平板上）、阳性对照组1（将双酶切空载体的连接产物均匀涂布在含100 μg/mL氨苄青霉素的平板上）、阳性对照组2（将空载体均匀涂布在含100 μg/mL氨苄青霉素的平板上）。实验组长出了单菌落，阴性对照组1长出了菌落；阴性对照组2、阳性对照组1、阳性对照组2没长出菌落。
从实验组中挑取4个单菌落培养保存后，各取0.5 μL培养液，用CYP2E1基因的引物进行PCR扩增来初步鉴定。结果如图3所示，表明全部4支培养液均能成功扩增出CYP2E1基因，接着将这些重组载体菌液送至上海生工公司测序，测序结果如图4所示，与预期完全相符。
取出之前保存的重组质粒菌液，取20 μl接种到15 ml LB培养基（含100 μg/ml氨苄青霉素）中，37℃，300 rpm培养16 h，用Endo-Free Plasmid Mini Kit II进行抽提重组质粒pLVX-CYP2E1，测其纯度和浓度，结果如表2所示。
实施例三 慢病毒包装。
培养293FT细胞，取生长状态良好的细胞接种到六孔中，每孔106个细胞，用慢病毒包装辅助试剂盒，取抽提的重组质粒pLVX-CYP2E1 2μg转染到293FT细胞，48h后收集含病毒的上清培养基，用0.45μm的筛子过滤病毒液，用于感染L-02肝细胞，Lenti-X GoStix试剂盒检测病毒的滴度为5×106～5×107IFU。
实施例四 慢病毒转导L-02肝细胞。
接种L-02肝细胞于6孔板中，每孔10 6 个细胞，12h后细胞密度约为50%，分别取病毒液，用RPMI-1640完全培养基10倍稀释病毒，再加入聚凝胺（polybrene）至终浓度为8 μg/mL。去6孔板中的培养基，加入含病毒的RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清），24h后弃去含病毒的RPMI-1640完全培养基，更换新鲜的RPMI-1640完全培养基，24h后用0.5μg/ml浓度的嘌呤霉素筛选细胞。筛选10d，每隔3d更换培养基一次，并不断的增加嘌呤霉素的浓度至1.00 μg/ml。
实施例五 荧光定量PCR检测CYP2E1基因表达量。
根据GAPDH和CYP2E1基因mRNA序列，利用引物设计软件Oligo 7.0设计引物。
分别接种L-02肝细胞、pLVX空载体对照L-02细胞、pLVX-CYP2E1高表达细胞至6孔板。细胞密度达到80%-90%时，用RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总RNA，利用PrimeScrip RT reagent Kit将mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。反转录结束后，加入90μL的RNase Free dH2O稀释cDNA，-20℃保存，以便后面检测使用。取各组细胞的cDNA 1μL为模板，以GAPDH为内参，实时荧光定量PCR（QPCR）检测CYP2E1相对表达量，设置反应条件：95℃ 30s，1循环，54℃ 30s 40循环，95℃ 5s，60℃ 1min，95℃ 15s，利用SYBR Primescript RT-PCR Kit检测各组细胞CYP2E1基因相对表达量。将pLVX-CYP2E1细胞连续培养20代后，重复以上实验。汇总后的结果如图5所示。可以看到，不管是刚筛选完，还是已经培养20代后的pLVX-CYP2E1细胞，其CYP2E1基因的表达量较L-02细胞都有267倍左右的升高，而pLVX空载体细胞的CYP2E1基因表达量与L-02细胞相比基本没有变化，说明本发明提供的CYP2E1基因cDNA序列成功插入至pLVX-AcGFP1-C1表达载体中，能特异、持续、高效、稳定地促进CYP2E1基因高表达。
实施例六 Western blot检测CYP2E1蛋白质表达量。
分别取L-02肝细胞、pLVX空载体对照L-02细胞、pLVX-CYP2E1高表达细胞1瓶（25cm2 细胞培养瓶），去培养基，用冷PBS洗3次，加入200 μl细胞裂解液，并用细胞刮将裂解的细胞快速从瓶壁刮下，收集蛋白至500μl的EP管中，4℃继续裂解30 min，12000rpm，4℃离心20min，最后加入5×SDS-PAGE Sample Loading Buffer，100℃变性5min, 进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h；分别加入CYP2E1抗体、GAPDH抗体，4℃孵育过夜。 TBST洗膜3次，每10min一次，再加入二抗，室温孵育1h, TBST洗膜3次，每10min一次。加入Western blot化学发光试剂后进行成像分析，结果如图6所示。以GAPDH为内参，结果表明pLVX-CYP2E1细胞的CYP2E1蛋白表达量有明显升高，约为正常L-02细胞的4.36倍，蛋白表达量显著升高。
连续培养细胞20代后，分别提取pLVX-CYP2E1细胞及其对照组细胞，Western blotting 分析CYP2E1蛋白表达量，结果如图7所示，与之前的结果接近。这说明pLVX-CYP2E1细胞构建成功，能持续、高效、稳定地高表达CYP2E1基因。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市疾病预防控制中心
<120> 特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用
<130> 2
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acctcgagtc atgtctgccc tcggagtcac 30
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgaattctc atgagcgggg aatgaca 27
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tctgacttca acagcgacac c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctgttgctgt agccaaattc gt 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctctgagata tgggctcctg att 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aatggtgtct cgggttgctt c 21
Claims (4)
1.一种特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体，其特征在于：包括pLVX-AcGFP1-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP2E1基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I酶切位点和EcoR I酶切位点，所述CYP2E1基因cDNA序列包括Xho I酶切位点、CYP2E1基因编码序列和EcoR I酶切位点，所述CYP2E1基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。
2.根据权利要求1所述的特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体，其特征在于：所述CYP2E1基因编码序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：5’-ACCTCGAGTCATGTCTGCCCTCGGAGTCAC-3’，即SEQ ID NO：1，所述下游引物的序列为：5’-ACGAATTCTCATGAGCGGGGAATGACA-3’，即SEQ ID NO：2。
3.根据权利要求 2所述的特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
A）CYP2E1基因引物设计：根据CYP2E1基因编码序列，使用Oligo 7分析后选取5’-ACCTCGAGTCATGTCTGCCCTCGGAGTCAC-3’，即SEQ ID NO：1作为上游引物，选取5’-ACGAATTCTCATGAGCGGGGAATGACA-3’，即SEQ ID NO：2作为下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；
B）CYP2E1基因cDNA序列的获得：用所述上游引物和所述下游引物进行PCR扩增，获得大量CYP2E1基因编码序列，然后将该序列进行加A尾反应后，用T4 DNA连接酶连接到pGM-T载体上得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；用液体LB培养基培养测序鉴定正确的大肠杆菌，并抽提其中带CYP2E1基因cDNA序列的pGM-T载体，用限制性内切酶XhoⅠ酶切回收后再用EcoRⅠ酶切，电泳、切胶回收1499 bp大小的片段，此片段即为CYP2E1基因cDNA序列；
C）特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒载体的构建和鉴定：提取质粒pLVX-AcGFP1-C1，用限制性内切酶XhoⅠ酶切回收后再用EcoRⅠ酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA ligase将所述CYP2E1基因cDNA序列连接到pLVX-AcGFP1-C1表达载体中，得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；
D）特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒载体的抽提：将测序结果证实CYP2E1基因cDNA序列插入成功的菌液扩增培养，对重组质粒进行抽提，得到特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体在制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210366745.0A CN102876716B (zh) | 2012-09-28 | 2012-09-28 | 特异促进肝细胞cyp2e1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210366745.0A CN102876716B (zh) | 2012-09-28 | 2012-09-28 | 特异促进肝细胞cyp2e1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102876716A CN102876716A (zh) | 2013-01-16 |
| CN102876716B true CN102876716B (zh) | 2015-07-01 |
Family
ID=47478231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210366745.0A Expired - Fee Related CN102876716B (zh) | 2012-09-28 | 2012-09-28 | 特异促进肝细胞cyp2e1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102876716B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017214829A1 (zh) * | 2016-06-14 | 2017-12-21 | 石庆学 | 特异促进 pd-l1 基因高表达的慢病毒表达载体及其应用 |
| WO2017214830A1 (zh) * | 2016-06-14 | 2017-12-21 | 石庆学 | 特异促进 pd-1 基因高表达的慢病毒载体及其应用 |
| WO2017214945A1 (zh) * | 2016-06-16 | 2017-12-21 | 毛侃琅 | 提升Hepcidin基因表达水平的慢病毒表达载体及其应用 |
| CN107177633B (zh) * | 2017-06-01 | 2020-10-27 | 深圳市疾病预防控制中心 | 促进StAR基因表达的表达载体及其构建方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000040272A2 (en) * | 1999-01-04 | 2000-07-13 | Ml Laboratories Plc | P450 / acetaminophen gdept for cancer treatment |
| CN1705741A (zh) * | 2002-10-14 | 2005-12-07 | Ml实验室公开有限公司 | 改进的免疫疗法 |
| WO2011052883A2 (ko) * | 2009-10-26 | 2011-05-05 | 한국생명공학연구원 | Ｓｏｃｓ２ 유전자의 발현을 조절하여 자연 살해 세포를 활성화시키는 방법 |
-
2012
- 2012-09-28 CN CN201210366745.0A patent/CN102876716B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000040272A2 (en) * | 1999-01-04 | 2000-07-13 | Ml Laboratories Plc | P450 / acetaminophen gdept for cancer treatment |
| CN1705741A (zh) * | 2002-10-14 | 2005-12-07 | Ml实验室公开有限公司 | 改进的免疫疗法 |
| WO2011052883A2 (ko) * | 2009-10-26 | 2011-05-05 | 한국생명공학연구원 | Ｓｏｃｓ２ 유전자의 발현을 조절하여 자연 살해 세포를 활성화시키는 방법 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CYP2E1在肝细胞癌中的作用研究进展;许钟等;《国际消化病杂志》;20090825;第29卷(第04期);第271-272,282页 * |
| 利用细菌/杆状病毒系统在昆虫细胞中表达人CYP2E1;路珂等;《浙江大学学报(医学版)》;20080325;第37卷(第02期);第118-125页 * |
| 用慢病毒转染RNAi技术沉默胆固醇7α羟化酶的基因表达,降低肝细胞中胆汁酸的分泌;郑吉春等;《生物物理学报》;20080615;第24卷(第03期);第182-190页 * |
| 表达细胞色素P2E1 C3A肝细胞系的建立及其对增殖的影响;刘天会等;《中华肝脏病杂志》;20061128;第14卷(第11期);第850页左栏第2段-右栏倒数第3段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102876716A (zh) | 2013-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102703507B (zh) | 特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用 | |
| CN102864171B (zh) | 特异促进肝细胞cyp3a4基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用 | |
| CN102876716B (zh) | 特异促进肝细胞cyp2e1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用 | |
| CN102766654A (zh) | 特异促进肝细胞cyp1a2基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用 | |
| CN102453716B (zh) | 猪骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的克隆及应用 | |
| CN102936600A (zh) | 稳定表达荧光素酶的a549裸鼠模型及其建立与应用 | |
| CN103834692B (zh) | 一种用于表达lncRNA的慢病毒载体及其应用 | |
| CN104805120A (zh) | 一种shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体、重组质粒及其构建方法 | |
| CN105132424A (zh) | microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达载体及其构建方法和应用 | |
| CN103937748B (zh) | 可稳定表达人tmprss2蛋白的单细胞自悬浮生长mdck细胞株及其构建方法与应用 | |
| CN102115762A (zh) | 一种建立高效表达人环氧合酶2的重组人肠癌细胞株的方法及应用 | |
| CN102994550B (zh) | 在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法 | |
| Wu et al. | Methanofollis formosanus sp. nov., isolated from a fish pond | |
| Liu et al. | CRISPR‐Cas13d effectively targets SARS‐CoV‐2 variants, including Delta and omicron, and inhibits viral infection | |
| CN106086075A (zh) | CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法 | |
| CN104388435A (zh) | 山羊脂联素基因真核表达载体的构建和应用 | |
| CN108517335B (zh) | 一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法 | |
| CN102181405B (zh) | 一种重组病毒及利用该病毒生产l-天冬酰胺酶ⅱ的方法 | |
| CN106177906B (zh) | Ddb1蛋白的应用 | |
| CN106520766A (zh) | 一种海藻内源组成型启动子及其应用 | |
| CN109321574A (zh) | 抑制ILT5表达的短发卡shRNA、慢病毒及其应用 | |
| Izvekova | Hydrolytic activity of enzymes produced by symbiotic microflora and its role in digestion processes of bream and its intestinal parasite Caryophyllaeus laticeps (Cestoda, Caryophyllidea) | |
| CN1924014A (zh) | 抑制肿瘤转移的特异性干扰MTA1 mRNA的干扰RNA序列 | |
| CN110195073A (zh) | 一种胰蛋白酶前体基因及其编码的蛋白质、干扰rna和应用 | |
| Cho et al. | A report of 17 unrecorded bacterial species of Korea belonging to the phylum Bacteroidetes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150701 Termination date: 20210928 |