CN1924014A - 抑制肿瘤转移的特异性干扰MTA1 mRNA的干扰RNA序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种特异性干扰MTA1 mRNA的干扰RNA序列及其用途，尤其是涉及一种抑制哺乳动物包括人肿瘤转移的特异性干扰MTA1 mRNA的干扰RNA序列，其包括：正义链5’－GAACATCTACGACATCTCCTT－3’和，反义链3’－TTCTTGTAGATGCTGTAGAGG－5’。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种特异性干扰MTA1mRNA的干扰RNA序列及其用途。
背景技术
在现有技术中，本领域技术人员公知MTA1基因是一个在肿瘤转移过程中表达上调的基因，文献报道认为其表达与肿瘤的转移能力相关。它是Toh等(J Biol Chem，1994，269(37)：22958-63)用差异cDNA文库扫描技术从高转移大鼠乳腺腺癌细胞系中发现的，随后用同源方法发现了人的同源MTA1基因。该基因产物是核小体重塑与脱乙酰基复合体(nuclear remodeling and deacetylation complex，NuRD)的成分，通过影响染色质的状态来调控基因转录。可见MTA1能发挥转录调节因子的作用广泛地影响下游基因的表达状态。组蛋白乙酰化酶HAT的功能是将组蛋白乙酰化，促进基因转录；组蛋白去乙酰化酶的作用是脱去组蛋白的乙酰基，使DNA结构变得紧密，基因表达受到抑制。组蛋白乙酰化/脱乙酰化与细胞周期及肿瘤的进展有关。MTA1过表达在许多人类的肿瘤中与其恶性进程有关。Toh等研究(Int J Cancer，2004，110(3)：362-7)也发现，MTA1在食管癌中的表达与其H4组蛋白的脱乙酰基活性相关。经典的抑癌基因如p53、p21和Rb基因都受组蛋白乙酰化的调控。高表达MTA1 mRNA的肿瘤细胞侵袭与淋巴结转移率明显升高。用反义方法抑制该基因的表达能导致有MTA1基因高表达的人乳腺癌细胞MDA-MB-231，出现生长和转移侵袭抑制。表明该基因可能在肿瘤的转移侵袭中发挥重要作用。近年来的研究表明，MTA1所属的组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase，HDAC)家族在肿瘤发生中起了关键性作用，成为肿瘤治疗中一个重要的目标分子。Toh等研究了食管癌组织标本中MTA1 mRNA的改变，发现MTA1 mRNA的表达升高与肿瘤的转移有关。
RNA干扰是特异性的转录后基因沉默，它既具有广泛的适用性又具有精确特异性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制肿瘤转移的基因序列，特别是提供一种能特异性干扰MTA1 mRNA的干扰RNA序列。
所述的双链干扰RNA(siRNA)的序列为：
正义链5’-GAACAUCUACGACAUCUCCTT-3’
反义链3’-TTCUUGUAGAUGCUGUAGAGG-5’。
本发明还涉及一种含有本发明上述的抑制哺乳动物包括人肿瘤转移的特异性干扰MTA1 mRNA的干扰RNA序列的载体，即用化学合成法合成双链干扰RNA(siRNA)和构建包含该RNA模板的质粒在细胞内转录成双链干扰RNA。
在体外培养的肿瘤细胞实验中，以上两种形式的MTA1 mRNA的干扰RNA序列均明显的抑制了肿瘤细胞的转移相关生物学行为，如体外迁移、侵袭、粘附、划痕愈合、克隆形成等；在肿瘤细胞的体内成瘤能力及实验性肺转移实验中表现出强大的抑制肿瘤生长和转移的生物学功能。
本发明涉及的针对人MTA1基因、小鼠MTA1基因的靶序列片段：
5’-GAACATCTACGACATCTCC-3’(对应人MTA1 mRNA序列gi：14141149第787～805碱基；对应鼠MTA1 mRNA序列gi：16905112第831～849碱基)，以该序列为基础化学合成的siRNA和构建的siRNA表达载体能产生特异性MTA1基因沉默效应，可产生抑制肿瘤生长和转移的功效，可用于肿瘤的基因治疗中。
在肿瘤基因治疗中，本发明的化学合成片段的应用可能会经多种化学方法的修饰以增加稳定性和靶向性等。该靶序列连接入载体后应用于肿瘤基因治疗，可采用多种现有技术中使用的病毒和非病毒候选载体，如质粒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体等。
因此，本发明进一步涉及一种药物组合物，其特征在于含有有效剂量的本发明所述的抑制肿瘤转移的特异性干扰MTA1 mRNA的干扰RNA序列，以及药学上可接受的载体。
本发明还涉及一种含有本发明所述的RNA序列的载体。优选的是，所述的载体包括pSilencer3.1-H1 neo。
附图说明
图1为pSilencer3.1-H1 neo载体结构图
图2MTA1-siRNA和pSilencer3.1-MTA1-siRNA抑制KYSE150与B16F10细胞MTA1蛋白表达。A、C，MTA1-siRNA抑制KYSE150细胞MTA1蛋白表达western blot检测及定量。B、D，pSilencer3.1-MTA1-siRNA抑制B16F10细胞MTA1蛋白表达westernblot检测及定量。
图3MTA1-siRNA和pSilencer3.1-MTA1-siRNA抑制KYSE150与B16F10细胞MTA1 mRNA表达。A、C，MTA1-siRNA抑制KYSE150细胞MTA1 mRNA表达RT-PCR检测及定量。B、D，pSilencer3.1-MTA1-siRNA抑制B16F10细胞MTA1 mRNA表达RT-PCR检测及定量。
图4MTA1-siRNA及pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染降低肿瘤细胞的体外迁移及侵袭能力。A，MTA1-siRNA转染降低KYSE150细胞的体外迁移及侵袭能力；B，pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染降低B16F10细胞的体外迁移及侵袭能力。
图5MTA1-siRNA及pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染降低肿瘤细胞的细胞外基质粘附能力。A，MTA1-siRNA转染降低KYSE150细胞的细胞外基质Matrigel粘附能力；B，pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染降低B16F10细胞的细胞外基质Matrigel粘附能力。
图6MTA1-siRNA及pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染降低肿瘤细胞的划痕愈合能力。A，MTA1-siRNA转染降低KYSE150细胞的划痕愈合能力；B，pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染降低B16F10细胞的划痕愈合能力。
图7MTA1-siRNA及pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染降低肿瘤细胞的克隆形成能力。A，MTA1-siRNA转染降低KYSE150细胞的克隆形成能力；B，pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染降低B16F10细胞的克隆形成能力。
图8MTA1-siRNA及pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染降低肿瘤细胞的克隆形成能力。食管癌细胞系KYSE150转染MTA1-siRNA及B16F10黑色素瘤细胞转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒后细胞生长减慢。
图9用流式细胞仪检测转染control vector和pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的B16F10细胞周期情况。转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的细胞G1期细胞增加，G2/S期细胞比例减少。
图10pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染降低B16F10肿瘤细胞的C57小鼠体内成瘤能力。A，处死后的荷瘤鼠；B，解剖后的肿瘤；C，不同的生长时间测量的肿瘤体积。
图11pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染降低B16F10肿瘤细胞的C57小鼠实验性肺转移能力。A，解剖后的肺，可见黑色的肺结节；B，肺重量称量图C，肺部形成的肿瘤结节计数。
具体实施方式
以下将结合附图进一步非限定性地详细说明本发明。
实施例1、MTA1干扰RNA的化学合成及表达载体的构建
采用现有技术公知的化学合成法合成MTA1-siRNA(上海吉凯基因化学技术有限公司合成)。
化学合成法直接合成双链干扰RNA序列如下，这两条序列碱基为互补关系：
正义链5’-GAACAUCUACGACAUCUCCTT-3’
反义链3’-TTCUUGUAGAUGCUGUAGAGG-5’
本发明以下将化学合成的退火双链称为MTA1-siRNA。pSilencer3.1-MTA1-siRNA载体的构建
采用化学合成法合成包含以上反向互补靶序列的DNA模板序列，并合成该模板DNA序列的互补序列，退火形成双链，并连接入Ambion公司pSilencer3.1-H1 neo载体(参见图1)。连接入载体的DNA模板是由上海英骏生物技术有限公司合成的。该载体将在细胞内转录出发夹状RNA，并经细胞内修饰后产生具有RNA干扰作用的MTA1-siRNA。模板序列、退火及连接过程如下：
合成序列：
正义模板序列
5′-GATCCCGAACATCTACGACATCTCCTTCAAGAGAGGAGATGTCGTAGATGTTCTTTTTTGGAAA-3′64bp
反义模板序列
5′-AGCTTTTCCAAAAAAGAACATCTACGACATCTCCTCTCTTGAAGGAGATGTCGTAGATGTTCGG-3′64bp
序列的退火连接：
1)将每一寡核苷酸稀释成1μg/μl溶液。
a.将发夹siRNA模板寡核苷酸稀于约100μl无RNA酶水中。
b.取1μl以1∶100到1∶1000稀释于TE溶液中，测定260nm处的吸光度，计算寡核苷酸的浓度。
c.将siRNA稀释至约1μg/μl。
2)将每对寡核苷酸模板退火。
a.按下表配制50μl退火混合物
2μl 正义siRNA模板寡核苷酸
2μl 反义siRNA模板寡核苷酸
46μl 1×DNA退火缓冲液；
b.加热至90℃，保持3min，然后冷却至37℃孵育1小时；
c.以上退火模板插入片断可用于连接反应。
3)退火模板与pSilencer3.1-H1 neo载体的连接。
a.以45μl无RNA核酶水稀释5μl已退火的siRNA模板，至终浓度为8ng/μl；
b.建立10μl连接反应体系，同时进行阴性对照片段的连接，设置连接反应对照。
插入体系 连接对照体系 加入成分
1μl - 稀释的退火siRNA模板
- 1μl 1×DNA退火缓冲液
6μl 6μl 无核酶水
1μl 1μl 10×DNA1连接酶
1μl 1μl pSilencer3.1-H1 neo载体
1μl 1μl T4DNA连接酶(5U/μl)
c.以T4DNA连接酶的反应条件进行连接反应，连接产物备用于转化大肠杆菌进行扩增。本化学合成的模板序列退火后前后端分别形成BamHI和HindIII内切酶的粘性末端，与经BamHI和HindIII线性化的pSilencer3.1-H1 neo载体连接。
本发明将构建的包含MTA1干扰靶序列的pSilencer3.1-H1 neo质粒命名为pSilencer3.1-MTA1-siRNA。
连接载体的测序结果(加下划线部分为连入载体的模板序列)表明与设计序列完全相同：
GAATTCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAA
ACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAG
ACCACTCG
GATCCCGAACATCTACGACATCTCCTTCAAGAGAGGA
GATGTCGTAGATGTTCTTTTTTGGAAAAGCTTGGCGTAATCATGGT
CATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA
CAACATACGAG
实施例2本发明以MTA1-siRNA和pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染哺乳动物细胞
本发明进一步以化学合成MTA1-siRNA转染食管癌细胞系KYSE150观察其抑制肿瘤细胞转移的能力，以构建的pSilencer3.1-MTA1-siRNA载体转染黑色素瘤细胞系B16F10观察载体表达MTA1-siRNA抑制肿瘤细胞转移的能力。
用Lipofectamine 2000将化学合成的MTA1-siRNA转入哺乳动物细胞进行细胞生物学分析(24孔板)。
1)转染前一天，于培养基内种植合适数量的细胞，不加抗生素，转染时的细胞密度为30～50％。转染前换成无血清培养基(含血清培养基亦可)。
2)准备转染复合体。
A将稀释为总量为50pmol的siRNA 3μl加入47μl的无血清培养基，轻轻混匀，室温孵育。
B用前混匀Lipofectamine 2000。取1μl加入49μl无血清培养基中混匀。轻轻混匀，室温孵育5min。
C将稀释好的siRNA与稀释好的Lipofectamine 2000轻轻混合，室温孵育20min以使复合体形成。
3)将复合体加入细胞培养孔中，轻轻混匀。
4)孵育48～96小时后观察基因沉默效应。
用Lipofectamine 2000将构建的pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒转入哺乳动物细胞进行细胞生物学分析(24孔板)。
1)转染前一天在500μl培养基中种植0.5～2×105细胞，不加抗生素，转染时细胞密度达到90～95％；
2)准备以下复合体A将DNA稀释于50μl无培养基中，轻轻混匀B Lipofectamine 2000用前混匀，取相应体积稀释于50μl无血清培养基，混匀，室温孵育5min(在30min内将稀释的脂质体与稀释的DNA混合)；
3)将稀释的脂质体与稀释的DNA混合，轻轻混匀，室温孵育20min(复合体于室温6小时内会保持稳定)；
4)将混合后的脂质体-DNA复合物100μl加入含培养基的细胞培养孔内，轻轻混匀。
实施例3.MTA1-siRNA及其表达载体pSilencer3.1-MTA1-siRNA沉默MTA1蛋白及其RNA的鉴定
以化学合成的双链干扰RNA转染食管癌细胞KYSE150，证实该片段能有效沉默MTA1蛋白及mRNA表达。以pSilencer3.1-MTA1-siRNA及空载质粒转染B16F10细胞，G418筛选，挑选阳性克隆，进行western blot及RT-PCR鉴定，证实了该载体同样能沉默细胞内MTA1蛋白及其mRNA的表达，但没有对其它蛋白的表达产生影响(参见图2、3)。
实施例4.MTA1-siRNA对KYSE150、pSilencer3.1-MTA1-siRNA对B16F10细胞体外迁移能力的影响及对侵袭能力的影响
以Boyden小室为模型进行了肿瘤细胞体外迁移能力的研究。将转染化学合成干扰片段MTA1-siRNA以及对照siRNA片段的KYSE150细胞各2×104种植于boyden小室上室，培养10小时。细胞经fibronectin包被的8μm聚碳酯膜进入膜的下层的能力反映了肿瘤细胞体外迁移能力。计数聚碳酯膜下表面的细胞数，进行统计分析。KYSE150-control和KYSE150-MTA1-siRNA细胞迁移至膜下表面的细胞数分别为442.67±42.55和158.33±27.79。与对照细胞相比，转染MTA1-siRNA的肿瘤细胞的体外迁移能力减弱(图4)。利用Boyden小室模型，聚碳酯膜经Matrigel包被，细胞经包被的聚碳酯膜微孔到达膜下表面的能力反映了细胞穿透细胞外基质的侵袭能力。将转染MTA1-siRNA和对照siRNA片段的KYSE150细胞各2×104种植于boyden小室上室，培养12小时。计数聚碳酯膜下表面的细胞，分别为369±44.03和131±19.97。对照细胞相比，转染MTA1-siRNA的肿瘤细胞的体外侵袭能力明显减弱(参见图4)。
以同样方法对B16F10细胞进行的研究中，将转染control vector、pSilencer3.1-MTA1-siRNA的B16F10细胞各2×104种植于boyden小室上室，37℃培养10小时，细胞经fibronectin包被的8μm聚碳酯膜进入膜的下层。计数聚碳酯膜下表面的细胞数。与对照细胞相比，转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的肿瘤细胞的体外迁移能力明显减弱(图4)。我们又以Boyden小室为模型，聚碳酯膜包被以Matrigel基质，将control vector和pSilencer3.1-MTA-siRNA转染的B16F10细胞各2×104种植上室，37℃培养12小时后观察通过膜微孔的细胞数，到达膜下表面的细胞数分别为423.33±35.64和163.67±33.86。与对照细胞相比，转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA的肿瘤细胞的体外侵袭能力明显减弱。不同处理的细胞体外侵袭能力如图4所示。
实施例5.MTA1-siRNA对KYSE150、pSilencer3.1-MTA1-siRNA对B16F10细胞粘附能力的影响
细胞粘附能力是细胞转移过程中的一个重要特性。细胞表面粘附分子起着直接作用。MTA1-siRNA和对照siRNA转染后的KYSE150细胞种植于Matrigel细胞外基质铺被的96孔板，在不同的时间点进行冲洗，残留的细胞即发生粘附的细胞，以MTT法在490nm检测粘附细胞的比率反映了细胞对细胞外基质的粘附能力。检测结果发现，在粘附的早期阶段，转染MTA1-siRNA的细胞粘附能力明显减弱。转染对照RNA和MTA1-siRNA的KYSE150细胞在30min的粘附率分别为42.376％±2.96％、21.63％±5.69％：60min的粘附率分别为51.42％±10.75％、32.74％±8.34％；90min的粘附率分别为72.67％±5.68％、45.25％±8.96％。(参见图5)
为了观察MTA1基因是否也影响了B16F10黑色素瘤细胞的体外粘附能力，将control vector、pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染的B16F10细胞种植于Matrigel细胞外基质铺被的96孔板，在不同的时间点进行冲洗，残留的细胞即发生粘附的细胞，以MTT法在490nm检测种植后不同时间点粘附细胞的比率。二种细胞在种植后15min的粘附率分别为15.51％±1.38％、13.17％±4.17％，30min的粘附率分别为29.42％±5.17％、11.40％±4.72％，60min的粘附率分别为45.72％±8.30％、14.68％±8.07％。在粘附的早期阶段，细胞转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒后粘附能力明显减弱(参见图5)，差异有显著性。
实施例6.MTA1-siRNA对KYSE150、pSilencer3.1-MTA1-siRNA对B16F10细胞细胞划痕愈合能力的影响
培养KYSE150细胞，经转染MTA1-siRNA及阴性对照siRNA 48小时后，重新种植细胞。在单层培养的细胞表面以tip头划一固定宽度的创伤口，创口愈合能力反映了细胞在培养支持物上的迁移能力。在8小时、16小时、24小时观察其划痕愈合情况，结果发现，转染MTA1-siRNA的细胞愈合速度明显低于转染阴性对照siRNA的细胞(见图6)。
培养转染质粒的B16F10细胞，以50×104每皿种植于35mm培养皿培养过夜。在单层培养的细胞表面以tip头划一固定宽度的创伤口，在8小时、16小时、24小时观察其愈合情况。结果发现，转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的细胞愈合速度明显低于对照细胞(见图6)。
实施例7.MTA1-siRNA对KYSE150、pSilencer3.1-MTA1-siRNA对B16F10细胞平板集落形成能力的影响
将转染对照siRNA和MTA1-siRNA的KYSE150细胞分别按每孔300个细胞接种35mm培养皿，两周后观察形成克隆的数量和大小，计数≥50个细胞的克隆数，计算克隆形成率。转染对照siRNA和MTA1-siRNA的细胞的克隆形成数分别为53.33±6.51和6.33±3.21。与对照组相比，MTA1-siRNA转染组的克隆形成率明显下降，差异有显著性(见图7)。
将转染control vector、pSilencer3.1-MTA1-siRNA的B16F10细胞分别按每孔300个细胞接种35mm培养皿，两周后观察形成克隆的数量和大小，计数≥50个细胞的克隆数，计算克隆形成率。二者的克隆形成数分别为45±8.89、5.33±2.52。与对照组相比，pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染组的克隆形成率下降，差异有显著性(见图7)。
实施例8.MTA1-siRNA对KYSE150、pSilencer3.1-MTA1-siRNA对B16F10细胞生长能力的影响
以阴性对照siRNA及MTA1-siRNA转染KYSE150细胞48小时后种植于96孔板，分别在种植细胞后1、2、3、4、5天采用MTT法检测细胞生长情况，画出生长曲线。与对照细胞相比，食管癌细胞系KYSE150转染MTA1-siRNA后细胞生长减慢。(见图8)
分别在96孔板种植2×103细胞/孔转染control vector与pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的细胞，并于1、2、3、4、5、6天采用MTT法检测细胞生长情况，画出生长曲线。与对照细胞相比，B16F10黑色素瘤细胞转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒后细胞生长减慢。表明MTA1对肿瘤细胞生长有促进作用(见图8)。
实施例9.pSilencer3.1-MTA1-siRNA对B16F10细胞周期的影响
用流式细胞仪检测转染control vector和pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的B16F10细胞周期情况。与转染对照质粒的B16F10细胞相比，转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的细胞G1期细胞增加，G2/S期细胞比例减少，差异有显著性(见图9)。
实施例10.MTA1基因对B16F10细胞C57小鼠致瘤能力的影响
为了观察MTA1基因对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响，本发明用B16F10来源的同系C57BL/6小鼠进行了MTA1基因影响B16F10细胞体内致瘤能力的动物实验研究。将转染control-vector与pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的B16F10细胞各5×104接种于小鼠右腋下，饲养24天。分别于12、15、18、21、24天测量肿瘤体积，并于最后一天处理荷瘤鼠，剥取肿瘤，称重并拍照，观察转染不同质粒的B16F10肿瘤细胞的体内成瘤能力。与转染对照质粒的细胞相比，转染MTA1-siRNA质粒的细胞成瘤能力明显下降。对照组的成瘤率为100％，而转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的实验组成瘤率为66.7％，6只实验小鼠有2只未形成可见的肿瘤，形成肿瘤的体积与重量均明显小于对照组细胞。对照组的平均瘤体积及平均瘤重分别为9052.97±3743.85(mm3)和9.67±2.70(g)，而pSilencer3.1-MTA1-siRNA转染组的平均瘤体积和平均瘤重分别为416.59±274.15(mm3)、0.41±0.22(g)。与对照组相比，转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的实验组肿瘤重抑制率为95.75％。经统计学分析，转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒实验组形成的肿瘤体积及肿瘤重量均明显小于对照组，差异显著(参见表1，图10)，pSilencer3.1-MTA1-siRNA干扰质粒转染抑制了肿瘤细胞的体内成瘤能力与生长。
表1B16F10细胞转染质粒后C57BL/6皮下种植模型结果
| 实验处理组 | 肿瘤体积(mm3) | 肿瘤重量(g) | 成瘤率(％) | 瘤重抑制率(％) |
| ControlPsilencer3.1-MTA1-siRNA | 9052.97±3743.85416.59±274.15 | 9.67±2.700.41±0.22 | 6/6(100)4/6(66.7) | 095.75 |
实施例11.MTA1基因对B16F10肿瘤细胞实验性肺转移能力的影响
为了进一步研究MTA1基因对肿瘤细胞体内转移能力的影响，发明人对转染过的B16F10肿瘤细胞进行了实验性肺转移的动物实验研究。将25×104不同处理的B16F10细胞经C57BL/6小鼠尾静脉注射建立肿瘤细胞实验性肺转移模型。经饲养21天后处理小鼠，取肺称重，计数肺部肿瘤转移结节的数目，并拍照。
参见表2以及图11，可见转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的实验组肺结节形成的数目明显少于对照组。对照组小鼠的肺已经全被黑色素瘤结节布满，肺体积变大，而转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA的实验组的肺，黑色素瘤结节少见，且结节也明显小得多，肺叶仍保持肉粉色。经计数对照组形成的肺结节数为64.6±27.25(个)，转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒的实验组形成肺结节数为10.8±11.88(个)。与对照组相比较，转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒组的肺结节形成抑制率为和83.28％，差异十分显著。实验后肺重量分别为对照组1.08±0.32(g)，转染pSilencer3.1-MTA1-siRNA组0.51±0.05(g)，差异有显著性，可见转染干扰质粒pSilencer3.1-MTA1-siRNA对肺部转移灶的形成有抑制作用。
表2B16F10细胞实验性肺转移模型结果
| 实验处理组(％) | 肺重量(g) | 肺结节数(个) | 肺结节抑制率 |
| ControlPsilencer3.1-MTA1-siRNA | 1.08±0.320.51±0.05 | 64.6±27.2510.8±11.88 | 083.28 |
Claims (9)
1.一种抑制哺乳动物包括人肿瘤转移的特异性干扰MTA1 mRNA的干扰RNA序列，其包括：
正义链5’-GAACATCTACGACATCTCCTT-3’
反义链3’-TTCTTGTAGATGCTGTAGAGG-5’。
2.一种含有如权利要求1所述的RNA序列的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述的载体包括pSilencer3.1-Hl neo。
4.根据权利要求1所述的RNA序列，其特征在于所述的肿瘤包括食管癌，肺癌，黑色素瘤，胃癌，结肠癌，宫颈癌以及其它高表达MTA1的恶性肿瘤。
5.一种药物组合物，其特征在于含有治疗有效剂量的如权利要求1所述的抑制肿瘤转移的特异性干扰MTA1 mRNA的干扰RNA序列，以及药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于所述的载体为病毒表达载体和非病毒表达载体，
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述的病毒表达载体包括腺病毒载体、逆转录病毒载体。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述的非病毒表达载体包括各种质粒载体。
9.根据权利要求1所述的RNA序列，其特征在于所述的干扰RNA序列为化学合成法合成双链干扰RNA(siRNA)和构建包含该RNA模板的质粒在细胞内转录成双链干扰RNA。
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Cited By (3)
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| CN103421738A (zh) * | 2012-05-18 | 2013-12-04 | 中国医学科学院肿瘤研究所 | Mta1及其抑制剂的制药用途 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103421738A (zh) * | 2012-05-18 | 2013-12-04 | 中国医学科学院肿瘤研究所 | Mta1及其抑制剂的制药用途 |
| CN103421738B (zh) * | 2012-05-18 | 2018-01-23 | 中国医学科学院肿瘤医院 | Mta1及其抑制剂的制药用途 |
| US9227956B2 (en) | 2013-04-17 | 2016-01-05 | Pfizer Inc. | Substituted amide compounds |
| CN107988254A (zh) * | 2017-10-18 | 2018-05-04 | 广东医科大学 | 一种mta1基因表达载体的构建与鉴定方法 |
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