CZ289155B6 - Izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosin fosforylázu, expresní vektor a protilátka - Google Patents
Izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosin fosforylázu, expresní vektor a protilátka Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289155B6 CZ289155B6 CZ19961868A CZ186896A CZ289155B6 CZ 289155 B6 CZ289155 B6 CZ 289155B6 CZ 19961868 A CZ19961868 A CZ 19961868A CZ 186896 A CZ186896 A CZ 186896A CZ 289155 B6 CZ289155 B6 CZ 289155B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mtase
- sequence
- cdna
- peptide
- dna
- Prior art date
Links
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 9
- MXYRZDAGKTVQIL-IOSLPCCCSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-2-methyloxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@]1(C)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O MXYRZDAGKTVQIL-IOSLPCCCSA-N 0.000 title description 6
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 title description 3
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 title description 3
- 108010034457 5'-methylthioadenosine phosphorylase Proteins 0.000 claims description 95
- 102100034187 S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase Human genes 0.000 claims description 86
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 32
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 7
- 101710201354 Metallothionein A Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012012 milestone trend analyses Methods 0.000 claims description 6
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101001014043 Puccinia graminis f. sp. tritici (strain CRL 75-36-700-3 / race SCCL) S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase 2 Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 5
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- WUUGFSXJNOTRMR-IOSLPCCCSA-N 5'-S-methyl-5'-thioadenosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CSC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 WUUGFSXJNOTRMR-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- WUUGFSXJNOTRMR-UHFFFAOYSA-N 5alpha-Hydroxy-3abeta,5beta,8-trimethyl-1-(1,5-dimethyl-hexen-(4)-yl)-4abetaH,7abetaH-dicyclopentano[a.d]cyclooctaen-(8) Natural products OC1C(O)C(CSC)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 WUUGFSXJNOTRMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022087 Granzyme M Human genes 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 108010043135 L-methionine gamma-lyase Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical group SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- PSLCKQYQNVNTQI-BHFSHLQUSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O PSLCKQYQNVNTQI-BHFSHLQUSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N Asp-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLFSBAPJTYKSLG-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RLFSBAPJTYKSLG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- MQFGXJNSUJTXDT-QSFUFRPTSA-N Ile-Gly-Ile Chemical compound N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O MQFGXJNSUJTXDT-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gly-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N Leu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100456048 Mus musculus Map4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- AJBQTGZIZQXBLT-STQMWFEESA-N Pro-Phe-Gly Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 AJBQTGZIZQXBLT-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- KAFKKRJQHOECGW-JCOFBHIZSA-N Thr-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 KAFKKRJQHOECGW-JCOFBHIZSA-N 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- ABSXSJZNRAQDDI-KJEVXHAQSA-N Tyr-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ABSXSJZNRAQDDI-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- BZMIYHIJVVJPCK-QSFUFRPTSA-N Val-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N BZMIYHIJVVJPCK-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 108010026364 glycyl-glycyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000030266 primary brain neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960000999 sodium citrate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Jsou pops ny polynukleotidy k duj c MTAsu, expresn vektory a protil tky k MTAse.\
Description
Oblast techniky
Vynález se týká polynukleotidu pro detekci deficitu methylthiodenosin fosforylázy v savčích buňkách, který je ukazatelem malignity u těchto buněk. Detekce buněk, které jsou na tento enzym deficitní, umožňuje zaměřit na tyto buňky chemoterapii využívající neschopnosti těchto buněk převádět methylthioadenosin a methionin.
Dosavadní stav techniky
Aminokyselina methionin (MET) je nezbytná pro růst normálních i maligních buněk. U určitých maligních buněk je tato potřeba absolutní, tzn. že bez adekvátní zásoby methioninu buňky hynou.
V savčích buňkách se MET získává ze tří zdrojů. Je možno jej získat z výživy nebo biochemickou syntézou MET z Lz-homocysteinu (homocystein) nebo methylthiodenosinu (MTA) (produkt biosyntetické dráhy polyaminů). V posledním případě se MTA převádí na MET pomocí methylthioadenosin fosforylázy (MTAsa; EC 2.4.2.28).
V poslední dekádě identifikovali výzkumníci četné maligní buněčné linie, kterým chybí MTAsa a které tudíž nemohou převádět MTA na MET. Například Katamari a d., Proč. Naťl Acad. Sci. USA 78: 1219-1223 (1981), uvádějí, že u 23 % ze 3 studovaných lidských maligních nádorových buněčných linií chyběla detekovatelná MTAsa, zatímco v každé ze 16 studovaných nemaligních buněčných linií byla aktivita MTAsy přítomna. Deficit MTAsy byl rovněž zaznamenán jako charakteristika nemalobuněčných rakovin plic (viz Nobori a d., Cancer Res. 53:1098—1101 (1981)), v 6 liniích buněk lymfomů a leukémií (id.), v buněčných liniích mozkového nádoru a tkáňových vzorcích primárního mozkového nádoru (id.). a v dalších malignitách (viz například Kries a d., Cancer Res. 33:1866-1869 (1973), Kries a d., Cancer Trmt. Rpts. 63:1069-1072 (1979), a Rangione a d., Biochem. J. 281:533-538 (1992)). MTAsa-negativní buňky principiálně uspokojují svou potřebu MET konverzí homocysteinu. Není-li však k dispozici homocystein, buňky obvykle hynou.
Je známo, že L-methionin-E-deamino-y-merkaptomethan lyáza (ED 4.4.1.11; METasa) degraduje nejen MET, ale také homocystein. Teoreticky je tedy možno zahubit maligní buňky, jimž chybí MTAsa (TJ. MTAsa-negativní buňky) degradací plazmového MET a homocysteinu METasou. Lze předpokládat že normální MTAsa-pozitivní buňky budou uspokojovat svou potřebu MET pokračující přeměnou MTE na MET.
Jednou z překážek vývoje úspěšného přístupu k vyvolání nedostatku MET u maligních buněk je potřeba identifikovat, které malignity jsou vhodnými cíli terapie, tj. které maligní jsou MTAsanegativní. Za tímto účelem byl vyvinut test, který zjišťuje, zdaje malignita MTAsa-negativní, ze stanovení, zda je v buněčné kultuře přítomna katalytická aktivita (Seidenfeld a d., Biochem. Biophys. Res. Comm. 95:1861-1866, 1980). Pro komerční nedostupnost radiochemického substrátu, potřebného pro test aktivity, však není dosud schůdné její použití při rutinních hodnoceních. Test aktivity navíc nepočítá s katalytickou labilitou MTAsy in vitro, jestliže detekuje, zda je v buněčné kultuře přítomen vůbec nějaký enzym bez ohledu na to, zda je katalyticky aktivní v době provádění testu.
Toto omezení testu aktivity by bylo možno překonat vyvinutím imunoanalýzy, která by byla dostatečně citlivá pro detekci relativně nepatrných množství enzymu. Ukázalo se však, že čištění enzymu MTAsy z přírodních zdrojů za účelem vývinu protilátek pro použití při imunologické
-1 CZ 289155 B6 detekci MTAsy je pracné a poskytuje relativně patné výtěžky (Rangione a d., J. Biol. Chem.
261:12324-12329,1986).
Neexistuje jednoduchého účinného prostředku identifikace MTAsa-deficitních buněk částečně přispívá k trvalé nedostupnosti účinného terapeutického přístupu k selektivnímu vyvolávání nedostatku MET in vivo v MTAsa-deficitních maligních buňkách. Tuto potřebu řeší tento vynález pomocí polynukleotidu, který kóduje MTAsu, použitelného pro detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti genu MTAsy ve vzorku.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosil fosforylázu, tj. MTAsu, vybraný z polynukleotidu majícího sekvenci nukleové kyseliny znázorněnou v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NOS 1 a polynukleotidu zahrnujícího pouze oblast kódující axony uvedené sekvence nukleových kyselin, jak jsou znázorněny na obr. 1.
Dále je předmětem vynálezu rekombinantní expresní vektor, obsahující uvedený polynukleotid, a protilátka, produkovaná imunizací živočicha alespoň jedním zMTAsových peptidů jako produktem exprese tímto vektorem. Rekombinantní MTAsu lze získat expresí MTAsy pomocí vhodného vektoru z polynukleotidu, který kóduje MTAsu. Dostupnost rekombinantní MTAsy umožňuje snadnější produkci vysoce čistého materiálu ve větším množství, než bylo možno dosáhnout podle Rengiona (viz výše) izolací a čištěním nativní MTAsy.
Zde používaný vraz „polynukleotid“ se vztahuje na polymer deoxyribonukleotidů nebo ribonukleotidů ve formě jednotlivého fragmentu nebo jako složku většího konstruktu. DNA, kódující MTAsu nebo MTAsový peptid podle vynálezu, může být sestavena z fragmentů cDNA nebo z oligonukleotidů, které poskytují syntetický gen, který je schopen exprese v rekombinantní transkripční jednotce. Polynukleotidové sekvence podle vynálezu zahrnují sekvence DNA, RNA a cDNA. Polynukleotidová sekvence může být dedukována z genetického kódu, avšak je nutno brát v úvahu degeneraci kódu. Polynukleotidy podle vynálezu zahrnují sekvence, které jsou degenerované v důsledku genetického kódu.
Peptidy a polynukleotidy podle vynálezu zahrnují funkční deriváty MTAsy, MTAsové peptidy a nukleotidy, které je kódují. „Funkční deriváty“ se rozumějí „fragmenty“, „varianty“, „analogy“ nebo „chemické deriváty“ molekuly. „Fragrent“ molekuly, například kterýkoli z polynukleotidů podle vynálezu, zahrnuje jakoukoli nukleotidovou podjednotku molekuly. „Varianta“ takové molekuly se vztahuje na přirozeně se vyskytující molekulu, vpodstatě podobnou buď celé molekule nebo jejímu fragmentu. ,,Analog“ molekuly se vztahuje na nepřirozenou molekulu, v podstatě podobnou buď celé molekule nebo jejímu fragmentu.
Molekula se označuje za „v podstatě podobnou“ jiné molekule, je-li sekvence aminokyselin v obou molekulách, nebo v případě polynukleotidů sekvence aminokyselin produkovaná oběma molekulami, v podstatě stejná. Molekuly s v podstatě podobnými aminokyselinami budou mít podobnou biologickou aktivitu. Pokud tedy mají dvě molekuly podobnou aktivitu, považují se varianty ve zde používaném smyslu toho výrazu i v případě, že jedna z molekul obsahuje další aminokyselinové zbytky, které se nenacházejí ve druhé, nebo jestliže sekvence aminokyselinových zbytků není identická.
Molekula se zde označuje za „chemický derivát“ jiné molekuly, jestliže obsahuje další chemické jednotky, které normálně nejsou součástí molekuly. Tyto jednotky mohou zlepšovat rozpustnost, absorpci, biologický poločas atd. molekuly. Alternativně mohou tyto jednotky snižovat toxicitu molekuly, eliminovat nebo zeslabovat její nežádoucí vedlejší účinky atd. Jednotky schopné zprostředkovat takovéto účinky jsou popsány například v Remingtonů Pharmaceutical Science, 16. vyd., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).
-2CZ 289155 B6
Menší modifikace primární sekvence aminokyselin MTAsy mohou vést k proteinům, které mají v podstatě ekvivalentní aktivitu v porovnání s enzymem MTAsou a peptidy podle vynálezu. Tyto modifikace mohou být záměrné, například místně řízenou mutagenezí, nebo spontánní. Do rozsahu vynálezu spadají všechny proteiny a peptidy, vzniklé těmito modifikacemi, pokud u nich ještě existuje biologická aktivita MTAsy. Delece jedné nebo více aminokyselin může dále také vést k modifikaci struktury vznikající molekuly bez významného pozměnění její biologické aktivity. Na základě toho je možno vyvinout menší aktivní molekulu, která by měla širší použití. Například je možno odstranit amino- nebo karboxyterminální aminokyseliny, které nemusejí být nezbytné pro požadovanou katalytickou nebo antigenní aktivitu enzymu.
Výraz „konzervativní variace“ zde označuje náhradu aminokyselinového zbytku jiným, biologicky podobným zbytkem. Příklady konzervativních variací zahrnují náhradu hydrofobního zbytku jiným, jako je izoleucin, valin, leucin nebo methionin, nebo náhradu polárního zbytku jiným polárním zbytkem, například náhradu lysinu argininem, kyseliny asparagové kyselinou glutamovou nebo asparaginu glutaminem apod. Výraz „konzervativní variace“ zahrnuje rovněž použití substituované aminokyseliny namísto stejné nesubstituované aminokyseliny za předpokladu, že protilátky, vytvořené proti substituovanému polypeptidu, také imunoreagují s nesubstituovaným polypeptidem.
Sekvence DNA pro použití při produkci MTAsy a MTAsových peptidů podle vynálezu je rovněž možno získat různými metodami. Například je možno DNA izolovat pomocí známých hybridizačních postupů, které zahrnují, aniž by se na ně omezovaly: 1) hybridizaci sond s genomovou cDNA nebo s knihovnami cDNA za účelem detekce sdílených nukleotidových sekvencí, 2) protilátkový screening expresních knihoven za účelem detekce sdílených strukturních rysů a 3) syntézu řetězovou reakcí s polymerázou (PCR).
Hybridizační postupy jsou vhodné pro screening rekombinantních klonů s použitím značených smíšených syntetických oligonukleotidových sond, kde každá sonda je potenciálně kompletním komplementem specifické sekvence DNA v hybridizačním vzorku, který zahrnuje heterogenní směs denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace pro takovýto screening se přednostně provádí buď na jednořetězcové DNA nebo denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace je použitelná zejména pro detekci klonů cDNA, odvozených ze zdrojů, kde je přítomno extrémně malé množství sekvencí mRNA, vztahujících se k příslušnému polypeptidu. Jinými slovy je tedy možno při použití přísných podmínek hybridizace zaměřených na zamezení nespecifické vazby například umožnit autoradiografické zobrazení specifického klonu cDNA hybridizaci cílové DNA s touto jedinou sondou ve směsi.
Knihovna cDNA, obsahující MTAsu, může být podrobena screeningu injekcí různých mRNA, odvozených od cDNA, do oocytů, ponecháním dostatečného času pro expresi genových produktů cDNA a testováním na přítomnost požadovaného expresního produktu cDNA, například použitím protilátky specifické pro MTAsu nebo použitím sond pro opakující se jednotky a tkáňové expresní vzorce charakteristické pro MTAsu. Alternativně je možno knihovnu cDNA podrobit nepřímo screeningu na MTAsové peptidy, mající alespoň jeden epitop, použitím protilátek specifických pro tyto polypeptidy. Jak je popsáno dále v odstavci C, mohou být takovéto protilátky odvozené buď polyklonálně nebo monoklonálně a mohou být použity k detekci expresního produktu, ukazujícího na přítomnost cDNA MTAsy.
Screeningové postupy, používající hybridizaci nukleových kyselin, umožňují izolovat jakoukoli genovou sekvenci z jakéhokoli organismu, pokud je k dispozici příslušná sonda. Oligonukleotidové sondy, které odpovídají části sekvence kódující daný protein, mohou být syntetizovány chemicky. K tomu je nutno znát krátké oligopeptidové úseky sekvence aminokyselin. Sekvence DNA kódující protein může být odvozena z genetického kódu, avšak je nutno vzít v úvahu degeneraci kódu. Je-li sekvence degenerovaná, je možno provádět smíšenou adiční reakci. Ta zahrnuje heterogenní směs denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace pro
-3CZ 289155 B6 takovýto screening se přednostně provádí buď na jednořetězcové DNA nebo denaturované dvouvláknové DNA.
Vývoj specifických sekvencí DNA kódujících MTAsu nebo její fragmenty je možno rovněž uskutečnit: 1) izolací sekvencí dvouvláknové DNA z genomové DNA, 2) chemickou výrobou sekvence DNA k získání potřebných kodonů pro daný polypeptid a 3) syntézou sekvence dvouvláknové DNA in vitro reverzní transkripcí mRNA, izolované z eukaryotické donorové buňky. V posledně uvedeném případě se nakonec jako komplement mRNA vytvoří dvouvláknová DNA, která se obvykle označuje cDNA.
Podle vynálezu je možno vložit polynukleotid a jakékoli jeho varianty kódující MTAsu do rekombinantního expresního vektoru. Výraz „rekombinantní expresní vektor“ označuje plazmid, virus nebo jiné známé vehikulum, které bylo podrobeno manipulaci inzercí nebo zabudováním příslušných genetických sekvencí. Takovéto expresní vektory obsahují promotorovou sekvenci, která usnadňuje účinnou transkripci vložené genetické sekvence hostitele.
Transformaci hostitelské buňky pomocí rekombinantní DNA je možno rovněž provádět konvenčními metodami, známými odborníkům. Hostitelské buňky mohou být eukaryotické (jako jsou ovariální buňky čínského křečka) nebo prokaryotické (jako jsou bakterie nebo kvasinky). Je-li hostitel prokaryotický, například E. coli, je možno z buněk získaných po exponenciální fázi růstu připravit kompetentní buňky, které jsou schopny přijmout DNA, a zpracovat je metodou CaCI2 známými postupy. Alternativně je možno použít MgCl2 nebo RbCl. Transformaci je možno rovněž provádět po vytvoření protoplazmy k hostitelské buňce nebo elektroporací.
Izolaci a čištění mikrobiálně exprimované MTAsy nebo jejích fragmentů podle vynálezu může odborník provádět běžnými metodami, zahrnujícími preparativní chromatografii a imunologické separační metody s použitím monoklonálních nebo polyklonálních protilátek.
Na základě informací obsažených v SE ID NO 1 je možno snadno odvodit sekvenci aminokyselin plné délky MTAsy. S použitím těchto informací je rovněž možno bez přílišného experimentování syntetizovat MTAsu a MTAsové peptidy s použitím běžných metod, jako je ochrana a-aminoskupin pomocí t-BOC nebo FMOC. Obě metody zahrnují postupnou syntézu, při níž se v každém stupni přidává jedna aminokyselina počínaje C-koncem peptidu (viz Coligan a d., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 991, unit 9). Peptidy podle vynálezu je možno rovněž syntetizovat různými známými metodami syntézy peptidů v pevné fázi, jak jsou popsány například Merrifieldem, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1962), a Stewartem a Youngem, Solid Phase Peptides Synthesis (Freeman, San Francisco, 27-62, 1969), s použitím kopoly(styren-divinylbenzen) s obsahem 0,1 až 1,0 mmol aminů/g polymeru.
Při této posledně uvedené metodě je možno po dokončení chemické syntézy sejmout z peptidů chránící skupiny a peptidy odštěpit od polymeru působením kapalné HF s 10 % anisolu při 0 °C po dobu asi 1/4 až 1 h. Po odpaření reakčních činidel se peptidy extrahují z polymeru 1% roztokem kyseliny octové, který se pak lyofilizuje a získá se surový materiál. Ten je možno normálně přečistit metodami, jako je gelová filtrace na Sephadexu G-15 s 5% kyselinou octovou jako rozpouštědlem. Lyofilizací příslušných frakcí sloupce se získá homogenní peptid nebo deriváty peptidu, které pak mohou být charakterizovány standardními metodami, jako je analýza aminokyselin, tenkovrstvá chromatografie, vysokoúčinná kapalinová chromatografie, ultrafialová absorpční spektroskopie, molámí rotace, rozpustnost, a kvantifikovaný Edmanovou degradací pevné fáze.
Produkce protilátek proti MTAse
Antigenicita MTAsových peptidů může být stanovena konvenčními metodami zjišťování velikosti protilátkové odezvy živočicha, který byl imunizován peptidem. Jako MTAsové peptidy k vyvolání tvorby protilátek proti MTAse se obecně používají takové peptidy, které indukují
-4CZ 289155 B6 produkci vysokých titrů protilátky stelativně vysokou afinitou kMTAse. Takovéto peptidy mohou být pro použití jako imunogeny čištěny například metodou popsanou Rangionem a d.
(J. Biol. Chem. viz výše) nebo výše popsanými metodami získávání MTAsových peptidů.
Jakmile jsou připraveny antigenní peptidy, získají se protilátky k imunizujícímu peptidu zavedením peptidu do savce (jako je králík, myš nebo krysa). Pro ilustraci jsou v připojeném seznamu sekvencí uvedeny aminokyselinové sekvence dvou antigenních MTAsových peptidů jako SEQ ID. NO. 2 a 3. Protilátky, produkované králíky, imunizovanými těmito peptidy, vykázaly 50 % maximální odpovědi na čištěnou MTAsu při ředění 1:1500, resp. 1:4000.
Pro imunizaci živočichů antigenními MTAsovými peptidy se přednostně používá imunizační protokol s vícerázovou injekcí (viz například langone a d., ed., „Production of Antisera with Amall Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections“, Methods of Enzymology (Acad. Press, 1981)). Příznivou protilátkovou odpověď je možno získat například u králíků při intradermální injekci 1 mg antigenního MTAsového peptidu emulgovaného v kompletním Freudově adjuvans, po níž za několik týdnů následuje jedna nebo několik posilovačích dávek téhož antigenu v neúplném Fraeundově adjuvans.
Je-li to žádoucí, je možno imunizující peptid navázat na nosný protein konjugací s použitím známých metod. Běžně používané nosiče, používané nosiče, které se chemicky navazují na peptid, zahrnují hemocyanin přísavky keyhole limpet (KLH), thyreoglobulin, bovinní sérový albumin (BSA) a tetanový toxoid. Navázaný peptid se pak použije k imunizaci živočicha (například myši nebo králíka). Jelikož se má v současnosti za to, že MTAsa je zachovávána mezi savčími druhy, je použití nosného proteinu ke zvýšení imunogenicity MTAsových proteinů preferováno.
Polyklonální protilátky, produkované imunizovanými živočichy, mohou být dále čištěny, například vazbou a elucí na matrici, kníž je navázán peptid, proti němuž byly vyvolány protilátky. Odborníkům jsou známy různé metody, běžné v oboru imunologie pro čištění a/nebo koncentraci polyklonálních protilátek, stejně jako monoklonálních protilátek (viz například Coligan a d., Unit 9, Current protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).
Pro přípravu monoklonálních protilátek je preferována imunizace myší nebo krys. Výraz „protilátka“ zde rovněž zahrnuje intaktní molekuly a jejich fragmenty, jako jsou například Fab a F(ab')2, které jsou schopné vázat epitopovou determinantu. V tomto kontextu se rovněž výraz „mAb podle vynálezu“ vztahuje na monoklonální protilátky specifické pro MTAsu.
Obecná metoda produkce hybridomů vylučujících monoklonální protilátky („mAb“) je známa (Kohler a Milstein, Nátuře 256:495,1975). Stručně řečeno zahrnovala metoda popsaná Kohlerem a Milsteinem izolaci lymfocytů z regionálních odtékajících mízních uzlin pěti různých pacientů buď s melanomem, teratokarcinomem nebo rakovinou čípku, gliomu nebo plic. Lymfocyty byly získány z chirurgických vzorků, spojeny a pak fúzovány s SHFP-1. Hibridomy byly podrobeny screeningu na produkci protilátky, která se vázala na rakovinné buněčné linie.
Potvrzená MTAsové specifícity mezi mAb je možno provádět pomocí relativně rutinních metod screeningu (například enzymová imunoanalýza ELISA) za účelem stanovení elementárního reakčního schématu příslušné mAb.
Bez zbytečné experimentální práce je rovněž možno hodnotit mAb za účelem stanovení, zda má stejnou specificitu jako mAb podle vynálezu, stanovením, zda testovaná mAb brání vazbě mAb podle vynálezu na MTAsu, izolovanou výše popsaným způsobem. Jestliže testovaná mAb soutěží s mAb podle vynálezu, což je patrné z poklesu vazby mAb podle vynálezu, pak je pravděpodobné, že se obě monoklonální protilátky vážou na stejný nebo blízký příbuzný epitop.
-5CZ 289155 B6
Další možností, jak zjistit, zda má mAb stejnou specificitu jako mAb podle vynálezu, je preinkubace mAb podle vynálezu s antigenem, s nímž normálně reaguje, a stanovení, zda testovaná mAb je inhibována ve své schopnosti vázat tento antigen. Je-li testovaná mAb inhibována, pak se vší pravděpodobností má stejnou nebo blízce příbuznou epitopovou specificitu jako mAb podle vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje make genu pro MTAsu a umístění exonů v polynukleotidu. Předpokládané exony jsou podtrženy; předpokládané introny jsou označeny jednou nebo více náhradami bází v polynukleotidové sekvenci symboly „N“. Sekvence, znázorněná na obr, 1, odpovídá sekvenci, uvedené v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je blíže osvětlen na příkladech provedení, které však neomezují jeho rozsah.
V příkladech jsou použity tyto zkratky: AS = pozitivní; DTT = dithiothreitol; min = minuta; MTAsa = 5'-deoxy-5'-methylthioadenosin fosforyláza; PCR = polymerázová řetězová reakce; S = negativní; SSc = 0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrát dihydrát; v/v = objem na objem; SDS = dodecylsulfát sodný.
Příklad I
Test katalytické aktivity MTAsy ve vzorku
Fosforolytická aktivita MTAsy byla stanovena měřením tvorby [methyl-14C]-5-methylthioribosa-l-fosfátu z [methyl14C]-5'-deoxy-5'-methylthioadenosinu (Seidenfeld a d., Biochem. Biophys. Res. Commun. 95, 1861-1866, 1980). V celkovém objemu 200 μΐ obsahovala standardní reakční směs 50 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4, 0,5 mM [methyl-14C]-5'-deoxy-5'-methylthiodenosinu (2.105 CPM/mmol), 1 mM DTT a uvedené množství enzymu. Po 20 min inkubace při 37 °C byla reakce zastavena přídavkem 50 μΐ 3M trichloroctové kyseliny a 200μ1 alikvoty byly naneseny na sloupec 0,6 x 2 cm „Dowex“ 50-H* ekvilibrovaný s vodou. [Methyl-14C]-5-methylthioribosa-l-fosfát byl eluován přímo do scintilačních nádobek obsahujících 2 ml 0,1 M HC1.
Příklad II
Čištění nativní MTAsy z krysích jater
MTAsa byla izolována z krysích jater modifikací metody Rangiona a d. (J. Biol. Chem. 261, 12324-12329, 1986). 50 g čerstvých krysích jatek bylo homogenizováno vmísiči Waring Blendor se 4 objemy lOmM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4, obsahujícího 1 mM DTT (pufru A). Homogenizát byl odstředěn (1 h při 15000 g) a vzniklý supematant byl podroben frakcionaci síranem amonným. Precipitát mezi 55 a 75 % nasycení byl shromážděn odstředěním (15000 g po dobu 20 min) a rozpuštěn v minimálním objemu pufru A. Vzorek pak byl dialyzován přes noc proti třem dávkám 100 objemů téhož pufru.
Vzorek byl vyčiřen odstředěním při 15000 g po dobu 30 min a pak nanesen na sloupec DEAESephacryl (1,5x18 cm, Pharmacia), předem ekvilibrovaný pufrem A. Po promytí 80 ml
-6CZ 289155 B6 ekvilibračního pufru byl aplikován lineární gradient (80 ml) 0 až 0,3 M NaCl v pufru A. MTAsová aktivita byla eluována mezi 0,1 a 0,15 M NaCl. Frakce obsahující alespoň 0,06 jedn./mg proteinu byly 20krát zahuštěny ultrafiltrací (membrány Diaflow Amicon PM-10) a intenzivně dialyzovány proti 25 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4 s obsahem 1 mM DTT (pufr B). Pak byl vzorek nanesen na sloupec hydroxyapatitu (1 x 12 cm; Bio-Rad). Po eluci nenaabsorbovaných proteinů pufrem B byl sloupec promyt asi 40 ml 50mM fosfátového pufru o pH 7,4 s obsahem 1 mM DTT.
Pak byla eluována MTAsa s použitím lineárního gradientu (40 ml) 50 až 250 mM fosforečnanu draselného, pH 7,4. Frakce obsahující MTAsovou aktivitu byly 30krát zahuštěny ultrafiltrací a zbaveny dithiothreitolu opakovaným koncentrováním a ředěním 50mM fosfátovým pufrem opH 7,4. Částečně přečištěný enzym pak byl nanesen na sloupec (0,8 x 3 cm) organortuťnaté agarózy (Bio-Rad), ekvilibrované 50 mM fosfátovým pufrem o pH 7,4. Eluce sloupce byla prováděna postupně a) 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, b) 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, 2 M KC1, a c) 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, 2 M KC1, 40 mM 2-mrkaptoethanolu. Enzym pak byl eluován 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, 2 M KC1, 200 mM 2-merkaptoethanolu. Frakce obsahující alespoň 3 jedn./mg proteinu byly spojeny, zahuštěny ultrafiltrací na 1 ml a dialyzovány přes noc proti 1000 obj. 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, 1 MDTT (pufr C). V posledním stupni čištění byly alikvoty vzorku (1 ml) nastřikovány v množství 1 ml/min do kolony „MONO Q“ (Pharmacia), preekvilibrované 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, s obsahem 1 mM DTT a byly jímány frakce 0,5 ml. MTAsová aktivita byla eluována mezi 0,08 a 0,14 M NaCl v pufru C. Frakce byly ultrafiltrací zahuštěny na 0,5 ml a dialyzovány proti 1000 objemů pufru B.
Přiklad III
Stanovení částečné sekvence aminokyselin proti krysí MTAsu
Přečištěný vzorek byl lyofilizován, rozpuštěn v 50 μΐ nosného pufru (1 % dodecylsulfátu sodného (SDS), 10 % glycerinu, 0,1 M DTT a 0,01 % bromfenolové modře) a nanesen na 0,5 mm tlustý polyakrylamidový gel s 10% SDS (zařízení Bio Rad „MINIGEL“). Po elektroforéze byly proteiny přenášeny elektroblottingem po dobu 2 h na ntirocelulózu (velikost pórů 0,45 mm, Millipore) v systému transblot Bio-Rad s použitím přenosového pufru (15 mM Tris, 192 mM glycinu a 20 % methanolu, pH 8,3), popsaného Towbinem a d. (Proč. Naťl Acad. Sci. USA 76, 4340-4345, 1979).
Po přenosu byly proteiny reverzibilně obarveny pomocí Ponceau S (Sigma) modifikovanou metodou, popsanou Salinovichem a Montelarem (Anal. Biochem. 156, 341-347, 1987). Nitrocelulózový filtr byl pomořen na 60 sdo roztoku 0,1 % barviva Ponceau Sv 1% vodné kyselině octové. Přebytečné zbarvení bylo odstraněno mírným třepáním po dobu 1 až 2 min v 1% vodné kyselině octové. Oblast obsahující protein, detekovaná barvením, byla vyříznuta, přenesena do Eppendorfory zkumavky (1,5 ml), promyta destilovanou vodou a inkubována po dobu 30 min při 37 °C v 1,2 ml 0,5 % polyvinylpyrrolidonu (průměrná molekulová hmotnost 40000, PVP-40, Sigma), rozpuštěného ve 100 mM kyseliny octové, za účelem zabránění absorpci proteázy na nitrocelulózu během digesce. Přebytek PVP-40 byl odstraněn intenzivním promytím vodou (alespoň 5 dávek).
Nitrocelulózové proužky pak byly nařezány na malé kousky o velikosti přibližně 1 mm x 1 mm a vloženy zpět do téže zkumavky. Protein na nitrocelulóze byl digerován dříve popsaným způsobem (Los a d., Science 243:217-220, 1989). Přidá se trypsin (10 pmol) ve 100 μΐ lOOmM Tris-HCl, pH 8,2/acetonitril, 95:5 (v/v) a provede se inkubace přes noc při 37 °C. Po digesci byl supematant obsahující peptid okyselen 30 μΐ 10% trifluoroctové kyseliny, přemístěn rychle na zařízení Vortex a odstřeďován 1 min při 15000 g. Supematant byl odebrán a okamžitě nastříknut na systém HPLC s reverzními fázemi (Beckmann), vybavený analytickou kolonou Brownlee Aquapore Bu-300 (2,1 x 100 mm).
-7CZ 289155 B6
Do kolony byl po dobu 5 min rychlostí 200 μΐ/min čerpán eluent D - 0,1% triofluoroctová kyselina (čistota pro sekvenování, ve vodě), načež byl průtok snížen na 100 μΐ/min a byl započat gradient eluentu E (0,08 až 0,095% trifluoroctová kyselina v acetonitril/H2O 70:30 v/v). Frakce, obsahující peptid podle absorpce UV při 215 nm, byly manuálně sebrány do Eppendorfových zkumavek. Reprezentativní frakce 60 a 77 byly podrobeny sekvenční analýze aminokyselin (ABI477A Protein Sequencer son-line analyzátorem PTH-AA 120A). Tak byly získány nezávislé částečné sekvence aminokyselin krysí MTAsy. Sekvence aminokyselin peptidů označených jako peptid 1 (frakce 60) a peptid 2 (frakce 77) jsou znázorněny jako SEQ ID NO 5 až 6.
Příklad IV
Amplifikace fragmentu DNA kódujícího část lidského genu MTAsy
Na základě částečných sekvencí aminokyselin peptidů 1 (SEQ ID NO 4) a 2 (SEQ ID NO 5) byly syntetizovány dvě sady oligonukleotidových primerů s různými polaritami. Každý oligonukleotid byl navržen tak, aby obsahoval jediné restrikční místo na 5'-konci (EcoRI nebo BamHI) pro usnadnění následného klonování amplifikovaného fragmentu DNA. Pro použití při amplifikaci PCR byla izolována totální cDNA z 1 milionu jednotek tvořících plak (plague forming units, pfu) z genové knihovny cDNA lidské plachety (Clontech) pomocí kitu „Lambda-Trap“ (Clontech). PCR reakce byla prováděna v celkovém objemu 100 μΐ, obsahujícím 1 pg totální cDNA z genové knihovny cDNA lidské placenty, 1 x PCR pufr (10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl2), 0,2 mM každého dNTP, po 100 mg negativního a pozitivního primerů a 10 jednotek Taq DNA polymerázy, Stoffel Fragment („AMPLI TAQ“, Perkin-Elmer Cetus).
Se systémem „GENE AMP“ PCR Systém 9600 (Perkin-Elmer Cetus) bylo provedeno 40 cyklů, sestávajících vždy zdenaturace (92 °C, 1 min), teplotní hybridizace (55 °C, 2 min) a prodlužování (72 °C, 2 min). PCR produkt byl oddělen elektroforeticky na 0,8% agarózovém gelu v pufru 1 x TA (40 mM Tris-acetát, 20 mM Na-acetát, 2 mM EDTA, pH 7,9) a byl amplifikován fragment DNA 450 bp. Produkt amplifikace PCR byl dvakrát digerován s restrikčními enzymy EcoRI/BamHI, rozdělen na 0,8% agarózovém gelu v pufru 1 x TA, získán z gelu pomocí kitu „GENE CLEAN“ (Biol01), subklonován do vektoru pBluescript SK+ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRI/BamHI, a sekvenován dideoxyterminační metodou s použitím univerzálního sekvenčního primem (kit pro sekvenování DNA „SEQUENASE“ verze 1,0, USB).
Příklad V
Screening genové knihovny cDNA lidské placenty
Sekvenční analýza amplifikovaného produktu PCR (příklad IV) vykazuje dokonalou shodu s C-terminální sekvencí aminokyselin peptidů 1 (SEQ ID NO 5). S použitím fragmentu DNA 450 bp jako hybridizační sondy byla podrobena screeningu genové knihovny cDNA lidské placenty (Clontech). Za tím účelem byly hostitelské buňky kmene Y1090 E. coli inkubovány při 37 °C přes noc za intenzivního třepání v médiu LB (na litr: 10 g tryptonu, 5 g kvasničkového extraktu, 10 g NaCl), obsahujícím 0,2 % maltózy a 10 mM MgSP. Pro každou kultivační plotnu bylo 0,3 ml kultury hostitelských buněk smíseno s 3.104 pfu fágů a inkubováno 20 min při 37 °C. Směsi hostitelských buněk a fágů byly přidány k 8 ml média LB, obsahujícího 0,7 % agarózy (LB na agaróze), které bylo předehřáto na 48 °C, a nality na 20 agarových ploten (135 x 15 mm). Po 6 až 8 h inkubace při 37 °C byly viditelné plaky a desky byly po dobu 1 h chlazeny na 4 °C. Plaky byly přeneseny na dobu 3 min na nylonové přenosové membrány Colony /Plague Screen (NEN Research Products, Dupont Boston, MA) a pak denaturovány (dvakrát v 0,5 N NaOH po
-8CZ 289155 B6 dobu 2 min), renaturovány (dvakrát v 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5 po dobu 2 min) a fixovány sušením na vzduchu. Prehybridizace 20 membrány byla provedena po dobu 4 h při 42 °C ve dvou plastových pytlích po 10 membránách s použitím 20 ml prehybridizačního pufru (1 % SDS, 2 x
SSC, 10 % dextransulfátu, 50 % deionizovaného formamidu).
Fragment EcoRI-BamHI 450 bp části lidského genu MTAsy byl označen [a-32P]dATP (3000 Ci/mmol) s použitím kitu pro posun jednořetězového zlomu (Boehringer Mannheim), oddělen od nezabudované radioaktivity na koloně NICK (Pharmacia), denaturován zahřátím na 96 °C po dobu 10 min, ochlazen na ledu a přidán k membránám v plastových pytlích s koncentrací sondy 106dpm/ml. Specifická aktivita značené sondy je kolem 108 dpm/pg. Hybridizace byla prováděna přes noc při 42 °C. Po hybridizaci byly membrány promyty třilaát po 5 min při teplotě místnosti přebytkem 2 x SSC, pak 20 min při 65 °C 2 x SSC, 0,1 % SDS ajednou 20 min při teplotě místnosti 0,2 x SSC, 0,1 % SDS. Promyté membrány byly přes noc vystaveny rentgenovému filmu.
Agarové výřezy, obsahující několik plaků kolem pozitivního signálu, byly přeneseny do 1 ml sterilního ředidla fágů (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 MNaCl, 8 mM MgSO4, 0,01 % želatiny) a podrobeny znovu screeningu výše popsaným způsobem do získání čistých pozitivních plaků. Ze screeningu přibližně půl milionu plaků bylo získáno 6 nezávislých pozitivních klonů. Po amplifikaci na plotnách LB byla každá fágová DNA pozitivních klonů čištěna s použitím kitu „Lambda-TRAP“ (Clontech). Za účelem získání celého inzertu byly čištěné fágové DNA rozštěpeny enzymem EcoRi, ale v důsledku existence místa EcoRi uvnitř inzertu byly ze všech klonů vyříznuty dva pásy.
Dva fragmenty inzertu EcoRi (850 a 1100 bp) z reprezentativního fágového klonu, označeného MTAp-1, byly subklonovány do vektoru pBluescript SK+ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRi. Tyto subklony byly označeny MTAP-2 (850 bp) a MTAP-3 (IlOObp). Restrikční analýzou a sekvenováním DNA těchto dvou subklonů bylo zjištěno, že subklon MTAP-2 má na C-konci otevřený čtecí rámec kódující 254 aminokyselin, obsahujících sekvenci aminokyselin odpovídající peptidu 3 (90 % homologie). Počítáno z molekulové hmotnosti MTAsy 32 kDA (F. D. Rangione a d., J. Biol. Chem. 261:12324-12329, 1986), pokrývá 85 % celého proteinu. Chybí asi 50 aminokyselin (alespoň 150 bp na úrovni DNA).
Příklad VI
Prodlužování primeru pro získání chybějícího 5'-konce cDNA MTAsy
K získání chybějícího 5'-terminálního fragmentu byla použita metoda RACE (rapid amplification of cDNA ends;, Loh a d., Science 243:217-220, 1989; Frohman a d., PNAS 85:8998-9002, 1988), 1 pg póly (A+) RNA z lidské placenty (Clontech) v 6,25 μΐ H2O byl 5 min zahříván na 65 °C, zchlazen na ledu a přidán ke 4 μΐ pufru 5 x RTC (250 mM Tris-HCl, pH 8,15, 30 mM MgCl2, 200 mM KC1, 5 mM DTT), 4 μΐ (0,4 mg/ml) aktinomycinu D (Boehringer), po 1 pg každého dNTP (20 mM), 0,25 μΐ (10 jednotek), RNasinu (Boehringer), 1 μΐ [a-35S]dATP (1443 Ci/mmol), 1 μΐ pozitivního oligonukleotidu 3 AS, specifického pro lidskou MTAsu, a 10 jednotkám reverzní transkriptázy viru ptačí myeloblastózy (Boehringer). Směs byla inkubována 2 h při 42 °C.
Přebytek primeru a dNTP byl odstraněn tímto způsobem. 20μ1 pool cDNA byl nanesen na kolonu NICK (Pharmacia) a byly jímány dvoukapkové frakce. Frakce 5 až 8, příslušející prvnímu píku radioaktivity, byly spojeny, bylo provedeno srážení po dobu 2 h při -80 °C s 1/10 objemu 7,5MNHOAc a 2,5 objemu ethanolu, odstřeďování po dobu 30 min při 4°C při 15000 g, promytí 0,5 ml 80% ethanolu, sušení za sníženého tlaku (Speedvac) a rozpuštění ve 20 μΐ H2O. Po zakončení bylo přidáno 1,5 μΐ dGTP (20 mM), 2,4 μΐ CoCl2 (25 mM), 6 μΐ 5 x zakončovacího
-9CZ 289155 B6 pufru (1 mM kakodylát draselný, 125 mM Tris-HCl, pH 6,6, 1,25 mg/ml bovinního sérového albuminu) a 0,5 μΐ (15 jednotek) terminální deoxynukleotidyltransferázy (Boehringer).
Směs byla inkubována 1 h při 37 °C, zahřívána 15 min při 65 °C, extrahována jednou stejným objemem pufru TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), nasyceného fenolem a pak vysráženy výše popsaným způsobem ethanolem. Pool zakončené cDNA byl rozpuštěn ve 20 μΐ H° a 1 μΐ byl použit pro PCR. Pro amplifikací byly syntetizovány další dva primery. Jedním byl pozitivní primer specifický pro MTAsu, který je umístěn o 180 bp proti směru exprese od polohy oligonukleotidu 3AS. Druhým byl primer pro konec poly(G). Amplifikace byla prováděna stejně jako výše popsaným způsobem po dobu 40 cyklů. Každý cyklus sestával z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (2 min, 50 °C) a prodlužování (0,5 min, 72 °C).
Produkt PCR byl elektroforeticky rozdělen na 0,8% agarózovém gelu. Získaný fragment DNA 520 bp byl specificky amplifikován. Po provedené, čištění na 0,8% agarózovém preparativním gelu byl fragment DNA 520 bp digerován s Not I a Bel I (příslušná restrikční místa přítomná v překrývající se doméně mezi prodlouženým fragmentem DNA a původním fragmentem subklonu MTAP-2) a subklonován do vektoru pBluescript SK+ (Stratagene), vyříznutého pomocí Not Ι/BamHI. Sekvenční analýza tří nezávislých subklonů, označených MTAP4, MTAP-5 a MTAP-6, ukázala, že každý z těchto klonů obsahuje v překrývající se doméně přesně souhlasící sekvenci aminokyseliny.
Délky těchto tří subklonů cDNA z prodlužených primerů se mírně liší. Z toho vyplývá, že se jedná o nezávislé produkty PCR a jejich sekvence odrážejí správnou sekvenci mRNA bez začlenění nějaké báze v průběhu amplifikace PCR. Kombinace nové sekvence proti směru exprese se startovacím kodonem ATG (kódujícím methionin) a sekvence po směru exprese ze subklonu MTAP-2 vytváří otevřený čtecí rámec, kódující 283 aminokyselin.
Příklad VII
Exprese rekombinantní lidské MTAsy v £. coli
Plná délka cDNA lidské MTAsy byla konstruována přidáním fragmentu cDNA subklonu MTAP-4, prodlouženého z primeru, který obsahuje největší inzert ze všech tří subklonů, získaných podle příkladu VI, k 5' konci inzertu DNA subklonu MTAP-2 s použitím jejich společného restrikčního místa HindlI. Fragment DNA not I/HindII ze subklonu MTAP-4 a velký fragment HindlI/EcoRI ze subklonu MTAP-2 byly smíseny a subklonovány do vektoru pBluescript SK+ (Strategene), vyříznutého pomocí Not Ι/EcoRI. Získaný subklon, obsahující plnou délku cDNA lidské MTAsy, byl označen MTAP-7. Autenticita tohoto klonu cDNA byla zkontrolována expresí rekombinantního proteinu pomocí expresního vektoru £. coli pKK223-3, opatřeného promotorem Taq (Pharmacia).
K vytvoření nového místa EcoRI na 5'-konci a místa PSt I na 3'-konci fragmentu cDNA byla použita PCR s použitím 5'-příměrového oligonukleotidu, obsahujícího Shine-Dalgamovu (SD) sekvenci, a dalšího 3'-primeru. Amplifikace byla prováděna výše uvedeným způsobem po dobu 20 cyklů, sestávajících vždy z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (1 min, 55 °C) a prodlužování (1 min, 72 °C). Produkt PCR byl digerován s restrikčními enzymy EcoRI/Pst I, čištěn elektroforeticky na 0,8% agarózovém gelu a subklonován do vektoru pBluescript SK+ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRI/Pstl.
Po zkontrolování plné sekvence inzertu v subklonu označeném MTAP-7 byl vyříznut fragment EcoRI/PST I a subklonován do vektoru pKK223-3, vyříznutého pomocí EcoRI/Pst I, čímž se získala cDNA lidské MTAsy v expresním vektoru E. coli. Subklon označený MTAP-9 byl transformován do kmene E. coli JMI05. Byla analyzována enzymatická aktivita a spektrum
-10CZ 289155 B6 celkových proteinů transformovaných buněk s indukcí a bez indukce izopropyl-|3-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG). Jedna transformovaná kolonie byla inokulována do 2 ml média LB a inkubována přes noc při 37 °C. 20 μΐ získané kultury bylo přidáno do dvou plastových zkumavek, obsahujících vždy 2 ml čerstvého média LB (zředění 1/100).
Po 1 h inkubace při 37 °C bylo k jedné zkumavce přidáno 20 μΐ 0,1 M IPTG pro indukci na konečnou koncentraci 1 mM IPTG a v inkubaci se pokračovalo 4 h při 37 °C. Po izolaci buněk odstředěním po dobu 5min při 15000 g byly buňky resuspendovány ve 100 μΐ fosfátového pufru (50 mM fosforečnan draselný, pH 7,5, 1 mM DTT), ve stupni 3 rozrušeny sonifikací na ledu po dobu 0,5 min a odstředěním po dobu 10 min při 15000 g byly získány surové buněčné extrakty.
Koncentrace proteinů byla stanovena s použitím Bradfordovy metody (Protein Assay Bio-Rad). Stejná množství vzorků s indukcí a bez indukce IPTG byla analyzována na enzymatickou aktivitu a podrobena elektroforéze na 10% SDS polyakrylamidovém gelu. Surový extrakt, získaný z IPTG indukovaných buněk, vykazoval aktivitu MTAsy více než pětinásobně vyšší než u neindukovaných buněk. Navíc byl na SDS gelu detekován pás nově indukovaného proteinu (31 kDa).
Příklad VIII
Klonování a částečná charakterizace genomového klonu MTAsy
Pro co nejúčinnější amplifikaci fragmentu DNA pomocí PCR pro diagnostické účely by jeho velikost měla přednostně být menší než 500 bp. Sekvence cDNA odráží souhrn exonů, které jsou normálně odděleny introny, což znesnadňuje v sekvenci cDNA nalézt příslušnou sekvenci vhodné velikosti. K překonání tohoto problému byl izolován genomový klon lidské MTAsy. Knihovna kosmidových genů, konstruovaná z DNA lidské placenty (Clontech) byla podrobena screeningu pomocí sondy genu cDNA MTAsy, fragmentu Not I/EcoRI ze subklonu MTAP-7. Transformované buňky E. coli z knihovny se nanesou na plotny LB s obsahem ampicilinu (50 mg/1) s hustotou kolonií 1 až 2.104 na plotnu 135 x 15 mm.
Následující postup byl prováděn způsobem uvedeným v příkladu VI. Z půl milionu kolonií byla izolována jediná pozitivní kolonie s označením MTAP-10 a byla částečně charakterizována analýzou PCR a nepřímým sekvenováním. Byly syntetizovány dva primery, antikódující oligonukleotid, umístěný 120 bp před stop kodonem, a kódující oligonukleotid umístěný 20 bp za stop kodonem, a použity pro analýzu PCR. PCR byla prováděna po dobu 25 cyklů, sestávajících vždy z denaturace (1 min, 92 °C) teplotní hybridizace (2 min, 55 °C) a prodlužování (5 min, 72 °C). Produkty PCR byly odděleny na 0,8% agarózovém gelu.
Umístění exonů, pokud identifikovaných v genu MTAsy výše popsanou metodou, je znázorněno na obr. 1.
Příklad IX
Aplikace oligonukleotidů specifických pro sekvenci MTAsy na maligní buněčné linie pro detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti MTAsy
Za účelem zkoumání použitelnosti oligonukleotidů byla PCR aplikována na několik buněčných linií, o nichž je známo, že obsahují buňky pozitivní a negativní na MTAsu. Genomové DNA byly izolovány způsobem popsaným v příkladu VIII a v množství 1 pg použity pro PCR. Amplifikace byla prováděna výše popsaným způsobem po dobu 40 cyklů, sestávajících z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (1 min, 55 °C) a prodlužování (1/2 min, 72 °C). Produkty PCR byly analyzovány na 1,5% agarózovém gelu. V buněčných liniích, o nichž je známo, že jsou negativní
-11CZ 289155 B6 na MTAsu, nebyla MTAsa detekována, zatímco v MTAsa-pozitivních buněčných liniích byla
MTAsa detekována.
PŘEHLED SEKVENCÍ
SEQ ID NO 1 je genomický klon pro methylthioadenosin fosforylázu (MTAsu).
SEQ IN NO 2 je antigenní MTAsový peptid („peptid 40“).
SEQ IN NO 3 je antigenní MTAsový peptid („peptid 51“).
SEQ IN NO 4 je primer pro PCR amplifikaci genu MTAsy („peptid 1 “).
SEQ IN NO 5 je primer pro PCR amplifikace genu MTAsy („peptid 2“).
SEZNAM SEKVENCÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: ZPŮSOB DETEKCE DEFICITU METHYLTHIOADENOSIN FOSFORYLÁZY V SAVČÍCH BUŇKÁCH (iii) POČET SEKVENCÍ: 5 (iv) KORESPONDENČNÍ ADRESA:
(A) ADRESÁT: Robbins, Berliner & Carson (B) ULICE: 201 N. Figueroa Street, 5Λ Floor (C) MĚSTO: Los Angeles (D) STÁT: Califomia (E) ZEMĚ: USA (F) POŠT. KÓD: 90012 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (vi) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:
(B) DATUM PODÁNÍ:
(C) KLASIFIKACE:
(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCE/AGENTOVI:
(A) JMÉNO: Berliner, Robert (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 20,121 (C) ZNAČKA/ČÍSLO SPISU: 5555-287 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:
(A) TELEFON: 213-977-1001 (B) TELEFAX: 213-977-1003
-12CZ 289155 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2763 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatáza (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: SDS (B) POLOHA: 1..2763 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 1:
- 13CZ 289155 B6
| TTTATACAGA | GCATGACAGT | GGGGTCCTCA | CTAGGGTCTG | TCTGCCACTC | TACATATTTG | 60 |
| AAACAGGAGT | GGCTTCTCAG | AATCCAGTGA | ACCTAAATTT | TAGTTTTAGT | TGCTCACTGG | 120 |
| ACTGGGTTCT | AGGAGACCCC | CTGTGTTAGT | CTGTGGTCAT | TGCTAGSAGA | ATCACTTAAT | 180 |
| TTTTTCTAGA | CTCTAGGAGA | AAACAGTTGG | TGGTGTACTC | ATCACGGGTT | AACAATTTCT | 240 |
| TCTCTCCTTC | CATAGGCATG | GAAGGCAGCA | CACCATCATG | CCTTCAAAGG | TCAACTACCA | 300 |
| GGCGAACATC | TGGGCTTTGA | AGGAAGAGGG | CTGTACACAT | GTCATAGTGA | CCACAGCTTG | 360 |
| TGGCTCCTTG | AGGGAGGAGA | TTCAGCCCGG | CGATATTGTC | ATTATTGATC | AGTTCATTGA | 420 |
| CANNNNNNNN | NNNNNNNNNN | GAGGTCGACG | GTATCGATAA | GCTTTGTAAA | CAATTGTCTT | 480 |
| TAGCTTATCC | AGAGGAATTG | AGTCTGGAGT | AAAGACCCAA | ATATTGACCT | AGATAAAGTT | 540 |
| GACTCACCAG | CCCTCGGAGG | ATGGAAAGAT | GGCCTTAAAA | TAAAACAAAC | AAAAACCTTT | 600 |
| TTTGCTTTAT | TTTGTAGGAC | CACTATGAGA | CCTCAGTCCT | TCTATGATGG | AAGTCATTCT | 660 |
| TGTGCCAGAG | GAGTGTGCCA | TATTCCAATG | GCTGAGCCGT | TTTGCCCCAA | AACGAGAGAG | 720 |
| GTGTGTAGTC | TTTCTGGAAG | GTGTACCAGA | ATAAATCATG | TGGGCTTGGG | GTGGCATCTG | 780 |
| GCATTTGGTT | AATTGGCAGA | CGGAGTGGCC | CCATACCCTC | ACTCAAGTTT | GCTTTGTATT | 840 |
| ATGCAAGTTT | ATGGAGAGTT | ATTTCCTGTT | GCTAATAATT | TNHHNNNNNN | HNNMNHNNHM | 900 |
| AAGTGCAGCC | TTAAGTTGTG | CATGTGCTAG | TATGTTTTGA | AGTTTCTGGT | TTTTCTTTTC | 960 |
| TAGGTTCTTA | TAGAGACTGC | TAAGAAGCTA | GGACTCCGGT | GCCACTCAAA | GGGGACAATG | 1020 |
| GTCACAATCG | AGGGACCTCG | TTTTAGCTCC | CGGGCAGAAA | GCTTCATGTT | CCGCACCTGG | 1080 |
| GGGGCGGATG | TTATCAACAT | GACCACAGTT | CCAGAGGTGG | TTCTTGCTAA | GGAGGCTGGA | 1140 |
| ATTTGTTACG | CAAGTATCGC | CATGGGCACA | GATTATGACT | GCTGGAAGGA | GCACGAGGAA | 1200 |
| GCAGTAGGTG | GAATTCTTTT | CTAAGCACAT | ATAGCATGGG | TTTCTGGGTG | CCAATAGGGT | 1260 |
| GTCTTAACTG | TTTGTTTCTA | TTACGTTAGT | TTCAGAAAGT | GCCTTTCTAC | AAGGTTTTGA | 1320 |
| AGTTGTTAAT | ATTTTCTGTA | GTTCCATTGG | AAGGTAAGAA | CAAAGATCAA | AAGAAAGAAA | 1380 |
| GAGACACTTT | TACCCAAGGA | TCAGTAGTGA | AAATAGTACA | TTGTAGGCAT | GTAGATGTGT | 1440 |
| TGAGAATCAT | ACTAAGACTT | GGGCCTTANN | NNNNNNNNNH | NNNNNNNNNN | NNTACCCTAC | 1500 |
| ATTGAGGATT | CGGTTTCAGC | AGATAAATTT | GAGGGACACA | AACATTTAGG | CTGTAGCAAG | 1560 |
| GCTGGAGCTC | AGAAAAATGT | TTTATGACAA | GCAGTGGAAT | TTTAAGTTCT | AGTAACCTCC | 1620 |
- 14CZ 289155 B6
| AGTGCTATTG | TTTCTCTAGG | TTTCGGTGGA | CCGGGTCTTA | AAGACCCTGA | AAGAAAACGC | 1680 |
| TAATAAAGCC | AAAAGCTTAC | TGCTCACTAC | CATACCTCAG | ATAGGGTCCA | CAGAATGGTC | 1740 |
| AGAAACCCTC | CATAACCTGA | AGGTAAGTGC | AGCCATGGAC | AATCAGGCAT | GTCTGTAGAC | 1800 |
| TCTCTATTGT | CTTCTTTTCT | TACTTGCATT | TCACCTTTGG | TCCTCATGTA | TTTTTTGCCA | 1860 |
| GCCTAGATGT | TTTCAACAAG | TTTTTGTGAC | ATCTACTACT | ACCATACCAA | CCACTTGTGA | 1920 |
| AACTGAGTAG | TCTTATTTTC | TTGGCTGGTA | GTGCAGANNN | NNNNNNNNNN | NNAATAAACA | 1980 |
| ATAATCCAGG | CTGGGCTGGT | ATGGCAATAA | GTGATTATCA | GAACAATGCT | CTGAGATAAG | 2040 |
| CATTATTAAC | CTCACTTTAC | AGGAAAGGGA | GGTGAGGAAC | CAAGAGTTTA | GAGTACCCGA | 2100 |
| AGTTCCACAT | CTGGTTAGTG | AACTTGAAAA | TTTTCTGTAG | AATTTATTTA | AAGTGTATGT | 2160 |
| TTCCTGCGTC | CTCACTTTGA | TCTAGAAAAT | CAAAATCTGT | TTTTTTTTTT | AACAAACATC | 2220 |
| TCAGTAATTA | CGCCAACATG | TGAATATCAC | TGCCTCCTTT | CTTCCTTTCA | GAATATGGCC | 2280 |
| CAGTTTTCTG | TTTTATTACC | AAGACATTAA | AGTAGCATGG | CTGCCCAGGA | GAAAAGAAGA | 2340 |
| CATTCTAATT | CCAGTCATTT | TGGGAATTCC | TGCTTAACTT | GAAAAAAATA | TGGGAAAGAC | 2400 |
| ATGCAGCTTT | CATGCCCTTG | CCTATCAAAG | AGTATGTTGT | AAGAAAGACA | AGACATTGTG | 2460 |
| TGTATAGAGA | CTCCTCAATG | ATTTAGACAA | CTTCAAAATA | CAGAAGAAAA | GCAAATGACT | 2520 |
| AGTAACATGT | GGGAAAAAAT | ATTACATTTT | AAGGGGGAAA | AAAAACCCCA | CCATTCTCTT | 2580 |
| CTCCCCCTAT | TAAATTTGCA | ACAATAAAGG | GTGGAGGGTA | ATCTCTACTT | TCCTATACTG | 2640 |
| CCAAAGAATG | TGAGGAAGAA | ATGGGACTCT | TTGGTTATTT | ATTGATGCGA | CTGTAAATTG | 2700 |
| GTACAGTATT | TCTGGAGGGC | AATTTGGTAA | AATGCATCAA | AAGACTTAAA | AATACGGACG | 2760 |
| TAC | 2763 |
- 15CZ 289155 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 2:
Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu 15 10 15
Glu Gly (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..13 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 3:
Lee Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gin Ile Gly Ser Met Glu
5 10 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid
-16CZ 289155 B6 (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatázové primery (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..8 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 4:
Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys
5 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatázové primery (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..9 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 5:
Thr Trp Gly Ala Asp Val Ile Asn Met
Claims (4)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosin fosforylázu, MTAsu, vybraný z polynukleotidu majícího sekvenci nukleové kyseliny znázorněnou v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1 a polynukleotidu zahrnujícího pouze oblast kódující exony uvedené sekvence nukleových kyselin, jak jsou znázorněny na obr. 1.
- 2. Rekombinantní expresní vektor, obsahující polynukleotid podle nároku 1.
- 3. Protilátka, produkovaná imunizací živočicha alespoň jedním z MTAsových peptidů, jako produktem exprese vektorem podle nároku 2.
- 4. Protilátka podle nároku 3, kterou je monoklonální protilátka, produkovaná hybridomy, tvořenými z buněk imunizovaných živočichů.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20011776A CZ289523B6 (cs) | 1993-12-29 | 2001-05-21 | Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17685593A | 1993-12-29 | 1993-12-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ186896A3 CZ186896A3 (en) | 1996-11-13 |
| CZ289155B6 true CZ289155B6 (cs) | 2001-11-14 |
Family
ID=22646145
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19961868A CZ289155B6 (cs) | 1993-12-29 | 1994-12-22 | Izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosin fosforylázu, expresní vektor a protilátka |
| CZ20011776A CZ289523B6 (cs) | 1993-12-29 | 2001-05-21 | Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20011776A CZ289523B6 (cs) | 1993-12-29 | 2001-05-21 | Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0733123B1 (cs) |
| JP (1) | JPH09507755A (cs) |
| CN (2) | CN1513997A (cs) |
| AT (1) | ATE215128T1 (cs) |
| AU (1) | AU690632B2 (cs) |
| CA (1) | CA2179908A1 (cs) |
| CZ (2) | CZ289155B6 (cs) |
| DE (1) | DE69430258T2 (cs) |
| DK (1) | DK0733123T3 (cs) |
| ES (1) | ES2174927T3 (cs) |
| HU (1) | HU220196B (cs) |
| NO (1) | NO962715L (cs) |
| NZ (1) | NZ279044A (cs) |
| PL (1) | PL181667B1 (cs) |
| PT (1) | PT733123E (cs) |
| RO (1) | RO117386B1 (cs) |
| WO (1) | WO1995018233A1 (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5840505A (en) * | 1993-12-29 | 1998-11-24 | The Regents Of The University Of California | Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity in methylthioadenosine phosphorylase deficient cells |
| US5861154A (en) * | 1995-10-30 | 1999-01-19 | Shionogi & Co., Ltd. | Recombinant L-methionine γ-lyase |
| EP1594900A2 (en) | 2003-02-14 | 2005-11-16 | Salmedix, Inc. | Compositions and methods for the detection and treatment of methylthioadenosine phosphorylase deficient cancers |
| CN1924014B (zh) * | 2005-09-01 | 2011-08-17 | 中国医学科学院肿瘤研究所 | 抑制肿瘤转移的特异性干扰MTA1 mRNA的干扰RNA序列 |
| EP3727420A4 (en) * | 2017-12-21 | 2022-04-06 | Board of Regents, The University of Texas System | Enzyme-mediated depletion of adenosine and/or methylthioadenosine |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
-
1994
- 1994-12-22 NZ NZ279044A patent/NZ279044A/en unknown
- 1994-12-22 AT AT95907260T patent/ATE215128T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-12-22 EP EP95907260A patent/EP0733123B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-22 HU HU9601776A patent/HU220196B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-12-22 CN CNA021578664A patent/CN1513997A/zh active Pending
- 1994-12-22 WO PCT/US1994/014920 patent/WO1995018233A1/en active IP Right Grant
- 1994-12-22 CZ CZ19961868A patent/CZ289155B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-12-22 AU AU15551/95A patent/AU690632B2/en not_active Ceased
- 1994-12-22 DK DK95907260T patent/DK0733123T3/da active
- 1994-12-22 DE DE69430258T patent/DE69430258T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-22 CN CN94195031A patent/CN1103820C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-22 JP JP7518170A patent/JPH09507755A/ja active Pending
- 1994-12-22 RO RO96-01325A patent/RO117386B1/ro unknown
- 1994-12-22 CA CA002179908A patent/CA2179908A1/en not_active Abandoned
- 1994-12-22 PT PT95907260T patent/PT733123E/pt unknown
- 1994-12-22 PL PL94315230A patent/PL181667B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-12-22 ES ES95907260T patent/ES2174927T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-06-27 NO NO962715A patent/NO962715L/no unknown
-
2001
- 2001-05-21 CZ CZ20011776A patent/CZ289523B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1513997A (zh) | 2004-07-21 |
| EP0733123A4 (en) | 1999-04-21 |
| DK0733123T3 (da) | 2002-07-22 |
| PL181667B1 (pl) | 2001-08-31 |
| PT733123E (pt) | 2002-09-30 |
| CN1145640A (zh) | 1997-03-19 |
| NO962715L (no) | 1996-08-26 |
| JPH09507755A (ja) | 1997-08-12 |
| RO117386B1 (ro) | 2002-02-28 |
| NZ279044A (en) | 1997-10-24 |
| CZ289523B6 (cs) | 2002-02-13 |
| EP0733123A1 (en) | 1996-09-25 |
| DE69430258T2 (de) | 2002-10-17 |
| CA2179908A1 (en) | 1995-07-06 |
| CZ186896A3 (en) | 1996-11-13 |
| HUT74668A (en) | 1997-01-28 |
| WO1995018233A1 (en) | 1995-07-06 |
| EP0733123B1 (en) | 2002-03-27 |
| CN1103820C (zh) | 2003-03-26 |
| ATE215128T1 (de) | 2002-04-15 |
| DE69430258D1 (de) | 2002-05-02 |
| AU690632B2 (en) | 1998-04-30 |
| NO962715D0 (no) | 1996-06-27 |
| HU9601776D0 (en) | 1996-09-30 |
| AU1555195A (en) | 1995-07-17 |
| ES2174927T3 (es) | 2002-11-16 |
| HU220196B (hu) | 2001-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4900673A (en) | Mutant human angiogenin (angiogenesis factor with superior angiogenin activity) genes therefor and methods of expression | |
| US5942393A (en) | Method for the detection of the presence or absence of methylthioadenosine phosphorylase (MTASE) in a cell sample by detection of the presence or absence of MTASE encoding nucleic acid in the cell sample | |
| JP3136551B2 (ja) | インターロイキン１β前駆体変換酵素をコードするＤＮＡ | |
| Chen et al. | Cloning, characterization and mutagenesis of Russell’s viper venom L-amino acid oxidase: Insights into its catalytic mechanism | |
| US5484703A (en) | Assay using recombinant histidyl-tRNA synthetase | |
| JP2653653B2 (ja) | インターフエロン誘起遺伝子及び酵素 | |
| Hirshey et al. | Sequence analysis, in vitro translation, and expression of the cDNA for rat liver minoxidil sulfotransferase. | |
| US6607724B2 (en) | Compositions and methods for inhibiting angiogenesis | |
| Rouimi et al. | Purification and characterization of a glutathione S-transferase Omega in pig: evidence for two distinct organ-specific transcripts | |
| CZ289155B6 (cs) | Izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosin fosforylázu, expresní vektor a protilátka | |
| FR2590576A1 (fr) | Peptides toxiques pour arreter la croissance, conjugues de ces peptides, et procede pour inhiber la croissance d'un groupe de cellules a l'aide de ces peptides | |
| Murakami et al. | The NH2-Terminal Structures of Human and Rat Liver Microsomal NADH-Cytochrome b 5 Reductases | |
| US6911309B2 (en) | Nucleic acids encoding MTAse | |
| US5459063A (en) | Plasmodium falciparum ribonucleotide reductase DNA | |
| US20020173475A1 (en) | Methods to inhibit viral replication | |
| US6649395B1 (en) | Tyrosine-containing cyclophilin and related methods | |
| CN100480379C (zh) | 白念珠菌ctd蛋白激酶基因及其用途 | |
| JPH1080281A (ja) | 新規蛋白質及びその製造方法 | |
| Shen | Structural and molecular genetic studies of the MHC novel gene RP | |
| MXPA96003897A (en) | Factor 10 of fibroblas growth | |
| AU2001250216A1 (en) | A thymus expressed human cytochrome P450 (P450TEC) | |
| JP2008528045A (ja) | リプロキシミン、新規ｉｉ型リボソーム不活性化タンパク質およびその使用 | |
| JPH04128298A (ja) | 抗体、その製造法および用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20031222 |