CZ289155B6 - Izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosin fosforylázu, expresní vektor a protilátka - Google Patents

Abstract

Jsou pops ny polynukleotidy k duj c MTAsu, expresn vektory a protil tky k MTAse.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká polynukleotidu pro detekci deficitu methylthiodenosin fosforylázy v savčích buňkách, který je ukazatelem malignity u těchto buněk. Detekce buněk, které jsou na tento enzym deficitní, umožňuje zaměřit na tyto buňky chemoterapii využívající neschopnosti těchto buněk převádět methylthioadenosin a methionin.

Dosavadní stav techniky

Aminokyselina methionin (MET) je nezbytná pro růst normálních i maligních buněk. U určitých maligních buněk je tato potřeba absolutní, tzn. že bez adekvátní zásoby methioninu buňky hynou.

V savčích buňkách se MET získává ze tří zdrojů. Je možno jej získat z výživy nebo biochemickou syntézou MET z Lz-homocysteinu (homocystein) nebo methylthiodenosinu (MTA) (produkt biosyntetické dráhy polyaminů). V posledním případě se MTA převádí na MET pomocí methylthioadenosin fosforylázy (MTAsa; EC 2.4.2.28).

V poslední dekádě identifikovali výzkumníci četné maligní buněčné linie, kterým chybí MTAsa a které tudíž nemohou převádět MTA na MET. Například Katamari a d., Proč. Naťl Acad. Sci. USA 78: 1219-1223 (1981), uvádějí, že u 23 % ze 3 studovaných lidských maligních nádorových buněčných linií chyběla detekovatelná MTAsa, zatímco v každé ze 16 studovaných nemaligních buněčných linií byla aktivita MTAsy přítomna. Deficit MTAsy byl rovněž zaznamenán jako charakteristika nemalobuněčných rakovin plic (viz Nobori a d., Cancer Res. 53:1098—1101 (1981)), v 6 liniích buněk lymfomů a leukémií (id.), v buněčných liniích mozkového nádoru a tkáňových vzorcích primárního mozkového nádoru (id.). a v dalších malignitách (viz například Kries a d., Cancer Res. 33:1866-1869 (1973), Kries a d., Cancer Trmt. Rpts. 63:1069-1072 (1979), a Rangione a d., Biochem. J. 281:533-538 (1992)). MTAsa-negativní buňky principiálně uspokojují svou potřebu MET konverzí homocysteinu. Není-li však k dispozici homocystein, buňky obvykle hynou.

Je známo, že L-methionin-E-deamino-y-merkaptomethan lyáza (ED 4.4.1.11; METasa) degraduje nejen MET, ale také homocystein. Teoreticky je tedy možno zahubit maligní buňky, jimž chybí MTAsa (TJ. MTAsa-negativní buňky) degradací plazmového MET a homocysteinu METasou. Lze předpokládat že normální MTAsa-pozitivní buňky budou uspokojovat svou potřebu MET pokračující přeměnou MTE na MET.

Jednou z překážek vývoje úspěšného přístupu k vyvolání nedostatku MET u maligních buněk je potřeba identifikovat, které malignity jsou vhodnými cíli terapie, tj. které maligní jsou MTAsanegativní. Za tímto účelem byl vyvinut test, který zjišťuje, zdaje malignita MTAsa-negativní, ze stanovení, zda je v buněčné kultuře přítomna katalytická aktivita (Seidenfeld a d., Biochem. Biophys. Res. Comm. 95:1861-1866, 1980). Pro komerční nedostupnost radiochemického substrátu, potřebného pro test aktivity, však není dosud schůdné její použití při rutinních hodnoceních. Test aktivity navíc nepočítá s katalytickou labilitou MTAsy in vitro, jestliže detekuje, zda je v buněčné kultuře přítomen vůbec nějaký enzym bez ohledu na to, zda je katalyticky aktivní v době provádění testu.

Toto omezení testu aktivity by bylo možno překonat vyvinutím imunoanalýzy, která by byla dostatečně citlivá pro detekci relativně nepatrných množství enzymu. Ukázalo se však, že čištění enzymu MTAsy z přírodních zdrojů za účelem vývinu protilátek pro použití při imunologické

-1 CZ 289155 B6 detekci MTAsy je pracné a poskytuje relativně patné výtěžky (Rangione a d., J. Biol. Chem.

261:12324-12329,1986).

Neexistuje jednoduchého účinného prostředku identifikace MTAsa-deficitních buněk částečně přispívá k trvalé nedostupnosti účinného terapeutického přístupu k selektivnímu vyvolávání nedostatku MET in vivo v MTAsa-deficitních maligních buňkách. Tuto potřebu řeší tento vynález pomocí polynukleotidu, který kóduje MTAsu, použitelného pro detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti genu MTAsy ve vzorku.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosil fosforylázu, tj. MTAsu, vybraný z polynukleotidu majícího sekvenci nukleové kyseliny znázorněnou v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NOS 1 a polynukleotidu zahrnujícího pouze oblast kódující axony uvedené sekvence nukleových kyselin, jak jsou znázorněny na obr. 1.

Dále je předmětem vynálezu rekombinantní expresní vektor, obsahující uvedený polynukleotid, a protilátka, produkovaná imunizací živočicha alespoň jedním zMTAsových peptidů jako produktem exprese tímto vektorem. Rekombinantní MTAsu lze získat expresí MTAsy pomocí vhodného vektoru z polynukleotidu, který kóduje MTAsu. Dostupnost rekombinantní MTAsy umožňuje snadnější produkci vysoce čistého materiálu ve větším množství, než bylo možno dosáhnout podle Rengiona (viz výše) izolací a čištěním nativní MTAsy.

Zde používaný vraz „polynukleotid“ se vztahuje na polymer deoxyribonukleotidů nebo ribonukleotidů ve formě jednotlivého fragmentu nebo jako složku většího konstruktu. DNA, kódující MTAsu nebo MTAsový peptid podle vynálezu, může být sestavena z fragmentů cDNA nebo z oligonukleotidů, které poskytují syntetický gen, který je schopen exprese v rekombinantní transkripční jednotce. Polynukleotidové sekvence podle vynálezu zahrnují sekvence DNA, RNA a cDNA. Polynukleotidová sekvence může být dedukována z genetického kódu, avšak je nutno brát v úvahu degeneraci kódu. Polynukleotidy podle vynálezu zahrnují sekvence, které jsou degenerované v důsledku genetického kódu.

Peptidy a polynukleotidy podle vynálezu zahrnují funkční deriváty MTAsy, MTAsové peptidy a nukleotidy, které je kódují. „Funkční deriváty“ se rozumějí „fragmenty“, „varianty“, „analogy“ nebo „chemické deriváty“ molekuly. „Fragrent“ molekuly, například kterýkoli z polynukleotidů podle vynálezu, zahrnuje jakoukoli nukleotidovou podjednotku molekuly. „Varianta“ takové molekuly se vztahuje na přirozeně se vyskytující molekulu, vpodstatě podobnou buď celé molekule nebo jejímu fragmentu. ,,Analog“ molekuly se vztahuje na nepřirozenou molekulu, v podstatě podobnou buď celé molekule nebo jejímu fragmentu.

Molekula se označuje za „v podstatě podobnou“ jiné molekule, je-li sekvence aminokyselin v obou molekulách, nebo v případě polynukleotidů sekvence aminokyselin produkovaná oběma molekulami, v podstatě stejná. Molekuly s v podstatě podobnými aminokyselinami budou mít podobnou biologickou aktivitu. Pokud tedy mají dvě molekuly podobnou aktivitu, považují se varianty ve zde používaném smyslu toho výrazu i v případě, že jedna z molekul obsahuje další aminokyselinové zbytky, které se nenacházejí ve druhé, nebo jestliže sekvence aminokyselinových zbytků není identická.

Molekula se zde označuje za „chemický derivát“ jiné molekuly, jestliže obsahuje další chemické jednotky, které normálně nejsou součástí molekuly. Tyto jednotky mohou zlepšovat rozpustnost, absorpci, biologický poločas atd. molekuly. Alternativně mohou tyto jednotky snižovat toxicitu molekuly, eliminovat nebo zeslabovat její nežádoucí vedlejší účinky atd. Jednotky schopné zprostředkovat takovéto účinky jsou popsány například v Remingtonů Pharmaceutical Science, 16. vyd., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

-2CZ 289155 B6

Menší modifikace primární sekvence aminokyselin MTAsy mohou vést k proteinům, které mají v podstatě ekvivalentní aktivitu v porovnání s enzymem MTAsou a peptidy podle vynálezu. Tyto modifikace mohou být záměrné, například místně řízenou mutagenezí, nebo spontánní. Do rozsahu vynálezu spadají všechny proteiny a peptidy, vzniklé těmito modifikacemi, pokud u nich ještě existuje biologická aktivita MTAsy. Delece jedné nebo více aminokyselin může dále také vést k modifikaci struktury vznikající molekuly bez významného pozměnění její biologické aktivity. Na základě toho je možno vyvinout menší aktivní molekulu, která by měla širší použití. Například je možno odstranit amino- nebo karboxyterminální aminokyseliny, které nemusejí být nezbytné pro požadovanou katalytickou nebo antigenní aktivitu enzymu.

Výraz „konzervativní variace“ zde označuje náhradu aminokyselinového zbytku jiným, biologicky podobným zbytkem. Příklady konzervativních variací zahrnují náhradu hydrofobního zbytku jiným, jako je izoleucin, valin, leucin nebo methionin, nebo náhradu polárního zbytku jiným polárním zbytkem, například náhradu lysinu argininem, kyseliny asparagové kyselinou glutamovou nebo asparaginu glutaminem apod. Výraz „konzervativní variace“ zahrnuje rovněž použití substituované aminokyseliny namísto stejné nesubstituované aminokyseliny za předpokladu, že protilátky, vytvořené proti substituovanému polypeptidu, také imunoreagují s nesubstituovaným polypeptidem.

Sekvence DNA pro použití při produkci MTAsy a MTAsových peptidů podle vynálezu je rovněž možno získat různými metodami. Například je možno DNA izolovat pomocí známých hybridizačních postupů, které zahrnují, aniž by se na ně omezovaly: 1) hybridizaci sond s genomovou cDNA nebo s knihovnami cDNA za účelem detekce sdílených nukleotidových sekvencí, 2) protilátkový screening expresních knihoven za účelem detekce sdílených strukturních rysů a 3) syntézu řetězovou reakcí s polymerázou (PCR).

Hybridizační postupy jsou vhodné pro screening rekombinantních klonů s použitím značených smíšených syntetických oligonukleotidových sond, kde každá sonda je potenciálně kompletním komplementem specifické sekvence DNA v hybridizačním vzorku, který zahrnuje heterogenní směs denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace pro takovýto screening se přednostně provádí buď na jednořetězcové DNA nebo denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace je použitelná zejména pro detekci klonů cDNA, odvozených ze zdrojů, kde je přítomno extrémně malé množství sekvencí mRNA, vztahujících se k příslušnému polypeptidu. Jinými slovy je tedy možno při použití přísných podmínek hybridizace zaměřených na zamezení nespecifické vazby například umožnit autoradiografické zobrazení specifického klonu cDNA hybridizaci cílové DNA s touto jedinou sondou ve směsi.

Knihovna cDNA, obsahující MTAsu, může být podrobena screeningu injekcí různých mRNA, odvozených od cDNA, do oocytů, ponecháním dostatečného času pro expresi genových produktů cDNA a testováním na přítomnost požadovaného expresního produktu cDNA, například použitím protilátky specifické pro MTAsu nebo použitím sond pro opakující se jednotky a tkáňové expresní vzorce charakteristické pro MTAsu. Alternativně je možno knihovnu cDNA podrobit nepřímo screeningu na MTAsové peptidy, mající alespoň jeden epitop, použitím protilátek specifických pro tyto polypeptidy. Jak je popsáno dále v odstavci C, mohou být takovéto protilátky odvozené buď polyklonálně nebo monoklonálně a mohou být použity k detekci expresního produktu, ukazujícího na přítomnost cDNA MTAsy.

Screeningové postupy, používající hybridizaci nukleových kyselin, umožňují izolovat jakoukoli genovou sekvenci z jakéhokoli organismu, pokud je k dispozici příslušná sonda. Oligonukleotidové sondy, které odpovídají části sekvence kódující daný protein, mohou být syntetizovány chemicky. K tomu je nutno znát krátké oligopeptidové úseky sekvence aminokyselin. Sekvence DNA kódující protein může být odvozena z genetického kódu, avšak je nutno vzít v úvahu degeneraci kódu. Je-li sekvence degenerovaná, je možno provádět smíšenou adiční reakci. Ta zahrnuje heterogenní směs denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace pro

-3CZ 289155 B6 takovýto screening se přednostně provádí buď na jednořetězcové DNA nebo denaturované dvouvláknové DNA.

Vývoj specifických sekvencí DNA kódujících MTAsu nebo její fragmenty je možno rovněž uskutečnit: 1) izolací sekvencí dvouvláknové DNA z genomové DNA, 2) chemickou výrobou sekvence DNA k získání potřebných kodonů pro daný polypeptid a 3) syntézou sekvence dvouvláknové DNA in vitro reverzní transkripcí mRNA, izolované z eukaryotické donorové buňky. V posledně uvedeném případě se nakonec jako komplement mRNA vytvoří dvouvláknová DNA, která se obvykle označuje cDNA.

Podle vynálezu je možno vložit polynukleotid a jakékoli jeho varianty kódující MTAsu do rekombinantního expresního vektoru. Výraz „rekombinantní expresní vektor“ označuje plazmid, virus nebo jiné známé vehikulum, které bylo podrobeno manipulaci inzercí nebo zabudováním příslušných genetických sekvencí. Takovéto expresní vektory obsahují promotorovou sekvenci, která usnadňuje účinnou transkripci vložené genetické sekvence hostitele.

Transformaci hostitelské buňky pomocí rekombinantní DNA je možno rovněž provádět konvenčními metodami, známými odborníkům. Hostitelské buňky mohou být eukaryotické (jako jsou ovariální buňky čínského křečka) nebo prokaryotické (jako jsou bakterie nebo kvasinky). Je-li hostitel prokaryotický, například E. coli, je možno z buněk získaných po exponenciální fázi růstu připravit kompetentní buňky, které jsou schopny přijmout DNA, a zpracovat je metodou CaCI₂ známými postupy. Alternativně je možno použít MgCl₂ nebo RbCl. Transformaci je možno rovněž provádět po vytvoření protoplazmy k hostitelské buňce nebo elektroporací.

Izolaci a čištění mikrobiálně exprimované MTAsy nebo jejích fragmentů podle vynálezu může odborník provádět běžnými metodami, zahrnujícími preparativní chromatografii a imunologické separační metody s použitím monoklonálních nebo polyklonálních protilátek.

Na základě informací obsažených v SE ID NO 1 je možno snadno odvodit sekvenci aminokyselin plné délky MTAsy. S použitím těchto informací je rovněž možno bez přílišného experimentování syntetizovat MTAsu a MTAsové peptidy s použitím běžných metod, jako je ochrana a-aminoskupin pomocí t-BOC nebo FMOC. Obě metody zahrnují postupnou syntézu, při níž se v každém stupni přidává jedna aminokyselina počínaje C-koncem peptidu (viz Coligan a d., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 991, unit 9). Peptidy podle vynálezu je možno rovněž syntetizovat různými známými metodami syntézy peptidů v pevné fázi, jak jsou popsány například Merrifieldem, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1962), a Stewartem a Youngem, Solid Phase Peptides Synthesis (Freeman, San Francisco, 27-62, 1969), s použitím kopoly(styren-divinylbenzen) s obsahem 0,1 až 1,0 mmol aminů/g polymeru.

Při této posledně uvedené metodě je možno po dokončení chemické syntézy sejmout z peptidů chránící skupiny a peptidy odštěpit od polymeru působením kapalné HF s 10 % anisolu při 0 °C po dobu asi 1/4 až 1 h. Po odpaření reakčních činidel se peptidy extrahují z polymeru 1% roztokem kyseliny octové, který se pak lyofilizuje a získá se surový materiál. Ten je možno normálně přečistit metodami, jako je gelová filtrace na Sephadexu G-15 s 5% kyselinou octovou jako rozpouštědlem. Lyofilizací příslušných frakcí sloupce se získá homogenní peptid nebo deriváty peptidu, které pak mohou být charakterizovány standardními metodami, jako je analýza aminokyselin, tenkovrstvá chromatografie, vysokoúčinná kapalinová chromatografie, ultrafialová absorpční spektroskopie, molámí rotace, rozpustnost, a kvantifikovaný Edmanovou degradací pevné fáze.

Produkce protilátek proti MTAse

Antigenicita MTAsových peptidů může být stanovena konvenčními metodami zjišťování velikosti protilátkové odezvy živočicha, který byl imunizován peptidem. Jako MTAsové peptidy k vyvolání tvorby protilátek proti MTAse se obecně používají takové peptidy, které indukují

-4CZ 289155 B6 produkci vysokých titrů protilátky stelativně vysokou afinitou kMTAse. Takovéto peptidy mohou být pro použití jako imunogeny čištěny například metodou popsanou Rangionem a d.

(J. Biol. Chem. viz výše) nebo výše popsanými metodami získávání MTAsových peptidů.

Jakmile jsou připraveny antigenní peptidy, získají se protilátky k imunizujícímu peptidu zavedením peptidu do savce (jako je králík, myš nebo krysa). Pro ilustraci jsou v připojeném seznamu sekvencí uvedeny aminokyselinové sekvence dvou antigenních MTAsových peptidů jako SEQ ID. NO. 2 a 3. Protilátky, produkované králíky, imunizovanými těmito peptidy, vykázaly 50 % maximální odpovědi na čištěnou MTAsu při ředění 1:1500, resp. 1:4000.

Pro imunizaci živočichů antigenními MTAsovými peptidy se přednostně používá imunizační protokol s vícerázovou injekcí (viz například langone a d., ed., „Production of Antisera with Amall Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections“, Methods of Enzymology (Acad. Press, 1981)). Příznivou protilátkovou odpověď je možno získat například u králíků při intradermální injekci 1 mg antigenního MTAsového peptidu emulgovaného v kompletním Freudově adjuvans, po níž za několik týdnů následuje jedna nebo několik posilovačích dávek téhož antigenu v neúplném Fraeundově adjuvans.

Je-li to žádoucí, je možno imunizující peptid navázat na nosný protein konjugací s použitím známých metod. Běžně používané nosiče, používané nosiče, které se chemicky navazují na peptid, zahrnují hemocyanin přísavky keyhole limpet (KLH), thyreoglobulin, bovinní sérový albumin (BSA) a tetanový toxoid. Navázaný peptid se pak použije k imunizaci živočicha (například myši nebo králíka). Jelikož se má v současnosti za to, že MTAsa je zachovávána mezi savčími druhy, je použití nosného proteinu ke zvýšení imunogenicity MTAsových proteinů preferováno.

Polyklonální protilátky, produkované imunizovanými živočichy, mohou být dále čištěny, například vazbou a elucí na matrici, kníž je navázán peptid, proti němuž byly vyvolány protilátky. Odborníkům jsou známy různé metody, běžné v oboru imunologie pro čištění a/nebo koncentraci polyklonálních protilátek, stejně jako monoklonálních protilátek (viz například Coligan a d., Unit 9, Current protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).

Pro přípravu monoklonálních protilátek je preferována imunizace myší nebo krys. Výraz „protilátka“ zde rovněž zahrnuje intaktní molekuly a jejich fragmenty, jako jsou například Fab a F(ab')₂, které jsou schopné vázat epitopovou determinantu. V tomto kontextu se rovněž výraz „mAb podle vynálezu“ vztahuje na monoklonální protilátky specifické pro MTAsu.

Obecná metoda produkce hybridomů vylučujících monoklonální protilátky („mAb“) je známa (Kohler a Milstein, Nátuře 256:495,1975). Stručně řečeno zahrnovala metoda popsaná Kohlerem a Milsteinem izolaci lymfocytů z regionálních odtékajících mízních uzlin pěti různých pacientů buď s melanomem, teratokarcinomem nebo rakovinou čípku, gliomu nebo plic. Lymfocyty byly získány z chirurgických vzorků, spojeny a pak fúzovány s SHFP-1. Hibridomy byly podrobeny screeningu na produkci protilátky, která se vázala na rakovinné buněčné linie.

Potvrzená MTAsové specifícity mezi mAb je možno provádět pomocí relativně rutinních metod screeningu (například enzymová imunoanalýza ELISA) za účelem stanovení elementárního reakčního schématu příslušné mAb.

Bez zbytečné experimentální práce je rovněž možno hodnotit mAb za účelem stanovení, zda má stejnou specificitu jako mAb podle vynálezu, stanovením, zda testovaná mAb brání vazbě mAb podle vynálezu na MTAsu, izolovanou výše popsaným způsobem. Jestliže testovaná mAb soutěží s mAb podle vynálezu, což je patrné z poklesu vazby mAb podle vynálezu, pak je pravděpodobné, že se obě monoklonální protilátky vážou na stejný nebo blízký příbuzný epitop.

-5CZ 289155 B6

Další možností, jak zjistit, zda má mAb stejnou specificitu jako mAb podle vynálezu, je preinkubace mAb podle vynálezu s antigenem, s nímž normálně reaguje, a stanovení, zda testovaná mAb je inhibována ve své schopnosti vázat tento antigen. Je-li testovaná mAb inhibována, pak se vší pravděpodobností má stejnou nebo blízce příbuznou epitopovou specificitu jako mAb podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje make genu pro MTAsu a umístění exonů v polynukleotidu. Předpokládané exony jsou podtrženy; předpokládané introny jsou označeny jednou nebo více náhradami bází v polynukleotidové sekvenci symboly „N“. Sekvence, znázorněná na obr, 1, odpovídá sekvenci, uvedené v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je blíže osvětlen na příkladech provedení, které však neomezují jeho rozsah.

V příkladech jsou použity tyto zkratky: AS = pozitivní; DTT = dithiothreitol; min = minuta; MTAsa = 5'-deoxy-5'-methylthioadenosin fosforyláza; PCR = polymerázová řetězová reakce; S = negativní; SSc = 0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrát dihydrát; v/v = objem na objem; SDS = dodecylsulfát sodný.

Příklad I

Test katalytické aktivity MTAsy ve vzorku

Fosforolytická aktivita MTAsy byla stanovena měřením tvorby [methyl-¹⁴C]-5-methylthioribosa-l-fosfátu z [methyl¹⁴C]-5'-deoxy-5'-methylthioadenosinu (Seidenfeld a d., Biochem. Biophys. Res. Commun. 95, 1861-1866, 1980). V celkovém objemu 200 μΐ obsahovala standardní reakční směs 50 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4, 0,5 mM [methyl-¹⁴C]-5'-deoxy-5'-methylthiodenosinu (2.10⁵ CPM/mmol), 1 mM DTT a uvedené množství enzymu. Po 20 min inkubace při 37 °C byla reakce zastavena přídavkem 50 μΐ 3M trichloroctové kyseliny a 200μ1 alikvoty byly naneseny na sloupec 0,6 x 2 cm „Dowex“ 50-H* ekvilibrovaný s vodou. [Methyl-¹⁴C]-5-methylthioribosa-l-fosfát byl eluován přímo do scintilačních nádobek obsahujících 2 ml 0,1 M HC1.

Příklad II

Čištění nativní MTAsy z krysích jater

MTAsa byla izolována z krysích jater modifikací metody Rangiona a d. (J. Biol. Chem. 261, 12324-12329, 1986). 50 g čerstvých krysích jatek bylo homogenizováno vmísiči Waring Blendor se 4 objemy lOmM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4, obsahujícího 1 mM DTT (pufru A). Homogenizát byl odstředěn (1 h při 15000 g) a vzniklý supematant byl podroben frakcionaci síranem amonným. Precipitát mezi 55 a 75 % nasycení byl shromážděn odstředěním (15000 g po dobu 20 min) a rozpuštěn v minimálním objemu pufru A. Vzorek pak byl dialyzován přes noc proti třem dávkám 100 objemů téhož pufru.

Vzorek byl vyčiřen odstředěním při 15000 g po dobu 30 min a pak nanesen na sloupec DEAESephacryl (1,5x18 cm, Pharmacia), předem ekvilibrovaný pufrem A. Po promytí 80 ml

-6CZ 289155 B6 ekvilibračního pufru byl aplikován lineární gradient (80 ml) 0 až 0,3 M NaCl v pufru A. MTAsová aktivita byla eluována mezi 0,1 a 0,15 M NaCl. Frakce obsahující alespoň 0,06 jedn./mg proteinu byly 20krát zahuštěny ultrafiltrací (membrány Diaflow Amicon PM-10) a intenzivně dialyzovány proti 25 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4 s obsahem 1 mM DTT (pufr B). Pak byl vzorek nanesen na sloupec hydroxyapatitu (1 x 12 cm; Bio-Rad). Po eluci nenaabsorbovaných proteinů pufrem B byl sloupec promyt asi 40 ml 50mM fosfátového pufru o pH 7,4 s obsahem 1 mM DTT.

Pak byla eluována MTAsa s použitím lineárního gradientu (40 ml) 50 až 250 mM fosforečnanu draselného, pH 7,4. Frakce obsahující MTAsovou aktivitu byly 30krát zahuštěny ultrafiltrací a zbaveny dithiothreitolu opakovaným koncentrováním a ředěním 50mM fosfátovým pufrem opH 7,4. Částečně přečištěný enzym pak byl nanesen na sloupec (0,8 x 3 cm) organortuťnaté agarózy (Bio-Rad), ekvilibrované 50 mM fosfátovým pufrem o pH 7,4. Eluce sloupce byla prováděna postupně a) 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, b) 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, 2 M KC1, a c) 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, 2 M KC1, 40 mM 2-mrkaptoethanolu. Enzym pak byl eluován 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, 2 M KC1, 200 mM 2-merkaptoethanolu. Frakce obsahující alespoň 3 jedn./mg proteinu byly spojeny, zahuštěny ultrafiltrací na 1 ml a dialyzovány přes noc proti 1000 obj. 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, 1 MDTT (pufr C). V posledním stupni čištění byly alikvoty vzorku (1 ml) nastřikovány v množství 1 ml/min do kolony „MONO Q“ (Pharmacia), preekvilibrované 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, s obsahem 1 mM DTT a byly jímány frakce 0,5 ml. MTAsová aktivita byla eluována mezi 0,08 a 0,14 M NaCl v pufru C. Frakce byly ultrafiltrací zahuštěny na 0,5 ml a dialyzovány proti 1000 objemů pufru B.

Přiklad III

Stanovení částečné sekvence aminokyselin proti krysí MTAsu

Přečištěný vzorek byl lyofilizován, rozpuštěn v 50 μΐ nosného pufru (1 % dodecylsulfátu sodného (SDS), 10 % glycerinu, 0,1 M DTT a 0,01 % bromfenolové modře) a nanesen na 0,5 mm tlustý polyakrylamidový gel s 10% SDS (zařízení Bio Rad „MINIGEL“). Po elektroforéze byly proteiny přenášeny elektroblottingem po dobu 2 h na ntirocelulózu (velikost pórů 0,45 mm, Millipore) v systému transblot Bio-Rad s použitím přenosového pufru (15 mM Tris, 192 mM glycinu a 20 % methanolu, pH 8,3), popsaného Towbinem a d. (Proč. Naťl Acad. Sci. USA 76, 4340-4345, 1979).

Po přenosu byly proteiny reverzibilně obarveny pomocí Ponceau S (Sigma) modifikovanou metodou, popsanou Salinovichem a Montelarem (Anal. Biochem. 156, 341-347, 1987). Nitrocelulózový filtr byl pomořen na 60 sdo roztoku 0,1 % barviva Ponceau Sv 1% vodné kyselině octové. Přebytečné zbarvení bylo odstraněno mírným třepáním po dobu 1 až 2 min v 1% vodné kyselině octové. Oblast obsahující protein, detekovaná barvením, byla vyříznuta, přenesena do Eppendorfory zkumavky (1,5 ml), promyta destilovanou vodou a inkubována po dobu 30 min při 37 °C v 1,2 ml 0,5 % polyvinylpyrrolidonu (průměrná molekulová hmotnost 40000, PVP-40, Sigma), rozpuštěného ve 100 mM kyseliny octové, za účelem zabránění absorpci proteázy na nitrocelulózu během digesce. Přebytek PVP-40 byl odstraněn intenzivním promytím vodou (alespoň 5 dávek).

Nitrocelulózové proužky pak byly nařezány na malé kousky o velikosti přibližně 1 mm x 1 mm a vloženy zpět do téže zkumavky. Protein na nitrocelulóze byl digerován dříve popsaným způsobem (Los a d., Science 243:217-220, 1989). Přidá se trypsin (10 pmol) ve 100 μΐ lOOmM Tris-HCl, pH 8,2/acetonitril, 95:5 (v/v) a provede se inkubace přes noc při 37 °C. Po digesci byl supematant obsahující peptid okyselen 30 μΐ 10% trifluoroctové kyseliny, přemístěn rychle na zařízení Vortex a odstřeďován 1 min při 15000 g. Supematant byl odebrán a okamžitě nastříknut na systém HPLC s reverzními fázemi (Beckmann), vybavený analytickou kolonou Brownlee Aquapore Bu-300 (2,1 x 100 mm).

-7CZ 289155 B6

Do kolony byl po dobu 5 min rychlostí 200 μΐ/min čerpán eluent D - 0,1% triofluoroctová kyselina (čistota pro sekvenování, ve vodě), načež byl průtok snížen na 100 μΐ/min a byl započat gradient eluentu E (0,08 až 0,095% trifluoroctová kyselina v acetonitril/H₂O 70:30 v/v). Frakce, obsahující peptid podle absorpce UV při 215 nm, byly manuálně sebrány do Eppendorfových zkumavek. Reprezentativní frakce 60 a 77 byly podrobeny sekvenční analýze aminokyselin (ABI477A Protein Sequencer son-line analyzátorem PTH-AA 120A). Tak byly získány nezávislé částečné sekvence aminokyselin krysí MTAsy. Sekvence aminokyselin peptidů označených jako peptid 1 (frakce 60) a peptid 2 (frakce 77) jsou znázorněny jako SEQ ID NO 5 až 6.

Příklad IV

Amplifikace fragmentu DNA kódujícího část lidského genu MTAsy

Na základě částečných sekvencí aminokyselin peptidů 1 (SEQ ID NO 4) a 2 (SEQ ID NO 5) byly syntetizovány dvě sady oligonukleotidových primerů s různými polaritami. Každý oligonukleotid byl navržen tak, aby obsahoval jediné restrikční místo na 5'-konci (EcoRI nebo BamHI) pro usnadnění následného klonování amplifikovaného fragmentu DNA. Pro použití při amplifikaci PCR byla izolována totální cDNA z 1 milionu jednotek tvořících plak (plague forming units, pfu) z genové knihovny cDNA lidské plachety (Clontech) pomocí kitu „Lambda-Trap“ (Clontech). PCR reakce byla prováděna v celkovém objemu 100 μΐ, obsahujícím 1 pg totální cDNA z genové knihovny cDNA lidské placenty, 1 x PCR pufr (10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl₂), 0,2 mM každého dNTP, po 100 mg negativního a pozitivního primerů a 10 jednotek Taq DNA polymerázy, Stoffel Fragment („AMPLI TAQ“, Perkin-Elmer Cetus).

Se systémem „GENE AMP“ PCR Systém 9600 (Perkin-Elmer Cetus) bylo provedeno 40 cyklů, sestávajících vždy zdenaturace (92 °C, 1 min), teplotní hybridizace (55 °C, 2 min) a prodlužování (72 °C, 2 min). PCR produkt byl oddělen elektroforeticky na 0,8% agarózovém gelu v pufru 1 x TA (40 mM Tris-acetát, 20 mM Na-acetát, 2 mM EDTA, pH 7,9) a byl amplifikován fragment DNA 450 bp. Produkt amplifikace PCR byl dvakrát digerován s restrikčními enzymy EcoRI/BamHI, rozdělen na 0,8% agarózovém gelu v pufru 1 x TA, získán z gelu pomocí kitu „GENE CLEAN“ (Biol01), subklonován do vektoru pBluescript SK⁺ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRI/BamHI, a sekvenován dideoxyterminační metodou s použitím univerzálního sekvenčního primem (kit pro sekvenování DNA „SEQUENASE“ verze 1,0, USB).

Příklad V

Screening genové knihovny cDNA lidské placenty

Sekvenční analýza amplifikovaného produktu PCR (příklad IV) vykazuje dokonalou shodu s C-terminální sekvencí aminokyselin peptidů 1 (SEQ ID NO 5). S použitím fragmentu DNA 450 bp jako hybridizační sondy byla podrobena screeningu genové knihovny cDNA lidské placenty (Clontech). Za tím účelem byly hostitelské buňky kmene Y1090 E. coli inkubovány při 37 °C přes noc za intenzivního třepání v médiu LB (na litr: 10 g tryptonu, 5 g kvasničkového extraktu, 10 g NaCl), obsahujícím 0,2 % maltózy a 10 mM MgSP. Pro každou kultivační plotnu bylo 0,3 ml kultury hostitelských buněk smíseno s 3.10⁴ pfu fágů a inkubováno 20 min při 37 °C. Směsi hostitelských buněk a fágů byly přidány k 8 ml média LB, obsahujícího 0,7 % agarózy (LB na agaróze), které bylo předehřáto na 48 °C, a nality na 20 agarových ploten (135 x 15 mm). Po 6 až 8 h inkubace při 37 °C byly viditelné plaky a desky byly po dobu 1 h chlazeny na 4 °C. Plaky byly přeneseny na dobu 3 min na nylonové přenosové membrány Colony /Plague Screen (NEN Research Products, Dupont Boston, MA) a pak denaturovány (dvakrát v 0,5 N NaOH po

-8CZ 289155 B6 dobu 2 min), renaturovány (dvakrát v 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5 po dobu 2 min) a fixovány sušením na vzduchu. Prehybridizace 20 membrány byla provedena po dobu 4 h při 42 °C ve dvou plastových pytlích po 10 membránách s použitím 20 ml prehybridizačního pufru (1 % SDS, 2 x

SSC, 10 % dextransulfátu, 50 % deionizovaného formamidu).

Fragment EcoRI-BamHI 450 bp části lidského genu MTAsy byl označen [a-³²P]dATP (3000 Ci/mmol) s použitím kitu pro posun jednořetězového zlomu (Boehringer Mannheim), oddělen od nezabudované radioaktivity na koloně NICK (Pharmacia), denaturován zahřátím na 96 °C po dobu 10 min, ochlazen na ledu a přidán k membránám v plastových pytlích s koncentrací sondy 106dpm/ml. Specifická aktivita značené sondy je kolem 10⁸ dpm/pg. Hybridizace byla prováděna přes noc při 42 °C. Po hybridizaci byly membrány promyty třilaát po 5 min při teplotě místnosti přebytkem 2 x SSC, pak 20 min při 65 °C 2 x SSC, 0,1 % SDS ajednou 20 min při teplotě místnosti 0,2 x SSC, 0,1 % SDS. Promyté membrány byly přes noc vystaveny rentgenovému filmu.

Agarové výřezy, obsahující několik plaků kolem pozitivního signálu, byly přeneseny do 1 ml sterilního ředidla fágů (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 MNaCl, 8 mM MgSO₄, 0,01 % želatiny) a podrobeny znovu screeningu výše popsaným způsobem do získání čistých pozitivních plaků. Ze screeningu přibližně půl milionu plaků bylo získáno 6 nezávislých pozitivních klonů. Po amplifikaci na plotnách LB byla každá fágová DNA pozitivních klonů čištěna s použitím kitu „Lambda-TRAP“ (Clontech). Za účelem získání celého inzertu byly čištěné fágové DNA rozštěpeny enzymem EcoRi, ale v důsledku existence místa EcoRi uvnitř inzertu byly ze všech klonů vyříznuty dva pásy.

Dva fragmenty inzertu EcoRi (850 a 1100 bp) z reprezentativního fágového klonu, označeného MTAp-1, byly subklonovány do vektoru pBluescript SK⁺ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRi. Tyto subklony byly označeny MTAP-2 (850 bp) a MTAP-3 (IlOObp). Restrikční analýzou a sekvenováním DNA těchto dvou subklonů bylo zjištěno, že subklon MTAP-2 má na C-konci otevřený čtecí rámec kódující 254 aminokyselin, obsahujících sekvenci aminokyselin odpovídající peptidu 3 (90 % homologie). Počítáno z molekulové hmotnosti MTAsy 32 kDA (F. D. Rangione a d., J. Biol. Chem. 261:12324-12329, 1986), pokrývá 85 % celého proteinu. Chybí asi 50 aminokyselin (alespoň 150 bp na úrovni DNA).

Příklad VI

Prodlužování primeru pro získání chybějícího 5'-konce cDNA MTAsy

K získání chybějícího 5'-terminálního fragmentu byla použita metoda RACE (rapid amplification of cDNA ends;, Loh a d., Science 243:217-220, 1989; Frohman a d., PNAS 85:8998-9002, 1988), 1 pg póly (A+) RNA z lidské placenty (Clontech) v 6,25 μΐ H₂O byl 5 min zahříván na 65 °C, zchlazen na ledu a přidán ke 4 μΐ pufru 5 x RTC (250 mM Tris-HCl, pH 8,15, 30 mM MgCl₂, 200 mM KC1, 5 mM DTT), 4 μΐ (0,4 mg/ml) aktinomycinu D (Boehringer), po 1 pg každého dNTP (20 mM), 0,25 μΐ (10 jednotek), RNasinu (Boehringer), 1 μΐ [a-³⁵S]dATP (1443 Ci/mmol), 1 μΐ pozitivního oligonukleotidu 3 AS, specifického pro lidskou MTAsu, a 10 jednotkám reverzní transkriptázy viru ptačí myeloblastózy (Boehringer). Směs byla inkubována 2 h při 42 °C.

Přebytek primeru a dNTP byl odstraněn tímto způsobem. 20μ1 pool cDNA byl nanesen na kolonu NICK (Pharmacia) a byly jímány dvoukapkové frakce. Frakce 5 až 8, příslušející prvnímu píku radioaktivity, byly spojeny, bylo provedeno srážení po dobu 2 h při -80 °C s 1/10 objemu 7,5MNHOAc a 2,5 objemu ethanolu, odstřeďování po dobu 30 min při 4°C při 15000 g, promytí 0,5 ml 80% ethanolu, sušení za sníženého tlaku (Speedvac) a rozpuštění ve 20 μΐ H₂O. Po zakončení bylo přidáno 1,5 μΐ dGTP (20 mM), 2,4 μΐ CoCl₂ (25 mM), 6 μΐ 5 x zakončovacího

-9CZ 289155 B6 pufru (1 mM kakodylát draselný, 125 mM Tris-HCl, pH 6,6, 1,25 mg/ml bovinního sérového albuminu) a 0,5 μΐ (15 jednotek) terminální deoxynukleotidyltransferázy (Boehringer).

Směs byla inkubována 1 h při 37 °C, zahřívána 15 min při 65 °C, extrahována jednou stejným objemem pufru TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), nasyceného fenolem a pak vysráženy výše popsaným způsobem ethanolem. Pool zakončené cDNA byl rozpuštěn ve 20 μΐ H° a 1 μΐ byl použit pro PCR. Pro amplifikací byly syntetizovány další dva primery. Jedním byl pozitivní primer specifický pro MTAsu, který je umístěn o 180 bp proti směru exprese od polohy oligonukleotidu 3AS. Druhým byl primer pro konec poly(G). Amplifikace byla prováděna stejně jako výše popsaným způsobem po dobu 40 cyklů. Každý cyklus sestával z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (2 min, 50 °C) a prodlužování (0,5 min, 72 °C).

Produkt PCR byl elektroforeticky rozdělen na 0,8% agarózovém gelu. Získaný fragment DNA 520 bp byl specificky amplifikován. Po provedené, čištění na 0,8% agarózovém preparativním gelu byl fragment DNA 520 bp digerován s Not I a Bel I (příslušná restrikční místa přítomná v překrývající se doméně mezi prodlouženým fragmentem DNA a původním fragmentem subklonu MTAP-2) a subklonován do vektoru pBluescript SK⁺ (Stratagene), vyříznutého pomocí Not Ι/BamHI. Sekvenční analýza tří nezávislých subklonů, označených MTAP4, MTAP-5 a MTAP-6, ukázala, že každý z těchto klonů obsahuje v překrývající se doméně přesně souhlasící sekvenci aminokyseliny.

Délky těchto tří subklonů cDNA z prodlužených primerů se mírně liší. Z toho vyplývá, že se jedná o nezávislé produkty PCR a jejich sekvence odrážejí správnou sekvenci mRNA bez začlenění nějaké báze v průběhu amplifikace PCR. Kombinace nové sekvence proti směru exprese se startovacím kodonem ATG (kódujícím methionin) a sekvence po směru exprese ze subklonu MTAP-2 vytváří otevřený čtecí rámec, kódující 283 aminokyselin.

Příklad VII

Exprese rekombinantní lidské MTAsy v £. coli

Plná délka cDNA lidské MTAsy byla konstruována přidáním fragmentu cDNA subklonu MTAP-4, prodlouženého z primeru, který obsahuje největší inzert ze všech tří subklonů, získaných podle příkladu VI, k 5' konci inzertu DNA subklonu MTAP-2 s použitím jejich společného restrikčního místa HindlI. Fragment DNA not I/HindII ze subklonu MTAP-4 a velký fragment HindlI/EcoRI ze subklonu MTAP-2 byly smíseny a subklonovány do vektoru pBluescript SK⁺ (Strategene), vyříznutého pomocí Not Ι/EcoRI. Získaný subklon, obsahující plnou délku cDNA lidské MTAsy, byl označen MTAP-7. Autenticita tohoto klonu cDNA byla zkontrolována expresí rekombinantního proteinu pomocí expresního vektoru £. coli pKK223-3, opatřeného promotorem Taq (Pharmacia).

K vytvoření nového místa EcoRI na 5'-konci a místa PSt I na 3'-konci fragmentu cDNA byla použita PCR s použitím 5'-příměrového oligonukleotidu, obsahujícího Shine-Dalgamovu (SD) sekvenci, a dalšího 3'-primeru. Amplifikace byla prováděna výše uvedeným způsobem po dobu 20 cyklů, sestávajících vždy z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (1 min, 55 °C) a prodlužování (1 min, 72 °C). Produkt PCR byl digerován s restrikčními enzymy EcoRI/Pst I, čištěn elektroforeticky na 0,8% agarózovém gelu a subklonován do vektoru pBluescript SK⁺ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRI/Pstl.

Po zkontrolování plné sekvence inzertu v subklonu označeném MTAP-7 byl vyříznut fragment EcoRI/PST I a subklonován do vektoru pKK223-3, vyříznutého pomocí EcoRI/Pst I, čímž se získala cDNA lidské MTAsy v expresním vektoru E. coli. Subklon označený MTAP-9 byl transformován do kmene E. coli JMI05. Byla analyzována enzymatická aktivita a spektrum

-10CZ 289155 B6 celkových proteinů transformovaných buněk s indukcí a bez indukce izopropyl-|3-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG). Jedna transformovaná kolonie byla inokulována do 2 ml média LB a inkubována přes noc při 37 °C. 20 μΐ získané kultury bylo přidáno do dvou plastových zkumavek, obsahujících vždy 2 ml čerstvého média LB (zředění 1/100).

Po 1 h inkubace při 37 °C bylo k jedné zkumavce přidáno 20 μΐ 0,1 M IPTG pro indukci na konečnou koncentraci 1 mM IPTG a v inkubaci se pokračovalo 4 h při 37 °C. Po izolaci buněk odstředěním po dobu 5min při 15000 g byly buňky resuspendovány ve 100 μΐ fosfátového pufru (50 mM fosforečnan draselný, pH 7,5, 1 mM DTT), ve stupni 3 rozrušeny sonifikací na ledu po dobu 0,5 min a odstředěním po dobu 10 min při 15000 g byly získány surové buněčné extrakty.

Koncentrace proteinů byla stanovena s použitím Bradfordovy metody (Protein Assay Bio-Rad). Stejná množství vzorků s indukcí a bez indukce IPTG byla analyzována na enzymatickou aktivitu a podrobena elektroforéze na 10% SDS polyakrylamidovém gelu. Surový extrakt, získaný z IPTG indukovaných buněk, vykazoval aktivitu MTAsy více než pětinásobně vyšší než u neindukovaných buněk. Navíc byl na SDS gelu detekován pás nově indukovaného proteinu (31 kDa).

Příklad VIII

Klonování a částečná charakterizace genomového klonu MTAsy

Pro co nejúčinnější amplifikaci fragmentu DNA pomocí PCR pro diagnostické účely by jeho velikost měla přednostně být menší než 500 bp. Sekvence cDNA odráží souhrn exonů, které jsou normálně odděleny introny, což znesnadňuje v sekvenci cDNA nalézt příslušnou sekvenci vhodné velikosti. K překonání tohoto problému byl izolován genomový klon lidské MTAsy. Knihovna kosmidových genů, konstruovaná z DNA lidské placenty (Clontech) byla podrobena screeningu pomocí sondy genu cDNA MTAsy, fragmentu Not I/EcoRI ze subklonu MTAP-7. Transformované buňky E. coli z knihovny se nanesou na plotny LB s obsahem ampicilinu (50 mg/1) s hustotou kolonií 1 až 2.10⁴ na plotnu 135 x 15 mm.

Následující postup byl prováděn způsobem uvedeným v příkladu VI. Z půl milionu kolonií byla izolována jediná pozitivní kolonie s označením MTAP-10 a byla částečně charakterizována analýzou PCR a nepřímým sekvenováním. Byly syntetizovány dva primery, antikódující oligonukleotid, umístěný 120 bp před stop kodonem, a kódující oligonukleotid umístěný 20 bp za stop kodonem, a použity pro analýzu PCR. PCR byla prováděna po dobu 25 cyklů, sestávajících vždy z denaturace (1 min, 92 °C) teplotní hybridizace (2 min, 55 °C) a prodlužování (5 min, 72 °C). Produkty PCR byly odděleny na 0,8% agarózovém gelu.

Umístění exonů, pokud identifikovaných v genu MTAsy výše popsanou metodou, je znázorněno na obr. 1.

Příklad IX

Aplikace oligonukleotidů specifických pro sekvenci MTAsy na maligní buněčné linie pro detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti MTAsy

Za účelem zkoumání použitelnosti oligonukleotidů byla PCR aplikována na několik buněčných linií, o nichž je známo, že obsahují buňky pozitivní a negativní na MTAsu. Genomové DNA byly izolovány způsobem popsaným v příkladu VIII a v množství 1 pg použity pro PCR. Amplifikace byla prováděna výše popsaným způsobem po dobu 40 cyklů, sestávajících z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (1 min, 55 °C) a prodlužování (1/2 min, 72 °C). Produkty PCR byly analyzovány na 1,5% agarózovém gelu. V buněčných liniích, o nichž je známo, že jsou negativní

-11CZ 289155 B6 na MTAsu, nebyla MTAsa detekována, zatímco v MTAsa-pozitivních buněčných liniích byla

MTAsa detekována.

PŘEHLED SEKVENCÍ

SEQ ID NO 1 je genomický klon pro methylthioadenosin fosforylázu (MTAsu).

SEQ IN NO 2 je antigenní MTAsový peptid („peptid 40“).

SEQ IN NO 3 je antigenní MTAsový peptid („peptid 51“).

SEQ IN NO 4 je primer pro PCR amplifikaci genu MTAsy („peptid 1 “).

SEQ IN NO 5 je primer pro PCR amplifikace genu MTAsy („peptid 2“).

SEZNAM SEKVENCÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: ZPŮSOB DETEKCE DEFICITU METHYLTHIOADENOSIN FOSFORYLÁZY V SAVČÍCH BUŇKÁCH (iii) POČET SEKVENCÍ: 5 (iv) KORESPONDENČNÍ ADRESA:

(A) ADRESÁT: Robbins, Berliner & Carson (B) ULICE: 201 N. Figueroa Street, 5^Λ Floor (C) MĚSTO: Los Angeles (D) STÁT: Califomia (E) ZEMĚ: USA (F) POŠT. KÓD: 90012 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (vi) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) KLASIFIKACE:

(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCE/AGENTOVI:

(A) JMÉNO: Berliner, Robert (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 20,121 (C) ZNAČKA/ČÍSLO SPISU: 5555-287 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: 213-977-1001 (B) TELEFAX: 213-977-1003

-12CZ 289155 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2763 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatáza (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: SDS (B) POLOHA: 1..2763 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 1:

- 13CZ 289155 B6

TTTATACAGA	GCATGACAGT	GGGGTCCTCA	CTAGGGTCTG	TCTGCCACTC	TACATATTTG	60
AAACAGGAGT	GGCTTCTCAG	AATCCAGTGA	ACCTAAATTT	TAGTTTTAGT	TGCTCACTGG	120
ACTGGGTTCT	AGGAGACCCC	CTGTGTTAGT	CTGTGGTCAT	TGCTAGSAGA	ATCACTTAAT	180
TTTTTCTAGA	CTCTAGGAGA	AAACAGTTGG	TGGTGTACTC	ATCACGGGTT	AACAATTTCT	240
TCTCTCCTTC	CATAGGCATG	GAAGGCAGCA	CACCATCATG	CCTTCAAAGG	TCAACTACCA	300
GGCGAACATC	TGGGCTTTGA	AGGAAGAGGG	CTGTACACAT	GTCATAGTGA	CCACAGCTTG	360
TGGCTCCTTG	AGGGAGGAGA	TTCAGCCCGG	CGATATTGTC	ATTATTGATC	AGTTCATTGA	420
CANNNNNNNN	NNNNNNNNNN	GAGGTCGACG	GTATCGATAA	GCTTTGTAAA	CAATTGTCTT	480
TAGCTTATCC	AGAGGAATTG	AGTCTGGAGT	AAAGACCCAA	ATATTGACCT	AGATAAAGTT	540
GACTCACCAG	CCCTCGGAGG	ATGGAAAGAT	GGCCTTAAAA	TAAAACAAAC	AAAAACCTTT	600
TTTGCTTTAT	TTTGTAGGAC	CACTATGAGA	CCTCAGTCCT	TCTATGATGG	AAGTCATTCT	660
TGTGCCAGAG	GAGTGTGCCA	TATTCCAATG	GCTGAGCCGT	TTTGCCCCAA	AACGAGAGAG	720
GTGTGTAGTC	TTTCTGGAAG	GTGTACCAGA	ATAAATCATG	TGGGCTTGGG	GTGGCATCTG	780
GCATTTGGTT	AATTGGCAGA	CGGAGTGGCC	CCATACCCTC	ACTCAAGTTT	GCTTTGTATT	840
ATGCAAGTTT	ATGGAGAGTT	ATTTCCTGTT	GCTAATAATT	TNHHNNNNNN	HNNMNHNNHM	900
AAGTGCAGCC	TTAAGTTGTG	CATGTGCTAG	TATGTTTTGA	AGTTTCTGGT	TTTTCTTTTC	960
TAGGTTCTTA	TAGAGACTGC	TAAGAAGCTA	GGACTCCGGT	GCCACTCAAA	GGGGACAATG	1020
GTCACAATCG	AGGGACCTCG	TTTTAGCTCC	CGGGCAGAAA	GCTTCATGTT	CCGCACCTGG	1080
GGGGCGGATG	TTATCAACAT	GACCACAGTT	CCAGAGGTGG	TTCTTGCTAA	GGAGGCTGGA	1140
ATTTGTTACG	CAAGTATCGC	CATGGGCACA	GATTATGACT	GCTGGAAGGA	GCACGAGGAA	1200
GCAGTAGGTG	GAATTCTTTT	CTAAGCACAT	ATAGCATGGG	TTTCTGGGTG	CCAATAGGGT	1260
GTCTTAACTG	TTTGTTTCTA	TTACGTTAGT	TTCAGAAAGT	GCCTTTCTAC	AAGGTTTTGA	1320
AGTTGTTAAT	ATTTTCTGTA	GTTCCATTGG	AAGGTAAGAA	CAAAGATCAA	AAGAAAGAAA	1380
GAGACACTTT	TACCCAAGGA	TCAGTAGTGA	AAATAGTACA	TTGTAGGCAT	GTAGATGTGT	1440
TGAGAATCAT	ACTAAGACTT	GGGCCTTANN	NNNNNNNNNH	NNNNNNNNNN	NNTACCCTAC	1500
ATTGAGGATT	CGGTTTCAGC	AGATAAATTT	GAGGGACACA	AACATTTAGG	CTGTAGCAAG	1560
GCTGGAGCTC	AGAAAAATGT	TTTATGACAA	GCAGTGGAAT	TTTAAGTTCT	AGTAACCTCC	1620

- 14CZ 289155 B6

AGTGCTATTG	TTTCTCTAGG	TTTCGGTGGA	CCGGGTCTTA	AAGACCCTGA	AAGAAAACGC	1680
TAATAAAGCC	AAAAGCTTAC	TGCTCACTAC	CATACCTCAG	ATAGGGTCCA	CAGAATGGTC	1740
AGAAACCCTC	CATAACCTGA	AGGTAAGTGC	AGCCATGGAC	AATCAGGCAT	GTCTGTAGAC	1800
TCTCTATTGT	CTTCTTTTCT	TACTTGCATT	TCACCTTTGG	TCCTCATGTA	TTTTTTGCCA	1860
GCCTAGATGT	TTTCAACAAG	TTTTTGTGAC	ATCTACTACT	ACCATACCAA	CCACTTGTGA	1920
AACTGAGTAG	TCTTATTTTC	TTGGCTGGTA	GTGCAGANNN	NNNNNNNNNN	NNAATAAACA	1980
ATAATCCAGG	CTGGGCTGGT	ATGGCAATAA	GTGATTATCA	GAACAATGCT	CTGAGATAAG	2040
CATTATTAAC	CTCACTTTAC	AGGAAAGGGA	GGTGAGGAAC	CAAGAGTTTA	GAGTACCCGA	2100
AGTTCCACAT	CTGGTTAGTG	AACTTGAAAA	TTTTCTGTAG	AATTTATTTA	AAGTGTATGT	2160
TTCCTGCGTC	CTCACTTTGA	TCTAGAAAAT	CAAAATCTGT	TTTTTTTTTT	AACAAACATC	2220
TCAGTAATTA	CGCCAACATG	TGAATATCAC	TGCCTCCTTT	CTTCCTTTCA	GAATATGGCC	2280
CAGTTTTCTG	TTTTATTACC	AAGACATTAA	AGTAGCATGG	CTGCCCAGGA	GAAAAGAAGA	2340
CATTCTAATT	CCAGTCATTT	TGGGAATTCC	TGCTTAACTT	GAAAAAAATA	TGGGAAAGAC	2400
ATGCAGCTTT	CATGCCCTTG	CCTATCAAAG	AGTATGTTGT	AAGAAAGACA	AGACATTGTG	2460
TGTATAGAGA	CTCCTCAATG	ATTTAGACAA	CTTCAAAATA	CAGAAGAAAA	GCAAATGACT	2520
AGTAACATGT	GGGAAAAAAT	ATTACATTTT	AAGGGGGAAA	AAAAACCCCA	CCATTCTCTT	2580
CTCCCCCTAT	TAAATTTGCA	ACAATAAAGG	GTGGAGGGTA	ATCTCTACTT	TCCTATACTG	2640
CCAAAGAATG	TGAGGAAGAA	ATGGGACTCT	TTGGTTATTT	ATTGATGCGA	CTGTAAATTG	2700
GTACAGTATT	TCTGGAGGGC	AATTTGGTAA	AATGCATCAA	AAGACTTAAA	AATACGGACG	2760
TAC						2763

- 15CZ 289155 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 2:

Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu 15 10 15

Glu Gly (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..13 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 3:

Lee Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gin Ile Gly Ser Met Glu

5 10 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

-16CZ 289155 B6 (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatázové primery (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..8 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 4:

Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys

5 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatázové primery (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..9 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 5:

Thr Trp Gly Ala Asp Val Ile Asn Met

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosin fosforylázu, MTAsu, vybraný z polynukleotidu majícího sekvenci nukleové kyseliny znázorněnou v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1 a polynukleotidu zahrnujícího pouze oblast kódující exony uvedené sekvence nukleových kyselin, jak jsou znázorněny na obr. 1.
2. 2. Rekombinantní expresní vektor, obsahující polynukleotid podle nároku 1.
3. 3. Protilátka, produkovaná imunizací živočicha alespoň jedním z MTAsových peptidů, jako produktem exprese vektorem podle nároku 2.
4. 4. Protilátka podle nároku 3, kterou je monoklonální protilátka, produkovaná hybridomy, tvořenými z buněk imunizovaných živočichů.