CZ289523B6 - Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy - Google Patents
Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289523B6 CZ289523B6 CZ20011776A CZ20011776A CZ289523B6 CZ 289523 B6 CZ289523 B6 CZ 289523B6 CZ 20011776 A CZ20011776 A CZ 20011776A CZ 20011776 A CZ20011776 A CZ 20011776A CZ 289523 B6 CZ289523 B6 CZ 289523B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mtase
- sample
- cells
- nucleic acid
- sequence
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- MXYRZDAGKTVQIL-IOSLPCCCSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-2-methyloxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@]1(C)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O MXYRZDAGKTVQIL-IOSLPCCCSA-N 0.000 title abstract description 7
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 title abstract description 7
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 title abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 59
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108010034457 5'-methylthioadenosine phosphorylase Proteins 0.000 claims description 118
- 102100034187 S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase Human genes 0.000 claims description 107
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 65
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 40
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 8
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 48
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 25
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 abstract description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 abstract description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 abstract description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 20
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WUUGFSXJNOTRMR-IOSLPCCCSA-N 5'-S-methyl-5'-thioadenosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CSC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 WUUGFSXJNOTRMR-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 6
- 101001014043 Puccinia graminis f. sp. tritici (strain CRL 75-36-700-3 / race SCCL) S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase 2 Proteins 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- DUGVKJPEEVFCLG-ZLYFVBIGSA-N (2R,3R,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-2-ethyl-5-(114C)methyl-4-sulfanyloxolan-3-ol Chemical compound [14CH3][C@@]1([C@H](S)[C@H](O)[C@@H](CC)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC1=2 DUGVKJPEEVFCLG-ZLYFVBIGSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 101710201354 Metallothionein A Proteins 0.000 description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical group SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- RTDXMJJSUVCSKB-RUCXOUQFSA-N (2s)-2-azanyl-4-sulfanyl-butanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS.OC(=O)[C@@H](N)CCS RTDXMJJSUVCSKB-RUCXOUQFSA-N 0.000 description 1
- XTIFMHMNJQRXDW-FCKMSMMTSA-N (2s,3r,4s,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-2-methylsulfanyloxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@]1(SC)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O XTIFMHMNJQRXDW-FCKMSMMTSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N Asp-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100022087 Granzyme M Human genes 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- MQFGXJNSUJTXDT-QSFUFRPTSA-N Ile-Gly-Ile Chemical compound N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O MQFGXJNSUJTXDT-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gly-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LBRCLQMZAHRTLV-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010043135 L-methionine gamma-lyase Proteins 0.000 description 1
- IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N Leu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- AJBQTGZIZQXBLT-STQMWFEESA-N Pro-Phe-Gly Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 AJBQTGZIZQXBLT-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101000969082 Puccinia graminis f. sp. tritici (strain CRL 75-36-700-3 / race SCCL) S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- NHQVWACSJZJCGJ-FLBSBUHZSA-N Thr-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NHQVWACSJZJCGJ-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 1
- XEVHXNLPUBVQEX-DVJZZOLTSA-N Thr-Trp-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)NCC(=O)O)N)O XEVHXNLPUBVQEX-DVJZZOLTSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- ABSXSJZNRAQDDI-KJEVXHAQSA-N Tyr-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ABSXSJZNRAQDDI-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026364 glycyl-glycyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012012 milestone trend analyses Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000030266 primary brain neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960000999 sodium citrate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Zp sob detekce, zda je v bun n m vzorku p° tomna methyladenosin fosfat za (MTAsa) bu v katalyticky aktivn nebo katalyticky inaktivn form . V jednom aspektu spo v zp sob v tom, e se ke vzorku p°idaj oligonukleotidov sondy, schopn specifick hybridizace s jakoukoli nukleovou kyselinou ve vzorku, k duj c MTAsu, za podm nek podporuj c ch hybridizaci. Absence MTAsy ve vzorku se pova uje za indikaci malignity. Jsou pops ny polynukleotidy k duj c MTAsu, MTAsov peptidy a protil tky k MTAse, stejn jako kity pro prov d n zp sobu podle vyn lezu.\
Description
Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu detekce deficitu methylthioadenosin fosforylázy v savčích buňkách, který je ukazatelem malignity u těchto buněk. Detekce buněk, které jsou na tento enzym deficitní, umožňuje zaměřit na tyto buňky chemoterapii využívající neschopnosti těchto buněk převádět methylthioadenosin na methionin.
Dosavadní stav techniky
Aminokyseliny methionin (MET) je nezbytná pro růst normálních a maligních buněk. U určitých maligních buněk je tato potřeba absolutní, tzn. že bez adekvátní zásoby methioninu buňky hynou.
V savčích buňkách se MET získává ze tří zdrojů. Je možno jej získat z výživy nebo biochemickou syntézou MET z L-homocysteinu (homocystein) nebo methylthioadenosinu (MTA) (produkt biosyntetické dráhy polyaminů). V posledním případě se MTA převádí na MET pomocí methylthioadenosin fosforylázy (MTAsa; EC 2.4.2.28).
V poslední dekádě identifikovali výzkumníci četné maligní buněčné linie, kterým chybí MTAsa a které tudíž nemohou převádět MTA a MET. Například Katamari a d., Proč. Naťl Adac. USA 78:1219-1223 (1981), uvádějí, že u 23% ze 3 studovaných lidských maligních nádorových buněčných linií chyběla detekovatelná MTAsa, zatímco v každé 16 studovaných nemaligních buněčných linií byla aktivita MTAsy přítomna. Deficit MTAsy byl rovněž zaznamenán jako charakteristika nemalobuněčných rakovin plic (viz Nobori a d., Cancer Res. 53:1098— 1101 (1981)), v 6 liniích buněk lymfomů a leukémií (id.), v buněčných liniích mozkového nádoru a tkáňových vzorcích primárního mozkového nádoru (id.) a v dalších maligních (viz například Kries a d., Cancer Res. 33:1866-1869(1973), Kries a d., Cancer Trmt, Rpts. 63:10691072)(1979), a Rangione a d., Biochem. J. 281:533-538(1992)). MTAsa-negativní buňky principiálně uspokojují svou potřebu MET konverzí homocysteinu. Není-li však k dispozici homocystein, buňky obvykle hynou.
Je známo, že L-methionin-L-deamino-y-merkaptomethan lyáza (ED 4.4.111; METsa) degraduje nejen MET, ale také homocystein. Teoreticky je tedy možno zahubit maligní buňky, jimž chybí MTAsa (tj. MTAsa-negativní buňky) degradací plazmového MET a homocysteinu METasou. Lze předpokládat, že normální MTAsa-pozitivní buňky budou uspokojovat svou potřebu MET pokračující přeměnou MTA na MET.
Jednou z překážek vývoje úspěšného přístupu k vyvolávání nedostatku MET u maligních buněk je potřeba identifikovat, které malignity jsou vhodnými cíli terapie, tj. které maligní jsou MTAsa-negativní. Za tímto účelem byl vyvinut test, který zajišťuje, zda je malignita MTAsanegativní, ze stanovení, zda je v buněčné kultuře přítomna katalytická aktivita (Seidenfeld a d., Biochem. Biophys. Res. Commun. 95:1861-1866,1980). Pro komerční nedostupnost radiochemického substrátu, potřebného pro test aktivity, však není dosud schůdné její použití při rutinních hodnoceních. Test aktivity navíc nepočítá s katalytickou labilitou MTAsy in vitro, jestliže detekuje, zdaje v buněčné kultuře přítomen vůbec nějaký enzym bez ohledu na to, zdaje katalyticky aktivní v době provádění testu.
Toto omezení testu aktivity by bylo možno překonat vyvinutím imunoanalýzy, která by byla dostatečně citlivá pro detekci relativně nepatrných množství enzymu. Ukázalo se však, že čištění enzymu MTAsy z přírodních zdrojů za účelem vývinu protilátky pro použití při imunologické
-1 CZ 289523 B6 detekci MTAsy je pracné a poskytuje relativně špatné výtěžky (Rangione a d., J. Biol. Chem. 261:12 324-12 329,1986).
Neexistence jednoduchého účinného prostředku identifikace MTAsa-deficitních buněk částečně přispívá k trvalé nedostupnosti účinného terapeutického přístupu k selektivnímu vyvolávání nedostatku MET in vivo v MTAsa-deficitních maligních buňkách. Tuto potřebu řeší tento vynález pomocí způsobu detekce přítomnosti nebo nepřítomnosti genu, který kóduje MTAsu, ve vzorku a pomocí rekombinantního zdroje MTAsy.
Podstata vynálezu
Cílem vynálezu je nalézt způsob detekce MTAsa-deficitních buněk (za něž se považují buňky, v nichž není detekovatelně přítomen protein MTAsa v katalyticky aktivní ani katalyticky inaktivní formě). Způsob podle vynálezu je založen na předpokladu, že deficit MTAsy je důsledkem delece genu, který kóduje MTAsu, zgenomu savce, který má MTAsa-negativní malignitu. Způsob podle vynálezu je tudíž zaměřen na detekci polynukleotidu uvnitř domény savčího genomu, kódující protein MTAsu, který, je-li přítomen, kóduje MTAsu, avšak je-li nepřítomen, vede k vývoji MTAsa-deficitních buněk.
Konkrétně je předmětem vynálezu způsob detekce MTAsy, spočívající v tom, že
a) se získá analyzovatelný vzorek buněk, u nichž se předpokládá deficit MTAsy,
b) ke vzorku se přidají detekovatelně značené oligonukleotidové sondy odvozené od sekvence nukleové kyseliny znázorněné v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1, které specificky hybridizují s jakoukoli nukleovou kyselinou, která kóduje MTAsu, přítomnou ve vzorku, a (c) detekuje se hybridizace sond s jakoukoli nukleovou kyselinou kódující MTAsu přítomnou ve vzorku, přičemž přítomnost uvedené nukleové kyseliny indikuje přítomnost katalyticky aktivní nebo inaktivní MTAsy v buňce.
Výhodně se dále provede selektivní amplifikace jakékoli nukleové kyseliny kódující MTAsu přítomné ve vzorku, přednostně za použití polymerázové řetězové reakce. Buňky jsou výhodně odvozeny od známé malignity. Přednostně se buňky rovněž analyzují na katalytickou aktivitu MTAsy.
A. Způsob amplifikace jakékoli MTAsy přítomné v buněčném vzorku
Jak uvedeno výše, předpokladem vynálezu je, že deficit MTAsy v buňkách je důsledkem delece genu, kteiý normálně kóduje MTAsu, ze savčího genomu. Protože je vynález zaměřen na detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti tohoto genu ve vzorku buněk, u nichž je podezření, že jsou MTAsa-negativní, provádí se přednostně amplifikace nukleových kyselin ve vzorku ke zvýšení citlivosti detekční metody. Tato amplifikace se přednostně provádí s použitím polymerázové řetězcové reakce (PCR), i když použití řetězcové reakce v polymeračním stupni není absolutně nutné.
Pro použití při provádění způsobu podle vynálezu se získává biologický vzorek, u něhož je podezření na obsah buněk s deficitem MTAsy. Vzorek může například obsahovat tělesné tekutiny nebo buňky, například z buněčné linie, tkáně nebo tumoru. Tyto vzorky se získávají metodami známými v klinickém oboru, například nádorové buňky je možno získat biopsí nebo chirurgickou resekcí. Přednostně jsou buňky v podstatě prosté „kontaminujících“ příměsí, tj. buněk, proteinů a podobných složek, které by mohly zkreslit výsledek způsobu podle vynálezu. Používají-li se jako zdroj genomové DNA MRTAsy pevné nádory, považují se za
-2CZ 289523 B6 kontaminující příměsi normální nemaligní buňky a MTAsy, která může být z těchto buněk uvolňována během postupu, prováděného při odebírání biologického vzorku.
Nukleová kyselina, která se ve vzorku amplifíkuje, je tvořena genomovou nebo standardní DNA, u níž se normálně předpokládá, že obsahuje MTAsu. Tato DNA (dále „cílová DNA“), která bude amplifikována, může být získána z eukaiyota, přednostně ze savčího organismu. Nej výhodněji se genomová DNA získává z člověka.
Genomová DNA se izoluje známými metodami, například způsobem popsaným v Maniatis a d. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Zde je popsán příklad provedení, demonstrující izolaci genomického klonu lidské MTAsy, kde je podrobena csreeningu knihovna kosmidových genů s použitím dále popsané sondy genu cDNA MTAsy. Odborníkovi je však zřejmé, že k získání DNA podle vynálezu je možno použít i jiných vhodných metod.
Plná délka nukleotidové sekvence genomického klonu pro MTAsu je uvedena v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1; exony v této sekvenci jsou znázorněny v mapě, uvedené na obr. 1. Kmen E. coli, obsahující plnou délku genomové DNA pro krysí MTAsu, byl uložen 30. prosince 1993 v Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, pod přírůstkovým číslem 55536 (exon „TC3“; nukleotidy 616-720 genu MTAsy); 55538 (exon „1.1“; nukleotidy 254-421 genu MTAsy); 55537, 55539 a 55540 („IX-7“, resp. „4-3“, resp. „7-2“; souhrnně zbytek genu MTAsy). Hostitelem pro každý uložený vzorek je E. coli. V současnosti ani v budoucnu se nepřipouští, že uložený vzorek je nezbytný k provedení vynálezu. Vzorek však bude udržován v životaschopné formě po veškerou dobu, vyžadovanou patentovými zákony, vztahujícími se nyní nebo v budoucnu na tento vynález.
Jakmile je získána genomová DNA, vystaví se vzorek, který ji obsahuje, podmínkám, favoritujícím selektivní amplifikaci cílové nukleové kyseliny. Přednostně je cílovou nukleovou kyselinou polynukleotidová část genu, který kóduje MTAsu (tj. „cílový polynukleotid“). Přednostní metodou amplifikace cílového polynukleotidu je PCR. PCR je metoda enzymové syntézy specifických sekvencí DNA nebo RNA in vitro s použitím oligonukleotidových primerů, které hybridizují se specifickými sekvencemi nukleové kyseliny a lemují oblast zájmu v cílové nukleové kyselině. Opakovaná řada cyklů denaturace templátu, teplotní hybridizace primerů a enzymatického prodlužování hybridizovaných primerů vede k exponenciálnímu hromadění specifického fragmentu nukleové kyseliny, definovaného na svých koncích 5'-konci primerů. Výsledné produkty (produkty PCR), syntetizované v jednom cyklu, působí jako templáty pro následující cyklus; počet kopií cílové nukleové kyseliny se tedy v každém cyklu přibližuje zdvojnásobuje.
Základní metody PCR jsou popsány v patentu US 4 683 195 a 4 683 202 Mullise a d., jejichž obsah je zde zahrnut jako příklad konvenčních metod provádění PCR. Vynález však nelze chápat jako omezený na použití metod PCR, které jsou uvedeny v Mullisově patentu 4 683 202. Od vzniku Mullisovy metody byly vyvinuty různé testy na bázi PCR, používající modifikace této metody. Tyto modifikace jsou známy, a tudíž zde nejsou podrobně popisovány. Pro účely osvětlení rozsahu techniky v daném oboru je však dále popsáno několik těchto modifikací.
Metoda PCR, která poskytuje vnitřní amplifikační standard s použitím konkurenčního templátu, jehož sekvence a velikost se liší od cílové nukleové kyseliny, je popsána v Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1990), 87:2 725-2 729 (autoři Gilliland a d.). Jiná metoda provádění „kompetitivní“ PCR, při níž se používají templáty s odlišnou sekvencí, ale ne velikostí, je popsána v Nuc. Acids Res. 21:3 469-3 472 (1993, autoři Kohsaka a d.). Tato metoda je zvlášť výhodná, protože k analýze amplifikovaných nukleových kyselin používá metodu enzymové imunoanalýzy ELISA. Nekompetitivní metoda PCR, která používá místně specifické oligonukleotidy k deteci mutací nebo polymorfismů v genech, rovněž použitelná pro způsob podle vynálezu, je popsána v Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1989) 86:6 230-6 234 (autoři Saiki a d.). Výhodou všech těchto metod je
-3CZ 289523 B6 použití hybridizačních sond, které napomáhají eliminaci zkreslujících pozitivních výsledků, odvozených od jakékoli nespecifické amplifikace, která se může během PCR vyskytnout.
Další informace může odborník získat v Innis a d., „Optimization of PCR's“, PCR Protocols: AGuide to Methods and Applications (Acad. Press, 1990). Tato publikace shrnuje metody ovlivňování specifity, přednosti a výtěžku požadovaných produktů PCR.
Volí se takové oligonukleotidové primery (alespoň jeden příměrový pár), které specificky hybridizují s malými úseky párů bází po obou stranách (tj. 5'a 3j cílového polynukleotidu MTAsy („lemující sekvence“). Odborník je snadno bez přílišného experimentování vybrat vhodné primery na základě informací o polynukleotidové sekvenci, uvedených jako SEQ ID NO 1 v připojeném seznamu sekvencí a na obr. 1.
Pro konstrukci primerů je důležité, aby primery neobsahovaly komplementární báze, aby mohly hybridizovat samy se sebou. Aby se eliminovala amplifikace veškerého kontaminujícího materiálu, popřípadě přítomného ve vzorku, navrhují se primery přednostně tak, aby překlenovaly interval mezi exony (které jsou pro geny MTAsy znázorněny na obr. 1).
Jak výše uvedeno, k adekvátní amplifikaci nukleových kyselin ve vzorku nemusí být nutno v tomto polymeračním stupni používat řetězovou reakci. Například používá-li se metoda popsaná výše citovaným Kohsakou a d. a polymerační stupeň se provádí na pevném nosiči a po něm následuje hybridizace se sondami, specifickými pro cílový polynukleotid, je citlivost postupu taková, že je nutná pouze polymerace cílového nukleotidu.
Jakmile je dokončen stupeň amplifikace, analyzují se produkty PCR za účelem zjištění, zdaje ve vzorku přítomen gen kódující MTAsu. Přednostně jsou dvouvláknové produkty PCR navázány na pevnou fázi, aby bylo možno dvojité vlákno rozdělit denaturací a umožnit hybridizaci sekvenčně specifických sond k navázanému pozitivnímu řetězci produktu PCR za účelem detekce genu v podstatě způsobem popsaným výše citovaným Kohsakou a d. Alternativně se dvouvláknové produkty PCR před přídavkem sond pro hybridizaci odstraní z reakčního prostředí a oddělí od amplifikační směsi. V tomto posledně uvedeném přístupu se produkty PCR oddělují od amplifikační směsi známými způsoby s ohledem na konkrétní zvolenou metodu detekce, například gelovým vylučováním, elektroforézou nebo afinitní chromatografií.
Detekci amplifikovaného produktu je možno provádět s použitím hybridizačních sond, které jsou stabilně asociovány s detekovatelnou značkou. Značka je látka, která může být kovalentně navázána nebo pevně asociována se sondou nukleové kyseliny, což umožňuje sondu detekovat, značkou může být například radioizotop, enzymový substrát nebo inhibitor, enzym, radioopakní látka (včetně koloidních kovů), fluorescenční látka, chemiluminiscenční molekula, liposomy obsahující kteroukoli z výše uvedených značek nebo člen specifického vazebného páru. Vhodná značka neztrácí během amplifikace vlastnost odpovědnou za detekovatelnost.
Odborníkům v oboru diagnostiky jsou známy vhodné detekovatelné značky pro použití v detekčních analýzách in vitro. Vhodné radioizotopy pro použití in vitro například zahrnují 3H, 125I, 1311, 32P, 14C, 35S. Amplifikované fragmenty, značené radioizotopem, mohou být detekovány přímo gama čítačem nebo denzitometrií autoradiogramů, Southemovým blottingem amplifikovaných fragmentů v kombinaci s denzitometrií. Příklady vhodných chemiluminiscenčních molekul jsou akridiny nebo luminol. Cílové sekvence hybridizované se sondami, derivatizovanými akridiumesterem, jsou chráněny před hydrolýzou interkalací. Příklady vhodných fluorescenčních látek jsou fluorescein, fykobiliprotein, cheláty vzácných zemin, dansyl nebo rhodamin.
Příklady vhodných substrátů nebo inhibitorů enzymů jsou sloučeniny, které se specificky vážou na křenovou peroxidázu, glukóza, oxidázu, glukózu-6-fosfát dehydrogenázu, β-galaltosidázu,
-4CZ 289523 B6 puruvát, kinázu nebo acetylchlinesterázu alkalické fosfatázy. Příklady radioopakních látek jsou koloidní zlato nebo magnetické částice.
Specifický vazebný pár zahrnuje dvě různé molekuly, přičemž jedna z nich má na svém povrchu nebo v dutině oblast, která se specificky váže na konkrétní prostorovou a polární organizaci jiné molekuly. Členové specifického vazebného páru se často označují jako ligand a receptor nebo ligand a antiligand. Je-li například receptorem protilátka, je ligandem odpovídající antigen. Další specifické vazebné páry zahrnují dvojice hormon-receptor, enzym-substrát, biotinavidin a glykoprotein-receptor. Zahrnuty jsou rovněž fragmenty a části specifických vazebných párů, které si uchovávají vazebnou specificitu, jako jsou fragmenty imunoglobulinů, včetně fragmentů Fab apod. Protilátky mohou být buď monoklonální nebo polyklonální. Použije-li se jako značka člen specifického vazebného páru, zahrnuje výhodný dělicí postup afinitní chromatografii.
Není-li možno výše popsaným postupem detekovat žádný amplifikovaný produkt, ukazuje to na deficit MTAsy v buňkách přítomných ve vzorku. Protože u normálních (tj. nemaligních) buněk se vždy očekává přítomnost MTAsy v detekovatelném množství, nález deficitu MTAsy indikuje, že analyzovaná genomová DNA byla získána z maligních buněk. Způsob podle vynálezu je zvlášť vhodný pro diagnostické účely, například pro diagnózu deficitu MTAsy, souvisejícího s neoplazmy zejména s maligními neoplazmy.
Podle potřeby může být vzorek předběžně podroben screeningu na katalytickou aktivitu MTAsy metodou popsanou v Seidenfeld a d., Biochem. Biophys. Res. Commun. 95:1 861-1 866 (1980); viz též dále příklad I. Pak je možno použít způsob podle vynálezu ke stanovení, zda je gen kódující MTAsu přítomen v buňkách ve vzorku. Vzorek může být testován rovněž na přítomnost katalyticky aktivního nebo inaktivního proteinu pro účely screeningu kontaminujících příměsí, tj. nemaligních buněk ve vzorku. Vhodná imunoanalýza pro použití v této souvislosti je popsána v Nobori a d., Cances Res. 53:1 098-1 101 (1991) a patentu US 5571510.
B. Produkce syntetických nebo rekombinantních MTAsových polynukleotidů a peptidů
Strategie navrhování polynukleotidů (zejména oligonukleotidů), které umožňují amplifikaci sekvence nukleové kyseliny specifické pro MTAsu, bere v úvahu výše zmíněné aspekty. Takovéto oligonukleotidy jsou zvlášť vhodné pro diagnózu deficitu MTA souvisejícího s malignitou.
Sekvence DNA pro použití při produkci MTAsy a MTAsových peptidů podle vynálezu je rovněž možno získat různými metodami. Například je možno DNA izolovat pomocí známých hybridizačních postupů, které zahrnují, aniž by se na ně omezovaly: 1) hybridizaci sond sgenomovou cDNA nebo s knihovnami cDNA za účelem detekce sdílených nukleotidových sekvencí, 2) protilátkový screening expresních knihoven za účelem detekce sdílených strukturních rysů a 3) syntézu řetězovou reakcí s polymerázou (PCR).
Hybridizační postupy jsou vhodné pro screening rekombinantních klonů s použitím značených smíšených syntetických oligonukleotidových sond, kde každá sonda je potenciálně kompletním komplementem specifické sekvence DNA v hybridizačním vzorku, který zahrnuje heterogenní směs denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace pro takovýto screening se přednostně provádí buď na jednořetězcové DNA nebo denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace je použitelná zejména pro detekci klonů cDNA, odvozených ze zdrojů, kde je přítomno extrémně malé množství sekvencí mRNA, vztahujících se k příslušnému polypeptidu. Jinými slovy je tedy možno při použití příslušných podmínek hybridizace zaměřených na zamezení nespecifické vazby například umožnit autoradiografické zobrazení specifického klonu cDNA hybridizaci cílové DNA s touto jedinou sondou ve směsi.
Knihovna cDNA, obsahující MTAsu, může být podrobena screeningu injekcí různých mRNA, odvozených od cDNA, do oocytů, ponecháním dostatečného času pro expresi genových produktů
-5CZ 289523 B6 cDNA a testováním na přítomnost požadovaného expresního produktu cDNA, například použitím protilátky specifické pro MTAsu nebo použitím sond pro opakující se jednotky a tkáňové expresní vzorce charakteristické pro MTAsu. Alternativně je možno knihovnu cDNA podrobit nepřímo screeningu na MTAsové peptidy, mající alespoň jeden epitop, použitím protilátek specifických pro tyto polypeptidy. Jak je popsáno dále v odstavci C, mohou být takovéto protilátky odvozené buď polyklonálně nebo monoklonálně a mohou být použity k detekci expresního produktu, ukazujícího na přítomnost cDNA MTAsy.
Screeningové postupy, používající hybridizaci nukleových kyselin, umožňují izolovat jakoukoli genovou sekvenci z jakéhokoli organismu, pokud je k dispozici příslušná sonda. Oligonukleovtidové sondy, které odpovídají části sekvence kódující daný protein, mohou být syntetizovány chemicky. K tomu je nutno znát krátké oligopeptidové úseky sekvence aminokyselin. Sekvence DNA kódující protein může být odvozena z genetického kódu, avšak je nutno vzít v úvahu degeneraci kódu. Je-li sekvence degenerovaná, je možno provádět smíšenou adiční reakci. Ta zahrnuje heterogenní směs denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace pro takovýto screening se přednostně provádí buď na jednořetězcové DNA nebo denaturované dvouvláknové DNA.
Vývoj specifických sekvencí DNA kódujících MTAsu nebo její fragmenty je možno rovněž uskutečnit: 1) izolací sekvencí dvouvláknové DNA zgenomové DNA, 2) chemickou výrobou sekvence DNA k získání potřebných kodonů pro daný polypeptid a 3) syntézou sekvence dvouvláknové DNA in vitro reverzní transkripcí mRNA, izolované z eukaryotické donorové buňky. V posledně uvedeném případě se nakonec jako komplement mRNA vytvoří dvouvláknová DNA, která se obvykle označuje cDNA.
Podle vynálezu je možno vložit polynukleotid a jakékoli jeho varianty kódující MTAsu do rekombinantního expresního vektoru. Výraz „rekombinantní expresní vektor“ označuje plazmid, virus nebo jiné známé vehikulum, které bylo podrobeno manipulaci inzerci nebo zabudováním příslušných genetických sekvencí. Takovéto expresní vektory obsahují promotorovou sekvenci, která usnadňuje účinnou transkripci vložené genetické sekvence hostitele.
Transformaci hostitelské buňky pomocí rekombinantní DNA je možno rovněž provádět konvenčními metodami, známými odborníkům. Hostitelské buňky mohou být eukaryotické (jako jsou ovariální buňky čínského křečka) nebo prokaryotické (jako jsou bakterie nebo kvasinky). Je-li hostitel prokaryotický, například E. coli, je možno z buněk získaných po exponenciální fázi růstu připravit kompetentní buňky, které jsou schopny přijmout DNA, a zpracovat je metodou CaCl2, známými postupy. Alternativně je možno použít MgCl2 nebo RbCl. Transformaci je možno rovněž provádět po vytvoření protoplazmy k hostitelské buňce nebo elektroporací.
Izolaci a čištění mikrobiálně exprimované MTAsy nebo jejích fragmentů podle vynálezu může odborník provádět běžnými metodami, zahrnujícími preparativní chromatografií a imunologické separační metody s použitím monoklonálních nebo polyklonálních protilátek.
Na základě informací obsažených v SEQ ID NO 1 je možno snadno odvodit sekvenci aminokyselin plné délky MTAsy. S použitím těchto informací je rovněž možno bez přílišného experimentování syntetizovat MTAsu a MTAsové peptidy s použitím běžných metod, jako je ochrana α-aminoskupin pomocí t-BOC nebo FMOC. Obě metody zahrnují postupnou syntézu, při níž se v každém stupni přidává jedna aminokyselina počínaje C-koncem peptidu (viz Coligan a d., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 991, unit 9). Peptidy podle vynálezu je možno rovněž syntetizovat různými známými metodami syntézy peptidů v pevné fázi, jak jsou popsány například Merrifíeldem, J. Am. Chem. Soc. 85:2 149 (1962), a Stewartem a Youngem, Solid Phase Peptides Synthesis (Freeman, San Francisco, 27-62, 1969), s použitím kopoly(styren-divinylbenzen) s obsahem 0,1 až 1,0 mmol aminů/g polymeru.
-6CZ 289523 B6
Při této posledně uvedené metodě je možno po dokončení chemické syntézy sejmout z peptidů chránící skupiny a peptidy odštěpit od polymeru působením kapalné HF s 10 % anisolu při 0 °C po dobu asi 1/4 až 1 h. Po odpaření reakčních činidel se peptidy extrahují z polymeru 1 % roztokem kyseliny octové, který se pak lyofílizuje a získá se surový materiál. Ten je možno normálně přečistit metodami, jako je gelová filtrace na Sephadexu G-15 s 5 % kyselinou octovou jako rozpouštědlem. Lyofilizací příslušných frakcí sloupce se získá homogenní peptid nebo deriváty peptidu, které pak mohou být charakterizovány standardními metodami, jako je analýza aminokyselin, tenkovrstvá chromatografíe, vysokoúčinná kapalinová chromatografíe, ultrafialová absorpční spektroskopie, molámí rotace, rozpustnost, a kvantifikovány Edmanovou degradací pevné fáze.
C. Produkce protilátek proti MTAse
Antigenicita MTAsových peptidů může být stanovena konvenčními metodami zjišťování velikostí protilátkové odezvy živočicha, který byl imunizován peptidem. Jako MTAsové peptidy k vyvolání tvorby protilátek proti MTAse se obecně používají takové peptidy, které indukují produkci vysokých titrů protilátky s relativně vysokou afinitou k MTAse. Takovéto peptidy mohou být pro použití jako imunogeny čištěny například metodou popsanou Rangionem a d. (J. Biol. Chem., viz výše) nebo výše popsanými metodami získávaní MTAsových peptidů.
Jakmile jsou připraveny antigenní peptidy, získají se protilátky k imunizujícímu peptidu zavedením peptidu do savce (jako je králík, myš nebo krysa). Pro ilustraci jsou v připojeném seznamu sekvencí uvedeny aminokyselinové sekvence dvou antigenních MTAsových peptidů jako SEQ ID. NO. 2 a 3. Protilátky, produkované králíky, imunizovanými těmito peptidy, vykázaly 50 % maximální odpovědi na čištěnou MTAsu při ředění 1:1 500, resp. 1:4 000.
D. Kity pro detekci MTAsy
Je možno připravit kity pro detekci MTAsy pro použití v laboratorních a klinických stanoveních, zahrnující reakční činidla, použitelná ve výše uvedených metodách. Například kit pro použití metodou podle výše uvedeného odstavce A přednostně obsahuje oligonukleotidové primery (získané podle výše uvedeného odstavce B), detekovatelně značené hybridizační sondy a mikrotitrační destičky s povlakem reakčního činidla. Kit může také obsahovat protilátky, popsané výše v odstavci C, pro použití v imunologické detekci MTAsového proteinu (popsané v patentu US 5571510.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje mapu genu pro MTAsu a umístění exonů v polynukleotidu. Předpokládané exony jsou podtrženy; předpokládané introny jsou označeny jednou nebo více náhradami bází v polynukleotidové sekvenci symboly „N“. Sekvence, znázorněná na obr. 1, odpovídá sekvenci, uvedené v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je blíže osvětlen na příkladech provedení, které však neomezují jeho rozsah.
V příkladech jsou použity tyto zkratky: AS = pozitivní; DTT = dithiothreitol; min = minuta; MTAsa= 5'-deoxy-5'-methylthioadenosin fosforyláza; PCR = polymerázová řetězcová reakce; S = negativní; Ssc = 0,3 M NaCl, 0,3 M natriumcitrát dihydrát; v/v = objem na objemu; SDS = dodecylsulfát sodný.
-7CZ 289523 B6
Příklad I
Test katalytické aktivity MTAsy ve vzorku
Fosforolytická aktivita MTAsy byla stanovena měřením tvorby [methyl-14C]-5-methylthioribóza-1-fosfátu z [methyl-14C]-5'-deoxy-5'-methylthioadenosinu (Seidenfeld a d., Biochem. Biophys. Res. Commun. 95, 1 861-1 866, 1980). V celkovém objemu 200 μΐ obsahovala standardní reakční směs 50 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4, 0,5 mM [methyl-14C]-5'-deoxy-5'-methylthioadenosinu (2.105 CPM/mmol), 1 mM DTT a uvedené množství enzymu. Po 20 min inkubace při 37 °C byla reakce zastavena přídavkem 50 μΐ 3M trichloroctové kyseliny a 200 μΐ alikvoty byly naneseny na sloupec 0,6 x 2 cm „Dowex“ 50-H* ekvilibrovaný s vodou. [Methyl-14C]-5-methylthioribóza-l-fosfát byl eluován přímo do scintilačních nádobek obsahujících 2 ml 0,1 M HCI.
Příklad Π
Čištění nativní MTAsy z krysích jater
MTAsa byla izolována z krysích jater modifikací metody Rangiona a d. (J. Biol. Chem. 261,12 324-12 329, 1986). 50 g čerstvých krysích jater bylo homogenizováno v mísiči Waring Blendor se 4 objemy lOmM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4, obsahujícího 1 mM DTT (pufr A). Homogenizát byl odstředěn (1 h při 15 000 g) a vzniklý supematant byl podroben frakcionaci síranem amonným. Precipitát mezi 55 a 75 % nasycení byl shromážděn odstředěním (15 000 g po dobu 20 min) a rozpuštěn v minimálním objemu pufru A. Vzorek pak byl dialyzován přes noc proti třem dávkám 100 objemů téhož pufru.
Vzorek byl vyčiřen odstředěním při 15 000 g po dobu 30 min a pak nanesen na sloupec DEAESephacryl (1,5x18 cm, Pharmacia), předem ekvilibrovaný pufrem A. Po promytí 80 ml ekvilibračního pufru byl aplikován lineární gradient (80 ml) 0 až 0,3 M NaCl v pufru A. MTAsová aktivita byla eluována mezi 0,1 a 0,15 M NaCl. Frakce obsahující alespoň 0,06 jedn./mg proteinu byly 20krát zahuštěny ultrafiltrací (membrány Diaflow Amicon PM-10) a intenzivně dialyzovány proti 25 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4 s obsahem 1 mM DTT (pufr B). Pak byl vzorek nanesen na sloupec hydroxyapatitu (1x12 cm; Bio-Rad). Po eluci nenaabsorbovaných proteinů pufrem B byl sloupec promyt asi 40 ml 50mM fosfátového pufru o pH 7,4 s obsahem 1 mM DTT.
Pak byla eluována MTAsa s použitím lineárního gradientu (40 ml) 50 až 250 mM fosforečnanu draselného, pH 7,4. Frakce obsahující MTAsovou aktivitu byly 30krát zahuštěny ultrafiltrací a zbaveny dithiothreitolu opakovaným koncentrováním a ředěním 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4. Částečně přečištěný enzym pak byl nanesen na sloupec (0,8 x 3 cm) organortuťnaté agarózy (Bio-Rad), ekvilibrované 50mM fosfátovým pufrem o pH7,4. Eluce sloupce byla prováděna postupně a) 50mM fosfátovým pufrem o pH7,4, b) 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, 2 M Kel, a c) 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4,2 M Kel, 40 mM 2-merkaptoethanolu. Enzym pak byl eluován 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, 2 M Kel, 200 mM 2-merkaptoethanolu. Frakce obsahující alespoň 3jedn./mg proteinu byly spojeny, zahuštěny ultrafiltrací na 1 ml a dialyzovány přes noc proti 1 000 obj. 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, 1 M DTT (pufr C). V posledním stupni čištění byly alikvoty vzorku (1 ml) nastřikovány v množství 1 ml/min do kolony „MONOQ“ (Pharmacia), preekvilibrované lOmM Tris/HCl, pH7,4, s obsahem 1 mM DTT a byly jímány frakce 0,5 ml. MTAsová aktivita byla eluována mezi 0,08 a 0,14 M NaCl v pufru C. Frakce byly ultrafiltrací zahuštěny na 0,5 ml a dialyzovány proti 1 000 objemů pufru B.
-8CZ 289523 B6
Příklad III
Stanovení částečné sekvence aminokyselin pro krysí MTAsu
Přečištěný vzorek byl lyofilizován, rozpuštěn v 50 μΐ nosného pufru (1 % dodecylsulfátu sodného (SDS), 10 % glycerinu, 0,1 M DTT a 0,001 % bromfenolové modře) a nanesen na 0,5 mm tlustý polyakiylamidový gel s 10% SDS (zařízení Bio Rad „MINIGEL“). Po elektroforéze byly proteiny přenášeny elektroblottingem po dobu 2h na nitrocelulózu (velikost pórů 0,45 mm, Millipore) v systému transblot Bio-Rad s použitím přenosového pufru (15 mM Tris, 192 mM glycinu a 20 % methanolu, pH 8,3), popsaného Towbinem a d. (Proč. Naťl Acad. Sci. USA 76, 4 340-4 345,1979).
Po přenosu byly proteiny reverzibilně obarveny pomocí Ponceau S (Sigma) modifikovanou metodou, popsanou Salinovichem a Montelarem (Anal. Biochem. 156, 341-347, 1987). Nitrocelulózový filtr byl ponořen na 60 s do roztoku 0,1 % barviva Poceau S v 1 % vodné kyselině octové. Přebytečné zbarvení bylo odstraněno mírným třepáním po dobu 1 až 2 min v 1 % vodné kyselině octové. Oblast obsahující protein, detekovaná barvením, byla vyříznuta, přenesena do Eppendorfovy zkumavky (1,5 ml), promyta destilovanou vodou a inkubována po dobu 30 min při 37 °C v 1,2 ml 0,5% polyvinylpyrrolidonu (průměrná molekulová hmotnost 40 000, PVP-40, Sigma), rozpuštěného ve 100 mM kyseliny octové, za účelem zabránění absorpci proteázy na nitrocelulózu během digesce. Přebytek PVP-40 byl odstraněn intenzivním promytím vodou (alespoň 5 dávek).
Nitrocelulózové proužky pak byly nařezány na malé kousky o velikosti přibližně 1 mm x 1 mm a vloženy zpět do téže zkumavky. Protein na nitrocelulóze byl digerován dříve popsaným způsobem (Los a d., Science 243:217-220, 1989). Přidá se trypsin (10 pmol) ve 100 μΐ lOOmM Tris-HCl, pH 8,2/acetonitril, 95:5 (v/v) a provede se inkubace přes noc při 37 °C. Po digesci byl supematant obsahující peptid okyselen 30 μΐ 10 % trifluoroctové kyseliny, přemístěn rychle na zařízení Vortex a odstřeďován 1 min při 15 000 g. Supematant byl odebrán a okamžitě nastříknut bna systém HPLC s reverzními fázemi (Beckmann), vybavený analytickou kolonou Brownlee Aguapore Bu-300 (2,1 x 100 mm).
Do kolony byl po dobu 5 min jychlostí 200 μΐ/min čerpán eluent d-0,1 % trifluoroctová kyselina (čistota pro sekvenování, ve vodě), načež byl průtok snížen na 100 μΐ/min a byl započat gradient eluentu E (0,08 až 0,095 % trifluoroctová kyselina v acetonitril/H2O 70:30 v/v). Frakce, obsahující peptid podle absorpce UV při 215 nm, byly manuálně sebrány do Eppendorfových zkumavek. Reprezentativní frakce 60 a 77 byly podrobeny sekvenční analýze aminokyselin (ABI477A Protein Seguencer s on-line analyzátorem PTH-AA 120A). Tak byly získány nezávislé částečné sekvence aminokyselin krysí MTAsy. Sekvence aminokyselin peptidů označených jako peptid 1 (frakce 60) a peptid 2 (frakce 77) jsou znázorněny jako SEQ ID NO 5 až 6.
Příklad IV
Amplifikace fragmentu DNA kódujícího část lidského genu MTAsy
Na základě částečných sekvencí aminokyselin peptidů 1 (SEQ ID NO 4) a 2 (SEQ ID NO 5) byly syntetizovány dvě sady oligonukleotidových primérů s různými polaritami. Každý oligonukleotid byl navržen tak, aby obsahoval jediné restrikční místo na 5'-konci (EcoRI nebo BamHI) pro usnadnění následného klonování amplifikovaného fragmentu DNA. Pro použití při amplifikaci PCR byla izolována totální cDNA z 1 milionu jednotek tvořících plak (plague forming units, pfu) z genové knihovny cDNA lidské placenty (Clontech) pomocí kitu „Lambda-TRAP“ (Clontech).
-9CZ 289523 B6
PCR reakce byla prováděna v celkovém objemu 100 pl, obsahujícím 1 pg totální cDNA z genové knihovny cDNA lidské placenty, lxPCR pufr (10 mM Kel, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5mMMgC12), 0,2 mM každého dNTP, po 100 mg negativního a pozitivního primerů a 10 jednotek Tag DNA polymerázy, Stoffel Fragment („AMPLITAQ“, Perkin-Elmer Cetus).
Se systémem „GENE AMP“ PCR Systém 9600 (Perkin-Emmer Cetus) bylo provedeno 40 cyklů, sestávajících vždy zdenaturace (92 °C, 1 min), teplotní hybridizace (55 °C, 2 min) a prodlužování (72 °C, 2 min). PCR produkt byl oddělen elektroforeticky na 0,8 % agarózovém gelu vpufru lxTA(40mM Tris-acetát, 20 mM Na-acetát, 2mM EDTA, pH7,9) a byl amplifikován fragment DNA 450 bp. Produkt amplifikace PCR byl dvakrát digerován s restrikčními enzymy EcoRI/BamHI, rozdělen na 0,8 % agarózovém gelu v pufru 1 x TA, získán z gelu pomocí kitu „GENE CLEAN“ (BiolOl), subklonován do vektoru pBluescript SK+ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRI/BamHI, a sekvenován dideoxyterminační metodou s použitím universálního sekvenčního primerů (kit pro sekvenování DNA „SEQUENASE“ verze 1,0, USB).
Příklad V
Screening genové knihovny cDNA lidské placenty
Sekvenční analýza amplifíkovaného produktu PCR (příklad IV) vykazuje dokonalou shodu s C-terminální sekvencí aminokyselin peptidu 1 (SEQ ID NO ). S použitím fragmentu DNA 450 bp jako hybridizační sondy byla podrobena sereeningu genová knihovna cDNA lidské placenty (Clontech). Za tím účelem byly hostitelské buňky kmene Y1090 E. coli inkubovány při 37 °C přes noc za intenzivního třepání v médiu LB (na litr: 10 g tryptonu, 5g kvasničného extraktu, 10 g NaCl), obsahujícím 0,2 % maltózy a 10 mM MgSP. Pro každou kultivační plotnu bylo 0,3 ml kultury hostitelských buněk smíseno s 3.104 pfu fágů a inkubováno 20 min při 37 °C. Směsi hostitelských buněk a fágů byly přidány k 8 ml média LB, obsahujícího 0,7 % agarózy (LB na agaróze), které bylo předehřáto na 48 °C, a nality na 20 agarových ploten (135 x 15 mm). Po 6 až 8 h inkubace při 37 °C byly viditelné plaky a desky byly po dobu 1 h chlazeny na 4 °C. Plaky byly přeneseny na dobu 3 min na nylonové přenosové membrány Colony/Plague Screen (NEN Research Products, Dupont Boston, MA) a pak denaturovány (dvakrát v 0,5 N NaOH po dobu 2 min), renaturovány (dvakrát v 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5 po dobu 2 min) a fixovány sušením na vzduch. Prehybridizace 20 membrán byla provedena po dobu 4 h při 42 °C ve dvou plastových pytlích po 10 membránách s použitím 20 ml prehybridizačního pufru (1 % SDS, 2 x SSC, 10 % dextransulfátu, 50 % deionizovaného formamidu).
Fragment EcoRI-BamHI 450 bp části lidského genu MTAsy byl označen [a-32P]dATP (3 000 Ci/mmol) s použitím kitu pro posun jednořetězcového zlomu (Boehringer Mannheim), oddělen od nezabudované radioaktivity na koloně NICK (Pharmacia), denaturována zahřátím na 96 °C po dobu 10 min, ochlazen na ledu a přidán k membránám v plastových pytlích s koncentrací sondy 106dpm/ml. Specifická aktivita značené sondy je kolem 10*dpm/pg. Hybridizace byla prováděna přes noc při 42 °C. Po hybridizaci byly membrány promyty třikrát po 5 min při teplotě místnosti přebytkem 2 x SSC, pak 20 min při 65 °C 2 x SSC, 0,1 % SDS a jednou 20 min při teplotě místnosti 0,2 x SSC, 0,1 % SDS. Promyté membrány byly přes noc vystaveny rentgenovému filmu.
Agarové výřezy, obsahující několik plaků kolem pozitivního signálu, byly přeneseny do 1 ml sterilního ředidla fágů (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO4, 0,01 % želatiny) a podrobeny znovu sereeningu výše popsaným způsobem do získání čistých pozitivních plaků.Ze sereeningu přibližně půl milionu plaků bylo získáno 6 nezávislých pozitivních klonů. Po amplifikaci na plotnách LB byla každá fágová DNA pozitivních klonů čištěna s použitím kitu „Lambda-TRAP“ (Clontech). Za účelem získání celého inzertu byly čištěné fágové DNA
-10CZ 289523 B6 rozštěpeny enzymem EcoRI, ale v důsledku existence místa EcoRI uvnitř inzertu byly ze všech klonů vyříznuty dva pásy.
Dva fragmenty inzertu EcoRI (850 a 1 100 bp) z reprezentativního fágového klonu, označeného MTAP-1, byly subklonovány do vektoru pBluescript SK+ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRI. Tyto subklony byly označeny MTAP-2 (850 bp) a MTAP-3 (1 100 bp). Restrikční analýzou a sekvenováním DNA těchto dvou subklonů bylo zjištěno, že subklon MTAP-2 má na C-konci otevřený čtecí rámec kódující 254 aminokyselin, obsahujících sekvenci aminokyselin odpovídající peptidu 3 (90 % homologie). Počítáno z molekulové hmotnosti MTAsy 32 kDa (F. D. Rangione a d., J. Biol. Chem. 261:12 324-12 329, 1986), pokrývá 85 % celého proteinu. Chybí asi 50 aminokyselin (alespoň 150 bp na úrovni DNA).
Příklad VI
Prodlužování primerů pro získání chybějícího 5'-konce cDNA MTAsy
K získání chybějícího 5-'terminálního fragmentu byla použita metoda RACE (rapid amplification of cDNA ends;, Loh a d., Science 243:217-220, 1989; Frohman a d., PNAS 85:8 998-9 002, 1988). pg póly A+( RNA z lidské placenty (Clontech) v 6,25 pl H2O byl 5 min zahříván na 65 °C, zchlazen na ledu a přidán ke 4 pl pufru 5 x RTC (250 mM Tris-HCl, pH 8,15, 30 mM MgCl2, 200 mM KC1, 5 mM DTT), 4 pl (0,4 mg/ml) aktinomycinu D (Boehringer), po 1 pl každého dNTP (20 mM), 0,25 pl (10 jednotek) Rnasinu (Boehringer), 1 pl [a-35S]dATP (1 443 Ci/mmol), 1 pl pozitivního oligonukleotidu 3 AS, specifického pro lidskou MTAsu, a 10 jednotkám reverzní transkriptázy viru ptačí maeloblastózy (Boehringer). Směs byla inkubována 2 h při 42 °C.
Přebytek primerů a dNTP byl odstraněn tímto způsobem: 20pl pool cDNA byl nanesen na kolonu NICK (Pharmacia) a byly jímány dvoukapkové frakce. Frakce 5 až 8, příslušející prvnímu píku radioaktivity, byly spojeny bylo provedeno srážení po dobu 2 h při -80 °C s 1/10 objemu 7,5M NHOAc a 2,5 objemu ethanolu, odstřeďování po dobu 30 min při 4 °C při 15 000 g, promytí 0,5 ml 80 % ethanolu, sušení za sníženého tlaku (Speedvací) a rozpuštění ve 20 pl H2O. Pro zakončení bylo přidáno 1,5 pl dGTP (20 mM), 2,4 pl CoCl2 (25 mM), 6 pl 5 x zakončovacího pufru (1 mM kakodylát draselný, 125 mM Tris-HCl, pH6,6,1,25 mg/ml bovinního sérového albuminu) a 0,5 pl (15 jednotek) terminální deoxynukleotidyltransferázy (Boehringer).
Směs byla inkubovány 1 h při 37 °C, zahřívána 15 min při 65 °C, extrahována jednou stejným objemem pufru TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), nasyceného fenolem a pak vysrážena výše popsaným způsobem ethanolem. Pool zakončené cDNA rozpuštěn ve 20 pl H°a 1 pl byl použit pro PCR. Pro amplifíkaci byly syntetizovány další dva primery.Jedním byl pozitivní primer specifický pro MTAsu, který je umístěn o 180 bp proti směru exprese od polohy oligonukleotidu 3AS. Druhým byl primer pro konec poly(G). Amplifíkace byla prováděna stejně jako výše popsaným způsobem po dobu 40 cyklů. Každý cyklus sestával z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (2 min, 50 °C) a prodlužování (0,5 min, 72 °C).
Produkt PCR byl elektroforeticky rozdělen na 0,8 % agarózovém gelu. Získaný fragment DNA 520 bp byl specificky amplifikóván. Po provedeném čištění na 0,8 % agarózovém preparativním gelu byl fragment DNA 520 bp digerován s Not I a Bel I (příslušná restrikční místa přítomná v překrývající se doméně mezi prodlouženým fragmentem DNA a původním fragmentu subklonu MTAP-2) a subklonován do vektoru pBluescript SK+ (Stratagene), vyříznutého pomocí Not I/BamHI. Sekvenční analýza tří nezávislých subklonů, označených MTAP-4, MTAP-5 aMTAP-6, ukázala, že každý z těchto klonů obsahuje v překrývající se doméně přesně souhlasící sekvenci aminokyselin.
-11 CZ 289523 B6
Délky těchto tří subklonů cDNA z prodloužených primerů se mírně liší. Z toho vyplývá, že se jedná o nezávislé produkty PCR a jejich sekvence odrážejí správnou sekvenci mRNA bez začlenění nějaké báze v průběhu amplifikace PCR. Kombinace nové sekvence proti směru exprese se startovacím kodonem ATG (kódujícím methionin) a sekvence po směru exprese ze subklonu MTAP-2 vytváří otevřený čtecí rámec, kódující 283 aminokyselin.
Příklad VII
Exprese rekombinantní lidské MTAsy v E. coli
Plná délka cDNA lidské MTAsy byla konstruována přidáním fragmentu cDNA subklonu MTAP-4, prodlouženého z primerů, který obsahuje největší inzert ze všech tří subklonů, získaných podle příkladu VI, k 5' konci inzertu DNA subklonu MTAP-2 s použitím jejich společného restrikčního místa HindlI. Fragment DNA Not I/HindII ze subklonu MTAP-4 a velký fragment HindlI/EcoRI ze subklonu MTAP-2 byly smíseny a subklonovány do vektoru pBluescript SK+ (Stratagene), vyříznutého pomocí Not I/EcoRI. Získaný subklon, obsahující plnou délku cDNA lidské MTAsy, byl označen MTAP-7. Autenticita tohoto klonu cDNA byla zkontrolována expresí rekombinantního proteinu pomocí expresního vektoru E. coli pKK223-3, opatřeného promotorem Tag (Pharmacia).
K vytvoření nového místa EcoRI na 5-konci a místa Pst I na 3'-konci fragmentu cDNA byla použita PCR s použitím 5'-příměrového oligonukleotidů, obsahujícího Shine-Dalgamovu (SD) sekvenci, a dalšího 3 '-primerů. Amplifikace byla prováděna výše uvedeným způsobem po dobu 20 cyklů, sestávajících vždy zdenaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (1 min, 55 °C) a prodlužování (1 min, 72 °C). Produkt PCR byl digerován s restrikčními enzymy EcoRI/Pst I, čištěn elektroforeticky na 0,8 % agarózovém gelu a subklonován do vektoru pBluescript SK+ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRI/Pstl.
Po zkontrolování plné sekvence inzertu v subklonu označeném MTAP-8 byl vyříznut fragment EcoRI/Pst I a subklonován do vektoru pKK223-3, vyříznutého pomocí EcoRI/Pst I, čímž se získala cDNA lidské MTAsy v xpresním vektoru E. coli. Subklon označený MTAP-9 byl transformován do kmene E. coli JMI05. Byla analyzována enzymatická aktivita a spektrum celkových proteinů transformovaných buněk s indukcí a bez indukce izopropyl-p-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG). Jedna transformovaná kolonie byla inkubována do 2 ml média LB a inkubována přes noc při 37 °C. 20 μΐ získané kultury bylo přidáno do dvou plastových zkumavek, obsahujících vždy 2 ml čerstvého média LB (zředění 1/100).
Po 1 h inkubace při 37 °C bylo k jedné zkumavce přidáno 20 μΐ 0,1 M IPTG pro indukci na konečnou koncentraci 1 mM IPTG a v inkubaci se pokračovalo 4 h při 37 °C. Po izolaci buněk odstředěním po dobu 5 min při 15 000 g byly buňky resuspendovány ve 100 μΐ fosfátového pufru (50 mM fosforečnan draselný, pH 7,5, 1 mM DTT), ve stupni 3 rozrušeny sonifikací na ledu po dobu 0,5 min a odstředěním po dobu 10 min při 15 000 g byly získány surové buněčné extrakty.
Koncentrace proteinů byla stanovena s použitím Bradfordovy metody (Protein Assay Bio-Rad). Stejná množství vzorků s indukcí a bez indukce IPTG byla analyzována na enzymatickou aktivitu a podrobena elektroforéze na 10 % SDS polyakrylamidovém gelu. Surový extrakt, získaný z IPTG indukovaných buněk, vykazoval aktivitu MTAsy více než pětinásobně vyšší než u neindukovaných buněk. Navíc byl na SDS gelu detekován pás nově indukovaného proteinu (31kDa).
-12CZ 289523 B6
Příklad VIII
Klonování a částečná charakterizace genomového klonu MTAsy
Pro co nejúčinnější amplifikaci fragmentu DNA pomocí PCR pro diagnostické účely by jeho velikost měla přednostně být menší než 500 bp. Sekvence cDNA odráží souhrn exonú, které jsou normálně odděleny introny, což znesnadňuje v sekvenci cDNA nalézt příslušnou sekvenci vhodné velikosti. K překonání tohoto problému byl izolován genomový klon lidské MTAsy. Knihovna kosmidových genů, konstruovaná z DNA lidské placenty (Clontech) byla podrobena screeningu pomocí sondy genu cDNA MTAsy, fragmentu Not I/EcoRI ze subklonu MTAP-7. Transformované buňky E. coli z knihovny se nanesou na plotny LB s obsahem ampicilinu (50 mg/1) s hustotou kolonií 1 až 2.104 na plotnu 135 x 15 mm.
Následující postup byl prováděn způsobem uvedeným v příkladu IV. Z půl milionu kolonií byla izolována jediná pozitivní kolonie s označením MTAP-10 a byla částečně charakterizována analýzou PCR a nepřítomným sekvenováním. Byly syntetizovány dva primery, antikódující oligonukleotid, umístěny 120 bp před stop kodonem, a kódující oligonukleotid umístěný 20 bp za stop kodonem, a použity pro analýzu PCR. PCR byla prováděna po dobu 25 cyklů, sestávajících vždy z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (2 min, 55 °C) a prodlužování (5 min, 72 °C). Produkty PCR byly odděleny na 0,8 % agarózovém gelu.
Umístění exonů, dosud identifikovaných v genu MTAsy výše popsanou metodou, je znázorněno na obr. 1.
Příklad IX
Aplikace oligonukleotidů specifických pro sekvenci MTAsy na maligní buněčné linie pro detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti MTAsy.
Za účelem zkoumání použitelnosti oligonukleotidů byla PCR aplikována na několik buněčných linií, o nichž je známo, že obsahují buňky pozitivní a negativní na MTAsu. Genomové DNA byly izolovány způsobem popsaným v příkladu VIII a v množství 1 pg použity pro PCR. Amplifikace byla prováděna výše popsaným způsobem po dobu 40 cyklů, sestávajících z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (1 min, 55 °C) a prodlužování (1/2 min, 72 °C). Produkty PCR byly analyzovány na 1,5 % agarózovém gelu. V buněčných liniích, o nichž je známo, že jsou negativní na MTAsu, nebyla MTAsa detekována, zatímco v MTAsa-pozitivních buněčných liniích byla MTAsa detekována.
PŘEHLED SEKVENCÍ
SEQ ID NO 1 je genomický klon pro methylthioadenosin fosforylázu (MTAsu).
SEQ ID NO 2 je antigenní MTAsový peptid („peptid 40“).
SEQ ID NO 3 je antigenní MTAsový peptid („peptid 51“).
SEQ ID NO 4 je primer pro PCR amplifikaci genu MTAsy („peptid 1“).
SEQ ID NO 5 je primer pro PCR amplifikaci genu MTAsy („peptid 2“). SEZNAM SEKVENCÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA
- 13CZ 289523 B6 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: ZPŮSOB DETEKCE DEFICITU METHYLTHIOADENOSIN FOSFORYLÁZY V SAVČÍCH BUŇKÁCH (iii) POČET SEKVENCÍ: 5 (iv) KORESPONDENČNÍ ADRESA:
(A) ADRESÁT: Robbins, Berliner & Carson (B) ULICE: 201 N. Figueroa Street, 5th Floor (C) MĚSTO: Los Angeles (D) STÁT: Califomia (E) ZEMĚ: USA (F) POŠT. KÓD: 90012 (v) STROJNĚ ČIŠTĚNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (vi) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:
(B) DATUM PODÁNÍ:
(C) KLASIFIKACE:
(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI/AGENTOVI:
(A) JMÉNO: Berliner, Robert (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 20,121 (C) ZNAČKA/ČÍSLO SPISU: 5555-287 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:
(A) TELEFON: 213-977-1001 (B) TELEFAX: 213-977-1003 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2 763 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatáza (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..2 763 (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 1:
-14CZ 289523 B6
| TTTATACAGA | GCATGACAGT | GGGGTCCTCA | CTAGGGTCTG | TCTGCCACTC | TACATATTTG | 60 |
| AAACAGGAGT | GGCTTCTCAG | AATCCAGTGA | ACCTAAATTT | TAGTTTTAGT | TGCTCACTGG | 120 |
| ACTGGGTTCT | AGGAGACCCC | CTGTGTTAGT | CTGTGGTCAT | TGCTAGSAGA | ATCACTTAAT | 180 |
| TTTTTCTAGA | ctctaggaga | AAACAGTTGG | TGGTGTACTC | ATCACGGGTT | AACAATTTCT | 240 |
| TCTCTCCTTC | cataggcatg | GAAGGCAGCA | CACCATCATG | CCTTCAAAGG | TCAACTACCA | 300 |
| GGCGAACATC | TGGGCTTTGA | AGGAAGAGGG | CTGTACACAT | GTCATAGTGA | CCACAGCTTG | 360 |
| TGGCTCCTTG | AGGGAGGAGA | TTCAGCCCGG | CGATATTGTC | ATTATTGATC | AGTTCATTGA | 420 |
| CANNNNNNNN | NNNNNNNNNN | GAGGTCGACG | GTATCGATAA | GCTTTGTAAA | CAATTGTCTT | 480 |
| TAGCTTATCC | AGAGGAATTG | AGTCTGGAGT | AAAGACCCAA | ATATTGACCT | AGATAAAGTT | 540 |
| GACTCACCAG | CCCTCGGAGG | ATGGAAAGAT | GGCCTTAAAA | TAAAACAAAC | AAAAACCTTT | 600 |
| TTTGCTTTAT | TTTGTAGGAC | CACTATGAGA | CCTCAGTCCT | TCTATGATGG | AAGTCATTCT | 660 |
| TGTGCCAGAG | GAGTGTGCCA | TATTCCAATG | GCTGAGCCGT | TTTGCCCCAA | AACGAGAGAG | 720 |
| GTGTGTAGTC | TTTCTGGAAG | GTGTACCAGA | ATAAATCATG | TGGGCTTGGG | GTGGCATCTG | 780 |
| GCATTTGGTT | AATTGGCAGA | CGGAGTGGCC | CCATACCCTC | ACTCAAGTTT | GCTTTGTATT | 840 |
| ATGCAAGTTT | ATGGAGAGTT | ATTTCCTGTT | GCTAATAATT | TNNNNNNNNM | NNNMMNHNNM | 900 |
| AAGTGCAGCC | TTAAGTTGTG | CATGTGCTAG | TATGTTTTGA | AGTTTCTGGT | TT.TTCTTTTC | 960 |
| TAGGTTCTTA | TAGAGACTGC | TAAGAAGCTA | GGACTCCGGT | GCCACTCAAA | GGGGACAATG | 1020 |
| GTCACAATCG | AGGGACCTCG | TTTTAGCTCC | CGGGCAGAAA | GCTTCATGTT | CCGCACCTGG | 1080 |
| GGGGCGGATG | TTATCAACAT | GACCACAGTT | CCAGAGGTGG | TTCTTGCTAA | GGAGGCTGGA | 1140 |
| ATTTGTTACG | CAAGTATCGC | CATGGGCACA | GATTATGACT | GCTGGAAGGA | GCACGAGGAA | 1200 |
| GCAGTAGGTG | GAATTCTTTT | CTAAGCACAT | ATAGCATGGG | TTTCTGGGTG | CCAATAGGGT | 1260 |
| GTCTTAACTG | TTTGTTTCTA | TTACGTTAGT | TTCAGAAAGT | GCCTTTCTAC | AAGGTTTTGA | 1320 |
| AGTTGTTAAT | ATTTTCTGTA GTTCCATTGG | AAGGTAAGAA | CAAAGATCAA | AAGAAAGAAA | 1380 | |
| GAGACACTTT | TACCCAAGGA TCAGTAGTGA | AAATAGTACA | TTGTAGGCAT | GTAGATGTGT | 1440 | |
| TGAGAATCAT | ACTAAGACTT | GGGCCTTANN | NNNNNNNNNN | NNNNNNNNNN | NNTACCCTAC | 1500 |
| ATTGAGGATT | CGGTTTCAGC | AGATAAATTT | GAGGGACACA | AACATTTAGG | CTGTAGCAAG | 1560 |
| GCTGGAGCTC | AGAAAAATGT | TTTATGACAA | GCAGTGGAAT | TTTAAGTTCT | AGTAACCTCC | 1620 |
- 15CZ 289523 B6
AGTGCTATTG TTTCTCTAGG TTTCGGTGGA CCGGGTCTTA AAGACCCTGA AAGAAAACGC1680
TAATAAAGCC AAAAGCTTAC TGCTCACTAC CATACCTCAG ATAGGGTCCA CAGAATGGTC1740
AGAAACCCTC CATAACCTGA AGGTAAGTGC AGCCATGGAC AATCAGGCAT GTCTGTAGAC1800
TCTCTATTGT CTTCTTTTCT TACTTGCATT TCACCTTTGG TCCTCATGTA TTTTTTGCCA1860
GCCTAGATGT TTTCAACAAG TTTTTGTGAC ATCTACTACT ACCATACCAA CCACTTGTGA1920
AACTGAGTAG TCTTATTTTC TTGGCTGGTA GTGCAGANNN NNNNNNNNNN RNAATAAACA1980
ATAATCCAGG CTGGGCTGGT ATGGCAATAA GTGATTATCA GAACAATGCT CTGAGATAAG2040
CATTATTAAC CTCACTTTAC AGGAAAGGGA GGTGAGGAAC CAAGAGTTTA GAGTACCCGA2100
AGTTCCACAT CTGGTTAGTG AACTTGAAAA TTTTCTGTAG AATTTATTTA AAGTGTATGT2160
TTCCTGCGTC CTCACTTTGA TCTAGAAAAT CAAAATCTGT TTTTTTTTTT AACAAACATC2220
TCAGTAATTA CGCCAACATG TGAATATCAC TGCCTCCTTT CTTCCTTTCA GAATATGGCC2280
CAGTTTTCTG TTTTATTACC AAGACATTAA AGTAGCATGG CTGCCCAGGA GAAAAGAAGA2340
CATTCTAATT CCAGTCATTT TGGGAATTCC TGCTTAACTT GAAAAAAATA TGGGAAAGAC2400
ATGCAGCTTT CATGCCCTTG CCTATCAAAG AGTATGTTGT AAGAAAGACA AGACATTGTG2460
TGTATAGAGA CTCCTCAATG ATTTAGACAA CTTCAAAATA CAGAAGAAAA GCAAATGACT2520
AGTAACATGT GGGAAAAAAT ATTACATTTT AAGGGGGAAA AAAAACCCCA CCATTCTCTT2580
CTCCCCCTAT TAAATTTGCA ACAATAAAGG GTGGAGGGTA ATCTCTACTT TCCTATACTG2640
CCAAAGAATG TGAGGAAGAA ATGGGACTCT TTGGTTATTT ATTGATGCGA CTGTAAATTG2700
GTACAGTATT TCTGGAGGGC AATTTGGTAA AATGCATCAA AAGACTTAAA AATACGGACG2760
TAC2763 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TYPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1.. 17
-16CZ 289523 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 2:
Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu 15 10 15
Glu Gly (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1. .13 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 3:
Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gin Ile Gly Ser Met Glu
5 10 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (Β) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatázové primery (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..8 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 4:
Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys
5
-17CZ 289523 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatázové primery (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..9 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 5:
Thr Trp Gly Ala Asp Val Ile Asn Met 1 5
Claims (5)
1. Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy, MTAsy, v savčích buňkách, vyznačující se tím, že
a) se získá analyzovatelný vzorek buněk, u nichž se předpokládá deficit MTAsy,
b) ke vzorku se přidají detekovatelně značené oligonukleotidové sondy odvozené od sekvence nukleové kyseliny znázorněné v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1, které specificky hybridizují s jakoukoli nukleovou kyselinou, která kóduje MTAsu, přítomnou ve vzorku, a (c) detekuje se hybridizace sond s jakoukoli nukleovou kyselinou kódující MTAsu přítomnou ve vzorku, přičemž přítomnost uvedené nukleové kyseliny indikuje přítomnost katalyticky aktivní nebo inaktivní MTAsy v buňce.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se dále provede selektivní amplifikace jakékoli nukleové kyseliny kódující MTAsu přítomné ve vzorku.
3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že buňky jsou odvozeny od známé malignity.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že buňky se rovněž analyzují na katalytickou aktivitu MTAsy.
-18CZ 289523 B6
5. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že použité podmínky zahrnují polymerázovou řetězovou reakci.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17685593A | 1993-12-29 | 1993-12-29 | |
| CZ19961868A CZ289155B6 (cs) | 1993-12-29 | 1994-12-22 | Izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosin fosforylázu, expresní vektor a protilátka |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ289523B6 true CZ289523B6 (cs) | 2002-02-13 |
Family
ID=22646145
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19961868A CZ289155B6 (cs) | 1993-12-29 | 1994-12-22 | Izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosin fosforylázu, expresní vektor a protilátka |
| CZ20011776A CZ289523B6 (cs) | 1993-12-29 | 2001-05-21 | Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19961868A CZ289155B6 (cs) | 1993-12-29 | 1994-12-22 | Izolovaný polynukleotid, který kóduje methylthioadenosin fosforylázu, expresní vektor a protilátka |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0733123B1 (cs) |
| JP (1) | JPH09507755A (cs) |
| CN (2) | CN1513997A (cs) |
| AT (1) | ATE215128T1 (cs) |
| AU (1) | AU690632B2 (cs) |
| CA (1) | CA2179908A1 (cs) |
| CZ (2) | CZ289155B6 (cs) |
| DE (1) | DE69430258T2 (cs) |
| DK (1) | DK0733123T3 (cs) |
| ES (1) | ES2174927T3 (cs) |
| HU (1) | HU220196B (cs) |
| NO (1) | NO962715L (cs) |
| NZ (1) | NZ279044A (cs) |
| PL (1) | PL181667B1 (cs) |
| PT (1) | PT733123E (cs) |
| RO (1) | RO117386B1 (cs) |
| WO (1) | WO1995018233A1 (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5840505A (en) * | 1993-12-29 | 1998-11-24 | The Regents Of The University Of California | Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity in methylthioadenosine phosphorylase deficient cells |
| US5861154A (en) * | 1995-10-30 | 1999-01-19 | Shionogi & Co., Ltd. | Recombinant L-methionine γ-lyase |
| EP1594900A2 (en) | 2003-02-14 | 2005-11-16 | Salmedix, Inc. | Compositions and methods for the detection and treatment of methylthioadenosine phosphorylase deficient cancers |
| CN1924014B (zh) * | 2005-09-01 | 2011-08-17 | 中国医学科学院肿瘤研究所 | 抑制肿瘤转移的特异性干扰MTA1 mRNA的干扰RNA序列 |
| EP3727420A4 (en) * | 2017-12-21 | 2022-04-06 | Board of Regents, The University of Texas System | Enzyme-mediated depletion of adenosine and/or methylthioadenosine |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
-
1994
- 1994-12-22 NZ NZ279044A patent/NZ279044A/en unknown
- 1994-12-22 AT AT95907260T patent/ATE215128T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-12-22 EP EP95907260A patent/EP0733123B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-22 HU HU9601776A patent/HU220196B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-12-22 CN CNA021578664A patent/CN1513997A/zh active Pending
- 1994-12-22 WO PCT/US1994/014920 patent/WO1995018233A1/en active IP Right Grant
- 1994-12-22 CZ CZ19961868A patent/CZ289155B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-12-22 AU AU15551/95A patent/AU690632B2/en not_active Ceased
- 1994-12-22 DK DK95907260T patent/DK0733123T3/da active
- 1994-12-22 DE DE69430258T patent/DE69430258T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-22 CN CN94195031A patent/CN1103820C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-22 JP JP7518170A patent/JPH09507755A/ja active Pending
- 1994-12-22 RO RO96-01325A patent/RO117386B1/ro unknown
- 1994-12-22 CA CA002179908A patent/CA2179908A1/en not_active Abandoned
- 1994-12-22 PT PT95907260T patent/PT733123E/pt unknown
- 1994-12-22 PL PL94315230A patent/PL181667B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-12-22 ES ES95907260T patent/ES2174927T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-06-27 NO NO962715A patent/NO962715L/no unknown
-
2001
- 2001-05-21 CZ CZ20011776A patent/CZ289523B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1513997A (zh) | 2004-07-21 |
| EP0733123A4 (en) | 1999-04-21 |
| DK0733123T3 (da) | 2002-07-22 |
| PL181667B1 (pl) | 2001-08-31 |
| PT733123E (pt) | 2002-09-30 |
| CN1145640A (zh) | 1997-03-19 |
| NO962715L (no) | 1996-08-26 |
| JPH09507755A (ja) | 1997-08-12 |
| RO117386B1 (ro) | 2002-02-28 |
| NZ279044A (en) | 1997-10-24 |
| EP0733123A1 (en) | 1996-09-25 |
| DE69430258T2 (de) | 2002-10-17 |
| CA2179908A1 (en) | 1995-07-06 |
| CZ186896A3 (en) | 1996-11-13 |
| HUT74668A (en) | 1997-01-28 |
| WO1995018233A1 (en) | 1995-07-06 |
| CZ289155B6 (cs) | 2001-11-14 |
| EP0733123B1 (en) | 2002-03-27 |
| CN1103820C (zh) | 2003-03-26 |
| ATE215128T1 (de) | 2002-04-15 |
| DE69430258D1 (de) | 2002-05-02 |
| AU690632B2 (en) | 1998-04-30 |
| NO962715D0 (no) | 1996-06-27 |
| HU9601776D0 (en) | 1996-09-30 |
| AU1555195A (en) | 1995-07-17 |
| ES2174927T3 (es) | 2002-11-16 |
| HU220196B (hu) | 2001-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6887660B2 (en) | Compounds for immunodiagnosis of prostate cancer and methods for their use | |
| US5942393A (en) | Method for the detection of the presence or absence of methylthioadenosine phosphorylase (MTASE) in a cell sample by detection of the presence or absence of MTASE encoding nucleic acid in the cell sample | |
| JP4969638B2 (ja) | 単球由来核酸および関連する組成物ならびに方法 | |
| WO2001062968A2 (en) | Mutant nucleic binding enzymes and use thereof in diagnostic, detection and purification methods | |
| CA2377665A1 (en) | Methods and compositions for assaying analytes | |
| Dombroski et al. | The ATP binding site on rho protein. Affinity labeling of Lys181 by pyridoxal 5′-diphospho-5′-adenosine. | |
| EP0708838A1 (en) | Use of heparanase to identify and isolate anti-heparanase compound | |
| KR100828506B1 (ko) | 마우스 정자 형성 유전자와 인간 남성 불임 관련 유전자,및 이들을 사용한 진단 시스템 | |
| JPH09511910A (ja) | 腫瘍サプレッサ遺伝子、並びに癌の検出、腫瘍進行のモニタおよび癌処理のための方法 | |
| JP2653653B2 (ja) | インターフエロン誘起遺伝子及び酵素 | |
| KR100938308B1 (ko) | 장내 세균의 검출 및 동정 | |
| CZ289523B6 (cs) | Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy | |
| US6911309B2 (en) | Nucleic acids encoding MTAse | |
| AU725973B2 (en) | Method for determining predisposition to boar taint | |
| CA2345000A1 (en) | A novel method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating gastrointestinal cancers | |
| US20030138928A1 (en) | Tumor suppressor gene and methods for detection of cancer, monitoring of tumor progression and cancer treatment | |
| US6689864B1 (en) | Cyclin dependent kinase 4 inhibitor | |
| WO2004018518A1 (ja) | ヒト固形癌抗原ペプチドとこれをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの利用 | |
| US7008772B1 (en) | Compounds for immunodiagnosis of prostate cancer and methods for their use | |
| WO1997001634A2 (en) | Polypeptide for repairing genetic information, nucleotidic sequence which codes for it and process for the preparation thereof (guanine thymine binding protein - gtbp) | |
| CA2457823A1 (en) | Methods for diagnosing and treating neoplasias using nf-at transcription factors | |
| CN117947002A (zh) | 一种突变型β-葡萄糖醛酸酶及其制备方法与应用 | |
| MXPA01012717A (es) | Expresion genica modulada en inflamacion gastrointestinal. | |
| Lederkremer et al. | A secreted form of the asialoglycoprotein receptor, SH2A, as a non-invasive biomarker for liver fibrosis and function |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20031222 |