CN110361461A - 一种蛋鸭应激状态的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蛋鸭应激状态鉴别方法，所述方法包括：(1)笼养蛋鸭血液经处理得到的血浆作为待测组样品，平养蛋鸭血液经处理得到的血浆为对照组样品；(2)采用色谱‑质谱分析，得到质谱结果；(3)对下机数据库进行分析后，得到代谢物的鉴定结果和代谢物丰度结果；(4)对待测组样品和对照组样品中的特征标志物的表达量进行T‑检验；待测组样品和对照组样品相比，若D‑苯基乳酸的表达量出现显著下调(P＜0.05)，即蛋鸭正处于笼养应激反应期；否则蛋鸭正处于笼养应激恢复期。该方法能够简便、准确地鉴别蛋鸭应激状态。

Description

一种蛋鸭应激状态的鉴别方法

技术领域

本发明涉及家禽育种与健康养殖技术领域，尤其涉及一种蛋鸭应激状态的鉴别方法。

背景技术

我国蛋鸭养殖量占世界的70％以上。随着设施化养殖的不断推广和人民对环保要求的日益提高，传统的蛋鸭水养模式因其生产效率低，环境污染大，逐渐受到挑战。目前，离水养殖成为主要的蛋鸭养殖手段。蛋鸭离水养殖主要采用三种方式，分别为：地面旱养模式、网床养殖模式和笼养模式。笼养模式因其生产效率高，蛋品洁净度好，粪污易于处理，逐渐被大型养殖企业和生产厂户接受。

但是，笼养蛋鸭存在着上笼应激问题，主要由于受环境限制，蛋鸭自然天性难以满足，应激反应明显。蛋鸭应激表现为体重减轻、体增重下降、采食量下降、抗病力降低等，应激造成的机体应激损伤需要一段时间才能够恢复。因此，可将蛋鸭上笼导致的生理性应激分为应激反应期和应激恢复期两个时期：第一阶段蛋鸭对刺激产生直接反应及代偿反应；第二阶段蛋鸭对笼养条件出现适应。对蛋鸭个体所处的上述两个阶段的科学鉴别，可广泛应用于笼养蛋鸭品种的选择，以及抗笼养应激蛋鸭新品种(系)的选育，还为饲养过程中的应对应激提供了新的靶点，具有重要的理论意义和实践意义。但是，基于体重、采食量、体增重、血清(浆)糖皮质激素含量、血清(浆)氧化应激指标、肠粘膜氧化应激水平等一系列指标综合检测，采样复杂，度量难度大，有时还要对个体进行屠宰，无法实现活体评价。

发明内容

本发明的目的在于提供了蛋鸭应激状态的鉴别方法，能够准确有效鉴别应激状态，简便、客观、精确，并有助于揭示蛋鸭笼养应激过程中的机体应答机制。

为实现上述目的，本发明是这样实现的：

本发明的目的在于提供了一种蛋鸭应激状态的鉴别方法，以D-苯基乳酸作为鉴别蛋鸭应激状态的特征标志物。

所述方法具体包括如下步骤：

步骤1、笼养蛋鸭血液经处理得到的血浆作为待测组样品，地面平养蛋鸭血液经处理得到的血浆为对照组样品；

步骤2、采用高效液相色谱-三重四级杆/超高场Orbitrap质谱分析所述待测组样品，得到质谱结果；

步骤3、对质谱结果中的下机数据库进行分析后，得到代谢物的鉴定结果和代谢物丰度结果；

步骤4、对待测组样品和对照组样品中的特征标志物的表达量进行T-检验，所述特征标志物为D-苯基乳酸；

待测组样品和对照组样品相比，若D-苯基乳酸的表达量出现下调，且差异显著P＜0.05，即蛋鸭正处于笼养应激反应期；否则蛋鸭正处于笼养应激恢复期。

本发明具备的有益效果是：

1、本发明提供的一种蛋鸭应激状态的鉴别方法，确定了以D-苯基乳酸作为鉴别蛋鸭应激状态的特征标志物，本发明筛选获得的标志代谢物D-苯基乳酸能够准确有效鉴别应激状态，并有助于揭示蛋鸭在笼养应激过程中的应答机制，标志代谢物的确定使分析更加简便、客观、精确；

本发明采用D-苯基乳酸作为用于鉴别蛋鸭应激状态的标志代谢物鉴别荆江蛋鸭三系配套商品代蛋鸭(实施例2)、山麻鸭(实施例3)、金定鸭(实施例4)与常规方法“体重变化数据、体增重数据、采食量情况数据、血清中D-乳酸情况、血清中内毒素情况、血清糖皮质激素变化数据、血清氧化应激指标，肠粘膜氧化应激指标等一系列指标结果”鉴别的结果一致。

2、本发明首次将非靶向高效液相色谱-三重四级杆/超高场Orbitrap质谱(LC-MS)技术应用于蛋鸭笼养应激状态代谢标志物的获得及应激状态鉴别；

3、本发明提供的一种蛋鸭应激状态的鉴别方法，可广泛应用于笼养蛋鸭品种的选择，以及抗应激笼养蛋鸭新品种(系)的选育，还为饲养过程中的应对应激提供了新的靶点，为提高我国蛋鸭设施化养殖水平具有重要的理论意义和实践意义。

附图说明

图1是实施例1中笼养应激5天(CR5)组、笼养应激10天(CR10)组、笼养应激15天(CR15)组和地面对照(TB)组在负离子模式下的PCA图；其中，编号23-27为TB组样品；13-18为CR5组样品；1-6为CR10组样品；7-12为CR15组样品；19-21为质控组样品，图中横坐标PC1和纵坐标PC2分别表示排名第一和第二的主成分的得分，置信椭圆为95％；

图2分别是实施例1中笼养应激5天(CR5)组，笼养应激10天(CR10)组和笼养应激15天(CR15)组与地面对照(TB)组的代谢物分析火山图；其中(A)图为应激5天组与地面对照组之间差异代谢物火山图；(B)图为应激10天组与地面对照组之间差异代谢物火山图；(C)图为应激15天组与地面对照组之间差异代谢物火山图；

图3为实施例1中D-苯基乳酸代谢物在笼养应激10天与对照组比较获得的ROC曲线图；

图4是实施例2中标志代谢物D-苯基乳酸的质谱图；(A)图为1级质谱图，(B)图为2级质谱图。

具体实施方式

实施例1用于鉴别蛋鸭应激状态的标志代谢物的获得

1、抽取已知上笼天数的蛋鸭血液500μl为实验组(待鉴别组)，抽取与上笼蛋鸭日龄相近(±8d)的平养蛋鸭血液500μl为对照组。血样肝素钠抗凝，5000rpm、4℃离心10min后，获得200μL血浆，液氮冻存，备用。

2、取步骤1的部分血浆样本等量混合制备质控样本，将步骤1获得的血浆样本以及质控样本100μL/样，置于EP管中，加入500μL含0.1％甲酸的80％甲醇水溶液，涡旋震荡后，冰浴静置5min，15000rpm、4℃离心10min，取一定量的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为60％，并置于带有0.22μm滤膜的离心管中15000g、4℃离心10min，收集滤液，进行高效液相色谱-三重四级杆/超高场Orbitrap质谱(LC-MS)检测。所述高效液相色谱使用AccucoreHILIC column色谱柱，质谱扫描范围选择m/z 100-1500。将下机数据搜库分析及峰面积分析后，得到代谢物的鉴定结果和和各代谢物丰度结果。

3、采用主成分分析法(PCA)对每组标准样品的数据进行分析，以初步判断以标志代谢物衡量应激状态变化是否可行：上笼应激一定时间后，蛋鸭采食量和体重已经开始上升，若实验组数据与对照组数据聚集在各自的95％置信限椭圆图内，且两组数据能够完全分离，则初步判断该阶段仍处于应激反应期；结果见图1，可知存在区分应激反应期和应激恢复期的标志代谢物。

图1为样品PCA分析图，PCA分析图是将所有实验样本和QC样本提取得到的峰，经Pareto-scaling处理后进行PCA分析。其中图1中的编号23-27为TB组样品；13-18为CR5组样品；1-6为CR10组样品；7-12为CR15组样品；19-21为质控组样品；图1中横坐标PC1和纵坐标PC2分别表示排名第一和第二的主成分的得分，置信椭圆为95％。

4、分析实验组和对照组数据，根据PLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度(Variable Importance in the Projection，VIP)值，并结合T检验的P值(P-value)来寻找差异性表达代谢物，其中设置阈值为：VIP＞1.0，差异倍数(Fold Change,FC)＞2.0或FC＜0.5且P值＜0.05。

5、对每个代谢物差异倍数以2为底取对数，将P值以10为底取对数的绝对值，绘制火山图，进一步从步骤4所述的潜在标志物中筛选特征标志物。所述火山图以log2(foldchange)为横坐标，-log10(P-value)为纵坐标，并取Fold change＞2，且P-value＜0.05的数值作图，结果见图2。

图2为火山图，为由每个代谢物差异倍数以2为底取对数，将p-value值以10为底取对数的绝对值做出。本代谢物为负离子模式鉴定获得的代谢物，因此，提供的火山图是以负离子模式鉴定获得的代谢物丰度为基础绘制的火山图。图中：横坐标表示差异代谢物的差异倍数(log2值)，纵轴表示p-value(-log10值)，黑色(图内下侧区域)代表差异不显著的代谢物(NoDiff)，红色(图内右上侧区域)代表上调代谢物(UP)，绿色(图内左上测区域)代表下调代谢物(DW)，图中圆点的大小代表VIP数值。

6、根据实验组和对照组的分析结果，绘制接受者操作特性曲线(receiveroperating characteristic curve，ROC曲线)如图3所示，并计算AUC值，以最大AUC值对应的物质作为可用于鉴别蛋鸭笼养应激状态的标志代谢物。最终得到代谢物D-苯基乳酸作为用于鉴别蛋鸭应激状态的标志代谢物。由图3可知，该标志物AUC值为1，表示作为区分应激反应期和应激恢复期的标志代谢物。Trp单独使用能够对样本进行区分，且有很好的灵敏度和特异性。(纵坐标表示真阳性率，横坐标表示假阳性率)。

下面即为D-苯基乳酸这代谢物作为用于鉴别蛋鸭应激状态的标志代谢物鉴别荆江蛋鸭三系配套商品代蛋鸭(实施例2)、山麻鸭(实施例3)、金定鸭(实施例4)。

实施例2

一、荆江蛋鸭应激状态的鉴别

步骤1、样品的获得：选取120日龄荆江蛋鸭三系配套商品代蛋鸭，分别采集蛋鸭上笼5天组，10天组，15天组以及地面平养组蛋鸭的血样，每组样品6个。血样肝素钠抗凝，5000rpm、4℃离心10min后，获得200μL血浆，液氮冻存，备用。

步骤2、色谱-质谱分析：取步骤1的部分血浆样本等量混合制备质控样本，将步骤1获得的血浆样本以及质控样本100μL/样，置于EP管中，加入500μL含0.1％甲酸的80％甲醇水溶液，涡旋震荡后，冰浴静置5min，15000rpm、4℃离心10min，取一定量的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为60％，并置于带有0.22μm滤膜的离心管中15000g、4℃离心10min，收集滤液，进行高效液相色谱-三重四级杆/超高场Orbitrap质谱(LC-MS)检测。

高效液相色谱采用Thermo Scientific Accucore HILIC column色谱柱，柱温：40℃；流速：0.2mL/min。正模式中：以0.1％甲酸，95％乙腈，10mM醋酸铵为流动相A：0.1％甲酸，50％乙腈，10mM醋酸铵为流动相B。负模式中：95％乙腈，10mM醋酸铵为流动相A；50％乙腈，10mM醋酸铵为流动相B，负模式A、B流动相pH均为9.0。所述的梯度洗脱为：0-1.5min：98％A，2％B；1.5-12min：98％A，2％B；12-14min：100％B；14-16min：98％A，2％B。

质谱扫描范围选择m/z 100-1500，质谱条件的设置如下：喷雾电压：3.2kV；鞘流气，辅助气压力分别为35arb和10arb；离子传输管温度为：320℃。极性：正极，负极；MS/MS二级扫描为数据依赖型扫描。

步骤3、将下机数据导入CD(compound discover)搜库软件中，进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后对不同样品根据保留时间偏差0.1min和质量偏差5ppm进行峰对齐，使鉴定更准确，随后根据设置的质量偏差5ppm、信号强度偏差30％、信噪比3、最小信号强度100000、加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud和Chemspider数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到代谢物鉴定结果和定量结果。D-苯基乳酸的质谱图见图4。

步骤4、对待测组样品和对照组样品中的特征标志物的表达量进行T-检验：对荆江蛋鸭三元配套组合上笼5天组，10天组，15天组和地面组的D-苯基乳酸(D(+)-Phenyllacticacid)的表达量进行T检验后，实验结果详见表1。

表1

表1中右肩字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

由表1可知，D-苯基乳酸代谢物在应激反应过程中，上笼5天组和上笼10天组表达量与对照组相比均出现显著下调(P＜0.05)，表明上笼5天组和上笼10天组的蛋鸭正处于笼养应激反应期。

上笼15天组表达量与对照组相比，D-苯基乳酸代谢物的表达量的差异均不显著，表明上笼15天组的蛋鸭正处于应激恢复期。

二、鉴别蛋鸭应激状态的方法的准确性验证

1、得到代谢物鉴定结果和定量结果后采用主成分分析法(PCA)对每组标准样品的数据进行分析：上笼应激5天后蛋鸭体重尚未开始上升，表示其仍处于应激反应期；上笼10天后，蛋鸭采食量和体重已经开始上升，上笼10天组数据与地面对照组数据聚集在各自的95％置信限椭圆图内，两组数据能够完全分离，判断该阶段仍处于应激反应期；上笼15天后，上笼15天实验组数据与地面对照组数据聚集在各自的95％置信限椭圆图内，两组数据不能够完全分离，判断该阶段仍处于应激恢复期。

2、基于荆江蛋鸭三元配套组合上笼5天，10天，15天和地面组的体重变化数据、体增重数据、采食量情况数据、血清中D-乳酸情况、血清中内毒素情况、血清糖皮质激素变化数据、血清氧化应激指标，肠粘膜氧化应激指标等一系列指标结果表明，蛋鸭在上笼第5天、第10天均处于应激反应期，第15天为应激恢复期。与本实施例提供的蛋鸭应激状态的鉴别方法的结果一致。

实施例3

一、山麻鸭应激状态的鉴别

步骤1、所述品种为山麻鸭，蛋鸭上笼日龄为100天，评价期为上笼后第6天和第12天。采集上笼第6天和第12天的待评价蛋鸭样品，同时采集相近日龄的地面养殖组蛋鸭样品每组样品6个。血样肝素钠抗凝，5000rpm、4℃离心10min后，获得200μL血浆，液氮冻存，备用。

步骤2、取获得的血浆样本以及质控样本100μL/样，置于EP管中，加入500μL含0.1％甲酸的80％甲醇水溶液，涡旋震荡后，冰浴静置5min，15000rpm、4℃离心10min，取一定量的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为60％，并置于带有0.22μm滤膜的离心管中15000g、4℃离心10min，收集滤液，进行高效液相色谱-三重四级杆/超高场Orbitrap质谱(LC-MS)检测。

高效色谱分析采用Thermo Scientific Accucore HILIC column色谱柱进行，柱温：40℃；流速：0.2mL/min。正模式中：以0.1％甲酸，95％乙腈，10mM醋酸铵为流动相A：0.1％甲酸，50％乙腈，10mM醋酸铵为流动相B。负模式中：95％乙腈，10mM醋酸铵为流动相A；50％乙腈，10mM醋酸铵为流动相B，负模式A、B流动相pH均为9.0。所述的梯度洗脱为：0-1.5min：98％A，2％B；1.5-12min：98％A，2％B；12-14min：100％B；14-16min：98％A，2％B。

质谱扫描范围选择m/z 100-1500；质谱条件的设置如下：喷雾电压：3.2kV；鞘流气，辅助气压力分别为35arb和10arb；离子传输管温度为：320℃。极性：正极，负极；MS/MS二级扫描为数据依赖型扫描。

步骤3、将下机数据导入CD(compound discover)搜库软件中，进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后对不同样品根据保留时间偏差0.1min和质量偏差5ppm进行峰对齐，使鉴定更准确，随后根据设置的质量偏差5ppm、信号强度偏差30％、信噪比3、最小信号强度100000、加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud和Chemspider数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到代谢物鉴定结果和定量结果。D-苯基乳酸的质谱图同图4。

步骤4、对待测组样品和对照组样品中的特征标志物D-苯基乳酸的表达量进行T-检验；对山麻鸭上笼第6天组和第12天组和地面组的表达量进行T检验后，实验结果详见表2。

表2

差异代谢物	TB	CR6	CR12
				D(+)-Phenyllactic acid	514648±175207<sup>a</sup>	155429±63777<sup>b</sup>	167551±26558<sup>b</sup>

表2中右肩字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

由表2可知，山麻鸭上笼6天组和12天组的D-苯基乳酸表达量值与对照组相比均出现显著变化，即表示蛋鸭正处于笼养应激反应期。

二、鉴别蛋鸭应激状态的方法的准确性验证

基于山麻鸭上笼6天，12天和地面组的体重变化数据、体增重数据、采食量情况数据、血清中D-乳酸情况、血清中内毒素情况、血清糖皮质激素变化数据、血清氧化应激指标，肠粘膜氧化应激指标等一系列指标结果表明，蛋鸭在上笼第6天、第12天均为应激反应期。与实施例提供的蛋鸭应激状态的鉴别方法的结果一致。

实施例4

一、金定鸭应激状态的鉴别

步骤1、所述品种为金定鸭，上笼日龄为90天，评价期为上笼后第6天和第12天。采集上笼第6天和第12天的待评价蛋鸭样品，同时采集相近日龄的地面养殖组蛋鸭样品每组样品3个。血样肝素钠抗凝，5000rpm、4℃离心10min后，获得200μL血浆，液氮冻存，备用。

步骤2、采用高效液相色谱-三重四级杆/超高场Orbitrap质谱分析所述待测组样品，得到质谱结果：取获得的血浆样本以及质控样本100μL/样，置于EP管中，加入500μL含0.1％甲酸的80％甲醇水溶液，涡旋震荡后，冰浴静置5min，15000rpm、4℃离心10min，取一定量的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为60％，并置于带有0.22μm滤膜的离心管中15000g、4℃离心10min，收集滤液，进行高效液相色谱-三重四级杆/超高场Orbitrap质谱(LC-MS)检测。

高效色谱分析采用Thermo Scientific Accucore HILIC column色谱柱进行，柱温：40℃；流速：0.2mL/min。正模式中：以0.1％甲酸，95％乙腈，10mM醋酸铵为流动相A：0.1％甲酸，50％乙腈，10mM醋酸铵为流动相B。负模式中：95％乙腈，10mM醋酸铵为流动相A；50％乙腈，10mM醋酸铵为流动相B，负模式A、B流动相pH均为9.0。所述的梯度洗脱为：0-1.5min：98％A，2％B；1.5-12min：98％A，2％B；12-14min：100％B；14-16min：98％A，2％B。

质谱扫描范围选择m/z 100-1500；质谱条件的设置如下：喷雾电压：3.2kV；鞘流气，辅助气压力分别为35arb和10arb；离子传输管温度为：320℃。极性：正极，负极；MS/MS二级扫描为数据依赖型扫描。

步骤3、对质谱结果中的下机数据库进行分析后，得到代谢物的鉴定结果和代谢物丰度结果：将下机数据导入CD(compound discover)搜库软件中，进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后对不同样品根据保留时间偏差0.1min和质量偏差5ppm进行峰对齐，使鉴定更准确，随后根据设置的质量偏差5ppm、信号强度偏差30％、信噪比3、最小信号强度100000、加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud和Chemspider数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到代谢物鉴定结果和定量结果。D-苯基乳酸的质谱图同图4。

步骤4、对待测组样品和对照组样品中的特征标志物D-苯基乳酸的表达量进行T-检验，对金定鸭上笼第6天组和第12天组和地面组的表达量进行T检验后，实验结果详见表3。

表3

差异代谢物	TB	CR6	CR12
				D(+)-Phenyllactic acid	452226±203705<sup>a</sup>	202836±60569<sup>b</sup>	458791±312479<sup>a</sup>

表3中右肩字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

由表3可知，金定鸭上笼第6天组的D-苯基乳酸表达量值与对照组相比出现显著下调，表示金定鸭上笼第6天组正处于笼养应激反应期。金定鸭上笼第12天组的D-苯基乳酸表达量值与对照组相比未出现显著下调，表示金定鸭上笼第12天组正处于笼养应激恢复期。

二、以D-苯基乳酸作为特征标志物进行鉴别蛋鸭应激状态的方法的准确性验证

基于金定鸭上笼6天，12天和地面组的体重变化数据、体增重数据、采食量情况数据、血清中D-乳酸情况、血清中内毒素情况、血清糖皮质激素变化数据、血清氧化应激指标，肠粘膜氧化应激指标等一系列指标结果表明，蛋鸭金定鸭在上笼第6天、第12天分别处于笼养应激反应期和笼养应激恢复期。与本发明提供的蛋鸭应激状态的鉴别方法的结果一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种蛋鸭应激状态的鉴别方法，其特征在于，以D-苯基乳酸作为鉴别蛋鸭应激状态的特征标志物。

2.如权利要求1所述的蛋鸭应激状态的鉴别方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

步骤1、笼养蛋鸭血液经处理得到的血浆作为待测组样品，平养蛋鸭血液经处理得到的血浆为对照组样品；

步骤2、采用色谱-质谱分析所述待测组样品，得到质谱结果；

步骤3、对质谱结果中的下机数据库进行分析后，得到代谢物的鉴定结果和代谢物丰度结果；

步骤4、对待测组样品和对照组样品中的特征标志物D-苯基乳酸的表达量进行T-检验；

待测组样品和对照组样品相比，若待测组样品的D-苯基乳酸的表达量出现下调，且差异显著P＜0.05，即蛋鸭正处于笼养应激反应期；否则蛋鸭正处于笼养应激恢复期。

3.如权利要求2所述的蛋鸭应激状态的鉴别方法，其特征在于，所述步骤1中血液经处理得到血浆的具体步骤为：血样先经肝素钠抗凝，然后在5000rpm、4℃离心10min后，获得血浆，液氮冻存，备用。

4.如权利要求2所述的蛋鸭应激状态的鉴别方法，其特征在于，所述步骤1中采集已知日龄及上笼天数的笼养蛋鸭血浆样品作为待测组样品；对照组样品为与待测组样品笼养组品种相同，日龄相近±8d的平养蛋鸭血浆样品；每组样本数3-10份，不同上笼天数即为不同待测组样品。

5.如权利要求2所述的蛋鸭应激状态的鉴别方法，其特征在于，所述步骤2中色谱-质谱的中的具体参数为：

色谱采用Accucore HILIC column色谱柱，柱温：40℃；流速：0.2mL/min；

正模式中以0.1％甲酸，95％乙腈，10mM醋酸铵为流动相A；0.1％甲酸，50％乙腈，10mM醋酸铵为流动相B；

负模式中以95％乙腈，10mM醋酸铵为流动相A；50％乙腈，10mM醋酸铵为流动相B，负模式A、B流动相pH均为9.0；

梯度洗脱为：0-1.5min：98％A，2％B；1.5-12min：98％A，2％B；12-14min：100％B；14-16min：98％A，2％B。

6.如权利要求2所述的蛋鸭应激状态的鉴别方法，其特征在于，所述步骤2中色谱-质谱的中的具体参数为：

质谱扫描范围选择m/z 100-1500；质谱条件的设置如下：喷雾电压：3.2kV；鞘流气，辅助气压力分别为35arb和10arb；离子传输管温度为：320℃；极性：正极，负极；MS/MS二级扫描为数据依赖型扫描。

7.如权利要求2所述的蛋鸭应激状态的鉴别方法，其特征在于，所述步骤3中对质谱结果中的下机数据库进行分析的具体步骤为：

S1、将下机数据导入CD搜库软件中，进行保留时间、质荷比参数的简单筛选；

S2、然后对不同样品根据保留时间偏差0.1min和质量偏差5ppm进行峰对齐，随后根据设置的质量偏差5ppm、信号强度偏差30％、信噪比3、最小信号强度100000、加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量；

S3、再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud和Chemspider数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到代谢物鉴定结果和定量结果。