CN109913553A - 用于诊断和治疗乳腺癌的生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于诊断和治疗乳腺癌的生物标志物，所述生物标志物为LINC02237。本发明公开了一种诊断乳腺癌的产品以及检测LINC02237的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用；本发明同时公开了LINC02237在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用。

Description

用于诊断和治疗乳腺癌的生物标志物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及用于诊断和治疗乳腺癌的生物标志物，所述生物标志物为LINC02237。

背景技术

肿瘤是机体体内结构功能正常的细胞，在内外致瘤因素的协同作用下，导致的基因水平异常和功能异常，局部异常的细胞增生而形成的新生物。常见的致瘤物质包括化学致瘤物、病毒和物理致瘤物。新生的肿瘤组织在细胞形态和组织结构上，均与其来源的正常组织存在差异，该差异称为肿瘤组织的异型性。恶性肿瘤，就是通常所说的癌症，具有浸润和转移的特点，而且没有完整的包膜，手术不易彻底切除。此外，它还会消耗机体大量的营养物质来进行快速繁殖，对机体的危害极大。对于恶性肿瘤，我们的原则是早发现，早诊断，早治疗。对于发现较晚的患者，往往错过了治疗的最佳机会，放疗、化疗、靶向药物等治疗对于晚期患者的疗效非常有限，使得晚期患者的生存率大幅度下降。

乳腺癌是一种十分常见的女性疾病，它的分类包括很多临床病理参数，如肿瘤实体大小、是否发生淋巴结转移、组织学分级和患者年龄分布等；病人在诊断和治疗过程中使用许多生物标志物，主要有雌激素受体(estrogen receptor ER)、表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)、孕激素受体(progesteronereceptor，PR)等。随着人们对乳腺癌的研究的不断深入，最新的分型结果把乳腺癌归纳为5种亚型:HER2过表达型(ER^-,PR^-且HER2⁺),luminal A型(ER⁺或PR⁺且HER2^-),luminal B型(ER⁺或PR⁺且HER2⁺)、基底样(basal-like)型(ER^-,PR^-且HER2^-)和正常组织(normal-like)型乳腺癌(Mackay A,Weigelt B,Grigoriadis A,et al.Microarray-based class discoveryfor molecular classification of breast cancer:analysis of interobserveragreement[J].J Natl Cancer Inst,2011,103(8):662-673.)。新的分型更有助于针对不同亚型的乳腺癌患者进行特异性的临床治疗。

长链非编码RNA是一类长度大于200个核苷酸且不具备蛋白翻译功能的RNA，其在转录调控中广泛表达。目前，lncRNA主要被分为五类:反义lncRNA、内含子lncRNA,lincRNA、启动子相关lncRNA和UTR相关lncRNA。LncRNA具有时空特异性，在不同组织中，表达模式行为也不同。相对于microRNA，lncRNA的长度较长，具有mRNA相似结构。LncRNA可以与microRNA,mRNA和蛋白结合，在细胞中起到重要的调控作用。目前来看，lncRNA与基因转录、表观遗传调控、蛋白编码基因、染色质组织等生物活动有关。同时，在RNA剪接、X染色体失活等分子机制中，lncRNAs也起到了重要作用。lncRNA长度与mRNA相近，具有mRNA结构特征，可以与转录因子、microRNA等结合。因此，lncRNA对蛋白编码基因和其它非编码RNA的表达起到了令人注目的调控作用。除了碱基序列，lncRNA还可以和蛋白结合，调节蛋白活性或行使其它功能。

尽管大多数lncRNAs的生物学功能尚未确定，已有许多研究工作指明，癌症病人的组织细胞中lncRNA表达会出现异常。在乳腺癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌等研究中，发现了多个lncRNA与癌症病变相关。基于一些lncRNAs的异常表达已经被证实与癌症密切相关，使用lncRNAs作为癌症诊断和预后的标志物也成为一个新的研究方向。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物，及该标志物在乳腺癌诊断和治疗中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测LINC02237的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用。

进一步，所述乳腺癌为Luminal B型乳腺癌。

进一步，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测LINC02237的表达水平的试剂。

进一步，所述试剂选自：特异性识别LINC02237的探针；或特异性扩增LINC02237的引物。

进一步，所述特异性扩增LINC02237的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。

本发明提供了一种诊断乳腺癌的产品，所述产品包括检测LINC02237表达水平的试剂。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒、核酸膜条。

进一步，所述芯片包括特异性识别LINC02237的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括特异性扩增LINC02237的引物，或特异性识别LINC02237的寡核苷酸探针；所述核酸膜条包括特异性识别LINC02237的寡核苷酸探针。

进一步，特异性扩增LINC02237的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。

本发明提供了LINC02237在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用。

进一步，所述乳腺癌为Luminal B型乳腺癌。

本发明提供了LINC02237在制备治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述乳腺癌为Luminal B型乳腺癌。

进一步，所述药物组合物包括LINC02237的促进剂。

进一步，所述LINC02237的促进剂为增加LINC02237水平的物质。

附图说明

图1是利用QPCR检测LINC02237基因在乳腺癌组织中的表达情况图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序的方法，检测乳腺癌标本中lncRNA在肿瘤组织和正常组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与乳腺癌的发生之间的关系，从而为乳腺癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了LINC02237在乳腺癌组织中显著上调，提示LINC02237可作为乳腺癌的诊断标志物以及治疗靶标。

术语“LINC02237”位于8号染色体上，基因ID为105375706，包括LINC02237基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的LINC02237，以及源自细胞中加工的任何形式的LINC02237。该术语涵盖LINC02237的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如LINC02237基因，人LINC02237的基因序列(NR_146282.1)，以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的LINC02237DNA。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。

如本文中使用的，术语“生物标志物”指能在样品中检测且包括例如LINC02237的指标分子或分子集合(例如预测，诊断，和/或预后指标)。生物标志物可以是预测生物标志物且充当具有特定疾病或病症。生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如DNA和/或RNA(例如mRNA))，多核苷酸拷贝数改变(例如DNA拷贝数)。

如本文中使用的，生物标志物的“量”或“水平”是生物学样品中的可检测水平。这些可通过本领域技术人员已知的及本文中公开的方法来测量。

术语“表达的水平”或“表达水平”一般指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息(例如基因编码和/或表观遗传信息)转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。在本发明的具体实施方案中，所述“表达”指转录成多核苷酸。

“增加的表达”，“增加的表达水平”，“增加的水平”，“升高的表达”，“升高的表达水平”或“升高的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体，内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的增加的表达或增加的水平。

“减少的表达”，“减少的表达水平”，“减少的水平”，“降低的表达”，“降低的表达水平”或“降低的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体或内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的降低的表达或降低的水平。在一些实施方案中，降低的表达是很少的表达或不表达。

在本发明中，LINC02237在乳腺癌患者中具有降低的表达水平。

芯片、试剂盒、核酸膜条

本发明提供了检测中LINC02237基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)制剂、芯片或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LINC02237所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

如本文中所使用的，“寡核苷酸”一般指短的，单链的多核苷酸，其在长度上小于约250个核苷酸，但这不是必须的。寡核苷酸可以是合成的。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样且完全可适用于寡核苷酸。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明的试剂盒包括检测LINC02237基因的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

本发明的核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的针对LINC02237的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

计算模型

本发明提供了LINC02237在制备预测乳腺癌的计算模型中的应用。正如熟练技术人员可以领会的，可以使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。生化标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。

在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合基因和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

促进剂

所述的LINC02237的促进剂是指任何可提高LINC02237基因或表达产物稳定性、上调LINC02237的表达、增加lncRNALINC02237的有效作用时间或促进LINC02237基因的转录的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调LINC02237基因的表达有用的物质，从而可用于预防或治疗乳腺癌。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与乳腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

分别收集4例Luminal B型乳腺癌的癌组织及相对应的正常组织样本(距离肿瘤边缘5公分)，进行高通量测序，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗，所有患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意，病人信息如表1所示。

表1样本信息

2、RNA样品的制备及质量分析

使用TRIZOL法提取组织总RNA

1)用剪刀组织剪碎，加入1ml Trizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml 75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

9)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。

3、cDNA文库的构建及测序

1)总RNA DNaseI消化：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水；

2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；

3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到140-160nt；

4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；

5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成带有dUTP的二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收；

6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复，末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；

7)cDNA 3’末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；

8)cDNA 5’adapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；

9)UNG消化cDNA二链：配制UNG消化反应体系，通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；

10)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增，对PCR产物进行磁珠纯化回收，回收产物溶于EB溶液中，贴上标签。

11)文库质量检测：使用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库质量进行检测；

12)上机测序：检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，最后使用IlluminaHiseq x-ten平台进行测序。

4、生物信息学分析

1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

2)hisat2比对到参考基因组上。参考基因组来自于Ensembl数据库，基因组版本GRCh38，基因注释信息为Ensemble 92；

3)stringtie定量lncRNA的表达量并标准化输出；

4)edgeR包比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异，差异变动lncRNA的筛选标准是|log2FC|>1且pvalue<0.05。

5、结果

测序数据如表2所示，生物信息学分析发现，LINC02237在乳腺癌患者中表达显著下调，提示LINC02237可以作为可能的检测靶标应用于乳腺癌的早期诊断。

表2测序数据

实施例2 QPCR测序验证LINC02237基因的差异表达

1、按照实施例1的收集方式收集的25例luminal B型乳腺癌患者癌组织样本和正常组织样本对LINC02237基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

利用Trizol法提取组织RNA，具体步骤参见实施例1。

3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒(Takara code：DRR047A)进行操作。

1)去除基因组DNA

在试管中加入5×gDNA Eraser Bμffer 2.0μl，gDNA Eraser1.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热2min。

2)反转录反应

将Buffer 24.0μl，RT Enzyme Mix I1.0μl，RTPrimer Mix1.0μl，RNase Free ddH₂O 4.0μl加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中37℃15min，85℃5s。

4、QPCR扩增

1)引物设计

根据LINC02237和GADPH的基因序列设计引物，具体引物序列如下：

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.2)。

LINC02237基因：

正向引物为5’-ACACAATTCTAACTCTCA-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-TTCCTCCATTTGAAGATA-3’(SEQ ID NO.4)。

2)QPCR扩增检验

用Premix Ex Taq^TMII(Takara Code:DRR081)试剂盒配置PCR反应体系，在Thermal CyclerReal Time System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认RealTime PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。

配置25μl反应体系：

Premix Ex TaqTM II(2×)12.5μl，正(反)向引物各1μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水8.5μl。

反应条件：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)×40

5、结果

QPCR结果如图1所示，与正常组织相比，LINC02237在乳腺癌组织中表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，提示LINC02237可作为生物标志物应用于乳腺癌的诊断和治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 德阳市人民医院

<120> 用于诊断和治疗乳腺癌的生物标志物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagccccagc cttctccat 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acacaattct aactctca 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcctccatt tgaagata 18

Claims (10)

1.检测LINC02237的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为Luminal B型乳腺癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测LINC02237的表达水平的试剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：特异性识别LINC02237的探针；或特异性扩增LINC02237的引物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增LINC02237的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。

6.一种诊断乳腺癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测LINC02237表达水平的试剂。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒、核酸膜条。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述芯片包括特异性识别LINC02237的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括特异性扩增LINC02237的引物，或特异性识别LINC02237的寡核苷酸探针；所述核酸膜条包括特异性识别LINC02237的寡核苷酸探针。

9.LINC02237在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用。

10.LINC02237在制备治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。