CN113817832B - 一种用于预测乳腺癌预后的LincRNA标志物、检测试剂及应用 - Google Patents

一种用于预测乳腺癌预后的LincRNA标志物、检测试剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于预测乳腺癌预后的LincRNA标志物、检测试剂及应用。所述LincRNA标志物为RP11‑358L4.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还涉及所述LincRNA标志物的检测试剂，所述检测试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用，抑制所述LincRNA标志物的SIRNA在制备促进乳腺癌细胞凋亡的药物中的应用。本发明为乳腺癌诊断和治疗提供了新的靶点。

Description

一种用于预测乳腺癌预后的LincRNA标志物、检测试剂及应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于预测乳腺癌预后的LincRNA标志物、检测试剂及应用。
背景技术
三阴乳腺癌是在临床上对乳腺癌的一种分型，三阴乳腺癌特指雌激素受体阴性、孕激素受体以及人表皮生长因子受体均呈阴性的乳腺癌患者。乳腺癌分型可以分为luminal型、HER-2(+)型以及基底型。基底型是指分子分型为ER、PR，还有HER-2(-)。这种类型的乳腺癌患者5年生存率不足80％，多见于绝经前的年轻女性患者，其内脏转移以及脑转移的发生率较高，病理分级多数较差，多为III级，细胞增殖较高，肿瘤侵袭性较强，相对容易发生局部复发及远处转移。
LincRNA即Long intergenic non-coding RNA。人类细胞中仅有少数转录生成的RNAs可作为蛋白质合成的模板。其余的RNA被称为非编RNAs(ncRNAs)它们位于编码蛋白的基因之间，其中长度超过200bp的ncRNAs称为lincRNAs。尽管细胞中存在大量的lincRNAs，然而长期以来它们被人们视为是转录RNAs中的"暗物质"，对其功能及机制均知之甚少。尽管已有文献报道，LincRNA可以作为人类HER2阳性乳腺癌诊断和治疗的靶标，但是发现更多与乳腺癌，尤其是三阴乳腺癌相关的LincRNA一直是本领域技术人员不断追求的目标。
发明内容
有鉴于上述技术问题，本发明的第一个目的，提供一种用于预测乳腺癌预后的LincRNA标志物，所述LincRNA标志物为RP11-358L4.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的，提供所述LincRNA标志物的检测试剂。
进一步的，所述检测试剂包括实时定量PCR检测所述LincRNA标志物mRNA表达水平的特异性引物。
更进一步的，所述引物序列如SEQ ID NO.2-3所示。
本发明的第三个目的，提供所述检测试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用。
进一步的，所述乳腺癌为乳腺导管癌和三阴乳腺癌。
本发明的第三个目的，提供所述LincRNA标志物的SIRNA在制备促进乳腺癌细胞凋亡的药物中的应用，所述SIRNA的序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步的，所述乳腺癌细胞为三阴乳腺癌细胞。
更进一步的，所述三阴乳腺癌细胞为BT474细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次发现了LincRNARP11-358L4.1可作为乳腺癌诊断的生物标志物，进一步的，可以作为三阴乳腺癌的治疗靶点，为临床治疗三阴乳腺癌提供了支持。
附图说明
图1为不同乳腺癌细胞中RP11-358L4.1的表达情况。
图2为RP11-358L4.1敲减效率。
图3为敲减RP11-358L4.1对MCF-7细胞和BT474细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：不同的乳腺癌细胞中RP11-358L4.1的表达情况
1、细胞：HCCL1806细胞，MDA-MB-231细胞，BT-474细胞，MCF-7细胞，购于昆明动物细胞库。
2、方法
2.1细胞培养：乳腺癌细胞用含10％的胎牛血清、1000×的链霉素和1000×的青霉素的DME/F12培养基培养，放置在37℃，5％CO2培养箱中培养；每2d换液1次，取3代细胞进行试验。
2.2RNA提取
用2mL PBS清洗后每6孔板单孔的细胞加入1mL trizol裂解液，室温静置5min。
移液枪反复吹打细胞，并将裂解液全部转移至1.5mLEP管中。向各EP管中加入200uL氯仿，上下颠倒混匀，冰上放置10min。在4℃低温离心机中12000rpm离心15min。小心吸取上层水相，转移到新的EP管中；然后向各管中加入500uL异丙醇，冰上放置10min。在4℃低温离心机中12000rpm离心10min。弃上清，各EP管中加入0.5mL 75％乙醇，轻柔晃动洗涤2次。在4℃低温离心机中7500rpm离心5min，弃上清。
沉淀在室温下放置约2min风干，根据RNA沉淀的量适当加入20uL-50uL的RNase-free的H2O；
在核酸蛋白定量仪上进行RNA浓度及纯度测定。
2.3逆转录(参照FastQuant RT Kit(With gDNase)说明书)
反应体系和反应条件如下表所示(二步法)：
表1逆转录一步反应体系
Figure BDA0003316712750000041
以上试剂混匀后，RT逆转录程序为42℃孵育3分钟，反应结束后冰上静置。接着按下表继续配置体系：
表2逆转录二步反应体系
Figure BDA0003316712750000042
混匀后，逆转录程序为：42℃孵育15分钟，95℃孵育3分钟后低温保存或用于后续实验。
2.4实时荧光定量PCR(Q-PCR)
参照SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)说明书，反应体系和反应条件如下：
表3 Q-PCR反应体系
Figure BDA0003316712750000043
Figure BDA0003316712750000051
mRNA检测结果以GAPDH为内参，通过2-△△ct计算相对表达量。
结果如图1所示，RP11-358L4.1在BT-474和MCF-7细胞中高表达，可用于后续实验。
实施例2：在表达较高的两株乳腺癌细胞中敲减RP11-358L4.1检测敲减效率(选取BT-474、MCF-7)
1、细胞培养：同实施例1步骤2.1。
2、细胞转染
(1)转染前一天用无抗生素的培养基换去细胞原有培养基，转染时细胞状态要良好，细胞融合度为60％。
(2)INVI DNA RNA Transfection Reagent转染：按照转染说明书计算加样量。
(3)分别把20uM的SIRNA与转染试剂直接按照体积比1：1混合制备复合液，用移液器吹打10-15次，
(4)室温孵育10min-15min。
(5)15min后将转染混合物加入至6孔板，前后轻摇细胞板混合均匀，置于37℃、5％CO2细胞培养箱培养48h。
(6)48h后观察细胞状态，并进行后续检测。
表4 SIRNA序列
Figure BDA0003316712750000061
3.Q-PCR检测(挑选敲减效率高的SIRNA)
实验方法同实施例1步骤2.4，实验结果如图2所示，RP11-358L4.1-121SIRNA敲减效率最高，后续转染都选用RP11-358L4.1-121SIRNA。
实施例3：细胞凋亡(BT-474和MCF-7)
1、细胞培养：同实施例1步骤2.1。
2.细胞转染：选用RP11-358L4.1-121SIRNA转染BT-474和MCF-7细胞，转染方法同实施例2。
3.细胞凋亡检测实验步骤：
(1)细胞经过以上处理后，用胰酶消化下来，300g离心5min，弃上清，收集细胞，PBS洗涤一次，轻轻重悬细胞并计数。
(2)取5×105重悬的细胞，300g离心5min，弃上清。用PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入100μL稀释的1×Annexin V Binding Buffer工作液重悬细胞。
(3)细胞悬液中加入2.5μL的Annexin V-FITC和2.5μL的PI染色液。
(4)轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育20min。
(5)加入400μL稀释的1×Annexin V Binding Buffer，混匀样本。
(6)立即上机检测。
结果如图3所示，凋亡检测结果提示RP11-358L4.1敲减对MCF-7细胞凋亡没有影响，对BT474细胞凋亡有促进作用。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
                         序列表
<110>  大理大学
<120>  一种用于预测乳腺癌预后的LincRNA标志物、检测试剂及应用
<160>  7
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  529
<212>  DNA
<213>  智人（Homo sapiens）
<400>  1
caattattgg ctcatcaagg agtgtgccac atgccagatg ctctgcagaa cccaacagag  60
gggttgctcc tccatggaaa caacaagaag ctttgatcaa agagcctgta ttgactcctt 120
cagtgaaatt cttgactgaa ataatcacct tcttaaaata cacacatggt gaggtttgaa 180
gaggggaaat tgccatccag gtaagaaacc ttggccttgt cccaatttag tagtgctgaa 240
ggtgtgttca tttgaacata gatcatgtgc taggtactgg gaggatacag gaatgagcat 300
gggaataaac tttacatagc tcttgttcaa gcaggaactt tacaatctag ttagaataaa 360
gaattatctg tgagtcctgg ttggacagtg tgtatcccag cactatctag gggtaaggat 420
gccttcatac caacctcgtc atgactgtgc taagtggcag gtctgatttg gttatagaac 480
tggatacatc agacagtttt aactttatgc tattaaatat ttgaacata             529
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
atgtgctagg tactgggagg a                                            21
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
agacctgcca cttagcacag                                              20
<210>  4
<211>  19
<212>  RNA
<213>  人工序列
<400>  4
uucuccgaac gugucacgu                                               19
<210>  5
<211>  19
<212>  RNA
<213>  人工序列
<400>  5
cagugaaauu cuugacuga                                               19
<210>  6
<211>  19
<212>  RNA
<213>  人工序列
<400>  6
gaaauaauca ccuucuuaa                                               19
<210>  7
<211>  19
<212>  RNA
<213>  人工序列
<400>  7
guguucauuu gaacauaga                                               19

Claims (2)

1.抑制RP11-358L4.1的SIRNA在制备促进乳腺癌细胞凋亡的药物中的应用，其特征在于，所述RP11-358L4.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SIRNA的序列如SEQ ID NO.5所示，所述乳腺癌细胞为人乳腺导管癌细胞。。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人乳腺导管癌细胞为BT474细胞。
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