CN107893113B - Hla相关的snp标记及其检测引物对与确定方法 - Google Patents

Hla相关的snp标记及其检测引物对与确定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种HLA相关的SNP标记及其检测引物对与确定方法；旨在为移植风险评估提供一种引物与方法，其技术方案包括HLA相关的SNP标记，SNP标记为人6号染色体32610275位置的碱基C或T；一种用于检测权利要求1所述的SNP标记引物对具有SEQ ID NO:1‑2或SEQ ID NO:3‑4所示的核苷酸序列；上述的SNP位点的确定方法，包括步骤：1)提取宿主细胞的基因组DNA；2)将模板DNA进行PCR扩增，并将PCR产物SAP/Exon I纯化；3)纯化后的PCR产物用测序引物分别进行正向和/或反向测序扩增，测序产物纯化，ABI 3730xl毛细管电泳测序，从而确定SNP位点及其基因型。

Description

HLA相关的SNP标记及其检测引物对与确定方法
技术领域
本发明涉及医学技术领域，具体涉及一种与HLADQ启动子相关的SNP标记分析，并通过这一SNP标记预测患者器官移植后排斥风险评估。
背景技术
在器官移植领域中，由HLA抗体介导的体液免疫引起的各类排斥反应是影响移植后人/移植物存活的最关键因素。
SNP(Single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)主要是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。
在人群中，HLA(Human leukocyte antigen，人类白细胞抗原)具有丰富的多态性，在器官移植中，供体器官内皮细胞中的HLA抗原常常作为识别抗原，引起一系列的排斥反应，影响这器官移植的人/器官存活率。另外HLA本质是MHC(Major histocompatibilitycomplex，主要组织相容性复合体)，在受体中具有提呈外来抗原的作用。在器官移植领域，对于供体来说，DQ表达量越低，其在细胞表面的DQ蛋白含量就越低，越难被受体的MHC提呈。而对于患者来说，DQ表达量越低，其抗原提呈能力越低，免疫状态也越低下。基于此原理，供受体DQ表达量越低越有利于器官移植的进行。研究报道，机体正常情况下，DQ的本底表达量较低，此时机体只利用HLA I类位点和DR位点提呈外来抗原。当机体的免疫状态被激活时，DQ表达量会迅速上升，产生大量的DQ蛋白，以较高的亲和力提呈外来抗原物质，激活机体的T/B淋巴细胞，杀伤外来入侵物质。而DQ蛋白的高亲和力，一方面使其更容易的提呈外来入侵抗原，但另一方面，过高的亲和力使其很容易提呈到自身蛋白，从而产生抗体攻击自身细胞，产生自身免疫病。据此前的文章报道，DQ启动子中某些转录激活区单核苷酸的改变，将使相关转录因子的结合能力受影响，从而影响DQ蛋白在各时期的调控。而位于人类第6号染色体中DR和DQ基因之间的32610275碱基是影响DQ表达量最为重要的SNP，32610275位置的碱基T时，DQ表达量较高，而当32610275位置的碱基C时，则DQ表达量较低。基于以上原理，我们通过测量患者的DQ的启动子以上位点的SNP，即可得知患者抗原提呈的能力，从而预测患者器官移植后发生体液排斥的风险。
在目前的器官移植临床中，因为供体的缺乏，供受体间HLA抗原很难完全匹配。通过DQ启动子SNP的检测，我们可以将DQ表达量低的患者配型要求降低，使患者更为容易的找到供体，减少手术等待时间；对于DQ表达量高的患者，可以提高配型的要求，减少患者术后发生排斥的风险，从而造福移植患者。
然而，目前还没有将DQ启动子SNP分析应用于器官移植的临床报道，若能通过分析DQ启动子SNP，明确患者在免疫状态下DQ蛋白的表达量，就能通过患者的抗原提呈能力预测术后产生体液排斥的风险，推动我国器官移植排斥反应的早期预测的现状，并指导临床中供体的选择，免疫抑制剂用量等。因此，通过对HLA的II类DQ位点超级启动子区SNP分子标记的研究，可以为移植排斥风险提供一种新的辅助评估手段，具有较强的临床指导意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种HLADQ启动子SNP位点的确定及分型方法及其应用，为移植风险评估提供一种补充手段。
为解决上述技术问题，本发明的一组HLA相关SNP位点，是人6号染色体HLA基因区第32610275位的C/T多态(ATGCCCTTC(C/T)CTTTTAAAACTG)，具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
本发明的HLA相关SNP位点的确定方法，包括步骤：
1)提取宿主细胞的基因组DNA；
2)将模板DNA进行PCR扩增，并将PCR产物SAP/Exon I纯化；
3)纯化后的PCR产物用测序引物分别进行正向和/或反向测序扩增，测序产物纯化，ABI 3730xl毛细管电泳测序，从而确定SNP位点及其基因型。
进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤2)所述的PCR扩增时：
上游引物：5'TAATTGAGATAATACACCTGGAAG 3'(SEQ ID NO.1)
下游引物：5'GTGAGAAGAATGGCTGACG 3'(SEQ ID NO.2)。
进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤2)所述的PCR扩增时：
上游引物：5'CTTTGAATTTAGGCAGAACG 3'(SEQ ID NO.3)
下游引物：5'GCAGCATCACTTGTCTCC 3'(SEQ ID NO.4)。
进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，步骤3)所述的PCR扩增产物正向测序引物5'TAATTGAGATAATACACCTGGAAG 3'(SEQ ID NO.1)；或/和反向测序引物：5'GTGAGAAGAATGGCTGACG 3'(SEQ ID NO.2)
进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤3)所述的PCR扩增产物正向测序引物5'CTTTGAATTTAGGCAGAACG 3'(SEQ ID NO.3)；或/和反向测序引物：5'GCAGCATCACTTGTCTCC 3'(SEQ ID NO.4)。
进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤2)PCR扩增时反应体系以20ul计为：50-100ng/ul模板DNA1ul，10pmol/ul上游引物和下游引物各1ul，2×PCR Solution Premix TaqTM 10ul，余量为双蒸水；
进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤2)PCR扩增时PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，51℃30秒，72℃45秒，35个循环；72℃5分钟；4℃∞。
本发明的一组HLA相关SNP位点，在DQ超级启动子转录激活区，该区域的单核苷酸改变，将使相关转录因子的结合能力受影响，从而提高或降低DQ蛋白在各时期的表达量。另外，SNP位点碱基为T突变型的患者，DQ表达量也较高。因此可以通过对这组SNP位点的基因多态性分析，来辅助移植排斥风险和自身免疫疾病的评估。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的SNP标记位点琼脂糖凝胶电泳图。
图2是本发明实施例1提供的SNP标记位点的基因型测序峰图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为本发明的限制。
实施例1一组HLA相关SNP标记的获得
1.1 实施例1血液样本的获得
实施例1血液样本为中山大学附属第一医院，器官移植科采集的肾移植患者移植前的全血样本中随机抽取的6个血样，用于基因组DNA提取。
1.2 实施例1血液样本基因组DNA提取
本试验采用TIANamp Blood DNA Kit(目录号：DP348)对实施例1血液样本进行基因组DNA提取，具体步骤如下：
(1)将实施例1六例患者全血样本轻柔颠倒混匀，并从中吸取200ul到一个新的1.5ml EP管(如果DNA提取浓度过低，亦可将血样500g，5min离心分层，取中间的白膜层细胞200ul进行后续提取操作)。
(2)向(1)中EP管加入200ul的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀，向细胞核沉淀中加200ul缓冲液GS，振荡至彻底混匀。
(3)加入200ul缓冲液GB和20ul Proteinase K的预混溶液至(1)中EP管，充分颠倒混匀，56度放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。
(4)室温放置2-5min后加入350ul缓冲液BD，充分颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀。
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CG2中(吸附柱CG2放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中。
(6)向吸附柱CG2中加入500ul缓冲液GDB，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中。
(7)向吸附柱CG2中加入600ul漂洗液PWB(使用前确认已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中。
(8)重复操作步骤(7)
(9)12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CG2置于室温放置2min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CG2转入1.5ml离心管中，向吸附膜位置悬空滴加100ul洗脱缓冲液TB，室温旋转2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
1.3扩增含SNP位点的核苷酸片段
以前述提取获得的实施例1血液样本的基因组DNA为模板，
利用上游引物：
5'TAATTGAGATAATACACCTGGAAG 3'(SEQ ID NO:1)；
下游引物：5'GTGAGAAGAATGGCTGACG 3'(SEQ ID NO:2)，
扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。
其中，PCR反应体系以20ul计为：50-100ng/ul模板DNA1ul，10pmol/ul上游引物和下游引物各1ul，2×PCR Solution Premix TaqTM(TaKaRa TaqTM Version 2.0)10ul，余量为双蒸水；PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，51℃30秒，72℃45秒，35个循环；72℃5分钟；4℃∞。
1.4PCR产物电泳检测(如图1，琼脂糖凝胶密度为3％，M表示DNA LADDER，各条带对应分子量大小如图标注，1-6代表1-6号样本，扩增目的片段设计大小为390bp，符合预期且条带特异)。
1.5PCR产物纯化(SAP和Exon I纯化)
纯化体系(10ul)：PCR产物8ul，虾碱性磷酸酶(SAP，1U/ul，ABI Biosystem)1ul，Exo外切酶(Exon I，20U/ul，ABI Biosystem)0.5ul，ddH2O 0.5ul。
纯化反应：37℃孵育30min，80℃20min，4℃∞。
1.6测序反应(正向测序)
1)反应体系：测序引物(10pM)1ul、PCR纯化产物(前述纯化产物加入20ul ddH2O稀释)1ul、BDT Ready Reaction Premix(2.5X Buffer)0.4ul、BDT Buffer(5X Buffer)1.8ul，ddH2O 5.8ul；
所述的正向测序引物5'TAATTGAGATAATACACCTGGAAG 3'(SEQ ID NO.1)。
2)测序扩增反应：96℃10秒；96℃10秒，50℃10秒，72℃1分钟，25个循环；4℃∞。
3)测序反应产物酒精/EDTA/NaAc法纯化。
4)纯化产物ABI 3730XL测序，SNP位点基因型的测序峰图如图2所示(1-6号样本均为C野生纯合型，检测SNP位点为测序峰图第169个碱基红色方框标示部分，如果是杂合型应该为测序结果第169个碱基C、T双峰)。
需要说明的是，上述测序反应也可以采用反向测序的方式，反向测序时的引物为：5'GTGAGAAGAATGGCTGACG 3'(SEQ ID NO:2)，测序扩增反应：96℃10秒；96℃10秒，50℃10秒，72℃1分钟，25个循环；4℃∞。
实施例2
本实施例与实施例2的不同之处在于扩增时采用的引物不同：
上游引物：5'CTTTGAATTTAGGCAGAACG 3'(SEQ ID NO.3)
下游引物：5'GCAGCATCACTTGTCTCC 3'(SEQ ID NO.4)。
扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。
PCR扩增产物可以正向测序，也可以进行反向测序，优选正向测序。
正向测序引物5'CTTTGAATTTAGGCAGAACG 3'(SEQ ID NO.3)；
反向测序引物：5'GCAGCATCACTTGTCTCC 3'(SEQ ID NO.4)。
由于32610275碱基是影响DQ表达量最为重要的SNP之一，32610275位置的碱基T时，DQ表达量较高，而当32610275位置的碱基C时，则DQ表达量较低。基于以上原理，我们通过测量患者的DQ的启动子以上位点的SNP，即可得知患者抗原提呈的能力，从而辅助评估患者器官移植后发生体液排斥的风险。因为HLA位点的多态性较高，每个患者DQ启动子序列均有差异，给设计引物检测DQ启动子的SNP带来困难。通过不断的改变引物序列，体系与PCR条件的优化，利用本方法检测243名等待移植患者的DQ启动子的SNP，其中241名患者(99.18％)能成功检测出来。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 广州博富瑞医学检验有限公司
<120> HLA相关的SNP标记及其检测引物对与确定方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taattgagat aatacacctg gaag 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgagaagaa tggctgacg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctttgaattt aggcagaacg 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcagcatcac ttgtctcc 18
<210> 5
<211> 212
<212> DNA
<213> 人属(Homo sapiens)
<400> 5
tcctatgaca atcagcaggt gggatcatgg gcttcttcat catttccatc tcgttcacca 60
caggtgctca tgcatcacta gcagggagaa tccagcgtca tagtcatgcc cttcyctttt 120
aaaactgacc agggacttcc cacagaggca tgaaaaatat caggtaacct cttctccccc 180
accaatacta agtactaaga gtctcagtct tt 212

Claims (1)

1.检测人类白细胞抗原相关SNP分子标记的引物对在制备辅助评估移植排斥风险试剂中的用途，其特征在于，所述的SNP位于人6号染色体32610275位，所述SNP分子标记序列如SEQ ID NO.5所示，上述序列中的y是碱基C或T；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2或SEQ ID NO:3-4所示。
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