CN104838269A - 用于预测对错配的人白细胞抗原的免疫应答的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及预测在移植之后对人白细胞抗原(HLA)的免疫应答的方法，所述方法包括使供体和/或供体材料与受体HLA分型以测定HLA错配；以及测定预测的间接识别的HLA抗原决定部位(PIRCHES)的数量。因此本发明提供了选择和/或筛选用于异源移植的供体材料的方法，例如，用于从错配的非亲缘供体选择具有可容许的错配的供体材料。在优选的实施方式中，所述方法涉及移植前预测可在移植造血干细胞、脐带血、肾和/或其他细胞、组织或器官之后出现的不想要的同种异体反应性。

Description

用于预测对错配的人白细胞抗原的免疫应答的方法

技术领域

本发明涉及用于预测移植之后对人白细胞抗原(HLA)的免疫应答的方法，所述方法包括使供体和/或供体材料和受体HLA分型以测定HLA错配以及测定预测的间接识别的HLA抗原决定部位(PIRCHES)的数量。所以本发明提供了用于选择和/或筛选异源移植用供体材料的方法，例如从错配的，优选非亲缘供体中选择具有可容许的错配的供体材料的方法。在优选的实施方式中，该方法涉及移植前预测可在移植异源的干细胞、不同来源的造血干细胞、脐带血、肾和/或其他细胞、组织或器官之后出现的不想要的同种异体反应性。

背景技术

异源细胞、组织和器官的移植是一种进化疗法。其逐渐成为有吸引力的治疗选择。预期在不久的将来，接收来自非亲缘供体移植物的患者数量将翻番。移植之后的同种异体反应性对临床结果具有大的影响，具有病理学以及有益的作用。已知HLA错配诱导移植之后的免疫反应，但是不十分了解与预测不想要的免疫反应的风险相关的因素。

造血干细胞移植

造血干细胞移植(HSCT)是快速生长治疗选择的一个例子。HSCT的主要限制因素仍是移植物抗宿主疾病(GVHD)，和因为预期接收HSCT的患者数量将增加，必须加速提供预防GVHD的方法。为了克服GVHD的风险，患者优选地用所有HLA-等位基因完全匹配的供体移植。但是，由于群体中HLA分子的多样性，这些完全匹配的供体对于约40％的患者不可用。当完全匹配的供体不可用时，临床医生通常必须面对决定从错配的供体中选择最佳供体(即携带最低GVHD风险的供体)的困难。直到现在，测定哪个供体最合适，依赖于需要多达14天实验室工作的费劲试验。

历史上，认为HSCT之后的同种异体反应性主要由于供体T细胞直接识别HLA差异而诱发。这意味着移植物T细胞识别作为完整的分子在宿主细胞的细胞表面上表达的错配的HLA。本发明尤其基于间接识别。当源自错配的宿主HLA等位基因的肽被加工和呈现在共享的HLA并且从而被供体T细胞识别时，可诱发同种异体反应性。

造血干细胞移植(HSCT)之后的同种异体反应性对于临床结果有大的影响，具有病理学以及有益的作用。同种异体反应性的病理学作用反映在移植物抗宿主病(GVHD)。急性GVHD(aGVHD)的风险取决于HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1等位基因的错配水平，最佳匹配是五个基因座的完全匹配(10/10匹配)。

与单个错配的供体的受体相比，匹配的非亲缘HSCT的受体的严重aGVHD累积发生率减少24％(参考文献1a)。尽管当与具有一个HLA-C等位基因错配的供体的HSCT相比时，10/10匹配HSCT的受体增加白血病复发的风险比(HR)为47％(参考文献2a)，但是移植方案优选选择10/10匹配供体，因为部分匹配的非亲缘供体中的总体存活率显著更差(参考文献1a)。但是，完全匹配的非亲缘供体并不是对所有的患者可用；在40％的情况下，单个HLA错配的供体(9/10匹配)是最佳可用的可选方案(参考文献3a)。

在这些情况下，限定最佳-容许的错配可有助于防止GVHD以及随后更差的结果。最近，基于流行病学鉴定了某些特异性非容许的错配，与增加的形成严重aGVHD的风险相关(参考文献4a)。具有这些非容许错配的HSCT之后，增加GVHD风险的机理仍不清楚。

功能上，用细胞毒素T-淋巴细胞前体频率(CTLpf)试验测定更好-容许的错配。大于1/10⁵的CTLpf预测为形成严重的aGVHD(参考文献5a)。而且，小于或等于1/10⁶PBL的CTLpf与更好的总体存活率相关(参考文献：Heemskerk等(2007)骨髓移植(Bone Marrow移植)，40，193-200)。因此，这些标准可用于区分潜在错配的供体。但是，CTLpf试验是费力的、延误移植的时间，所以在大部分移植中心不使用。另外，来自潜在供体的材料在用于移植之前需要被运输和测试。目前没有有效的方式可用来基于消除可能产生不利结果的样品，进行递送前直接供体选择。

为了寻找CTLpf试验的可选方案，已经进行了多个迄今未成功的尝试，使用两个一般可用的预测程序，HLAMatchmaker和HistoCheck预测非容许的错配。HLAMatchmaker测定抗体潜在的抗原决定部位并且已经证明其有效用于实体-器官移植(参考文献6a，7a)。HLAMatchmaker考虑HLA上作为抗原决定部位的氨基酸三联体的差异。尽管抗体潜在地在形成GVHD中起作用，但是基于HLAMatchmaker的预测与同种异体反应性不相关(参考文献1a)。HistoCheck是基于直接识别HLA偏离的概念，即，供体T细胞识别装载非多态肽的完整的错配的HLA分子(参考文献9a)。HistoCheck测定接触T-细胞受体的肽-结合凹槽或区域中HLA分子的结构差异(参考文献10a)。通过测定这些结构差异，其目的是预测直接识别HLA偏离的可能性。HistoCheck获得的差异分数也与同种异体反应性不相关(参考文献11a，12a)。

鉴于先前存在的技术，需要更可靠的用于预测HLA错配的移植用供体材料是否增加导致失败的移植的风险(例如形成GVHD)和/或增加死亡率。

肾移植

人白细胞抗原(HLA)的错配显著改善了肾移植的结果(参考文献1b)。但是，由于各种HLA基因座的高水平的多态性和有限数量的供体，供体和受体之间的HLA错配存在于约85％的尸肾移植(欧洲移植数据库；http://www.eurotransplant.org，2012年4月24日访问)。明显地，这些HLA错配经常导致产生HLA-特异性抗体，其缩短移植物存活率(参考文献2b)和减少再移植选择。为了防止针对HLA的抗体形成，最佳肾移植物是与受体相同的HLA，或表达不诱导抗体形成的可接受的HLA错配。至有限的程度，这些可接受的错配可用HLAMatchmaker算法鉴定。

HLAMatchmaker限定HLA分子上的多态抗原决定部位，称为抗原决定部位联体(eplet)，其被HLA抗体可用并且减去患者自身HLA上出现的那些抗原决定部位联体(参考文献3b，4b)。在肾移植物上没有留下待识别的抗原决定部位联体的情况下，不能预期抗体应答(参考文献5b)。尽管HLAMatchmaker预测哪种HLA-抗原可潜在地诱导HLA抗体形成，但是其不能预测针对异源HLA的T-细胞反应性(参考文献6b)。

在之前的研究中，已经显示效应器的HLA-DR表型影响产生Bw4特异性抗体和I型抗体敏化等级(参考文献7b，8b)。这提示了间接识别源自供体的HLA肽对患者抗原呈递细胞的HLA II型分子的作用。该现象将解释导致产生IgG同种型的供体特异性抗体(DSA)的Thelper-2-细胞应答(参考文献9b)。

肽与HLA分子的结合

肽与HLA分子的结合是可预测的。预测的结合亲和力和实验测量之间的差异已经显示如不同实验室之间测量的差异一样小(参考文献10b)。对于HLAI型分子，可预测性尤其高，因为这些分子对于九个氨基酸长的肽(9-mers)具有更严格的偏好并且需要具体的氨基酸作为在清楚限定的锚定位置的锚定残基(参考文献11b)。对于HLA II型分子，可预测性更低，因为不同长度的肽可使用不同位置作为锚定残基结合(参考文献12b)。所以，难以测定肽如何与HLAII型结合凹槽对齐，以及肽中的哪个氨基酸残基优选作为锚。为了解决该问题，Nielsen等使用所谓的核心预测指标，以评估II型结合凹槽中的肽位置(参考文献23a)。核心预测指标使得能够开发精确的HLA II型预测指标，称为NetMHCII(参考文献24a)。

尽管在预测与I型和II型HLA分子结合的肽方面的进步，但是就评估涉及同种异体反应性和产生供体特异性抗体(DSA)因素而言，仍有很大的不确定性。考虑目前可用于预测肾移植之后不想要的免疫应答的工具，需要提供更可靠的方法用于评估移植后的潜在不利反应。

间接识别错配的HLA抗原

概念上，错配的HLA定向的T-细胞同种异体反应性可源自直接和间接识别HLA差异。迄今为止，目的在于阐释和预测针对错配的HLA的临床同种异体反应性的研究主要关注直接识别HLA差异。直接识别涉及供体T细胞，其识别具有非多态肽的完整的错配的HLA分子(参考文献9a)。当HLA等位基因的多态性导致肽-结合凹槽的差异时，存在的HLA分子的肽集合可根本上不同。这些不同的肽集合可导致T-细胞应答。HistoCheck算法测定接触T-细胞受体的肽-结合凹槽或区域的HLA分子的结构差异，从而预测差异分数(参考文献10a)。但是，HistoCheck获得的分数在体外(参考文献6c)以及在体内(参考文献7c，11a，12a)都与同种异体反应性不相关。

T-细胞相关的同种异体反应性也可潜在地被间接识别错配的HLA等位基因诱发。对于次要组织相容性(H)抗原，更详细研究了间接识别。这些HLA呈递多态蛋白的错配与增加的aGVHD风险(参考文献13a)和下降的复发风险相关(参考文献14a，15a)。与源自次要H错配的肽类似，源自错配的HLA分子的肽可也由HLA呈递。

间接识别错配的HLA抗原可导致T细胞相关的同种异体反应性。在间接HLA识别期间，T细胞识别由共享(匹配)的HLA分子呈递的源自多态HLA抗原的肽。源自错配的HLA分子的肽经常由HLA呈递(参考文献10c)。这些间接可识别的HLA抗原决定部位已经与实体器官移植的急性和慢性移植物衰竭相关(参考文献11c，12c，13c，14c)。所以，在自身HLA背景下，间接识别HLA错配的T细胞可在临床同种异体反应性中起重要作用。

利用今天鉴定的约8800个HLA等位基因(参考文献15c)，实验测定所有潜在的所有HLA抗原中呈递的HLA起源的抗原决定部位是大量的和几乎不可能的工作。为了利于识别这些间接可识别的HLA抗原决定部位，已经开发了新的方法。该方法基于有效的预测工具(参考文献18a，19a，21a，20a，20c)。

本发明指出了预测作为预测间接可识别的HLA抗原决定部位(PIRCHES)呈递的HLA起源的抗原决定部位。本发明识别了分别由共享的HLA I型(PIRCHE-I)和II型(PIRCHE-II)呈递的PIRCHES。PIRCHE-II显示为在肾移植之后诱导同种异体反应性；HLA-DR呈递的PIRCHES与供体特异性HLA IgG抗体的从新形成相关(参考文献21c)。

因此，本发明基于发现识别HLA起源的肽对HLA错配的HSCT之后的临床同种异体反应性起作用。为了该目的，可评估预测的PIRCHE-I和PIRCHE-II的数量和评估它们HSCT的不利临床作用。基于该研究，本发明描述了普遍适用的方法，其可在HSCT和其他细胞或器官移植物之前预测非容许的HLA错配。

发明内容

鉴于现有技术，本发明的技术问题是提供在经历移植程序的患者中预测不想要的免疫应答、预测移植的治疗结果(例如存活、GVHD、复发、植入，移植物排斥)的方式或用于选择适于异源移植的具有低不利反应风险的供体细胞或组织制品的另外方式。

该问题通过独立权利要求的特征来解决。独立权利要求提供了本发明的优选实施方式。

因此，本发明涉及用于预测在移植之后对人白细胞抗原(HLA)的免疫应答的方法，其中所述免疫应答与供体和受体之间的HLA错配相关，所述方法包括：

-使供体和/或供体材料和受体HLA分型以测定HLA错配；以及

-测定预测的间接识别的HLA抗原决定部位(PIRCHES)的数量，其中所述PIRCHES是来自错配的受体-HLA等位基因的受体特异性或供体特异性的HLA起源的肽，并且预测为由共享(匹配)的HLA分子呈递，

-其中PIRCHES的数量与所述免疫应答的可能性相关。

所述方法因此提供了用于移植前预测发生不想要的对人白细胞抗原(HLA)的免疫应答的风险或可能性的优选方式，所述免疫应答可在移植之后出现。可提前进行所述方法的HLA分型，并且随后经本发明的方法分析与HLA类型相关的数据。

根据本发明，在HSCT和GVHD，GVL和降低的存活率的情况下，PIRCHES通常是受体特异性肽；而在器官或组织移植之后移植物排斥的情况下，PIRCHES可以是供体特异性的。

现有技术的方法如HLAMatchmaker评估错配之间结构相容性的程度(参考文献8a)，该方法没有提供不想要的免疫反应风险的预测性测定的有效方式。HLAMatchmaker考虑了可诱导HLA-抗体的HLA-抗原上抗原决定部位的结构基础。其通过将HLA I型抗原视为短序列的组合(三联体)，以及测定这些三联体的差异而这样做。三重错配的程度不显著与aGVHD相关。现有技术另外的方法(HistoCheck是通过Spellman和Askar和同事评估的方法(参考文献11a，12a))基于HLA分子内的位置和蛋白质中氨基酸的功能相似性，对HLA-等位基因产物进行分级。利用该级系统获得的差异分数不能预测aGVHD。

因为之前利用计算方法的尝试不能预测GVHD，本发明的方法是第一个计算机实施的方法，其利用可靠的和有效的移植前预测不想要的和潜在地危险的免疫应答为HSCT提供改善的供体选择。此外，尽管之前的尝试用主要评估HLA分子之间的结构/功能差异的方法进行(即基于直接识别HLA差异或经抗体识别的可能性)，本发明优选地基于预测的间接识别HLA错配的分子。本发明的方法令人吃惊地适于预测同种异体反应性，这在之前是不可能的。因此本发明基于令人吃惊的和出人意料的原理，即预测间接可识别的HLA抗原决定部位(PIRCHES)的数量与移植后不想要的免疫应答的可能性相关。现有技术中没有提供关于存在这种关系的提示。

因此本发明表示同种异体反应性的风险和由共享-HLA分子呈递的增加数量的错配HLA起源的肽之间关系的技术使用。这些数量可优选地经电脑测定和可用作与发展同种异体反应性，例如GVHD相关的预测性标记物。

本发明提供了优选地计算机实施的方法，该方法测定当完全匹配供体不可用时，哪个供体适于移植，而不需要费力的相容性试验。例如，本发明适于多种移植设置，比如干细胞、脐带血细胞或实体器官移植等等。本发明包括其中HLA错配在测定移植之后的同种异体反应性或组织排斥起重要作用的基本上任何移植。

考虑已经遭受移植之后不想要的免疫应答的患者的巨大健康成本，用于预测安全可移植的材料的方法对医学团体具有至高的重要性。如本文所描述的方法能够减少外科手术(或治疗)的上游风险，从而分别避免患者、医学从业者和机构的大量健康和财务成本。

因此，在一种实施方式中，本发明涉及预测移植之后对人白细胞抗原(HLA)的与供体和受体之间的HLA错配相关的免疫应答，优选地由供体和受体之间的HLA错配诱导的免疫应答的方法，其中以优选地利用基于序列的分型以高分辨率水平进行供体和受体的HLA分型以测定错配，使用计算机实施的方法通过测定呈递和/或结合源自错配的受体和/或供体HLA等位基因的肽，鉴定预测的间接识别的HLA抗原决定部位(PIRCHES)的数量，由此PIRCHES的数量与所述免疫应答的可能性相关。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述移植包括造血干细胞移植(HSCT)。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述移植包括脐带血或脐带血细胞移植。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述移植包括肾移植。

本发明的方法也可用于在其他医学不适的背景下预测不想要的免疫应答，比如继发性复发流产、妊娠期间的抗体形成或用于角膜移植之间评估的风险。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述免疫应答包括不想要的同种异体反应性。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述免疫应答包括需要的同种异体反应性，由此需要的同种异体反应性可以是抗白血病同种异体反应性。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述免疫应答包括T-细胞介导的应答。在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述免疫应答导致急性移植物抗宿主病(aGVHD)或慢性移植物抗宿主病(cGVHD)。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述免疫应答包括抗体介导的应答。如在下面实验实施例中显示的，针对其形成抗体的HLA分子具有统计上较大量的PIRCHES。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述免疫应答的可能性随着PIRCHES数量的增加而增加。如在本申请的实施例中广泛描述的，具有可由HLA I型呈递的大量(>2)肽的患者与具有少量(≤2)的患者相比，显著更早地形成aGVHD(实施例1)。与没有或有限的cGVHD的那些相比，遭受广泛cGVHD的患者显示由HLA I型和II组合和分别由HLA I型和II型可呈递的更大量的肽的趋势。在预测HLA I型和II型组合上存在大量肽相比少量的患者中更早地形成广泛cGVHD。具有低PIRCHE-I和PIRCHE-II值的患者显示最低的风险评估，类似于10/10匹配移植。尤其低PIRCHE-I组中的供体-受体组合是有利的：与更高PIRCHE-I组中的患者相比，这些组合具有显著增加的生存和无疾病生存率的概率，和显示降低的急性和慢性GvHD的风险。这些结果表示完全史无前例和出人意料的技术效果。通过本方法，可选择错配的供体，其提供与HLA匹配供体基本上相同低风险的不想要的免疫应答。

本发明的计算机实施能够确保有效的、快速和可靠的方法，用于识别潜在地容许的异源移植用供体材料。通过软件处理的数据可以完全或部分自动方式加工，从而在优选的实施方式中确保自动计算机实施的方法。与供体和受体的HLA分型相关的数据，以及为任何供体-受体对测定的PIRCHES的数量可电子储存和保持在适当的数据库中。因此，本发明也涉及能够进行如本文所描述方法的计算机软件。本发明进一步涉及优选地自动计算机实施的方法，其用于预测移植之后针对人白细胞抗原(HLA)的免疫应答。

所述系统优选地包括具有关于所有公开HLA等位基因的信息的数据库。当公开新的HLA等位基因序列时，可更新数据库。优选地基于PERL，但是也可以基于其他计算语言的计算机软件可用于产生和/或更新数据库，除了调用各自用于评估PIRCHES的数量的程序(例如NetChop，NetMHC等)。

本发明进一步包括用于优选地移植前预测对人白细胞抗原(HLA)的免疫应答的系统，所述免疫应答可在移植之后出现，其中所述免疫应答与供体和受体之间的HLA错配相关，所述方法包括使供体和/或供体材料和受体进行HLA分型以测定HLA错配；以及测定预测的间接识别的HLA抗原决定部位(PIRCHES)的数量，其中所述PIRCHES是来自错配的受体-HLA等位基因的受体特异性或供体特异性的HLA起源的肽，并且预测为由共享(匹配)的HLA分子呈递，其中PIRCHES的数量与所述免疫应答的可能性相关。所述系统可包括计算设备、数据储存设备和/或适当的软件，例如各个软件模块，其彼此相互作用以实施如本文所描述的方法。

在一种实施方式中，所述系统可包括脐带血库的资料库或数据库，由此测试每个样品的HLA类型；和电子储存的信息。所述系统也可包括其中储存受体的HLA类型数据的另外计算设备，例如临床医生、移植中心或医院的设备之间的联系。通过两个数据库之间的联系，例如通过因特网，本发明的方法可使用适当的软件进行。可比较多个潜在的供体样品和患者的HLA类型并且测定任何给定供体-受体对的PIRCHE。根据基于本文所述的方法的分析，可进行临床上相关的预测，任何给定的供体材料，例如储存在脐带血库或其他细胞或组织库中的那些样品是否适于移植。本发明也涉及适于进行本文所述方法的软件。

在一种实施方式中，本发明的方法包括比较来自受体的HLA分型有关的数据与多个潜在的供体样品，以便识别适当的移植材料。

因此，本发明涉及用于基于移植之后针对人白细胞抗原(HLA)的免疫应答的预测，选择和/或筛选具有可接受的错配异源移植用供体材料的方法，其中所述免疫应答与供体和受体之间的HLA错配相关，所述方法包括：比较多个供体样品的HLA类型与受体的HLA类型以便测定HLA错配；以及测定每个供体-受体对的预测的间接识别的HLA抗原决定部位(PIRCHES)的数量，其中所述PIRCHES是来自错配的受体-HLA等位基因的受体或供体特异性HLA起源的肽，并且预测为由共享(匹配)的HLA分子呈递，其中PIRCHES的数量与所述免疫应答的可能性相关。

在一种实施方式中，供体和/或受体的HLA分型可在计划移植之前进行，并且与任何给定的供体材料HLA分型相关的相应数据可优选地储存在适当的计算机储存器和/或计算介质如数据库和/或资料库中，其可由适当的软件访问。这种数据库可以是干细胞数据库、脐带血数据库或组织或器官数据库，例如与潜在的供体材料相关的数据的集中化或局部储存。当可通过任何给定的移植治疗的病况的医学诊断时，可进行(如果还未进行的话)患者(受体)的HLA分型并且HLA分型的结果与为潜在的供体材料储存的数据比较。这种比较可通过标准软件进行。

当识别HLA匹配材料时，可进行移植。在材料鉴定为其中供体和受体之间的HLA错配是明显的情况下，可通过将本发明的方法或系统应用至任何给定的或所有可能的供体-受体对来确定错配的可容许性。能够进行测定PIRCHES的数量的适当的软件可用于任何给定的供体-受体对，并且基于PIRCHES的数量，评估HLA错配的可容许性，优选地自动评估。

尤其对于HSCT，就搜索而言有两个选择：

1)识别许多潜在匹配的供体，对所述潜在匹配的供体分型和测定它们是否具有某些错配，随后基于PIRCHES的分析选择最佳(最容许的)错配；和/或

2)识别难以或不可能完全匹配的某些患者，对可能的替换方案/错配运行PIRCHE算法，以及随后从具有低PIRCHES的潜在供体调取样品。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中来自错配的受体-HLA等位基因的所述受体特异性或供体特异性的HLA起源的肽通过用于鉴定人蛋白酶体的切割位点(内肽酶和/或蛋白酶位点)的计算机实施的方法来鉴定。本发明该特征的优选实施方式涉及软件NetChop，或可选的如本文所描述软件的使用，其能够测定肽序列的蛋白酶体切割。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述通过共享(匹配)的HLA分子呈递肽的所述呈递是由用于预测所述肽与任何给定的HLA分子结合的计算机实施的方法。本发明该特征的优选实施方式涉及软件NetMHCpan和/或NetMHCII的使用，或如本文所描述的其他可选方案，其能够测定(或预测)任何给定的，优选地HLA或MHC分子中九聚体肽的结合。

蛋白酶体切割预测和HLA-结合预测可在设计为顺序并入两个模块的软件中进行，以便提供PIRCHES的数量的自动测定。

本发明的方法可以这种方式进行，使得任何长度包括或5-20，优选地8-15，更优选地9-10个氨基酸的肽可被鉴定，并且被考虑为PIRCHES。在优选的实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述PIRCHES为九聚体(9氨基酸)肽。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中所述PIRCHES由共享的HLA I型(PIRCHE I)或共享的HLA II型(PIRCHE II)呈递。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中PIRCHE-I肽预测的IC50结合值≤10μM，优选地≤1000nM，更优选地≤500nM。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中PIRCHE-II肽预测的IC50结合值≤20μM，优选地≤5μM，更优选地≤1000nM。

其他结合标准可用于预测肽是否由HLA分子呈递。所提供的值是基于先前在文献中描述的结合特性，但是如果PIRCHE可合理地认为结合和甚至根据呈递HLA订制它，可推断或应用不同的值。尽管当前的值是我们在本研究中使用的，但是看上去有效。

对于每个供体-受体对，鉴定可呈递的受体特异性或供体特异性的HLA起源的肽(PIRCHES)。PIRCHE-I可优选地在两个步骤中鉴定：

1)优选地使用NetChop，进行氨基酸序列被蛋白酶体的预测加工和经TAP通道的运输的计算机评估。NetChop是公知基于软件的方法，其用于基于序列分析鉴定人蛋白酶体的切割位点。九聚体肽优选地包括在分析中。

在优选的实施方式中，测定C-末端切割潜能。切割(优选地经计算机)整个HLA蛋白并且标记可切割的所有位置。从标记的位置往后，优选地鉴定分析结合I型的九聚体肽。

作为NetChop的可选方案，可应用的各种基于软件的方法是本领域已知的，比如MAPP、PaProc或Lu等(J Zhejiang Univ Sci B，2013Sep；14(9):816-28)或Ginodi等(Bioinformatics，2008年2月15日；24(4):477-83)描述的那些方法。

2)随后使用NetMHCpan，测试具有高概率加工的肽(根据步骤1)被供体和受体(优选地HLA-A、-B和-C)之间共享(匹配)的HLA呈递的能力。NetMHCpan是公知方法，其用于使用人工神经网络鉴定和/或预测肽与任何已知MHC分子的结合。该方法在覆盖大于150种不同MHC分子的大于150,000个量化的结合数据上操作。可对HLA-A、B、C、E和G等位基因进行预测。可以nM IC50值给予预测值，或作为200000个随机天然肽集合的％-分级。优选地，选择IC50结合值≤500nM的肽作为相关的结合子。

可如下鉴定PIRCHE-II：

优选地，潜在的15聚合体HLA-DR、-DQ和-DP结合子的九聚体结合核心可优选地用NetMHCIIPan 2.0/NetMHCII 1.0或NetMHCII 2.2分析。NetMHCII是用于使用人工神经网络预测肽结合HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP和小鼠MHC II型等位基因的公知方法。可获得覆盖9个HLA-DR超类型的14个HLA-DR等位基因的预测，六个HLA-DQ、六个HLA-DP和两个小鼠H2II型等位基因。以nM IC50值给予预测值，并且作为1000000个随机天然肽集合的％-分级。IC50-结合值≤1000nM的肽被认为是相关的。

本领域已知许多可选的方法，其可用于测定HLA结合。SYFPEITHI(基于Rammensee等Immunogenetics 41，178-228，1995和Rammensee等，LandesBioscience 1997中描述的方法)和BIMAS是熟知的可选方案，并且适于I型结合但在II型结合中显示一些缺点。其他可选方案涉及Tepitope(基于Sturniolo等，1999，Nat.Biotechnol.17:555-561)、TepitopePAN、EpicCapo、PAAQD、POPI、Propred和Multipred。

在一种实施方式中，根据呈递共享的-HLA等位基因，源自供体-HLA等位基因的预测的结合子视为自供体肽，以及受体-HLA等位基因视为自受体肽，这取决于治疗设置，因此从分析中排除。一般而言，对于每个供体-受体对，计数可呈递的受体特异性或供体特异性肽(源自错配的受体-HLA等位基因和预测由共享HLA呈递)的数量，以便产生PIRCHES的数量。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中对HLA亚型HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPB1、-DQA1、-DPA1、-G、-E、-F、MICA、MICB和/或KIR进行HLA分型。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中对HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1进行HLA分型。这些5个等位基因提供通常使用的术语“9/10匹配”的基础，其指9/10匹配的非亲缘供体。在这种情况下，这些5个基因中的10个等位基因的9个显示匹配但是一个等位基因仍不匹配。在优选的实施方式中，本发明因此允许测定使用来自这种9/10匹配的非亲缘供体的材料是否安全，即是否错配对于移植是容许的。

本发明还涉及如本文所描述的方法，其用于在供体样品中发现容许的HLA错配，所述供体中存在比常见的9/10情形更多的错配。本发明包含的潜在供体的一个例子是单倍体相同的供体，其可使用本文所述的用于容许的错配供体材料的方法来筛选。单倍体相同相关的供体可描述为与患者具有“50％匹配”的供体。该类型的供体可以是父母、兄弟姊妹或孩子。根据定义，患者的父母或孩子都是单倍体相同的供体，因为一半的遗传物质来自每个父母。兄弟姊妹有50％的机会是单倍体相同的供体。单倍体相同的HSCT为更多的人提供HCT的选择，因为90％的患者具有单倍体相同的家族成员。其他优势包括：立即供体可用性；对于所有的患者无论种族背景等价获取；在多个供体之间选择的能力；以及如果需要获得另外细胞的能力。可选地，脐带血单位(CBU)可能不显示高水平的HLA匹配，但是如果错配如本文所描述方法测定是容许的，则仍适于移植。CBU通常最小4/6匹配，但是该匹配可在等位基因水平导致4/10或5/10情况。

考虑如本文所描述的方法一些程度上依赖于共享的HLA，最小HLA匹配是一个等位基因匹配。尽管这对于HSCT不可能发生，对于器官移植经常出现这种情形，这是因为可用的供体材料数量有限。所以，本发明可在具有最小一个等位基因匹配的错配的样品上进行。因此错配的供体可涉及1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10(DP错配)匹配。如果测试另外的等位基因，供体也可以显示任何其他类型的错配，由此存在至少一个等位基因匹配。对于移植，优选的是具有显著HLA匹配的供体。如果另外等位基因经受分型，所以供体可以是例如11/12或13/14匹配。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中HLA分型包括血清和/或分子分型。在优选的实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中HLA分型利用基于序列的分型以高分辨率水平进行。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中HLA分型包括对HLA I型等位基因的外显子1-7和HLA II型等位基因的外显子1-6进行测序。在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中HLA分型包括对HLA I型等位基因的外显子2和3以及HLA II型等位基因的外显子2进行高分辨率HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1分型。这些具体的HLA分型方法描述在本文提供的实施例中，并且显示出超过之前分型方法的优势，提供充分覆盖需要待分型以识别错配的等位基因。

本发明的方法可原则上对人蛋白质组/基因组中的任何给定的多态蛋白质(或编码所述多态蛋白质的相应基因)进行。在本发明的进一步方面中，提供了预测在移植之后对任何给定的多态蛋白质的免疫应答的方法，其中所述免疫应答与供体和受体之间的多态蛋白质的差异相关，所述方法包括：

-识别供体和受体之间的多态蛋白质，例如，经已知携带潜在免疫相关的多态型的基因组区域的核酸测序和/或经优选地“下一代”测序技术的全基因组测序(例如，454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序)；以及

-测定预测的间接识别的抗原决定部位的数量，其中所述抗原决定部位是来自HLA分子的受体特异性或供体特异性的多态源的肽，并且预测由HLA分子呈递，

-其中抗原决定部位的数量与所述免疫应答的可能性相关。

根据本发明的该方面，全基因组测序可对一组HLA-相同的兄弟姊妹移植进行并且识别供体和受体之间基因组范围的所有多态性。所有这些多态性然后使用本文描述的方法，用于产生与为HLA错配描述的数据库类似的数据库。然后经类似的计算方法计算免疫错配分数并且分析用于临床结果。

本发明进一步涉及预测移植的治疗结果的方法，其包括如本文所描述的方法。在优选的实施方式中，所述治疗结果选自由患者存活率、无疾病存活率和移植相关的死亡率所组成的组。如在本文实施例中所显示的，PIRCHE数量与移植之后的治疗结果密切相关。根据这些实施方式，通过进行本发明的方法，不仅确保这样移植的成功，而且也可确保具体治疗的相关治疗益处，例如预先筛选潜在的供体材料，如本文所描述的。

因此，本发明进一步涉及用于选择异源移植用细胞或组织制品的方法，包括如本文所描述的方法。该方法优选地涉及一种用于选择和/或筛选可接受的错配的异源移植用供体材料。本发明的方法表示计算机实施的程序，其对于移植受体的健康和安全性有直接相关性。

在优选的实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中异源移植用供体材料起源于具有至少一个等位基因匹配的供体。

在优选的实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中异源移植用供体材料起源于具有10/10匹配和HLA-DP错配的供体。HLA-DP是已知对移植相关的免疫应答相关的基因座，并且先前与GVHD相关。可能地，在具有10/10匹配的患者中；存在HLA-DP错配。本发明可也用于评估源自HLA-DP错配的PIRCHE。

在优选的实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中用于异源移植的供体材料起源于9/10匹配的非亲缘供体。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中当PIRCHE-I的数量≤3，优选地≤2，更优选地≤1时，用于异源移植的供体材料与低风险的不想要的免疫应答相关。如在本文的实施例中显示的，这些PIRCHE数量的值与移植后降低频率的不想要的免疫应答显著相关。

本领域没有提出对这种肽存在“可接受的数量”的阈值。除了由指示安全或危险的供体材料的具体值限定的进一步实施方式，本发明的该方面能够以简单的“是-否”读出形式评估复杂的生物现象，从而为方法的终端使用者提供反馈，任何给定的供体材料是否合适。这随后确保完全自动的方法朝着询问包括HLA分型数据的资料库，并且能够进行其中提供关于来自优选地9/10错配供体的材料对于应用是否可相对安全的清楚指示的方法。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中当PIRCHE-II的数量≤4，优选地≤3，更优选地≤2时，异源移植用供体材料与低风险的不想要的免疫应答相关。如在本文的实施例中显示的，这些PIRCHE数量的值与移植后降低频率的不想要的免疫应答显著相关。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中当组合的PIRCHE-I和PIRCHE-II的数量≤6，优选地≤4，更优选地≤2时，用于异源移植的供体材料与低风险的不想要的免疫应答相关。如在本文的实施例中显示的，这些PIRCHE数量的值与移植后降低频率的不想要的免疫应答显著相关。

与有害移植的风险相关的PIRCHE数量的具体值是基于本文实施例中提供的分析。根据实施例，基于剂量响应(即风险与PIRCHE比)不必是线性的假设，将群体分成三分位。这种剂量响应曲线可本质上是S形的或显示某种平稳阶段，从而提示基于三分位的分析。本文提供的PIRCHES的具体值可考虑为目标值，尽管这些值表示不是限定本发明本质的优选的值。鉴于对考虑不同长度的肽，或对于HLA分子的不同结合亲和力，或根据基因座的数量或错配的数量而应用的不同严格度，这些值可以改变。在优选的实施方式中，相对高水平的PIRCHES与免疫反应之间、以及低PIRCHE水平与容许的错配之间的相关性与本发明的目标表示相关。因此，该方法也包括免疫应答的风险的相关评估，由此当评估多个潜在的供体时；与其他供体相比，那些具有相对更低数量的PIRCHES的供体认为对于移植是优选的。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其中询问HLA-DQB1抗原错配。如在实施例5中所显示的，HLA-DQB1抗原错配导致最高数量的PIRCHE-I和-II，从而指示当预先筛选用于适当的移植材料的潜在错配供体时，该等位基因尤其应被评估。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其用于预测多个HLA错配的供体中的最佳供体。在一种实施方式中，本发明涉及如本文所描述的方法，其还包括分析和比较多个HLA错配的供体，以预测多个供体之间，例如两个脐带血单位之间和/或匹配的和HLA错配的供体之间的同种异体反应性。作为移植，尤其是干细胞或脐带血的移植成为更可靠和优选的治疗选择，有时必须使用多个供体样品以便为移植提供足够的材料。鉴于此，本发明方法能够“多供体”分析，从而不仅比较供体-受体匹配，而且另外或可选地评估供体-供体匹配，以便提前测定除了彼此的可能与受体相容的另外供体样品。本发明方法因此能够快速和可靠的“三路”相容性评估，而没有过去基于实验室方法的复杂性。

本发明的方法确保许多有益的技术和第二作用。通过如目前描述的方法，用异源的材料的移植可基本上以相同或类似低风险的不想要的免疫反应进行。鉴于该作用，本发明由于自动化地和/或计算机-实施而节省了时间；由于通过选择容许的错配的风险减少而降低健康风险、降低潜在地失败移植的医学成本、对于任何给定的受体增加可能的供体材料的库和确保先前无法医治的患者(例如具有非常稀少HLA-等位基因的那些患者)能够用异源的材料治疗。

具体实施方式

“预测”意思是关于未来可能事件的说明。也可使用术语“预报”。“预测”在本发明中表示评估移植之后发生的免疫应答的可能性或风险。基于预测、或风险评估，在潜在不想要的事件之前获得的有价值信息可用于测定进一步治疗选择。

术语“免疫应答”在本发明中指如本领域技术人员通常理解的免疫应答。免疫应答可理解为来自部分免疫系统对抗原的应答，当抗原被鉴定为外源时发生的应答，其优选地随后诱导产生能够破坏或固定“外源”抗原或使其无害的抗体和/或淋巴细胞。本发明的免疫应答可指受体的免疫系统对移植材料的应答，或移植细胞、组织或器官的细胞实施的免疫应答，由此例如在GVHD中，移植材料的T细胞与受体抗原或组织反应和/或攻击受体抗原或组织。免疫应答可以是受体的防御功能，其防止身体遭受外源物质如外源组织，或移植材料的免疫细胞对受体细胞或组织的反应。

人白细胞抗原(HLA)系统是人的主要组织相容性复合物(MHC)。超基因座包含许多与人免疫系统功能相关的基因。该组基因位于染色体6上，并且编码细胞-表面抗原呈递蛋白质且已经具有许多其他功能。由某些基因编码的蛋白质也称为抗原，由于它们历史上发现为器官移植物中的因子。主要HLA抗原是免疫功能的基本组成。对应MHC I型(A、B和C)的HLA从细胞内侧(如果存在的话，包括病毒肽)呈递肽。这些肽从在蛋白酶体中降解的消化蛋白质产生。一般而言，这些具体的肽是小聚合物，约9个氨基酸长度。外源抗原攻击破坏细胞的杀伤T-细胞(也称为CD8阳性或细胞毒素T-细胞)。对应MHC II型(DP、DM、DOA、DOB、DQ和DR)的HLA从细胞的外侧呈递抗原至T-淋巴细胞。这些具体的抗原刺激T辅助细胞的增殖，其接着刺激产生抗体的B-细胞，以产生针对该特异性抗原的抗体。

MHC基因座是哺乳动物中一些遗传上最可变的编码基因座，并且人HLA基因座也不例外。大部分HLA基因座对每个基因座显示一打或更多等位基因组。六个基因座具有超过100个等位基因，其已经在人群体中检测到。其中，最可变的是HLA-B和HLA-DRB1。

等位基因是基因座处核苷酸(DNA)序列的变体，使得每个等位基因与所有其他等位基因在至少一个(单核苷酸多态性，SNP)位置上不同。大部分这些改变导致改变的氨基酸序列，其导致蛋白质的轻微至巨大的功能差异。

“HLA”指人染色体6p21上的白细胞抗原基因座，由HLA基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1等)组成，其用于测定例如组织移植物的受体和供体之间错配的程度。“HLA等位基因”意思是在两个亲本染色体之一的基因座中的核苷酸序列。

“HLA分型”意思是识别给定基因座的HLA等位基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1等)。可采用基因测序。样品可获得自供体和/或供体材料和受体的血液或其他身体样品，其可随后被分析。一般而言，抗原的序列决定抗体反应性，并且所以具有好的测序能力(或基于测序的分型)消除需要血清反应。对于HLA分型的测序方法是优选的。测序可指基本方法，比如Maxam-Gilbert测序、链-终止方法、高级方法和从头测序如鸟枪测序或桥PCR；或所谓的“下一代”方法，比如大规模平行签名测序(MPSS)、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序或其他类似的方法。

如果采用血清分型，不同血清型反应可指示需要对人的HLA序列以测定基因序列。等位基因多样性使得优选使用宽抗原分型，随后基因测序，因为血清分型技术的有一些增加的错误识别的风险。表型分型指可采用的用于分析的血清学方法。基因分型可以择一或组合地进行。利用该策略，使用对于DNA的变体区域特定的PCR引物(称为SSP-PCR)。如果出现正确尺寸的产物，推定鉴定出了HLA等位基因。PCR-SSO也可用于并入探针杂交。关于HLA分型的技术方法的综述提供在文献：Erlich H，Tissue Antigens，2012年7月；80(1):1-11和Dunn P，Int J Immunogenet，2011年12月；38(6):463-73中。

就HLA分型而言，在分离/制备移植之前、期间或之后获得自供体本身和/或获得自供体材料的样品可用于HLA分型以及随后比较来自受体的HLA分型数据。例如，可进行供体本身的HLA分型，例如通过分析唾液、血液或其他体液样品用于HLA信息，以及任选地另外或可选地，在HLA分型期间分析获得自供体所期望的用于移植的材料(供体材料)的相同和/或互补的HLA类型特征。

“HLA错配”被定义为在供体和受体中识别不同的等位基因，其出现在任何给定的基因座。

供体通常理解为个体或多个个体(例如在多个样品或制品如脐带血单位(CBUs)需要有效治疗相关量的供体材料用于移植的情况下)，其提供供体材料，或换句话说生物材料，例如但不限于细胞、组织、器官；或用于在受体中移植的其他身体部分、体液和/或制品。提及供体或供体的HLA分型，也可分别指供体材料或供体材料的HLA分型。

本发明的目标受体通常是哺乳动物，优选是人。受体通常是遭受特征在于需要移植如必须移植的器官衰竭的患者。术语“器官”意指包括任何身体结构或细胞组，其包含组织化而进行身体的特定功能的不同组织，例如，心脏、肺、脑、肾、皮肤、肝、骨髓等。在一种实施方式中，移植物是同种异体移植，即个体和供体是相同的物种。受试者也可遭受可通过移植细胞治疗的病况，即使当不适本身不明确缺少或丧失内源细胞的具体子集的功能。一些不适可通过移植某些类型的干细胞来治疗，由此这些细胞的天然或内源库在受体中没必要是非功能的。

本发明的方法尤其适于打算接收或预测需要细胞、组织或器官移植的患者以预测不想要的免疫应答的可能性，比如起源移植物损伤或排斥，和/或对非移植物组织的免疫起源损伤。例如，患者可预期在接下来的一个、两个、三个、四个、五个、六个或十二月个内接收移植。可选地，试验尤其适于已经接收移植的个体，以预测免疫起源移植物损伤或排斥的可能性，和/或对非移植物组织的免疫起源损伤。移植后，所述方法尤其适于显示明显慢性器官功能障碍(移植物器官的)或可能的移植物抗宿主病(GVHD)，尤其慢性GVHD和尤其其中移植物是骨髓移植物的情况的患者。

移植以将细胞、组织或器官从一个身体(供体)移动至另一身体(受体或患者)，或从患者自身身体的供体位点移动至另一位点的，或从储存的供体材料移动至受体身体，以替换受体的受损或缺失的器官、或提供能够提供疗效的干细胞、其他细胞、组织或器官。

异源移植或同种异体移植是将来自相同物种的基因不同供体的细胞、组织或器官至受体。移植物称为同种异体移植物、异源的移植物或同种移植物。大部分人组织和器官移植物是同种异体移植物。同种异体移植物可来自活的或尸体来源。一般而言，可被移植的器官是心脏、肾、肝、肺、胰腺、肠道和胸腺。组织包括骨骼、肌腱(都称为肌肉骨骼移植物)、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经和静脉。世界上，肾是最常见的移植器官，接着是肝和然后是心脏。角膜和肌肉骨骼移植物是最常见的移植组织。

本发明还包括在筛选经再生医学产生的器官、细胞或组织，例如已经离体构建并且期望用于移植的重建的供体材料的背景下使用该方法。干细胞技术使得能够离体产生许多医学上相关的细胞类型或组织。所以，本发明也可用于筛选已经通过生物技术和/或组织工程化方法产生的其适于移植的异源材料。

本发明包括评估免疫反应的风险，优选地移植前风险评估，由此任何给定的干细胞可考虑为期望用于移植的供体材料。例如，造血干细胞移植(HSCT)是通常源自骨髓、外周血或脐带血的的多能造血干细胞的移植。其是在血液学和肿瘤学领域中常见的医学程序，通常为某些血液或骨髓的癌症患者进行，比如多发性骨髓瘤或白血病。在这些情况下，受体的免疫系统通常在移植之前用辐射或化疗破坏。感染和移植物抗宿主病是同种异体(也称为异源的)HSCT的主要并发症。

干细胞理解为未分化的生物细胞，其可分化成专用细胞并且可分裂(通过有丝分裂)生产更多的干细胞。高度弹性成人干细胞常规上用于医学疗法，例如在骨髓移植中。干细胞现在可人工生长并且通过细胞培养转化(分化)成具有与各种组织如肌肉或神经一致特征的专用细胞类型。通过治疗性克隆产生的胚胎细胞系和自体胚胎干细胞也已经建议为用于未来疗法的有希望的候选物。潜在的干细胞移植可指任何给定的干细胞疗法，由此存在许多干细胞疗法。医学研究人员预期成人和胚胎干细胞将很快能够治疗癌症、1型糖尿病、帕金森疾病、亨廷顿疾病、腹部疾病、贲门衰竭、肌肉损伤和神经科性不适和许多其他疾病。

也称为体细胞干细胞和生殖细胞系干细胞的干细胞可出现在儿童以及成年人中。多能成人干细胞是稀少的并且通常数量少，但是可出现在包括脐带血的许多组织中。以及发现骨髓是成人干细胞的丰富来源之一，其已经用于治疗数个病症，包括脊髓损伤、肝硬化、慢性肢局部缺血和晚期心力衰竭。成人干细胞可以是谱系限制性(多能)并且通常由它们组织起源称为(间质干细胞、源自脂肪的干细胞、内皮干细胞、牙髓干细胞等)。

多能干细胞也出现在羊水中。这些干细胞非常活跃，不用给料而广泛扩展并且不是致瘤的。羊水干细胞是多能的并且可在成脂细胞、成骨细胞、肌细胞、内皮细胞、肝细胞以及神经系细胞线中分化。可能收集羊水干细胞用于供体或用于自体使用。

源自脐带血的多能干细胞显示胚胎和造血特征。表型表征表明(CB-SCs)显示胚胎细胞标记物(例如，转录因子OCT-4和Nanog，阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3，和SSEA-4)和白细胞常见抗原CD45，但是它们可对于血液细胞系标记物是阴性的。另外，CB-SCs显示非常低的免疫原性，如表达非常低水平的主要组织相容性复合物(MHC)抗原和衰竭以刺激异源淋巴细胞的增殖。

HSC通常可获得自骨髓、外周血干细胞、羊水或脐带血液。在骨髓移植的情况下，通过到达骨中心的大针，从所述供体的大骨(通常是盆骨)去除HSC。该技术称为骨髓收获并且在一般麻醉下进行。外周血干细胞是用于异源HSCT的干细胞常用来源。它们可通过成为单采血液成分术的方法收集自血液。通过无菌针在一个臂中抽取供体的血液并且穿过去除白细胞的机器。红细胞可返回供体。利用每天皮下注射粒细胞-集落刺激因子，用于将来自供体骨髓的干细胞移动进入外周循环，可刺激外周干细胞产生。

也可能从羊水提取造血干细胞。脐带血液获得自出生后婴儿的脐带和胎盘。脐带血具有比通常在成人血液中出现的更高浓度的HSC。但是，获得自脐带的少量血液(通常约50mL)使得其更适于移植进入小的儿童而不是成年人。但是可使用多个单位。使用离体扩展脐带血单位或使用来自不同供体的两个脐带血单位的更新技术使得脐带血移植物用于成年人。脐带血可收获自新生儿童的脐带。

不像其他器官，骨髓细胞可被冷冻(冷冻保存)延长的时间，而不损伤过多的细胞。这对于自体HSC是必要的，因为细胞一般在移植治疗之前数月收获自受体。在异源移植物的情况下，新鲜的HSC是优选的，以便避免在冷冻和融化过程中可能发生的细胞损失。异源脐带血通常冷冻储存在脐带血库中，因为其仅仅在儿童出生时获得。为了冷冻保存HSC，必须添加防腐剂、DMSO，并且细胞必须在控制速度的冰箱中缓慢冷却，以防止在冰晶形成过程中渗透细胞损伤。HSC可在冷冻冰箱中储存数年，其通常使用液氮。鉴于此，本发明可涉及已经如本文所描述储存的供体材料的分型和风险评估，然后考虑用于移植。

本发明包括免疫反应的风险的评估，优选地移植前风险评估，由此任何给定的器官或组织可考虑为期望用于移植的供体材料。例如，肾移植或肾移植是肾器官移植进入患者，例如患晚期肾疾病的患者。肾移植通常归类为已故的-供体(之前称为尸体)或活的-供体移植，取决于供体器官的器官移植。活的供体肾移植物进一步表征为基因相关的(活的相关的)或非相关的(活的非亲缘)移植物，这取决于供体和受体之间是否存在生物关系。

同种异体反应性定义为淋巴细胞或抗体与同种异体抗原的反应，其可理解为来自外源材料的抗原。可经直接或间接同种异体抗原识别发生同种异体抗原识别，通过其T细胞可在器官移植之后识别同种异体抗原和潜在地导致移植排斥。

移植物抗宿主病(GVHD)是异源细胞、组织或器官移植之后相对常见的并发症。其通常与干细胞或骨髓移植相关，但是术语也适用于其他形式的组织移植物或器官移植。组织(移植物)中的免疫细胞(通常白细胞)将受体(宿主)视为“外源”。移植免疫细胞然后攻击宿主的体细胞。如果使用的血液产品还未被辐射，GVHD可也在输血之后出现。

蛋白酶体是所有真核生物和古细菌，并且一些细菌中内侧的蛋白质复合物。在真核生物中，它们位于核和细胞质中。蛋白酶体的主要功能是通过破坏肽键的化学反应，蛋白水解而降解不需要的或损伤的蛋白质。由MHC I型分子呈递的大部分抗原肽源自细胞内蛋白质被蛋白酶体的降解。错配的HLA抗原的蛋白酶体降解可由如本文所描述的计算工具预测。

在实施例5的背景下，总生存率(OS)定义为不论疾病状态在任何时间点的生存概率。审查在上次随访中活着的患者。无疾病生存率(DFS)定义为在随访的任何时间点活着并且没有疾病的概率。审查在他们上次随访时活着的患者。移植相关的死亡率(TRM)定义为没有之前疾病复发的死亡率。复发视为抵触事件。急性GvHD等级根据国际共识定义，慢性GvHD根据西雅图标准定义(参考文献31c，32c)。复发率(RI)定义为在任何给定的时间点的复发的概率，由于任何其他原因的死亡视为抵触事件。

附图说明

通过下述图描述本发明。本文提供的图表示对于本发明的具体实施方式的支持并且不旨在限制本发明的范围。

图1显示根据临床结果可呈递的肽的数量的框型图。A-C：根据急性GVHD的等级可呈递的肽的数量。D-F：根据慢性GVHD的等级肽的数量。G-I：根据恶性疾病的复发/进展肽的数量。J-L：根据生存率肽的数量。左图表示根据组合的HLA I型和II型可呈递的肽的数量，中图表示根据HLA I型可呈递的肽的数量，和右图表示根据HLA II型可呈递的肽的数量。水平线表示中值，白色盒表示25％至75％，以及须表示范围。用Mann-Whitney U检验测试肽的数量的差异。在发展的II-IV级aGVHD、广泛的cGVHD和那些不复发/进展其疾病的患者中观察到可呈递的肽的数量的不显著的增加。无aGVHD或具有I级和II-IV级aGVHD的患者的中值分别为：由组合的HLA I型和II型6和8可呈递的肽；由HLA I型2和3可呈递的肽；由HLA II型4和5可呈递的肽。具有无或有限的和广泛的cGVHD的患者的中值分别为：组合的HLA I型和II型6和10；HLA I型2·5和4；和HLA II型4和6。非复发和复发患者的中值分别为：由组合的HLA I型和II型8和8可呈递的肽；由HLA I型4·5和2可呈递的肽；和由HLA II型4和5可呈递的肽。生存蛋白和非生存蛋白患者的中值分别为：由组合的HLA I型和II型8和8可呈递的肽；由HLA I型3和2可呈递的肽；和由HLA II型4和5可呈递的肽。

图2显示根据临床结果具有高的或低的可呈递的肽的数量的患者的Kaplan-Meier曲线。A-C：按照II-IV级急性GVHD的累积发生率可呈递的肽的数量。D-F：按照广泛慢性GVHD的累积发生率肽的数量。G-I：按照恶性疾病的复发/进展的累积发生率肽的数量。J-L：按照死亡率的累积发生率肽的数量。左图表示由组合的HLA I型和II型可呈递的肽的数量，中图表示由HLAI型可呈递的肽的数量，和右图表示由HLA II型可呈递的肽的数量。对于每项临床结果，选择对照组的中值作为截取值，如在图1中所显示。虚线表示预测存在高于该截取值的肽的数量的患者，实线表示预测存在于该截取值处或低于该截取值的肽的数量的患者。比较第一组与后一组确定风险比。NS＝不显著的。

图3给出了提取自一组869肾移植对的匹配本发明的纳入标准的肾移植研究组的描述。

图4显示免疫原性(实心点)和非免疫原性(空心框)HLA I型等位基因中PIRCHE-IIs的数量的比较。A)与非免疫原性等位基因相比，观察到免疫原性等位基因中PIRCHE-IIs的数量较大。B)当以搜索的受体DRB1为背景分析错配的源自供体的HLA等位基因时观察到无差异。报告的p-值源自Mann-Whitney U检验。

图5显示在免疫原性(实心点)和非免疫原性(空心框)HLA I型等位基因中HLAMatchmaker三联体(A)和抗原决定部位联体(B)的数量的比较。报告的p-值源自Mann-Whitney U检验。

图6描述将抗原决定部位联体和PIRCHE-II识别为两个分开的实体。A)抗原决定部位联体的数量和PIRCHE-II的数量之间的相关性。免疫原性等位基因被描述为实心点；非免疫原性等位基因被描述为空心框。所得的回归曲线分别用实线和虚线描述。回归系数基于两组的组合的分析。重叠数据被移位0.1个单位，仅为了直观化目的。B)HLA I型分子上的PIRCHE-IIs的定位，如在研究的肾移植组中所观察。颜色指示在免疫原性HLA I型抗原中氨基酸的相关存在；(绿色＝0，黄色＝1至4，橙色＝5至9，和红色＝>10)。非多态β-2m分子被描述为蓝色。C)PIRCHE-IIs的定位(实线)对在HLA I型分子中抗原决定部位联体相关的残基(黑条)，如在10000个模拟的移植物的虚拟的移植组中观察。抗原决定部位联体相关的残基定义为存在于3.0埃抗原决定部位联体块(4)内的多态残基。重叠(灰条)被计算为其中氨基酸残基存在于抗原决定部位联体和PIRCHE-II的情形二者中的百分数。

图7：A：PIRCHE-I与总生存率的相关性；B：PIRCHE-II与总生存率的相关性。在低的PIRCHE-I和-II组中的患者均具有与10/10s相似的OS比。具有中的或高的PIRCHE-I和-II的患者具有与10/10s相比显著降低的OS比(表3)。当三组PIRCHE彼此比较时，在中的或高的PIRCHE组中的患者(组合的中的和高的PIRCHES组)具有与低的PIRCHE组相比统计学上显著降低的OS比(PIRCHE-I：p＝0.029和PIRCHE-II：p＝0.048)。

图8：A：PIRCHES对总体生存率的作用；B：PIRCHES对无疾病生存率的作用；C：PIRCHES对移植相关的死亡率的作用；D：PIRCHES对急性GvHD的作用；E：PIRCHES对慢性GvHD的作用。与参考10/10情形相比，不同的PIRCHE组的作用的多变量分析；在急性GvHD的情况中的HRs或ORs显示具有95％置信区间。

图9：A：PIRCHE-I与TRM，B的相关性：PIRCHE-II与TRM的相关性。在低的PIRCHE-I和-II组中的患者均具有与10/10s相似的TRM比。具有中的或高的PIRCHE-I和-II的患者具有与10/10s相比显著增加的TRM风险(表3)。与较高的PIRCHES相比，低的PIRCHE-I和-II与显著较低的TRM关联(p＝0.038和p＝0.039，分别地)。

图10：PIRCHE-I和-II的相互作用分析，对OS的作用。呈现低数量的PIRCHE-I和-II的患者具有可与10/10s相比的OS比。

实施例

通过下述实施例描述本发明。本文提供的实施例表示对本发明具体的实施方式的实践支持。这些并不旨在限制本发明的范围。实施例应视为提供可能的和潜在地优选的实施方式的描述，其表明一个或多个非限制性实施方式的相关技术操作。

实施例1-错配的HSCT之后同种异体反应性的风险随着由共享-HLA分子呈递的受体特异性HLA-肽的数量增加而增加

实施例1的总结：

背景：移植物抗宿主病(GVHD)是造血干细胞移植(HSCT)的主要限制因素之一。确立的GHVD的风险因素是具有HLA错配的非亲缘供体的HSCT。一些错配好像是更容许的，而其他的导致发展GVHD的增加风险。目前，由于这些非容许的错配的同种异体反应性的生物基础未知。本实施例表明该方法预测非容许的错配和它们与由共享HLA呈递源自受体特异性错配的HLA分子的肽至供体-T细胞的用途。

方法：回顾性地，分析用9/10匹配非亲缘供体移植的48个非清髓性预处理患者。用基于序列的分型以高分辨率水平测定HLA分型。使用经电脑方法预测由共享HLA可呈递的受体特异性HLA肽的数量和对照组的预测的肽的中值数量选择为截取值。

结果：预测在HLA I型上存在大于中值数量肽的患者更早和更频繁发展急性GVHD(aGVHD)，而预测在HLA I型和II型组合上存在大于中值肽的患者比预测存在中值或小于中值的肽的患者更早发展广泛慢性GVHD(cGVHD)。此外，预测在HLA I型上存在大于中值数量肽的患者具有降低危险的恶性疾病的复发/进展，此外，这发展更晚。错配的HSCT之后的同种异体反应性的发生可基于HSCT之前供体和受体的HLA分型预测。

方法：

研究群体：2001和2011之间，回顾性分析University Medical CentreUtrecht，Utrecht，netherlands中移植9/10匹配非亲缘供体的患者。该分析中包括的患者已经接收非清髓性(NMA)预处理方案并且用错配在GVH方向上移植。排除非移植的患者。根据Helsinki的声明和当地IRB指南，患者已经给予书面知情同意书允许使用他们的医学记录用于研究。

疗法：用由在一天2Gy的总体身体照射，ATG(genzyme)2mg/kg/天进行四天，和氟达拉滨30mg/m²/天进行三天组成的NMA预处理治疗患者。接收未处理的移植物的患者。免疫抑制疗法由下述组成：环孢素A 4.5mg/kg每天两次直到120天，其然后以10％剂量减少每周逐渐减少没有GVHD。环孢素A结合吗替麦考酚酯15mg/kg，每天三次直到84天，并且如果没有GVHD，逐渐减少并且在两周内停止。所有的患者接收抗生素预防，包括复方新诺明480mg每天两次和伐昔洛韦500mg每天两次，如所报道(参考文献16a)。

HLA分型：为所有包括的患者和供体使用基于对五个基因座(HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1)的测序的分型进行高分辨率HLA分型。解决等位基因和基因型歧义。对于一个HSCT对的回顾性高分辨率HLA-C分型，没有可用的剩下的DNA，但是先前进行低分辨率水平HLA-C分型。对于该供体-受体对，基于HLA-B-C关联的频率推理高分辨率HLA分型(参考文献17a)。

HLA起源的肽测定：优选地，对于每个供体-受体对，可鉴定可呈递的受体特异性HLA起源的肽。供体和受体的所有的HLA等位基因中，使用NetChop3.0预测通过蛋白酶体它们氨基酸序列的加工和经TAP通道的运输(参考文献18a，19a)。随后，使用NetMHCpan 2.0测试具有高概率加工的肽的它们由供体和受体之间共享的HLA I型等位基因(HLA-A和-B)呈递的能力(参考文献20a，21a)。仅九聚体肽包括在分析中。IC50结合值≤500nM的肽选择为相关的结合子(参考文献22a)。对于HLA II型呈递(HLA-DRB1)，用NetMHCII 1.0预测潜在的结合子(参考文献23a，24a)，和≤1000nM的IC50结合值认为是相关的(参考文献25a)。根据呈递共享-HLA等位基因，预测的源自供体-HLA等位基因的结合子视为自供体肽并且因此从分析中排除。对于每个供体-受体对，计数可呈递的受体特异性肽(源自错配的受体-HLA等位基因和预测由共享HLA呈递)的数量。这些受体特异性肽报道为可呈递的肽的数量。如本文鉴定的可呈递的肽通常称为预测间接可识别的HLA抗原决定部位(PIRCHES)，其来自I型等位基因(PIRCHE-I)或II型等位基因(PIRCHE-II)。

统计方法：评估临床结果是：aGVHD、cGVHD、恶性疾病的复发/进展，和总体死亡率(由于任何原因的死亡)。为与这些临床终点相关性分析的因素：可呈递的肽的数量(总计，分别HLA I型和II型)、供体淋巴细胞浸润(DLI)、错配的受体和供体之间的性别、和患者年龄。也分析与cGVHD相关的aGVHD的发展。仅仅分析具有恶性疾病的受体的复发/进展。死亡视为GVHD和复发的竞争性风险。DLI和来那度胺视为aGVHD的竞争性风险。报告绝对变量的连续变量和百分数的中值和范围。

使用Mann-Whitney U检验统计上分析根据可能的临床结果的可呈递的肽数量的差异。对于每个临床结果，对照组(例如没有II-IV级aGVHD、广泛cGVHD、复发或死亡率的组)的可呈递的肽的中值数量选择为截取值。患者分成两组：具有大量可呈递的肽(大于中值)的那些和具有少量可呈递的肽(小于中值或为中值)的那些。为这些组构建Kaplan-Meier曲线，以分析出现aGVHD和cGVHD、复发/进展和死亡率的时间差异。进行对数秩检验以比较这些组。Cox-回归分析用于测定两组之间的HR和用于测试其他变量。<0.05的P-值认为是统计上显著的。使用SPSS 17.0(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)软件进行统计程序。

结果：

研究群体：

2001年8月和2011年3月之间，48名NMA-预处理的患者移植9/10匹配非亲缘供体。大部分移植HLA I型错配(76％)。详细的研究组特征列举在表1中。对于这些患者，预测可呈递的源自错配的HLA的肽的数量。观察八个可呈递的肽(范围0-24)的中值。对于HLA I型-可呈递的肽，中值是三(0-12)；对于HLA II型-可呈递的肽中值是四(0-24)。

表1显示研究组特征。2001和2011之间在University Medical CentreUtrecht中具有GVH方向上的单个错配的所有HSCT供体的受体列举在此。受体的总数是48，除非另外指出。

¹急性髓性白血病、急性淋巴白血病、骨髓增生异常综合症、范可尼贫血；

²慢性髓性白血病；

³非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴白血病；

⁴非恶性的疾病：严重再生障碍性贫血。

aGVHD：

在所有受体的15个(31％)中观察II-IV级AGVHD(表1)。与不发展或发展I级aGVHD的那些相比，遭受II-IV级AGVHD的患者显示不显著的可呈递的肽的数量增加(图1A-C)。

为了测定可呈递的肽的数量在出现aGVHD时的作用，构建Kaplan-Meier曲线，以比较预测具有大量可呈递的肽的患者与预测具有少量的那些。具有大量(>2)由HLA I型可呈递的肽的患者与具有少量(≤2)的患者相比，明显更早发展aGVHD(评估平均223天和353天，p＝0.03，图2A)和具有增加的危险(HR3.45，95％-CI 1.08-11.07，p＝0.04)。对于预测具有大量由HLA I型和II组合或单独由HLA II型可呈递的肽的患者，出现aGVHD的时间没有显著不同(图2B,C)。DLI、错配性别和年龄与II-IV级AGVHD无关。

cGVHD：

cGVHD的中值随访时间是186天。十一名患者(23％)发展广泛cGVHD(表1)。与没有或有限cGVHD的那些相比，遭受广泛cGVHD的患者显示由HLAI型和II组合和分别由HLA I型和II可呈递的更大量的肽的趋势(图1D-F)。

在预测HLA I型和II型组合上存在大量肽(>6)的患者中相比少量(≤6)的患者更早发展广泛cGVHD(402天对523天，p＝0·05，图2D)，和第一组显示增加广泛cGVHD危险的趋势(HR 4.18，95％-CI 0.90-19.40，p＝0.07)。对于分别由HLA I型或II型可呈递的肽，没有观察到这些趋势(图2E、F)。其他测试的变量都不与增加的广泛cGVHD危险相关。

复发/进展：

由于有限的患者数量，分析恶性疾病的复发和进展作为组合的临床结果。对44名(98％)遭受恶性肿瘤的患者监测复发/进展，并且这些患者中的17名(39％)发展(表1)。复发/进展组显示更低数量的HLA I型可呈递的肽的趋势(非复发/进展患者的中值是4.5和复发/进展患者是2，p＝0.13，图1H)。没有观察到由HLA I型和II型组合或单独由HLA II型呈递的肽的数量差异(图1G、I)。

对于预测存在大量HLA I型的肽的患者(>4)相比少量(≤4)的患者，HSCT之后的复发/进展发展滞后(1573天对417天，p<0.01，图2H)和具有降低的危险(HR 0.08，95％-CI 0.01-0.61，p＝0.02)。对于预测存在由HLA I型和II组合或单独由HLA II型少量或大量肽的患者不存在该作用(图2G,I)。所有其他测试的变量不与复发/进展的发生显著相关。

生存：

在该研究组中，观察了15名(31％)非幸存者。当与那些幸存者比较时，对于非幸存者，可呈递的肽的数量没有统计上的不同(图1J-L)。当与预测存在少量或大量肽的患者相比时，至死亡的时间没有不同并且其他测试的变量都不与生存率显著相关(图2J-L)。

实施例1的讨论：

为HSCT限定最佳-容许的错配为9/10匹配非亲缘供体改善了临床结果(参考文献1a)。经常基于耗时CTLpf试验的结果选择最佳错配。优选地，根据本发明的方法预测9/10HSCT设置中的同种异体反应性。该方法尤其基于间接识别HLA-差异的概念；当由供体和受体共享的HLA等位基因呈递时，源自HLA-差异的肽是潜在的T细胞靶标。更大量的这些受体特异性可呈递的肽与临床同种异体反应性相关。

对于预测HLA I型上存在大量肽的患者，比预测存在少量的患者可观察到更高发生率和更早发展aGVHD(图2B)。该观察与CTLs在aGVHD的发病机理中通常接受的作用一致(参考文献26a)。而且，其匹配CTLpf试验的预测性可能和缺少混合淋巴细胞培养(MLC)试验的预测性可能；CTLpf试验关注对HLA I型错配的应答，而MLC试验主要测试针对HLA II型错配的应答(参考文献27a)。

与预测存在少量的患者相比，预测HLA I型和II型组合上存在大量肽的患者，显示增加的广泛cGVHD危险的趋势(图2D)。优选地，发展cGVHD涉及通过专职抗原呈递细胞(APCs)呈递HLA起源的肽，产生HLA II型和CD4⁺T细胞之间的相互作用。在动物模型中，宿主和供体APCs已经表明在启动供体CD4⁺T细胞中是重要的，但是精确的临床相关性仍不清楚(参考文献28a)。测试APCs在cGVHD中的作用仍是困难的，因为没有模型完全表示复杂的表型和延迟人cGVHD的出现。

观察可呈递的肽数量对GVT反应性的清晰作用；预测由HLA I型呈递>4个肽的患者复发/进展更晚并且具有降低的发生率(图2H)。该作用可由增加的供体T细胞识别患者肿瘤细胞的可能性解释。因此，根据本发明的方法，优选地不仅能够预测间接识别HLA-差异的病理学作用，而且也预测期望的作用。但是，对于具有增加风险的aGVHD患者观察到复发的减少(预测在HLA I型上存在>2肽)。

HLA-C错配导致不成比例的增加的同种异体反应性的风险(参考文献2a，29a)。因为HLA-C好像在细胞表面上较不稳定(参考文献30a)，直接识别受体特异性HLA-C等位基因不大可能。因此，在HLA-C错配的HSCT之后，间接识别受体特异性HLA-C等位基因可能是最重要的诱发同种异体反应性的途径。HLA-C呈递可能是可能的解释，由于大量源自HLA-C错配的肽。当预测源自HLA错配的可呈递的肽的数量时，显著更大量的源自错配的HLA-C等位基因的肽预测为由HLA I型呈递而不是源自HLA-A或HLA-B(表2)。当比较HLA-C与HLA-DQB1错配时，观察到类似的趋势。综合考虑，这些结果表明HLA-C错配增加的同种异体反应性的风险是由于更大量的源自HLA-C错配的可呈递的肽。

表2显示每个错配的HLA-基因座预测的可呈递的肽的数量。源自HLA-C的可呈递的肽的数量显著大于源自HLA-A或HLA-B的可呈递的肽。对于HLA-DRB1，可能检测不到差异，因为组中仅包括两个HLA-DRB1错配。

#：与可呈递的肽源自HLA-A错配的数量比较

$：与可呈递的肽源自HLA-B错配的数量比较

^：与可呈递的肽源自HLA-C错配的数量比较

*：与可呈递的肽源自HLA-DQB1错配的数量比较

NS＝不显著

NA＝不可用

之前用计算方法评估HLA错配的差异，如抗体的抗原决定部位(HLAMatchmaker)或如被T细胞直接识别的可能性(HistoCheck)的尝试未成功预测错配的HSCT之前的同种异体反应性。的确，在该组中，由HLAMatchmaker预测的抗原决定部位的数量联体和HistoCheck的差异分数也与同种异体反应性不相关。抗原决定部位联体的数量和差异分数与我们预测的肽的数量不相关，与所有的方法评估HLA多态性的差异的事实一致。本发明中HLAMatchmaker、HistoCheck的同种异体反应性的预测性潜能的差异提供了间接识别HLA-差异预测同种异体反应性的可能性，而预测直接识别或抗体形成的可能性则不能。

优选地，本发明关注同质组的NMA-预处理的患者，用于评估可呈递的肽的数量的作用。由于三个原因不评估MA-预处理的患者。第一，如已经广泛显示，MA方案增加同种异体反应性的风险(参考文献1a)。第二，NMA预处理是最经常使用的方案。最后，从而，MA-预处理的患者的数量太少(N＝12)而不能适当分析可呈递的肽作用以及预处理的作用。

如在实施例1中所显示，根据本发明，预测在共享-HLA等位基因上可呈递的受体特异性肽的数量与同种异体反应性(即aGVHD和复发/进展)相关。预测这些可呈递的肽的数量有助于限定接收9/10匹配非亲缘供体的患者的最佳容许的错配。进一步优选的是，该方法有益于可选形式的错配的HSCT，例如在单或双脐带血移植中。优选地，该方法的使用改善了错配的HSCT中的供体选择。

实施例2-预测的间接可识别的HLA抗原决定部位与儿科患者脐带血移植之后的慢性移植物抗宿主病和复发相关的死亡相关

背景和目的：

具有HLA错配的供体的造血干细胞移植(HSCT)是移植物抗宿主病(GVHD)的风险因素。根据本发明，可提前预测用单个HLA错配的成人-非亲缘供体HSCT之后的移植物抗宿主反应性。优选地，匹配的HLA中存在的源自错配的HLA等位基因的肽的数量(预测的间接识别的HLA抗原决定部位；PIRCHES)与发展同种异体反应性相关。因为HLA错配在用脐带血(CB)移植的情况下更好耐受，CB供体通常选择具有大于单个HLA错配。根据本发明，优选地PIRCHES的数量与CB移植之后的同种异体反应性。

材料和方法：

回顾性分析用单个CB供体移植的79名儿科患者的临床结果。优选地，以高分辨率水平进行HLA分型。使用NetChop和NetMHC-Pan为PIRCHES(PIRCHE-I)的HLA I型测定PIRCHES的数量，和PIRCHES(PIRCHE-II)存在的HLA II型的NetMHC-II，如实施例1中描述。

结果：

根据实施例2更大量的PIRCHE-II与增加的发展广泛慢性GVHD的风险相关。更大量的PIRCHE-I优选地与降低的由于复发死亡的风险相关。具有非植入或移植物排斥的患者在宿主抗移植物方向存在显著更大量的PIRCHE-I。PIRCHE-II的数量预测慢性GVHD的发展，而PIRCHE-I的数量预测复发相关死亡的发展。根据本发明，优选地通过选择CB单位改善CB移植结果导致减少广泛慢性GVHD而不损伤移植物抗白血病作用。

实施例3-预测的间接可识别的由HLA-DRB1呈递的HLA抗原决定部位与肾移植之后从新形成供体特异性HLA IgG抗体相关

本发明提供一种方法，其预测源自有来自受体的HLA II型分子呈递的HLA I型分子的T辅助细胞抗原决定部位在形成IgG同种型的供体特异性HLA抗体中的作用。更早已经提示了受体的HLA-DRB1分子在形成这些抗体中的作用。在实施例3中，使用大于800名肾受体的大组。从该组，选择接收他们的第一肾移植的所有非免疫患者，随后排斥和肾切除。分析从新产生供体特异性HLA I型抗体(DSA)并且使数据与预测的受体的HLA II型呈递的间接可识别的HLA抗原决定部位(命名为PIRCHE-IIs)相关。尽管相对少量的受体匹配纳入标准，尤其可能显示免疫原性HLA等位基因，即导致DSA的等位基因，包含比非免疫原性等位基因更多的PIRCHE-II。而且，通过使用随机HLA-DRB1背景，可显示该作用的确限制于呈递HLA等位基因。关于PIRCHE-II和抗原决定部位联体定位的数据，提示这些抗原决定部位的确在产生供体特异性HLA抗体时用作独立于抗原决定部位联体的实体。通过该分析，表明了潜在的技术效果，其能够提供用于在移植之后同种异体免疫测定和/或预测的方法，其产生限定可接受的错配的另外的工具。

实施例3的总结：

背景：HLA I型错配选择性诱导肾移植之后的抗体形成。从新形成供体特异性IgG HLA I型抗体可通过在识别HLA I型抗原中呈递T辅助抗原决定部位取决于患者的HLA II型背景。

方法：通过本发明的实施例3描述针对错配的供体人白细胞抗原(HLA)I型的抗体生产和各自的HLA I型错配中HLA II型限制性预测间接可识别的HLA抗原决定部位(PIRCHE-II)的数量的相关性。为了该目的，分析肾切除之后从一组接收和排斥的肾移植的21名非免疫个体中取的血清。

结果：发现四十九个HLA I型错配，其都包含根据HLA-Matchmaker的免疫原性抗原决定部位联体。检测肾切除之后针对38HLA I型错配的供体特异性HLA抗体应答。发现当与不诱导供体特异性HLA抗体比较时，这些错配包含更大量的PIRCHE-II。大部分PIRCHE-II(大于60％)不是如HLA-Matchmaker定义的抗原决定部位联体的一部分。所以，本发明提供了一种利用下述发现的方法：由受体HLA II型分子呈递源自供体的HLA I型肽在从新形成供体特异性IgG HLA抗体中起显著作用。

受体、材料和方法：

移植受体：

分析在1990和2008之间在University Medical Center Utrecht，Utrecht，netherlands中进行的进行全部组的869个肾移植。从该组，选择去除肾移植物并且没有移植前同种异体免疫事件，即没有妊娠、输血或之前的器官或干细胞移植的受体。排除HLA-A和HLA-B抗原完全匹配的受体对，因为他们对研究目的没有意义。排除一对，因为没有结合算法可用用于受体的HLA II型等位基因。这些选择标准产生21个可分析的受体-供体对。对于所有供体-受体组合，使用基础NIH技术对未分离的外周血单核细胞在存在苏糖醇的情况下在移植之间进行T-细胞交叉匹配试验。所有交叉匹配产生是阴性的。

样品：

在两个时间点获得血清样品。第一，分析用于交叉错配的移植前血清。第二，使用移植切除后三个月获得的移植后血清。后者时间点的原因是在该时间，缺少免疫抑制并且抗体分析不再受任何供体肾的抗体过滤作用的影响。获得的所有受体的血清用于定期组反应性HLA抗体(PRA)筛选的目的。

HLA分型：

对于每个受体，两个独立地收集样品用不同的方法分型；一个样品是血清分型，其使用常规的补体-依赖性细胞毒性(CDC)程序使用商用分型托盘(Biotest，Dreieich，德国)和一个样品以中等分辨率分子分析，用于HLA I型和-II等位基因，其基于PCR-SSO技术结合Luminex使用商用试剂和按照制造商的指导(OneLambda Inc.，Canoga Park，CA，USA)。对于供体分型，仅仅一个样品局部可用，以进行血清分型和分子分型二者，按照对于受体分型相同的程序。在所有情况下，在我们中心的供体分型确认了由供体中心提供的HLA分型。从DNA仍可用的所有受体和供体进行另外的高分辨率分型。基于观察的NMDP多个等位基因编码中报道的HLA频率，来自剩余的5个体的所有分型结果转化成最可能高分辨率分型(参考文献15b)。在一种情况下，该方法导致频率大于10％的多个选择；B44可转化成B*44:02或B*44:03(图3)。尽管这些HLA分子仅仅相差一个氨基酸，对于该对之一，对于两个可能性分析数据并且结果对于该对取平均值。

HLA抗体筛选和表征：

使用Lab筛选单个抗原试剂盒(OneLambda Inc.)根据标准制造商的指南进行测试，以测定针对HLA-A和-B的HLA抗体的存在或缺失。在Luminex 200流式细胞计数器(Luminex Inc.，Austin，TX，USA)上分析珠。MFI>1000的结果的分数为阳性。

识别源自HLA I型的PIRCHE-II：

根据本发明，优选地对于所有错配的HLA I型分子，检查PIRCHE-II的数量，以阐释针对包含抗原决定部位的HLA I型等位基因的潜在的抗体应答。PIRCHE-II在该实施例定义为错配的源自供体的HLA I型分子的受体HLA II型结合抗原决定部位，其不被受体的任何其他HLA I型等位基因覆盖。使用HLA II型结合预测指标NetMHCII预测源自HLA I型的PIRCHE-II(参考文献23a)。该预测指标基于SMM-对齐预测指标(参考文献24a)，以预测潜在的配体如何与HLA II型分子的结合凹槽对齐，并且其随后预测对齐的配体如何预期结合。如果预测的结合亲和力高(IC50<1000nM)(参考文献16b)，与结合凹槽对齐的九个氨基酸定义为HLA II型抗原决定部位。

Matchmaker分析：

基于HLAMatchmaker版本2.1(http://www.HLAMatchmaker.net)(参考文献17b)，HLAMatchmaker抗原决定部位联体属于HLA等位基因。仅仅HLA-A和-B基因座包括在这些分析中。错配的抗原决定部位联体的数量测定为在受体的HLA-A和-B基因座中缺少的供体抗原决定部位联体的数量。

T辅助配体和抗原决定部位联体的定位：

HLA分子中的不同多态残基产生不同类型的错配，即如通过抗原决定部位联体-或PIRCHE-II方法所测定。为了识别参与抗原决定部位联体和/或PIRCHE-II的多态残基，优选地对获得自研究组和一组随机产生的虚拟受体-供体对的数据进行分析。对于后面的组，产生反映白种人中HLA-A/B/C/DR-单体型频率的虚拟群体。这些单体型频率获得自之前的研究(参考文献15b)。为了模拟受体-供体组合错配局部匹配曲线，组合的HLA-A和-B基因座上的三个错配的最大值是可接受的，并且在HLA-DR基因座的一个是可接受的。当达到符合这些要求的10000个虚拟受体-供体组合时，停止产生虚拟个体。随后，使用抗原决定部位联体方法和PIRCHE-II方法如上述评估错配的HLA I型等位基因。基于HLA分子中的抗原决定部位联体和PIRCHE-II的定位构建相关频率图。为了测量PIRCHE方法和抗原决定部位联体方法之间使用位置的重叠，测定由每个方法在MHC-I分子中可用的那些位置使用的每个氨基酸。对于两种方法，使用数量归一化使得它们总和达100％。数量之间的重叠测定为这些归一化的使用数量的重叠。

统计分析：

来自供体的所有错配的等位基因分成检测到DSA的组(免疫原性组)和未表现DSA的组(非免疫原性组)。这两组之间，使用Mann-Whitney U检验(GraphPad Prism 5.03，GraphPad软件，Inc.，La Jolla，CA)比较源自非自我HLAI型PIRCHE-II的数量和/或HLAMatchmaker三联体和抗原决定部位联体的数量。

结果：

特异性综述：

总共22名受体符合纳入标准(图3)。在它们21名的血清中，可检测到供体特异性抗体。可鉴定总共38个免疫原性(18HLA-A和20HLA-B)和11个非免疫原性等位基因HLA等位基因(3HLA-A和8HLA-B)。这些数量均等分布(卡方检验，数据未显示)。

免疫原性等位基因包含更多的PIRCHE-II：

对于根据本发明的所有错配的等位基因，预测尤其可结合受体的HLA-DRB1等位基因的源自非自我HLA I型的PIRCHE的数量。如图4A中所显示，与非免疫原性组相比，免疫原性组包含更多的PIRCHE-II(Mann-WhitneyU检验中p<0.01)。平均值分别是3.0和1.2。当错配的源自供体的HLA等位基因针对搜索的受体DRB1背景分析时，未观察到这些差异(图4B)，指示具体受体的DRB1背景在PIRCHE-II分析中起作用。

免疫原性等位基因具有增加数量的三联体和抗原决定部位联体：

比较免疫原性组和非免疫原性组它们三联体和抗原决定部位联体的数量，如通过HLAMatchmaker所测定。三联体(图5A)和抗原决定部位的数量联体(图5B)的数量在免疫原性组中比在非免疫原性组中都显著更高(Mann-Whitney U检验中，三联体：p<0.005；抗原决定部位联体：p<0.0005)。

抗原决定部位联体不与PIRCHE-II共定位：

基于抗原决定部位联体和PIRCHE-II的共享生物起源，抗原决定部位的数量联体和PIRCHE-II之间的相关性是可预期的。为了解决该问题，抗原决定部位联体的数量针对PIRCHE-II的数量并且进行的相关性分析绘图。对于非免疫原性等位基因(R2＝0.83；斜率的显著性：p<0.0005)和免疫原性等位基因(R2＝0.14；斜率的显著性：p<0.05；图6A)都观察相关性。两组的斜率彼此重叠。随后分析有涉及的氨基酸的位置指示的研究的组中的PIRCHE-II的形态定位。比较这些PIRCHE-II的定位与抗原决定部位联体的定位。PIRCHE-II的多态氨基酸高度过度出现在HLA蛋白的β-片层和α-3结构域中(图6B)，而抗原决定部位联体定位在HLA蛋白的表面上抗体可触及的残基上。通过对10000个虚拟移植对的模拟实验确认了这些数据(图6C)，显示大量的源自HLA I型的多态氨基酸(62％)可鉴定为PIRCHE-II，而不是由DSA识别的抗原决定部位联体的一部分。

实施例3的讨论：

效应器的HLA-DR表型可对HLA抗原的免疫原性起决定性作用(参考文献7b，8b，18b)。Bw4特异性抗体的产生与效应器中HLA-DR1或HLA-DR3表型的出现强烈相关。在体外，Bw4-derived肽强烈结合表达DRB1*01和DRB1*03的细胞，而相应的Bw6肽不结合。类似地，HLA-DRB1*15:01显示在HLA-A2错配的移植对中丰富产生HLA-A2抗体(参考文献24a)。基于该概念，已经提出在效应器HLA-DR表型的背景下考虑供体的HLA I型错配，以便改善肾移植的结果。迄今为止，该概念仅仅被评估而不考虑受体的HLA I型背景。而且，考虑大量的HLA等位基因，在该方法中可能需要大量的移植组，以定义有风险的所有组合。

根据本发明，优选地采用计算方法，用于HLA结合减去自身HLA，以阐释供体特异性HLA抗体对严格的选择组；仅仅包括没有移植前免疫事件并且其肾移植物在HLA抗体的分析之前被去除的那些受体。尽管该选择导致更小的研究群体，分析可局限于单个免疫事件，即肾移植。而且，该选择排除了残留的供体器官的吸收作用的影响，其可阻碍血清中供体特异性HLA抗体的正确探测(参考文献19b)。利用本发明，表明免疫原性源自供体的HLA I型等位基因，其限定为针对其可检测到DSA的等位基因，包含可由来自受体的HLAII型分子、PIRCHE-II呈递的更多的抗原决定部位。明显地，供体的和受体的HLA I型等位基因的相似性水平影响PIRCHE-II的数量；相似性越低，发现非自我抗原决定部位的几率越高。受体的HLA-DR而不是相似性水平阐释该观察。所以例如利用使用随机HLA-DR背景对PIRCHE-II的数量计数得到了确认。在这些分析中，免疫原性和非免疫原性等位基因在随机HLA-DR背景下显示类似数量的肽(图4B)。因此，受体的实际HLA-DR背景必须被考虑以阐释某些错配为什么是或不是免疫原性的。受体特异性HLA-DR背景对于预测移植之后发展DSA的几率是关键的并且观察的差异是由于抗原呈递的差异而不是由于错配之间的相似性。HLAMatchmaker作用和PIRCHE-II作用是两个独立参数，二者都支持DSA的发展。

两个因素改善了我们分析的结果；HLA II型结合预测的质量和受体和供体的HLA分型的分辨率。在NetMHCII中，对于包含11个不同HLA-DRB1等位基因的9个HLA-DR抗原，良好限定了HLA结合基序。因此，对于许多HLA-DRB1等位基因，还未测定肽结合特征。给定HLA-DRB1等位基因中高水平的多样性，经肽-筛选结合试验，每个个体HLA II型结合基序的表征不可行。所以，经计算方法已经开发了一种可选的算法NetMHCIIpan(参考文献20b)。

NetMHCIIpan可基于一级氨基酸序列限定结合基序，为已经报道有限实验结合数据的等位基因提供信息(参考文献20b)。对于数据集，NetMHCIIpan仅仅提供对HLA-DRB1*13:01等位基因更好预测。这样，用NetMHCIIpan分析不增强模型的性能(数据未显示)。在本回顾性研究中，低分辨率分型数据不能外推至3个供体和2个受体的高分辨率HLA分型。在这些情况下，来自所有可能选择的结果被区平均值(在供体分型的情况下)或都去掉(在受体分型的情况下)。该方法例如导致不正确的赋值并且随后导致低估T辅助配体对诱导特异性抗体的作用。因此，例如PIRCHE-II对产生抗HLA IgG抗体的作用比报道的更强。

在本发明中描述的PIRCHE-II和如HLAMatchmaker测定的抗原决定部位联体二者都基于相同的现象；受体和供体的HLA等位基因中错配的氨基酸。这样，这些两个参数不能完全割裂。但是，尽管免疫原性等位基因显示比非免疫原性等位基因更大量的抗原决定部位联体/三联体，分析的各种方面指示PIRCHE-II至少部分独立地于抗原决定部位的数量联体/三联体起作用。

第一，显示实际的HLA-DRB1背景是关键的；当使用搜索的HLA-DRB1背景时，未发现与免疫原性的相关性(图4B)。第二，尽管当分析非免疫原性组时，在PIRCHE-II的数量和抗原决定部位的数量联体之间有强的相关性，但是该相关性在免疫原性组中更弱(图6A)。第三，包含在潜在的T辅助配体中的氨基酸的物理定位与涉及的氨基酸的抗原决定部位联体的定位不同分布(图6B-C)；对于PIRCHE-II，α-3结构域和α-1结构域的氮末端部分好像是富集的，而它们很少产生抗原决定部位联体。综合考虑，当预测DSA发展的几率时，这两个参数彼此互补。在产生移植后DSA中间接识别受体HLA II型呈递的供体HLA I型在回顾性研究中产生更好预测性值。两个参数对于发展移植后DSA的更好可预测性彼此互补的事实与对IgG抗体形成的免疫生物学概念一致。抗体抗原决定部位(抗原决定部位联体)和源自多态I型的T辅助抗原决定部位的分别物理定位的发现可对于我们理解'连锁识别'是重要的。

所以，本发明提供了新的预测性方法，用于在肾移植的背景下预测临床上相关的同种异体抗原。

根据本发明的方法提供了从新发展供体特异性HLA IgG抗体与供体的错配的HLA I型等位基因中源自HLA I型的PIRCHE-II的数量和与HLAMatchmaker抗原决定部位联体的数量相关的发现的技术使用。例如，形态分析和HLA-DRB1背景的搜索显示这两个现象部分源于两个独立的实体。所以，源自供体的HLA I型肽由受体HLA II型分子的呈递是供体特异性HLA抗体的IgM-to-IgG同种型切换的重要的机制。本发明优选地产生器官移植中可接受的HLA错配和该机制对移植物生存的作用的更好定义。

实施例4-确认和阐释HLA-DPB1非容许错配对10/10HLA匹配非亲缘供体干细胞移植的作用：单中心研究

利用HLA-DPB1错配的供体的造血干细胞移植导致增加的急性移植物抗宿主病(aGVHD)的风险。研究已经表明用于基于T-细胞-抗原决定部位(TCE)组对HLA-DPB1错配分类的潜在的预后值。

为了测定HLA-DPB1错配的非容许性的是否可由间接识别HLA起源的抗原决定部位阐释，如本文所描述测定每个移植对的预测间接可识别的HLA-抗原决定部位(PIRCHES)的数量。通过TCE算法，与容许的错配相比，分类为GVH非容许的错配与更大量的HLA II型呈递的PIRCHES(PIRCHE-II)更大量的HLA II型(p＝0.026)，并且对于PIRCHE-I用GVH和HVG非容许错配二者，有类似的趋势(分别p＝0.087和p＝0.061)。此外，与具有I级或没有aGVHD的患者相比，具有II-IV级AGVHD的患者具有更大量的PIRCHE-I的趋势(p＝0.050)。

所以本发明为某些HLA-DPB1组合的非容许性提供了可选的阐释，因为更大量的PIRCHES与非容许错配相关。数据总结在表3中。

表3

实施例5-鉴定容许的HLA错配：预测间接可识别的HLA抗原决定部位

实施例5的总结：

背景：在HLA错配的造血干细胞移植(HSCT)之后的同种异体反应性对临床结果具有主要的不利作用。该影响反应在与HLA匹配移植(对于HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1的匹配)相比，部分匹配的非亲缘供体(MUD)中显著更差的总体生存率(OS)(参考文献1a)。HLA匹配供体并不是对所有患者可用；在20-40％的病例中，单HLA错配的供体(9/10匹配)是潜在可选的(参考文献3a)。在这些情况下，限定最佳容许的错配可以是有益的临床结果。先前，基于流行病学已经鉴定了某些具体非容许的错配，与增加的发展严重急性GvHD风险相关(参考文献4a)。但是，先前描述的方法显示有限的成功。本实施例表明了源自受体错配的HLA分子的肽的数量和HSCT结果之间的关系，所述肽可由供体-受体共享HLA呈递，其命名为预测间接可识别的HLA-抗原决定部位(PIRCHES)。

方法：我们分析经电脑预测源自受体的错配的HLA分子的肽的数量是否与HSCT结果相关，所述肽可由供体-受体共享HLA呈递，其命名为预测间接可识别的HLA-抗原决定部位(PIRCHES)。我们使用HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1分型，为909名受体预测单HLA错配的非亲缘供体(9/10)呈递在HLAI型(PIRCHE-I)和-II(PIRCHE-II)上的PIRCHES。为了测试PIRCHES是否可足够作为供体选择工具，将患者根据它们的PIRCHE分数分成等大小的三分位(低、中和高)。评估这些组的临床结果并且与用HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1匹配供体移植的患者的参考组(10/10，n＝1847)比较。

结果：呈递低PIRCHE-I和-II的患者具有与HLA匹配移植相当的总体生存率(HR 0.98，CI 0.81-1.19，p＝0.812)，而呈递中或高PIRCHE-I和-II的患者当与HLA匹配移植比较时，显示更高风险评估(HR 1.23，CI 1.06-1.42，p＝0.007)。对于无疾病生存率(HR 1.15，CI 1.00-1.32，p＝0.044)，移植相关的死亡率(HR 1.36，CI 1.10-1.69，p＝0.005)，急性(HR 1.64，CI 1.35-2.00，p<0.001)和慢性移植物抗宿主病(HR 1.43，CI 1.10-1.86，p＝0.008)有类似的观察。在用HLA错配的非亲缘供体的成年人移植中，PIRCHES与总体生存率相关。基于PIRCHES的供体选择可为HLA错配的HSCT提供生存预后，与HLA匹配HSCT的类似。

方法：

研究群体：

总共2756名为恶性的疾病用MUD在29个德国移植中心移植的患者包括在该分析中(表4)。这些中，n＝909(33.0％)用单HLA错配的供体(9/10)移植。这些患者形成研究组。剩余的n＝1847(67.0％)用HLA-相同的非亲缘供体(10/10)移植并且用作对照组。排除大于一个HLA错配的患者。根据EBMT指南收集数据。22名患者年龄中值是52岁(范围18-76)。清髓性预处理(MAC)用于n＝1696(61.5％)，和减少强度的预处理(RIC)用于n＝1060(38.5％)的患者。23个移植物来源是骨髓(n＝269，9.8％)和外周血干细胞(PBSC，n＝2487，90.2％)。所有移植物是充满T-细胞。

HLA分型：

在所有受体和供体中进行高分辨率(4位)HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1分型。对于HLA I型等位基因测定外显子2和3和对于HLA II型等位基因测定外显子2。根据NMDP(国家髓供体程序)要求排除临床上相关的零等位基因歧义(不是表达等位基因)(参考文献24c)。等位基因和抗原错配二者都归类为HLA错配，而不考虑错配的载体(参考文献25c，26c)。对于PIRCHES的测定，优选HLA I型的外显子1-7的完整序列和HLA II型的外显子1-6的完整序列。对于我们组的大部分HLA等位基因，这些完整序列是可用的(参考文献15c)。基于最近邻原理评估不完全的可用的序列。

识别PIRCHES：

为每个供体-受体对鉴定PIRCHES。

在两个步骤中鉴定PIRCHE-I。第一，使用NetChop C-term 3.0.16，为所有供体和受体HLA分子预测蛋白酶体介导的切割和经TAP通道的运输(参考文献19a)。随后，使用NetMHCpan 2.4，测试加工概率>0.5的肽它们与供体和受体之间共享的HLA-A、-B和-C分子的结合能力(参考文献21a，20a)。仅仅IC50-结合值≤500nM的九聚体肽可接受为相关的结合子。该IC50值是对于HLA I型-结合肽通常可接受的截取值(参考文献22a)。

对于PIRCHE-II，用NetMHCIIPan 2.0(参考文献23a，24a)考虑≤1000nM的IC50-结合值是相关的(参考文献25a)，预测潜在的15-meric HLA-DRB1结合子的九聚体结合核心。基于胸腺培养，每个呈递共享-HLA分子，预测的源自供体-HLA分子的结合子视为自供体肽并且因此从受体特异性PIRCHE集合中排除。对于每个供体-受体对，分别计数PIRCHE-I和-II的总数。

实施例5的术语：

OS定义为无论疾病状态在任何时间点的生存概率。审查在上次随访时活着的患者。无疾病生存率(DFS)定义为在任何随访时间点是活着的并且没有疾病的概率。审查在他们上次随访时活着的患者。移植相关的死亡率(TRM)定义为没有之前疾病复发的死亡率。复发视为抵触事件。急性GvHD的分级根据国际共识定义和慢性GvHD根据西雅图标准定义(参考文献31c，32c)。复发率(RI)定义为在任何给定时间点的复发的概率，由于任何其他原因的死亡视为抵触事件。

统计分析：

使用Kaplan-Meier分析和对数秩检验进行PIRCHES对OS和DFS作用的单变量分析。使用扩展的Cox回归模型进行多变量分析，其允许模拟时间依赖性作用。使用竞争性风险分析来分析RI、TRM和慢性GvHD。已经对具有完整数据和随访至少100天的患者的子集进行GvHD的分析。逻辑回归用于分析急性GvHD。分层用于考虑诊断的异质性。使用γ-弱点术语调整中心作用(参考文献33c)。统计模型评估下述临床预测指标：患者年龄、疾病阶段、至移植的时间、供体-受体性别组合、供体-受体KIR配体状态、患者和供体CMV状态、移植的年数、预处理方案强度、供体起源(国内对国际)、干细胞来源(骨髓对PBSC)和用抗胸腺细胞球蛋白的治疗(ATG)(参考文献23c)。n＝727(26.4％)和n＝537(19.5％)的病例分别缺少CMV状态和用ATG值治疗。通过包括确实的病例作为分开的组以及通过省略具有缺失值的病例交叉验证模型(参考文献34c)。在交叉验证期间，未发现偏差。单错配移植的PIRCHE值分成等尺寸的三分位并且结果与各自的组相关以及与10/10匹配移植的对照组相关。所有的模型检查成比例的危险假设并且没有发现例外。统计显著性设置为p＝0.05。所有的统计程序用R，版本3.0.1进行。

结果：

患者和供体特征：

用9/10非亲缘供体移植的909名患者和1847名用HLA-相同的供体的对照移植的特征列举在表4中。接收单HLA错配的供体的患者一般以相比10/10移植更有利的因素移植；9/10组中的患者更年轻，接收更频繁的RIC方案，更少的PBSC和更少的性别错配的移植物(男性供体对女性受体)。但是，9/10比10/10匹配HSCT更最近进行(表4)。

表4：9/10和10/10组的患者特征。9/10组中的患者一般以更有利的特征移植：他们更年轻、已经接收更频繁的RIC方案、更少的PBSC和更少的性别错配的移植物(男性供体对女性受体).

AML＝急性髓系白血病，ALL＝急性淋巴细胞白血病，AL＝未分类的急性白血病，CML＝慢性髓性白血病，CLL＝慢性淋巴细胞白血病，MDS＝骨髓增生异常综合征，NHL＝非霍奇金淋巴瘤，MM＝多发性骨髓瘤，BM＝骨髓，PBSC＝外周血干细胞。

用HLA错配的供体移植的患者呈现0-31PIRCHE-I和0-79PIRCHE-II。为了分析PIRCHES的作用，根据观察的三分位，患者分成三个相同的组：呈递低、中间(中)或高PIRCHES，如表5中列举。分类成这三个PIRCHE组与整个研究的临床结果相关。

表5：PIRCHES分数的分布，为了分析PIRCHES的作用，根据观察的三分位，患者分成三个相同的组：呈递低、中间(中)或高PIRCHES

低、中、高：根据PIRCHES分数的相同大小的三分位分组，n＝患者的数量，％＝HLA错配的组中的百分数

PIRCHES对生存的作用：

为了分析PIRCHES对临床结果的作用，我们首先测试PIRCHE三分位的OS和DFS比例的差异。当与更高(中和高组)PIRCHES比较时，低PIRCHES显著与改善的OS和DFS相关(图7；见下表7)。为了分析PIRCHES就HLA匹配情况的作用，我们接下来用10/10组比较PIRCHES三分位。呈递低PIRCHE-I或-II的患者具有与用10/10MUD移植的患者类似的OS和DFS比例。但是，当与10/10匹配比较时，中和高PIRCHE-I和-II具有显著降低的OS和DFS比例(图7AB，表6)。

表6A和6B：与10/10HSCT相比，对于PIRCHES组OS、DFS和TRM的单变量分析。与10/10比较，低PIRCHE-I和-II组中的患者具有类似的OS、DFS和TRM比例。与10/10比较，中和高PIRCHE-I和-II组中的患者具有显著降低的OS和DFS和显著增加的TRM。

表6A：根据PIRCHE分数的存活率

OS＝总体生存率，括弧中置信区间，对数秩p-值比较PIRCHES组和10/10匹配参考组，显著的结果为黑体。

表6B：根据PIRCHE分数的存活率

DFS＝无疾病生存率，TRM＝移植相关的死亡率，括弧中的置信区间，对数秩p-值比较PIRCHES组针对10/10匹配参考组，显著的结果为黑体。

在多变量分析中，当与低PIRCHE-I比较时，具有中或高PIRCHE-I的患者具有显著增加的OS和DFS危险(OS：HR 1.21，CI 1.00-1.46，p＝0.049，DFS：HR 1.22，CI 1.03-1.45，p＝0.024)。当比较PIRCHE-II组时，未观察到此点。当比较10/10匹配移植时，呈递低PIRCHE-I和-II的患者具有类似的OS和DFS比例。但是，对中、高PIRCHE-I以及中PIRCHE-II组的患者观察到显著更高总体死亡率(图8AB)。当与10/10比较时，中和高PIRCHES也与更高的DFS风险相关，但是仅仅在中PIRCHE-I组中，达到统计显著性。

在TRM的单变量分析中，与低PIRCHE-I和-II相比，PIRCHE-I和-II越高，具有显著更高的TRM发生率(见表6B)。当与完全匹配移植相比时，低PIRCHE-I和-II组具有类似的TRM发生率，而与完全匹配移植相比，中和高PIRCHE-I和PIRCHE-II组具有统计学上显著的更高的TRM发生率(图9，表6)。低和更高PIRCHE-I之间的多变量比较显示对于更高PIRCHE-I值增加TRM风险的趋势(HR 1.26，CI 0.96-1.65，p＝0.090)。当比较低PIRCHE-II与更高值时，获得类似的发现(HR 1.28，CI 0.97-1.70，p＝0.082)。当PIRCHE组与10/10情况比较时，中和高值PIRCHE-I和-II与更高的TRM风险相关(图8C)。

表7：PIRCHES I和II相互作用模型

PIRCHES对移植物抗宿主病的作用：

对随访至少100天的患者的子集进行急性和慢性GvHD的分析(n＝2054，74.5％)。在HLA错配的组中，与低PIRCHE-I或-II值相比，更高PIRCHE-I和-II值与统计学上显著的增加急性GvHD概率相关(分别对于PIRCHE-I和-II：OR 1.68，CI 1.27-2.21，p＝0.001，OR 1.33，CI 1.01-1.75，p＝0.045)。此外，与低PIRCHE-I相比，更高PIRCHE-I显示增加发展慢性GvHD的风险(HR 1.47，1.06-2.06，p＝0.022)，而对于PIRCHE-II值未发现该作用(HR 1.18，0.84-1.66，p＝0.344)。

低PIRCHE-I和-II组中的患者具有与10/10匹配移植类似的急性和慢性GvHD比例，而高PIRCHE-I和-II组显示显著增加的急性和慢性GvHD风险(图8DE)。

对于最佳供体选择的PIRCHE-I和-II值：

基于PIRCHES的供体选择可导致以低PIRCHE-I和高PIRCHE-II的选择或反之亦然。为了分析PIRCHE组不同组合的作用，形成相互作用模型并且与OS相关。为了减少子组的数量，中和高三分位PIRCHES组合在更高组中。具有低PIRCHE-I和PIRCHE-II值的患者显示最低的风险评估，与10/10匹配移植类似(n＝288，HR 0.98，CI 0.81-1.19，p＝0.817)。涉及中和高PIRCHES值的大部分组合显示些许更高的风险评估，尤其与更高PIRCHE-I的组合，因为更高的PIRCHE-I与低PIRCHE-II也明显与增加的总体死亡率的风险相关(HR1.73，CI 1.14-2.62，p＝0.010，图8A，图10)。

实施例5的讨论：

在一个大组中，我们表明了更大量的间接可识别的HLA抗原决定部位，PIRCHES，与有害HSCT结果相关。更重要地，我们表明具有少量的PIRCHES的HSCT产生与完全HLA匹配HSCT后观察到的类似临床结果(图8)。

低PIRCHE-I和-II与10/10匹配的HSCT类似的总体死亡率、DFS、TRM、急性和慢性GvHD风险相关。PIRCHE-I和-II与复发不相关(图11)。所以，通过选择具有与当患者被HLA-相同的非亲缘供体移植时类似的预测的先验供体，PIRCHES可利于选择涉及HLA错配的供体的程序。尤其低PIRCHE-I组中的供体-受体组合是有利的：与更高PIRCHE-I组中的患者相比，这些组合具有显著增加的OS和DFS的概率，并且显示降低的急性和慢性GvHD的风险。该PIRCHE-I的相关重要性也通过相互作用分析的结果反映：当与低的或更高的PIRCHE-II组合时，在更高PIRCHE-I组中的患者看起来具有降低的OS比。

为了评估PIRCHES相对于10/10匹配HSCT的作用，PIRCHE组与HLA匹配移植的对照组比较。该对照组在基线特征上不匹配，而是来自非亲缘-供体移植的总体组的完全选择。所以，基线特征在9/10和10/10HSCT之间不同(表4)。分析所有这些基线因素与临床结果的相关性，当与结果相关联时添加至多变量模型。还进行与PIRCHE组中的基线特征相比较的类似的策略(表8A，8B)。

表8 PIRCHE-I和PIRCHE-II组中的患者特征。

表8A：PIRCHE-I组中的患者特征

AML＝急性髓系白血病，ALL＝急性淋巴细胞白血病，AL＝未分类的急性白血病，CML＝慢性髓性白血病，CLL＝慢性淋巴细胞白血病，MDS＝骨髓增生异常综合征，NHL＝非霍奇金-淋巴瘤，MM＝多发性骨髓瘤，BM＝骨髓，PBSC＝外周血干细胞。

表8B：PIRCHE-II组中的患者特征

AML＝急性髓系白血病，ALL＝急性淋巴细胞白血病，AL＝未分类的急性白血病，CML＝慢性髓性白血病，CLL＝慢性淋巴细胞白血病，MDS＝骨髓增生异常综合征，NHL＝非霍奇金-淋巴瘤，MM＝多发性骨髓瘤，BM＝骨髓，PBSC＝外周血干细胞。

匹配HSCT的结果的HLA-DQB1的相关性先前被认为是有争议的(参考25c)。HLADQB1错配被包括在该实施例中，由于他们与该组之前的分析中增加的死亡率相关联(参考23c)。有趣地，当与其他基因座比较时，HLA-DQB1抗原错配，导致最高数量的PIRCHE-I和-II均在该组中(数据未显示)。这显示HLA-DQB1在该组错配的原因与不良事件相关联。

整个序列的可用性优选的最精确地评估由于间接识别同种异体反应性的风险。如在方法章节提到，在该实施例中，不完全的序列基于等位基因之间的类似性被补充。当这些序列被完全阐明时，PIRCHES潜在的预测性可被改善。因此，当描述新的HLA等位基因时，我们的研究强调全部HLA I型等位基因的外显子1-7和全部HLA II型等位基因的外显子1-6的完全测序的存在。

因为HLA错配的HSCT与不良事件的增加的风险高度相关，对于仅仅HLA错配的供体是可用的患者，尤其是对于具有非恶性的疾病的患者，经常不进行HSCT。对于这些患者，可选的干细胞来源可以是单个或双脐带血(CB)单位，因为CB移植HLA匹配标准是较不严格的(参考36c)。但是，对于具有非恶性疾病的患者，CB的持续植入可以是有问题的，报告的移植物-衰竭率高至90％(参考37c)。所以该实施例的结果提示选择具有低数量的PIRCHES的HLA错配的非亲缘成人供体导致并发症的减少。所以，具有非恶性骨髓疾病的患者可潜在地用HLA错配的供体移植，对于HLA匹配的供体具有类似的预测。

总之，实施例5表明PIRCHES与临床同种异体反应性相关。尤其，呈现低PIRCHE-I的患者与用HLA匹配的供体移植的患者具有类似的临床结果。因此我们的数据提示错配的HLA被T细胞的间接识别是在HLA错配HSCT之后临床同种异体反应性中的重要机制。通过避免可识别更大量的PIRCHES的供体，在HSCT之前测定潜在的供体的PIRCHES的数量可允许降低在HLA错配HSCT后的并发症。呈现的结果指示选择具有少量PIRCHES的HLA错配的供体可导致类似于完全HLA匹配供体的5年生存概率。

实施例6-用于筛选具有容许的错配的适当的供体材料的方法；HSCT移植

实施下述步骤以便筛选和选择用于HSCT的适当的供体材料：

1.执行用于受体的高分辨率分型，至少为HLA-A、-B、-C、DRB1和-DQB1。

2.执行用于优选地多个供体的高分辨率分型，至少为HLA-A、-B、-C、DRB1和-DQB1，或理论上测定潜在的9/10匹配非亲缘供体的预期的高分辨率分型。

3.使获得的HLA分型数据进入计算机程序，其被设计为实施本发明的方法。

4.该程序将随后，优选地自动地，计算PIRCHE的总数—PIRCHE-I的数量和PIRCHE-II的数量(见以下来自DNA分型和PIRCHE的随后测定的输出数据的实施例)。

5.采用给出的输出，基于图8中展示的数据可获得各种结果的风险评估，并且选择可基于最低的风险，如本文公开的方法和相应的软件所评估的。

从本文公开的实施例可见，所描述的方法能够实现有效的用于评估免疫反应的可能性的方法，优选地自动和/或计算机实施该方法，优选地在移植之前。该方法从而能够实现选择错配的供体材料的方法，所述方法将有效显示同种异体反应性的相同风险为完全匹配供体。

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Claims (39)

1.用于预测在移植之后对人白细胞抗原(HLA)的免疫应答的方法，其中，所述免疫应答与供体和受体之间的HLA错配相关，所述方法包括：

-使供体和/或供体材料与受体HLA分型以测定HLA错配；以及

-测定预测的间接识别的HLA抗原决定部位(PIRCHES)的数量，其中所述PIRCHES是来自错配的受体-HLA等位基因的受体特异性或供体特异性的HLA起源的肽并且预测为由共享(匹配)的HLA分子呈递，

其中，PIRCHES的数量与所述免疫应答的可能性相关。

2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答的可能性随着PIRCHES的数量增加而增加。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，来自错配的受体-HLA等位基因的所述受体特异性或供体特异性的HLA起源的肽通过用于鉴定人蛋白酶体的所述肽中的切割位点的计算机实施的方法来鉴定。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过共享(匹配)的HLA分子呈递肽的所述呈递通过用于预测所述肽与任何给定的HLA分子结合的计算机实施的方法来测定。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述移植包括独立于其起源的干细胞的移植。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述移植包括造血干细胞移植(HSCT)。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述移植包括脐带血或脐带血细胞移植。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述移植包括肾移植。

9.用于选择异源移植用细胞或组织制品或器官的方法，包括根据前述权利要求中任一项所述的方法。

10.用于选择和/或筛选具有可接受的错配的异源移植用供体材料的方法，包括根据前述权利要求中任一项所述的方法。

11.用于预测移植的治疗结果的方法，包括根据前述权利要求中任一项所述的方法。

12.用于预测移植的治疗结果的方法，包括根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗结果选自由患者存活率、无疾病存活率和移植相关的死亡率所组成的组。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答包括T-细胞介导的应答。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答包括抗体介导的应答。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答包括不想要的同种异体反应性。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答包括需要的同种异体反应性，由此需要的同种异体反应性可以是抗白血病的同种异体反应性。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答导致急性移植物抗宿主病(aGVHD)或慢性移植物抗宿主病(cGVHD)。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答导致肾移植之后从新生长供体特异性的HLA IgG抗体。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述PIRCHES的长度在5至20个氨基酸之间，优选其长度是8至15个氨基酸。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述PIRCHES是九聚体(9个氨基酸的长度)肽。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述PIRCHES由共享的HLA I型(PIRCHE I)或由共享的HLA II型(PIRCHE II)呈递。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，PIRCHE-I肽的预测的IC50结合值≤10μM，优选地≤1000nM，更优选地≤500nM。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，PIRCHE-II肽的预测的IC50结合值≤20μM，优选地≤5μM，更优选地≤1000nM。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在HLA亚型HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPB1、-DQA1、-DPA1、-G、-E、-F、MICA、MICB和/或KIR上进行HLA分型。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1上进行HLA分型。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，HLA分型包括血清分型和/或分子分型。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，利用基于序列的分型以高分辨率水平进行HLA分型。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，HLA分型包括对HLAI型等位基因的外显子1-7和HLA II型等位基因的外显子1-6进行测序。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，HLA分型包括对HLAI型等位基因的外显子2和3以及HLA II型等位基因的外显子2进行高分辨率HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1分型。

30.用于选择和/或筛选具有可接受的错配的异源移植用供体材料的方法，包括根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在移植之前进行。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，异源移植用供体材料起源于具有至少一个等位基因匹配的供体。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，异源移植用供体材料起源于具有10/10匹配和HLA-DP错配的供体。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，异源移植用供体材料起源于9/10匹配的非亲缘供体。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，当PIRCHE-I的数量≤3，优选地≤2，更优选地≤1时，异源移植用供体材料与低风险的不想要的免疫应答相关。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，当PIRCHE-II的数量≤4，优选地≤3，更优选地≤2时，异源移植用供体材料与低风险的不想要的免疫应答相关。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，当组合的PIRCHE-I和PIRCHE-II的数量≤6，优选地≤4，更优选地≤2时，异源移植用供体材料与低风险的不想要的免疫应答相关。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，询问HLA-DQB1抗原错配。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，用于预测多个HLA错配的供体中的最佳供体。

39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：为了预测多个供体之间，例如两个脐带血单位之间和/或匹配的供体与HLA错配的供体之间的同种异体反应性的目的，分析和比较多个HLA错配的供体。