CN112322737B - 肾癌早期筛查基因v21-j26检测方法 - Google Patents

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Abstract

肾癌早期筛查基因V21‑J26检测方法，属于医药生物技术领域。检测方法：1)肾脏组织，提取肾组织总RNA；2)对样本的肾组织总RNA进行逆转录，得到样本肾组织的cDNA；3)以肾组织的cDNA为模板，实时荧光定量PCR扩增。V21‑J26基因可在制备检测肾透明细胞癌试剂盒中的应用，所述试剂盒包括V21‑J26基因测序引物；V21‑J26基因可在作为检测肾透明细胞癌标记物中应用。采用实时荧光定量PCR的方法，针对TRA链V21和J26设计特异性引物，扩增特异性的基因序列，从而明确V21‑J26基因表达情况，操作简单，重复性好，可广泛用于科研、临床研究。

Description

肾癌早期筛查基因V21-J26检测方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，尤其是涉及肾癌早期筛查基因V21-J26检测方法。
背景技术
T淋巴细胞主要参与肿瘤的免疫杀伤功能，其细胞膜表面受体(T cell receptor，TCR)能够特异性识别肿瘤细胞表面特异性抗原，从而介导肿瘤细胞杀伤(Nikolich-ZugichJ,Slifka MK,Messaoudi I:The many important facets of T-cell repertoirediversity.Nature reviews Immunology 2004,4(2):123-132)。TCR主要是由TRA、TRB或者TRG、TRD两条短多肽链构成的异二聚体。在基因结构上，将TCR分为V(Variable)、D(Diversity)、J(Joining)、C(Constant)四个区域，其中TRA链和TRG链由V和J区域组成，而TRB链和TRD链是由V、D、J区域构成。T细胞在发育成熟过程中，不同亚型的V、(D)、J在基因水平上随机组合和重排，并且伴随单个核苷酸可随机插入或缺失，从而导致TCR种类具有高度的多样性(据估计TCR种类数量高达1015-1018)(Mikszta JA,McHeyzer-Williams LJ,McHeyzer-Williams MG:Antigen-driven selection of TCR In vivo:related TCRalpha-chains pair with diverse TCR beta-chains.Journal of immunology 1999,163(11):5978-5988)。
发明内容
本发明的目的在于提供肾癌早期筛查基因V21-J26检测方法。
肾癌早期筛查基因V21-J26检测方法，包括以下步骤：
1)肾脏组织，提取肾组织总RNA；
2)对样本的肾组织总RNA进行逆转录，得到样本肾组织的cDNA；
3)以肾组织的cDNA为模板，实时荧光定量PCR扩增。
在步骤3)中，所述PCR扩增的条件为95℃/15min+(94℃/30s+57℃/30s+72℃/30s)×40次+72℃/10min。
V21-J26基因可在制备检测肾透明细胞癌试剂盒中的应用，所述试剂盒包括V21-J26基因测序引物；所述V21-J26基因的测序引物包括扩增V21-J26基因的PCR引物；
正向引物1：5’-GCCTCGCTGGATAAATCATCAGGA-3’；
反向引物1：5’-GGTTCCGGGACCAAAGACAA-3’。
V21-J26基因可在作为检测肾透明细胞癌标记物中应用。
本发明人在对人肾透明细胞癌的研究中发现，TRAV21-TRAJ26(V21-J26)在患者肾透明细胞癌组织中表达明显增高，而正常人的表达量很低，基于此，可将人体外周血中的V21-J26基因作为检测肾透明细胞癌的标记物。
所述基因V21-J26可用于制备定量检测样本中基因表达情况的试剂在肾癌早期筛查检测产品中应用。所述样本为肾组织或外周血。
本发明的有益效果是：本发明采用实时荧光定量PCR的方法，针对TRA链V21和J26设计特异性引物，扩增特异性的基因序列，从而明确V21-J26基因表达情况，该方法操作简单，重复性好，实现快速、低成本早期诊断肾透明细胞癌的目的，可广泛用于科研、临床研究。
附图说明
图1是正常肾组织样本与肾透明细胞癌组织样本荧光定量PCR结果对比图。
图2是正常肾组织样本与肾透明细胞癌组织样本的荧光定量PCR电泳图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明进行详细说明。
PCR引物：
正向引物1：5’-GCCTCGCTGGATAAATCATCAGGA-3’；
反向引物1：5’-GGTTCCGGGACCAAAGACAA-3’；
(一)样本收集与提取：
选取确诊为肾透明细胞癌患者的外周血32例，正常肾组织对照组为健康人群外周血25例，进行外周血单核细胞总RNA提取，具体步骤为：
(1)在征得同意后取人外周血3～5mL置于含有500μL Trizol的无RNAase匀浆管中，肾脏组织匀浆机搅碎组织后，补加500μL Trizol，室温静置3～5min。
(2)用索莱宝单核细胞。如：采用Ficoll 400(北京索莱宝科技有限公司，CodeNo.P8610-200)试剂密度梯度离心的方法分离肾癌患者和健康人的外周血单核细胞。
(3)吸出离心上层液体到新离心管，加入500μL异丙醇，常温静置10min，离心：4℃，12000g，10min。
(4)吸出上清液到新的离心管，加入75％乙醇1mL，离心：4℃7500g,5min。
(5)吸出上清液，加入100～200μL DEPC水，置于55℃恒温箱溶解，5min后取出，-80℃保存。
(6)取2μL RNA用TE缓冲液稀释35倍，振荡混匀。用紫外分光光度检测仪检测RNA的浓度和纯度；当A260/A280值在1.8～2.0之间，表示RNA纯度好，可用于下一步的逆转录实验和实时荧光定量PCR实验。
(二)逆转录反应
(1)按测得的RNA浓度计算，取RNA样本1μg时所需的量。再加入DNase酶0.5μL、10×DNase Buffer 1μL、RNAase-free ddH2O至总体积10μL，恒温放置37℃，15min。
(2)向总体积中加入EDTA 1μL，恒温放置65℃，10min。
(3)利用Takara公司cDNA合成试剂盒将提取出的1μg RNA样本反转录为cDNA。反转录体系为：
Figure BDA0002785705620000031
在PCR仪中设定42℃，20min；95℃，5min；40℃，5min。
(4)逆转录后的cDNA加入pH8.0的10mM Tris﹒HCl于-20℃保存。
(三)实时荧光定量PCR扩增。
(1)实时荧光定量PCR通过采集PCR循环产物中的荧光信号，实现对模板的定量分析，荧光染料为SYBRGreen。
PCR体系：
Figure BDA0002785705620000032
(2)在PCR仪中设定95℃/15min+(94℃/30s+57℃/30s+72℃/30s)×40次+72℃/10min。
(3)对扩增后的PCR产物，利用1％的琼脂糖凝胶，在90V、100mA的电泳条件下跑电泳30min进行鉴定、测定其浓度。
图1给出正常肾组织样本与肾透明细胞癌组织样本荧光定量PCR结果对比图。图2给出正常肾组织样本与肾透明细胞癌组织样本的荧光定量PCR电泳图。
实验结果确定：阳性标本荧光定量PCR结果较正常组织升高5倍以上；同时PCR产物进行凝脂糖电泳后出现条带。TRAV21-TRAJ26(V21-J26)在患者肾透明细胞癌组织中表达明显增高，而正常人的表达量很低，基于此，可将人体外周血中的V21-J26基因作为检测肾透明细胞癌的标记物。所述基因V21-J26可用于制备定量检测样本中基因表达情况的试剂在肾癌早期筛查检测产品中应用。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 肾癌早期筛查基因V21-J26检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gcctcgctgg ataaatcatc agga 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ggttccggga ccaaagacaa 20

Claims (1)

1.引物在制备检测肾透明细胞癌试剂盒中的应用，其特征在于：所述引物为一对扩增TRAV21-TRAJ26基因的PCR引物，所述引物的序列如下所示：
正向引物1：5’-GCCTCGCTGGATAAATCATCAGGA-3’；
反向引物1：5’-GGTTCCGGGACCAAAGACAA-3’；
所述试剂盒为PCR检测试剂盒。
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