CN107574249B - 一种预测中国人群乳腺癌复发的基因表达谱检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了适用于中国人群的预测乳腺癌复发的特征性基因表达谱，同时提供了复发指数计算公式以及复发预测判断标准，本发明还提供该乳腺癌特征性基因谱的荧光定量检测试剂盒，本发明的PCR扩增引物由包括8对引物组成，可以联合检测8个基因相关表达量：CCNA2，CCND1，SERP1NE1，SPRR1B，TOP2A，β‑ACTIN，GAPDH，HPRT1。本发明可用于指导临床乳腺癌的个体化治疗，预防乳腺癌复发。
Description
技术领域
本发明属于医学分子生物学领域，具体涉及一种预测中国人群乳腺癌复发的基因表达谱检测试剂盒。
背景技术
乳腺癌是一种常见的女性恶性肿瘤，是全球女性中发病率及致死率最高的恶性肿瘤。中国抗癌协会公布的统计数字显示，我国近年来乳癌发病率正以每年3％的速度递增，发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势。乳腺癌的治疗手段包括手术、放射治疗、化学治疗、内分泌治疗和生物治疗等。常规的治疗是手术尽量切除肿瘤病灶，术后通过放化疗来杀死残余的肿瘤细胞，防治肿瘤复发。化疗是治疗有效的一种手段，但是并不是所有的患者都适用化疗，有时无谓的化疗甚至会加重患者的病情。根据St Gallen和ΜS National InstitutesofHealth的标准，乳腺癌患者术后需要接受辅助治疗的为淋巴结阳性的患者和85～90％的淋巴结阴性的乳腺癌患者。究竟哪些淋巴结阴性的乳腺癌患者需要接受辅助治疗，这就需要一个特殊的标准来进行区别，确保每一位患者都能接受合适的治疗，真正实现个体化治疗。
近年来通过对复发和未复发乳腺癌患者肿瘤组织中基因表达谱的对比性研究，人们发现了具有预测ER(+)淋巴结(-)乳腺癌的复发转移风险的几组多基因标志物。如70基因谱、76基因谱、21基因谱、28基因谱及97基因谱等。其中21基因检测是目前应用较为广泛的基因表达谱，美国国家癌症联合中心系统(NCCN)在2011年乳腺癌治疗指南中指出，对于ER+/HER2-患者的化疗指征评定需要结合21基因检测来判断，然而这一类患者只占乳腺癌的10％左右。此外由于它们所针对的乳腺癌患者群体不同，存在着种族、地域、环境以及生活和饮食习性等方面的差别。
到目前为止应用于指导乳腺癌的治疗、预测乳腺癌的乳腺癌基因谱主要是欧美国家的研究结果，国内尚未有一个针对中国人的预测乳腺癌预后的特征性基因谱，因此它们的实用价值在中国人群中具有一定的局限性。因此建立一个适合于中国人群的预测乳腺癌预后的特征性基因表达谱，将对我国乳腺癌的个体化治疗提供可靠的科学依据，同时避免治疗上处理不足或治疗上过度处理等状况。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种有效的预测中国人群乳腺癌复发的基因表达谱检测试剂盒。
一种预测中国人群乳腺癌复发的基因表达谱检测试剂盒，所述试剂盒包括以下扩增8个基因表达水平的引物对：扩增CCNA2基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示；扩增CCND1基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；扩增SERP1NE1基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示；扩增SPRR1B基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示；扩增TOP2A基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；扩增β-ACTIN基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；扩增GAPDH基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；扩增HPRT1基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
所述扩增引物用于检测乳腺癌组织CCNA2，CCND1，SERP1NE1，SPRR1B，TOP2A，β-ACTIN，GAPDH，HPRT1基因表达水平，计算复发指数，进而判断乳腺癌患者的复发风险；所述复发指数计算公式为Log[P/(1-P)]＝1.843-0.2226×CCNA2-0.1676×CCND1+0.1665×SERP1NE1+0.4170×SPRR1B-0.1221×TOP2A；预测复发风险指数判断：低风险：P≤2.1；中风险：2.1＜P＜3.6；高风险：P≥3.6。
本发明的有益效果：本发明试剂盒通过检测乳腺癌组织CCNA2，CCND1，SERP1NE1，SPRR1B，TOP2A，β-ACTIN，GAPDH，HPRT1基因表达水平，计算复发指数，进而判断乳腺癌患者的复发风险，可用于指导临床乳腺癌的个体化治疗，预防乳腺癌复发，其临床应用前景良好。
附图说明
图1为石蜡标本提取RNA电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合举例，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的举例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)乳腺癌石蜡标本mRNA的提取：(采用Ambion公司RecoverALLTMTotal NucleicAcid Isolation Kit)
1.石蜡切片机切取5～6张10μm蜡片，放于1.5mL RNA free离心管中。
2.加1mL二甲苯脱蜡，50℃水浴，3～5min后12000rpm，2min，弃二甲苯。
3.加1mL 100％乙醇，12000rpm，2min，弃乙醇，重复乙醇洗一次(如果脱蜡还没有完全，再加入二甲苯重复上述步骤)。
4.吸干乙醇后，空气干燥20min，加100μL消化液和4μL蛋白酶。
5.混匀后，50℃，15min；80℃，15min。
6.加120μL Isolation additive以及275μL 100％乙醇，上下颠倒混匀。
7.将过滤芯放入收集管中，将上述混合液加入过滤芯中，10000rpm，30s。
8.弃废液后加700μL wash1到柱子中，10000rpm，30s。
9.弃废液后加500μL wash2/3，10000rpm，30s，弃废液。重复步骤9。
10.加以下60μL混合液至过滤芯正中
6μL 10×Dnase Buffer
4μL Dnase
50μL Nuclease-free water
11.室温静置30min。
12.加wash1 700μL，静置1min，10000rpm，30s，弃废液。
13.加500μL wash2/3，10000rpm，30s，弃废液(重复一次)。
14.把柱子放入新的收集管中，10000rpm，1min，把柱子放入新管中。
15.加Elution Solution 40μL至过滤芯正中，室温放置5min，10000rpm，1min，洗提RNA，测定RNA浓度后立即进行逆转录反应，剩余置-80℃保存。
16.NANO DROP法检测RNA的纯度和浓度，OD260/OD280在1.8～2.0，OD260/OD230＞2.0，表示RNA优质。(1％的琼脂糖凝胶电泳结果见图1)。
(2)逆转录反应：(采用TaKaRa试剂盒RR036A)
1.按下列组份配制RT反应液(反应液配制请在冰上进行)。
5×PrimeScript RT Master Mix 4μL
RNA ≤1μg
Nuclease-free water up to 20μL
2.轻柔混匀后，37℃15min，85℃5s。
3.将上述逆转录好的cDNA在-20℃储存备用。
(3)Real Time PCR反应:(采用ABI公司
Select Master Mix；仪器采用Applied Biosystems 7300Real-Time PCR System)
1.稀释上述cDNA：根据逆转录时RNA浓度稀释10到20倍。
2.按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)
3.Real Time PCR反应程序如表1所示：
表1
4.结果判定：观察溶解曲线和扩增曲线(如果溶解曲线峰值不好或增长曲线不呈S型曲线，则CT值不可信，需重做)。计算各基因的相对表达量△CT靶基因，计算如下：靶基因的△CT靶基因＝CT靶基因-CT内参基因，以所选3个管家基因β-ACTIN，GAPDH和HPRT1的CT值均值作为校正基数来标化测定结果。如果样本中的靶基因在扩增50个循环结束时仍没有出现荧光扩增信号，则该基因的CT值被规定为50(最大循环数)，以便统计。上述试剂盒检测乳腺癌石蜡标本结果示例如表2所示：
表2试剂盒检测乳腺癌石蜡标本结果示例
(5)结果计算和分析
1.复发指数计算公式：Log[P/(1-P)]＝1.843-0.2226×CCNA2-0.1676×CCND1+0.1665×SERP1NE1+0.4170×SPRR1B-0.1221×TOP2A；低风险：P≤2.1；中风险：2.1＜P＜3.6；高风险：P≥3.6。
2.使用本发明检测中国人群中80例乳腺癌患者术后标本，将预测结果与术后5年随访结果进行比较，如表3所示预测高风险的患者5年内复发率为82.05％，而低风险的患者5年内复发率仅为19.51％，本基因表达谱检测试剂盒预测乳腺癌5年内复发的准确率为81.48％，因此本发明能有效预测中国人群乳腺癌复发，可用于指导临床乳腺癌的个体化治疗，预防乳腺癌复发。
表3 81例乳腺癌患者复发风险预测结果与术后5年随访结果
| 复发危险度 | 未复发患者(％) | 复发患者(％) | 合计 |
| 低风险(P≤2.1) | 33(80.49) | 8(19.51) | 41 |
| 中风险(2.1＜P＜3.6) | 0(0) | 1(100) | 1 |
| 高风险(P≥3.6) | 7(17.95) | 32(82.05) | 39 |
| 合计 | 40 | 41 | 81 |
以上仅为本发明的具体实施例，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省肿瘤医院 江苏省肿瘤防治研究所
<120> 一种预测中国人群乳腺癌复发的基因表达谱检测试剂盒
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
gaaagcaaac agtaaacagc c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
gcatcttcac gctctattt 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
atgaccccgc acgatttc 18
<210> 4
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
cgcaacgtgg ttttctca 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
gaatcccata gctgcttgaa t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
agttctaagg gaccatacag a 21
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
ccttggtttt ggggatg 17
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
gctgtggtat tgtagaaagc 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
ggcatcatcg agtttggga 19
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
tgagattggc atggcttt 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
caccttcacc gttccagttt 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
acaactttgg tatcgtggaa gg 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 14
acaactttgg tatcgtggaa gg 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
cctggcgtcg tgattagtga t 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 16
agacgttcag tcctgtccat aa 22
Claims (1)
1.一种预测中国人群乳腺癌复发的基因表达谱检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下扩增8个基因表达水平的引物对：扩增CCNA2基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；扩增CCND1基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示；扩增SERP1NE1基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示；扩增SPRR1B基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；扩增TOP2A基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9和SEQID NO:10所示；扩增β-ACTIN基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12所示；扩增GAPDH基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；扩增HPRT1基因的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；
所述扩增引物用于检测乳腺癌组织CCNA2，CCND1，SERP1NE1，SPRR1B，TOP2A，β-ACTIN，GAPDH，HPRT1基因表达水平，计算复发指数，进而判断乳腺癌患者的复发风险；所述复发指数计算公式为Log[P/(1-P)]＝1.843-0.2226×CCNA2-0.1676×CCND1+0.1665×SERP1NE1+0.4170×SPRR1B-0.1221×TOP2A；预测复发风险指数判断：低风险：P≤2.1；中风险：2.1＜P＜3.6；高风险：P≥3.6。
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