DE10102687A1 - Trisomie 13-Diagnostik-Kit - Google Patents
Trisomie 13-Diagnostik-KitInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Diagnose-Kit für die Erfassung einer Trisomie 13 eines menschlichen Fötus aus einer mütterlichen Blutprobe oder aus Amnionflüssigkeit mit mindestens zwei Paaren Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer), wobei die beiden Oligonukleotide eines Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge mindestens zweier gesuchter DNS-Abschnitte geeignet sind, die Teil von STR-DNS-Bereichen des menschlichen Chromosoms 13 sind.
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Diag
nostik-Kit für die Erfassung einer Trisomie 13 eines
menschlichen Fötus sowie auf einen Mikroarray hierfür
und ein Verfahren zur Erfassung einer Trisomie 13.
Derartige Verfahren, Diagnostik-Kits und Mikroarrays
werden in der Prenatal-Diagnostik benötigt.
Normalerweise wird die genetische Information von Ge
neration zu Generation unverändert weitergegeben, wo
bei über den Mechanismus der "Meiose" der Genbestand
teil in jedem Elternteil neu kombiniert und tradiert
wird. Es können jedoch durch bestimmte Eigenschaften
der Gene und durch mutagene Faktoren Veränderun
gen/Mutationen am genetischen Material auftreten, die
nach Art, Entstehungsweise und Ebene des Geschehens
unterschiedlich klassifiziert werden. Bei sog. Chro
mosomenmutationen bzw. -aberrationen treten Struktur
veränderungen der Chromosomen auf. Diese Aberrationen
werden meist durch Fehler in der "Meiose" verursacht
und können numerischen oder strukturellen Charakter
haben. Im Fall einer numerischen Aberration weicht
dabei entweder die Anzahl eines einzelnen Chromosoms
(Trisomie, Monosomie) oder die eines ganzen Chromoso
mensatzes (Polyploidie) von der Norm ab. Eine der am
häufigsten auftretenden Trisomien ist Trisomie 13, da
im Fall von Trisomie 13 Lebendgeburten betroffener
Feten beobachtet werden.
Die Trisomie 13 tritt mit einer Durchschnittshäufig
keit von 1 : 5000 Lebendgeborenen auf. Die meisten be
troffenen Kinder sterben im 1. Lebensjahr, nur 10%
werden älter. Die mittlere Lebensdauer beträgt nur
wenige Monate. Hauptmerkmale der Trisomie 13 sind Mi
kro- oder Anophthalmie, Hypotelorismus, ein- bzw.
doppelseitige Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalte, Holopros
enzephalie, Kopfhautdefekte, tiefsitzende und dyspla
stische Ohren, postaxiale Polydaktylie, Herzfehler
und Fehlbildungen des Urogenitalsystems.
Die zur Zeit verwendeten Methoden einer pränatalen
Trisomie 13-Diagnostik basieren nahezu ausschließlich
auf invasiven Prozeduren, wie z. B. die Amniozentese
oder die Chorionzottenbiopsie, und sind demzufolge
mit einem hohen Gesundheitsrisiko für Mutter und das
heranwachsende Kind verbunden. Zudem sind die zur
Zeit verfügbaren Analyse- bzw. Detektionsverfahren
für Trisomie 13 wie z. B. cytogenetische Analysen oder
die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung sehr kostenin
tensiv und zeitaufwendig, so daß sie nicht routinemä
ßig bei allen Schwangeren sondern lediglich bei Vor
liegen von entsprechenden medizinischen Indikationen
durchgeführt werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es also, Verfahren,
ein Diagnose-Kit und einen Mikroarray zur
Verfügung zu stellen, mit denen ohne große Risiken
für Fötus oder Mutter eine Trisomie 13 des Fötus auf
einfache Art und Weise erfaßt werden kann.
Diese Aufgabe wird durch das Diagnose-Kit gemäß An
spruch 1, den Mikroarray gemäß Anspruch 19 sowie das
Verfahren gemäß Anspruch 23 gelöst. Vorteilhafte Wei
terbildungen des erfindungsgemäßen Diagnose-Kits, des
erfindungsgemäßen Mikroarrays und des erfindungsgemä
ßen Verfahrens werden in den jeweiligen abhängigen
Ansprüchen gegeben.
Die Detektion von Trisomie 13 gemäß der vorliegenden
Erfindung basiert auf einer quantitativen PCR-Methode
und beinhaltet die Amplifikation von auf Chromosom 13
lokalisierten sogenannten "short tandern repeats"
(STR's) bzw. "Mini-Satelliten-DNS's". Dabei handelt
es sich um hypervariable, kurze DNS-Sequenzmotive
(2-4 bp) in Form sogenannter Tandern-Repetitionen, d. h.
hintereinander liegender Einheiten mit einer Gesamt
länge von 100-1000 bp. Die Verwendung von automati
sierbaren Fluoreszenz-basierenden Analysemethoden er
laubt eine kostengünstige und zeitlich sehr kurze
Probenverarbeitung, so daß das erfindungsgemäße Ver
fahren routinemäßig allen Schwangeren zugänglich ge
macht werden kann. In Verbindung mit einer ebenfalls
erfindungsgemäßen Methodik zur nicht-invasiven Gewin
nung von fötalen, kernhaltigen Zellen entfallen zudem
sämtliche Gesundheitsrisiken für Mutter und das her
anwachsende Kind.
Das erfindungsgemäße nicht-invasive Trisomie 13-
Diagnoseverfahrens weist zwei wichtige Aspekte auf.
Zum einen wird für die Trisomie 13-Detektion ein
quantitatives Multiplex-PCR-Verfahren verwendet, das
vorteilhafterweise drei verschiedene STR-DNA-Bereiche
des Chromosoms 13 spezifisch amplifiziert. Vorteil
hafterweise eignen sich hierzu die drei STR-Bereiche
D13S631, D13S258 und D13S303. Derartige STR-DNA-
Regionen sind äußerst heterogen, so daß ein diploides
Individuum meist zwei verschiedene Allele eines STR's
trägt, was zur Erzeugung zweier PCR-Fragmente unter
schiedlicher Länge jedoch gleicher Quantität führt.
Im Falle eines triploiden Individuums führen die drei
Kopien des Chromosoms 13 entweder zur Erzeugung von
drei PCR-Fragmenten unterschiedlicher Länge (die 3
Allele sind vollständig heterogen bzw. heterozygot),
oder es werden nur zwei verschiedene PCR-Amplifikate
erzeugt, die jedoch in einem Mengenverhältnis von 2 : 1
bzw. 1 : 2 vorliegen (2 von 3 Allelen sind homogen bzw.
homozygot). In seltenen Fällen kommt es zu einer so
genannten "equivokalen" Fragmenterzeugung, d. h. die
Amplifikation eines bestimmten STR-DNA-Bereiches
führt zur Erzeugung eines singulären Fragments. In
diesem Fall ist es nicht möglich eine Aussage über
Diploidie/Triploidie zu treffen, da sowohl zwei als
auch drei Kopien des Chromosoms 13 vorliegen könnten,
die Allele gleicher Größe tragen. Um dieses "Diagno
seloch" auszuschließen, wird vorteilhafterweise ein
Multiplex-PCR-Verfahren vorgeschlagen, bei dem
gleichzeitig drei STR-DNA-Bereiche des Chromosoms 13
analysiert werden.
Der zweite Aspekt betrifft die Anreicherung/Isolie
rung fötaler Zellen aus peripherem, mütterlichem Blut
oder aus Amnionflüssigkeit. Vorteilhafterweise er
folgt dabei eine Anreicherung fötaler, kern- bzw.
DNA-haltige Erythrozyten aus einer mütterlichen Blut
probe, da diese bereits in frühen Schwangerschafts
stadien reproduzierbar und in relativ hohen Mengen im
mütterlichen Blut zirkulieren.
Vorteilhafterweise kann die Anreicherung fötaler Zel
len aus einer maternalen Blutprobe (Vollblut, Blut
plasma, Blutserum) oder aus Amnionfluid der Schwange
ren, wie beispielsweise fötaler Erythrozyten aus pe
ripherem, mütterlichem Blut, durch eine Percoll-
Dichtegradienten-Zentrifugation oder auch durch eine
FACS-Durchflußzytometrie erfolgen.
Im folgenden werden einige Beispiele für das erfin
dungsgemäße Kit und das erfindungsgemäße Verfahren
gegeben.
Fig. 1A zeigt dabei die Ergebnisse aus Kontrollblut
von gesunden Probanden;
Fig. 1B die Ergebnisse aus Kontrollblut von Triso
mie 13-Patienten;
Fig. 1C die Ergebnisse aus reinem Wasser als Kon
trolle.
Fig. 2A die Ergebnisse aus Anmionfluid bei einem
gesunden Fötus;
Fig. 2B die Ergebnisse aus Anmionfluid bei einem
Fötus mit Trisomie 13 und
Im folgenden werden zwei Beispiele für die Anreiche
rung fötaler Erythrozyten aus peripherem mütterlichem
Blut gegeben.
In einem ersten Beispiel erfolgt die Anreicherung
durch eine Percoll™-Dichtegradienten-Zentrifugation.
Bei einer konstanten Zentrifugalkraft und Mediumvis
kosität ist die Sedimentationsrate von Partikeln proportional
zur Partikelgröße. Diese Gesetzmäßigkeit
nutzt das Verfahren der Dichtegradienten-Zentrifu
gation, wobei in diesem Beispiel Percoll™ als Zen
trifugationsmedium verwendet wird. Bei Percoll™ han
delt es sich um ein Silika-Derivat, das standardmäßig
zur Anreicherung/Trennung von subzellulären Partikeln
verwendet wird.
Zunächst wird ein kontinuierlicher Percoll-Gradient
erzeugt, der einen Dichtebereich von 1,02-1,13 g/ml
abdeckt. Dafür werden 14 ml einer Percoll™-NaCl-
Lösung (0,15 M NaCl), die eine Dichte von 1,07 g/ml
aufweist, 30 min bei 20000 g in einem Festwinkelrotor
Typ F 0630 (Beckman Coulter) zentrifugiert. Anschlie
ßend wird der so erzeugte kontinuierliche Gradient
mit 5 ml EDTA-Vollblut, d. h. in EDTA-Puffer bei
spielsweise in standardisierten, kommerziell verfüg
baren EDTA-Röhrchen, aufgenommenes Vollblut, über
schichtet und 15 min bei 1000 g zentrifugiert. Nach
diesem Zentrifugationsschritt verbleiben u. a. die
Thrombozyten in der Serumschicht oberhalb des Gra
dienten und werden mit einer Pasteurpipette entfernt.
Ein zweiter Zentrifugationsschritt bei 1000 g für 15 min
führt schließlich zur Trennung der verbliebenen,
unterschiedlichen Blutzelltypen entsprechend ihrer
jeweiligen isopycnischen Dichten. Die Sedimentations
schicht mit mononuklearen Blutzellen wird anschlie
ßend mit einer Pasteurpipette entnommen, dreimal mit
Phosphat-Puffer-Saline (PBS, pH = 7,4) gewaschen und
schließlich in 1 ml PBS resuspendiert. Phosphat-
Puffer-Saline (PBS, pH = 7,4) enthält in wäßriger Lö
sung KCl 0,2 g/l, KH2PO4 0,2 g/l, NaCl 8,0 g/l und
Na2HPO4 1,15 g/l und wird beispielsweise von Life
Technologies (Cat.-No.: 14190-094) vertrieben. Die
DNS der mononuklearen Blutzellen wird dann durch die
Standardprozeduren des "QIAamp Blood Kit" (Qiagen,
Hilden) isoliert und kann für eine Multiplex-PCR ein
gesetzt werden.
In einem zweiten Beispiel wurden die fötalen, kern
haltigen Erythrozyten mittels FACS-Durchflußzyto
metrie (FACS = fluoreszenzassoziierte Zellsortierung)
isoliert. Es erfolgt zunächst eine Anreicherung aller
mono-nuklearer Blutzellen mittels Percoll-Dichte
gradienten-Zentrifugtation (siehe oben). Die Sedimen
tationsschicht mit mononuklearen Blutzellen wird da
bei mit einer Pasteurpipette entnommen, dreimal mit
Phosphat-Puffer-Saline (PBS, pH = 7,4) gewaschen und
schließlich in 1 ml PBS resuspendiert.
Im Anschluß an die Dichtegradienten-Zentrifugation
werden 800 µl der erhaltenen Blutzellsuspension für
60 min bei 4°C mit einem Phycoerythrin-konjugierten
monoklonalen Antikörper, Hersteller: BD PharMingen
(Cat.No.: 32595A) Klon: GA-R2 (HIR2) Isotype: Mouse
IgG2b, K gegen das GlycophorinA-Oberflächenprotein
und einem Fluorescein-Isothiocyanat (T9-FITC)-kon
jugierten monoklonalen Antikörper, Hersteller: BD
PharMingen (Cat.-No.: 30984X) Klon: CB38 (NL07) Iso
type: Mouse IgM, κ gegen den Transferrin-Rezeptor
(CD36) inkubiert bzw. markiert. Ein dritter Fluores
zenzkanal wird benutzt für die negative Diskriminie
rung von T-, B- und NK-Zellen. Die Endkonzentration
beider Antikörper beträgt jeweils 0,2 µg pro 107 Zel
len. Die markierten Zellen werden zweimal mit PBS ge
waschen und im Anschluß werden 107 Zellen in 1 ml PBS
resuspendiert.
Für die Isolierung kernhaltiger Erythrozyten wird ein
FACS Vantage SE-Durchflußzytometer (Becton-Dickinson)
verwendet. Das System ist mit einem wassergekühlten
Doppelwellenlängen-Argon-Laser (Emmissionswellenlängen
488 nm und 365 nm - UV) und einem luftgekühlten
Helium-Neon-(HeNe) Laser konfiguriert und mitfluo
reszierenden Beads (Becton Dickinson) kalibriert. Das
CellQuest Programm, Hersteller: Becton Dickinson,
Version: 3.3 (Cat.-No.: 342182) wird verwendet für
die Datenaufnahme, Instrumentkontrolle, sowie die
statistische Auswertung. Die Sortierung der Blutzel
len erfolgt mit Zellraten von 20000-25000 Zellen
pro Sekunde, wobei die Zellgröße ("forward scatter"),
und die Granularität, sowie die Oberflächenstruktur
("side scatter"), die Emission der grünen Fluoreszenz
(Transferin-Rezeptor, T9-FITC), die Emission der
orangen Fluoreszenz (GlycophorinA, KC16-Rd) sowie die
Emission der roten Fluoreszenz für die übrigen Para
meter, wie CD45, CD3, CD19 und CD16/56 (APC oder Cy5
markiert), als Selektionskriterien verwendet werden.
Um eine zusätzliche Diskriminierung von kernhaltigen
Zellen zu gewährleisten wird der Kernfarbstoff
Hoechst 33342 eingesetzt. Die Anregung erfolgt
gleichzeitig mit der UV-Linie des Argon-Lasers. Die
sortierten Zellen werden direkt in ein 1,5 ml Reakti
onsgefäß, das mit 1 ml PBS gefüllt ist, überführt und
können bei -20°C gelagert werden.
Auch hier kann die DNS der mononuklearen Blutzellen
anschließend durch die Standardprozeduren des "QIAamp
Blood Kit" (Fa. Qiagen, Hilden) isoliert und für eine
Multiplex PCR wie im folgenden beschrieben, einge
setzt werden.
Mit der so isolierten DNS aus kernhaltigen fötalen
Erythrozyten wird eine Multiplex-PCR durchgeführt.
Als Primer wurden dabei die in Tabelle I angegebenen
Sequenzen verwendet. Erfindungsgemäße Kits enthalten
zumindest eines der in Tabelle I angegebenen Primer
paare. Hier wurde ein Kit verwendet, das sämtliche in
Tabelle I enthaltenen Primerpaare enthielt. Die Pri
mer PTR13S631F bzw. PTR13S631R sind Forward (F)- und
Reverse (R)-Primer zur Amplifikation des STR D13S631,
die Primer PTR13S258F und PTR13S258R zur Amplifikati
on des STR D13S258 sowie die Primer PTR13S303F und
PTR13S303R zur Amplifikation des STR D13S303. In der
Spalte "Markierung" ist für den jeweiligen Primer an
gegeben, ob und mit welchen Fluoreszenzfarbstoffen er
markiert ist. Weiterhin ist in der vierten Spalte von
Tabelle I die Größe des amplifizierten Abschnitts in
Basenpaaren angegeben. Wie zu erkennen ist, liegen
die jeweils amplifizierten Abschnitte ausreichend
auseinander, so daß sie eindeutig identifiziert wer
den können.
Die PCR wurde anschließend mit den in Tabelle II ge
gebenen Parametern durchgeführt. Dabei wurde ein PCR-
Mastermix verwendet, dessen Zusammensetzung in Tabel
le III angegeben ist. Die PCR wurde dabei auf einem
PCR-Blockcycler PE 9700 der Firma Applied Biosystems
durchgeführt.
Taq-Puffer bezeichnet dabei einen Taq DNA Polymerase
Storage Buffer (Taq-Buffer B), der in wäßriger Lösung
enthält: Tris-HCl 20 mM (pH = 8,0 bei 25°C), KCl
100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Glycerol 50% (v/v),
Tween 20 0,5% (v/v), Nonidet-P40 0,5% (v/v) und bei
spielsweise von Promega Corp. (Cat.-No: M166B) ver
trieben wird.
Die Ergebnisse der PCR wurden mittels ABI-Fragment
analyse ausgewertet. Hierzu wurden die einzelnen PCR-
Ansätze zunächst unverdünnt eingesetzt, wobei für die
ABI-Fragmentanalyse jeweils 1 µl verwendet wurde. Als
PCR-Template wurde zunächst Kontrollblut von gesunden
Probanden (siehe Fig. 1A) und von Trisomie 13-Patien
ten (siehe Fig. 1B) verwendet. Das Kontrollblut der
Trisomie 13-Patienten wurde hier zur Überprüfung
durch cytogenetische Standardverfahren typisiert.
Die Dokumentation dieser Fragmentanalyse ist in Fig.
1 zu erkennen. In Fig. 1A ist dabei unmittelbar zu
sehen, daß die Fragmente, die mit 1 bzw. 1', 2 bzw.
2' oder 3 bzw. 3' bezeichnet sind, jeweils etwa
gleich hohe Fluoreszenzsignale erzeugen. Mit 1, 1'
sind dabei die Fragmente bezeichnet, die durch die
Primer PTR13S631 (F und R), mit 2, 2' die Fragmente,
die durch die Primer PTR13S258 (F und R) und mit 3,
3' die Fragmente, die durch die Primer PTR13S303 (F
und R) amplifiziert wurden, bezeichnet.
Aus Fig. 1A ist folglich zu erkennen, daß hier ledig
lich zwei Chromosomen 13 vorliegen, d. h. daß der Pro
band keine Trisomie 13 aufweist.
In Fig. 1B ist zu erkennen, daß die Fragmente, die
mit 1, 1' bezeichnet sind, sich in einem Größenver
hältnis von 2 : 1 befinden. Weiterhin ist im Bereich
zwischen 240 Basenpaaren und 280 Basenpaaren sowie
zwischen 440 bp und 470 bp jeweils ein Trippel an
Fragmenten 2, 2', 2" bzw. 3, 3', 3" zu erkennen,
die in etwa gleiche Signalstärken zeigen. Sowohl die
Verhältnisse des Fragmentpaares 1, 1' als auch der
Fragmenttrippel 2, 2', 2" und 3, 3', 3" weisen ein
deutig auf das Vorliegen einer Trisomie 13 bei dem
hier untersuchten Patienten hin.
In Fig. 1C ist eine Kontrolle dargestellt, bei der
lediglich reines Wasser gemessen wurde. Es ist zu er
kennen, daß hier keine signifikante Amplifikation von
DNS erfolgte und daher keine signifikanten Signale in
den relevanten Bereichen zu erkennen sind.
Fig. 2, bei der dieselben Elemente mit demselben Be
zugszeichen wie in Fig. 1 bezeichnet sind, zeigt die
Ergebnisse einer Untersuchung an Proben von Amnion
flüssigkeit (Fig. 2A und 2B). Als Ausgangsmaterial
für die Extraktion von DNS wurde in diesem Beispiel
Amnionflüssigkeit verwendet, wie sie bei der Amnio
zentese gewonnen wird. Die DNA-Isolierung erfolgte
vollständig wie im obigen Beispiels mittels des
"QIAamp DNA Blood Kit" der Firma Qiagen, Hilden. Die
weitere Amplifikation und Auswertung dieser Probe er
folgte exakt nach demselben Protokoll wie für die
Fig. 1 beschrieben. Anschließend wurde eine ABI-
Fragmentanalyse durchgeführt, deren Ergebnisse in den
Fig. 2A und 2B dargestellt sind.
Wie aus Fig. 2A ersichtlich ist, sind dort die jewei
ligen Signale 1, 1' bzw. 3, 3' der amplifizerten
Fragmente etwa gleich hoch. Weiterhin ist nur ein
einziges Signal 2 zu erkennen, das jedoch etwa dop
pelt so hoch ist. Es handelt sich also folglich um
einen gesunden Fötus, dessen in der Amnionflüssigkeit
vorhandene Zellen bestimmt wurden.
In Fig. 2B ist zu erkennen, daß die Fragmente, die
mit 1, 1' bezeichnet sind, sich in einem Größenver
hältnis von 2 : 1 befinden. Weiterhin ist im Bereich
zwischen 240 Basenpaaren und 280 Basenpaaren sowie
zwischen 440 bp und 470 bp jeweils ein Trippel an
Fragmenten 2, 2', 2" bzw. 3, 3', 3" zu erkennen,
die in etwa gleiche Signalstärken zeigen. Sowohl die
Verhältnisse des Fragmentpaares 1, 1' als auch der
Fragmenttrippel 2, 2', 2" und 3, 3', 3" weisen ein
deutig auf das Vorliegen einer Trisomie 13 bei dem
hier untersuchten Patienten hin.
Claims (32)
1. Diagnose-Kit für die Erfassung einer Trisomie 13
eines menschlichen Fötus mit
mindestens zwei Paaren Oligonukleotide (Reverse primer, Forwardprimer),
wobei die beiden Oligonukleotide jedes Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerase- Kettenreaktion jeweils eines der beiden komple mentären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und
wobei der gesuchte DNS-Abschnitt ein Short- Tandern-Repeat-Bereich (STR-DNS-Bereich) des menschlichen Chromosoms 13 ist.
mindestens zwei Paaren Oligonukleotide (Reverse primer, Forwardprimer),
wobei die beiden Oligonukleotide jedes Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerase- Kettenreaktion jeweils eines der beiden komple mentären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und
wobei der gesuchte DNS-Abschnitt ein Short- Tandern-Repeat-Bereich (STR-DNS-Bereich) des menschlichen Chromosoms 13 ist.
2. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß es insgesamt drei
verschiedene Paare Oligonukleotide (Reverse
primer, Forwardprimer) enthält,
wobei die beiden Oligonukleotide jedes Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerase- Kettenreaktion jeweils eines der beiden komple mentären Stränge jeweils verschiedener Short- Tandem-Repeat-DNS-Bereiche des menschlichen Chromosoms 13 geeignet sind.
wobei die beiden Oligonukleotide jedes Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerase- Kettenreaktion jeweils eines der beiden komple mentären Stränge jeweils verschiedener Short- Tandem-Repeat-DNS-Bereiche des menschlichen Chromosoms 13 geeignet sind.
3. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An
sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Short-
Tandern-Repeat-Bereich der Bereich D13S631,
D13S258 und/oder D13S303 ist.
4. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An
sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die zur
Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion er
forderlichen Substanzen enthält.
5. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An
sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur
Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion er
forderliche Substanzen eine Pufferlösung, Mag
nesiumchlorid, Desoxynukleotid-Triphosphate,
und/oder eine hitzestabile Polymerase enthält.
6. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile
Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus
(Taq-Polymerase) enthält.
7. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An
sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Po
sitivkontrolle eine DNS-Probe mit zumindest ei
nem der gesuchten DNS-Abschnitte enthält.
8. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An
sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest
jeweils eines der beiden Oligonukleotide eines
Paares von Oligonukleotiden mit Fluorophoren
markiert sind.
9. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide
der verschiedenen Paare mit verschiedenen Fluo
rophoren markiert sind.
10. Diagnose-Kit nach Anspruch 9, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Oligonukleotide des ersten und
des zweiten Paares mit verschiedenen Fluoropho
ren markiert sind.
11. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An
sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligo
nukleotide der Paare folgende Sequenzen aufwei
sen:
GGCAACAAGAGCAAAACTCT und TAGCCCTCACCATGATTGG und/oder
ACCTGCCAAATTTTACCAGG und GACAGAGAGAGGGAATAAACC und/oder
ACATCGCTCCTTACCCCATC und TGTACCCATTAACCATCCCCA
GGCAACAAGAGCAAAACTCT und TAGCCCTCACCATGATTGG und/oder
ACCTGCCAAATTTTACCAGG und GACAGAGAGAGGGAATAAACC und/oder
ACATCGCTCCTTACCCCATC und TGTACCCATTAACCATCCCCA
12. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid
mit folgender Sequenz
ACCTGCCAAATTTTACCAGG
mit dem Fluorophor 5'-NED markiert ist.
ACCTGCCAAATTTTACCAGG
mit dem Fluorophor 5'-NED markiert ist.
13. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehen
den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das
Oligonukleotid mit der Sequenz
GGCAACAAGAGCAAAACTCT und/oder
ACATCGCTCCTTACCCCATC
mit dem Fluorophor 4,7,2',4',5',7'-Hexachloro-6- Carboxyfluorescein markiert ist.
GGCAACAAGAGCAAAACTCT und/oder
ACATCGCTCCTTACCCCATC
mit dem Fluorophor 4,7,2',4',5',7'-Hexachloro-6- Carboxyfluorescein markiert ist.
14. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An
sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es
eine Anleitung zur Durchführung einer DNS- Isolierung und/oder
eine Anleitung zur Durchführung der Polymerase- Kettenreaktion und/oder
eine Anleitung zur Durchführung einer Fragment analyse enthält.
eine Anleitung zur Durchführung einer DNS- Isolierung und/oder
eine Anleitung zur Durchführung der Polymerase- Kettenreaktion und/oder
eine Anleitung zur Durchführung einer Fragment analyse enthält.
15. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An
sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein
Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergeb
nisse enthält.
16. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An
sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen
Nucleinsäure-Mikroarray (DNS-Chip) enthält, wo
bei der Array eine Anzahl Zellen (Felder) auf
weist und in mindestens einer Zelle ein Oligonu
kleotid angeordnet ist, das mit dem gesuchten
DNS-Abschnitt hybridisiert.
17. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer
weiteren Zelle des Mikroarrays ein weiteres Oli
gonukleotid angeordnet ist und die Sequenz des
Oligonukleotides, das in der mindestens einen
Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des
weiteren Oligonukleotides unterscheidet.
18. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehen
den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in
mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleo
tid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen
Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit
verschiedenen gesuchten DNS-Abschnitten hybridi
sieren.
19. Mikroarray zur Erfassung einer Trisomie 13, bei
spielsweise DNS-Chip, mit einer Anordnung von
mehreren, voneinander getrennten Zellen (Fel
dern), dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens
einer Zelle ein Oligonukleotid angeordnet ist,
das mit einem DNS-Abschnitt hybridisiert, der
Teil von Short-Tandern-Repeat-Bereichen des
menschlichen Chromosoms 13 ist.
20. Mikroarray nach Anspruch 19, dadurch gekenn
zeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle
ein weiteres Oligonukleotid angeordnet ist, wo
bei die Sequenz des Oligonukleotides, das in der
mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von
der Sequenz des weiteren Oligonukleotides unter
scheidet.
21. Mikroarray nach Anspruch 19 oder 20, dadurch ge
kennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen je
weils ein Oligonukleotid angeordnet ist, wobei
die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligo
nukleotide mit verschiedenen gesuchten DNS-
Abschnitten hybridisieren.
22. Mikroarray nach einem der Ansprüche 19 bis 21,
dadurch gekennzeichnet, daß der Short-Tandern-
Repeat-Bereich der Bereich D13S631, D13S258
und/oder D13S303 ist.
23. Verfahren zur Erfassung einer Trisomie 13 eines
menschlichen Fötus, dadurch gekennzeichnet, daß
in einer maternalen Blutprobe oder Amnionflüs
sigkeit mindestens zwei gesuchte DNS-Abschnitte,
die Teil eines Short-Tandern-Repeat-Bereiches
(STR-DNS-Bereiches) des menschlichen Chromosoms
13 sind, durch eine Polymerase-Kettenreaktion
mittels mindestens zweier verschiedener Paare
von Oligonukleotiden amplifiziert werden, wobei
die beiden Oligonukleotide des mindestens einen
Paares zur Amplifikation jeweils eines der kom
plementären Stränge der beiden gesuchten DNS-
Abschnitte geeignet sind, und
zuletzt die amplifizierte DNS quantitativ nach
gewiesen wird.
24. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da
durch gekennzeichnet, daß vor der Amplifikation
die DNS-haltigen Bestandteile in der maternalen
Blutprobe oder der Amnionflüssigkeit zuerst auf
konzentriert werden.
25. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da
durch gekennzeichnet, daß zur Aufkonzentration
der DNS-haltigen Bestandteile eine Sedimentation
der maternalen Blutprobe (Blutsatz) oder der Am
nionflüssigkeit durchgeführt wird.
26. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auf
konzentration der DNS-haltigen Bestandteile eine
Lyse darin enthaltener nukleierter fötaler
Erythrozyten durchgeführt und anschließend die
zellfrei vorliegende DNS abzentrifugiert und für
die weitere Diagnose gewonnen wird.
27. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeich
net, daß aus der maternalen Blutprobe das Blut
plasma/Blutserum gewonnen wird und anschließend
die gesuchten DNS-Abschnitte durch eine Polyme
rase-Kettenreaktion mittels der in dem Kit ent
haltenen Oligonukleotide amplifiziert werden und
zuletzt die amplifizierte DNS nachgewiesen wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27,
dadurch gekennzeichnet, daß als Short-Tandern-
Repeat-Bereich der Bereich D13S6311, D13S258
und/oder D13S303 verwendet wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 28,
dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am
plifizierten DNS die von fluoreszenzmarkierten
Oligonukleotiden abgegebene Fluoreszenzstrahlung
erfaßt wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 29,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Kit nach einem
der Ansprüche 1 bis 19 verwendet wird.
31. Verwendung eines Kits, eines Oligonukleotid-
Mikroarray und/oder eines Verfahrens nach einem
der vorhergehenden Ansprüche zur pränatalen,
nicht-invasiven Erfassung einer Trisomie 13 ei
nes menschlichen Fötus.
32. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch zur
pränatalen, nicht-invasiven Erfassung einer Tri
somie 13 eines menschlichen Fötus aus einer ma
ternalen Blutprobe oder Amnionflüssigkeit.
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---|---|---|---|
DE2001102687 DE10102687A1 (de) | 2001-01-22 | 2001-01-22 | Trisomie 13-Diagnostik-Kit |
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DE2001102687 DE10102687A1 (de) | 2001-01-22 | 2001-01-22 | Trisomie 13-Diagnostik-Kit |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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