JP5683964B2 - Ｓｎｐアレイを用いた染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列のコピー数測定方法 - Google Patents

Ｓｎｐアレイを用いた染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列のコピー数測定方法 Download PDF

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Description

本発明は、以下のステップ：（ａ）ホモ接合ＤＮＡを検体試料ＤＮＡと混合する工程；（ｂ）該ＤＮＡ混合物をＳＮＰアレイで分析する工程；そして（ｃ）ホモ接合ＤＮＡからのシグナルと検体試料ＤＮＡからのシグナルとの差異を測定して、染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列のコピー数を決定する工程とを含む、染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列のコピー数測定方法に関する。
特定の染色体配列の変化は、しばしばヒトの疾患と症候群に関連している。このような変化としては、ダウン症候群（Ｄｏｗｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のような一つの染色体全体の付加あるいは欠失や、ディジョージ症候群（Ｄ−Ｇｅｏｒｇｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のような数百万の塩基対の欠失や、ベッカー型（Ｂｅｃｋｅｒ）またはデュシエンヌ型（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）筋ジストロフィーのような小染色体断片の欠失あるいは重複が挙げられる。精神疾患患者では末端領域（ｓｕｂｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）欠失も多く報告されている（Ｌａｍｂ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。また、特定遺伝子の染色体領域、例えばＢＲＣＡ１、ＭＬＨ１／ＭＬＨ２などが癌においてよく変化するが、これは遺伝子の発現に重要であることが知られている（Ｐｅｔｒｉｊ−Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｗｉｊｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＥＲＢＢ２遺伝子が増幅した乳癌患者を治療するためにＥＲＢＢ２特異抗体を使用する例から分かるように、遺伝子コピー数の変化を分析することは、癌患者の治療にも重要な要素となりうる（Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，２００１）。
現在、染色体変化のコピー数を決定するための様々な方法が使用されている。染色体の数と構造的変化を測定する最も標準的な方法は核型分析（ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）法であるが、この核型分析法は、患者の血液、線維芽細胞または羊水細胞を培養しなければならず、その結果の解釈に多くの時間およびマンパワーを必要とする。また核型分析法では、通常、１メガベース以上の染色体変化のみを観察することができるが、この感度の問題はＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法で補完することができる。ところが、ＦＩＳＨ法もまた多くの時間とマンパワーを必要とし、さらに通常１回に４種以上の異なる標的遺伝子の変化を測定できない（Ｋｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。また、核型分析を自動化するための方法としてマルチカラー染色体彩色（ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｐａｉｎｔｉｎｇ）法が紹介されているが、この方法は互いに異なる色の蛍光物質で染色体の部分を標識することで容易に染色体の欠失、重複あるいは転座を調べることができるようにするものである（米国特許第６０６６４５９号）。マルチカラー染色体彩色法では、核型分析法に比べて感度がある程度増加するが、基本的には核型分析に必要な細胞培養と後処理過程が要求される。
時間とマンパワーの必要性を克服すべく、最近、染色体変化を検出するための幾つかの分子的方法が開発されている。アレイベースの競合的ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は最も有望な方法の一つであり、遺伝性疾患の診断への適用、あるいは癌組織における染色体変化の検出を試みるべく多くの施行がなされている（Ｐｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８；米国特許第６１９７５０１号および同６１５９６８５号）。この方法は、ＢＡＣクローンを基板表面に固定化してアレイを形成し、予め標識した標準ＤＮＡとサンプルＤＮＡをアレイにハイブリダイゼーションする。この方法によれば、標準およびサンプルＤＮＡからのシグナルの相対的な量を比較することにより、欠失や重複といった染色体変化を調べることができる。
また、多重ＰＣＲ法によって相対的な増幅を測定することによりコピー数を決定する方法が存在する（Ｒａｈｉｌ ｅｔ ａｌ．，２００２）。この方法を改変した方法として、多重連鎖反応依存性プローブ増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＭＬＰＡ）が最近紹介された（Ｓｃｈｏｕｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；ＷＯ９６１５２７１）。
ヘテロ接合体の欠失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ；ＬＯＨ）は染色体の欠失または重複を発見するために現在最もよくみられる方法である。ＬＯＨの研究のために、マイクロサテライトマーカー（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒ）（Ｃａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）が用いられてきた。ところが、マイクロサテライトマーカーを用いたＬＯＨ法は、ホモ接合欠失の場合を除いて染色体の変化が欠失か重複かを区別できなかった。
Ｐｏｎｔ−ＫｉｎｄｏｎとＬｙｏｎ（２００３）は染色体異常の発見にＳＮＰを用いた他の方法を報告したが、これらはヘテロ接合アレル（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ａｌｌｅｌｅ）の相対的な量を検出するために、溶融曲線分析（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用した。すなわち、２つのアレルの相対的な量が正常とは異なる場合、トリソミーが存在することを確認する方法である。
また、ＳＮＰアレイの手段によって染色体の欠失と重複を検出する方法が紹介された（Ｌｉｎｄｂｌａｄ−Ｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。この方法は、数多くのＳＮＰを検出するためにアレイを拡張可能であるという点で、計り知れない可能性を有している。ところが、このＳＮＰアレイを用いた染色体変化の検出には、必ず、検体ＤＮＡ内にヘテロ接合アレルが存在しなければならないという制限がある。一般的なＳＮＰとは、５％以上の人々に存在するものを意味するが、単一の遺伝子においては、ＣＮＶ（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）のために用いられるＳＮＰ数とヘテロ接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）の出現頻度は低い。したがって、興味のある特定のＳＮＰｓを検出するために、至急当該方法を改善することが求められている。
本発明者らは、上述した問題点を解決し、染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列のコピー数を測定するためのより効率的な方法を開発するために鋭意努力した。最終的に本発明者らは、ホモ接合ＤＮＡと検体試料ＤＮＡとを混合し、該ＤＮＡ混合物をレアＳＮＰを測定する能力を有するＳＮＰアレイで分析して、各試料からのシグナルの差異を測定する工程を含む方法を開発した。本発明者らは当該方法が、費用と必要とされるマンパワーを著しく節減させることができるうえ、特定遺伝子のコピー数を決定する他の分子的方法に比べて正確な値を得ることができることを見出し、本発明を完成した。
技術的解決方法
本発明の目的は、以下のステップ：（ａ）ホモ接合ＤＮＡを検体試料ＤＮＡと混合する工程；（ｂ）該ＤＮＡ混合物をＳＮＰアレイで分析する工程；そして（ｃ）ホモ接合ＤＮＡからのシグナルと検体試料ＤＮＡからのシグナルとの差異を測定して染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列のコピー数を決定する工程とを含んでなる、染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列のコピー数測定方法を提供することである。
本発明の染色体、遺伝子および特定ヌクレオチドのコピー数を測定するための、分析キットおよび方法によれば、染色体の変化を分析する場合において、時間と必要とされるマンパワーを著しく節減させることができるうえ、特定遺伝子のコピー数を決定する場合において、他の分子的方法に比べてより正確な値を得ることができる。それゆえ本発明の方法は公知の方法に比べて、染色体または遺伝子の増幅および欠失を容易に判別することができる。
図１は、正常の検体試料ＤＮＡを単独で分析したときと、正常の検体試料ＤＮＡとホモ接合ＤＮＡとの１：１混合物を分析したときの、各アレルの相対的シグナル強度を示す図である。 図２は、一つのアレルに欠失がある場合の、各アレルの相対的シグナル強度を示す図である。 図３は、本発明の実験過程と分析方法を模式化して示す図である。 図４は、ホモ接合細胞株としての胞状奇胎（ｈｙｄａｔｉｄｉｆｏｒｍ ｍｏｌｅ）細胞株ＤＮＡとダウン症候群患者のＤＮＡとの１：１混合物を用いることによってコピー数を分析した場合の、ＳＮＰアレイの結果を示す図である。 図４は、ホモ接合細胞株としての胞状奇胎（ｈｙｄａｔｉｄｉｆｏｒｍ ｍｏｌｅ）細胞株ＤＮＡとダウン症候群患者のＤＮＡとの１：１混合物を用いることによってコピー数を分析した場合の、ＳＮＰアレイの結果を示す図である。 図５は、ダウン症候群の試料（検体試料）および正常のコントロールＤＮＡ（ホモ接合）とを用いることによってコピー数を分析した場合の、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＳＮＰアレイ（３１７Ｋ Ｄｕｏ）の結果を示す図である。ここで三角形は１番染色体に対するＳＮＰ分析結果を示し、ひし形は２１番染色体に対するＳＮＰ分析の結果を示す。 図６は、試料としてダウン症候群ＤＮＡ（１番染色体および２１番染色体）を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ ＳＮＰアレイ（３１７Ｋ Ｄｕｏ）分析を行った後の、シグナル強度比較の結果を示す図である。ここで三角形は１番染色体に対するＳＮＰ分析結果を示し、ひし形は２１番染色体に対するＳＮＰ分析の結果を示す。 図７は、ダウン症候群ＤＮＡ（１番染色体および２１番染色体）を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ ＳＮＰアレイ（３１７Ｋ Ｄｕｏ）分析を行った後の、各ＳＮＰ毎のシグナル比を示す図である。三角形は１番染色体に対するＳＮＰ分析結果を示し、ひし形は２１番染色体に対するＳＮＰ分析の結果を示す。
好ましい実施態様の記載
一つの見地では、上記目的を達成するために、本発明は、以下のステップ：（ａ）ホモ接合ＤＮＡを検体試料ＤＮＡと混合する工程；（ｂ）該ＤＮＡ混合物をＳＮＰアレイで分析する工程；そして（ｃ）ホモ接合ＤＮＡからのシグナルと検体試料ＤＮＡからのシグナルとの差異を測定して、染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列のコピー数を決定する工程とを含む、染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列のコピー数測定方法に関する。
具体的には、工程（ａ）におけるホモ接合ＤＮＡは、ホモ接合である限り特に制限無くあらゆる細胞株使用可能であり、本発明の目的に従う限り、例えば単為生殖細胞株あるいは胞状奇胎細胞株に由来したホモ接合体が好ましい。
本明細書中で使用する限り、用語「単為生殖細胞株」（Ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）とは、未受精状態の卵子（ｎ）から発生した２倍体（２ｎ）の細胞株をいい、用語「胞状奇胎細胞株」とは、非正常の胚芽組織塊由来の細胞株であって、ＤＮＡ（２ｎ）が精子（ｎ）のみに由来するものをいう。よって、単為生殖細胞株および胞状奇胎細胞株の全てのＤＮＡは、ホモ接合ＤＮＡである。
本明細書中で使用する限り、ホモ接合体（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）は、前述した 胞状奇胎細胞株または単為生殖細胞株の他に、ハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）またはＢＡＣクローンＤＮＡであり得る。前記ＤＮＡ混合物は、増幅された後、次の工程のＳＮＰアレイに使用される。
本明細書中で使用する限り、用語「増幅」とは、標的配列がさらに合成されるようにするプロセスを意味する。前記増幅過程は、当業界で使用される通常の増幅方法を特に制限なく使用でき、好ましくはＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。このプロセスは試料からの十分なＤＮＡを得るためのものある。一般的に増幅プロセスはアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、合成（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｒ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）、および変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）のプロセスを含む。上述した方法によって試料配列が増幅された後、ＳＮＰアレイに使用される。
本明細書中で使用する限り、用語「試料」とは、生命体から得られる生物学的物質であり、主としてヒト由来の生物学的物質のことをいう。用語「検体試料」とは、染色体、遺伝子あるいは特定ヌクレオチド配列のコピー数を測定しようとする対象となる試料をいう。検体試料として使用可能な試料としては特に制限されるものではないが、好ましくは染色体数の異常または変化があると思われる個体から得た試料でありうる。本発明の好適な実施例では、ダウン症候群に対する試料を検体試料として遺伝子コピー数の変化様相を分析した。
工程（ｂ）は、増幅されたＤＮＡの断片化および標識化の工程であって、前記標識されたＤＮＡをＳＮＰアレイチップ上でハイブリダイズする工程である。この際、ＳＮＰ位置に応じた塩基の種類によって、異なる種類の蛍光物質を標識することが好ましい。ホモ接合ＤＮＡと試料ＤＮＡとの混合物をＳＮＰアレイで分析するとき、２つの異なる細胞型、あるいは塩基が互いに異なる場合の２つの異なる塩基からのアレルによって、シグナル比を得ることができる。欠失あるいは増幅などの染色体異常がある場合には、シグナル比は正常な染色体のそれとは異なる。本発明では、ＳＮＰアレイは当業界で一般に使用されるＳＮＰアレイ法を採用することができ、市販され購入可能なＳＮＰアレイチップ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＳＮＰアレイチップ（１０Ｋ、１００Ｋ、５００Ｋなど）を使用することができる。
本明細書中で使用する限り、用語「一塩基多型（ＳＮＰ）」は、単一ヌクレオチドにおける多型性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）である。すなわち、ある集団において、ゲノムにある一つの塩基が染色体毎に異なる場合が存在するが、典型的には、ＳＮＰは３００〜１０００個の塩基に約１個存在し、ヒトゲノムＤＮＡ全体には少なくとも３００万個のＳＮＰが存在する。
ＳＮＰは、プロモーター領域などの転写活性の調節に関係する領域に存在するｒＳＮＰ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＳＮＰ）、エクソン部分でアミノ酸変位を起こすｃＳＮＰ（ｃｏｄｉｎｇ ＳＮＰ）、イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）領域に存在するｉＳＮＰ（ｉｎｔｒｏｎｉｃ ＳＮＰ）、エクソン部分でサイレンス変異を起こすｓＳＮＰ（ｓｉｌｅｎｔ ＳＮＰ）、およびその他のゲノム領域で現れるｇＳＮＰ（ｇｅｎｏｍｅ ＳＮＰ）などのＳＮＰに分類されるが、これらの例に制限されない。
ヒトゲノムでは、ＤＮＡ配列の９９．９％は共通し、残りの０．１％は配列のバリエーションを含み、これが疾患に対する感受性や薬剤に対する個人応答といった集団内における多様性に関与する。最近、このような感受性または薬物の副作用と直接関連するのがＳＮＰｓであると推測されている。ＳＮＰは、出現頻度が高く、ゲノム上に均等に分布しているため、ＳＮＰは、疾患への感受性または薬剤への個人応答を研究するために用いられうる高信頼性の遺伝子多型である。したがってＳＮＰｓを研究することによって、自然界の遺伝的バリエーションと各種疾患との関係を理解することができ、そして薬剤の感受性または副作用を分析することができる。それゆえこれらのＳＮＰ研究は、遺伝性疾患のさらなるスクリーニングやオーダーメイド治療のデザインのための出発点を提供しうる。
一般的にＳＮＰは、非常に高度に保存された周囲の配列によって定義付けられる。ＳＮＰは通常、一つの塩基が別の塩基のいずれか一つで置換されて起こるが、ヌクレオチドの欠失または重複によっても起こる。特に、アレル頻度が５％以下のＳＮＰのことをレアＳＮＰといい、アレル頻度が５％以上のＳＮＰのことをコモンＳＮＰという。レアＳＮＰは民族別または人種別に異なりうる。レアＳＮＰは、本発明の目的上、一定に定義された集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の定義を人類全体に対して適用するか、特定の集団に限定して適用するかによってその範囲が変化しうる。また一つの集団はコモンＳＮＰとして存在する変異であっても、他の集団ではレアＳＮＰとなることもある。よって、比較対象となる範囲によっては、ある集団でのみレアＳＮＰを示す場合でも、本発明のレアＳＮＰに該当する。前述したように民族または人種に依存して異なって発生するレアＳＮＰは、効果的なアレイを構築するために用いられうる。分析されるべき集団の特異性に基づいて、集団の規模が決定されるべきである。これにより、レアＳＮＰの定義が変化しうることが明らかとなる。このようなＳＮＰプロファイルは特定の集団ひいては全人類の疾患モデルをスクリーニングする際に有用である。
本明細書中で使用する限り、用語「多型性部位（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｉｔｅ）」とは、様々な塩基が発見される遺伝子座のことをいう。通常ＳＮＰは、少なくとも２種のアレルが存在し、一般人において１％以上の出現頻度を示す場合をいう。最も頻繁に発生するアレルの形態を野生型といい、それ程頻繁に現れないアレルの形態を突然変異アレルという。
本明細書中で使用する限り、用語「アレル」は相同染色体上の所定の遺伝子座に存在する同じ遺伝子の異なるタイプをいう。アレルは多型性の一つの型を示すのに使用されることもある。例えば、ＳＮＰの多くは両アレルである。
本明細書中で使用する限り、用語「ＳＮＰアレイチップ」とは、例えば、公知の配列を有するＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡまたはＲＮＡ断片などの核酸をプローブとして、少なくは数百個から多くは数十万個まで配列して付着させることにより、試料ＤＮＡに含まれたＳＮＰの存在の有無を分析することが可能な生物学的マイクロチップをいい、これらはガラス、シリコンまたはナイロンで形成される小さい固形基板上に、等間隔で固定化されている。塩基配列の相補性に応じて、試料に含有されている核酸と表面に固定されたプローブとの間でハイブリダイゼーションがおこる。このハイブリダイゼーションを検出し解釈することにより、試料に含有されている情報を同時に得ることができる。
工程（ｃ）は、ホモ接合ＤＮＡからのシグナル、および検体試料ＤＮＡからのシグナルを測定して、染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列のコピー数を決定する工程である。
シグナルの検出には、一般に当業界で使用する典型的な方法を制限なく採用することができ、例えばレーザー誘起型蛍光検出法、電気化学的検出法、質量検出法または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などを使用することができる。レーザー誘起型蛍光検出法は、試料ＤＮＡに蛍光物質を結合させ、ハイブリダイゼーションの後に蛍光検出機器で反応の結果を検出することにより、光学的にハイブリダイゼーションが行われた否かを決定する方法である。電気化学的検出法では、化学物質の電気化学反応、すなわち電極上での他の化学物質の酸化還元反応を用いて、ハイブリダイゼーションを検出する。質量検出法ではプローブと試料ＤＮＡ間の相互作用を電気信号化して検出する。典型的な例としては、高周波数で振動する水晶上に固定されたキャプチャープローブの重さに依存した振動数の変化を測定する、電気化学水晶振動子マイクロバランス（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｑｕａｒｔｚ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ、ＥＱＣＭ）法などがある。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）とは、タンパク質などの生体物質がセンサーの表面に結合したときのシグナル変化を誘導する現象であって、金属表面に沿って伝播される自由電子の量子化振動などの光学的方法によってプローブ質量の変化から生じるＳＰＲシグナル変化を検出する。この方法は、試料に追加の蛍光物質を標識しなくても質量差からＤＮＡの結合親和度を測定することが可能な方法である。好ましくはレーザー誘起蛍光検出法を用いることができる。
ホモ接合ＤＮＡからのシグナルおよび検体試料ＤＮＡからのシグナルの差異を測定することによって、染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列のコピー数を容易に決定することができる。本発明のコピー数変化測定方法は、増加したコピー数だけでなく、減少したコピー数も決定することができる。すなわち、染色体の重複（例えば、常染色体の場合のトリソミーまたはテトラソミー）による増加的コピー数および染色体の欠失による減少したコピー数を測定することができる。
具体的には、異型のホモ接合アレル（ａｌｔｅｒ ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ ａｌｌｅｌｅ）の場合、言い換えれば、検体試料ＤＮＡのＳＮＰアレルがホモ接合体であるが、その塩基配列がホモ接合細胞株ＤＮＡの塩基配列と異なる場合には、検体試料とホモ接合細胞株のＳＮＰアレルとが互いに異なる。したがって、それぞれのＤＮＡからのＳＮＰシグナルの比（ＳＲ）を測定することにより、コピー数の変化を分析することができる。
例えば、試料ＤＮＡとホモ接合細胞株のＤＮＡとの１：１混合物をＳＮＰアレイに使用すると、それぞれのＤＮＡからのＳＮＰシグナルの比（ＳＲ）は１：１になる。この際、その比率が１：１ではない場合、コピー数の変化があると判断することができる。実験過程でＤＮＡを１：１の比率で混合することが困難な場合には、２種のＤＮＡから得られる全体的なシグナルの比を測定してＳＲを矯正することにより、さらに正確にコピー数の変化を測定することができる。
また、検体試料ＤＮＡがヘテロ接合アレルの場合には、本発明の方法によれば、２種の塩基からのシグナル強度が１：３あるいは３：１の比と確認される。コピー数の変化に依存してこの比は変化しうる。したがって検体試料がヘテロ接合アレルの場合にも、コピー数を決定することができる。
本発明の方法によれば、正常のＤＮＡを単独で分析する公知の方法と比較して、より効率的にコピー数の変化に対する情報を提供することができる。本発明の好適な一実施例によれば、検体試料のみを用いる公知の方法（図６および図７）と比較した場合、ごく少数のＳＮＰを用いる場合でさえも、本発明の方法によれば特定の物質の染色体の増幅や欠失をより容易に、またより正確に検出できる（図５）。
本明細書中で使用する限り、用語「異型のホモ接合アレル（ａｌｔｅｒ ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ ａｌｌｅｌｅ）」とは、検体試料ＤＮＡのＳＮＰアレルがホモ接合体であるが、その塩基配列がホモ接合細胞株ＤＮＡのアレルのそれと異なる場合の、ＳＮＰのことをいう。これは本発明を容易に表現するために本発明者が導入した用語である。
好適な実施態様としては、本発明の方法をレアＳＮＰｓのためのＳＮＰアレイに適用するとき、コピー数の変化情報を得るのにさらに有用である。
例えば、図１および図２に示すように、正常のＤＮＡ試料を単独で分析したときは、ＳＮＰアレイでは、６つのＳＮＰのうち２つのＳＮＰしか使用できない。しかしながらレアＳＮＰのうちホモ接合細胞株のＤＮＡに現れるＳＮＰのみをＳＮＰアレイに用いられるように選択した場合、少ない数のＳＮＰを用いることによってさえも、多くの情報を得ることができる。すなわち、５％の頻度で現れるＳＮＰｓからなるＳＮＰアレイを１００個のＳＮＰの分析に用いた場合、１０個のヘテロ接合ＳＮＰが発見され、これによりコピー数の変化に関する情報を得ることができる。これに対し、１％以下の頻度で現れるレアＳＮＰｓからなるＳＮＰアレイを１００個のＳＮＰを分析するために用いた場合、アレイに存在する９８％以上のヘテロ接合アレルを用いることができるという利点がある。また、出現頻度が低いＳＮＰを全て用いることができる。したがって単為生殖細胞株のうち、レアＳＮＰの多い細胞株を選択し、あるいは別の人種のホモ接合体細胞株を用いることによって、特定領域のコピー数変化をさらに正確に探し出すことができるという利点がある。
このように、本発明のコピー数決定方法は、レアＳＮＰのみからなるＳＮＰアレイに対しては非常に有用でありレアＳＮＰとコモンＳＮＰの両方からなる市販のＳＮＰアレイにも適用可能である。すなわち、市販のＳＮＰアレイを用いて異型のホモ接合アレルを別途分析することにより、コピー数を決定することができる。
本発明の実践には、有機化学、高分子技術、分子生物学（組み換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および免疫学分野ににおける従来の技術および説明が必要であり、これらは当業者に公知である。このような従来の技術としては、例えば、高分子アレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、標識を用いたハイブリダイゼーションの検出などの技術を含む。このような従来の技術および説明は、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）などの標準的実験マニュアル、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｇａｉｔ，１９８４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ，２０００，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に詳細に記述されており、前記文献の全ての内容は、あらゆる目的のために参照をもって本発明に完全に取り込まれる。
本発明で使用するポリマーアレイ合成に適用される技術および方法は、米国特許出願０９／５３６，８４１、ＷＯ００／５５８１６、米国特許５，１４３，８５４、同５，２４２，９７４、同５，２５２，７４３、同５，３２４，６３３、同５，３８４，２６１、同５，４０５，７８３，同５，４２４，１８６、同５，４５１，６８３、同５，４８２，８６７、同５，４９１，０７４、同５，５２７，６８１、同５，５５０，２１５、同５，５７１，６３９、同５，５７８，８３２、同５，５９３，８３９、同５，５９９，６９５、同５，６２４，７１１、同５，６３１，７３４、同５，７９５，７１６、同５，８３１，０７０、同５，８３７，８３２、同５，８５６，１０１、同５，８５８，６５９、同５，９３６，３２４、同５，９６８，７４０、同５，９７４，１６４、同５，９８１，１８５、同５，９８１，９５６、同６，０２５，６０１、同６，０３３，８６０、同６，０４０，１９３、同６，０９０，５５５、同６，１３６，２６９、同６，２６９，８４６および同６，４２８，７５２、ＷＯ９９／３６７６０、およびＷＯ０１／５８５９３に記述されており、前記文献の全ての内容は、あらゆる目的のために参照をもって本発明に完全に取り込まれる。
核酸アレイについては米国特許５，４１２，０８７、同６，１４７，２０５、同６，２６２，２１６、同６，３１０，１８９、同５，８８９，１６５、および同５，９５９，０９８に記述されており、同一の技術がポリペプチドアレイにも適用できる。
本発明はまた、遺伝子発現モニタリング、プロファイリング、ライブラリスクリーニングおよびジェノタイピング（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）技術を意図することができ、遺伝子発現モニタリングおよびプロファイリング方法は、米国特許第５，８００，９９２、同６，０１３，４４９、同６，０２０，１３５、同６，０３３，８６０、同６，０４０，１３８、同６，１７７，２４８、および同６，３０９，８２２に示されている。ジェノタイピングおよびその使用は、Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏｓ．１０／４４２，０２１、同１０／０１３，５９８、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，８５６，０９２、同６，３００，０６３、同５，８５８，６５９、同６，２８４，４６０、同６，３６１，９４７、同６，３６８，７９９および同６，３３３，１７９に示されている。
本発明は、ゲノム試料をＰＣＲを採用するなどの多様なメカニズムによって増幅する。たとえば、ＰＣＲ技術：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｄ．Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，１９９２）；ＰＣＲプロトコール：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｃａｔｉｏｎｓ １，１７（１９９１）；ｐｃｒ（Ｅｄｓ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許４，６８３，２０２、同４，６８３，１９５、同４，８００，１５９、同４，９６５，１８８、同５，３３３，６７５を参照のこと。
ハイブリダイゼーションアッセイの手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２．ｓｕｐ．ｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）；Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｓｍ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，８０：１１９４（１９８３）に記述されている。
ハイブリダイゼーションのシグナル検出の方法は、米国特許５，１４３，８５４、同５，５７８，８３２、同５，６３１，７３４、同５，８３４，７５８、同５，９３６，３２４、同５，９８１，９５６、同６，０２５，６０１、同６，１４１，０９６、同６，１８５，０３０、同６，２０１，６３９、同６，２１８，８０３および同６，２２５，６２５、およびＷＯ９９／４７９６４に記述されている。
本発明は、従来の生物学的方法、ソフトウェアおよびシステムもまた採用しうる。本発明のコンピュータソフトウェア製品としては、典型的には、本発明の方法の論理工程を実行するためのコンピュータで実行可能な命令語を持つ、コンピュータで読み込み可能な記録媒体が挙げられる。適切なコンピュータで読み込み可能な記録媒体としては、プロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープなどが挙げられる。コンピュータで実行可能な命令語は、適切なコンピュータ言語または多様な言語の組み合わせで記載されうる。基本的な生物情報学的方法は、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９７）；Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８）；Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｂａｓｃｉｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０００）およびＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．，２００１）に記述されている。
本発明はまた、プローブデザイン、データ管理、分析および装置作動などの様々な目的のための、多様なコンピュータプログラム製品およびソフトウェアを使用することができる。米国特許５，５９３，８３９、同５，７９５，７１６、同５，７３３，７２９、同５，９７４，１６４、同６，０６６，４５４、同６，０９０，５５５、同６，１８５，５６１、同６，１８８，７８３、同６，２２３，１２７、同６，２２９，９１１、および同６，３０８，１７０を参照のこと。
本発明は、重複と欠失による染色体異常、例えばトリソミー、モノソミーおよび性染色体異常などの診断や、スクリーニングに使用することができる。さらに本発明は、例えばデュシエンヌ型筋ジストロフィーなどの小染色体の欠失による遺伝疾患の診断、そして例えば精神疾患、アルツハイマー病および糖尿病といった様々な原因によって誘導される遺伝的素因のある疾患における、小染色体の変化の検出に有用である。さらに本発明は、癌組織において癌遺伝子と癌抑制遺伝子のコピー数変化、あるいは全般的な染色体の数異常を分析するのにも利用できる。また、個人毎に染色体のコピー数に差異があり、このようなコピー数変異（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）がいくつかの疾患と関連があるという報告がある（Ｉａｆｒａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００４）。それゆえ個人間のコピー数変異の検出にも本発明を用いることができる。特に、本発明の分析方法は、公知の方法に比べて、３ｎよりも大きい増幅を検出するための強力なツールであり、また小染色体領域の効果的な分析方法でもありうる。
以下、本発明を下記の実施例によってさらに具体的に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明の例示に過ぎず、本発明は実施例によって限定されることを意図するものではない。
実施例１．ＳＮＰアレイによる、増加したコピー数の検出
正常の検体試料ＤＮＡを単独で分析し、また正常の検体試料ＤＮＡとホモ接合ＤＮＡとの１：１混合物を分析した後、各アレルの相対的なシグナル強度を示した。正常な検体試料（ｎｏｒｍａｌ）におけるアレルのシグナル強度は、図１の左側に示した。コピー数がトリソミーに変化した場合のアレルの相対的なシグナル強度を、図の右側に示した。ここで各ＤＮＡ鎖の変化を図式化した。検体試料ＤＮＡとホモ接合ＤＮＡの全てのアレルに対する情報を分析した後、さらに本発明の方法に従って、各アレルをＳＮＰアレイで分析した。コピー数の測定が可能な場合をｏで表した。コピー数の測定が不可能な場合をｘで表示した。ｐは、特定のアレルの相対的シグナル強度からはコピー数の増加または減少を決定することはできないが、変化したということは分かる場合であって、全シグナルの強度によって増加または減少を決定できる場合である。
実施例２．ＳＮＰアレイによる、減少したコピー数の検出
各アレルの相対的シグナル強度として一つのアレルの欠失が認められ、この場合の各ＤＮＡ鎖における欠失を分けて図式化した。検体試料のみをもってＳＮＰアレイを実施したとき、一つのアレルの結果からは欠失したことを決定することができず、隣接したアレルの分析によって欠失の可能性を決定することができた。ところが、本発明の方法を用いた場合、各アレルを分析することができ、それによって欠失を決定することができ、さらに以前の方法に比べて分解能が激的に改善されることが分かる（図２）。
実施例３．ホモ接合細胞株としての胞状奇胎細胞株ＤＮＡおよびダウン症候群患者ＤＮＡのＳＮＰアレイ
ホモ接合細胞株としての胞状奇胎細胞株のＤＮＡと、２１番染色体の３コピーを持つダウン症候群患者のＤＮＡのそれぞれとを１：１で混合した後、ＳＮＰアレイを用いてコピー数を分析した。２１番染色体とＸ染色体を除いた場合、ＳＲが１：１、１：３、３：１であることを確認した。２１番染色体はＳＲが２：３、３：２、１：４、４：１であることを確認した。ここでＳＲが２：３または３：２であることは、ダウン症候群患者における２１番染色体が３コピーあることを示している（図４）。
実施例４．ダウン症候群ＤＮＡと正常のコントロールＤＮＡにおけるＩｌｌｕｍｉｎａ ＳＮＰ ａｒｒａｙ
ダウン症候群ＤＮＡと正常のコントロールＤＮＡを試料として用い、これを胞状奇胎ＤＮＡとそれぞれ混合した（１：１）。次いでＩｌｌｕｍｉｎａ ＳＮＰ ａｒｒａｙ（３１７Ｋ Ｄｕｏ）を用いてＳＮＰ分析を実施した。胞状奇胎ではＡＡを示すものを、ダウン症候群ではＢＢを示すもののみを別途分析した。１番染色体および２１番染色体から３００個の対応するＳＮＰｓをそれぞれ抽出して分析した（図５）。その結果、２１番染色体は、ダウン症候群において追加されており（３ｎ）、正常な染色体（２ｎ）である１番染色体とは、コピー数の状態において容易に区別された。
本発明の検出方法の有用性を確認するために、ダウン症候群ＤＮＡ（ホモ接合体としてのコントロールＤＮＡ試料なしで、正常の１番染色体および３ｎ状態の２１番染色体）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＳＮＰアレイ（３１７Ｄｕｏ）の手段によってＳＮＰ分析を実施した。当該分析は、典型的には、シグナル強度を比較する方法や、ＡおよびＢアレルのシグナル強度比を分析する方法によって実施した。本発明の方法と同様に３００個のＳＮＰ結果を抽出した後、それぞれの結果をグラフで示した（図６および図７）。
その結果、正常なコントロール試料との混合なしで、シグナル強度のみから分析する方法（図６）に比べて、本発明の方法（図５）を用いると、染色体または遺伝子の増幅をより簡単に区別することができた。特に、検体試料のみを用いてシグナル強度を分析した場合、２１番染色体のシグナル強度（ひし形で表示）が１番染色体のシグナル強度に比べて増加してはいるが、全般的に変異が大きくてシグナルの区別が容易ではなかった。
また、それぞれのピークからのシグナル強度比を分析した場合（図７）は、その比率の値が０．５より上または下で変動し、それゆえシグナルが増幅したか減少したかを区別するのは難しかった。具体的に、正常の１番染色体の場合、ヘテロ接合の比率の値は０．５付近になるが、２１番染色体（３ｎ）は０．６６および０．３３付近の比率の値を持つ。試料の２１番染色体が増加たか減少したかを区別するのは困難であった（図７）。また、（３ｎではなく）８ｎよりも大きい遺伝子増幅がある場合、あるいは染色体の小さい部位でのみ増幅が起こった場合、バックグラウンドからのシグナルとの区別が難しい。例えば、染色体または遺伝子の増幅が４倍または５倍以上ある場合、比率の値が１または０に近接して分析が難しくなる。
既存の方法が上述の問題を有しているのと比較して、本発明の正常なコントロール群と検体試料との混合物を用いて分析する方法は、染色体の増幅を容易に区別することができ、３ｎよりも大きい増幅でも正確に分析することができ、そして染色体の小さい部位で増幅が起こった場合でも効果的に分析が可能である点で有利である。

Claims (4)

  1. 以下の工程：
    （ａ）ホモ接合ＤＮＡを検体試料ＤＮＡと混合する工程；
    （ｂ）該ＤＮＡ混合物をＳＮＰアレイで分析してＳＮＰシグナルを測定する工程；そして
    （ｃ）該ＤＮＡ混合物からのＳＮＰアレルのシグナル比（ＳＲ）を測定して、検体試料中の染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列中のコピー数変異（variations）を決定する工程
    を含み、ホモ接合ＤＮＡのＳＮＰアレルと検体試料ＤＮＡのＳＮＰアレルとが異型のホモ接合アレルである、検体試料中の染色体、遺伝子または特定ヌクレオチド配列中のコピー数変異の測定方法。
  2. ホモ接合ＤＮＡが単為生殖細胞株または胞状奇胎細胞株のＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. （ａ）工程において、ホモ接合ＤＮＡを検体試料ＤＮＡと１：１の比率で混合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. ＳＮＰアレイがレアＳＮＰを測定するように考案されたＳＮＰアレイであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
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