CN105408479A - 改进的ngs工作流程 - Google Patents

改进的ngs工作流程 Download PDF

Info

Publication number
CN105408479A
CN105408479A CN201480033731.4A CN201480033731A CN105408479A CN 105408479 A CN105408479 A CN 105408479A CN 201480033731 A CN201480033731 A CN 201480033731A CN 105408479 A CN105408479 A CN 105408479A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
mixture
pcr
reaction
dna polymerase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480033731.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张锐
梁诗婷
萧若姗
阿西尼·史密诺夫
杨詠强
其他发明人请求不公开姓名
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wei (shanghai) Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Vela Operations Pte Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vela Operations Pte Ltd filed Critical Vela Operations Pte Ltd
Publication of CN105408479A publication Critical patent/CN105408479A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
    • C12Y302/02027—Uracil-DNA glycosylase (3.2.2.27)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种改进的半自动方法，所述方法允许样品提取核酸、制备PCR和DNA文库的PCR后制备步骤，所述DNA文库用于可实施的下一代测序方法。所述方法以及关于这种方法的额外方面相比非自动的可比的方法更不费力、安全成本更低、试剂更少，并且更不易于受到污染。

Description

改进的NGS工作流程
技术领域
本发明涉及核酸序列分析领域。具体地，本发明涉及关于下一代测序(NGS)的方法和工具。DNA测序是一种用于破译一些人类疾病(所述疾病包含涉及癌症的形成的不同类型的基因)的有力方法。
背景技术
下一代测序(NGS)技术的出现成数量级地降低了测序成本并且显著地增加了通量，从而使全基因组测序成为用于获得关于可被采取临床措施的患者的整体基因组信息的可行方式。DNA测序可被用于确定个别基因、较大基因区域(即，基因或操纵子的簇)、全部染色体或整个基因组的序列。取决于使用的方法，测序可以提供DNA中或从动物、植物、细菌等的细胞或者实际上任何其他基因信息源分离的核苷酸的序列。得到的序列可被分子生物学或遗传学的研究者使用，并且可被用于进一步的科学进程，或者可被医务人员用来做出治疗决策或帮助基因咨询。后两种用途经常在具有个体化治疗或伴随诊断应用的背景中引用。
无论NGS技术提供多大的利益，在NGS技术可以从研究工具变成常规临床实践之前必须充分解决一些挑战。为了诊断目的的NGS技术应当需要尽可能少的手动步骤，包括适当机制以防止被源于临床样品(所述临床样品在给定时间点进行分析)之外的其他来源的核酸材料污染，并且所述方法应当快速并且应当被在临床实验室工作的人员容易地执行。
已经发展了不同NGS技术，其涉及多种物理-化学机制，导致相应核酸序列分析中使用不同方法。这些技术在本技术领域中通常是已知的。最广泛应用的技术是离子半导体(IonTorrent)测序、焦磷酸测序和合成测序(Illumina)。
定义
已经一般性描述了本发明的方法，将更详细地描述所述方法的每个方面。
如本文使用的，被测序的核酸称为目标核酸(或目标)。目标核酸包括但不限于DNA(例如但不限于基因组DNA、线粒体DNA、cDNA等)和RNA(例如但不限于mRNA、miRNA)，等。目标核酸可来源于任何来源(包括天然存在的来源或合成来源)。核酸可以是PCR产物、粘粒、质体、天然存在或者合成库的成员或种类等。本发明不意在限于此点。核酸可以来自动物或病原体来源，包括但不限于哺乳动物(例如人)和微生物(例如细菌、病毒、真菌、寄生物和分枝杆菌)。在某些实施方式中，核酸不是病毒核酸。目标核酸可以从任何体液或组织(包括但不限于血液、唾液、脑脊髓液(“CSF”)、皮肤、毛发、尿液、大便和粘液)获得。目标核酸可还来源于但不限于，环境样品(例如水的样品)、食品样品、或法医样品，所述样品可以是新鲜样品(例如，直接进行核酸提取的活检材料)或者已被处理以便允许存储的样品(例如，被福尔马林固定的和/或石蜡包埋的样品(FFPE样品))。
使用本领域中任何已知方式来制备目标核酸。作为实例，可以根据本领域中公知的技术(见例如Sambrook等的‘Maniatis’)从样品来获得基因组DNA。在获得之后，DNA可以被片段化以便生成具有较短长度的核酸。形成的片段可具有数百、数千或数万个核苷酸的长度数量级。在某些实施方式中，片段具有50-1000个核苷酸长度、100-1000个核苷酸长度、200-1000个碱基对长度或300-800个碱基对长度，而它们并不限于这些长度。核酸可以通过任何方式片段化，包括但不限于机械、酶促或化学方式。实例包括剪切、超声处理、雾化和核酸内切酶(例如，脱氧核糖核酸酶I)消化或者本领域中已知的任何其他技术，以便产生核酸片段(优选地具有期望长度的片段)。片段化之后可以是大小选择技术，用于将具体长度的片段富集或分离。这种技术在本领域中也是已知的，并且包括但不限于凝胶电泳或SPRI。
可选地，可以使用已经具有期望长度的目标核酸。这种目标核酸包括来源于外显子富集方法的那些核酸，对于在测序之前分离和/或富集序列(例如外显子)的方法，参见Albert等NatMeth4(11)：903-905(2007)、Porreca等NatMeth4(11)：931-936(2007)、Okou等NatMeth4(11)：907-909(2007)。因此，除了片段化(随机地或非随机地)较长的目标核酸，目标可以是天然存在的或可被以较短的可用长度分离的核酸，例如mRNA、cDNA、外显子、PCR产物(如上面描述的)等。
通常，目标核酸在5′和3′端中的一端或两端连到序列。这些接头序列包括测序引物位点(即，测序引物将杂交到的位点)，所述测序引物位点将被用于本发明的测序方法中。
在某些实施方式中，如下面论述的，进行扩增的目标具有相同或类似长度(例如，目标之间5-10％的变化)。在某些实施方式中，这种变化可以保持得尽可能小，以便确保均匀地施加所有模板。
扩增的产物能够以多种方式固定到支持物表面(例如，玻璃表面)。例如，扩增方法可以在溶液中执行并且最终产品随后连接到支持物表面。扩增产品可以在其5′端或其3′端连接到支持物固体支持物。可以通过杂交连接到核酸(所述核酸被固定到支持物表面)，或者可以通过扩增产品的末端的部分的相互作用与支持物表面上的部分连接。实例包括：使用生物素或双生物素标记的DNA(Margulies等Nature437:376(2005))与链霉亲和素/抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白包被的支持物表面、DIG(地高辛)和抗DIG抗体或抗体片段、荧光素和抗荧光素抗体或抗体片段(Gore等Nature442,836-9(2006))，或者通过使用杂官能交联剂，例如生物素化琥珀酰亚胺基丙酸酯-PEG，所述杂官能交联剂可被例如偶联到胺官能化玻璃并且用于通过链霉亲和素夹心(即，核酸生物素链霉亲和素/抗生素蛋白/中性抗生素蛋白-生物素固体支持物相互作用)来固定化生物素标记的DNA。
模板可被提及为随机固定到表面上。这意味着模板不是基于序列置于固体支持物表面上。然而，它们以确保每个模板都被一个区域(并且因此所述体积)环绕的方式置于固体支持物上，在聚合酶介导的掺入反应和/或在模板的延伸期间所述区域将不会被另一个模板占据。也就是说，在一些情况下，模板彼此以足够距离定位在表面上以便防止模板之间的任何相互作用。
固体支持物是指模板结合或固定的元件，其可包括任意材料，然而，只要所述材料对于模板、引物、聚合酶、dNTP和在测序反应和清洗中使用的其他组分来说相对惰性，所述材料包括但不限于玻璃或其他硅基材料、塑料或其他聚合物基材料。固体支持物可以是或者可以不是刚性的。它可以是多孔的。它可以是或者可以不是连续的。在某些实施方式中，固体支持物是载玻片。在某些实施方式中，支持物是自身固定到固体支持物上的多个珠子或颗粒(例如微粒)。这种珠子可以是多孔的。支持物可以是筛网。在某些实施方式中，固体支持物本身是探测器或传感器，例如但不限于接触成像器。
应当理解的是，只要多个成员中的每个都与其他成员充分地间隔开以使得模板之间没有发生重叠，那么多个模板(无论相同或者不同)可被拴连到固体支持物。
通常，模板必须在其自由末端连接到可观察(或可检测)的部分。这种部分意在代表模板的自由末端，并且因此其位置和沿着力的方向上的移动指示模板的长度。可观察部分可以是任何数量的部分并且本发明不限于其性质。可观察部分的性质将决定适于观察(或者检测或监测)模板长度的传感器或检测器的类型。在某些重要实施方式中，可观察部分是珠，例如微珠并且甚至更具体地例如磁珠。
部分可以通过多种方法连接到模板，并且采用多种相互作用，包括但不限于非共价相互作用，例如生物素/链霉亲和素、DIG/抗DIG和荧光素/抗荧光素结合对以及共价相互作用，例如本文关于模板(或引物)共价固定到支持物表面所讨论的那些。
固体支持物是流通池的一部分或者邻近流通池。如本文使用的，流通池是腔室，所述腔室具有流体流动通过的至少一个进入端口和至少一个排出端口。取决于用于观察模板的检测系统的位置，模板拴连到其上的固体支持物可以在流通池下方、上方或旁边。固体支持物可以是流通池的壁，包括底部壁、侧壁或顶壁。
应当理解的是，模板的准确和快速测序取决于未掺入的核苷酸从系统去除的程度和速率。因此，快速和完全(或几乎完全)去除未掺入的核苷酸是重要的。微流体系统必须还被设计成使清洗最大化，从而潜在地导致更小的清洗体积和清洗持续时间。
还可通过三磷酸腺苷双磷酸酶部分或完全的使用来促进未掺入的核苷酸的清除，所述三磷酸腺苷双磷酸酶降解未掺入的dNTP并且使它们不适于进一步的掺入。三磷酸腺苷双磷酸酶可以自由流动，添加到清洗缓冲液，并且一旦任何给定核苷酸三磷酸盐类型的掺入(如通过可检测部分在模板的端部处的任何上述背景运动的中断所指示)停止就导入流通池中。可选地或另外地，三磷酸腺苷双磷酸酶可以固定或固定化在流通池内，例如固定或固定化到固体支持物表面(模板也固定或固定化到所述固体支持物表面)。这可以通过使用接头形成，以便使酶更易获取并且去除关于非常接近表面的任何位阻。三磷酸腺苷双磷酸酶可以连接到长度不同的多种接头。以此方式，三磷酸腺苷双磷酸酶可以存在于流通池内的多种流动流中，所述多种流动流包括那些更接近于壁的流动流和那些更接近于或位于中心流动流的流动流。如上面论述的，接近壁的流动流(它低速流动)和在这些流动流中存在的未掺入dNTP不大可能被清除。这些流动流中具有三磷酸腺苷双磷酸酶应当改善这些dNTP的去除。这将增加模板长度改变是新引入到流通池中的dNTP(而非在清洗之后剩余在流通池中的残留和未掺入的dNTP)掺入的结果的可能性。
在本发明的某些方面中，测序方法被称为合成测序反应。这意味着，确定第一核酸的序列需要使用第一核酸作为模板来合成第二核酸。以此方式，通过未掺入dNTP的顺序和数量确定第二核酸的序列，并且第一核酸的序列确定为第一核酸序列的互补序列。本发明的方法通过改变模板的长度而不是通过直接观察dNTP添加到被合成的核酸来检测dNTP掺入。因此，dNTP可以是天然dNTP(即，缺乏任何修饰(包括诸如荧光团的任何外源可观察标记物)的dNTP)。如通过本公开应当清楚的是，本发明的测序方法还需要模板保持完整。本发明的某些方面涉及测序方法，所述测序方法被描述为在没有荧光的情况下或者以非荧光方式来进行。这些表征意味着可以在没有检测荧光的情况下尤其是在没有检测来自每个掺入dNTP的荧光的情况来执行所述方法。因此，这些方法的实施方式可以采用没有通过添加外来荧光团来修饰的天然dNTP。然而，这些表征不排除缀合到模板的自由末端的可观察部分自身发出荧光的可能性。在后一种情况下，可以通过可观察部分的荧光而不是来自单个掺入dNTP的任何荧光来可视化模板长度的改变。
类似地，还应当理解的是，本文提供的测序方法能够通过检测可观察部分本身(例如，可以通过CMOS接触成像器来进行)来检测核苷酸的掺入。因此，在某些实施方式中，可观察部分直接检测而无需酶介导事件。酶促检测的核苷酸掺入的实例是与释放的无机焦磷酸盐的硫酸化酶和荧光素酶介导的检测偶联的焦磷酸测序(见Leamon和RothbergChemicalReviews“CrammingMoreSequencingReactionsontoMicroreactorChips”，2006)。因此，本发明的方面被称为非酶促方法(或者被称为以非酶促方式检测核酸掺入)，因为可以在没有酶生成的信号的情况下检测核酸掺入。
在各种实施方式中，特别关注的分析物是氢离子，并且根据本公开的大规模ISFET阵列具体配置成测量pH值。在其他实施方式中，监测的化学反应可与DNA合成过程或者其他化学和/或生物过程相关，并且chemFET阵列可具体地配置成测量pH值或者一个或多个其他分析物，所述一个或多个其他分析物提供关于所关注的具体化学过程的相关信息。在各种方面中，chemFET阵列使用常规CMOS加工技术来制造，并且具体地配置以促进从整个阵列快速地获取数据(扫描所有像素来获取对应的像素输出信号)。优选的测序系统是IonPGM系统，然而，还可以考虑基于质子检测的其他测序系统。例如，可以选择焦磷酸测序系统和Illumina合成测序。关于分析物检测和测量，应当理解的是，在下面更详细讨论的各种实施方式中，由根据本公开的chemFET阵列测量的一个或多个分析物可包括多种化学物质中的任意物质，所述多种化学物质提供关于所关注的化学过程的相关信息(例如，多个核酸链的结合、抗体到抗原的结合等)。在某些方面中，测量一个或多个分析物的水平或浓度的能力，除了仅检测分析物的存在之外，还提供关于一个或多个化学过程的有价值信息。在其他方面中，仅检测所关注的分析物的存在可以提供有价值的信息。本发明的最优选测序方法涉及IonTorrent′sPGM系统的使用。
在其他方面中，本发明提供了一种用于核酸测序的方法，所述方法包括：将模板核酸片段化以便生成多个片段化核酸，将来自多个片段化核酸中每个的一个链单独地连接到珠子以便生成多个珠子，所述多个珠子每个都具有连接到其上的单链片段化核酸，将多个其上连接有单链片段化核酸的珠子递送到chemFET阵列(所述阵列对于区域中每个传感器具有分开的反应腔室)并且其中在每个反应腔室中仅设置一个珠子，并且在多个腔室中同时执行测序反应。
本发明考虑在相同流通池内或在相同固体支持物上同时执行多个不同测序反应。每个测序反应生成关于固定到固体支持物上的一个模板的信息。可以在一次运行中测序的模板数目将取决于模板的期望长度和固体支持物的区域。因此，取决于所述实施方式，至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或者至少1000个模板可以固定在固体支持物上并且因此同时测序。在另外一些其他实施方式中，100-500、100-750、100-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-10000或者更多模板可以同时排序。表格1示出了固体支持物可以配置成每2.8μm珠子具有1.6个像素。
通过将dNTP掺入成新合成的核酸链来执行测序反应，所述新的合成核酸链杂交到模板。新合成的链可源于引物，所述引物结合到模板或者源于其他分子，聚合酶介导的延伸可以从所述其他分子进行。
在一个非限制性示例中，测序反应可以通过使模板与引物在允许它们杂交的条件下接触开始，并且使模板/引物杂交物与聚合酶接触。这种接触可以在固化到固体支持物之前、期间和/或之后进行。在重要实施方式中，它在固定化到固体支持物之后进行。
一旦引物和聚合酶被结合到模板，试剂的重复循环流动进入并且穿过流通池。当试剂流包含与引物3′端的直接下游的模板上的核酸互补的核苷酸时，聚合酶将掺入dNTP。如果模板上的连续下游位置被相同核苷酸占据(本文称为均聚物)，那么聚合酶将掺入相同数量的互补dNTP。当流动的dNTP不与模板上的下一个可用核苷酸互补时，这种掺入将停止。流动的dNTP的量和这种流动的时间将相应地超过模板上的互补碱基的量和掺入所有可能dNTP所需的时间。
重要地，互补dNTP的掺入在多于一个结合的引物处发生。更优选地，结合引物的至少10％、至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者全部发生掺入。引物的百分比可取决于模板中目标拷贝的数量。对于某些实施方式，每个单独模板至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个或者更多引物发生掺入。应当理解的是，本发明考虑在给定模板上掺入与杂交引物一样多的dNTP，以便通过增加发生的长度变化(无论是增加或减小长度)的幅度来增加信噪比。
作为测序反应的一部分，如果dNTP的互补核酸存在于模板核酸上的相同位置处，dNTP将连接到(或者如本文使用的“掺入到”)新合成链的3′(或者，在首先掺入dNTP的情形中，测序引物的3′端)。引入的dNTP的掺入将模板的单链区域转换成双链区域，并且这种转换随后反应出模板在张力下的长度变化。通过确定和监测定位在模板的自由末端处的可观察部分(例如，珠子)的位置来检测长度变化。因此，如果珠子位置在任何给定流穿过之后未改变，那么没有dNTP掺入，并且可以推断流过的dNTP不与模板中的下一个可用核酸互补。如果检测到部分的位置变化，那么流过的dNTP是互补的，并且掺入到新合成的链中。dNTP可以以任何次序流动，只要所述次序是已知的并且优选地在测序运行期间保持恒定。
对于本发明的某些方面，典型测序循环可包括：用清洗缓冲液来清洗流通室(和孔)、对拴连到模板核酸的末端的可观察部分的位置进行测量、在聚合酶存在的情况下将第一dNTP种类(例如，dATP)引入到流通室中、测量可观察部分的位置、使三磷酸腺苷双磷酸酶任选地在清洗缓冲液中流过、流过清洗缓冲液、在聚合酶存在的情况下引入第二dNTP种类，等等。所述过程持续，直到所有4个dNTP(即，dATP、dDTP、dGTP和dTTP)已流过腔室并且允许掺入到新合成的链。该4核酸循环可以重复任何次数，包括但不限于10次、25次、50次、100次、200次、300次、400次、500次、600次、700次、800次、900次、1000次或者更多次。循环的数目将取决于被测序的目标的长度和再补充反应试剂，尤其是dNTP原液和清洗缓冲液的需要。因此，可以使用本发明的方法来确定的序列长度可以是至少50个核酸、至少100个核酸、至少200个核酸、至少300个核酸、至少400个核酸、至少500个核酸、至少600个核酸、至少700个核酸、至少800个核酸、至少900个核酸，高达并且包括1000个核酸、1500个核酸、2000个核酸或者更多核酸。
适当聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶或者它们的亚基，只要该亚基能够基于模板合成新的核酸链并且从杂交的引物开始。合适的聚合酶亚基的实例是大肠杆菌DNA聚合酶I(其缺少3′到5′核酸切外酶活性)的Klenow片段的外切型。其他适当的聚合酶包括T4外切-、终止子和Bst聚合酶。聚合酶在溶液中可以是游离的(并且可以存在于清洗和/或dNTP溶液中)或者其可以固定到固体支持物、流通池的一个或多个壁、模板或者引物。
应当理解的是，本文提供的测序方法具有一些应用，包括但不限于：确定核酸(或核酸的集合，例如基因组中存在的，包括哺乳动物基因组并且更具体地人类基因组)的部分或完全核酸序列、确定样品中核酸的存在或不存在(如可用于例如诊断和法医方法)、确定核酸是否包括序列突变或变异(例如，包括单核苷酸多态性的等位基因变异)、确定已知核酸是否经历导致生成新种类的突变(例如，可以是导致抗药性微生物的潜在原因)、确定基因修饰的生物体或基因改造的核酸的存在、确定两个样品(例如，正常组织和病变组织)之间是否存在基因差异并且存在何种基因差异、确定何种治疗方案对治疗具有特定状况(如可以通过对象的基因组成确定的)的对象将最有效，以及基因分型(例如，分析一个或多个遗传基因座来确定例如载体状态)。在某些这些实施方式中，使用本发明的方法确定的核酸序列可以与已知或参照序列相比较以便定向获得的序列和/或鉴定两者之间的差异。这可以帮助鉴定基因变异和突变。已知或参照序列可以是先前确定的序列(例如，来自物种的全基因测序)。
本文描述的方法可还被用于帮助鉴定和治疗病情。例如，所述方法可被用于鉴定与具体病情相关的序列或者用于鉴定用于诊断没有具体病情的序列。分析的样品可来自包括人类的对象。病情可以是癌症或传染病。
所述方法还可被用于鉴定与对药剂的阳性反应结合的序列。所述方法可包括：使用本文提供的一个或多个测序方法对DNA(所述DNA来自展示阳性反应的多个对象以及来自对药剂展示阴性反应的多个对象)测序，并鉴定展示阳性反应的多个对象中或者来自展示阴性反应的对象的共有序列(此序列在其他多个对象中不存在)。优选地，所述对象是哺乳动物，并且更优选地是人。
本文描述的方法可以是自动化的使得测序反应通过机器人执行。另外，从检测器或传感器获得的测序数据可以输入个人计算机、个人数字助理、手机、视频游戏系统或电视，以便用户可以远程监测测序反应的过程。
本发明进一步考虑试剂盒，所述试剂盒包括执行扩增和/或测序反应所必须的各种试剂以及根据本文所述方法使用的说明书。
本文提供的方法取决于检测模板中的每个目标拷贝的单个核苷酸。分辨率的限制取决于使用的检测系统的分辨率。
虽然本文描述和阐释了若干个本发明的实施方式，但是所属领域技术人员将会容易地设想多种其他方式和/或结构，所述多种其他方式和/或结构用于执行本文所述功能和/或获取本文所述结果和/或本文所述一个或多个优点，并且这种变型和/或修饰中的每个都应被认为落入本文描述的本发明实施方式的范围内。更通常地，所属领域技术人员将容易理解的是，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置意在是示例性的并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明技术的一种或多种具体应用。所属领域技术人员将会认识到或者仅使用常规实验就能够发现本文描述的本发明的具体实施方式的许多等价实施方式。因此，应当理解的是，之前的实施方式仅通过实例表示并且落入所附权利要求及其等价技术方案的范围内；本发明的实施方式能够以具体描述和请求保护的之外的其他方式来实施。当前公开的本发明的实施方式涉及本文描述的每个个体特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这些特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法并非相互不一致，那么两个或更多个这些特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合也包含在当前公开的本发明的范围内。
所有定义，如本文限定和使用的，应当理解为限于词典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或限定术语的普通含义。
如在说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数对象，除非上下文以其它方式明确规定。
本发明的实施方式
本发明尤其涉及独特的半自动方法，所述方法用于将核酸从样品分离、建立(RT-)PCR反应、基于(RT-)PCR的核酸扩增、PCR后标准化和扩增产品的净化、将PCR扩增产品片段化、与接头连接，特征是具有(A)和(B)中列举的下述步骤：
方法(A)
(a)从样品提取核酸；
(b)在实施(RT-)PCR反应之前，任选地添加尿嘧啶-DNA-转葡糖基酶(UDG)到(RT-)PCR混合物，以便消化交叉和残留的来自之前的扩增反应的污染物；
(c)(RT-)PCR，取决于分离的核酸的类型-即RNA或DNA，使用核苷三磷酸构建块(即，单个核苷酸)-包括A、T、C、G，任选地还包括尿嘧啶；
(d)将RT-PCR中获得的核酸标准化(使用载体结构，例如用于标准化的顺磁性微珠(例如，AxyPrepMagPCRNormalizer，Axygen)，其中所述珠结合具有期望序列长度的核苷酸序列)包括将PCR之后的RT-PCR混合物结合到所述珠，在结合PRC-产物之后彻底清洗微珠，从微珠洗脱PCR扩增产物；
(e)将在步骤(d)中获得的洗脱的PCR扩增产物片段化(剪切)；
(f)将步骤(e)的产物结合到载体结构(例如微珠)，然后清洗和洗脱结合的核酸；
(g)将接头序列(包含允许分配核酸到具体样品(例如，临床样品和患者)的条形码序列)连接到步骤(f)中获得的产物；
(h)净化步骤(g)中使用载体结构(例如之前的步骤(d)和/或(f)中使用的微珠)获得的产物；
(i)使在步骤(h)中获得的产物进行测序反应(例如，使用IonPGM系统)，并且
(j)分析在步骤(i)中获得的测序反应的结果。
方法(B)
(a)从样品提取核酸；
(b)在实施(RT-)PCR反应之前，任选地添加尿嘧啶-DNA-转葡糖基酶(UDG)到(RT-)PCR混合物，以便消化交叉和残留的来自之前的扩增反应的污染物；
(c)RT-PCR，取决于分离的核酸的类型，即RNA或DNA，使用核苷三磷酸构建块(即，单个核苷酸)，包括A、T、C、G，任选地还包括尿嘧啶；
(d)部分消化引物(例如，使用LifeTechnologies的FuPa试剂)；
(e)将接头序列(包含条形码)连接到步骤(d)中获得的产物；
(f)将在RT-PCR中获得的核酸标准化(使用载体结构，例如用于标准化的顺磁性微珠(例如，AxyPrepMagPCRNormalizer，Axygen)，其中所述珠结合具有期望序列长度的核酸序列)包括将PCR的RT-PCR混合物序列结合到所述珠，在结合PRC-产物后彻底清洗微珠，从微珠洗脱PCR扩增产物；
(g)净化从步骤(g)中使用载体结构(例如之前的步骤(d)和/或(f)中使用的微珠)获得的产物；
(i)使在步骤(h)中获得的产物进行测序反应(例如，使用IonPGM系统；IonTorrent)，并且
(j)分析在步骤(i)中获得的测序反应的结果。
上述工作流程方法的独特性允许在从提取核酸用于分析以及最终NGS反应，随后分析结果的过程中需要的时间量减少。UDG的使用极大地降低了用于核酸提取、PCR设置、PCR后纯化步骤、文库制备和NGS的自动系统中污染的风险。使用上述方法的这些步骤的自动化减少了特别是用于诊断应用所需的时间和成本。
惊奇地，注意到，本文描述的创新的替代方法可以用于下一代测序文库的制备。本发明的方法可以用于不同类型NGS-文库的制备，例如用于Illumina测序或用于IonTorrent测序的文库。这种方法可以包含到上面设定的NGS工作流程中。
通常，使用包含适用于这种目的的缓冲液的商购试剂盒来制备NGS库。无论GC含量如何，这些缓冲液特别地优化用于NGS-文库的稳健、高保真的扩增。作为用于制备NGS文库的自动开放系统可容易存在来自之前轮次的PCR扩增子的临床样品污染残留的高风险，一个目标是降低所述风险。为了防止残留污染，将dUTP添加到(RT-)PCR预混混合物。PCR预混混合物的尿嘧啶DNA-脱氢酶(UDG)处理将来自之前轮次的以及可能意外地残留到后续反应混合物中的污染物扩增子去除。尿嘧啶脱氢酶(UDG)是一种酶，所述酶通过水解脱氧核糖与碱基之间的N-糖苷键留下脱嘌呤或脱嘧啶位点(AP位点)而将尿嘧啶从DNA去除。
然而，用于NGS-文库制备的缓冲液(例如，具有PlatinumHighFidelity的SuperScriptTMШ一步RT-PCR系统)通常不适于扩增反应期间的dUTP掺入。惊奇地发现，专门开发用于NGS-文库制备的特异性高保真酶可由常规Taq聚合酶来替代，所述常规Taq聚合酶是非高保真酶。可以使用常规(RT-)PCR缓冲液(例如包含100MmTris-HCl、pH8.3，500mMKCl，15mMMgCl2的缓冲液)。用于制备NGS-文库的方案的这种修饰允许扩增期间的dUTP的掺入。
相应地，在一个方面中，本发明涉及制备NGS文库的方法，所述方法包括在扩增期间掺入uUTP而无需使用专门的高保真PCR缓冲液，但是其中基本上使用适用于PCR的任何DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)。缓冲液和酶的这种相当简单的更换允许引入dUTP和随后用UDG处理从而防止污染物的残留。
进一步，本发明涉及一种方法，所述方法用于消除在使用野生型(重组或天然的)Taq聚合酶掺入dUTP用于制备下一代测序文库的核酸扩增反应中的残留污染(即用于消除包含提取的核酸的试剂混合物的污染，所述提取的核酸应受到分析并且可能潜在地污染源于之前的(RT-)PCR反应的DNA)，所述方法包括下述步骤：
a)将从样品获得的核酸片段化；
b)添加降解酶，所述降解酶适于降解扩增反应混合物中存在的任何污染核酸扩增物；
c)扩增核酸模板以便在dUTP存在的情况下在第一核酸扩增反应中提供第一核酸扩增物；以及
d)灭活所述降解酶。
在用于消除在使用野生型(重组或天然的)Taq聚合酶或其衍生物掺入dUTP用于制备下一代测序文库的核酸扩增反应中的残留污染的上述方法的优选实施方式中，降解酶是UDG。UDG处理通常进行几分钟，例如高达10分钟，优选地高达5分钟。随后，灭活酶，例如通过暴露到大约50℃的温度约5分钟。
在消除在使用野生型Taq聚合酶掺入dUTP用于制备下一代测序文库的核酸扩增反应中的残留污染的上述方法的另一个优选实施方式中，降解酶是UDG，所述Taq聚合酶是重组的或天然的聚合酶。
在消除在使用野生型(重组或天然的)Taq聚合酶掺入dUTP用于制备下一代测序文库的核酸扩增反应中的残留污染的上述方法的优选实施方式中，降解酶是UDG，并且UDG-处理的文库进行下一代测序方法中的进一步步骤，所述步骤包括：
a)将从样品获得的核酸片段化；
b)添加降解酶，所述降解酶适于将扩增反应混合物中存在的任何污染核酸扩增物降解；
c)扩增核酸模板以便在dUTP存在的情况下在第一核酸扩增反应中提供第一核酸扩增物；以及
d)灭活所述降解酶。
用于生成DNA文库或消除上述DNA文库制备过程中的反应混合物的污染的本发明方法的优选实施方式还在权利要求书中描绘。
上述方法(A)和(B)的优选实施方式涉及体外诊断应用，例如在伴随诊断中，其中知晓临床样品中存在的目标核酸(例如，癌基因或来源于病原体如HCV、HIV等的核酸)的序列帮助内科医生为患者选择最有希望的治疗方案，因为某些癌基因的修饰赋予对某些药物的抗药性。
在方法(A)的优选实施方式中，样品是获得的新鲜样品，例如来自患者，优选人患者。样品材料可以是例如血液、血浆、血细胞的亚群，例如T-细胞、脑脊髓液、痰、大便，等。
在方法(A)的优选实施方式中，样品是血浆以便分离其中发现的核酸材料，例如病毒的、细菌的、真菌的或寄生虫衍生的核酸或含有这些核酸的材料(例如，病毒、细菌)等。
在方法(A)的优选实施方式中，样品材料是血浆并且核酸材料来源于病毒，例如HVC、HIV等。当靶向HCV时，关注的区域优选地是NS5B基因区，所述NS5B基因区非常适于鉴定6个主要HCV基因类型以及大量的亚型。HCV基因组的目标区域优选地从核苷酸8616延伸到核苷酸9298，但是只要能够鉴定6个HCV基因型，所述区域可以稍微更长些或更短些。优选的引物结合到HCV基因组的核苷酸8616-8638、8614-8635、9276-9298和9171-9191。引物可包括如所属领域中已知的天然或修饰的核苷酸构建块。
在方法(B)的优选实施方式中，样品是获得的新鲜样品，例如来自患者，优选人患者。样品材料可以是例如血液、血浆、血细胞的亚群，例如T-细胞、脑脊髓液、痰、大便等。在方法(B)的另一个优选实施方式中，样品不是新鲜样品，而是在获得其之后处理过的样品，例如，使用福尔马林固定和/或石蜡包埋(FFPE样品是用于分析各种癌基因的优选样品)。
在方法(B)的另一个优选实施方式中，样品材料是来源于人患者的FFPE-样品，例如来自可被福尔马林固定和/或石蜡包埋的任何组织的样品，例如来源于皮肤、乳腺组织、结肠、肺、肝、肌肉等的样品。在非常优选的实施方式中，样品是皮肤样品，所述皮肤样品用于分析涉及黑色素瘤形成的基因。在该背景中作为目标的优选基因包括下面基因的组中的至少一个或多个：NRAS、AKT3、MAP2KI、GNAll、ERBB4、PIK3CA、FGFR3、KIT、BRAF、CDKN2A和GNAQ。这些基因已知为涉及黑色素瘤的发展并且可包含在相应基因的不同位点处的不同点突变。具体突变的分析允许主治医师选择合适的治疗，因为某些突变已知赋予抗药性，而其他突变是药物有效的(对药物敏感)。
本发明的另一个方面是提供可用作从FFPE组织提取核酸的对照材料的新FFPE细胞系。这些细胞系可携带对应于目标序列的基因信息，例如之前通过转化使用其他方法引入的基因材料。可选地，这些基因可能未被基因修饰，例如，在细胞已经携带关注的目标基因(例如癌基因)时或者在实际测定中目标基因应当不同于靶向的基因时。例如，当测定针对临床样品中的一个或多个癌基因的突变时，FFPE细胞系中被针对的基因可以是管家基因或者非突变的野生型基因。基因系提供可定量量的目标核酸的来源，因为可以选择FFPE细胞系材料的量来匹配个别测定的需要。本发明的细胞系可以提供为用于任何测定的试剂盒的一部分。所述试剂盒可进一步包括适用于核酸的提取、纯化、扩增或其他操作的额外化学试剂，例如引物、缓冲液、酶等。
本文提供的另一个方面是用于DNA文库标准化的方法。在进一步的实施方式中，这些DNA文库用于随后的NGS，所述NGS涉及载体颗粒的使用，例如顺磁微珠。
在之前的方法中，DNA库的标准化需要将在接头连接之前(RT-)PCR反应中获得的片段化DNA扩增产物进行定量和/或大小选择。惊奇地发现，涉及微珠使用的文库制备不需要进行大小选择和/或在先定量，优选微珠是通过Axygen(AxyPrepMAG-PCR-CL-5Kit)或类似产品提供的那些微珠。这些微珠的使用还消除了在核酸扩增和/或接头连接到扩增产物之后仍存在的较短片段。
此外，还惊奇地发现，这样生成的DNA文库的PCR扩增不是必需的，不像在现有技术中的方法中连接后包含接头的文库被再次扩增。
取决于珠的量和所述珠与DNA文库的孵育时间，可以限定结合的DNA的量，因为珠随着时间的推移而被核酸饱和。
本发明的自动核酸提取、扩增和文库制备方法(例如，使用VelaDiagnositic的SentosaSX101平台)允许一般性减少时间、试剂量和成本，并且避免与用于NGS的DNA文库的手动制备相关的风险。
本发明还考虑用于制备基因库的试剂盒。
再进一步，本发明提供一种简化和改进的文库制备方案。如上面所述的，为了获得适当量的核酸用于进一步分析，用于制备在随后的NGS方案中使用的DNA文库的标准化磁珠是非常重要的。为此目的，可以在(RT-)PCR之后使用具有有限结合表面的DNA结合珠用于扩增的核酸的标准化。
进一步，为了获得预定量的DNA用于下面的下一代测序步骤，现有技术方法基本上需要下述步骤：
1)(RT-)PCR
2)使用磁珠和净化缓冲液来净化PCR产物
3)清洗所述珠(例如用乙醇)
4)洗脱结合到磁珠的PCR产物
5)使用标准化磁珠海外标准化缓冲液来将PCR产物标准化
6)清洗所述珠(例如用乙醇)
7)洗脱标准化的PCR产物
标准化磁珠(定义)对RT-PCR缓冲液非常敏感，可能是因为在一步RT-PCR缓冲液中的dTT抑制扩增的DNA产物结合到标准化珠。之前在现有技术方法中执行上述步骤2)到4)是必要的，扩增之后进行上述步骤2)到4)去除RT-PCR混合物中存在的试剂。
惊奇地，本发明人发现，当(RT-)PCR产物暴露于包含用于NGS库制备的标准化磁珠的新的本发明的组合物时，可以省略繁重、耗时并且成本高昂的步骤2)到4)，所述组合物包含溶剂，例如聚乙二醇和碱金属盐，例如NaCl、MgCl等。在某些实施方式中，所述组合物包含例如约2.0到约5.0MNaCl，例如2.0M到约4.0MNaCl，优选地2.5M到约3.5MNaCl，非常优选地约2.5到约3.0MNaCl，并且最优选地本发明缓冲液中的碱金属的浓度为2.5MNaCl。用于用于NGS文库制备的标准化珠的本发明的缓冲液进一步包含约10％到约30％的溶剂，例如约12.5％到约25％、或15.0％到约25％、或17.5％到约22.5％、优选地约20％的溶剂。所述溶剂优选地是聚二乙醇，例如高分子量PEG，例如聚二乙醇(PEG)8000。还可以用其他碱金属盐例如Mg、K等来替换NaCl。在非常优选的实施方式中，用于用于NGS库制备的标准化珠的本发明缓冲液包含约2.5MNaCl和20％聚二乙醇(PEG)8000。
在用于制备NGS库和改进NGS工作流程的本发明的方法中，上述缓冲液直接添加到获得的含有扩增的核酸的RT-PCR扩增混合物。本发明的缓冲液优选地以2:1到1:2的比例添加到扩增混合物，并且最优选地，本发明的缓冲液以大约等量(例如1:1)添加到PCR扩增混合物。在非常优选的实施方式中，用于用于NGS库制备的标准化珠的本发明的缓冲液包括约2.5MNaCl和20％聚二乙醇(PEG)8000，以1:1的比例添加到PCR扩增混合物。
可因此有力地减少用于制备用于NGS的文库的时间和步骤。进一步，添加到(RT-)PCR产物的缓冲液非常便宜，特别是，它比净化珠和净化缓冲液便宜的多。
下面列举的示例仅作为示例并且绝不应被理解为对本发明的范围的限制。
实施例
实施例1：使用VelaDiagnostic的自动平台SentosaSX101来制备用于NGS的HCV文库
1.RT-PCR
·将HCV病毒RNA从人血浆和合成的cDNA分离。
在此，使用自动平台SentosaSX101来执行该步骤。
·在实施RT-PCR之前，尿嘧啶-DNA-转葡糖基酶(UDG)添加到RT-PCR混合物以便消除来源于之前测定的潜在污染物。在扩增之前，用UDG在25℃进行扩增子-残留污染物消化4分钟。
2.在RT-PCR之后标准化
参照图1中描绘的工作平台。
制备试剂96-孔板的孔(图1，位置C1)：
·将试剂96-孔板(图1中的TEMP2)的温度设定为15℃；
·将每个样品的每个PCR产物(总共4个)25μL注入限定位置。
·混合5次并且将195μL标准化珠转移到1500μLPCR净化缓冲液(文库制备试剂)；
·混合10次并且转移86μLPCR净化缓冲液(VelaDiagnostics)和标准化珠(Axygen)。混合(文库制备试剂)
到注入PCR产物的限定位置并且混合10次。
·在室温孵育3min；
·转移PCR板到图1平台中B5的磁性托架；
·孵育2min；
·通过吸取40μL3次和50μL1次来丢弃上清液；
·添加100μL80％EtOH到PCR板上的所选孔；
·将PCR板转移到热混合器(TMX)并且以1000rpm摇动2min；
·将PCR板转移回到在图1中位置B5处的磁性托架；
·将TMX的温度控制打开并且设定为56℃；
·孵育2min；
·通过吸取70μL3次和40μL1次来丢弃上清液；
·将PCR板转移到之前设定为56℃的热混合器(TMX)；
·使所述板干燥2min；
·将PCR板转移到位置C1；
·添加35μL洗脱缓冲液(文库制备试剂1A到PCR板)；
·通过吹打混合5次；
·将PCR板转移到热混合器；
·以1400rpm在56℃在热混合器上摇动5min；
·将板转移回到磁板(B5)并且等待2min；
3.剪切
·转移63μL剪切缓冲液(Lifetechnologies)和30μL到限定位置并且混合5次。分别转移80μL混合物到剪切酶(Lifetechnologies)(C4和D4)混合20次。
·转移15μL到限定位置。转移15μL洗脱样品(来自步骤2)到相同限定位置并且混合。
·转移PCR板到热混合器并且孵育12min，在38℃保持13分钟。
4.PCR珠净化
·混合PCR净化珠并且将50μL珠从文库制备试剂转移到限定PCR板孔；
·转移PCR板到TMX并且在26℃以1200rpm摇动3min。
·转移PCR板到位置B5处的磁性托架并且等待2min。
·通过分别吸取70μL和30μL来丢弃上清液；
·添加100μL80％EtOH(文库制备试剂到PCR板)；
·将PCR板转移到TMX并且在26℃以1200rpm摇动2min；
·将PCR板转移到B5处的磁性托架。等待3min；
·通过吸取70μL1次和50μL1次来丢弃上清液；
·通过等待5min来使所述珠干燥；
·将PCR板转移回到位置C1；
·添加28μL洗脱缓冲液(将洗脱缓冲液从文库制备试剂转移到所选PCR板孔)；
·将PCR板转移到TMX并且在26℃以1200rpm摇动2min；
·将PCR板转移到B5上的磁性托架并且等待2min；
5.连接
·从限定的试剂板孔将90μL连接酶缓冲液(Enzymatics)、18μLdNTP、36μLT4连接酶(Enzymatics)、18μLManta聚合酶(Enzymatics)和108μL水转移到另一个限定的管并且混合10次；
·从试剂板限定孔转移另外15μL混合物到另一个限定孔；
·随后，转移10μL条形码接头到相同限定孔。
·将25μL从步骤4洗脱的样品转移到相同限定孔并且混合10次。用25μL矿物油覆盖混合物。
·转移PCR板到TMX并且在26℃孵育10min；
·使温度增加到65℃并且孵育另外5min。
实施例2：AmpliSeqTM文库自动化
使用AmpliSeqTM试剂(Lifetechnologies,Inc.)来制备试剂96-孔板的孔(图1，位置C1)：
使用自动平台SentosaSX101(VelaDiagnostics)的Ampliseq文库自动化
1.PCR
·在位置TEMP2将温度设定为4℃。
·从试剂板中的限定孔转移4μLPCR预混混合物到在其他所选孔中的引物池；
·通过吹打混合10次
·从所选试剂96-板孔分别转移7μLPCR混合物到所选PCR96-孔板孔；
·从限定洗脱板孔分别转移3μLgDNA样品到所选PCR96-孔板孔(总PCR体积＝10μL)；
·手动地密封PCR板并且转移到PCR用于使用下述程序进行扩增：
步骤1:99℃2min
步骤2:99℃15sec
步骤3:60℃4min
重复步骤2(21次)
保持在10℃
·在PCR之后，使PCR板返回到Sentosa平台SX101(图1)上的C1位置；
·将热混合器温度设定为52℃。
2.FuPa反应
·从所选试剂96-孔板孔转移2μLFuPa(Lifetechnologies)到预定PCR96-孔板孔。(使用自动系统转移非常少量的粘性试剂)；
·从限定孔注入10μLPCR产物到包含FuPa试剂的PCR板上的孔并且通过吹打混合5次；
·添加40μL油覆盖物到先前步骤的PCR板孔。(文库制备试剂->PCR板)；
·转移PCR板到TMX并且在52℃以300rpm
摇动10min，57℃摇动10min，并且在62℃摇动20min；
·将PCR板转移回到SX101上的位置C1。
3.连接反应
·从限定的试剂板孔添加4μL转变溶液(Lifetechnologies)到其他限定PCR板孔；
·从限定试剂板孔转移2μL连接酶到另一个限定PCR板孔；
·从限定试剂板孔转移2μL条形码接头到预定PCR板孔；
·从包含文库制备试剂的预定孔添加5μL水到另一个预定PCR板孔；
·添加17μL样品并且通过吹打混合5次；
·从所选PCR板孔转移全部样品到已经包含连接酶的孔并且通过吹打混合5次；
·添加40μL油覆盖物到选定PCR板孔B5。(文库制备试剂到限定PCR板孔)；
·等待20min；
·将热混合器设定为72℃并且再等待10min。
4.珠净化
·通过吹打将标准化珠混合10次；
·将文库制备试剂中10μL标准化珠添加到文库制备试剂中200μL结合缓冲液；
·从TMX转移PCR板到位置C1；
·将热混合器设定为25℃；
·在将100μL珠溶液转移到期望PCR板孔之前，将限定板孔中的珠溶液混合10次；
·从一个选择的PCR板孔转移25μL样品到另一个限定的孔用于结合并通过吹打10次混合；
·等待5min；
·将PCR板转移到TMX；
·在25℃以1200rpm摇动1min；
·孵育4min；
·将PCR板转移到磁性板托架B5并且孵育2min；
·通过吸取50μL2次和20μL1次丢弃上清液；
·将100μL80％EtOH转移到选定PCR板孔；
·将板转移回到TMX并且在25℃以1000rpm摇动1min；
·孵育1min；
·将PCR板转移回到磁板托架B5并且孵育2min；
·通过吸取50μL2次和20μL1次丢弃上清液；
·将板转移回到TMX并且在25℃以1000rpm摇动1min；
·孵育1min；
·将PCR板转移回到磁板保持器B5并且孵育2min；
·通过吸取50μL2次和20μL1次丢弃上清液；
·将TMX设定为58℃；
·将PCR板转移回到TMX以干燥掉EtOH2min；
·将PCR板转移回到位置C1；
·将25μL洗脱缓冲液添加到PCR板所选孔；
·将PCR板转移回到TMX并且以1200rpm摇动2min；
·将PCR板转移到磁板托架B5并且孵育2min；
·从一个限定PCR板孔吸取25μL洗脱样品到另一个限定孔。
与非自动的或者需要更多手动步骤的可比方法相比较，所述方法以及关于这种方法的额外方面更不费力、安全成本更低、试剂更少，并且更不易于受到污染。

Claims (18)

1.一种制备DNA文库的方法，其包括下述步骤：
a)从样品提取核酸，
b)使提取的核酸暴露于混合物，所述混合物包含UDG，DNA聚合酶和任选地逆转录酶，和dUTP，
c)孵育所述混合物以便消除混合物中来源于之前的扩增反应的残留扩增产物的污染，
d)在dUTP存在的情况下执行扩增反应，其中所述去污染反应，任选地逆转录和DNA聚合酶实施的扩增反应在相同反应混合物中执行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA聚合酶是栖热水生菌(Thermusaquaticus,Taq)DNA聚合酶或者其功能衍生物，其中Taq聚合酶的功能衍生物具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少100％的Taq聚合酶的DNA聚合活性。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述提取的核酸在步骤b)之前片段化。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述DNA文库随后用于下一代测序反应。
5.试剂组合物，其包含酶混合物，所述酶混合物包括UDG、DNA聚合酶，任选地逆转录酶。
6.根据权利要求5所述的试剂组合物，其进一步包括dUTP。
7.包含TaqDNA聚合酶或其功能性衍生物的试剂组合物。
8.包含用于逆转录和/或PCR的试剂的试剂组合物。
9.消除用于核酸模板扩增的反应混合物中污染的方法，所述反应混合物包括所述核酸模板、DNA聚合酶、UDG酶和任选地逆转录酶，和dUTP，以及用于DNA聚合反应并且任选地逆转录的试剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述UDG酶灭活一段时间，所述一段时间足以消除混合物中来源于先前扩增反应的残留扩增产物的污染。
11.根据权利要求9和10中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶是栖热水生菌(Taq)DNA聚合酶或其功能衍生物。
12.根据权利要求9到11中任一项所述的方法，其中所述提取的核酸在步骤b)之前片段化。
13.根据权利要求9到12中任一项所述的方法，其中所述DNA文库随后用于下一代测序反应。
14.一种用于制备DNA文库的方法，所述方法包括下述步骤：
a)从样品提取核酸，
b)使提取的核酸暴露于混合物，所述混合物包含DNA聚合酶和任选地逆转录酶，
c)在dUTP存在的情况下执行扩增反应
d)将获得的扩增产物标准化，其中所述标准化方法包括下述步骤：
(ⅰ)添加包含碱金属盐和溶剂的缓冲液组合物到包含扩增产物的扩增混合物，
(ⅱ)添加载体颗粒到包含扩增产物的扩增混合物，
(ⅲ)使所述混合物孵育一段时间，所述时间足以使DNA结合到载体颗粒，
(ⅳ)使用乙醇清洗所述混合物，
(ⅴ)从载体颗粒洗脱标准化的PCR产物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述碱金属盐是NaCl。
16.根据权利要求14和15中任一项所述的方法，其中所述溶剂是聚乙二醇。
17.根据权利要求14到16中的任一项所述的方法，其中以约2.0到约5.0MNaCl，优选约2.5MNaCl的量添加所述碱金属盐。
18.根据权利要求14到17中任一项所述的方法，其中所述溶剂是PEG8000。
CN201480033731.4A 2013-06-13 2014-06-12 改进的ngs工作流程 Pending CN105408479A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13171793 2013-06-13
EP13171793.6 2013-06-13
PCT/IB2014/062174 WO2014199336A2 (en) 2013-06-13 2014-06-12 Improved ngs workflow

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105408479A true CN105408479A (zh) 2016-03-16

Family

ID=51022941

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480033731.4A Pending CN105408479A (zh) 2013-06-13 2014-06-12 改进的ngs工作流程

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20160208240A1 (zh)
EP (1) EP3008182A2 (zh)
JP (1) JP2016520330A (zh)
CN (1) CN105408479A (zh)
AU (1) AU2014279672A1 (zh)
HK (1) HK1222881A1 (zh)
SG (1) SG11201510029UA (zh)
WO (1) WO2014199336A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111247593A (zh) * 2017-08-21 2020-06-05 皇家飞利浦有限公司 使用实时定位系统和下一代测序在健康护理机构中预测、预防和控制感染传播
CN112020564A (zh) * 2018-03-20 2020-12-01 纽亘技术公司 用于线性样品加工的方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2527115A (en) * 2014-06-12 2015-12-16 Vela Operations Pte Ltd Improved NGS workflow
GB201506669D0 (en) * 2015-04-20 2015-06-03 Cambridge Epigenetix Ltd Nucleic acid sample enrichment
US20180243719A1 (en) * 2015-07-23 2018-08-30 Biocartis, Nv Automated sample to ngs library preparation
CN111133135B (zh) * 2017-07-17 2024-04-16 希昆斯生物科学公司 用于高通量测序的快速文库构建
CN113293200B (zh) * 2021-05-28 2022-03-04 北京金匙基因科技有限公司 一种降低或消除二代测序中扩增产物污染的方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0401037A2 (en) * 1989-06-01 1990-12-05 Life Technologies Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US20080299609A1 (en) * 2007-03-12 2008-12-04 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration Uracil-DNA glycosylase of psychrobacter sp. HJ147 and use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2122203C (en) * 1993-05-11 2001-12-18 Melinda S. Fraiser Decontamination of nucleic acid amplification reactions
WO2011019964A1 (en) * 2009-08-12 2011-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods, compositions, and kits for generating nucleic acid products substantially free of template nucleic acid
EP2769007B1 (en) * 2011-10-19 2016-12-07 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0401037A2 (en) * 1989-06-01 1990-12-05 Life Technologies Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US20080299609A1 (en) * 2007-03-12 2008-12-04 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration Uracil-DNA glycosylase of psychrobacter sp. HJ147 and use thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION: "EXPRESS One-Step SuperScript® qRT-PCR Kits", 《HTTPS://TOOLS.THERMOFISHER.COM/CONTENT/SFS/MANUALS/EXPRESS_ONESTEP_MAN.PDF》 *
MARGARET M. DEANGELIS ET AL.: "Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
MARY C. LONGO ET AL.: "Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions", 《GENE》 *
樊代明 主编: "《肿瘤研究前沿》", 31 December 2011, 第四军医大学出版社 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111247593A (zh) * 2017-08-21 2020-06-05 皇家飞利浦有限公司 使用实时定位系统和下一代测序在健康护理机构中预测、预防和控制感染传播
CN111247593B (zh) * 2017-08-21 2023-05-30 皇家飞利浦有限公司 使用实时定位系统和下一代测序在健康护理机构中预测、预防和控制感染传播
CN112020564A (zh) * 2018-03-20 2020-12-01 纽亘技术公司 用于线性样品加工的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20160208240A1 (en) 2016-07-21
HK1222881A1 (zh) 2017-07-14
WO2014199336A2 (en) 2014-12-18
JP2016520330A (ja) 2016-07-14
EP3008182A2 (en) 2016-04-20
WO2014199336A3 (en) 2015-03-26
SG11201510029UA (en) 2016-01-28
AU2014279672A1 (en) 2015-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105408479A (zh) 改进的ngs工作流程
JP7074978B2 (ja) 核酸の正確な超並列定量化
US20220033901A1 (en) Universal sanger sequencing from next-gen sequencing amplicons
US20160251712A1 (en) Sequential Sequencing
JP4481491B2 (ja) 核酸の検出方法
EP2861769A1 (en) Compositions and methods for sensitive mutation detection in nucleic acid molecules
CN110914449B (zh) 构建测序文库
EP3105324B1 (en) Ngs systems control and methods involving the same
CN102628082A (zh) 基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法
CN115261468A (zh) 用于核酸扩增的样品制备
EP3749782A1 (en) Generation of single-stranded circular dna templates for single molecule
CN110869515A (zh) 用于基因组重排检测的测序方法
CN106715692A (zh) 改善的ngs工艺流程
TWI252254B (en) Detection of sequence variation of nucleic acid by shifted termination analysis
US20220145380A1 (en) Cost-effective detection of low frequency genetic variation
CN109971831A (zh) 等位基因核酸富集方法
US10072290B2 (en) Methods for amplifying fragmented target nucleic acids utilizing an assembler sequence
JP2019176860A (ja) アセンブラ配列を利用する断片化された標的核酸の増幅方法
US20190119746A1 (en) Oligonucleotides for selective amplification of nucleic acids
CN117545852A (zh) 用于消耗和/或富集由生物样品制备的文库片段的固体载体和方法
Ladas Hybridization enrichment of subgenomic targets for next generation sequencing
JP2018102252A (ja) 検出キット，及び検出方法
Kumar et al. Characterization of Plant Pathogens through PCR

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Singapore Singapore

Applicant after: Bella medical Singapore Pte Ltd

Address before: Singapore Singapore

Applicant before: VELA OPERATIONS PTE LTD.

COR Change of bibliographic data
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1222881

Country of ref document: HK

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20170718

Address after: Taigu road Shanghai Free Trade Zone No. 78 three floor room 333

Applicant after: Wei (Shanghai) Biological Technology Co. Ltd.

Address before: Singapore Singapore

Applicant before: Bella medical Singapore Pte Ltd

TA01 Transfer of patent application right
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160316

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1222881

Country of ref document: HK