CN105506136A - 一种基于滚环扩增和上转换材料检测microRNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测microRNA的方法和试剂盒：向含microRNA的体系中加入microRNA检测探针，探针末端区域与靶标microRNA以碱基配对的方式结合，再加入T4？DNA连接酶，使探针的3’端和5’端连接起来，形成环状结构；然后加入5’端修饰有生物素的DNA引物，并加入Phi？29？DNA聚合酶，进行滚环扩增；扩增结束后，将链霉亲和素磁珠加入到待测体系中，利用铁磁体钓取后洗脱；随后，将修饰有DNA的上转换材料加入到待测体系中，上转换材料上的单链DNA与磁珠上钓取出的引物DNA以碱基配对结合，孵育后，利用铁磁体将磁珠吸附，洗脱掉未配对结合的上转换材料，留下的磁珠吸附的上转换材料部分作为信号输出；最后，在荧光分光光度计上，使用980nm的激发光激发，得到上转换材料的荧光信号来检测microRNA含量。

Description

一种基于滚环扩增和上转换材料检测microRNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种基于滚环扩增和上转换材料检测microRNA的方法。

背景技术

成熟的微RNA（microRNAs；miRNA，又译小分子RNA）是真核细胞中发现的一类可以对基因表达进行调控的单链的非编码RNA。通常来说，microRNA由大约22个核苷酸组成（核苷酸个数在18-25个不等），在动物、植物和病毒中广泛地通过转录调控基因的表达。microRNA通过与靶标信使核糖核酸(mRNA)特异结合，从而抑制转录后基因表达。研究表明，microRNA调控着一半以上的人类基因，一种microRNA可以拥有上百种目标基因。

由于microRNA在疾病预测中的重要性，microRNA已经成为了新一代的疾病诊断和预测方面的标志物。程序化地定量检测细胞、组织和血液中的microRNA受到了科学家们的极大重视。目前为止，已经发展出了很多检测方法，但都或多或少存在着一些不足。传统的Northern杂交方法灵敏度十分有限，而芯片检测等方法虽然具有通量高的优点，但存在着成本昂贵且依赖大型仪器的配套使用。因此发展新型的microRNA检测方法，能够方便快捷、灵敏有效地检测microRNA，具有十分重要的意义。

滚环扩增信号放大过程因为具有简单稳定、特异性和灵敏度高的优点，目前已被广泛应用于DNA、RNA和蛋白质等的检测中。由于整个过程中复制出大量的DNA链，工作人员通过选择荧光染料（如：SYBRGreenI）对扩增后的DNA双链进行染色，以此作为信号输出。但是，由于扩增前的体系中已存在着双链部分，DNA染料存在着背景较高的问题。

上转换发光材料是一类无机基质及镶嵌稀土掺杂离子组成的具有反斯托克斯性质的材料，能够通过红外光激发，发射紫外光和可见光。由于上转换材料具有近红外长波长激发、传统性强和生物背景小等优点，目前已被广泛应用于生物标记、标识物检测和药物释放等领域。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明基于滚环扩增、磁珠分离和980nm激发上转换材料产生信号，提供一种高灵敏检测microRNAs的方法以及一种用于检测microRNA的试剂盒。

一种用于检测microRNA的试剂盒，包括microRNA检测探针、引物、修饰有DNA的上转换材料以及链霉亲和素磁珠；所述的microRNA检测探针为5’端磷酸化修饰的单链DNA，包括三个区段：5’端区段、3’端区段以及中间区段，microRNA检测探针的3’端区段与靶标microRNA的5’端互补，5’端区段与靶标microRNA的3’端互补；所述的引物为5’端修饰有生物素的单链DNA，其DNA序列与microRNA检测探针的中间区段完全相同；所述的修饰有DNA的上转换材料中，修饰在上转换材料上的DNA的5’端修饰有氨基，其5’端包含3-5个T的重复序列，3’端有21-23个与microRNA检测探针完全互补配对的碱基。

所述的microRNA为let-7a序列。

所述的microRNA检测探针的3’端区段有11个碱基与靶标microRNA的5’端互补配对，5’端区段有11个碱基与靶标microRNA的3’端互补配对。

所述的用于检测microRNA的试剂盒，还包括T4DNA连接酶和Phi29DNA聚合酶。

所述的上转换材料包含镱、钇、铥三种稀土元素，其粒径为40-60nm，激发波长为980nm，发射波长为480nm。

一种利用上述用于检测microRNA的试剂盒检测microRNA的方法，包括如下步骤：

（1）向含靶标microRNA的待测体系中加入microRNA检测探针，microRNA检测探针3’端区段和5’端区段分别与靶标microRNA的5’端和3’端以碱基配对的方式结合；再加入T4DNA连接酶，使microRNA检测探针的3’端和5’端连接起来，形成环状结构；

（2）向待测体系中加入引物和Phi29DNA聚合酶，进行滚环扩增；

（3）将链霉亲和素磁珠加入到待测体系中，利用铁磁体将链霉亲和素磁珠连同扩增后的引物从待测体系中钓取出来，洗脱；

（4）将修饰有DNA的上转换材料加入到待测体系中，修饰有DNA的上转换材料上的单链DNA与链霉亲和素磁珠上钓取出的引物DNA以碱基配对的方式结合，孵育后，利用铁磁体吸附链霉亲和素磁珠，将DNA未参加碱基配对结合的上转换材料洗脱掉；

（5）将链霉亲和素磁珠重新分散在缓冲液中，利用荧光分光光度计检测相应靶标microRNA含量。

上述修饰有DNA的上转换材料是由镱、钇、铥三种稀土元素通过一定的比例合成的无机稀土材料，其上修饰的DNA序列包括两个部分：5’端部分有若干个T的重复序列，3’端有23个与探针序列完全互补配对的碱基。

本发明方法的检测原理是：向含靶标microRNA的待测体系中加入microRNA检测探针，探针末端区域的单链DNA与靶标microRNA以碱基配对的方式结合，再向待测体系中加入T4DNA连接酶，使探针的3’端和5’端连接起来，形成环状结构；然后加入5’端修饰有生物素的DNA引物，并向待测体系中加入Phi29DNA聚合酶，进行滚环扩增；扩增结束后，将链霉亲和素磁珠加入到待测体系中，利用铁磁体钓取后洗脱；随后，将修饰有DNA的上转换材料加入到待测体系中，上转换材料上的单链DNA与磁珠上钓取出的引物DNA以碱基配对结合，孵育后，利用铁磁体将磁珠吸附，洗脱掉未配对结合的上转换材料，留下的磁珠吸附的上转换材料部分作为信号输出；最后，在荧光分光光度计上，使用980nm的激发光激发，得到上转换材料的荧光信号来检测相应靶标microRNA含量。由于microRNA的含量会影响滚环扩增的程度，进而决定体系中被配对的上转换材料的含量，故可以根据体系的荧光强度来衡量体系中的microRNA浓度。本发明的检测方法采取了滚环扩增信号、磁珠钓取富集和上转换材料发光的手段，是一个能灵敏有效检测低浓度microRNA的方法。

本发明具有以下优点和有益效果：

（1）本发明设计的每一个探针都针对一个特定的microRNA序列，具有良好的序列选择性。

（2）使用了滚环扩增的信号放大方法，具有很高的灵敏度，可以用来检测fM级别的microRNA；选取了磁珠钓取洗脱的方法，可以有效地去除背景干扰，保持样品信号的真实性。

（3）由于上转换材料具有近红外长波长激发光激发、生物背景干扰小、荧光信号保真时间长等优点，可以克服磁珠在荧光测量过程中的光散射，利用上转换材料的荧光来作为信号输出具有真实可靠的特点。

附图说明

图1为比色检测microRNA示意图。

图2为针对let-7a的比色检测梯度图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若无特别说明，本发明中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知的常规操作。

实施例1

1.microRNAs检测体系的设计

（1）如图1所示，实施例中所用的microRNAs检测探针来自上海生工公司合成，该探针是针对microRNAslet-7a序列合成的，该microRNAs的序列为：UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU；microRNA检测探针的3’端区段有11个碱基与靶标microRNA的5’端互补配对，5’端区段有11个碱基与靶标microRNA的3’端互补配对，中间区段为单链DNA。探针序列从5’端至3’端为：磷酸化-CTACTACCTCATTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGCATTTCGCAATTTTAACTATACAAC。加入的引物为5’端修饰有生物素的DNA序列，与探针中的一段序列完全相同，引物序列为：生物素-CAACCTACTACCTCATTTGC。另外，修饰在上转换材料上的DNA的特征为5’端氨基修饰的DNA序列，包括两个部分：5’端部分有若干个T的重复序列，3’端有23个与探针序列完全互补配对的碱基，该序列为：氨基-TTTTTTTTTTAAAATTGCGAAATGCTAAACC。

（2）所需达到的检测目标：对于相应靶标microRNA探针能产生很好信号响应。

2.验证探针的灵敏性

（1）连接过程

此反应在1×T4DNA连接酶缓冲溶液中进行，其中，1×T4DNA连接酶缓冲溶液中包含400mMTris-HCl、100mM氯化镁、100mMDTT、5mMATP，且pH=7.6；体系中探针浓度为10nM，37℃孵育2小时，将探针的5’端和3’端连接起来，使之成为环状结构；然后65℃加热10分钟使T4DNA连接酶灭活，再缓慢降至12℃。所用的配方如下：10nM探针、2U的T4DNA连接酶和不同浓度的microRNA。

（2）扩增过程

在之前的反应溶液中加入10μL的样品溶液（样品溶液包括：200nM引物、500μMdNTPs、20U的Phi29DNA聚合酶），在30℃孵育6小时，进行滚环扩增，产生大量5’端带有生物素的单链DNA；然后65℃下加热，10分钟使Phi29DNA聚合酶灭活，再缓慢降至12℃。

3.与磁珠和上转换材料孵育、洗脱过程

取3μL扩增反应后的溶液，加入到1×PBS缓冲溶液的体系中（体系中还包括16mg的链酶亲和素磁珠），在37℃孵育30分钟后，通过磁力架吸附磁珠，使用1×PBS缓冲溶液洗脱3次；将洗脱后的磁珠分散在250μL的1×PBS缓冲溶液中，加入0.01mgDNA标记的上转换材料，37℃孵育30分钟；孵育结束后，用1×PBS缓冲溶液洗3次，保留磁珠弃去上清液，并用1×PBS缓冲溶液补至250μL。

4.荧光检测

荧光测量时，使用980nm的激发器激发，电流为0.75A，使用日本岛津公司的RF-5301荧光仪器在光谱模式下进行检测，扫描的发射波长范围为400-550nm。扫描结果如图2所示。

SEQUENCELISTING

<110>武汉顺可达生物科技有限公司，武汉大学

<120>一种基于滚环扩增和上转换材料检测microRNA的方法

<130>2016

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>未知

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ugagguaguagguuguauaguu22

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<212>DNA

<213>人工序列

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ctactacctcatttgcatttcagtttacggtttagcatttcgcaattttaactatacaac60

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ttttttttttaaaattgcgaaatgctaaacc31

Claims (6)

1.一种用于检测microRNA的试剂盒，其特征在于：包括microRNA检测探针、引物、修饰有DNA的上转换材料以及链霉亲和素磁珠；

所述的microRNA检测探针为5’端磷酸化修饰的单链DNA，包括三个区段：5’端区段、3’端区段以及中间区段，microRNA检测探针的3’端区段与靶标microRNA的5’端互补，5’端区段与靶标microRNA的3’端互补；

所述的引物为5’端修饰有生物素的单链DNA，其DNA序列与microRNA检测探针的中间区段完全相同；

所述的修饰有DNA的上转换材料中，修饰在上转换材料上的DNA的5’端修饰有氨基，其5’端包含若干个T的重复序列，3’端有21-23个与microRNA检测探针完全互补配对的碱基。

2.根据权利要求1所述的用于检测microRNA的试剂盒，其特征在于：所述的microRNA为let-7a序列。

3.根据权利要求2所述的用于检测microRNA的试剂盒，其特征在于：所述的microRNA检测探针的3’端区段有11个碱基与靶标microRNA的5’端互补配对，5’端区段有11个碱基与靶标microRNA的3’端互补配对。

4.根据权利要求2或3所述的用于检测microRNA的试剂盒，其特征在于：还包括T4DNA连接酶和Phi29DNA聚合酶。

5.根据权利要求2或3所述的用于检测microRNA的试剂盒，其特征在于：所述的上转换材料包含镱、钇、铥三种稀土元素，其粒径为40-60nm，激发波长为980nm，发射波长为480nm。

6.一种利用权利要求1所述的用于检测microRNA的试剂盒检测microRNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)向含靶标microRNA的待测体系中加入microRNA检测探针，microRNA检测探针3’端区段和5’端区段分别与靶标microRNA的5’端和3’端以碱基配对的方式结合；再加入T4DNA连接酶，使microRNA检测探针的3’端和5’端连接起来，形成环状结构；

(2)向待测体系中加入引物和Phi29DNA聚合酶，进行滚环扩增；

(3)将链霉亲和素磁珠加入到待测体系中，利用铁磁体将链霉亲和素磁珠连同扩增后的引物从待测体系中钓取出来，洗脱；

(4)将修饰有DNA的上转换材料加入到待测体系中，修饰有DNA的上转换材料上的单链DNA与链霉亲和素磁珠上钓取出的引物DNA以碱基配对的方式结合，孵育后，利用铁磁体吸附链霉亲和素磁珠，将DNA未参加碱基配对结合的上转换材料洗脱掉；

(5)将链霉亲和素磁珠重新分散在缓冲液中，利用荧光分光光度计检测相应靶标microRNA含量。