CN109338014B - Dna循环诱导开启型dna荧光纳米机器人构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种DNA循环诱导开启型DNA荧光纳米机器人构建方法，首次将驱动DNA循环诱导开启型DNA纳米机器人与以DNA为模板原位合成的金属纳米簇结合，构建新型荧光纳米机器人，实现免标记、免修饰及荧光信号诱导性级联增强的功能。本发明多功能纳米机器人的构建未见报道，为功能化DNA纳米机器人理性设计提供了新思路，为荧光成像技术提供了新工具；将该多功能纳米机器人用于目标物的检测未见报道，拓展了功能化DNA纳米机器人的应用，为生物传感技术提供了新思路构建新型免标记、驱动DNA循环诱导开启荧光纳米机器人，提高了纳米机器人的工作效率，实现荧光免标记。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种DNA循环诱导开启型DNA 荧光纳米机器人构建方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
19世纪五十年代，J.D.Watson和F.H.C.Crick在Nature上公开了DNA的双螺旋结构模型，并暗示DNA就是传承生命的遗传模板。1983年，Seeman首次利用DNA构建了核酸纳米结构，表明DNA不仅承载了生命的重要遗传信息，而且还可作为构建纳米材料的元件，从而一门新兴科学——DNA纳米技术产生了(Seeman，2010)。DNA纳米机器人是其中发展最为迅速的方向之一，它是指利用DNA准确的互补配对功能，在特定形式的能量驱动下通过改变碱基排列顺序进而可控地改变DNA的构象，并做出某种机械运动实现能量转移的纳米装置(樊春海和刘冬生，2011)。众所周知，DNA包含A、T、C、G四种碱基种类，赋予了DNA纳米机器人结构多样性；同时由于DNA碱基排列顺序可变、设计灵活，使其设计上具有可编程性；加之DNA特有的碱基互补配对原则，使其具有高度地运动可控性。DNA纳米机器人可以像真正的开关一样捕获、保存和释放目标分子，实现“机器”的功能。目前，结构各异的DNA纳米机器人相继被构建并在许多领域，如药物运输(Bhatia et al.,2011；Douglas et al.,2012；Lee etal.,2012；Amir et al.,2014；Chen et al.2017；Li et al.,2018)、生物成像(Bhatia etal.,2011；Modi et al.,2013；Jungmann et al.,2014；You et al.,2017)和生物传感(Torelli et al.,2014，2018；He et al.,2018)等发挥重要作用，具有十分广阔的应用前景。
HIV现有的检测方法主要包括HIV抗原检测、核酸检测方法。
目前技术方案：
目前构建纳米机器人的方法主要是设计多条线性DNA序列，利用碱基互补原则，通过自组装方式结合成DNA纳米机器人。如果需要对纳米机器人进行表征、示踪或成像，则需对其DNA骨架进行荧光基团标记。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)目前文献报道的DNA纳米机器人的驱动元件，如DNA，不能循环使用，限制了其使用效率；
(2)目前文献报道的DNA纳米机器人的表征、示踪及成像等功能的实现所需的荧光信号需要对其DNA骨架进行荧光基团标记，但价格昂贵，限制了其广泛应用。
解决上述技术问题的难度在于：
如何设计一种新型纳米机器人，使得其开启运行受驱动元件得调控；如何设计一种新型荧光纳米机器人，使得其荧光信号地获得无需标记修饰，且荧光信号得开启和增强受驱动元件得调控。综上，纳米机器人构建原理、荧光纳米机器人构建原理及生物传感器运行原理的创新性设计是解决上述技术问题的难点。
解决上述技术问题带来的意义为：开发新型免标记、免修饰荧光DNA纳米机器人，实现驱动DNA循环诱导开启、无酶介导及荧光信号诱导性级联增强的目标，可为功能化DNA纳米机器人的理性设计提供新思路，为荧光成像技术提供新工具，对于创新和发展智能化DNA纳米机器人具有重要科学意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种DNA循环诱导开启型DNA 荧光纳米机器人构建方法。
本发明是这样实现的，首先是构建一种驱动DNA循环诱导开启型DNA纳米机器人，其构建方法包括：
通过理性设计并借助软件模拟，设计三个不同序列的发卡结构DNA，使其能只在目标DNA存在的情况下，通过链置换反应依次打开，继而相互结合形成稳定的“Y型”结构，并置换目标DNA使其循环使用。
将驱动DNA循环诱导开启型DNA纳米机器人与以DNA为模板原位合成的金属纳米簇结合，构建新型荧光纳米机器人，实现免标记、免修饰及荧光信号诱导性级联增强。
进一步，构建一种驱动DNA循环诱导开启型DNA纳米机器人，其构建方法包括：
以DNA为模板原位合成的金属纳米簇的制备，通过理性设计并借助软件模拟，设计三个不同序列的发卡结构DNA，合成金属纳米簇的双链模板DNA理性设计进入发卡结构DNA中，只在目标DNA存在的情况下形成稳定的“Y型”结构，并置换目标DNA使其循环使用；金属离子在还原剂的作用下，以“Y型”结构为模板，形成金属纳米簇，呈现荧光；并置换目标DNA使其循环使用。
本发明的另一目的在于提供一种所述新型DNA纳米机器人在HIV的检测上的应用，HIV的检测方法包括：一个HIV适配体和Trigger DNA偶联探针和三个不同序列的发卡结构DNA，并将合成金属纳米簇的双链模板DNA理性设计进入发卡结构DNA中，只在目标HIV存在的情况下形成稳定的“Y型”结构；金属离子在还原剂的作用下，以“Y型”结构为模板，形成金属纳米簇，并呈现荧光；并置换目标DNA使其循环使用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
(1)本发明构建了一种新型免标记、驱动DNA循环诱导开启荧光纳米机器人，提高了纳米机器人的工作效率，实现了荧光免标记，为功能化DNA纳米机器人构建提供新思路，为荧光成像技术提供新工具；
(2)本发明首次设计了一个目标链驱动开启型DNA纳米机器人，只有目标DNA存在的情况下，DNA纳米机器人才能驱动开启，且目标DNA能循环利用；
(3)本发明首次将金属纳米簇模板糅合进纳米机器人设计中，首次用无酶链置换反应介导以DNA为模板原位合成铜纳米簇，构建新型DNA荧光纳米机器人，实现免标记、免修饰及荧光信号诱导性级联增强的功能。该多功能纳米机器人的构建未见报道，为功能化DNA纳米机器人理性设计提供了新思路，为荧光成像技术提供了新工具；
(4)本发明首次将DNA荧光纳米机器人用于目标物的检测，拓展了功能化DNA纳米机器人的应用，为生物传感技术提供了新思路。
附图说明
图1是本发明实施例提供的DNA循环诱导开启型DNA荧光纳米机器人构建方法原理图。
图2是本发明实施例提供的DNA纳米机器人的AFM鉴定图。
图3是本发明实施例提供的DNA纳米机器人的荧光光谱鉴定图。
图4是本发明实施例提供的DNA纳米机器人的TEM鉴定图。
图5是本发明实施例提供的基于荧光DNA纳米机器人的HIV的检测方法原理图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
目前文献报道的DNA纳米机器人的驱动元件，如DNA，不能循环使用，限制了其使用效率；DNA纳米机器人表征、示踪及成像等功能的实现所需的荧光信号需要对其DNA骨架进行荧光基团标记，价格昂贵，限制了其广泛应用。
下面结合具体分析对本发明作进一步描述。
本发明实施例提供的新型荧光纳米机器人的构建方法，为DNA链循环诱导开启型荧光DNA纳米机器人的构建；
(1)荧光DNA纳米机器人的理性设计：
通过理性设计并借助DNAMAN软件模拟，一种荧光DNA纳米机器人的构建原理见图1。在本系统中，一个创新性设计的诱导序列(Trigger DNA，SEQ ID NO：1CACAGAAATATTGATGAACGTATGA)被用作识别探针。发卡A、B、 C分别包含铜纳米簇(CuNPs)模板的部分序列，序列信息见Table 1。更重要的是，发卡A DNA序列(Hairpin A，SEQ ID NO：2AATATTGATGAACGTATGAGCGCTCATACGTTTCATACGTTCATCAATATTTC TGTG)、发卡B DNA序列(Hairpin B，SEQ ID NO：3 GTATGAGCGCTCATACGTTCATCACAGAAATATTAACGTATGAGCGCTCATACGTTCAT)、发卡C DNA序列(Hairpin C，SEQ ID NO：4 CGTTCATCACAGAAATATTGATGAACGTATGAAATATTTCTGTGATGAACGT ATGAGCG)被创新性地设计成发卡结构，以锁住部分CuNPs合成模板，并且在3′端具有突出末端，作为立足点，它只有与特异性序列相结合，才能启动链置换反应来打开发卡结构。在有TS存在时，它结合发卡A的立足点，促发第一轮链迁移，打开发卡A，发卡A的5'端随即结合发卡B的立足点，启动第二轮链迁移，打开发卡B；然后，发卡B的5'端结合发卡C的立足点，启动第三轮链迁移，打开发卡C；随后，发卡C的5'端结合发卡A的3'端，形成稳定的“Y 型”DNA结构ABC，同时，置换出TS，继而诱发新一轮的链迁移，实现TS的循环利用。此时，形成的“Y型”DNA中含有完整的CuNPs模板。最终，通过抗坏血酸钠(Ascorbate)的还原作用，Cu2+被还原成Cu0，后者以形成的“Y型” DNA为模板，生成CuNPs，产生显著增强的荧光信号，实现荧光DNA纳米机器人的构建。如下表：
表1使用的寡核苷酸序列
(2)荧光DNA纳米机器人AFM表征：
取5μL实验组的反应液，轻轻滴加到新剥离的云母表面上，静置2min，待其吸附后，用30μL Mg(Ac)2(2mM)溶液轻轻冲洗，压缩氮气彻底吹干，使用原子力显微镜MultiMode 8AFM系统(Bruker)，采用轻巧模式(AC mode) 成像，检测反应液中是否有“Y型”DNA纳米机器人成功组装。实验重复三次。
结果如图2所示，DNA结构完整、边缘清晰、大小均一，结构呈“Y型” (红色方框内)，与预期设计一致，表明DNA纳米机器人原理设计成功，并成功自组装成“Y型”DNA纳米机器人；
(3)荧光DNA纳米机器人荧光光谱分析：
使用荧光分光光度计F-7100(Hitachi)，在室温条件下，在300-400nm范围内记录实验样品的荧光强度，寻找最大激发波长(λex)；在室温条件下，在 500-700nm范围内记录上述实验样品的荧光强度，寻找最大发射波长(λem)。每组样品重复测定3次。
结果如图3所示，构建的DNA纳米机器人的最大激发波长为345nm，最大发射波长为605nm。
(4)荧光DNA纳米机器人荧光TEM表征：
吸取5μL实验组的反应液，滴加到置于吸水纸上的铜网中，避光干燥处理。将铜网取出，应用TEM上样处理，验证金属纳米簇是否成功合成。
结果如图4所示，产物呈圆球状，大小均一，且在水溶液中有很好的分散性，表明合成铜纳米簇的DNA模板成功糅合进DNA纳米机器人设计中，并通过募集DNA作为模板成功合成CuNPs。
(5)基于DNA纳米机器人的荧光传感器的构建：
选取人类免疫缺陷病毒(HIV)为目标物，通过理性设计并借助DNAMAN 软件模拟，一种基于DNA纳米机器人的免标记、免修饰、免DNA提取的荧光传感器对HIV进行荧光检测的原理见图5。在本传感系统中，一个创新性设计得捕获探针复合物，包括HIV适配体和部分互补的诱导序列(Trigger DNA)被用作HIV的识别探针。发卡A、B、C分别包含CuNPs模板的部分序列。更重要的是，发卡A、B、C被创新性地设计成发卡结构，以锁住部分CuNPs合成模板，并且在3′端具有突出末端，作为立足点，且只有与特异性序列相结合时，才能启动链置换反应来打开发卡结构。在只有HIV存在时，它特异性地结合HIV 适配体，释放出Trigger DNA，继而结合发卡A的立足点，促发第一轮链迁移，打开发卡A，发卡A的5'端随即结合发卡B的立足点，启动第二轮链迁移，打开发卡B；然后，发卡B的5'端结合发卡C的立足点，启动第三轮链迁移，打开发卡C；随后，发卡C的5'端结合发卡A的3'端，形成稳定的“Y型”DNA 结构ABC，同时，置换出Trigger DNA，继而诱发新一轮的链迁移，实现Trigger DNA的循环利用。此时，形成的“Y型”DNA中含有完整的CuNPs模板。最终，通过抗坏血酸钠(Ascorbate)的还原作用，Cu2+被还原成Cu0，后者以形成的“Y型”DNA为模板，生成CuNPs，产生显著增强的荧光信号，实现对HIV 的超灵敏检测，免去标记、修饰和DNA提取过程。
下面结合效果对本发明作进一步描述。
1)DNA链循环诱导开启型DNA纳米机器人的制备方法，该方法包括三个不同序列的发卡结构DNA，使其能只在目标DNA存在的情况下，通过链置换反应依次打开，继而相互结合形成稳定的“Y型”结构，并置换目标DNA使其循环使用；
2)DNA链循环诱导开启型荧光DNA纳米机器人的制备方法，该方法包括三个不同序列的发卡结构DNA，并将合成金属纳米簇的双链模板DNA理性设计进入发卡结构DNA中，使其能够只在目标DNA存在的情况下形成“Y型”结构，金属离子在还原剂的作用下，以此结构为模板，形成金属纳米簇，继而呈现荧光。
3)基于荧光DNA纳米机器人的HIV的检测方法，该方法包括一个HIV适配体和Trigger DNA偶联探针和三个不同序列的发卡结构DNA，并将合成金属纳米簇的双链模板DNA理性设计进入发卡结构DNA中，使其能够只在目标HIV 存在的情况下形成“Y型”结构，金属离子在还原剂的作用下，以此结构为模板，形成金属纳米簇，继而呈现荧光，实现对HIV的早期诊断。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种DNA循环诱导开启型DNA荧光纳米机器人构建方法，其特征在于，所述荧光纳米机器人的构建方法包括：
通过理性设计并借助软件模拟，设计三个不同序列的发卡结构DNA，合成铜纳米簇的双链模板DNA理性设计进入发卡结构DNA中，只在Trigger DNA存在的情况下，诱导三个发卡结构通过链置换反应依次打开，相互结合形成稳定的“Y型”结构；并置换Trigger DNA使“Y型”结构循环产生；
将DNA纳米机器人与以DNA为模板原位合成的铜纳米簇结合，铜离子在还原剂抗坏血酸或抗坏血酸钠的作用下，以“Y型”结构为模板，形成铜纳米簇，呈现级联增强的荧光信号，实现无酶、免标记、免修饰及荧光信号诱导型级联增强的目的；
其中，Trigger DNA序列如下：
CACAGAAATATTGATGAACGTATGA；
三个不同序列的发卡结构DNA序列如下：
发卡A DNA序列：AATATTGATGAACGTATGAGCGCTCATACGTTTCA
TACGTTCATCAATATTTCTGTG；
发卡B DNA序列：GTATGAGCGCTCATACGTTCATCACAGAAATATTA
ACGTATGAGCGCTCATACGTTCAT；
发卡C DNA序列：CGTTCATCACAGAAATATTGATGAACGTATGAAAT
ATTTCTGTGATGAACGTATGAGCG。
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