CN115261491A - 一种检测志贺氏菌属的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测志贺氏菌属的方法及其应用。所述方法包括：识别志贺氏菌属基因组序列中富含AT碱基的序列作为目标序列；针对目标序列自动化、高通量地设计特异性引物；设计特定的Tm值计算公式计算反应变性及退火温度，并据此设置核酸扩增反应条件；在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应。本发明靶向传统核酸扩增方法通常需要规避的富含AT碱基的序列，极大地拓宽候选靶标区域；通过基于海量基因组数据的特异性排查，以及针对富含AT区域的Tm值的精确计算，实现双链DNA的局部解链，大大降低了核酸扩增技术中非特异性扩增的可能性。该方法有效地拓展了传统核酸扩增技术的应用范围，显著提升了反应性能。

Description

一种检测志贺氏菌属的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测志贺氏菌属的方法及其应用，所述方法是一种专门针对志贺氏菌属的基因组序列进行核酸扩增的方法。
背景技术
核酸扩增技术(nucleic acid amplification technology，NAAT)是一类分子生物学技术的总称，这类技术通过引物、DNA聚合酶和其它试剂在特定温度下进行反应，实现微量核酸的快速、特异性扩增，可广泛应用于疾病诊断、病原微生物检测、食品安全检测、动植物检疫以及涉及分子克隆的各项应用，如测序、基因克隆、基因操作、等位基因分析、突变检测等。其中聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是最早实现应用的核酸扩增技术，它模仿DNA在体内复制的过程，通过一对特异的寡核苷酸引物与待扩增DNA片段互补，再经过若干个循环的变性、退火、延伸过程，实现DNA片段的指数级扩增。PCR技术由Cetus公司的Mullis于1985年发明，随后Saiki等人将热稳定DNA聚合酶引入PCR反应体系，解决了早期PCR技术因热变性循环过程中DNA聚合酶钝化导致需要不断人工添加聚合酶的缺点，大大提高了核酸扩增效率并使该技术可以实现自动化，自此以后，以PCR为代表的核酸扩增技术得到广泛的推广和应用，也极大的推动了分子生物学的发展。
众所周知，现有核酸扩增技术通常会避开富含GC或AT的区域，其原因在于，这些区域易通过自身互补配对形成发夹环二级结构，从而阻碍引物与模板的结合；即使引物与模板能够勉强结合，也容易影响DNA聚合酶延模板链的延伸，从而导致DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。因此，为了提高反应成功率，传统的核酸扩增技术对扩增区域的碱基组成具有选择偏好性，其引物设计往往集中在GC含量40％～60％的区域，以45％～55％为最适宜，不同扩增技术略有差别，如PCR的引物设计建议G+C含量为40％～60％(见分子克隆实验指南第四版，表7-1引物设计)，LAMP引物设计建议G+C含量为40％～65％(见AGuide to LAMP primer designing(PrimerExplorer V3))。
然而，自然界中生物体的核酸碱基组成差别巨大，如疟原虫基因组AT碱基含量约为82％，周慧琦等研究了2670株细菌和古细菌，发现其基因组GC含量变化范围从14％到75％(周慧琦,2014)。从检测角度讲，现有核酸扩增技术的碱基组成选择偏好性忽略了大量潜在的靶序列，放大了目标对象被成功检出的难度；从基因操作角度讲，该选择偏好性导致相当多的目标序列难以被顺利扩增，从而难以开展进一步分子操作。如能针对传统核酸扩增方法所回避的GC碱基含量、AT碱基含量非均衡域设计适当的引物，避免形成二级结构，同时设置适宜的反应条件，顺利开展核酸扩增实验，将显著增加目标对象被检出的成功率，同时使得更多序列能够被扩增进而方便地实施下游分子操作。
针对GC碱基含量、AT碱基含量非均衡区域开展核酸扩增反应，其关键步骤是引物设计环节。鉴于以上分析，领域内公开发布的种属特异基因(或序列)通常来自于GC含量40％～60％甚至45％～55％的区域，因而无法应用于针对GC、AT碱基含量非均衡区域的引物设计。另外，此类序列中连续存在的GC-rich或AT-rich区，其碱基组成多样性相比其它区域偏弱，又为特异性引物的设计带来额外的困难。因此首先需要提出一套能够针对GC、AT碱基含量非均衡序列进行高通量、自动化、高效率的引物设计算法流程。
除了扩增区域选择和引物设计外，扩增区域和引物的Tm值计算也是扩增过程能否顺利完成的重要影响因素。扩增区域和引物的Tm值通常按照最近邻二态模型进行计算，但是不同研究者及引物生产公司采用的具体计算公式各有不同，如分子克隆实验指南第四版中建议的引物Tm计算公式为Tm＝4×(G,C数)+2×(A,T数)，TaKaRa公司建议的引物Tm计算公式为Tm＝4×(G,C数)+2×(A,T数)+32-2×(总碱基数)；生工生物的引物Tm计算公式为Tm(0.05M Na+)＝59.94+1×(GC的百分含量)-(675/引物序列长度)。对于GC、AT碱基含量非均衡区域而言，应当如何设计模型进行引物Tm值计算，成为确保实验成功的重要因素。
综上所述，领域内亟需发展一种针对传统核酸扩增技术难以涉及的区域的核酸扩增技术，能够高通量、自动化地设计特异性引物，计算其Tm值，并设置适宜的变性温度、退火温度等反应条件，拓展核酸扩增技术的应用范围，提升扩增的特异性，满足核酸检测、分子遗传学研究等多方面的需求。
发明内容
本发明提出了一种创新的核酸扩增方法，并应用于检测志贺氏菌属。该方法以富含AT的核酸序列为扩增目标，进行目标序列识别、引物设计、变性温度及退火温度计算、模板局部解链的核酸扩增等。首先，采用自动化的引物设计流程，充分利用公共数据资源中丰富的基因组序列信息，高通量地设计针对富含AT的目标序列的特异性引物对。其次，拟合了符合富含AT序列特点的Tm值计算公式，可根据理论扩增产物序列及引物的序列长度、碱基组成等因素计算变性温度和退火温度；考虑到富含AT的核酸序列变性温度显著低于GC含量40％～60％以及高GC的序列，因此将计算所得的理论扩增产物序列Tm值作为最低变性温度，在该温度下，能够在不添加任何化学变性剂的前提下，对双链DNA的富含AT区域进行局部解链，进而启动核酸扩增反应。
本发明一方面在引物设计环节引入公共数据资源中的海量基因组数据，进行序列特异性排查；另一方面，在变性温度设置环节有别于传统核酸扩增方法在93～95℃变性温度下打开所有双链结构，而是通过降低变性温度仅打开富含AT序列，从而在源头上极大地减少了非靶向区域发生非特异扩增的可能性。这两方面的设计策略显著降低了核酸扩增反应中常见的非特异性扩增的可能性，在此基础上形成了针对富含AT序列的核酸扩增方法。该方法的引物设计步骤采用C语言和Perl语言编程实现，具有高通量、自动化的特点，整个扩增方法特异性强、成功率高，有效地拓展了传统核酸扩增技术的应用范围，显著提升了反应性能。
本发明中，所述核酸扩增方法包括识别待扩增核酸序列中富含AT碱基的序列作为目标序列；针对目标序列自动化、高通量地设计特异性引物；设计特定的Tm值计算公式计算反应变性及退火温度，并据此设置核酸扩增反应条件；在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应。
具体包括如下步骤：
(1)筛选待扩增核酸序列中富含AT碱基的目标序列；
(2)针对所述目标序列自动化、高通量地设计兼具通用性和特异性的引物；
(3)通过特定公式计算反应变性温度及退火温度，并设置核酸扩增反应条件；即，基于GC的百分含量、引物序列长度、引物对的理论扩增产物序列长度计算反应变性温度及退火温度，并设置核酸扩增反应条件；
(4)在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
本发明中，所述检测志贺氏菌属的方法，具体步骤为：
(1)筛选志贺氏菌属基因组序列中富含AT碱基的目标序列；
(2)针对所述目标序列设计兼具通用性和特异性的引物；
(3)基于GC的百分含量、引物序列长度、引物对的理论扩增产物序列长度计算反应变性温度及退火温度，并设置核酸扩增反应条件；
(4)在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
本发明步骤(1)中，对于待扩增核酸序列，从第一个碱基开始滑动宽度为1000bp的窗口，步长为5～100bp。针对每次窗口所在位置包含的序列计算AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为目标序列。优选地，保留序列AT碱基含量在60-80％的区域作为目标序列。
本发明步骤(1)中，对于志贺氏菌属基因组序列，从第一个碱基开始滑动宽度为1000bp的窗口，步长为5～100bp。针对每次窗口所在位置包含的序列计算AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为目标序列。优选地，保留序列AT碱基含量在60-80％的区域作为目标序列。
本发明步骤(2)中，所述引物的设计方法，包括：(2.1)针对一条目标序列进行单条引物设计，得到候选引物；(2.2)对所述候选引物进行理化性质判定，筛选符合条件的单条引物；(2.3)将步骤(2.2)筛选得到的单条引物组合成引物对；(2.4)对所述引物对进行通用性、特异性的判定；(2.5)输出符合条件的引物对，得到所述特异性引物。
本发明中，可以采用任何能实现高通量的引物设计的编程语言来实现，如可操作性强、速度较快的C、Perl等编程语言实现。
步骤(2.1)中，针对目标序列设计候选引物，候选引物需满足以下条件：a)引物序列长度在20bp～36bp之间；b)AT碱基含量在55％～80％；c)连续GC数≤5；同时记录所述候选引物匹配到目标序列上的位置信息、正负链信息。
其中，优选地，所述AT碱基含量为60％～75％。
其中，所述“连续GC数”是指引物序列中连续碱基G或者连续碱基C的数量，如引物序列AAGGGGGTTCCAGGCATTA(SEQ ID NO：17)中连续GC数为5/2/2。
步骤(2.2)中，对满足上述(2.1)条件的单条引物进行理化性质判定，包含但不限于3’端稳定性、5’端稳定性和/或二级结构稳定性等物理化学性质，保留符合要求的单条引物。
其中，所述“符合要求的单条引物”是指具备3’端稳定性、5’端稳定性和二级结构稳定性的单条引物。
步骤(2.3)中，对上述步骤(2.2)筛选得到的单条引物，根据其匹配到目标序列上的位置信息、正负链信息，将单条引物组合成引物对；引物对的理论扩增产物序列的长度应在200bp～600bp之间。根据公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值；以引物对Tm差值≤3℃，以及引物之间不能发生相互作用为条件，对引物对进行筛选，得到候选引物对。其中，GC的百分含量是指引物中的碱基G和C的个数占引物总碱基个数的百分比；引物序列长度是指引物的碱基个数。
步骤(2.4)中，对步骤(3)得到的候选引物对中的每一条引物做通用性、特异性判定。其中通用性判定指检查引物对是否严格匹配到所有的目标序列(如志贺氏菌的多个菌株基因组)；
特异性判定指检查单条引物是否不能与所有目标序列之外的非目标序列发生特异性匹配，所述非目标序列指除待扩增核酸序列之外的其它核酸序列，所述特异性匹配指不大于2个错配的匹配。
通过通用性和特异性判定的候选引物可进入下一步骤。
步骤(2.5)中，输出符合条件的引物对，即得到所述核酸扩增反应的引物对。
本发明所述步骤(3)中，所述反应变性温度的计算公式为0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/引物对的理论扩增产物序列长度)，记为Tma；其中，GC的百分含量是指引物对的理论扩增产物序列中的碱基G和C的个数占引物对的理论扩增产物序列总碱基个数的百分比。
本发明所述步骤(3)中，所述反应退火温度为上述步骤(2.3)中两条引物的Tm值的平均值，记为Tmb。即，根据公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，将所述Tm值取平均值即为所述反应退火温度，记为Tmb；其中，GC的百分含量是指引物中的碱基G和C的个数占引物总碱基个数的百分比。
本发明所述步骤(3)中，所述核酸扩增反应条件包括：在变性温度下反应5秒，在退火温度下反应5秒，在延伸温度下反应20秒，以上过程重复30-40次。其中变性温度根据需要可在Tma±5℃之间调整；退火温度根据需要可在Tmb±2℃之间调整；延伸温度为72℃。
本发明还提供了所述的方法在用于富含AT区的目标核酸序列进行核酸扩增中的应用。
本发明还提供了如上所述设计方法获得的引物对。
本发明中，所述引物对为：
引物对H：
Shi-F：5’-CGGCAGAACGTTCAAATATGA-3’(SEQ ID NO：9)
Shi-R：5’-CGCAGAAGGATATCCTGATA-3’(SEQ ID NO：10)。
本发明还提供了如上所述的方法在同时检测金黄色葡萄球菌、阪崎克罗诺杆菌、沙门氏菌、小肠结炎耶尔森菌之任意两种及以上组合中的应用。
本发明提供了一种用于诊断志贺氏菌属的试剂及其在检测志贺氏菌属中的应用，所述诊断试剂包括如上所述的引物对。
本发明还提供了一种诊断试剂及其在检测志贺氏菌属中的应用，所述诊断试剂包括如上所述的引物对。
本发明还提供了一种检测志贺氏菌属的系统，所述系统包括：
筛选模块，用于筛选志贺氏菌属基因组序列中富含AT碱基的目标序列；
引物设计模块，其用于针对所述目标序列设计兼具通用性和特异性的引物；
计算模块，用于基于GC的百分含量、引物序列长度、引物对的理论扩增产物序列长度计算反应变性温度及退火温度，并设置核酸扩增反应条件；
扩增模块，用于在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
本发明还提供了一种检测志贺氏菌属的设备，包括：存储器、处理器和扩增模块；所述存储器上存储有计算机程序，当所述计算机程序被所述处理器执行时，实现如上所述方法的步骤1-3；所述扩增模块用于在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
本发明的有益效果在于，本发明靶向传统核酸扩增方法通常需要规避的富含AT碱基的序列，极大地拓展了候选靶标区域；通过基于海量基因组数据的特异性排查，以及针对富含AT区域的Tm值的精确计算，从而对双链DNA进行局部解链，大大降低了核酸扩增技术中普遍存在的非特异性扩增的可能性。该方法有效地拓展了传统核酸扩增技术的应用范围，同时在引物设计通量、反应特异性等方面显著提升了反应性能，可满足核酸检测、分子遗传学研究等多方面的需求。
附图说明
图1为基于本发明的志贺氏菌属(Shigella Castellani)引物对H的核酸扩增反应在适合温度下的实时荧光定量PCR的扩增曲线。
图2为基于本发明的志贺氏菌属(Shigella Castellani)引物对H的核酸扩增反应在适合温度下的实时荧光定量PCR的溶解曲线。
图3为基于本发明的志贺氏菌属(Shigella Castellani)引物对H的核酸扩增反应在适合温度下的琼脂糖凝胶电泳。
图4为基于本发明的志贺氏菌属(Shigella Castellani)引物对H的针对痢疾志贺氏菌为模板的核酸扩增反应分别在81℃(图4A)和82℃(图4B)变性的实时荧光定量PCR的灵敏度。
图5为基于本发明的志贺氏菌属(Shigella Castellani)引物对H的针对福氏志贺氏菌为模板的核酸扩增反应分别在81℃(图5A)和82℃(图5B)变性的实时荧光定量PCR的灵敏度。
图6为基于本发明的志贺氏菌属(Shigella Castellani)引物对H的针对宋氏志贺氏菌为模板的核酸扩增反应分别在81℃(图6A)和82℃(图6B)变性的实时荧光定量PCR的灵敏度。
图7为基于本发明的志贺氏菌属(Shigella Castellani)引物对H的核酸扩增反应分别在81℃(图7A)和82℃(图7B)变性的灵敏度染色结果。
图8为基于本发明的志贺氏菌属(Shigella Castellani)引物对H的核酸扩增反应分别在81℃(图8A)和82℃(图8B)变性的灵敏度凝胶电泳结果。
图9为基于本发明的志贺氏菌属(Shigella Castellani)引物对H的核酸扩增反应在82℃变性温度下核酸扩增特异性检测的染色结果。
图10为基于本发明的阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)不同变性温度下核酸扩增特异性检测的染料显色结果。
图11为基于本发明的阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)94℃变性温度下核酸扩增特异性检测的扩增产物电泳结果。
图12为基于本发明的阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)82℃变性温度下核酸扩增特异性检测的扩增产物电泳结果。
图13为本发明针对肠炎沙门氏菌亚种、金黄色葡萄球菌亚种、小肠结肠炎耶尔森菌、阪崎克罗诺杆菌四种细菌核酸扩增反应的荧光染料染色结果。
图14为本发明针对肠炎沙门氏菌亚种、金黄色葡萄球菌亚种、小肠结肠炎耶尔森菌、阪崎克罗诺杆菌四种细菌核酸扩增反应的琼脂糖凝胶电泳结果。
图15为本发明针对肠炎沙门氏菌亚种、金黄色葡萄球菌亚种、小肠结肠炎耶尔森菌、阪崎克罗诺杆菌四种细菌的核酸扩增反应在81℃变性温度下的特异性检测的SYBRGreen I染料显色结果。
图16为本发明针对肠炎沙门氏菌亚种、金黄色葡萄球菌亚种两种细菌核酸扩增反应的琼脂糖凝胶电泳结果。
图17为本发明针对肠炎沙门氏菌亚种、小肠结肠炎耶尔森菌两种细菌核酸扩增反应的琼脂糖凝胶电泳结果。
图18为本发明针对肠炎沙门氏菌亚种、金黄色葡萄球菌亚种和小肠结炎耶尔森菌三种细菌核酸扩增反应的琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
本发明还提供了一种检测志贺氏菌属的系统，所述系统包括：
筛选模块，用于筛选志贺氏菌属基因组序列中富含AT碱基的目标序列；
引物设计模块，其用于针对所述目标序列设计兼具通用性和特异性的引物；
计算模块，用于基于GC的百分含量、引物序列长度、引物对的理论扩增产物序列长度计算反应变性温度及退火温度，并设置核酸扩增反应条件；
扩增模块，用于在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
实施例1志贺氏菌属(Shigella Castellani)的检测
本发明针对志贺氏菌属(Shigella Castellani)基因组筛选富含AT的序列并设计特异性引物，根据计算的引物Tm和目标序列Tm设置反应条件进行核酸扩增，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在目标序列，进而确定待测样品中是否存在志贺氏菌属。具体步骤如下：
(1)富含AT碱基的目标序列的筛选：
使用2019年8月5号从NCBI的FTP上下载的有完整基因组序列的细菌、古菌和病毒的数据，共2896个全基因组序列。设定集合A，其包含所有志贺氏菌属基因组序列；设定集合B，其包含所有非志贺氏菌属基因组序列。以志贺氏菌属基因组序列作为参考基因组，从基因组第一个碱基开始滑动宽度为1000bp的窗口，步长为50bp；每次滑动前计算一次序列AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为候选目标序列。以上过程采用perl脚本实现。
(2)特异性引物的设计：
根据PCR引物的特性及本发明的需求，设定引物的AT碱基含量为55％～75％、3’端稳定性ΔG<4、5’端稳定性ΔG<3及引物序列长度(20～36bp)等特性参数，同时设定单条引物不能产生发卡结构、自身不能发生相互作用等条件，以步骤(1)中的候选目标序列作为单条引物设计的候选序列，计算得出符合上述设定条件的单条引物。通过公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，并记录每条引物在目标序列上的位置、正负链信息(即来源于正链还是负链)以及引物的长度等信息。
根据单条引物的位置信息进行引物配对，保留同时满足引物对Tm差值<3℃以及引物对扩增区域在200～600bp两个条件的引物对作为候选引物对。
使用比对软件Bowtie，将上一步设计出的候选引物对中的每一条引物分别与集合A中的目标基因组序列和集合B中的非目标基因组进行序列比对。为了保证引物的通用性，当该单条引物与集合A中的目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 0”，即要求该单条引物与目标序列完全匹配；为了保证引物的特异性，当该单条引物与集合B中的非目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 3”，即允许该单条引物与非目标序列有不超过3个错配。系统输出满足条件的引物对，其中引物对的数量可预先设置，在本实施例中引物对的数量预先设置为20。以上高通量、自动化引物设计流程采用C、Perl脚本实现。
程序运行后在AT富集区设计出PCR反应引物对20个，随机选择一个引物组进行有效性验证。所述引物对的序列为：
Shi-F：5’-CGGCAGAACGTTCAAATATGA-3’(SEQ ID NO.9)
Shi-R：5’-CGCAGAAGGATATCCTGATA-3’(SEQ ID NO.10)
所述引物的AT碱基含量分别为57.14％和55％，所述引物对的理论扩增产物序列AT的百分含量为68.66％。
PCR反应变性温度和退火温度的计算：
使用公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算可知引物Shi-F的m＝64.58℃，Shi-R的Tm＝64.51℃，该引物对平均Tm值为64.55℃；使用公式0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/扩增产物序列长度)计算扩增区域变性温度为77.2℃。
(4)核酸扩增反应及结果检测：
核酸扩增反应体系配置如下表1所示。根据计算结果，用实时荧光定量PCR仪确定适用的变性温度及溶解曲线；测试了在适用变性温度下引物针对不同检测对象的特异性；测试了在适用变性温度下的检测限。变性5秒，63.5℃退火5秒，72℃延伸20秒，推荐以上过程重复35次。特异性检测对象清单见表2。
在使用普通梯度PCR仪反应完成后可通过两种方式判定扩增结果，一是加入终浓度25x的SYBRGreen I染料，通过颜色判定扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列；二是对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列。
表1.志贺氏菌属(Shigella Castellani)核酸扩增反应体系
体系 体积(μl) 终浓度
R300MIX(TaKaRaTaq<sup>TM</sup> HS Perfect Mix) 12.5 /
Shi-F/Shi-R(10μM) 1.25+1.25 0.5μM
100％DMSO 0.5 2％
DNA模板 0/1 /
ddH2O Up to 25 /
表2.志贺氏菌属(Shigella Castellani)核酸扩增反应特异性检测对象清单
1.金黄色葡萄球菌 21600 16.福氏志贺氏菌 1.1868
2.金黄色葡萄球菌亚种 1.2465 17.大肠埃希氏菌 10738
3.表皮葡萄球菌 1.4260 18.致病性大肠埃希氏菌 10372
4.马红球菌 1.4262 19.致泻大肠埃希氏菌 10411
5.蜡样芽胞杆菌 1.3760 20.产肠毒素大肠埃希氏菌 10415
6.蕈样芽胞杆菌 21473 21.肠产毒性大肠埃希氏菌 10665
7.单增李斯特菌 21635 22.出血性大肠埃希氏菌 21530
8.英诺克李斯特菌 10417 23.阪崎克罗诺杆菌 21560
9.伊氏李斯特菌 21663 24.小肠结肠炎耶尔森菌 21669
10.肠炎沙门氏菌亚种 1.1859 25.假结核耶尔森菌 53504
11.肠炎沙门氏菌 21482 26.创伤弧菌 21615
12.鼠伤寒沙门氏菌 10420 27.副溶血弧菌 1.1997
13.乙型副伤寒沙门菌 10437 28.弗式弧菌 1.1613
14.痢疾志贺氏菌 1.1869 29.霍乱弧菌 1.8676
15.阴沟肠杆菌 10015 30.宋氏志贺氏菌
实验结果见图1-9，其中1～13分别为金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌亚种、表皮葡萄球菌、马红球菌、蜡样芽孢杆菌、蕈样芽孢杆菌、单核增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、肠炎沙门氏菌亚种、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌，15是阴沟肠杆菌，17～29分别为大肠埃希氏菌(含肉毒梭菌A型基因)、致病性大肠埃希氏菌、致泻大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠产毒性大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌、阪崎克罗诺杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、弗氏弧菌、霍乱弧菌；N：阴性对照；14、16分别为痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌，30为宋氏志贺氏菌。
图1-3展示了本发明针对志贺氏菌属(Shigella Castellani)的核酸扩增反应在适合温度下的实时荧光定量PCR的扩增曲线、溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳结果，其中“81℃”、“82℃”指该变性温度下阳性模板的扩增结果，“NTC”或“N”为其对应的阴性模板扩增结果，“M”指Marker DL2000。图1痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌和宋氏志贺氏菌的阳性模板及阴性模板扩增情况符合预期。图2痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌和宋氏志贺氏菌的溶解曲线均为单一峰，无非特异反应。图3“M”左右两边分别为80℃和81℃变性的扩增电泳鉴定结果，若扩增产物电泳后在217bp处有一条单一的条带，则为阳性；若扩增产物电泳后无条带，则为阴性。
图4-6、7和8展示了本发明针对志贺氏菌属(Shigella Castellani)的核酸扩增反应在81℃和82℃变性温度下的3种检测限检测方法。图4-6及表3，10ng到10fg做10倍稀释，在10ng到10pg范围中，每差10倍，扩增曲线差3圈多些，10pg以下线性差一些。因此，在10pg以上，做标准曲线，可以进行定量测定。图7展示了加入终浓度25x的SYBRGreen I染料后的灵敏度，10ng到10fg做10倍稀释，在10ng到100pg范围中染色结果判为阳性。图8展示了对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，10ng到100pg范围中在217bp处有一条单一的条带，判为阳性。
表3图4-6实时荧光定量PCR灵敏度小结
Figure BDA0003049550920000101
图9展示了本发明针对志贺氏菌属(Shigella Castellani)的核酸扩增反应在82℃变性温度下的特异性检测的SYBRGreen I染料显色结果。若扩增产物呈亮绿色，则为阳性；若扩增产物呈橙色，则为阴性。图9中，阴性对照(N)呈现橙色，为阴性结果，符合预期；13/15分别为痢疾志贺氏菌和福氏志贺氏菌、30为宋氏志贺氏菌，呈现亮绿色，为阳性结果，符合预期，同时，其它细菌基因组DNA模板检测结果均呈阴性，如第1～13、17～29号管所示。所有结果符合预期，提示在82℃变性温度下未产生非特异性扩增或即使产生微量非特异扩增但不足以影响染料法结果判定。
本实施例完美地验证了本方法所提出的，通过降低变性温度对模板序列进行局部解链，能够显著降低非特异性扩增。
实施例2阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)的检测
将本发明引物设计针对的志贺氏菌基因组变更为阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)基因组，筛选富含AT的序列并设计特异性引物，根据计算的引物Tm和目标序列Tm设置反应条件进行核酸扩增，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在目标序列，进而确定待测样品中是否存在阪崎克罗诺杆菌。具体步骤如下：
(1)富含AT碱基的目标序列的筛选：
使用2019年8月5号从NCBI的FTP上下载的有完整基因组序列的细菌、古菌和病毒的数据，共2896个全基因组序列。设定集合A，其包含所有阪崎克罗诺杆菌基因组序列；设定集合B，其包含所有非阪崎克罗诺杆菌基因组序列。以GI号为156932229的阪崎克罗诺杆菌基因组序列作为参考基因组，从基因组第一个碱基开始滑动宽度为1000bp的窗口，步长为50bp；每次滑动前计算一次序列AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为候选目标序列。以上过程采用perl脚本实现。
(2)特异性引物的设计：
根据PCR引物的特性及本发明的需求，设定引物的AT碱基含量为55％～75％、3’端稳定性ΔG<4、5’端稳定性ΔG<3及引物序列长度(20～36bp)等特性参数，同时设定单条引物不能产生发卡结构、自身不能发生相互作用等条件，以步骤(1)中的候选目标序列作为单条引物设计的候选序列，计算得出符合上述设定条件的单条引物。通过公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，并记录每条引物在目标序列上的位置、正负链信息(即来源于正链还是负链)以及引物的长度等信息。
根据单条引物的位置信息进行引物配对，保留同时满足引物对Tm差值<3℃以及引物对扩增区域在200～600bp两个条件的引物对作为候选引物对。
使用比对软件Bowtie，将上一步设计出的候选引物对中的每一条引物分别与集合A中的目标基因组序列和集合B中的非目标基因组进行序列比对。为了保证引物的通用性，当该单条引物与集合A中的目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 0”，即要求该单条引物与目标序列完全匹配；为了保证引物的特异性，当该单条引物与集合B中的非目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 3”，即允许该单条引物与非目标序列有不超过3个错配。系统输出满足条件的引物对，其中引物对的数量可预先设置，在本实施例中引物对的数量预先设置为20。以上高通量、自动化引物设计流程采用C、Perl脚本实现。
程序运行后在AT富集区设计出PCR反应引物对20个，随机选择一个引物组进行有效性验证。所述引物对的序列为：
Cro-F：5’-CGCCATAACTGCATAATCAT-3’(SEQ ID NO：3)
Cro-R：5’-ATAACGAGTTACCGTGCAGA-3’(SEQ ID NO：4)
所述引物的AT碱基含量分别为60％和55％，所述引物对的理论扩增产物序列AT的百分含量为69％。
(3)PCR反应变性温度和退火温度的计算：
使用公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算可知引物Cro-F的Tm＝62.2℃，Cro-R的Tm＝64.5℃，该引物对平均Tm值为63.4℃；使用公式0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/扩增产物序列长度)计算扩增区域变性温度为78.3℃。
(4)核酸扩增反应及结果检测：
核酸扩增反应体系配置如下表4所示。根据计算结果，实验共设3组，分别测试在94℃/90℃/82℃变性温度下引物针对不同检测对象的特异性，核酸扩增反应条件为94℃/90℃/82℃变性5秒，63℃退火5秒，72℃延伸20秒，以上过程重复35次。特异性检测对象清单见表5。
反应完成后通过两种方式判定扩增结果，一是加入终浓度25x的SYBRGreen I染料，通过颜色判定扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列；二是对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列。
表4.阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)核酸扩增反应体系
体系 体积(μl) 终浓度
R300MIX(TaKaRaTaq<sup>TM</sup> HS Perfect Mix) 12.5 /
Cro-F/Cro-R(50μM) 0.25+0.25 0.5μM
100％DMSO 0.5 2％
DNA模板(10ng) 0/1 /
ddH2O Up to 25 /
表5.阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)核酸扩增反应特异性检测对象清单
Figure BDA0003049550920000121
Figure BDA0003049550920000131
实验结果见图10-12，其中1-22分别为金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种、表皮葡萄球菌、马红球菌、蜡样芽孢杆菌、蕈样芽孢杆菌、单核增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、肠炎沙门氏菌亚种、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌(含肉毒梭菌A型基因)、致病性大肠埃希氏菌、致泻大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠产毒性大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌，24-30分别为小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、弗氏弧菌、霍乱弧菌和福式志贺氏菌，N：阴性对照，P：阳性对照(含目的序列的质粒)；23为阪崎克罗诺杆菌。
图10展示了本发明针对阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)的核酸扩增反应在不同变性温度下的特异性检测的SYBRGreen I染料显色结果。若扩增产物呈亮绿色，则为阳性；若扩增产物呈橙色，则为阴性。图10中，当变性温度为94℃/90℃，阴性对照(N)呈现橙色，为阴性结果，符合预期；阳性对照(P)和23号阪崎克罗诺杆菌呈现亮绿色，为阳性结果，符合预期。说明整个反应体系能正常工作。然而，其它细菌基因组DNA模板扩增产物出现大量阳性结果，如变性温度94℃条件下的3、4、10～18、20～22、24、26、27、29、30号，变性温度90℃条件下的3、7、10～18、20～22、24、26、27、29、30号管所示，与预期不符，提示在94℃/90℃变性温度下易产生非特异性扩增，导致结果呈假阳性。当变性温度为82℃，阴性对照(N)呈现橙色，为阴性结果，符合预期；阳性对照(P)和23号阪崎克罗诺杆菌呈现亮绿色，为阳性结果，符合预期。说明整个反应体系能正常工作。同时，其它细菌基因组DNA模板检测结果均呈阴性，如第1～22、24～30号管所示。所有结果符合预期，提示在82℃变性温度下未产生非特异性扩增或即使产生微量非特异扩增但不足以影响染料法结果判定。
图11展示了本发明针对阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)的核酸扩增反应在94℃变性温度下的特异性检测的扩增产物电泳结果。若扩增产物电泳后在291bp处有一条单一的条带，则为阳性；若扩增产物电泳后无条带，则为阴性；若扩增反应产物电泳后在291bp之外出现一条或多条条带，则为非特异扩增所导致的假阳性。图11中，阴性对照(N)无条带，符合预期；阳性对照(P)和23号阪崎克罗诺杆菌在291bp处均有一条清晰条带，符合预期。说明整个反应体系能正常工作。然而，其它细菌基因组DNA模板扩增产物在500bp～2000bp范围内出现多条条带，与预期不符，提示在94℃变性温度下反应体系产生大量非特异性扩增，该结果与图10中染料显色结果一致。
图12展示了本发明针对阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)的核酸扩增反应在82℃变性温度下的特异性检测的扩增产物电泳结果。若扩增产物电泳后在291bp处有一条单一的条带，则为阳性；若扩增反应产物电泳后无条带，则为阴性；若扩增反应产物电泳后在291bp之外出现一条或多条条带，则为非特异扩增所导致的假阳性。图12中，阴性对照(N)无条带，符合预期；阳性对照(P)和23号阪崎克罗诺杆菌在291bp处均有一条清晰条带，符合预期。说明整个反应体系能正常工作。同时，其它细菌基因组DNA模板扩增反应产物大部分无条带，呈阴性结果，如2～6、10、12、13、15～22、26～30号泳道所示；少数模板扩增反应产物电泳后出现极微弱条带，易于与阳性结果区分，如1、7、8、9、11、14、24、25管所示，提示在82℃变性温度下不产生或产生在电泳结果中易于区分的微量非特异性扩增。
综合图10-12及表5可看出，本发明核酸扩增方法针对阪崎克罗诺杆菌的应用具有良好的菌株特异性，即，在本发明提出的反应体系和反应条件下，仅阪崎克罗诺杆菌呈现阳性结果，而非阪崎克罗诺杆菌为阴性结果。值得注意的是，当使用传统PCR方法的变性温度(90℃或者94℃)进行反应时，尽管电泳结果(图11)显示目标检测对象(阪崎克罗诺杆菌，第23泳道)有单一清晰的条带，然而非目标检测对象普遍出现大量非特异性扩增，如第3泳道的表皮葡萄球菌；若使用染料显色法判定检测结果，如图10所示，在90℃和94℃变性条件下，呈现大量假阳性结果，从而无法区分检测对象和非检测对象。在同样的反应体系下，当使用本发明计算生成的变性温度82℃进行反应时，电泳结果(图12)显示目标检测对象(阪崎克罗诺杆菌，第23泳道)有单一清晰的条带，而非目标检测对象少有非特异性扩增发生，即使有，非特异性扩增条带也很微弱，极易与阳性结果区分；若使用染料显色法判定检测结果，如图10所示，在82℃变性条件下，仅目标检测对象(阪崎克罗诺杆菌，23号管)呈阳性结果，非目标检测对象均呈阴性结果，表现出良好的区分性。
实施例3同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结炎耶尔森菌和阪崎克罗诺杆菌
将本发明针对的志贺氏菌基因组变更为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结炎耶尔森菌和阪崎克罗诺杆菌基因组，筛选富含AT的序列并设计特异性引物，根据计算的引物Tm和目标序列Tm筛选引物组合，设置反应条件进行核酸扩增，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在目标序列，进而确定待测样品中是否存在沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结炎耶尔森菌和阪崎克罗诺杆菌中的一种或多种。具体步骤如下：
(1)富含AT碱基的目标序列的筛选：
使用2019年8月5号从NCBI的FTP上下载的有完整基因组序列的细菌、古菌和病毒的数据，共2896个全基因组序列。设定集合A，其包含所有沙门氏菌基因组序列；设定集合B，其包含所有非沙门氏菌基因组序列。沙门氏菌基因组序列作为参考基因组，从基因组第一个碱基开始滑动宽度为1000bp的窗口，步长为50bp；每次滑动前计算一次序列AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为候选目标序列。以上过程采用perl脚本实现。
(2)特异性引物的设计：
根据PCR引物的特性及本发明的需求，设定引物的AT碱基含量为55％～75％、3’端稳定性ΔG<4、5’端稳定性ΔG<3及引物序列长度(20～36bp)等特性参数，同时设定单条引物不能产生发卡结构、自身不能发生相互作用等条件，以步骤(1)中的候选目标序列作为单条引物设计的候选序列，计算得出符合上述设定条件的单条引物。通过公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，并记录每条引物在目标序列上的位置、正负链信息(即来源于正链还是负链)以及引物的长度等信息。
根据单条引物的位置信息进行引物配对，保留同时满足引物对Tm差值<3℃以及引物对扩增区域在200～600bp两个条件的引物对作为候选引物对。
使用比对软件Bowtie，将上一步设计出的候选引物对中的每一条引物分别与集合A中的目标基因组序列和集合B中的非目标基因组进行序列比对。为了保证引物的通用性，当该单条引物与集合A中的目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 0”，即要求该单条引物与目标序列完全匹配；为了保证引物的特异性，当该单条引物与集合B中的非目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 3”，即允许该单条引物与非目标序列有不超过3个错配。系统输出满足条件的引物对，其中引物对的数量可预先设置，在本实施例中引物对的数量预先设置为100。以上高通量、自动化引物设计流程采用C、Perl脚本实现。程序运行后在AT富集区设计出沙门氏菌扩增引物对100个。
通过同样的方法分别设计出金黄色葡萄球菌、小肠结炎耶尔森菌和阪崎克罗诺杆菌扩增引物对100个。使用公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算每条引物的Tm并计算该引物对平均Tm值作为反应退火温度；使用公式0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/扩增产物序列长度)计算每个引物对扩增区域的变性温度。
以不同细菌扩增序列长度至少相差50bp、反应变性温度最多相差2℃、反应退火温度最多相差2℃为条件筛选引物组合。系统输出满足条件的引物组合，数量可预先设置，在本实施例中引物组合的数量预先设置为10。随机选择一个引物组进行有效性验证。所述引物组合的序列为：
引物对A：
Sal-F：5’-TCAGACATCCGTTCAGAAAAT-3’(SEQ ID NO.1)
Sal-R：5’-GTTCAACTGTCGACAAGATTAA-3’(SEQ ID NO.2)
引物对B：
Sta-F：5’-GTAGGTATGGTAAATAGTTACAC-3’(SEQ ID NO.5)
Sta-R:5’-CACTAATGCCAAATTTACTTAAAATCG-3’(SEQ ID NO.6)
引物对C:
Cro-F：5’-CGCCATAACTGCATAATCAT-3’(SEQ ID NO.3)
Cro-R:5’-ATAACGAGTTACCGTGCAGA-3’(SEQ ID NO.4)
引物对D:
Yer-F：5’-TGTGCGGTGGATGTAAATAATTC-3’(SEQ ID NO.7)
Yer-R:5’-GCTTTGAAACTCAAGGACTG-3’(SEQ ID NO.8)
所述引物对A的AT碱基含量分别为60％和64％，理论平均退火温度为62℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为355bp，AT的百分含量为71％，理论变性温度为78.14℃。
所述引物对B的AT碱基含量分别为65.22％和70.37％，理论平均退火温度为62.5℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为465bp，AT的百分含量为73.76％，理论变性温度为77.82℃。
所述引物对C的AT碱基含量分别为60％和55％，理论平均退火温度为63℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为291bp，AT的百分含量为68.73％，理论变性温度为78.34℃。
所述引物对D的AT碱基含量分别为60.87％和55％，理论平均退火温度为64℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为235bp，AT的百分含量为68.09％，理论变性温度为77.76℃。
(4)核酸扩增反应及结果检测：
核酸扩增反应体系配置如下表6所示。根据计算结果，采用81℃变性5秒，62℃退火5秒，72℃延伸20秒，推荐以上过程重复35次。检测对象清单见表7。
在使用普通梯度PCR仪反应完成后可通过两种方式判定扩增结果，一是加入终浓度25x的SYBRGreen I染料，通过颜色判定扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列；二是对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列。
表6.四种细菌核酸扩增反应体系
体系 体积(μl) 终浓度
Taq RR001(5U/μl) 0.4 2U
dNTP(2.5mM each) 3 0.3mM each
10x buffer(20mM Mg2+) 2.5 1x buffer
SAL-F/R(50μM) 0.2+0.2 0.4μM
STA-F/R(50μM) 0.2+0.2 0.4μM
YER-F/R(50μM) 0.3+0.3 0.6μM
CRO-F/R(50μM) 0.2+0.2 0.4μM
100％DMSO 0.5 2％
MgSO4(100mM) 0.5 4(mM)
模板(10ng) 0/1 /
ddH2O Upto25 /
表7.四种细菌核酸扩增反应特异性检测对象清单
Figure BDA0003049550920000171
Figure BDA0003049550920000181
图13和14展示了本发明针对肠炎沙门氏菌亚种、金黄色葡萄球菌亚种、小肠结肠炎耶尔森菌、阪崎克罗诺杆菌四种细菌核酸扩增反应的荧光染料染色结果和琼脂糖凝胶电泳结果。其中“N”为其对应的阴性模板扩增结果，“M1”指Marker DL2000，“M2”指Marker B(100～600bp)，“混合”指四种细菌基因组DNA的混合模板。图13各单菌、混合模板及阴性模板扩增显色结果情况符合预期。图14各单菌扩增片段均符合理论计算值且混合模板种各菌扩增片段能彼此分开。
图15展示了本发明针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、阪崎克罗诺杆菌四种细菌的核酸扩增反应在81℃变性温度下的特异性检测的SYBRGreen I染料显色结果。若扩增产物呈亮绿色，则为阳性；若扩增产物呈橙色，则为阴性。图15中，1～2号金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌亚种，10～13号肠炎沙门氏菌肠种、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌，23号阪崎克罗诺杆菌，24号小肠结炎耶尔森菌呈现亮绿色，为阳性结果，符合预期；同时，其它细菌基因组DNA模板检测结果均呈阴性，如第3～9、14～22号、25～30号管所示。所有结果符合预期，提示在81℃变性温度下未产生非特异性扩增或即使产生微量非特异扩增但不足以影响染料法结果判定。
实施例4同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌
本发明针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌基因组筛选富含AT的序列并设计特异性引物，根据计算的引物Tm和目标序列Tm筛选引物组合，设置反应条件进行核酸扩增，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在目标序列，进而确定待测样品中是否存在沙门氏菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。具体步骤如下：
(1)富含AT碱基的目标序列的筛选：
使用2019年8月5号从NCBI的FTP上下载的有完整基因组序列的细菌、古菌和病毒的数据，共2896个全基因组序列。设定集合A，其包含所有沙门氏菌基因组序列；设定集合B，其包含所有非沙门氏菌基因组序列。沙门氏菌基因组序列作为参考基因组，从基因组第一个碱基开始滑动宽度为1000bp的窗口，步长为50bp；每次滑动前计算一次序列AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为候选目标序列。以上过程采用perl脚本实现。
(2)特异性引物的设计：
根据PCR引物的特性及本发明的需求，设定引物的AT碱基含量为55％～75％、3’端稳定性ΔG<4、5’端稳定性ΔG<3及引物序列长度(20～36bp)等特性参数，同时设定单条引物不能产生发卡结构、自身不能发生相互作用等条件，以步骤(1)中的候选目标序列作为单条引物设计的候选序列，计算得出符合上述设定条件的单条引物。通过公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，并记录每条引物在目标序列上的位置、正负链信息(即来源于正链还是负链)以及引物的长度等信息。
根据单条引物的位置信息进行引物配对，保留同时满足引物对Tm差值<3℃以及引物对扩增区域在200～600bp两个条件的引物对作为候选引物对。
使用比对软件Bowtie，将上一步设计出的候选引物对中的每一条引物分别与集合A中的目标基因组序列和集合B中的非目标基因组进行序列比对。为了保证引物的通用性，当该单条引物与集合A中的目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 0”，即要求该单条引物与目标序列完全匹配；为了保证引物的特异性，当该单条引物与集合B中的非目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 3”，即允许该单条引物与非目标序列有不超过3个错配。系统输出满足条件的引物对，其中引物对的数量可预先设置，在本实施例中引物对的数量预先设置为100。以上高通量、自动化引物设计流程采用C、Perl脚本实现。程序运行后在AT富集区设计出沙门氏菌扩增引物对100个。
通过同样的方法分别设计出金黄色葡萄球菌扩增引物对100个。使用公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算每条引物的Tm并计算该引物对平均Tm值作为反应退火温度；使用公式0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/扩增产物序列长度)计算每个引物对扩增区域的变性温度。
以不同细菌扩增序列长度至少相差50bp、反应变性温度最多相差2℃、反应退火温度最多相差2℃为条件筛选引物组合。系统输出满足条件的引物组合，数量可预先设置，在本实施例中引物组合的数量预先设置为10。随机选择一个引物组进行有效性验证。所述引物组合的序列为：
引物对A：
Sal-F：5’-TCAGACATCCGTTCAGAAAAT-3’(SEQ ID NO.1)
Sal-R：5’-GTTCAACTGTCGACAAGATTAA-3’(SEQ ID NO.2)
引物对E：
Sta-F1：5’-CCTTTCATCTAAAAACCTCCA-3’(SEQ ID NO.11)
Sta-R1:5’-GAAATGGATGTTTTAAAAGAAGG-3’(SEQ ID NO.12)
所述引物对A的AT碱基含量分别为60％和64％，理论平均退火温度为62℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为355bp，AT的百分含量为71％，理论变性温度为78.14℃。
所述引物对E的AT碱基含量分别为61.90％和69.57％，理论平均退火温度为61℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为595bp，AT的百分含量为76.30％，理论变性温度为77.38℃。
(4)核酸扩增反应及结果检测：
核酸扩增反应体系配置如下表8所示。根据计算结果，采用81℃变性5秒，62℃退火5秒，72℃延伸20秒，推荐以上过程重复35次。检测对象清单见表7。
在使用普通梯度PCR仪反应完成后通过对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列。
表8.两种细菌核酸扩增反应体系
体系 体积(μl) 终浓度
Taq R300mix 15 1x
SAL-F/R(50μM) 0.25+0.25 0.5μM
STA-F1/R1(50μM) 0.25+0.25 0.5μM
100％DMSO 0.5 2％
模板(10ng) 0/1 /
ddH2O Upto25 /
图16展示了本发明针对肠炎沙门氏菌亚种和金黄色葡萄球菌亚种两种细菌核酸扩增反应的琼脂糖凝胶电泳结果。其中“N”为其对应的阴性模板扩增结果，“M”指MarkerDL2000，“沙门”指肠炎沙门氏菌亚种，“金葡”指金黄色葡萄球菌亚种，“混合”指两种种细菌基因组DNA的混合模板。图16各单菌扩增片段均符合理论计算值且混合模板种各菌扩增片段能彼此分开。
实施例5同时检测沙门氏菌和小肠结炎耶尔森菌
本发明针对沙门氏菌、小肠结炎耶尔森菌基因组筛选富含AT的序列并设计特异性引物，根据计算的引物Tm和目标序列Tm筛选引物组合，设置反应条件进行核酸扩增，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在目标序列，进而确定待测样品中是否存在沙门氏菌、小肠结炎耶尔森菌菌中的一种或多种。具体步骤如下：
(1)富含AT碱基的目标序列的筛选：
使用2019年8月5号从NCBI的FTP上下载的有完整基因组序列的细菌、古菌和病毒的数据，共2896个全基因组序列。设定集合A，其包含所有沙门氏菌基因组序列；设定集合B，其包含所有非沙门氏菌基因组序列。沙门氏菌基因组序列作为参考基因组，从基因组第一个碱基开始滑动宽度为1000bp的窗口，步长为50bp；每次滑动前计算一次序列AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为候选目标序列。以上过程采用perl脚本实现。
(2)特异性引物的设计：
根据PCR引物的特性及本发明的需求，设定引物的AT碱基含量为55％～75％、3’端稳定性ΔG<4、5’端稳定性ΔG<3及引物序列长度(20～36bp)等特性参数，同时设定单条引物不能产生发卡结构、自身不能发生相互作用等条件，以步骤(1)中的候选目标序列作为单条引物设计的候选序列，计算得出符合上述设定条件的单条引物。通过公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，并记录每条引物在目标序列上的位置、正负链信息(即来源于正链还是负链)以及引物的长度等信息。
根据单条引物的位置信息进行引物配对，保留同时满足引物对Tm差值<3℃以及引物对扩增区域在200～600bp两个条件的引物对作为候选引物对。
使用比对软件Bowtie，将上一步设计出的候选引物对中的每一条引物分别与集合A中的目标基因组序列和集合B中的非目标基因组进行序列比对。为了保证引物的通用性，当该单条引物与集合A中的目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 0”，即要求该单条引物与目标序列完全匹配；为了保证引物的特异性，当该单条引物与集合B中的非目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 3”，即允许该单条引物与非目标序列有不超过3个错配。系统输出满足条件的引物对，其中引物对的数量可预先设置，在本实施例中引物对的数量预先设置为100。以上高通量、自动化引物设计流程采用C、Perl脚本实现。程序运行后在AT富集区设计出沙门氏菌扩增引物对100个。
通过同样的方法分别设计出小肠结炎耶尔森菌扩增引物对100个。使用公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算每条引物的Tm并计算该引物对平均Tm值作为反应退火温度；使用公式0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/扩增产物序列长度)计算每个引物对扩增区域的变性温度。
以不同细菌扩增序列长度至少相差50bp、反应变性温度最多相差2℃、反应退火温度最多相差2℃为条件筛选引物组合。系统输出满足条件的引物组合，数量可预先设置，在本实施例中引物组合的数量预先设置为10。随机选择一个引物组进行有效性验证。所述引物组合的序列为：
引物对F：
Sal-F2：5’-TGGGTTGAAATAGCCCATTA-3’(SEQ ID NO.13)
Sal-R2：5’-GACGTGACACACTTCGTTTT-3’(SEQ ID NO.14)
引物对G：
Yer-F1：5’-ATGGAAAATAACATAATTTCTATTACCGG-3’(SEQ ID NO.15)
Yer-R1:5’-TCTCTGCGAATAACCTTGTG-3’(SEQ ID NO.16)
所述引物对F的AT碱基含量分别为60％和55％，理论平均退火温度为63℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为352bp，AT的百分含量为74.43％，理论变性温度为76.90℃。
所述引物对G的AT碱基含量分别为72.41％和55％，理论平均退火温度为63.5℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为242bp，AT的百分含量为72.02％，理论变性温度为76.48℃。
(4)核酸扩增反应及结果检测：
核酸扩增反应体系配置如下表9所示。根据计算结果，采用81℃变性5秒，62℃退火5秒，72℃延伸20秒，推荐以上过程重复35次。检测对象清单见表7。
在使用普通梯度PCR仪反应完成后通过对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列。
表9.两种细菌核酸扩增反应体系
体系 体积(μl) 终浓度
Taq R300mix 15 1x
SAL-F2/R2(50μM) 0.25+0.25 0.5μM
YER-F1/R1(50μM) 0.25+0.25 0.5μM
100％DMSO 0.5 2％
模板(10ng) 0/1 /
ddH2O Upto25 /
图17展示了本发明针对肠炎沙门氏菌亚种和小肠结炎耶尔森菌两种细菌核酸扩增反应的琼脂糖凝胶电泳结果。其中“N”为其对应的阴性模板扩增结果，“M”指MarkerDL2000，“沙门”指肠炎沙门氏菌亚种，“小耶”指小肠结炎耶尔森菌亚种，“混合”指两种种细菌基因组DNA的混合模板。图17各单菌扩增片段均符合理论计算值且混合模板种各菌扩增片段能彼此分开。
实施例6同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和小肠结炎耶尔森菌
本发明针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和小肠结炎耶尔森菌基因组筛选富含AT的序列并设计特异性引物，根据计算的引物Tm和目标序列Tm筛选引物组合，设置反应条件进行核酸扩增，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在目标序列，进而确定待测样品中是否存在沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和小肠结炎耶尔森菌菌中的一种或多种。具体步骤如下：
(1)富含AT碱基的目标序列的筛选：
使用2019年8月5号从NCBI的FTP上下载的有完整基因组序列的细菌、古菌和病毒的数据，共2896个全基因组序列。设定集合A，其包含所有沙门氏菌基因组序列；设定集合B，其包含所有非沙门氏菌基因组序列。沙门氏菌基因组序列作为参考基因组，从基因组第一个碱基开始滑动宽度为1000bp的窗口，步长为50bp；每次滑动前计算一次序列AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为候选目标序列。以上过程采用perl脚本实现。
(2)特异性引物的设计：
根据PCR引物的特性及本发明的需求，设定引物的AT碱基含量为55％～75％、3’端稳定性ΔG<4、5’端稳定性ΔG<3及引物序列长度(20～36bp)等特性参数，同时设定单条引物不能产生发卡结构、自身不能发生相互作用等条件，以步骤(1)中的候选目标序列作为单条引物设计的候选序列，计算得出符合上述设定条件的单条引物。通过公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，并记录每条引物在目标序列上的位置、正负链信息(即来源于正链还是负链)以及引物的长度等信息。
根据单条引物的位置信息进行引物配对，保留同时满足引物对Tm差值<3℃以及引物对扩增区域在200～600bp两个条件的引物对作为候选引物对。
使用比对软件Bowtie，将上一步设计出的候选引物对中的每一条引物分别与集合A中的目标基因组序列和集合B中的非目标基因组进行序列比对。为了保证引物的通用性，当该单条引物与集合A中的目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 0”，即要求该单条引物与目标序列完全匹配；为了保证引物的特异性，当该单条引物与集合B中的非目标序列进行比对时，使用参数设置“-a-n 3”，即允许该单条引物与非目标序列有不超过3个错配。系统输出满足条件的引物对，其中引物对的数量可预先设置，在本实施例中引物对的数量预先设置为100。以上高通量、自动化引物设计流程采用C、Perl脚本实现。程序运行后在AT富集区设计出沙门氏菌扩增引物对100个。
通过同样的方法分别设计出小肠结炎耶尔森菌扩增引物对100个。使用公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算每条引物的Tm并计算该引物对平均Tm值作为反应退火温度；使用公式0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/扩增产物序列长度)计算每个引物对扩增区域的变性温度。
以不同细菌扩增序列长度至少相差50bp、反应变性温度最多相差2℃、反应退火温度最多相差2℃为条件筛选引物组合。系统输出满足条件的引物组合，数量可预先设置，在本实施例中引物组合的数量预先设置为10。随机选择一个引物组进行有效性验证。所述引物组合的序列为：
引物对F：
Sal-F2：5’-TGGGTTGAAATAGCCCATTA-3’(SEQ ID NO.13)
Sal-R2：5’-GACGTGACACACTTCGTTTT-3’(SEQ ID NO.14)
引物对G：
Yer-F1：5’-ATGGAAAATAACATAATTTCTATTACCGG-3’(SEQ ID NO.3)
Yer-R1:5’-TCTCTGCGAATAACCTTGTG-3’(SEQ ID NO.4)
引物对E：
Sta-F1：5’-CCTTTCATCTAAAAACCTCCA-3’(SEQ ID NO.11)
Sta-R1:5’-GAAATGGATGTTTTAAAAGAAGG-3’(SEQ ID NO.12)
所述引物对F的AT碱基含量分别为60％和55％，理论平均退火温度为63℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为352bp，AT的百分含量为74.43％，理论变性温度为76.90℃。
所述引物对G的AT碱基含量分别为72.41％和55％，理论平均退火温度为63.5℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为242bp，AT的百分含量为72.02％，理论变性温度为76.48℃。
所述引物对E的AT碱基含量分别为61.90％和69.57％，理论平均退火温度为61℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为595bp，AT的百分含量为76.30％，理论变性温度为77.38℃。
(4)核酸扩增反应及结果检测：
核酸扩增反应体系配置如下表10所示。根据计算结果，采用81℃变性5秒，62℃退火5秒，72℃延伸20秒，推荐以上过程重复35次。检测对象清单见表7。
在使用普通梯度PCR仪反应完成后通过对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列。
表10.三种细菌核酸扩增反应体系
体系 体积(μl) 终浓度
Taq R300mix 15 1x
SAL-F2/R2(50μM) 0.25+0.25 0.5μM
YER-F1/R1(50μM) 0.25+0.25 0.5μM
STA-F1/R1(50μM) 0.25+0.25 0.5μM
100％DMSO 0.5 2％
模板(10ng) 0/1 /
ddH2O Upto25 /
图18展示了本发明针对肠炎沙门氏菌亚种、金黄色葡萄球菌亚种和小肠结炎耶尔森菌三种细菌核酸扩增反应的琼脂糖凝胶电泳结果。其中“N”为其对应的阴性模板扩增结果，“M”指Marker DL2000，“肠亚”指肠炎沙门氏菌亚种，“小耶”指小肠结炎耶尔森菌亚种，“金亚”指金黄色葡萄球菌亚种，“混合”指三种细菌基因组DNA的混合模板。图18各单菌扩增片段均符合理论计算值且混合模板种各菌扩增片段能彼此分开。
本发明还提供了一种检测志贺氏菌属的设备，包括：存储器、处理器和扩增模块；所述存储器上存储有计算机程序，当所述计算机程序被所述处理器执行时，实现如上所述方法的步骤；所述扩增模块用于在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
参考文献
周慧琦.(2014).基因组GC含量与碱基、密码子和氨基酸使用偏好的关系.(mastermaster),电子科技大学,(67)
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海生物信息技术研究中心,上海旺旺食品集团有限公司
<120> 一种检测志贺氏菌属的方法及其应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcagacatcc gttcagaaaa t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttcaactgt cgacaagatt aa 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgccataact gcataatcat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ataacgagtt accgtgcaga 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtaggtatgg taaatagtta cac 23
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cactaatgcc aaatttactt aaaatcg 27
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtgcggtgg atgtaaataa ttc 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gctttgaaac tcaaggactg 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cggcagaacg ttcaaatatg a 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgcagaagga tatcctgata 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cctttcatct aaaaacctcc a 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaaatggatg ttttaaaaga agg 23
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgggttgaaa tagcccatta 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gacgtgacac acttcgtttt 20
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atggaaaata acataatttc tattaccgg 29
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tctctgcgaa taaccttgtg 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aagggggttc caggcatta 19

Claims (13)

1.一种检测志贺氏菌属的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)筛选志贺氏菌属基因组序列中富含AT碱基的目标序列；
(2)针对所述目标序列设计兼具通用性和特异性的引物；
(3)基于GC的百分含量、引物序列长度、引物对的理论扩增产物序列长度计算反应变性温度及退火温度，并设置核酸扩增反应条件；
(4)在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，对于所述志贺氏菌属基因组序列，从第一个碱基开始滑动宽度为1000bp的窗口，步长为5～100bp；针对每次窗口所在位置包含的序列计算AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为目标序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述引物的设计方法包括：(2.1)针对一条目标序列进行单条引物设计，得到候选引物；(2.2)对所述候选引物进行理化性质判定，筛选符合要求的单条引物；(2.3)将步骤(2.2)筛选得到的单条引物组合成引物对；(2.4)对所述引物对进行通用性、特异性判定；(2.5)输出符合条件的引物对，得到所述特异性引物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2.1)中，所述候选引物需满足以下条件：a)引物序列长度在20bp～36bp之间；b)AT碱基含量在55％～80％；c)连续GC数≤5；同时记录所述候选引物匹配到所述目标序列上的位置信息、正负链信息；和/或，步骤(2.2)中，对满足上述(2.1)条件的所述单条引物进行理化性质判定，包含3’端稳定性、5’端稳定性和/或二级结构稳定性。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2.3)中，对上述步骤(2.2)筛选得到的单条引物，根据所述单条引物匹配到所述目标序列上的位置信息、正负链信息，将所述单条引物组合成引物对；所述引物对的理论扩增产物序列的长度应在200bp～600bp之间；根据公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值；以引物对Tm差值≤3℃，以及引物之间不能发生相互作用为条件，对引物对进行筛选，得到候选引物对；
其中，GC的百分含量是指引物中的碱基G和C的个数占引物总碱基个数的百分比；
引物序列长度是指引物的碱基个数。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2.4)中，所述通用性判定指检查引物对可否严格匹配到所有的目标序列；特异性判定指检查单条引物是否不能与所有目标序列之外的非目标序列发生特异性匹配，所述非目标序列指除待扩增核酸序列之外的其它核酸序列，所述特异性匹配指不大于2个错配的匹配。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述反应变性温度的计算公式为0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/引物对的理论扩增产物序列长度)，记为Tma；其中，GC的百分含量是指引物对的理论扩增产物序列中的碱基G和C的个数占引物对的理论扩增产物序列总碱基个数的百分比；和/或，
根据公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，对所述Tm值取平均值即为所述反应退火温度，记为Tmb；其中，GC的百分含量是指引物中的碱基G和C的个数占引物总碱基个数的百分比。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述核酸扩增反应条件包括：在所述变性温度下反应5秒，在所述退火温度下反应5秒，在延伸温度下反应20秒，以上过程重复30-40次；其中所述变性温度根据需要可在Tma±5℃之间调整；所述退火温度根据需要可在Tmb±2℃之间调整；所述延伸温度为72℃。
9.如权利要求1～8之任一项所述的方法获得的引物对。
10.如权利要求9所述的引物对，其特征在于，所述引物对为：
引物对H：
Shi-F：5’-CGGCAGAACGTTCAAATATGA-3’(SEQ ID NO：9)
Shi-R：5’-CGCAGAAGGATATCCTGATA-3’(SEQ ID NO：10)。
11.一种诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包括如权利要求9或10所述的引物对。
12.如权利要求1～8之任一项所述的方法在用于志贺氏菌属基因组序列进行核酸扩增中的应用、如权利要求1～8之任一项所述的方法或如权利要求9或10所述的引物对在志贺氏菌属相关基因或区域的扩增和/或检测中的应用、如权利要求1～8之任一项所述的方法或如权利要求9或10所述的引物对在制备扩增和/或检测志贺氏菌属基因组相关基因或区域的产品中的应用、如权利要求11所述的诊断试剂在检测志贺氏菌属中的应用、如权利要求1～8之任一项所述的方法在同时检测金黄色葡萄球菌、阪崎克罗诺杆菌、沙门氏菌、小肠结炎耶尔森菌之任意两种及以上组合中的应用。
13.一种检测志贺氏菌属的设备，其特征在于，包括：存储器、处理器和扩增模块；所述存储器上存储有计算机程序，当所述计算机程序被所述处理器执行时，实现如权利要求1所述方法的步骤1-3；所述扩增模块用于在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
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