BRPI0609031B1

BRPI0609031B1 - METHODS FOR THE SYNTHESIS OF A NUCLEIC ACID MOLECULE, TO SELECTIVELY AMPLIFY A SEQUENCE OF NUCLEIC ACID TARGETED OF A DNA OR A MIXTURE OF NUCLEIC ACIDS, TO AMPLIFY TWO OR MORE SEQUENCES OF NUCLEOTIDE TARGET SIMULTANEOUSLY, TO SEQUENCE A TARGETED NUCLEIC ACID MOLECULE , To detect a nucleic acid molecule with genetic diversity to detect a target nucleotide sequence in a sample of the nucleic acid and to allow a ring specificity of an oligonucleotide to be determined by a structure of the oligonucleotide and oligonucleotide OF DUAL SPECIFICITY

Info

Publication number: BRPI0609031B1
Application number: BRPI0609031-1A
Authority: BR
Inventors: Chun Jong-Yoon
Original assignee: Seegene, Inc.
Priority date: 2005-03-05
Filing date: 2006-03-03
Publication date: 2017-09-26
Also published as: US9884890B2; US20130090464A1; DK1856257T3; ES2375571T3; AU2006221202B2; IL185683A0; JP4903725B2; KR20140056397A; WO2006095941A1; NO20074394L; US20180141970A1; US20120135473A1; EP2365078B1; DK2365078T3; CN101189336A; BRPI0609031A2; CA2599647A1; CN101189336B; US20080305478A1; NO20161140A1

Abstract

metodos para a sintese de uma molécula de ácido nucleico, para seletivamente amplificar uma sequencia de ácido nucleico alvo de um dna ou de uma mistura de acidos nucleicos, para amplificar duas ou mais sequencias de nucleotídeos alvo simultaneamente, para sequenciar uma molécula de ácido nucleico alvo, para detectar uma molécula de ácido nucleico com diversidade genetica, para detectar uma sequencia de nucleotídeos alvo em uma amostra da ácido nucléico, e para permitir que uma especificidade anelar de um oligonucleotideo seja dualmente determinada por meio de uma estrutura do oligonucleotídeo, e, oligonucleotídeo de especificidade dual. a presente invenção refere-se aos vários processos por uma reação de extensão dependente de gabarito usando um oligonucleotídeo de especificidade dual e um oligonucleotídeo de especificidade dual composto de três porções de t~m~ para o mesmo. são demonstradas na presente invenção as características do oligonucleotídeo de especificidade dual, que são tolerância à má combinação e especificidade de hibridização alta.

Description

“MÉTODOS PARA A SÍNTESE DE UMA MOLÉCULA DE ACIDO NUCLEICO, PARA SELETIVAMENTE AMPLIFICAR UMA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO ALVO DE UM DNA OU DE UMA MISTURA DE ÁCIDOS NUCLEICOS, PARA AMPLIFICAR DUAS OU MAIS SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS ALVO SIMULTANEAMENTE, PARA SEQÜENCIAR UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ALVO, PARA DETECTAR UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO COM DIVERSIDADE GENÉTICA, PARA DETECTAR UMA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS ALVO EM UMA AMOSTRA DA ÁCIDO NUCLEICO, E PARA PERMITIR QUE UMA ESPECIFICIDADE ANELAR DE UM OLIGONUCLEOTÍDEO SEJA DUALMENTE DETERMINADA POR MEIO DE UMA ESTRUTURA DO OLIGONUCLEOTÍDEO, E, OLIGONUCLEOTÍDEO DE ESPECIFICIDADE DUAL” FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se aos vários processos usando um oligonucleotídeo de especificidade dual e a um oligonucleotídeo de especificidade dual para o mesmo. Mais particularmente, a presente invenção refere-se aos vários processos por uma reação de extensão dependente de gabarito usando um oligonucleotídeo de especificidade dual e um oligonucleotídeo de especificidade dual para o mesmo. Mais particularmente, a presente invenção refere-se aos vários processos por uma reação de extensão dependente de gabarito usando um oligonucleotídeo de especificidade dual e um oligonucleotídeo de especificidade dual para o mesmo.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

Amplificação de ácido nucleico é um processo fundamental para uma ampla variedade de métodos em biologia molecular, de tal modo que vários métodos de amplificação têm sido propostos. Por exemplo, Miller, Η. I. et al. (WO 89/06700) amplificaram uma seqüência de ácido nucleico baseado na hibridização de uma seqüência de promotor / iniciador em um DNA de fita única alvo ("ssDNA") seguido por transcrição de muitas cópias de RNA da seqüência. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico conhecidos incluem sistema de amplificação baseada em transcrição (Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A., 86:1173(1989); e Gingeras T.R. et al., WO 88/10315). O processo mais predominante para amplificação de ácido nucleico conhecido como reação em cadeia da polimerase (daqui em diante referida como "PCR"), é baseado em ciclos repetidos de desnaturação de DNA de fita dupla, seguido por anelamento de iniciador oligonucleotídeo em DNA gabarito, e extensão de iniciador por uma DNA polimerase (Mullis et al. Patentes U.S. 4.683.195, 4.683.202, e 4.800.159; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354). Os iniciadores oligonucleotídeos usados em PCR são planejados para anelarem em fitas opostas do DNA gabarito. Os iniciadores são estendidos por DNA polimerase, do qual o produto de um iniciador pode servir como a fita gabarito do outro iniciador em reações subseqüentes. A amplificação por PCR resulta no aumento exponencial de fragmentos de DNA discretos cujo comprimento é definido pelas extremidades 5' dos iniciadores oligonucleotídeos. O sucesso em amplificações de ácido nucleico, em particular em amplificação por PCR, baseia-se na especificidade com a qual um iniciador anela apenas em suas seqüências alvo (e não em seqüências não-alvo); portanto, é importante otimizar esta interação molecular. Se um iniciador pode anelar em apenas seu complemento perfeito ou também em seqüências que possuem uma ou mais más combinações depende criticamente da temperatura de anelamento. Em geral, a temperatura de anelamento mais alta acarretará anelamento mais específico do iniciador em seu gabarito perfeitamente combinado, que por sua vez aumentará a possibilidade de amplificação de apenas a seqüência alvo. Por outro lado, mais más combinações entre o gabarito e o iniciador podem ser toleradas em temperaturas de anelamento mais baixas. Em consideração de tal fenômeno, ajuste da temperatura de anelamento pode alterar a especificidade de pareamento do gabarito e iniciador. Por exemplo, de não houver produto, a temperatura pode ser muito alta para anelamento. Se houver vários produtos diferentes em tamanho onde apenas um iniciador está presente, isto indica que o único iniciador está anelando em mais do que uma região do gabarito. Neste caso, a temperatura de anelamento deve ser aumentada.

Em adição à temperatura de anelamento, vários “parâmetros de pesquisa de iniciador”, tais como comprimento de iniciador, conteúdo de GC, e comprimento de produto de PCR, devem ser considerados para especificidade de anelamento de iniciador. Um iniciador satisfazendo todos tais parâmetros resultará em intensificação significativa de especificidade de anelamento de iniciador durante a amplificação de DNA alvo, enquanto resolve os problemas de resíduos gênicos e produtos não-específicos r decorrentes dos iniciadores usados nos experimentos. E normal que iniciadores bem planejados possam evitar resíduos e anelamento não-específico bem como distinguir entre cDNAs ou gabaritos genômicos em RNA-PCR.

Muitas abordagens têm sido desenvolvidas para melhorar a especificidade de anelamento de iniciador e portanto realizar a amplificação do produto desejado. Exemplos são “touchdown PCR” (Don et al., (1991) “Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplifícation”, Nucleic Acids Res., 19, 4008), “hot start PCR” (DAquíla et al., (1991) “Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating”, Nucleic Acids Res., 19, 3749), “nested PCR” (Mullis and Faloona, (1987) “Specific synthesis of DNA in vitro via a polimerase-catalyzed chain reaction”, Methods Enzymol. 155, 335-350), e “booster PCR” (Ruano et al., (1989) “Biphasic amplification of very dilute DNA samples via booster PCR”, Nucleic Acids Res. 17, 540). Em outras abordagens alternativas também têm sido relatadas que vários compostos ‘intensificadores’ podem melhorar a especificidade de PCR. Os compostos intenslficadores incluem compostos químicos que aumentam a temperatura de anelamento efetiva da reação, proteínas ligadoras de DNA, e reagentes comercialmente disponíveis. Contudo, não há aditivo ‘mágico’ que garantirá o sucesso em cada PCR, e é muito tedioso testar aditivos diferentes sob condições diferentes tal como temperatura de anelamento. Embora estas abordagens tenham contribuído para melhoria da especificidade de anelamento de iniciador em alguns casos, não têm acessado fundamentalmente uma solução para os problemas de iniciadores usados na amplificação por PCR, tais como produtos não específicos e resíduos gênicos altos. Técnicas baseadas em PCR têm sido amplamente usadas para amplificação de uma seqüência de DNA alvo, mas também para aplicações científicas ou métodos nos campos de pesquisa médica e biológica, tais como PCR com transcriptase reversa (RT-PCR), PCR de exibição diferencial (DD-PCR), clonagem de genes conhecidos e desconhecidos por PCR, amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE),PCR de iniciação arbitrária PCR (AP-PCR), multiplex PCR, tipificação de genoma SNP, e análise genômica baseada em PCR (McPherson e Moller, (2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, NY).

Como descrito acima, todos estes métodos e técnicas envolvendo amplificação de ácido nucleico, notavelmente amplificação por PCR, não podem estar completamente livres de limitações e problemas resultantes de não-especificidade de iniciadores usados em cada método, tais como positivos falsos, reprodutibilidade insatisfatória, resíduos gênicos altos, embora abordagens melhoradas para cada um dos métodos tenham sido continuamente introduzidas. Portanto, permanece uma necessidade de novos iniciadores e métodos para melhorar a especificidade de anelamento, que podem ocasionar verdadeiros resultados de amplificação.

Por enquanto, hibridização de DNA é um processo fundamental em biologia molecular e é afetada pela força iônica, composição de base, comprimento de fragmento ao qual o ácido nucleico tem sido reduzido, o grau de má combinação, e a presença de agentes desnaturantes. Tecnologias baseadas em hibridização de DNA seriam uma ferramenta muito útil em determinação de seqüência de ácido nucleico específica e claramente valiosa em diagnóstico clínico, pesquisa genética, e análise de laboratório forense. Por exemplo, Wallace e colaboradores mostraram que as diferenças de seqüência tão sutis quanto uma única troca de base são suficientes para permitirem discriminação de oligômeros curtos (e.g., 14-mer) e demonstraram como isto podería ser aplicado em análise molecular de mutação pontual no gene de β-globina (Wallace, B.R., et al., (1981) “The use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes. Hybridization of oligonucleotides of mixed sequence to rabbit β-globin DNA”, Nucleic Acids Res. 9, 879-894; e Conner, B.3., et al. (1983) “Detection of sickle cell β-globin allele by hybridization with synthetic oligonucleotides”, Proc. Natl Acad Sei. USA 80, 278-282).

Apesar do poder da hibridização de oligonucleotídeo de corretamente identificar uma fita complementar, pesquisadores aínda se deparam com limitações. Híbridos contendo oligonucleotídeos são muito menos estáveis do que híbridos de ácidos nucleicos longos. Isto é refletido em temperatura de fusão menor. A instabilidade dos híbridos é um dos fatores mais importantes a serem considerados quando se planeja hibridização de oligonucleotídeo. A diferença de estabilidade entre um complemento perfeitamente combinado e um complemento mal combinado em apenas uma base pode ser bastante pequena, correspondendo a tão pouco quanto 0,5°C em suas Tms (temperatura de fusão de duplex). Quanto mais curto o oligonucleotídeo de interesse (permitindo identificação de uma fita complementar em uma mistura mais complexa), mais forte será o efeito de uma má combinação de base única sobre a estabilidade de duplex total. Contudo, a desvantagem de uso de tais oligonucleotídeos curtos é que hibridizam fracamente, até mesmo em uma seqüência perfeitamente complementar, e assim têm que ser usados sob condições de estringência reduzida, o que resulta seriamente em decréscimo de especificidade de hibridização. Têm havido muitos esforços para melhorar a especificidade de hibridização de oligonucleotídeo. Têm sido propostos um método para modificar quimicamente bases de DNA para hibridização de sensibilidade alta (Azhikina et al., (1993) Proc. Natl Acad. Sei., USA, 90:11460-11462) e um método no qual a lavagem após a hibridização é conduzida em temperaturas baixas por um período de tempo longo para intensificar a capacidade de discriminação da má combinação (Drmanac et al., (1990) DNA and Cell Biology, 9:527-534). Recentemente, outro método tem sido introduzido para aumentar o poder de resolução de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em hibridização de DNA por meio de más combinações artificiais (Guo et al., (1997) Nature Biotechnology, 15:331-5). Em adição, muitas Patentes U.S. incluindo Patentes U.S. 6.077.668, 6.329.,144, 6.140.054, 6.350.580, 6.309.824, 6.342.355 e 6.268.128 descrevem a sonda para hibridização e suas aplicações. Embora as abordagens melhoradas para cada métodos tenham sido continuamente introduzidas, todos estes métodos e técnicas envolvendo hibridização de oligonucleotídeo poderíam estar completamente livres das limitações e dos problemas decorrentes da não-especificidade de hibridização de oligonucleotídeo.

Ainda há uma possibilidade de que fatores artificiais, tais como as falhas de aplicação pontual de mancha e de imobilização de oligonucleotídeo sobre substrato e estabelecimento de condições de hibridização ótimas, afetariam os dados negativos de hibridização; o efeito de resultados errôneos é mais vulnerável para os resultados gerados do método de triagem de rendimento alta. Tais fatores artificiais inerentes para aplicação pontual de mancha e hibridização são as desvantagens práticas principais em microarranjos de DNA baseados em oligonucleotídeo.

Além disso, o desenvolvimento de técnicas de determinação de seqüência de DNA com velocidade, sensibilidade, e rendimento intensificados é de maior importância para o estudo de sistemas biológicos. Técnica de seqüenciamento de DNA convencional originalmente desenvolvida mais do que duas décadas atrás (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei., 74:5463-5467) apresenta limitações tanto em rendimento quanto em custo para aplicações futuras. Três métodos grandemente promissores são seqüenciamento por hibridização (Brain e Smith, (1988) J. Theor. Biol, 135:303-307); Drmanac et al., (1989) Genomics, 4:114-128); e Southern, E.M. (1989) Patente WO/10977), seqüenciamento por assinatura paralela baseado em ligação e divagem (Brenner et al., (2000) Proc. Natl Acad. Sei., 97:1665-1670), e pirosseqüenciamento (Ronaghi et al., (1996) Anal. Biochem., 242:84-89; e (1998) Science 281:363-365). Para todas as técnicas mencionadas acima, o sucesso das reações de seqüenciamento absolutamente depende da especificidade de hibridização do iniciador de seqüenciamento para um ácido nucleico alvo. Em consideração com a especificidade de hibridização do iniciador de seqüenciamento, métodos correntes estão sujeitos à limitação do comprimento dos ácidos nucleicos gabarito fornecidos para as reações de seqüenciamento. Em geral, reações de seqüenciamento são conduzidas usando ácidos nucleicos modelo preferivelmente menores do que umas poucas centenas de pares de bases em comprimento de tal modo que a hibridização específica do iniciador de seqüenciamento seja alcançada em certa extensão.

Para estudos avançados, contudo, reações de seqüenciamento de DNA com velocidade, sensibilidade, e rendimento intensificados não são impedidas pelo tamanho dos ácidos nucleicos gabarito. À luz disto, seqüenciamento direto de um ácido nucleico alvo de uma população de ácido nucleico de gabarito é permitido, desde que os iniciadores de seqüenciamento sejam hibridizados com ácidos nucleicos alvo em especificidade alta.

Em todo este pedido, várias patentes e publicações são referidas, e citações são proporcionadas entre parêntesis. As descrições destas patentes e publicações em suas totalidades são por meio desta aqui incorporadas como referências com o objetivo de descrever mais completamente esta invenção e o estado da técnica ao qual esta invenção pertence.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Para eliminar os problemas e as desvantagens de tais oligonucleotídeos convencionais, usados como iniciadores ou sondas, e de vários métodos envolvendo hibridização de ácido nucleico, o presente inventor tem desenvolvido um o oligonucleotídeo de especificidade dual se permite que uma reação dependente de gabarito prossiga com especificidade muito maior e tem encontrado suas excelentes aplicações em uma ampla variedade de processos envolvendo anelamento ou hibridização de oligonucleotídeo.

Conseqüentemente, um objetivo desta invenção é proporcionar um método para sintetizar uma molécula de ácido nucleico usando um oligonucleotídeo de especificidade dual por uma reação de extensão dependente de gabarito.

Outro objetivo desta invenção é proporcionar um método para seletivamente amplificar uma seqüência de ácido nucleico alvo de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos.

Ainda outro objetivo desta invenção é proporcionar um método para amplificar duas ou mais seqüências de ácido nucleico alvo simultaneamente usando dois ou mais pares de iniciadores na mesma reação.

Outro objetivo desta invenção é proporcionar um método para seqüenciar uma molécula de ácido nucleico de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos.

Ainda outro objetivo desta invenção é proporcionar um método para detectar uma molécula de ácido nucleico com diversidade genética por uma reação de extensão dependente de gabarito.

Outro objetivo desta invenção é proporcionar um método para detectar uma seqüência de nucleotídeos alvo em uma amostra de ácido nucleico pelo uso de microarranjo imobilizado de oligonucleotídeo de especificidade dual.

Ainda outro objetivo desta invenção é proporcionar um oligonucleotídeo de especificidade dual para sintetizar uma molécula de ácido nucleico por uma reação de extensão dependente de gabarito.

Outro objetivo desta invenção é proporcionar um método para permitir que uma especificidade de anelamento de um oligonucleotídeo seja dualmente determinada por intermédio de uma estrutura do oligonucleotídeo.

Ainda outro objetivo desta invenção é proporcionar um método para melhorar uma especificidade de anelamento de um oligonucleotídeo.

Outros objetivos e vantagens da presente invenção se tomarão evidentes a partir da descrição detalhada tomada juntamente com os desenhos e as reivindicações apendidas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIGS. IA e 1B representam esquematicamente o princípio de oligonucleotídeo de especificidade dual (DS) desta invenção em uma reação de extensão dependente de gabarito. FIG IA mostra a especificidade de hibridização alta do oligonucleotídeo DS sob condições de estringência alta. FIG 1B mostra tolerância de má combinação do oligonucleotídeo DS. FIG 2 mostra representações esquemáticas para seletivamente amplificar um ácido nucleico alvo de DNA de fita dupla usando iniciadores oligonucleotídeo DS desta invenção. FIG 3 mostra representações esquemáticas para seletivamente amplificar um ácido nucleico alvo de mRNA usando iniciadores oligonucleotídeo DS desta invenção. FIG 4 mostra representações esquemáticas para reações de extensão dependente de gabarito em determinação seletiva de um ácido nucleico alvo usando oligonucleotídeos de especificidade dual sobre microarranjo de oligonucleotídeos. FIG 5 é uma fotografia de gel de agarose mostrando os resultados de amplificação por PCRpara genes de família de citocina, IL-Ιβ e IL-19, usando um conjunto de iniciadores convencionais (IL-lb-5'-0 e IL-lb-3-0, pista 1; IL-19-5'-0 e IL-19-3-0, pista 3) e os oligonucleotídeos de especificidade dual (IL-lb-5' e IL-lb-3', pista 2; IL-19-5' e IL-19-3', pista 4). M é um marcador de tamanho de 100-pb gerado por Forever 100-bp Ladder Personalizer (Seegene, Inc. Seoul, Coréia). FIG 6A é uma fotografia de gel de agarose mostrando os resultados de 3'-RACE (amplificação rápida de extremidades de cDNA) do gene DEG 10, demonstrando especificidade de PCR do oligonucleotídeo de especificidade dual. Pista 1 representa um iniciador com seqüência de combinação perfeita, pistas 2-4 representam iniciadores com 3, 2 e 1 más combinações de bases em sua porção de especificidade de Tm baixa-3’, respectivamente, e pistas 5-7 representam iniciadores com 5, 3 e 2 más combinações de bases em sua porção de especificidade de Tm alta-5’. M é um marcador de tamanho de 100-pb gerado por Forever 100-bp Ladder Personalizer. FIG. 6B é uma fotografia de gel de agarose mostrando os resultados de 3'-RACE do gene DEG 10, demonstrando a tolerância à má combinação do oligonucleotídeo de especificidade dual em PCR. Pista 1 representa um iniciador com seqüêncía de combinação perfeita, pistas 2-4 representam iniciadores com 3, 2 e 1 más combinações de bases em sua porção de especificidade de Tm baixa-3’, respectivamente, e pistas 5-7 representam iniciadores com 5, 3 e 2 más combinações de bases em sua porção de especificidade de Tm alta-5’, respectivamente. M é um marcador de tamanho de 100-pb gerado por Forever 100-bp Ladder Personalizer. FIG 7A representa as seqüências de iniciadores 5’ para 3’-RACE dos genes da família de homeobox específicos de placenta Psxl e Psx2. Psxl-5'-40 e Psx2-5-40 são iniciadores convencionais e Psxl-5-41 e Psx2-5'-41 são iniciadores planejados de acordo com a presente invenção. FIG 7B é uma fotografia de gel de agarose mostrando os resultados de 3 ’-RACE de Psxl e Psx2. Pista 1, 3-RACE de Psxl usando o iniciador oligonucleotídeo de especificidade dual Psxl-5'-41; Pista 2, 3'-RACE de Psx2 usando o iniciador oligonucleotídeo de especificidade dual Psx2-5'-41; Pista 3, 3'-RACE de Psxl usando iniciador convencional Psxl-5’-40; e Pista 4, 3-RACE de Psx2 usando iniciador convenciona Psx2-5'-40. M é um marcador de tamanho de 100-pb gerado por Forever 100-bp Ladder Personalizer. FIG 8 mostra os resultados de seqüenciamento cíclico direto para genes Psxl e Psx2 de reunião de cDNA de placenta de camundongo usando os iniciadores oligonucleotídeo de especificidade dual Psxl-5'-41 (para Psxl) e Psx2-5'-41 (para Psx2) como um iniciador de seqüenciamento. FIG 9 mostra os resultados de multiplex PCR usando 9 conjuntos de iniciadores de especificidade dual específicos de gene da família de citocinas. Pista 1, multiplex PCR para 9 genes de citocinas; Pista 2, monoplex PCR para IL-3 (200 pb); Pista 3, monoplex PCR para IL-15 (250 pb); Pista 4, monoplex PCR para IL-18 (300 pb); Pista 5, monoplex PCR para IL-25 (350 pb); Pista 6, monoplex PCR para IL-2 (400 pb); Pista 7, monoplex PCR para IL-6 (450 pb); Pista 8, monoplex PCR para IL-19 (500 pb); Pista 9, monoplex PCR para IL-Ιβ (550 pb); e Pista 10, monoplex PCR para IL-10 (600 pb). M é um marcador de tamanho de 100-pb gerado por Forever 100-bp Ladder Personalizer. FIG 10 mostra os resultados de amplificação por PCR do gene de glicoprotéina de fusão (F) de metapneumovírus de humano (hMPV) pelo uso dos iniciadores de oligonucleotídeo de especificidade dual. Pista 1, PCR alvo usando hMPV5'-585 e conjunto de iniciadores 3'-698 de hMPV; Pista 2, PCR alvo usando conjunto de iniciadores 5'-585 de hMPV e conjunto de iniciadores 3’-1007 de hMPV; Pista 3, PCR alvo usando iniciadores de β-actina de humano; Pista 4, PCR alvo sem gabarito; e Pista 5, PCR alvo sem gabarito.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção em geral é direcionada a (a) uma ampla variedade de processos usando um oligonucleotídeo de especificidade dual e (b) um oligonucleotídeo de especificidade dual para o mesmo. O oligonucleotídeo de especificidade dual desta invenção (daqui em diante referido como “oligo DS") permite que iniciador ou sonda seja anelado em sua seqüência alvo com especificidade melhorada, de tal modo que a especificidade da amplificação de ácido nucleico (em particular, PCR) e a reação de hibridização possam ser significativamente melhoradas. Oligonucleotídeo de especificidade dual (Oligo DS) Em um aspecto desta invenção, um oligonucleotídeo de especificidade dual para sintetizar uma molécula de ácido nucleico por uma reação de extensão dependente de gabarito, que é representada pela seguinte fórmula geral: 5,-Xp-Yq.Zr-3' na qual, Xp representa uma porção de especificidade de Tm alta-5’ possuindo uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, Yq representa uma porção de separação compreendendo pelo menos duas bases universais, Zr representa a porção de especificidade de Tm baixa-3’ possuindo uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, p, q e r representam o número de nucleotídeos, e X, Y, e Z são desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo; a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não-pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ são aneladas no ácido nucleico de gabarito, permitindo que a porção de especificidade de Tm alta-5’ se separe da porção de especificidade de Tm baixa-3’ em termos de especificidade anelar para o ácido nucleico de gabarito, deste modo a especificidade anelar do oligonucleotídeo é determinada dualmente pela a porção de especificidade de Tm alta-5’ e pela porção de especificidade de Tm baixa-3’ de tal maneira que a especificidade anelar total do oligonucleotídeo seja intensificada. O termo “especificidade dual” com referência ao oligonucleotídeo DS (daqui em diante referido como "oligo DS") desta invenção aqui usado é cunhado para descrever sua característica proeminente de que sua especificidade de anelamento em uma seqüência alvo é dualmente determinada por suas duas porções separadas, i.e., a porção de especificidade de Tm alta-5’ a porção de especificidade de Tm baixa-3’. Em geral, a especificidade de anelamento de iniciadores ou sondas é governada por sua seqüência consecutiva. Em contraste, a especificidade de anelamento do oligo DS é dualmente determinada por suas duas porções (a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’) separadas pela porção de separação, em cujo caso estas três porções estão localizadas em uma seqüência de oligonucleotídeo. Tal especificidade dual permite que o oligo DS sirva como um iniciador e uma sonda exibindo especificidade muito maior, tomando a presente invenção nova e não óbvia sobre a técnica anterior.

Entretanto, o presente inventor já tem desenvolvido o ACP (iniciador de controle de anelamento) para melhorar a especificidade de anelamento como descrito em WO 03/050303, cujos ensinamentos são aqui incorporados como referência. O oligo DS desta invenção é distintamente diferente de ACP à luz do seguinte: (Í) o oligo DS possui duas porções de especificidade a serem hibridizadas com uma seqüência alvo enquanto que o ACP possui apenas uma porção de especificidade; (ii) três porções no oligo DS são distintamente discriminadas em vista de Tm enquanto que as porções em ACP não o são; (iii) o iniciador DS é estendido para sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar ao gabarito apenas quando anelamento ocorre por ambas a porção de especificidade de Tm alta-5 * e a porção de especificidade de Tm baixa-3', enquanto que o ACP é estendido até mesmo quando anelamento ocorre pela porção de extremidade 3’; e (iv) assim a especificidade de anelamento ou de hibridização do oligo DS é determinada dualmente pelas duas porções separadas, i.e., a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’, enquanto que o ACP é governado apenas pela porção de extremidade-3’. Conseqüentemente, podería ser reconhecido que a especificidade de anelamento ou de hibridização do oligo DS em sua seqüência alvo é muito maior do que aquela de ACP, chamando a atenção de que o oligo DS é novo e não óbvio sobre o ACP. A característica surpreendente do oligo DS é que possui três porções diferentes com propriedades distintas dentro de uma molécula de oligonucleotídeo: porção de especificidade de Tm alta-5’, porção de especificidade de Tm baíxa-3’ e porção de separação. O oligo DS é útil em, uma ampla variedade de processos e de análises envolvendo uma reação de extensão dependente de gabarito. O termo aqui usado "uma reação de extensão dependente de gabarito" significa uma reação para estender uma molécula de oligonucleotídeo hibridizada em uma seqüência alvo pela incorporação de nucleotídeos sucessivos em seu grupo de extremidade no qual a seqüência estendida é determinada por uma seqüência gabarito complementar.

Uma representação esquemática dos princípios governando a especificidade de hibridização (anelamento) do oligo DS é ilustrada na Fig. A. Referindo à Fig. A, o oligo DS será descrito com mais detalhe.

Onde apenas a porção de especificidade de Tm alta-5’ do oligo DS é anelada em um gabarito, ele não pode servir como um sítio de iniciação para uma extensão dependente de gabarito, resultando em nenhuma ocorrência de extensão.

Enquanto que a porção de especificidade de Tm alta-5’ do oligo DS é anelada em uma seqüência não-alvo, a porção de especificidade de Tm baíxa-3’ possuindo uma seqüência mais curta é improvavelmente anelada na seqüência não-alvo. As razões para isto são que a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’estão separadas pela porção de separação em termos de eventos de anelamento. Em outras palavras, a porção de especificidade de Tm baixa-3’ está envolvida nos eventos de anelamento em uma maneira relativamente independente da porção de especificidade de Tm alta-5’ e o anelamento da porção de especificidade de Tm baixa-3’ é menos afetado pelo anelamento da porção de especificidade de Tm alta-5’. Nesta conexão, a possibilidade de anelamento da porção de especificidade de Tm baixa-3’ em uma seqüência não-alvo se toma muito menor.

Onde apenas a porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma seqüência complementar a um sítio não-alvo, o anelamento quer não ocorre sob certas condições de estringência alta, e.g., condições estringentes para anelamento da porção de especificidade de Tm alta-5’. De acordo com uma modalidade preferida, é vantajoso realizar as reações de extensão dependente de gabarito usando o oligo DS sob condições estringentes com temperatura de anelamento muito maior do que a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3 Onde tanto a porção de especificidade de Tm alta-5’ quanto a porção de especificidade de Tm baixa-3’ possuem uma seqüência substancialmente complementar com um gabarito, o oligo DS pode ser anelado no gabarito e como conseqüência ocorre extensão bem sucedida.

Sem o desejo de se ligar a teoria, é crido que a porção de separação toma a porção de especificidade de Tm baixa-3’ mais sensível às condições de anelamento (e.g., temperatura e complementaridade de seqüência). Com relação a isto, a incidência da hibridização não específica entre a porção de especificidade de Tm baixa-3’ e as seqüências não alvo toma-se muito menor sob certas condições de anelamento (ou estringentes). Onde a porção de especificidade de Tm baixa-3’ bem como a porção de especificidade de Tm alta-5’ é anelada em sua seqüência alvo, a extremidade-3’ da porção de especificidade de Tm baixa-3’ mais provavelmente gera um sítio extensível por DNA polimerases.

O termo "oligonucleotídeo" como aqui usado refere-se a um oligômero linear de ligações ou monômeros modificados ou naturais, incluindo desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e semelhantes, capazes de especificamente hibridizarem com uma seqüência de nucleotídeos alvo, naturalmente ocorrente ou sinteticamente produzida. O oligonucleotídeo é preferivelmente de fita única para eficiência máxima em hibridização. Preferivelmente, o oligonucleotídeo é um oligodesoxirribonucleotídeo. O oligonucleotídeo desta invenção pode ser compreendido de dNMP naturalmente ocorrente (i.e., dAMP, dGM, dCMP e dTMP), análogos de nucleotídeo, ou derivados de nucleotídeo. O oligonucleotídeo também pode incluir ribonucleotídeos. Por exemplo, o oligonucleotídeo desta invenção pode incluir nucleotídeos com modificações de estrutura principal tais como ácido peptídeo-nucleico (PNA) (M. Egholm et al., Naíure, 365:566-568(1993)), fosforotioato DNA, fosforoditioato DNA, fosforamidato DNA, DNA amida-ligado, DNA MMI-ligado, 2'-0-metil-RNA, alfa-DNA e metil-fosfonato DNA, nucleotídeos com modificações de açúcar tais como 2'-0-metil RNA, 2'-fluoro RNA, 2’-amino RNA, 2’-0-alquil DNA, 2'-0-alil DNA, 2'-0-alquinil DNA, hexose DNA, piranosil RNA, e hexitol DNA anidro, e nucleotídeos possuindo modificações de base tais como pirimidinas C-5 substituídas (substituintes incluindo fluoro-, bromo-, cloro-, iodo-, metil-, etil-, vinil-, formil-, etinil-, propinil-, alquinil-, tiazolil-, imidazolil-, piridil-), 7-desazapurinas com substituintes C-7 (substituintes incluindo fluoro-, bromo-, cloro-, iodo-, metil-, etil-, vinil-, formil-, alquinil-, alquenil-, tiazolil-, imidazolil-, piridil-), inosina, e diamino-purina. O termo "iniciador" como aqui usado refere-se a um oligonucleotídeo, que é capaz de atuar como um ponto de iniciação de síntese quando posto sob condições nas quais síntese de produto de extensão de iniciador que é complementar a uma fita de ácido nucleico (gabarito) é induzida, i.e., na presença de nucleotídeos e de um agente para polimerização, tal como DNA polimerase, em uma temperatura e em um pH adequados. O iniciador é preferivelmente de fita única para eficiência máxima em amplificação. Preferivelmente, o iniciador é um oligodesoxírribonucleotídeo. O iniciador desta invenção pode ser compreendido de dNMP naturalmente ocorrente (i.e., dAMP, dGM, dCMP e dTMP), nucleotídeo modificado, ou nucleotídeo não-natural. O iniciador também inclui ribonucleotídeos O iniciador tem que ser suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos de extensão na presença do agente de polimerização. O comprimento exato dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, aplicação, e fonte de iniciador. O termo “anelamento” ou “iniciação” como aqui usado refere-se à justaposição de um oligodesoxinucleotídeo ou ácido nucleico em um ácido nucleico de gabarito, deste modo a justaposição permite que a polimerase polimerize os nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico que é complementar ao ácido nucleico de gabarito ou a uma sua porção. O termo usado “hibridização” aqui usado refere-se à formação de um ácido nucleico de fita dupla a partir de ácidos nucleicos de fita única complementares. Não há distinção intencionada entre os termos “anelação” e “hibridização”, e estes termos serão usados intercambiavelmente. O termo aqui usado “sonda” refere-se a uma molécula de ácido nucleico de fita única compreendendo uma porção ou porções que é (são) substancialmente complementar(e)s a uma seqüência de nucleotídeos alvo. O termo “porção” como aqui usado conjuntamente com o oligo DS desta invenção refere-se a uma seqüência de nucleotídeos separada pela porção de separação. O termo "porção de especificidade de Tm alta-5’" ou "porção de especificidade de Tm baixa-3’” refere-se a uma seqüência de nucleotídeos na extremidade-5’ ou na extremidade-3’ do oligo DS desta invenção, respectivamente, que é separada pela porção de separação. O termo "porção de especificidade de Tm alta-5’" conjuntamente com o oligo DS é intencionado para se referir a uma porção com a Tm mais alta dentre as três porções e possuindo uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico codificador gabarito. O termo “porção de especificidade de Tm baixa-3" em referência ao oligo DS significa uma porção com uma Tm menor do que a de uma porção de especificidade de Tm alta-5’ mas maior do que a Tm da porção de separação e possuindo uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito. O termo "Tm” como aqui usado refere-se à temperatura de fusão na qual metade das moléculas de um duplex de ácido nucleico são de fita única. Os termos “Tm alta” e “Tm baixa” conjuntamente com as porções no oligo DS são intencionados para descreverem um valor de Tm relativo ainda não um valor de Tm absoluto. Isto é, é apenas requerido que a Tm de uma porção de especificidade de Tm alta-5 ’ seja alta em relação àquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’. A porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ são planejadas para possuírem uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobre uma molécula de ácido nucleico de gabarito para hibridizar com a mesma. O termo “substancialmente complementar” em referência ao oligo DS como aqui usado significa que a molécula de oligonucleotídeo é suficientemente complementar para seletivamente hibridizar em uma seqüência de ácido nucleico de gabarito sob condições de anelamento ou condições estringentes planejadas, de tal modo que o oligonucleotídeo anelado pode ser estendido por uma polimerase para formar uma cópia complementar do gabarito. Portanto, este termo possui um significado diferente de “perfeitamente complementar” ou seus termos relacionados. Será reconhecido que uma porção de especificidade de Tm alta-5’ e uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ do oligo DS podem possuir uma ou mais más combinações em um gabarito em uma extensão que o oligo DS pode servir como iniciador ou sonda. Mais preferivelmente, a porção de especificidade de Tm alta-5’ e/ou porção de especificidade de Tm baixa-3’ do oligo DS possuem uma seqüência de nucleotídeos perfeitamente complementar a um sítio sobre um gabarito, i.e., sem más combinações.

Para desempenho bem sucedido do oligo DS, é essencial que a Tm de uma porção de especificidade de Tm alta-5’ seja maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’. É preferido que a Tm de uma porção de especificidade de Tm alta-5’ varie de 40°C a 80°C, com maior preferência, 40°C a 75°C, ainda com maior preferência, 50°C a 68°C, e mais preferivelmente, 50°C a 65°C. É preferido que Tm de uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ varie de 10°C a 40°C, com maior preferência, 15°C a 40°C, e mais preferivelmente, 20°C a 35°C. Preferivelmente, a Tm de uma porção de especificidade de Tm alta-5’ é pelo menos 5°C mais alta, com maior preferência pelo menos 10°C, ainda com maior preferência pelo menos 15°C, e mais preferivelmente pelo menos 20°C mais alta do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’. Vantajosamente, a Tm de uma porção de especificidade de Tm alta-5’ é mais alta 5-70°C, preferivelmente, 10-70°C, com maior preferência, 10-60°C, ainda com maior preferência, 10-50°C, ainda com preferência bem maior, 10-40°C e mais preferivelmente, 20-40°C do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’.

De acordo com uma modalidade preferida, a porção de especificidade de Tm alta-5’ é mais longa do que a porção de especificidade de Tm baíxa-3’. O comprimento da porção de especificidade de Tm alta-5’ é preferivelmente 15 a 40 resíduos de nucleotídeos, com maior preferência, 15 a 30 resíduos de nucleotídeos, e mais preferivelmente, 20 a 25 resíduos de nucleotídeos. O comprimento da porção de especificidade de Tm baixa-3’ é preferivelmente 3 a 15 resíduos de nucleotídeos, com maior preferência, 5 a 15 resíduos de nucleotídeos, e mais preferivelmente, 6 a 12 resíduos de nucleotídeos. A porção de separação compreendendo pelo menos duas bases universais é parcialmente responsável pelas vantagens e características do oligo DS. O termo “base universal” como aqui usado refere-se a uma capaz de formar pares de bases umas com as outras das bases de DNA/RNA naturais com pouca discriminação entre elas.

Tem sido amplamente sabido que os nucleotídeos em algumas posições ambíguas de iniciadores degenerados têm sido substituídos pela base universal tal como desoxiinosina (Ohtsuka, E. et al., (1985) J. Biol Chem. 260, 2605-2608; e Sakanari, J.A. et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sei. 86, 4863-4867), l-(2'-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol (Nichols, R. et al., (1994) Nature 369, 492-493) e 5-nitro-indol (Loakes, D. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4039-4043) para solucionar os problemas de planejamento associados com os iniciadores degenerados, porque tais bases universais são capazes de parear bases não específicas com todas as quatro bases convencionais. Contido, não tem havido relatório de que estas bases universais permitem a formação de uma porção de uma molécula de oligonucleotídeo para gerar uma estrutura de bolha durante anelamento (hibridização) ou amplificação e então separam duas seqüências adjacentes opostas, resultando na elevação da especificidade de anelamento de iniciador ou sonda em uma seqüência alvo por especificidade dual por intermédio de duas porções de especificidade (anelamento) separada.

De acordo com uma modalidade preferida, a base universal na porção de separação é selecionada do grupo consistindo de desoxiinosina, inosina, 7-desaza-2,-desoxiinosina, 2-aza-2'-desoximosina, 2-OMe-inosina, 2f-F-inosina, desoxi-3-nitro-pirrol, 3-nitro-pirrol, 2’-OMe-3-nitro-pirrol, 2'-F-3-nitro-pirrol, 1 -(2'-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3 -nitro-pirrol, desoxi-5- nitro-indol, 5-nitro-indol, 2’-OMe-5-nitro-indol, 2'-F-5-nitro-indol, desoxi-4-nitro-benzimidazol, 4-nitro-benzimidazol, desoxi-4-amino-benzimidazol, 4-amino-benzimidazol, desoxi-nebularina, 2-F-nebularina, 2'-F-4-nitro-benzimidazol, ΡΝΑ-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitro-benzimidazol, ΡΝΑ-3-nitro-pirrol, morfolino-5-nitro-indol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitro-benzimidazol, morfolino-3-nitro-pirrol, fosforoamidato-5-nitro-indol, fosforoamidato-nebularina, fosforoamidato-inosina, fosforoamidato-4-nitro-benzimidazol, fosforoamidato-3-nitro-pirrol, 2'-0-metóxi-etil-inosina, 2-O-metóxi-etil-nebularina, 2'-0-metóxi-etil-5-nitro-indol, 2'-0-metóxi-etil-4-nitro- benzimidazol, 2'-0-metóxi-etil-3-nitro-pirrol, e suas combinações. Com maior preferência, a base universal ou análogo de base não-discriminatória é desoxiinosina, l-(2'-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol ou 5-nitro-indol, mais preferivelmente, desoxiinosina.

Tais bases universais podem estar contidas na porção de separação em uma maneira contígua ou maneira interrompida com outros nucleotídeos tais como dNMPs. É preferível que a porção de separação compreenda nucleotídeos possuindo bases universais, preferivelmente, desoxiinosina. É crítico que a porção de separação no oligo DS possua a Tm mais baixa nas três porções, com o objetivo de que a porção de separação forme uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições de que a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baíxa-3’ sejam aneladas no ácido nucleico de gabarito, permitindo que a porção de especificidade de Tm alta-5’ se separe da porção de especificidade de Tm baixa-3’ em termos de especificidade de anelamento no ácido nucleico de gabarito, deste modo a especificidade de anelamento do oligonucleotídeo é determinada dualmente pela porção de especificidade de Tm alta-5’ e pela porção de seletividade de Tm baixa-3’ de tal modo que a especificidade de anelamento total do oligonucleotídeo seja consideravelmente intensificada. Preferivelmente, a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C, com maior preferência, 4°C a 15°C, e mais preferivelmente 5°C a 10°C.

De acordo com uma modalidade preferida, a porção de separação entre a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ contém pelo menos 3 bases universais, com maior preferência pelo menos 4 bases universais, e mais preferivelmente pelo menos 5 bases universais. De acordo com uma modalidade preferida, a porção de separação contém 2-10 bases universais, com maior preferência 3-10 bases universais, ainda com maior preferência, 4-8 bases universais, e mais preferivelmente, 5-7 bases universais.

Onde um iniciador ou uma sonda possuindo uma seqüência mais longa é requerido(a), as vantagens do oligo DS são mais realçadas. Por exemplo, de acordo com uma técnica convencional, um iniciador possuindo uma seqüência de nucleotídeos mais longa do que 35 pb como uma seqüência de hibridização é mais confiável para gerar amplicons não específicos. Em contraste, o oligo DS pode gerar amplicons específicos até mesmo com seqüências longas, porque ele transporta duas seqüências de hibridização (i.e., a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’) separadas uma da outra em termos de interação molecular com gabaritos (i.e., anelamento). Por exemplo, o oligo DS pode conter 35-45 pb de uma seqüência de hibridização complementar a uma seqüência alvo. Com relação a isto, podería ser reconhecido que a presente invenção permite que sejam planejados iniciadores com seqüências muito maiores consideradas como não praticáveis em estratégias de planejamento de iniciador convencionais.

De acordo com uma modalidade preferida, a porção de especificidade de Tm alta-5’ é de 15 a 25 nucleotídeos em comprimento, a porção de separação é de 3 a 15 nucleotídeos em comprimento, e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ é de 3 a 15 nucleotídeos em comprimento.

Com maior preferência, a porção de especificidade de Tm alta-5’ é de 15 a 25 nucleotídeos em comprimento; a porção de separação é de 3 a 10 nucleotídeos em comprimento; e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ é de 5 a 15 nucleotídeos em comprimento. Mais preferivelmente, a porção de especificidade de Tm alta-5’ é de 15 a 25 nucleotídeos em comprimento; a porção de separação é de 5 a 7 nucleotídeos em comprimento; e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ é de 6 a 10 nucleotídeos em comprimento. De acordo com o oligo DS ilustrativo e exemplar descrito nos Exemplos, a porção de especificidade de Tm alta-5’é cerca de 20 nucleotídeos em comprimento; a porção de separação é cerca de 5 nucleotídeos em comprimento; e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ é cerca de 8-10 nucleotídeos em comprimento.

Na modalidade mais preferida, o oligo DS é representado pela seguinte fórmula geral: 5,-Xp-(dI)q.Zr-3' (definição e características de Xp e Zr são as mesmas como descritas previamente, dl representa desoxiinosina, (dl)q representa a porção de separação compreendendo nucleotídeos contíguos possuindo bases universais e q é um número inteiro entre 5 e 7). O interessante é que o presente oligo DS também possui tolerância à má combinação sob as condições estringentes suficiente para tolerar má combinação em sua seqüência alvo.

Uma representação esquemática para os princípios governando a tolerância à má combinação do oligo DS é ilustrada em Fig. 1B. Uma ou mais, preferivelmente uma a três más combinações de bases na porção de especificidade de Tm alta-5 ’ podem ser toleradas sob a condição de que ambas a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ sejam aneladas no gabarito. Uma ou mais, preferivelmente uma a duas más combinações de bases na porção de especificidade de Tm baixa-3’ podem ser toleradas sob a condição de que ambas a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Ttn baixa-3’ sejam aneladas no gabarito. Em adição, uma ou mais, preferivelmente uma a cinco más combinações de bases em ambas a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ podem ser toleradas sob condições de que ambas a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ sejam aneladas no gabarito.

Para impor tolerância à má combinação sobre o oligo DS, a condição de anelamento, notavelmente, a temperatura de anelamento é importante. O anelamento é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3’, ainda anelamento por todas as porções ocorre quando a porção de especificidade de Tm alta-5’ e/ou a porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma ou mais, ainda limitadas, bases mal combinadas em seu sítio alvo. Os oligos DS possuindo tolerância à má combinação são requeridos para amplificar ou detectar uma seqüência de nucleotídeos com diversidade genética. Os oligos DS com tolerância à má combinação podem ser anelados nas seqüências alvo mostrando diversidade genética e resultam em amplificação e detecção bem sucedidas de seqüências de nucleotídeos de interesse. Em outras palavras, o oligo DS originalmente desenvolvido para dramaticamente intensificar especificidade de anelamento e hibridização também pode ser usado em processos para requerer tolerância à má combinação onde condições estríngentes ou de anelamento são adequadamente ajustadas.

Em outro aspecto desta invenção, é proporcionado um método para permitir que uma especificidade de anelamento de um oligonucleotídeo seja dualmente determinada por intermédio de uma estrutura de oligonucleotídeo, que compreende as etapas de: (a) selecionar uma seqüência de ácido nucleico; (b) planejar uma seqüência de um oligonucleotídeo possuindo (i) uma seqüência de hibridização substancialmente complementar ao ácido nucleico alvo e (ii) uma porção de separação compreendendo pelo menos duas bases universais, de tal modo que a porção de separação intervém na seqüência de hibridização para formar três porções no oligonucleotídeo; e (c) determinar a posição da porção de separação no oligonucleotídeo para permitir que a porção na direção-5’ da porção de separação possua uma Tm mais alta do que a da porção na direção-3’ da porção de separação e para permitir que a porção de separação possua a Tm mais baixa nas três porções, proporcionando deste modo um oligonucleotídeo possuindo três porções diferentes com valores de Tm diferentes entre elas na qual (i) uma porção de especificidade de Tm alta-5’ do oligonucleotídeo possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar ao ácido nucleico alvo, (ii) uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ do oligonucleotídeo possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar ao ácido nucleico alvo; e (iii) a porção de separação do oligonucleotídeo entre a porção de especificidade de Tm alta-5 ’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3* compreende pelo menos duas bases universais; e a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’ e a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções, pelo qual a especificidade anelar do oligonucleotídeo para o ácido nucleico alvo é determinada dualmente tanto pela porção de especificidade de Tm alta-5’ quanto pela porção de especificidade de Tm baixa-3’. O presente método é direcionado para proporcionar uma abordagem nova para dramaticamente aumentar a especificidade de anelamento de um oligonucleotídeo a ser hibridizado com sua seqüência alvo. O presente método também é expressado domo um método para melhorar uma especificidade de anelamento e um oligonucleotídeo. Além disso, a presente invenção é expressada como um método usando uma porção de separação compreendendo pelo menos duas bases universais para melhorar a especificidade de anelamento de um oligonucleotídeo hibridizado em uma seqüência alvo. O presente método é realizado para preparar o oligo DS discutido aqui acima. Portanto, no interesse de evitar de redundância desnecessária, as descrições comuns entre eles não estão sendo repetidas mas são incorporadas nesta descrição do método como se fossem repetidas. A maioria dos métodos convencionais para planejamento de iniciadores ou sondas usa meramente uma seqüência como hibridizável em suas seqüências alvo como disponível. Além disso, para aumentar a especificidade de anelamento de oligonucleotídeos, tem sido convencionalmente tentado ajustar as condições de amplificação ou de hibridização tais como temperatura e concentração de íons.

Em contraste, o presente método proporciona uma estratégia nova para aumentar a especificidade de anelamento pela introdução de características novas nas sequências de oligonucleotídeo per se. O termo "por intermédio de uma estrutura do oligonucleotídeo" aqui usado com referência à permissão de que a especificidade de anelamento de oligonucleotídeos seja dualmente determinada significa que a estrutura de oligonucleotídeos contribui pesadamente para aumentar a especificidade de anelamento de oligonucleotídeos pela imposição sobre os oligonucleotídeos de uma característica nova para ser dualmente determinada em termos de especificidade de anelamento. É crítico no presente método o planejamento de uma sequência de um oligonucleotídeo possuindo (i) uma seqüência de hibridização substancialmente complementar ao ácido nucleíco alvo e (ii) uma porção de separação compreendendo pelo menos duas bases universais. Nesta etapa, o esboço estrutural do oligonucleotídeo é apresentado para mostrar uma porção de extremidade-5’ / porção de separação / porção de extremidade-3’ no oligonucleotídeo. Ambas as porções de extremidade-5’ e de extremidade-3’ trazem uma seqüência de hibridização substancialmente complementar ao ácido nucleico alvo e estão interpostas pela porção de separação. A etapa mais crítica na presente invenção é determinar a posição da porção de separação no oligonucleotídeo para permitir que uma porção na direção-5’ da porção de separação possua uma Tm maior do que a de uma porção na direção-3’ da porção de separação e para permitir que a porção de separação possua a Tm mais baixa nas três porções, proporcionando deste modo um oligonucleotídeo possuindo três porções distintas com valores de Tm distintos uns dos outros.

As características estruturais novas introduzidas nos oligonucleotídeos pelo presente método são: (i) três porções distintas (porção de especificidade de Tm alta-5’, porção de separação e porção de especificidade de Tm baixa-3’) em seqüências de oligonucleotídeo; (ii) valores de Tm diferentes uns dos outros das três porções; (iii) porção de separação entre a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ compreendendo pelo menos duas bases universais; (iv) duas porções envolvidas em interação molecular com alvos em etapa de anelamento, que estão separadas em termos de evento de anelamento pela porção de separação; (v) valores de Tm seguindo a ordem de a porção de especificidade de Tm alta-5’, porção de especificidade de Tm baixa-3’ e porção de separação. Tais características estruturais garantem que a especificidade de anelamento de oligonucleotídeos finalmente proporcionada pela presente invenção seja dualmente determinada por ambas a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’, permitindo o aumento dramático na especificidade de anelamento de oligonucleotídeos em sua seqüência alvo.

Os oligonucleotídeos planejados e preparados de acordo com o presente método exibem especificidade de anelamento muito mais alta do que aqueles não possuindo tais três porções.

As características e vantagens do oligo DS serão descritas como segue: (a) a porção de separação do oligo DS compreende pelo menos duas bases universais que gera a região de Tm mais baixa no oligo DS, de modo que forma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ são aneladas no ácido nucleico de gabarito. Tal estrutura de bolha de não pareamento de bases permite que a porção de especificidade de Tm alta-5’ se separe da porção de especificidade de Tm baixa-3’ em termos de especificidade de anelamento no ácido nucleico de gabarito; (b) A Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, e a porção de separação mostra a Tm mais baixa, o que toma possível estabelecer condições estringentes sob as quais não ocorre o anelamento pela porção de especificidade de Tm baixa-3’; (c) assim, a especificidade total de anelamento do oligo DS é determinada dualmente por ambas a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’; e (d) conseqüentemente, a especificidade total de anelamento do oligo DS é dramaticamente melhorada.

Pode ser reconhecido que o oligo DS da presente invenção é muito útil em uma variedade de (i) métodos de amplificação de ácido nucleico codificador baseados em iniciador tais como os métodos de Miller, Η. I. (WO 89/06700) e Davey, C. et al. (EP 329,822), Reação em Cadeia da Ligase (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), Reação em Cadeia da Polimerase Ligase (Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), Reação em Cadeia de Reparo (EP 439.182), 3 SR (Kwoh et al, PNAS, USA, 86:1173(1989)) e NASBA (Pat. U.S. de No. 5.130.238), (ii) tecnologias baseadas em extensão de iniciador tais como seqüenciamento cíclico (Kretz et al., (1994) Cycle sequencing. PCR Methods Appl. 3:S107-S112) e pirosseqüenciamento (Ronaghi et al, (1996) Anal. Biochem., 242:84-89; and (1998) Science 281:363-365), e (iii) tecnologias baseadas em hibridização tal como detecção de uma seqüência de nucleotídeos alvo usando microarranjo de oligonucleotídeo. O oligo DS da presente invenção pode ser aplicado em uma variedade de tecnologias baseadas em amplificação, seqüenciamento e hibridização de ácido nucleico. Exemplos representativos para provar o efeito do oligo DS são como segue: I. Aplicação para sintetizar uma molécula de ácido nucleico Em outro aspecto desta invenção, é proporcionado um método para sintetizar uma molécula de ácido nucleico usando oligonucleotídeo de especificidade dual por uma reação de extensão dependente de gabarito, que compreende as etapas de: (a) anelar o oligonucleotídeo de especificidade dual em uma molécula de ácido nucleico de gabarito, no qual o oligonucleotídeo de especificidade dual possui três porções nas quais uma porção de especificidade de Tm alta-5’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, uma porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo; Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não-pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ são aneladas no ácido nucleico de gabarito, no qual o anelamento é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas por uma porção de especificidade de Tm baixa-3’; e (b) estender o oligonucleotídeo de especificidade dual para sintetizar a molécula de ácido nucleico complementar ao ácido nucleico de gabarito.

Visto que o método de síntese desta invenção emprega o oligo DS desta invenção, as descrições comuns entre eles são omitidas com o objetivo de evitar a complexidade deste relatório descritivo acarretando multiplicidade indevida.

Este pedido usando o oligo DS da presente invenção pode proporcionar um método melhorado para seletivamente sintetizar uma seqüência de ácido nucleico complementar a uma seqüência alvo por uma reação de extensão dependente de gabarito envolvendo etapas de anelamento e extensão. Em particular, a síntese de uma seqüência de ácido nucleico complementar a uma seqüência alvo pode ser realizada pela repetição do processo de reação de extensão dependente de gabarito no qual as etapas de anelamento e extensão são seguidas pela etapa de desnaturação. O método da presente invenção pode ser usado para sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar a qualquer molécula de ácido nucleico de gabarito. Tal molécula pode ser quer DNA quer RNA. A molécula pode estar na forma quer de fita única quer de fita dupla. Onde o ácido nucleico como material inicial é de fita dupla, é preferido tomar as duas fitas em uma forma de fita única ou parcialmente de fita única. Métodos que conhecidamente separam as fitas incluem, mas sem limitação, aquecimento, tratamento com álcali, com formamida, com uréia ou com glioxal, métodos enzimáticos (e.g., ação de helicase), e proteínas ligantes. Por exemplo, separação de fitas pode ser realizada por aquecimento em temperatura variando de 80°C a 105°C. Métodos gerais para realizar este tratamento são proporcionados por Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001).

Onde um mRNA é empregado como material inicial, uma etapa de transcrição reversa é necessária antes da realização da etapa de anelamento, cujos detalhes são encontrados em Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); e Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)). Para transcrição reversa, é usado um iniciador oligonucleotídeo dT hibridizável em cauda poli A de mRNA. O iniciador oligonucleotídeo dT é compreendido de dTMPs, um ou mais dos quais pode ser substituído por outros dNMPs desde que o iniciador dT possa servir como iniciador. Transcrição reversa pode ser feita com transcriptase reversa que possui atividade de RNase H. Se se utiliza uma enzima possuindo atividade de RNase H, pode ser possível omitir a etapa de digestão por R Nase H separada pela escolha cuidadosa das condições de reação.

Os presentes métodos não requerem que as moléculas de ácido nucleico de gabarito possuam qualquer comprimento ou sequência particular. Em particular, as moléculas incluem qualquer ácido nucleico procariótico, eucariótico (por exemplo, de protozoário e de parasitas, de fimgos, de levedura, de plantas superiores, de animais inferiores e superiores, incluindo mamíferos e humanos), viral (por exemplo, vírus do Herpes, HIV, vírus de influenza, vírus Epstein-Barr, vírus da hepatite, poliovírus, etc.), ou viróide. A molécula de ácido nucleico também pode ser qualquer molécula de ácido nucleico que tem sido ou pode ser quimicamente sintetizada. Assim a seqüência de ácido nucleico pode ou não ser encontrada na natureza. O oligo DS usado na presente invenção é hibridizado ou anelado em um sítio sobre o gabarito de tal modo que seja formada uma estrutura de fita dupla. Condições de anelamento de ácido nucleico adequadas para formar tais estruturas de fita dupla são descritas por Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) e Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985). As seqüências da porção de especificidade de Tm alta-5’ e da porção de especificidade de Tm baixa-3’ do oligo DS não precisam exibir complementaridade precisa, porém necessitam apenas ser substancialmente complementares em seqüência para serem capazes de formarem uma estrutura de fita dupla estável. Assim, desvios da complementaridade completa são permissíveis, desde que tais desvios não sejam suficientes para completamente impedirem a hibridização para formar uma estrutura de fita dupla. Anelamento do oligo DS em um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito é um pré-requisito para sua polimerização dependente de gabarito com polimerases. Fatores (veja Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); e Haymes, B.D., et. al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)) que afetam o pareamento de bases do oligo DS em seus ácidos nucleicos complementares substancialmente afetam a eficiência de iniciação. A composição de nucleotídeos do oligo DS pode afetar a temperatura na qual o anelamento é ótimo e portanto pode afetar sua eficiência de iniciação. A porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baíxa-3’ do oligo DS durante a etapa de anelamento desempenham um papel como uma porção de hibridização ou um sítio de determinação de especificidade (i.e., sítio de determinação de especificidade dual), enquanto que a porção de separação não serve como um sítio de hibridização e não interage com o gabarito para pareamento de bases.

Uma variedade de DNA polimerases pode ser usada na etapa de extensão dos presentes métodos, que inclui fragmento de "Klenow" e DNA polimerase I de E. coli, uma DNA polimerase termoestável, e DNA polimerase de bacteriófago T7. Preferivelmente, a polimerase é uma DNA polimerase termoestável que pode ser obtida de uma variedade de espécies bacterianas, incluindo Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, e Pyrococcus furiosus (Pfü). Quando uma reação de polimerização estiver sendo conduzida, é preferível proporcionar os componentes requeridos para tal reação em excesso no vaso de reação. Excesso em referência aos compostos da reação de extensão refere-se a uma quantidade de cada componente de tal modo que a capacidade para alcançar a extensão desejada não seja substancialmente limitada pela concentração daquele componente. É desejável proporcionar à mistura reacional uma quantidade de cofatores requeridos tais como Mg2+, dATP, dCTP, dGTP, e dTTP em quantidade suficiente para manterem o grau de extensão desejada.

Anelamento ou hibridização no presente método é realizado sob condições estringentes que permitem a ligação específica entre o oligo DS e o ácido nucleico de gabarito. Tais condições estringentes para anelamento serão dependentes de seqüência e variadas dependendo dos parâmetros ambientais. No presente método, a etapa de anelamento é geralmente realizada sob condições de estringência alta. In Contudo, se o presente método for aplicado em processos requerendo tolerância à má combinação, será preferível que a etapa de anelamento seja realizada sob condições estringentes nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ são aneladas no gabarito a despeito da presença de uma ou mais, ainda limitadas, más combinações de pares de bases. Tal tolerância à má combinação é muito útil na amplificação ou detecção de um gene com diversidade genética. Condições estringentes podem ser prontamente determinadas do conhecimento padrão na técnica. É vantajoso realizar a etapa de anelamento em uma temperatura de anelamento maior do que a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3’, garantindo que não ocorra anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3’. Preferivelmente, a temperatura de anelamento é mais alta pelo menos 5°C, com maior preferência pelo menos 10°C, ainda com maior preferência pelo menos 15°C, e mais preferivelmente pelo menos 20°C do que a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3’.

Em uma modalidade preferida, a temperatura de anelamento varia de cerca de 40°C a 75°C, com maior preferência, 45°C a 72°C, ainda com maior preferência, 50°C a 68°C, e mais preferivelmente, 55°C a 65°C. Temperaturas de anelamento adequadas no presente método podem ser determinadas pela consideração independentemente do valores de Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ e da porção de especificidade de Tm baixa-3’. Em outras palavras, temperaturas de anelamento no presente método não são determinadas pelo comprimento total e pelas composições de nucleotídeos de ambas a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ mas pelo comprimento individual e pela composição individual da porção de especificidade de Tm alta-5’ e/ou da porção de especificidade de Tm baixa-3’. Normalmente, a temperatura de anelamento determinada pela consideração apenas da Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ pode ser muito maior do que a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3’ e se tomar uma ótima.

Se tolerância à má combinação for requerida na etapa de anelamento, será preferido que a temperatura de anelamento seja ajustada para se tomar menor do que aquelas indicadas acima. O presente método pode ser combinado com muitos outros processos conhecidos na técnica para alcançar um objetivo específico. Por exemplo, o isolamento (ou a purificação) de produto sintetizado pode depois da reação de extração. Isto pode ser realizado por eletroforese em gel, cromatografia em coluna, cromatografia de afinidade, ou hibridização. Em adição, o produto sintetizado desta invenção pode ser inserido em veículo adequado para clonagem. Além disso, o produto sintetizado desta invenção pode ser expressado em um vetor de expressão hospedando hospedeiro adequado. II. Aplicação para amplificar seqüência de ácido nucieico alvo Em ainda outro aspecto desta invenção, é proporcionado um método para seletivamente amplificar uma seqüência de ácido nucieico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos, que compreende amplificar a seqüência de ácido nucieico alvo pela realização de pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão de iniciador, e desnaturação, usando um par de oligonucleotídeos de especificidade dual como um iniciador; no qual o oligonucleotídeo de especificidade dual possui três porções nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico alvo para hibridizar com o mesmo, uma porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico alvo para hibridizar com o mesmo, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ são aneladas no ácido nucleico alvo; no qual o anelamento na reação de amplificação é realizado sob condições nas quais não ocorre anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3’.

Visto que o método de amplificação desta invenção emprega o oligo DS desta invenção, as descrições comuns entre eles são omitidas com o propósito de se evitar a complexidade deste relatório descritivo acarretando multiplicidade indevida. Em adição, visto que este método envolve processos de anelamento e extensão, as descrições dos dois processos são omitidas com o objetivo de se evitar a complexidade deste relatório descritivo acarretando multiplicidade indevida. Por exemplo, a composição e a estrutura do oligo DS usado e as condições para o anelamento e a extensão são comuns entre este processo e o método para a síntese de molécula de ácido nucleico previamente discutido.

Este pedido usando o oligo DS da presente invenção pode proporcionar um método melhorado para seletivamente amplificar uma seqüência de ácido nucleico alvo a partir de um ácido nucleico ou de uma mistura de ácidos nucleicos (DNA ou mRNA) pela realização de amplificações de ácido nucleico codificador, preferivelmente, PCR (reação em cadeia de polimerase).

Uma representação esquemática para a amplificação seletiva de um ácido nucleico alvo de DNA de fita dupla usando o oligo DS como descrito acima é ilustrada na Fig. 2. Como mostrado na Fig. 2, um par de oligos DS é anelado em um dsDNA gabarito desnaturado. A porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ durante o anelamento desempenham um papel como uma porção de hibridização ou um sítio de determinação de especificidade (i.e., sítio de determinação de especificidade dual), enquanto que a porção de separação não serve como um sítio de hibridização e não interage com o gabarito para pareamento de bases. Neste momento, a porção de separação forma uma estrutura de bolha no oligo DS, com o objetivo de que duas porções de extremidade, i.e., a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ podem estar espacialmente separadas para dualmente determinar a especificidade total do oligo DS. Detalhes de reações subseqüentes são similares àqueles das amplificações de ácido nucleico baseadas em iniciador convencional conhecidas na técnica descrita aqui acima. O presente método para amplificar uma seqüência de ácido nucleico pode ser realizada de acordo com várias amplificações de ácido nucleico baseadas em iniciador conhecidas na técnica. Preferivelmente, os métodos são realizados de acordo com o processo de PCR descrito em Patentes U.S. 4.683.195, 4.683.202, e 4.800.159, com maior preferência, o método de “hot start PCR”.

Fig. 3 ilustra uma representação esquemática para a amplificação seletiva de um ácido nucleico alvo de mRNA usando o oligo DS. Na primeira etapa, mRNA obtido de várias amostras biológicas é reversamente transcrito usando o iniciador oligo dT hibridizável na cauda poli A de mRNA e transcriptase reversa. Detalhes de transcrição reversa são encontrados em Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); e Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)). A descrição de reações subseqüentes é similar àquela das amplificações de ácido nucleico baseadas em iniciador convencionais conhecidas na técnica discutida previamente.

III. Aplicação em amplificação de Multiplex PNA

Em outro aspecto desta invenção, é proporcionado um método para amplificar duas ou mais seqüências de nucleotídeos alvo simultaneamente usando dois ou mais pares de iniciadores na mesma reação, que compreende amplificar as seqüências de nucleotídeos alvo pela realização de pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação de iniciador, usando dois ou mais pares de oligonucleotídeos de especificidade dual como um iniciador, caracterizado pelo fato de que os oligonucleotídeos de especificidade dual possuem três porções nas quais uma porção de especificidade de Tm alta-5’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência de nucleotídeos alvo para hibridizar com a mesma, a porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência de nucleotídeos alvo para hibridizar com a mesma, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; uma porção de separação forma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ são aneladas na seqüência de nucleotídeos alvo; no qual o anelamento na reação de amplificação é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3’.

Este pedido usando o oligo DS da presente invenção também pode proporcionar um método melhorado para amplificar mais do que uma seqüência alvo usando mais do que um par de iniciadores na mesma reação. Em geral, é extremamente difícil configurar condições de multiplex PCR para amplificar mais do que 10 seqüências alvo em paralelo, porque uma reação PCR ótima é requerida para amplificar até mesmo um locus específico sem quaisquer subprodutos não específicos. Visto que o anelamento necessita ocorrer em temperatura suficientemente alta para permitir a ocorrência das combinações perfeita de DNA-DNA na reação, o oligo DS da presente invenção é ideal na otimização de amplificação de multiplex DNA devido à sua função de melhoria da especificidade de amplificação. "Multiplex PCR" como aqui usado refere-se à amplificação simultânea de alvos de multiplex DNA em uma única mistura de reação em cadeia de polimerase (PCR).

Em uma modalidade específica desta invenção, este processo de Multiplexação compreende realização de uma reação de amplificação compreendendo pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação de iniciador, usando os pares de iniciadores de oligo DS, caracterizado pelo fato de que os iniciadores são um oligonucleotídeo de especificidade dual possuindo três porções nas quais uma porção de especificidade de Tm alta-5’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência de nucleotídeos alvo para hibridizar com a mesma, a porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência de nucleotídeos alvo para hibridizar com a mesma, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tra baixa-3’ são aneladas na seqüência de nucleotídeos alvo; no qual o anelamento na reação de amplificação é realizado sob condições nas quais não ocorre anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3’.

Visto que esta aplicação usando o oligo DS desta invenção é realizada de acordo com o presente método para amplificação de seqüência de ácido nucleico previamente discutido, exceto pelo uso de mais do que uma seqüência de nucleotídeos alvo e pares de iniciadores, as descrições comuns entre eles são omitidas para se evitar a complexidade deste relatório descritivo acarretando multiplicidade indevida. Por exemplo, a composição e a estrutura do oligo DS usado e as condições para amplificação, são comuns entre este processo e os presentes métodos para amplificação de seqüência de ácido nucleico previamente discutido.

De acordo com uma modalidade preferida, a temperatura de anelamento varia de cerca de 40°C a 70°C, com maior preferência, 45°C a 68°C, ainda com maior preferência, 50°C a 65°C, e mais preferivelmente, 55°C a 65°C.

Em uma modalidade preferida, os produtos amplificados de cada uma das seqüências de nucleotídeos alvo são diferentes em tamanho para análise subseqüente. De acordo com uma modalidade preferida, os produtos de amplificação das seqüência de nucleotídeos alvo multiplex podem ser analisados por meio de separação de tamanho. A comparação de separação de tamanho é realizada usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica, tais como eletroforese através de uma matriz de gel de poliacrilamida ou matriz de gel de agarose e seqüenciamento de nucleotídeos. O seqüenciamento de nucleotídeos pode ser rapidamente realizado com um seqüenciador automático disponível em vários fabricantes.

Como exemplificado em Exemplo abaixo, a multiplexação desta invenção permite que os produtos amplificados finais estejam livres de problemas de resíduos gênicos bem como de não-especificidade decorrente de processos multiplex convencionais conhecidos na técnica. A vantagem da amplificação multiplex é que numerosas doenças ou alterações de seqüência de nucleotídeos específicas (e.g., polimorfismo de nucleotídeo único ou mutação pontual) podem ser ensaiadas na mesma reação. O número de análises que podem ser realizadas simultaneamente é ilimitado; contudo, o limite superior é provavelmente cerca de 20 e é provavelmente dependente da diferença de tamanho requerida para resolução e métodos que estão disponíveis para resolver o produto amplificado. O método da presente invenção pode ser aplicado para o diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, determinação de gênero, análise de ligação genética, e estudos forenses.

IV. Aplicacão em seqiienciamento de DNA A especificidade melhorada permite que oligo DS seja usado em seqiienciamento direto como um iniciador de seqiienciamento em fase de solução (em particular, seqiienciamento cíclico) ou como uma sonda de seqiienciamento em fase sólida (em particular, seqiienciamento de chip de oligonucleotídeo) pelo uso do princípio de extensão dependente de gabarito do oligo DS.

Em ainda outro aspecto desta invenção, é proporcionado um método para seqüenciar uma molécula de ácido nucleico alvo usando um oligonucleotídeo de especificidade dual a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos, que compreende as etapas de: (a) seqüenciar uma molécula de ácido nucleico complementar à molécula de ácido nucleico alvo a ser seqüenciada pela realização de pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação de iniciador, usando o oligonucleotídeo de especificidade dual como um iniciador de seqüenciamento; no qual o oligonucleotídeo de especificidade dual possui três porções nas quais uma porção de especificidade de Tm alta-5’ possui uma seqüência de nucíeotídeos de hibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a molécula de ácido nucleico alvo para hibridizar com a mesma, a porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma seqüência de nucíeotídeos de hibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a molécula de ácido nucleico alvo para hibridizar com a mesma, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tra mais baixa nas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ são aneladas na molécula de ácido nucleico alvo; no qual o anelamento na reação de síntese é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3’; e (b) determinar uma seqüência de nucíeotídeos da molécula de ácido nucleico complementar sintetizada.

Geralmente, seqüenciamento de DNA tem sido realizado por várias metodologias tais como seqüenciamento de Maxam-Gilbert, seqüenciamento de Sanger, pirosseqüenciamento, e seqüenciamento com digestão por exonuclease. O presente método de seqüenciamento intenciona o pirosseqüenciamento bem como seqüenciamento cíclico térmico. O presente método pode ser realizado de acordo com variações do método de didesoxi de Sanger. Seqüenciamento cíclico térmico da presente invenção pode ser realizado em gabaritos de ácido nucleico amplificados por PCR. Em adição, de acordo com a invenção, seqüenciamento cíclico térmico serão realizados sobre um gabarito de ácido nucleico que não tem sido amplificado por PCR imediatamente antes do seqüenciamento.

Em resumo, seqüenciamento de Sanger é baseado no princípio de que DNA polimerase incorporará 2',3'-didesoxinucleotídeos em cadeias de ácido nucleico resultando em terminação de cadeia (Sanger et al., (1977) PNAS. USA 74:5463). O método desenvolvido por Sanger é referido como o método de terminação de cadeia didesoxi. No mais tradicional deste método, um segmento de DNA para o qual a sequência é desejada é clonado em um fago de DNA de fita única, tal como Ml 3. Estes DNAs de fago podem servir como modelos para a síntese iniciada da fita complementar pelo fragmento de Klenow de DNA polimerase I. O iniciador é um oligonucleotídeo sintético para hibridizar especificamente com uma região do vetor Ml3 próxima da extremidade 3’ do inserto clonado. Em cada uma de quatro reações de seqüenciamento, a síntese iniciada é realizada na presença de didesoxi-análogo suficiente de um dos quatro possíveis desoxinucleotídeos, com o objetivo de que as cadeias em crescimento sejam aleatoriamente terminadas pela incorporação destes nucleotídeos de extremidade-morta. A concentração relativa das formas didesoxi para desoxi é ajustada para dar uma propagação de eventos de terminação correspondendo a todos os possíveis comprimentos de cadeia que podem ser resolvidos por eletroforese em gel. Marcadores incorporados nas cadeias em crescimento são usados para desenvolver imagem de autorradiograma do padrão de DNA em cada canaleta de eletroforese. A seqüência dos desoxinucleotídeos no gabarito de ácido nucleico clonado é determinada a partir de um exame do padrão de bandas nas quatro pistas.

Como uma variação do método de Sanger, o método de seqüenciamento cíclico térmico normalmente envolve o uso de soluções contendo um iniciador de seqüenciamento de ácido nucleico, desoxinucleotídeo trifosfatos (ddNTPs), uma solução tampão adequada, uma DNA polimerase termicamente estável (e.g., Taq polimerase), e o gabarito de ácido nucleico a ser seqüenciado. Os detalhes de seqüenciamento cíclico térmico podem ser encontrados em Patentes U.S. 5.432.065, 5.23.298, 5.756.285, 5.817.797 e 5.831.065, cujos ensinamentos são aqui incorporados como referências em suas totalidades. Os processos do método são geralmente realizados sob condições de ciclo térmico similares à PCR comum.

Uma vez tendo sido realizada uma reação de seqüenciamento sobre um gabarito de ácido nucleico, a determinação da sequência da molécula requer que os produtos de reação sejam identificados. Um número considerável de métodos de detecção é conhecido na técnica. Estes métodos geralmente envolvem a detecção de marcadores incluindo marcadores de radionuclídeo, fluorescentes, de infravermelho e quimioluminescentes como descritos em Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1993) John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y. Os marcadores podem ser marcados com iniciadores ou ddNTP, preferivelmente, ddNTP. O marcador mais preferido é um fluorescente incluindo 6- carbóxi-fluoresceína, 6-carbóxi-X-rodamina, 3-(c-carbóxi-pentil)-3 '-etil-5,5 '-dimetil-oxa- carbocianina, 6-carbóxi-X-rodamina, derivados de ácido 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-Índaceno-3-propiônÍco, e corantes de 4,7-dicloro-rodamina.

Preferivelmente, a temperatura de anelamento varia dé cerca de 40°C a 70°C, com maior preferência, 45°C a 68°C, e mais preferivelmente, 50°C a 65°C. O presente método prova um seqüenciamento específico alto de uma molécula de ácido nucleico alvo como demonstrado no Exemplo aqui abaixo. Mais especificamente, os genes da família homeobox específicos de placenta de camundongo, Psxl e Psx2 podem ser diferentemente seqüenciados usando nosso iniciador de seqüenciamento planejado para possuir uma estrutura incomum de oligo DS. Tal seqüenciamento diferencial é realçado no sentido de que as seqüências totais dos iniciadores de seqüenciamento são diferentes em apenas uma base em uma porção de especificidade de Tm baixa-3*.

Surpreendentemente, a presente invenção permite que uma molécula de ácido nucleico alvo contida em um DNA genômico ou uma população de cDNAs seja diretamente seqüenciada sem purificação ou isolamento. 0 sucesso no seqüenciamento direto de uma molécula de ácido nucleico alvo em um DNA genômico ou em uma população de cDNAs ainda não tem sido relatado. Onde o presente método de seqüenciamento é empregado para diretamente seqüenciar uma molécula de ácido nucleico alvo contida em uma população de cDNAs a partir de um RNA total, este método compreende as etapas de: (a) contatar uma população de mRNAs com um iniciador oligonucleotídeo dT que é hibridizado na cauda poli A de mRNAs sob condições suficientes para ocorrer a síntese de ácido desoxirribonucleico enzimática conduzida por gabarito; (b) reversamente transcrever os mRNAs nos quais o iniciador oligonucleotídeo dT hibridiza para produzir uma população de fitas de primeiro DNA que são complementares aos mRNAs nos quais o iniciador oligonucleotídeo dT hibridiza; (c) sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar à primeira fita de cDNA a ser seqüenciada pela realização de pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação de iniciador, usando o oligonucleotídeo de especificidade dual como um iniciador de seqüenciamento; no qual o oligonucleotídeo de especificidade dual possui três porções nas quais uma porção de especificidade de Tm alta-5’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a primeira fita de cDNA para hibridizar com a mesma, a porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibrídização substancialmente complementar ao sítio sobre a primeira fita de cDNA para hibridizar com a mesma, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3 ’ são aneladas na primeira fita de cDNA; no qual o anelamento na reação de síntese é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3 e (d) determinar uma seqüência de nucleotídeos da primeira fita de cDNA sintetizada. V. Anlicacão em deteccão de molécula de ácido nucleico com diversidade genética Em outro aspecto desta invenção, é proporcionado um método para detectar uma molécula de ácido nucleico com diversidade genética por uma reação de extensão dependente de gabarito de um oligonucleotídeo de especificidade dual, que compreende as etapas de: (a) anelar o oligonucleotídeo de especificidade dual em uma molécula de ácido nucleico de gabarito, no qual o oligonucleotídeo de especificidade dual possui três porções nas quais uma porção de especificidade de Tm alta-5’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibrídização substancialmente complementar ao sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com a mesma, a porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibrídização substancialmente complementar ao sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com a mesma, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3 ’ são aneladas no ácido nucleico de gabarito, no qual o anelamento é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3’ e anelamento ocorre quando a porção de especificidade de Tm alta-5’ e/ou a porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma ou mais bases mal combinadas em seu sítio alvo; e (b) estender o oligonucleotídeo de especificidade dual para sintetizar a molécula de ácido nucleico complementar ao gabarito. (c) detectar a ocorrência de extensão dependente de gabarito do oligonucleotídeo de especificidade dual.

Visto que esta aplicação usando o oligo DS desta invenção é realizada de acordo com os presentes métodos para sintetizar a seqüência de ácido nucleico previamente discutida, as descrições comuns entre eles são omitidas com o propósito de se evitar complexidade deste relatório descritivo acarretando multiplicidade indevida.

Esta aplicação usando o oligo DS da presente invenção pode proporcionar um método melhorado para seletivamente detectar uma seqüência de ácido nucleico com diversidade genética por uma reação de extensão dependente de gabarito envolvendo etapas de anelamento e extensão. Em particular, a detecção de uma seqüência de ácido nucleico alvo com diversidade genética pode ser realizada pela repetição do processo de reação de extensão dependente de gabarito no qual as etapas de anelamento e de extensão são seguidas pela etapa de desnaturação A presente invenção é baseada em tolerância à má combinação do oligo DS.

Diversidade genética tem sido relatada para vários genomas. Este fenômeno tem sido considerado um obstáculo para detectar um gene ou genoma de interesse sem falha. A presente invenção é direcionada para proporcionar uma abordagem para suplantar tais problemas convencionais pelo uso de oligo DS com tolerância à má combinação. O oligo DS com uma seqüência definida pode ser anelado em várias seqüências alvo mostrando diversidade genética e resultar em amplificação e detecção bem sucedidas das seqüências de nucleotídeos de interesse. Em outras palavras, o oligo DS originalmente desenvolvido para dramaticamente intensificar a especificidade de anelamento e de hibridização também pode ser usado em processos requerendo tolerância à má combinação onde condições estringentes e anelamento são adequadamente ajustadas.

Para proporcionar o oligo DS demonstrando tolerância à má combinação, ele deve ser planejado tendo por base uma região conservada de moléculas de ácido nucleico geradas pelo alinhamento de todas as seqüências de nucleotídeos disponíveis. O termo "região conservada" como aqui usado refere-se a um segmento de seqüência de nucleotídeos de um gene ou uma seqüência de aminoácidos de uma proteína que é significativamente similar entre várias seqüências de nucleotídeos diferentes de um gene. Este termo é intercambiavelmente usado com o termo “seqüência conservada”.

Em uma modalidade preferida, a seqüência mais conservada dentro da região conservada está localizada na porção de extremÍdade-3’ do oligo DS e a seqüência menos conservada em uma porção de separação. A porção de especificidade de Tm alta-5’ e/ou a porção de especificidade de Tm baixa-3’, preferivelmente a porção de especificidade de Tm alta-5’ podem possuir uma ou mais, preferivelmente, uma a três, com maior preferência uma ou duas bases mal combinadas em seu sítio alvo devido à tolerância à má combinação do oligo DS.

Para impor tolerância à má combinação ao oligo DS, a condição de anelamento, em particular, temperatura de anelamento é importante. O anelamento é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3’, porém ocorre anelamento por todas as porções quando a porção de especificidade de Tm alta-5’ e/ou a porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma ou mais bases mal combinadas em seu sítio alvo.

Preferivelmente, a temperatura de anelamento varia de cerca de 40°C a 70°C, com maior preferência, 45°C a 68°C, e mais preferivelmente, 50°C a 65°C.

De acordo com uma modalidade preferida, a presente invenção é realizada de acordo com a reação em cadeia de polimerase (PCR). A etapa de detecção do presente método pode ser realizada por uma multiplicidade de técnicas convencionais. Por exemplo, a detecção do produto da extensão dependente de gabarito pode ser prontamente realizada por eletroforese em gel convencional se o presente método for executado em uma maneira repetida para gerar produtos suficientes para serem detectados em um gel. Se materiais marcados incluindo aqueles detectáveis por medição espectroscópica, medição fotoquímica, medição bioquímica, medição bioeletrônica, medição imunoquímica, medição eletrônica, e medição química, uma medição adequada pode ser realizada para detectar a ocorrência da extensão dependente de gabarito.

Diversidade genética é mais freqüentemente verificada e gerada em genoma viral (Nathafie B. et al., (2004) Journal of Clinicai Microbiology, 42, 3532; Tersa C. et al., (2002) Journal oflnfectious Diseases, 185, 1660; Takashi E. et al., (2004) Journal of Clinicai Microbiology, 42, 126; e Elizabeth R. et al., (2001) Clinicai Infectious Diseases, 32, 1227). Com relação a isto, é preferido que a molécula de ácido nucleico com diversidade genética a ser detectada seja um ácido nucleico de um vírus exibindo diversidade genética. Por exemplo, onde a presente invenção é aplicada para detectar metapneumovírus de humano exibindo diversidade genética por PCR, o conjunto de iniciadores mais preferível planejado para possuir a estrutura do oligo DS é mostrado nas SEQID NOs: 39 (para iniciador 5') e 40 (para iniciador 3') de SEQ ID NOs: 39 e 41 (para 3' iniciador). VI. Aplicação em deteccão de seqüência de nucleotídeos alvo usando oligos DS imobilizados sobre microarranio Esta aplicação é um processo novo para detectar seqüência de nucleotídeos alvo pela repetição da reação dependente de gabarito sobre oligo DS imobilizado sobre microarranjo.

Em outro aspecto desta invenção, é proporcionado um método para detectar a seqüência de nucleotídeos alvo em uma amostra de ácido nucleíco por uma reação de extensão dependente de gabarito, compreendendo as etapas de: (a) estender um oligonucleotídeo de especificidade dual como uma sonda imobilizada sobre um substrato compreendendo pelo menos um ciclo de uma hibridização, uma extensão dependente de gabarito e uma desnaturação, no qual a hibridização é realizada pelo contato do oligonucleotídeo de especificidade dual na amostra de ácido nucleico, no qual o oligonucleotídeo de especificidade dual possui três porções nas quais uma porção de especificidade de Tm alta-5’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência de nucleotídeos alvo para hibridizar com a mesma, a porção de separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência de nucleotídeos alvo para hibridizar com a mesma, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’ são aneladas na seqüência de nucleotídeos alvo, no qual a hibridização é realizada sob condições nas quais não ocorre hibridização apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3’; e (b) analisar a ocorrência da extensão dependente de gabarito.

Uma representação esquemática para detectar uma seqüência de nucleotídeos alvo em uma amostra de ácido nucleico pelo uso de oligo DS imobilizado sobre microarranjo é ilustrada na Fig. 4.

Este processo usando o oligos DS pode ser realizado sob condições de hibridização adequadas rotineiramente determinadas por procedimentos de otimização. Condições tais como temperatura, concentração de componentes, tempos de hibridização e de lavagem, componentes de tampão, e seu pH e sua força iônica podem ser variadas dependendo de vários fatores, incluindo o comprimento e o conteúdo por GC de oligonucleotídeo e seqüência de nucleotídeos alvo. Por exemplo, quando um oligonucleotídeo relativamente curto é usado, é preferível que condições de estringência baixa sejam adotadas. As condições detalhadas para hibridização podem ser encontradas em Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); e M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Sprínger-Verlag New York Inc. N.Y.(1999).

Os oligos DS estão imobilizados sobre um substrato. Um substrato preferível inclui suportes sólidos ou semi-sólidos adequados, tais como membrana, filtro, chip, lâmina, bolacha, fibra, glóbulo magnético ou não-magnético, gel, tubo, placa, macromolécula, micropartícula e tubo capilar. Tal imobilização pode ocorrer por meio de ligação química ou ligação covalente por radiação ultravioleta. Em uma modalidade desta invenção, os oligos DS são ligados em uma superfície de vidro modificada para conter grupos epóxido ou grupos aldeído ou em uma superfície revestida com polilisina. Além disso, os oligos DS são ligados em um substrato por intermédio de ligantes (e.g. diamina e oligômero de etileno-glicol). Oligos DS imobilizados podem ser fabricados para produzirem arranjo ou arranjos para uma dada aplicação por tecnologias de fabricação convencionais tais como fotolitografia, jato de tinta, micromanchamento mecânico, e seus derivados.

De acordo com o presente método, dNTPs usados na etapa de extração são preferivelmente marcados. Para marcação, são usados materiais detectáveis por medição espectroscópica, medição fotoquímica, medição bioquímica, medição bioeletrônica, medição imunoquímica, medição eletrônica, ou medição química. Por exemplo, os marcadores incluem, mas não se limitam a, radioisótopos como P e S , compostos quimioluminescentes, marcadores espectroscópicos, tais como marcadores de fluorescência e corantes, e marcadores magnéticos. Os corantes, por exemplo, incluem, mas não se limitam a, corante de quinolina, corante de triaril-metano, ftaleína, corante azo, e corante de cianina. Os marcadores de fluorescência incluem, mas não se limitam a, fluoresceína, ficoeritrina, rodamina, lissamina, Cy3 e Cy5 (Pharmacia). Marcação é realizada de acordo com vários métodos conhecidos na técnica.

Seqüências de nucleotídeos alvo em uma amostra de ácido nucleico são hibridizadas com os oligos DS como sondas imobilizadas em um substrato,preferivelmente, um suporte sólido, e por sua vez os oligos DS hibridizados com a seqüências de nucleotídeos alvo são estendidos usando dNTPs, preferivelmente dNTPs marcados com fluorescência e DNA polimerase em um modo dependente de gabarito. A etapa (a) é preferivelmente repetida para realizar as reações de hibridização na extensão na qual todos ou a maioria dos oligos DS são hibridizados com as seqüências de nucleotídeos alvo, tomando os resultados de análise de hibridização mais reprodutíveis. A ocorrência de hibridização é verificada com vários métodos conhecidos na técnica dependendo dos tipos de marcadores usados. Por exemplo, microscópio de fluorescência, preferivelmente, microscópio de fluorescência confocal é usado para marcadores de fluorescência, e a intensidade do sinal detectado com tais instrumentos aumenta proporcionalmente à extensão de hibridização. Microscópios de fluorescência, em geral, são equipados com um dispositivo de varredura que constrói uma imagem bidimensional quantitativa da intensidade de hibridização. A intensidade do sinal detectado com tais instrumentos aumenta proporcionalmente à extensão de hibridização e então a extensão da reação de extensão dependente de gabarito. A presente invenção agora será descrita com mais detalhe por exemplos. Será óbvio para aquelas pessoas experientes na técnica que estes exemplos são intencionados para serem mais concretamente ilustrativos e o escopo da presente invenção como descrito nas reivindicações apendidas é não limitado aos ou pelos exemplos. EXEMPLO 1: Especificidade de PCR usando oligonucleotídeos de especificidade d uai (DS) Os oligonucleotídeos DS desenvolvidos pela presente invenção foram aplicados como iniciadores para amplificar seqüências de nucleotídeos alvo de genes da família de citocina de camundongo IL-19 e IL-lbeta. O processo e os resultados para a amplificação das seqüências de nucleotídeos alvo de IL-19 e IL-lbeta usando iniciadores DS são aqui descritos.

As seguintes seqüências de iniciador convencionais foram escolhidas e usadas para comparar com os oligonucleotídeos DS em vista de especificidade de PCR: Os iniciadores convencionais específicos para IL-19 usados no Exemplo (500 pb) são: EL19-5’-0 5’-GTCTC ATCTGCTGCCCTTAAGTCTCTAGGAGAACT-3’ (SEQ ID NO:l); e IL19-3’-0 5’-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGCTTTACAATAAGTTAG-3’ (SEQ ID NO:2).

Os iniciadores convencionais específicos para IL-l-beta usados no Exemplo (550 pb) são: ILlb-5’-0 5’-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCAATACCCAAAGAAG-3’ (SEQ ID NO:3); e ILlb-3’-0 5 ^AGACCTCAGTGCAGGCTATGACC AATTCATCCC-3 ’ (SEQ ID NO:4).

Os oligonucleotídeos DS da presente invenção foram aplicados nestas seqüências de iniciador convencionais para demonstrar se os oligonucleotídeos DS podem suplantar os problemas principais decorrentes destas seqüências de iniciador convencionais, tais como geração de resíduo gênico e produtos não-específicos.

Os seguintes iniciadores DS compreendem seqüências idênticas àquelas dos iniciadores convencionais acima exceto por uma porção de separação possuindo um ligante polidesoxiinosina [poli(dl)] entre a porção 5' e a porção 3'. Os iniciadores DS são planejados para compreenderem uma porção de especificidade de Tm alta-5’ e uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ em um modo que a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, enquanto que a porção de separação possui a Tm mais baixa dentre as três porções.

Os iniciadores DS para IL-19 usados no Exemplo (500 pb) são: IL19-5’ 5 ’-GTCTCArCTG€TGCCCTTAAIIIIITAGGAGAACT-3 ’ (SEQ ID NO:5): e IL19-3’ 5’-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGmiICAATAAGTTAG-3’ (SEQ DD NO:6), nos quais I é desoxiinosina.

Os iniciadores DS para IL-lbeta usados no Exemplo (550 pb) são: ILlb-5’ 5'-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCimiCCAAAGAAG-3* (SEQ ID NO:7); e ILlb-3’ S^AGACCTCAGTGCAGGCTATGimnTCATCCC-S’ (SEQ ID NO:8), nos quais I é desoxiinosina. A amplificação por “PCR alvo” foi conduzida no volume final de 20 jjL contendo 2 pL (50 ng) de DNA genômico isolado de tecidos de placenta de ICR de cérebro de camundongo, 2 pL de tampão de reação PCR 10 x contendo 15 mM MgCb (Roche), 2 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 1 pL de 5' DS ou iniciador convencional (10 pM), 1 pL de 3' DS ou iniciador convencional (10 pM), e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura readonal foi deixado em um termociclo preaquecido (94°C); amostras foram desnaturadas por 5 min a 94°C e submetidas a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 60°C, e 1 min a 72°C, seguidos por uma incubação de 7 min a 72°C.

Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese em um gel de agarose a 2% e foram detectados por coloração com brometo de etídio. Os produtos de PCR resultantes também poderíam ser detectados sobre um gel de poliacrilamida desnaturado ou por métodos de detecção não-radioativos, tal como coloração com prata (Gottschlich et al., (1997) Res. Commun. Mol. Path. Pharm. 97, 237-240; Kociok, N., et al. (1998) Mol. Biotechnol. 9, 25-33), ou pelo uso de oligomarcadores marcados com fluorescência (Bauer D., et al., (1993) Nucleic Acids Res. 21, 4272-4280; Ito, T. et al., (1994) FEBS Lett. 351, 231-236. Luehrsen, K.R. et al., (1997) BioTechniques 22, 168-174; Smith, N.R. et al., (1997) BioTechniques 23, 274-279), e o uso de iniciadores biotinilados (Kom, B. et al., (1992) Hum. Mol Genet. 1, 235-242; Tagle, D.A. et al., (1993) Nature 361. 751-753; Rosok, O. et al., (1996) BioTechniques 21, 114-121).

Como mostrado na FIG. 5, as amplificações por “PCR alvo” para os genes da família de citocina IL-lb e IL-19 usando cada conjunto de iniciadores de ELlb-5' e ILlb-3', e IL19-5' e IL19-3' geram uma única banda que corresponde ao tamanho esperado de 550-pb para IL-lbeta (pista 2) e o tamanho esperado de 500-pb para IL-19 (pista 4), respectivamente. Clonagem e análise de seqüência subseqüentes dos clones confirmaram que as bandas são fragmentos de IL-lbeta e IL-19. Em contraste, os conjuntos de íniciadores convencionais (IL19-5'-0 e IL19-3-0; ILlb-5'-0 e ILlb-3'-0), que não contêm [poli(dl)], produziram produtos não-específicos (FIG 5, pistas 1 e 3). Estes resultados indicam que os Íniciadores DS planejados para possuírem três porções de Tm diferente (porção de especificidade de Tm alta-5’, porção de especificidade de Tm baixa-3’e porção de separação) podem suplantar os problemas principais decorrentes das seqüências de íniciador convencional tais como resíduo gênico e produtos não-específicos e intensificar notavelmente a especificidade de PCR. EXEMPLO 2: Avaliação de especificidade de PCR usando oligonucleotídeos de especificidade dual (DS) Os oligonucleotídeos de especificidade dual são caracterizados por especificidade de hibridização alta e tolerância à má combinação decorrente de sua estrutura incomum, dependendo da estringência de hibridização. Especificidade de hibridização alta dos oligonucleotídeos DS é alcançada sob condições de estringência alta nas quais ambas as porções-5'- e 3' são aneladas no gabarito. Entretanto, tolerância à má combinação do oligonucleotídeos DS é alcançada sob condições de estringência nas quais ambas as porções-5'- e 3' são aneladas no gabarito a despeito da presença de uma ou mais, porém limitadas, má combinações de pares de bases.

Os oligonucleotídeos de especificidade dual DS desenvolvidos de acordo com a presente invenção foram avaliados em termos de especificidade de hibridização e tolerância à má combinação por 3 -RACE do gene novo, DEG10, que foi identificado para ser expressado em placenta de camundongos (Kim, YJ. et al., (2004) “Annealing control primer system for identification of differentially expressed genes on agarose gels”, BioTechniques 36:424-434; XM_129567). Para esta avaliação, uns poucos nucleotídeos em ambas as porções foram substituídos por outros nucleotídeos de modo a serem mal combinados com a seqüência gabarito alvo.

Os iniciadores DS específicos de 5'-DEG10 usados no Exemplo são: DEG10-5’-108: S^TGTAGTrTTGGGTTTCCTCCnniCTCCGATG-S’ (SEQID NO:9); DEG10-5M03: 5,-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCimiCTfiCÇATÇ-3> (SEQ Π) NO: 10); DEG10-5M02: 5,-TGTAGTTTTGGGΊTTCCTCCIIfflσΓCCÇATÇ-3, (SEQ ID NO: 11); DEG10-5’-101: 5'“TGTAGTnTGGGTTTCCTCCIIIIICTCCCATG-3’ (SEQ ID NO:12); DEG10-5’-158: 5’-TGTAÇTTATGCGTATCGTCCimiCTCCGATG-3’ (SEQ ED NO: 13); DEG10-5’-138: 5’-TGTACTTTTGÇGTTTCGTCCIiniCTCCGATG-3’ (SEQ ID NO:14); e DEG10-5M28: 5 ’-TGTAGTTATGGGTATCCTCCIiniCTCCGATG-3’ (SEQ ID NO:15), nos quais os nucleotídeos substituídos estão sublinhados e em negrito, e I é desoxiinosina. A. Intensificação em especificidade de PCR sob estringência alta RNAs totais de tecidos de placenta 17.5-dpc (El 7.5) de cepa ICR de camundongo foram isolados e usados para a síntese de cDNAs de fita única por transcriptase reversa, como descrito previamente (Hwang, I.T., et al., (2003) “Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplification”, BioTechniques 35:1180-1184). Reação de transcrição o reversa foi realizada usando os RNAs totais por 1,5 h a 42 C um volume de reação de 20 pL composto do seguinte: 3 pg de RNA total, 4 pL de tampão de reação 5 x (Promega, USA), 5 pL de dNTPs (cada 2 mM), 2 pL de iniciador de síntese de cDNA 10 pM (oligo (dT)20-Adaptador), 0,5 pL de inibidor de RNase (40 unidades/pL, Promega), e 1 pL de transcriptase reversa (200 unidades/pL, Promega). cDNAs de primeira fita foram diluídos pela adição de 180 pL de H20 ultra-purificada. O iniciador de síntese de cDNA oligo (dT),8-ACPl é 5,-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIII(T),8-3', no qual I é desoxiinosina. A 3-RACE de DEG10 foi conduzida em um volume final de 20 pL contendo 2 pL (30 ng) de cDNA de primeira fita diluído, 2 pL de tampão de reação PCR 10 x contendo MgCl2 15 mM (Roche), 2 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 pL de um dos iniciadores DS específicos para DEG10 (10 μΜ), lpL de oligo (dT)i5-ACP2 (10 μΜ), e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi posicionado dentro de um termociclo preaquecido (94°C); amostras foram desnaturadas por 5 min a 94°C e submetidas a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 68°C, e 1 min a 72°C, seguidos por uma incubação de 7 min a 72°C. O oligo (dT)i5-ACP2 é: 5'- CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIII(T)i5-3', no qual I é desoxiinosina.

B. Tolerância à má combinação de olisonucleotídeos DS

Os iniciadores DS de amostra, gabarito, e condições de PCR para a 3'-RACE de DEG10 usada no Exemplo 2A foram empregados exceto para a temperatura de anelamento. Amplificação por PCR foi conduzida sob as seguintes condições: um ciclo de 94°C por 5 min, 60°C por 3 min, e 72°C por 3 min; seguido por 29 ciclos de 94°C por 40 s, 65°C por 1 min, e 72°C por 40 s, e um ciclo de extensão final de 7 min a 72°C.

Como um resultado, FIG 6A mostra a especificidade de hibridização rápida de iniciadores oligonucleotídeo DS pela 3-RACE de DEG10. O iniciador DS específico para 5-DEG10 (DEG10-5'-108) gerou um produto de 677-pb esperado de DEG10 3-RACE (pista 1). Em contraste, os outros iniciadores (DEG10-5'-103, DEG10-5M02, DEG10-5M01, DEG10-5'-158, DEG10-5'-138, e DEG10-5'-128) com sequências mal combinadas na porção 5’ ou na porção 3’ não geraram qualquer produto: a má combinação de três (pista 2), duas (pista 3), ou uma (pista 4) base(s)na porção 3'; a má combinação de cinco (pista 5), três (pista 6), ou duas (pista 7) base(s) na porção 5*.

Estes resultados demonstram que a especificidade dual dos iniciadores DS pode discriminar as bases mal combinadas não apenas na extremidade-3’ mas também na extremidade-5’ sob tais condições de estringência alta.

Em geral, a região de iniciadores que deve ser perfeitamente complementar ao gabarito é a extremidade-3’, porque esta extremidade é a região estendida pela DNA polimerase e é portanto a mais importante para garantir ocorrência de anelamento na seqüência alvo correta. Entretanto, a extremidade-5 de iniciadores é menos importante na determinação da especificidade de anelamento na seqüência alvo e pode ser modificada para trazer seqüência adicional tais como sítios de restrição e seqüências de promotor que não são complementares ao gabarito (McPherson, M.J., Moller, S.G. (2000) PCR. BIOS Scientifrc Publishers, Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, N.Y.). Em contraste a estes, a vantagem excepcional dos iniciadores DS é demonstrada pela especificidade dual devido à sua estrutura incomum, permitindo discriminação das bases mal combinadas em extremidade-5’ bem como em extremidade-3’. FIG 6B mostra um exemplo da tolerância à má combinação de iniciadores oligonucleotídeo DS por 3-RACE de DEG10. Embora os iniciadores DS (DEG10-5’-108, DEG10-5’-101, DEG105'-128, e DEG10-5'-138) não possuindo nucleotídeos mal combinados ou uns poucos nucleotídeos mal combinados em suas porções de extremidade-5' ou 3' ainda geraram um produto esperado de 677 pb de DEG10 3-RACE (pistas 1, 4, 6 e 7). Em contraste, os outros iniciadores (DEG10-5'-103, DEG10-5'-102, e DEG 10-5'-158) com mais nucleotídeos mal combinados em suas porções- 5' ou 3' não geraram qualquer produto (pistas 2, 3 e 5). Estes resultados indicam que os iniciadores DS também podem ser aplicados em amplificações de diversas seqüências de nucleotídeos requerendo tolerância à má combinação.

Em sumário, estes resultados confirmam os seguintes princípios de iniciadores DS: 1) apenas quando anelamento ocorre por ambas a porção de especificidade de Tm alta-5’ e a porção de especificidade de Tm baixa-3’, o iniciador DS é estendido para sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar ao gabarito (pista 1); contudo, 2) quando anelamento ocorre apenas pela porção de especificidade de Tm alta-5’ e não pela porção de especificidade de Tm baixa-3’, o iniciador DS não é estendido para sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar ao gabarito (pistas 2-4); e 3) embora a seqüência da porção de especificidade de Tm baixa-3’ possua uma combinação perfeita com o gabarito, o anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baíxa-3’ não ocorre sob condições de estringência alta (pistas 5-7). Referindo-se à porção de anelamento, o iniciador DS é distintamente diferente do iniciador de controle de anelamento (ACP) que é estendido apenas pelo anelamento da porção de extremidade-3 ’ em uma etapa de PCR inicial PCR (Hwang, I.T., et al., (2003) “Annealing control primer system for improving specifícity of PCR amplification”, BioTechniques 35:1180-1184). EXEMPLO 3; Discriminação de base única usando oligonucleotídeos de especificidade dual (DS) Para demonstrar a especificidade dual de oligonucleotídeos DS para discriminação de base única, os Psxl e Psx2 cDNAs de genes da família homeobox específicos de placenta de camundongo foram amplificados com iniciadores convencionais ou com iniciadores DS . Identidade de seqüência total entre os dois Psx cDNAs foi 91% em nível de nucleotídeo (Han, Y.J., et al., (2000) “Identification and characterization of Psx2, a novel member of the Psx (placenta-specific homeobox) family”, Gene 241:149-155). Os iniciadores-5' foram designados para distinguir Psxl e Psx2 por discriminação de uma ou duas bases (FIG 7A). Contudo, o iniciador-3'-foi designado para possuir uma seqüência conservada para ambos os Psx cDNAs. As seqüências de iniciador DS e convencionais específicas para Psxl e Psx2 são: Psxl-5’-10: 5’-AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTTCTAGCT-3’ (SEQID NO: 16);

Psx2-5’-10: 5’-AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTrCTGGCÇ-3’ (SEQ ID NO: 17);

Psxl-5’-ll: 5’-AAGGAAGACATGCTGGTGAniinTTCTAGCT-35 (SEQ ID NO:18);

Psx2-5’-l 1: 5’-AAGGAAGACATGCTGGTGATII3IITTCTGGCC-3 ’ (SEQ ID NO:19);

Psxl-5M0: 5 ’-TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAATGT GA-3 ’ (SEQ ID NO:20);

Psx2-5’-40: 5 '-TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAATÇT GA-3 ’ (SEQ ID NO:21); PSK1-5M1: 5’-TCTTGCACGATGGATGGGTGimiGAAIGIGA-3 ’ (SEQ ID NO:22); e Psx2-5’-4l; 5 ^TCTTGCACGATGGATGGGTGimiGAAIÇIGA-S7 (SEQ ID NO:23);

Psx-3’-2: 5’-TTCATCCACACCCATCCATCIiniAGArCCCT-3 ’ (SEQ ID NO:24), nas quais os nucleotídeos específicos para Psxl ou Psx2 estão sublinhadas e em negrito. Síntese de cDNA de primeira fita cDNA de primeira fita de placenta de camundongo sintetizado em Exemplo 2 foi usado como um material inicial para 3-RACE e uma “PCR alvo” de Psx cDNA. 3’-RACE de Psxl e Psx2 usando iniciador DS específico para Psxl e Psx2 A 3'-RACE de Psxl e Psx2 foram conduzidas em um volume final de 20 pL contendo 2pL (30 ng) de cDNA de primeira fita diluído, 2 pL de tampão de reação PCR 10 x contendo MgCl2 15 mM (Roche), 2 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 1 pL de um de iniciadores DS específicos para 5-Psxl ou 5'-Psx2 ou iniciadores convencionais (10 pM), 1 pL de oligo (dT)15-ACP2 (10 pM), e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unídades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi posicionado em um termociclo preaquecido (94°C); amostras foram desnaturadas por 5 min a 94°C e submetidas a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 60-65°C, e 1 min a 72°C, seguidos por uma incubação de 7 min a 72°C. C. Amolificacão de ácido nucleico alvo de Psxl e Psx2 usando iniciadores DS específicos para Psxl e Psx2 As amplificações por “PCR alvo” de Psxl e Psx2 foram conduzidas em um volume final de 20 pL contendo 2 μι (30 ng) de cDNA de primeira fita diluído, 2 pL de tampão de PCR 10 x contendo MgCk 15 mM (Roche), 2 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 1 pL de um dos inicíadores DS específico para 5-Psxl ou 5’-Psx2 ou iniciadores convencionais (10 μΜ), 1 de Psx-3'-2 (10 μΜ), e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi posicionado em um termociclo preaquecido (94°C); amostras foram desnaturadas por 5 min a 94°C e submetidas a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 60-65°C, e 1 min a 72°C, seguidos por uma incubação de 7 min a 72°C.

Como um resultado, FIG 7B mostra os produtos de 3'-RACE e de PCR alvo gerados pelos iniciadores específicos para 5'Psxl ou Psx2. Visto que os dois Psx cDNAs diferem um do outro por inserção ou deleção de 29 pb na direção de sua extremidade-3’, é esperado que os produtos diferentes em tamanho em 29-pb sejam amplificados por sua 3'-RACE. A 3'-RACE de Psxl cDNA usando cada um dos iniciadores DS específicos para Psxl ou Psx2, Psxl-5'-41 e Psx2-5'-41, gerou uma banda única que corresponde ao tamanho esperado de 311-pb (pista 1) e de 282-pb (pista 2), respectivamente. Análise subseqüente de seqüência dos produtos gerados pela 3 '-RACE confirmou que os iniciadores específicos para 5’-Psxl e Psx2 amplificaram os Psxl e Psx2 cDNAs, respectivamente. Em contraste, os iniciadores convencionais (Psxl-5'-40 e Psx2-5'-40), que não correspondem aos princípios dos oligonucleotídeos DC, não distinguiram dois Psx cDNAs (pistas 3 e 4).

Estes resultados indicam que os iniciadores DS de acordo com a presente invenção podem discriminar uma má combinação de base única. Portanto, oligonucleotídeos DS podem ser aplicados para identificar mutações pontuais ou genotipificação de polimorfismo de nucleotídeo único. EXEMPLO 4: Seqüenciamento direto de cDNA alvo a partir de reunião de cDNA usando oligonucleotídeos de especificidade dual (DS) A maioria das tentativas para identificar e isolar um cDNA novo resulta na aquisição de clones que representam apenas uma parte da seqüência de mRNA. Uma vez tenha sido identificada a sequência parcial, o restante do transcrito pode ser muitas vezes obtido por meio de típica triagem de biblioteca de cDNA ou por métodos baseados em PCR tal como RACE (amplificação rápida de extremidades de cDNA), seguido por seqüenciamento do cDNA obtido. Assim, todos os métodos correntes são uma etapa previamente necessária para obter informação de seqüência do restante do transcrito. Se a informação de seqüência faltante for diretamente obtida a partir de uma população de cDNAs gerados a partir de uma célula alvo, estas etapas previamente necessárias consumidoras de tempo podem ser completamente eliminadas e a seqüência do cDNA alvo pode ser determinada diretamente a partir de uma amostra biológica bruta.

Os oligonucleotídeos DS da presente invenção foram aplicados como iniciadores para diretamente seqüenciar Psx cDNAs de gene homeobox específico de placenta de camundongo usando reunião de cDNA de primeira fita de placenta. O processo e os resultados para o seqüenciamento direto de cDNAs de gene específico de placenta da reunião de cDNA de placenta são aqui descritos. Os mesmos iniciadores DS específicos para 5'-Psx usados em Exemplo 3 foram utilizados. Eles são Psxl-5'-ll, Psx2-5'-ll, Psxl-5'-41, e Psx2-5'-41. Síntese de cDNA de primeira fita O cDNA de primeira fita de placenta de camundongo sintetizado em Exemplo 2 foi usado como um gabarito para seqüenciamento direto de Psx cDNAs.

Seqüenciamento direto de Psx cDNA de reunião de cDNA de placenta usando iniciador DS de especificidade nara Psx A reação de seqüenciamento cíclico foi conduzida em um volume final de 20 pL contendo 13 pL (150 ng) de cDNA de primeira fita diluído, 2 pL de mistura ABI PRISM Big Dye Terminator Reaction (Applied Biosystems, USA), 3 pL de tampão de reação de seqüência 5 x (Applied Biosystems), e 1,6 pL de um dos iniciadores DS específicos para 5'-Psxl ou 5'-Psx2 (1 μΜ); o tubo contendo a mistura reacional foi posicionado em um termociclo preaquecido (94°C); amostras foram desnaturadas por 5 min a 94°C e submetidas a 40-50 ciclos de 10 s a 94°C, 3 min a 50-60°C, e 4 min a 60-65°C. Os produtos de seqüenciamento foram purificados como segue: 1) adicionar 2 pL de acetato de sódio 3 M (pH 4,6) e 50 pL de EtOH 100% frio fresco, 2) manter a -75°C por 30 min, 3) centrifugar por 15-30 min a 13.000 g e remover o sobrenadante, 4) lavar com 200 pL de EtOH 70%, 5) centrifugar por 15-30 min a 13.,000 g e remover o sobrenadante cuidadosamente, e secar. A pelota foi ressuspensa em 10 pL de Formamida HiDi imediatamente antes da corrida do produto de seqüenciamento no ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer.

Surpreendentemente, os iniciadores Psx DS precisamente seqüenciaram seus específicos Psx cDNAs. Em outras palavras, iniciador DS específico para Psxl (Psxl-5'-41) seqüenciou apenas Psxl cDNA e iniciador DS específico para Psx2 (Psx2-5'-41) seqüenciou apenas Psx2 cDNA (FIG 8). A região de deleção de 29-pb em Psx2 é mostrada em uma barra preta. Em contraste, os iniciadores convencionais (Psxl-5'-40 e Psx2-5’-40), que não correspondem aos princípios de oligonucleotídeos DS, não distinguem dois Psx cDNAs.

Estes resultados indicam que iniciadores DS podem discriminar má combinação de base única até mesmo em seqüenciamento cíclico bem como em amplificação por PCR. EXEMPLO 5: Multiplex PCR usando oligonucleotídeos de especificidade dual (DS) Para demonstrar a aplicação de iniciadores oligonucleotídeo DS em multiplex PCR, nove genes diferentes da família de citocina foram amplificados com iniciadores DS. O processo e os resultados para a amplificação por multiplex PCR usando iniciadores DS são aqui descritos. Os iniciadores DS específicos para gene de família de citocina foram designados para gerarem uma escada de 50 pb pelo uso de uma seqüência de exon mais longa de cada gene de citocina.

Os iniciadores DS para IL-3 usados no Exemplo (200 pb) são: IL3-5’ 5 5-GCTGCCAGGGGTCTTCATTCIimCTGGATGA-3 ’ (SEQ JD NO:25); e IL3-3’ 5 ’ -GGCCATGAGGAACATTC AGADUIGGTGCTCT-3 ’ (SEQ Π) NO:26).

Os iniciadores DS para IL-15 usados no Exemplo (250 pb) são: IL15-5’ S^ATGTAGCAGAATCTGGCTGCnmATGTGAGG-S* (SEQ ID NO:27); e IL15-35 5’-ATGTGATCC AAGTGGCTCATmiICCTTGTTAGG-3 ’ (SEQ ID NO:28).

Os iniciadores DS para IL-18 usados no Exemplo (300 pb) são: 11,18-5’ 5’-AGGAAATGGATCCACCTGAAIIIIITGATGATATA-3’ (SEQ ID NO:29); e IL18-3’ 5 ’-ATGGAAATACAGGCGAGGTCnmAAGGCGCA-3 ’ (SEQ ID NO:30).

Os iniciadores DS para IL-25 usados no Exemplo (350 pb) são: IL25-5’ 5 ’-AGCTCTCCAAGCTGGTGATCmnCAAGGCGG-3 ’ (SEQ ID NO:31); e IL25-3’ 5’-GAGCTGCCCTGGArGGGGTTnniGTGGTCCT“3’ (SEQ ID NO:32).

Os iniciadores DS para IL-2 usados no Exemplo (400 pb) são: IL2-5’ 5 ’-CTCTGACAACACATTTGAGTGCIimCGArGAIGAG-3 ’ (SEQ ID NO:33); e IL2-3’ 5 5-GTGCTGTCCTAAAAArGACAGAiniIGAGCTTATTT-3 ’ (SEQ ID NO:34).

Os iniciadores DS para IL-6 usados no Exemplo (450 pb) são: IL6-5’ 5’-CCAATGCTCTCCTAACAGATAAimiAGTCACAGAA-3’ (SEQ ID NO:35); e 1L6-3’ 5 -Αυϋ 1AAAU11 AlACAi 1 CCAAUAAAllinTGGCTAuU-3 (SJíQ 1D JNU:3òJ.

Os iniciadores DS para IL-19 usados no Exemplo (500 pb) são: IL19-5’ S^GTCTCATCTGCTGCCCTTAAUniTAGGAGAACT-S * (SEQID NO:5); e DL19-3’ 5’ -C ATAGGCCTGGAAGAAGCCGniIICAATAAGTTÀG-3 ’ (SEQ ID NO:6).

Os iniciadores DS para IL-lbeta usados no Exemplo (550 pb) são: ÍLlb-5’ 5 ’-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCimiCCAAAGAAG-3 * (SEQ ID NO:7); e ILlb-3’ 5’-AGACCTCAGTGCAGGCTATGnmTTCATCCC-3 ’ (SEQ ID NO:8).

Os iniciadores DS para IL-10 usados no Exemplo (600 pb) são: IL10-5’ 5 ’-AAGGCCATGAATGAATTTGAimiTC ATCAACTG-35 (SEQ ID NO:37); e IL10-3’ 5 5-TGACAGTAGGGGAACCCTCTHIIIGCTGCAGG-3 ’ (SEQ ID NO:38). A- Monoplex PCR usando um conjunto de iniciadores DS específicos para gene da família de citocinas A amplificação por “único PCR alvo” para cada gene da família de citocinas foi conduzida em um volume final de 20 pL contendo 2 pL (50 ng) de DNA genômico de camundongo, 2 pL de tampão de PCR 10 x contendo MgCk 15 mM (Roche), 2 de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 pL de cada iniciador 5’DS específico para gene da família de citocinas (10 pM), 1 pL de cada iniciador 3’DS específico para gene da família de citocinas (10 pM), e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi posicionado em um termociclo preaquecido (94°C); amostras foram desnaturadas por 5 min a 94°C e submetidas a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 60-65°C, e 1 min a 72°C, seguidos por uma incubação de 7 min a 72°C. B- Multiplex PCR usando 9 conjuntos of iniciadores DS específicos para gene da família citocina A amplificação por multiplex PCR foi conduzida em um único tubo pelo uso de 9 conjuntos de iniciadores DS específicos para gene da família de citocínas; a mistura reacional esteve em volume final de 50 pL contendo 100 ng de DNA genômico de camundongo, 5 \\L de tampão de PCR 10 x contendo MgCl2 15 mM (Roche), 5 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 1 pL d cada iniciador 5’DS específico para gene da família de citocinas (0,2-5 pM), 1 pL de cada iniciador 3’DS específico para gene da família de citocinas (0,-5 pM), e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi posicionado em um termociclo preaquecido (94°C); as condições de PCR são um ciclo de 94°C por 5 min, 50°C por 3 min, e 72°C por 3 min; seguido por 29 ciclos de 94°C por 40 s, 60°C por 1 min, e 72°C por 40 s, e um ciclo de extensão final de 5 min a 72°C.

Como mostrado na FIG 9, amplificação por multiplex PCR gera múltiplas bandas que correspondem aos tamanhos esperados de 200 pb a 600 pb para 9 produtos de gene de citocina diferentes (FIG 4, pista 1). Cada amplificação por monoplex PCR gerou uma banda única que corresponde ao tamanho esperado de 200 pb para IL-3 (FIG 4, pista 2), 250 pb para EL-15 (FIG 4, pista 3), 300 pb para IL-18 (FIG 4, pista 4), 350 pb para IL-25 (FIG 4, pista 5), 400 pb para IL-2 (FIG. 4, lane 6), 450 pb para IL-6 (FIG 4, pista 7), 500 pb para IL-19 (FIG 4, pista 8), 550 pb para IL-lbeta (FIG 4, pista 9), e 600 pb para IL-10 (FIG 4, pista 10), respectivamente.

Conseqüentemente, poderia ser reconhecido que os iniciadores DS desenvolvidos pela presente invenção podem se bem sucedidamente aplicados em multiplex PCR. A estrutura incomum de oligonucleotídeos DS permite suplantar o problema comum de qualquer multiplex PCR convencional, a saber a interferência de iniciador e a formação de dímero. EXEMPLO 6: Detecção de metapneumovírus de humano tolerância à má combinação de oligonucleotídeos de especificidade dual (DS) Para demonstrar a aplicação de iniciadores oligonucleotídeo DS em tolerância à má combinação, iniciadores DS foram aplicados para detectar metapnemovírus de humano (hMPV) em amostras clínicas. O processo e os resultados para a detecção de metapnemovírus de humano usando iniciadores DS são aqui descritos. Este Exemplo não deve ser entendido como limitante das aplicações da invenção à detecção de vírus específico.

Os iniciadores DS foram planejados baseado na região conservada do gene de glicoproteína de fusão (F) gerado pelo alinhamento de seqüências de todos os isolados de hMPV disponíveis (veja Tabela 1). Para tolerar a diversidade genética destes isolados, os iniciadores foram planejados baseado nos seguintes critérios: (a) regiões conservadas devem ser de pelo menos 30 nucleotídeos em comprimento a despeito da presença de uma ou mais, porém limitadas, má combinações de pares de bases (Tabela 1); (b) as seqüências mal combinadas dentro das regiões conservadas estão em sua maioria preferivelmente localizadas em uma porção de separação no iniciador DS (e.g., hMPV 5'-585, hMPV 3-698, ehMPV 3'4007); (c) caso contrário, os nucleotídeos mal combinados estão localizados na porção de extremidade-5’, alguns dos quais poderíam ser substituídos por bases universais tais como desoxiinosinas (e.g., hMPV 3'-698 e hMPV 3'-1007); e (d) um ou dois nucleotídeo(s) mal combinados na porção de extremidade 3’ podem ser substituídos por nucleotídeo(s) degenerado(s) ou por base(s) universal(ais) (e.g., hMPV 3'-1007). TABELA 1. Iniciadores oligonucleotídeo DS específicos para hMPV baseados em região conservada do gene de glicoproteína de fusão (F) de todos os isolados de hMPV disponíveis * Diversidade genética entre isolados de hMPV é mostrada como nucleotídeos sublinhados.

Os iniciadores DS específicos para gene hMPV F usados no Exemplo são: hMPV 5’-585 5’-AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAIIinCTAAuArGTTG-3 ’ (SEQ ID NO:39); hMPV 3’-698 5 ’-AACATCAITTTTATITGTCCTGCAIIIIITGGCATGT-3 ’ (SEQ ID NO:40); e hMPV 3’-1007 5’ -TTGAITGCTCAGCIACATTGAminCWGCTGTGTC-3 ’ (SEQ ID NO:41), no qual W pode ser A ou T, e I é desoxiinosina. RNA viral total foi extraído pelo uso do método RNAzol B de acordo com o protocolo de fabricante (RNAzol LS; Tel-Test, Inc.). Reação de transcrição reversa foi realizada para sintetizar cDNA usando o RNA viral por 1,5 h a 42°C um volume de reação de 20 pL composto do seguinte: 5 pL de RNA total (aproximadamente 100 ng), 4 pL de tampão de reação 5 x (Invitrogen, USA), 5 pL de dNTPs (cada 5 mM), 2 pL de hexadesoxínuclotídeos aleatórios 10 pM, 0,5 pL de inibidor de RNase (40 unidades/pL, Promega), e 1 pL de transcriptase reversa de vírus de leucemia murina Moloney (200 unidades/pL, Promega). A amplificação por “PCR alvo” do gene hMPV F foi conduzida em um volume final de 20 pL contendo 2 pL (30 ng) de cDNA de primeira fita, 2 pL de tampão de PCR 10 x contendo MgCl2 15 mM (Roche), 2 pL de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 1 pL de iniciador DS específico para 5' hMPV (hMPV 5-585; 10 pM), 1 pL de iniciador DS específico para 3' hMPV (hMPV 3-698 ou hMPV 3-1007; 10 pM), e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi posicionado em um termociclo preaquecido (94°C); amostras foram desnaturadas por 5 min a 94°C e submetidas a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 60-65°C, e 1 min a 72°C, seguidos por uma incubação de 7 min a 72°C.

Como mostrado na FIG 10B, cada par de iniciadores DS específicos para hMPV (hMPV 5f-585 e hMPV 3'-698, e hMPV 5’-585 e hMPV 3'-1007) gera uma única banda que corresponde aos tamanhos esperados de 150-pb e 459-pb, respectivamente (pistas 1 e 2). Análise de seqüência subseqüente dos produtos confirmou que são as seqüências parciais de gene de glicoproteína de fusão (F) de hMPV. Em contraste, estes iniciadores não geram produto em uma PCR de controle negativo sem o gabarito (pistas 4 e 5). Como um controle positivo, foi usado o conjunto de iniciadores específicos para beta-actina de humano (pista 3).

Estes resultados indicam que is iniciadores DS podem ser aplicados para detectar hMPVs de paciente com infecções respiratórias. Assim, podería ser entendido que os oligonucleotídeos DS podem ser adaptados, como iniciadores em amplificação por PCR ou como sondas em chip de oligonucleotídeo, para todas as situações potenciais encontradas no campo. EXEMPLO 7: Detecção de seqüência de nucleotídeos alvo usando oligo DS imobilizado em microarranjo Os oligos DS complementares a uma região de uma molécula de ácido nucleico alvo são sintetizados por meio de síntetizador de DNA (Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems (ABI)) de acordo com um protocolo padrão. Os oligos DS sintetizados são imobilizados sobre uma lâmina de vidro para microarranjo. Então, a mistura de reação de extensão dependente de gabarito contendo 50-200 ng de amostra de DNA, 5 pL de tampão de PCR 10 x (Promega), 5 pL de MgCl2 15 mM, 5 pL de dNTP marcado com fluorescência (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Promega) é adicionada no microarranjo, após o qual o microarranjo é posicionado em um termociclo preaquecido (94°C). A reação de extensão dependente de gabarito é conduzida de acordo com o seguinte ciclo térmico: desnaturação por 5 min a 94°C, e 15-50 ciclos de 1 min a 94°C, 1-3 min a 50-65°C e 1-4 min a 60-72°C, seguidos por uma extensão de 5 min a 72°C. Após a reação de extensão dependente de gabarito, os oligos DS estendidos são lavados e detectados por suas imagens fluorescentes por intermédio de um escâner de microarranjo, seguido por análise das imagens.

EXEMPLO 8: Genotipificação de SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) usando oligonucleotídeos DS

Os oligos DS são sintetizados por meio de sintetizador de DNA (Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems (ABI)) de acordo com um protocolo padrão com posicionamento de uma base polimórfica (sítio de interrogação) no centro da porção de especificidade de Tm baixa-3’. Os oligonucleotídeos sintetizados são imobilizados sobre uma lâmina de vidro para microarranjo. Então, uma mistura reação de extensão dependente de gabarito contendo 50-200 ng de amostra de DNA, 5 pL de tampão de PCR 10 x (Promega), 5 pL de MgCh 15 mM, 5 pL de dNTP marcado com fluorescência (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e 0,5 pL de Taq polimerase (5 unidades/pL; Promega) é adicionada no microarranjo, após o qual o microarranjo é posicionado em um termociclo preaquecido (94°C). A reação de extensão dependente de gabarito é conduzida de acordo com o seguinte ciclo térmico: desnaturação por 5 min a 94°C, e 15-50 ciclos de 1 min a 94°C, 1-3 min a 50-65°C e 1-4 min a 60-72°C, seguido por uma extensão de 5 min a 72°C. Após a reação de extensão dependente de gabarito, os oligos DS estendidos são lavados e detectados por suas imagens fluorescentes por intermédio de um escâner de microarranjo, seguido por análise das imagens.

Tendo descrito uma modalidade preferida da presente invenção, é para ser entendido que variantes e modificações da mesma caindo dentro do espírito da invenção podem se tomar evidentes para aquelas pessoas experientes nesta técnica, e o escopo desta invenção é para ser determinado pelas reivindicações apendidas e seus equivalentes.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para a síntese de uma molécula de ácido nucleico usando um oligonucleotídeo de especificidade dual por uma reação de extensão dependente de gabarito, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) anelar o oligonucleotídeo de especificidade dual a uma molécula de ácido nucleico de gabarito, em que o oligonucleotídeo de especificidade dual é representado pela seguinte fórmula geral: 5’-Xp-YM-Zr-3’ em que Xp representa uma porção.de especificidade de TITt alta-5’ tendo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, Y<, representa uma porção de separação consistindo de bases universais, Zr representa uma porção de especificidade de T,„ baixa-3’ possuindo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo; p, q e r representam o número de nucleotídeos; p representa um número inteiro de 15 a 40, q representa um número inteiro de 3 a 10 e r representa um número inteiro de 3 a 15; e X, Y, e Z são desoxirribonuc 1 eotideo ou ribonucleotídeo; a Tm da porção de especificidade de T„, alta-5’ varia de 40°C a 80°C, a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3’ varia de 10°C a 40°C e a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C; T,n da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação separa a porção dc especificidade de Tm alta-5‘ da porção de especificidade de T1U baixa-3’ em termos de especificidade de anelamento para o ácido nucleico de gabarito, deste modo a especificidade de anelamento do oligonucleotídeo é determinada dual mente pela porção de especificidade de Tm alta-5’ e pela porção de especificidade de Tm baixa-3’ de tal maneira que a especificidade de anelamento total do oligonucleotídeo seja intensificada; em que o anelamento é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas por uma porção de especificidade de Tm baixa-3’; em que o anelamento é realizado em temperatura variando de 40°C a 75°; e (b) estender o oligonucleotídeo de especificidade dual para sintetizar a molécula de ácido nucleico complementar ao ácido nucleico de gabarito.

2. Método para seletivamente amplificar uma sequência de ácido nucleico alvo de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos, caracterizado pelo fato de compreender amplificar a sequência de ácido nucleico alvo por realização de pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação de iniciador, usando um conjunto de iniciadores que compreende pelo menos um oligonucleotídeo de especificidade dual; em que o oligonucleotídeo de especificidade dual é representado pela seguinte fórmula geral: 5 ’ -Xp-Yq-Zi--3 ’ em que Xp representa uma porção de especificidade de Tm alta-5’ tendo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, Yq representa uma porção de separação consistindo de bases universais, Z* representa uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possuindo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo; p, q e r representam o número de nucleotídeos; p representa um número inteiro de 15 a 40, q representa um número inteiro de 3 a 10 e r representa um número inteiro de 3 a 15; e X, Y, e Z são desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo; a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ varia de 40°C a 80°C, a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3’ varia de 10°C a 40°C e a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C; Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação separa a porção de especificidade de Tm alta-5’ da porção de especificidade de Tm baixa-3’ em termos de especificidade de anelamento para o ácido nucleico de gabarito, deste modo a especificidade anelamento do oligonucleotídeo é determinada dualmente pela porção de especificidade de Tm alta-5’ e pela porção de especificidade de Tm baixa-3’ de tal maneira que a especificidade de anelamento total do oligonucleotídeo seja intensificada; no qual o anelamento na reação de amplificação é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas por uma porção de especificidade de Tm baixa-3’; em que o anelamento é realizado em uma temperatura variando de 40°C a 75°C.

3. Método para amplificar duas ou mais sequências de nucleotídeos alvo simultaneamente usando dois ou mais pares de iniciadores na mesma reação, caracterizado pelo fato de compreender a amplificação das sequências de nucleotídeos alvo por realização de pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação de iniciador, usando dois ou mais pares de iniciadores nos quais pelo menos um iniciador do par de iniciadores é um oligonucleotídeo de especificidade dual, em que o oligonucleotídeo de especificidade dual é representado pela seguinte fórmula geral: 5’-Xp-Yq-Zr3’ em que Xp representa uma porção de especificidade de Tm alta-5’ tendo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, Yq representa uma porção de separação consistindo de bases universais, Z* representa uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possuindo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo; p, q e r representam o número de nucleotídeos; p representa um número inteiro de 15 a 40, q representa um número inteiro de 3 a 8 e r representa um número inteiro de 3 a 15; e X, Y, e Z são desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo; a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ varia de 40°C a 80°C, a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3’ varia de 10°C a 40°C e a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C; Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação separa a porção de especificidade de Tm alta-5’ da porção de especificidade de Tm baixa-3’ em termos de especificidade de anelamento para o ácido nucleico de gabarito, deste modo a especificidade anelamento do oligonucleotídeo é determinada dualmente pela porção de especificidade de Tm alta-5’ e pela porção de especificidade de Tm baixa-3’ de tal maneira que a especificidade de anelamento total do oligonucleotídeo seja intensificada; no qual o anelamento na reação de amplificação é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas por uma porção de especificidade de Tm baixa-3’; em que o anelamento é realizado em uma temperatura variando de 40°C a 75°C.

4. Método para sequenciar uma molécula de ácido nucleico alvo usando um oligonucleotídeo de especificidade dual de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar à molécula de ácido nucleico a ser sequenciada por realização de pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação de iniciador, usando o oligonucleotídeo de especificidade dual como um iniciador de sequenciamento; em que o oligonucleotídeo de especificidade dual é representado pela seguinte fórmula geral: 5’-Xp-Yq-Zr3’ em que Xp representa uma porção de especificidade de Tm alta-5’ tendo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, Yq representa uma porção de separação consistindo de bases universais, Zr representa uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possuindo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, p, q e r representam o número de nucleotídeos; p representa um número inteiro de 15 a 40, q representa um número inteiro de 3 a 10 e r representa um número inteiro de 3 a 15; e X, Y, e Z são desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo; a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ varia de 40°C a 80°C, a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3’ varia de 10°C a 40°C e a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C; Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação separa a porção de especificidade de Tm alta-5’ da porção de especificidade de Tm baixa-3’ em termos de especificidade de anelamento para o ácido nucleico de gabarito, deste modo a especificidade anelamento do oligonucleotídeo é determinada dualmente pela porção de especificidade de Tm alta-5’ e pela porção de especificidade de Tm baixa-3’ de tal maneira que a especificidade de anelamento total do oligonucleotídeo seja intensificada; no qual o anelamento na reação de síntese é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas por uma porção de especificidade de Tm baixa-3’; em que o anelamento é realizado em uma temperatura que varia de 40°C a 75C; e (b) determinar uma sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico complementar sintetizada.

5. Método para detectar uma molécula de ácido nucleico com diversidade genética por uma reação de extensão dependente de gabarito de um oligonucleotídeo de especificidade dual, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) anelar um oligonucleotídeo de especificidade dual em uma molécula de ácido nucleico de gabarito, em que o oligonucleotídeo de especificidade dual é representado pela seguinte fórmula geral: 5’-Xp-Yq-Zr3’ em que Xp representa uma porção de especificidade de Tm alta-5’ tendo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, Yq representa uma porção de separação consistindo de bases universais, Zr representa uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possuindo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, p, q e r representam o número de nucleotídeos; p representa um número inteiro de 15 a 40, q representa um número inteiro de 3 a 10 e r representa um número inteiro de 3 a 15; e X, Y, e Z são desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo; a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ varia de 40°C a 80°C, a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3’ varia de 10°C a 40°C e a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C; Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação separa a porção de especificidade de Tm alta-5’ da porção de especificidade de Tm baixa-3’ em termos de especificidade de anelamento para o ácido nucleico de gabarito, deste modo a especificidade anelamento do oligonucleotídeo é determinada dualmente pela porção de especificidade de Tm alta-5’ e pela porção de especificidade de Tm baixa-3’ de tal maneira que a especificidade de anelamento total do oligonucleotídeo seja intensificada; no qual o anelamento é realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas por uma porção de especificidade de Tm baixa-3’; em que o anelamento é realizado em uma temperatura variando de 40°C a 75°C; e ocorre anelamento quando uma porção de especificidade de Tm alta-5’ e/ou uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui uma ou mais bases mal combinadas em seu sítio alvo; (b) estender o oligonucleotídeo de especificidade dual para sintetizar a molécula de ácido nucleico complementar ao gabarito; e (c) detectar a ocorrência da extensão dependente de gabarito do oligonucleotídeo de especificidade dual.

6. Método para detectar uma sequência de nucleotídeos alvo em uma amostra da ácido nucleico por uma reação de extensão dependente de gabarito de um oligonucleotídeo de especificidade dual, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) estender um oligonucleotídeo de especificidade dual como uma sonda imobilizada sobre um substrato compreendendo pelo menos um ciclo de uma hibridização, uma extensão dependente de gabarito e uma desnaturação, no qual a hibridização é realizada pelo contato do oligonucleotídeo de especificidade dual com a amostra de ácido nucleico, em que o oligonucleotídeo de especificidade dual é representado pela seguinte fórmula geral: 5’-Xp-Yq-Zr3’ em que Xp representa uma porção de especificidade de Tm alta-5’ tendo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, Yq representa uma porção de separação consistindo de bases universais, Zr representa uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possuindo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, p, q e r representam o número de nucleotídeos; p representa um número inteiro de 15 a 40, q representa um número inteiro de 3 a 10 e r representa um número inteiro de 3 a 15; e X, Y, e Z são desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo; a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ varia de 40°C a 80°C, a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3’ varia de 10°C a 40°C e a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C; Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação separa a porção de especificidade de Tm alta-5’ da porção de especificidade de Tm baixa-3’ em termos de especificidade de anelamento para o ácido nucleico de gabarito, deste modo a especificidade anelamento do oligonucleotídeo é determinada dualmente pela porção de especificidade de Tm alta-5’ e pela porção de especificidade de Tm baixa-3’ de tal maneira que a especificidade de anelamento total do oligonucleotídeo seja intensificada; no qual a hibridização é realizada sob condições nas quais não ocorre hibridização por uma porção de especificidade de Tm baixa-3’; em que o anelamento é realizado em uma temperatura que varia de 40°C a 75°C, e (b) analisar a ocorrência da extensão dependente de gabarito.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ιό, caracterizado pelo fato de que a base universal na porção de separação é selecionada do grupo consistindo de desoxiinosina, inosina, 7-desaza-2'-desoxiinosina, 2-aza-2'-desoxiinosina, 2'-OMe-inosina, 2’-F-inosina, desóxi- 3- nitro-pirrol, 3-nitro-pirrol, 2'-OMe-3-nitro-pirrol, 2'-F-3-nitro-pirrol, l-(2'- desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol, desóxi-5-nitro-indol, 5-nitro- indol, 2'-OMe-5-nitro-indol, 2'-F-5-nitro-indol, desóxi-4-nitro-benzimidazol, 4- nitro-benzimidazol, desóxi-4-amino-benzimidazol, 4-amino-benzimidazol, desóxi-nebularina, 2'-F-nebularina, 2'-F-4-nitro-benzimidazol, PNA-5- introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, ΡΝΑ-4-nitro-benzimidazol, PNA-3-nitro-pirrol, morfolino-5-nitro-indol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitro-benzimidazol, morfolino-3-nitro-pirrol, fosforoamidato-5-nitro-indol, fosforoamidato-nebularina, fosforoamidato-inosina, fosforoamidato-4-nitro-benzimidazol, fosforoamidato-3-nitro-pirrol, 2'-0-metóxi-etil-inosina, 2'-0-metóxi-etil-nebularina, 2'-0-metóxi-etil-5-nitro-indol, 2'-0-metóxi-etil-4-nitro-benzimidazol, 2'-0-metóxi-etil-3-nitro-pirrol, e suas combinações.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a base universal é desoxiinosina, l-(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol ou 5-nitro-indol.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a base universal é desoxiinosina.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ιό, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm alta-5’ é mais longa do que a porção de especificidade de Tm baixa-3’.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ιό, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui a sequência de nucleotídeos de hibridização perfeitamente complementar ao sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm alta-5’ é 15 a 25 nucleotídeos em comprimento.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ιό, caracterizado pelo fato de que o anelamento é realizado em temperatura variando de 45°C a 68°C.

14. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizado pelo fato de que a síntese de uma sequência de ácido nucleico alvo é realizada pela repetição do processo da reação de extensão dependente de gabarito na qual as etapas de extensão e andamento de nucleotídeo de especificidade dual são seguidas pela etapa de desnaturação.

15. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a amplificação é realizada de acordo com a reação em cadeia da polimerase.

16. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico alvo a ser sequenciada está contida em um DNA genômico ou em uma população de cDNAs.

17. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico com diversidade genética é um ácido nucleico de um vírus exibindo diversidade genética.

18. Oligonucleotídeo de especificidade dual para a síntese de uma molécula de ácido nucleico por uma reação de extensão dependente de gabarito, caracterizado pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula geral: S^Xp-Yq-Zr-S' em que Xp representa uma porção de especificidade de Tm alta-5’ possuindo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, Yq representa uma porção de separação consistindo de bases universais, Zr representa uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possuindo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, p, q e r representam o número de nucleotídeos, p representa um número inteiro de 15 a 40, q representa um número inteiro de 3 a 10 e r representa um número inteiro de 3 a 15; e X, Y, e Z são desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo; a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3’, a porção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação separa a porção de especificidade de Tm alta-5’ da porção de especificidade de Tm baixa-3’ em termos de especificidade de anelamento para o ácido nucleico de gabarito, deste modo a especificidade anelamento do oligonucleotídeo é determinada dualmente pela a porção de especificidade de Tm alta-5’ e pela porção de especificidade de Tm baixa-3’ de tal maneira que a especificidade de anelamento total do oligonucleotídeo seja intensificada.

19. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a base universal na porção de separação é selecionada do grupo consistindo de desoxiinosina, inosina, 7-desaza-2'-desoxiinosina, 2-aza-2'-desoxiinosina, 2'-OMe-inosina, 2'-F-inosina, desóxi-3-nitro-pirrol, 3-nitro-pirrol, 2’-OMe-3-nitro-pirrol, 2'-F-3-nitro-pirrol, 1 -(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol, desóxi-5-nitro-indol, 5-nitro-indol, 2'-OMe-5-nitro-indol, 2'-F-5-nitro-indol, desóxi-4-nitro-benzimidazol, 4-nitro-benzimidazol, desóxi-4-amino-benzimidazol, 4-amino-benzimidazol, desóxi-nebularina, 2'-F-nebularina, 2'-F-4-nitro-benzimidazol, ΡΝΑ-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, ΡΝΑ-4-nitro-benzimidazol, ΡΝΑ-3-nitro-pirrol, morfolino-5-nitro-indol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitro-benzimidazol, morfolino-3-nitro-pirrol, fosforoamidato-5-nitro-indol, fosforoamidato-nebularina, fosforoamidato-inosina, fosforoamidato-4-nitro-benzimidazol, fosforoamidato-3-nitro-pirrol, 2'-0-metóxi-etil-inosina, 2'-0-metóxi-etil-nebularina, 2'-0-metóxi-etil-5-nitro-indol, 2'-0-metóxi-etil-4-nitro-benzimidazol, 2'-0-metóxi-etil-3-nitro-pirrol, e suas combinações.

20. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a base universal é desoxiinosina, l-(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol ou 5-nitro-indol.

21. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a base universal é desoxiinosina.

22. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm alta-5’ é mais longa do que a porção de especificidade de Tm baixa-3’.

23. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui a sequência de nucleotídeos de hibridização perfeitamente complementar ao sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo.

24. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que p representa um número inteiro de 15 a 25.

25. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ varia de 40°C a 80°C.

26. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3’ varia de 10°C a 40°C.

27. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C.

28. Método para permitir que uma especificidade de andamento de um oligonucleotídeo seja dualmente determinada por meio de uma estrutura do oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) selecionar uma sequência de ácido nucleico alvo; (b) planejar uma sequência de um oligonucleotídeo possuindo (i) uma sequência de hibridização complementar ao ácido nucleico alvo e (ii) uma porção de separação consistindo de bases universais, de tal modo que a porção de separação intervém na sequência de hibridização para formar três porções no oligonucleotídeo; e (c) determinar a posição da porção de separação no oligonucleotídeo para permitir que a porção na direção-5’ da porção de separação possua uma Tm mais alta do que a da porção na direção-3’ da porção de separação e para permitir que a porção de separação possua a Tm mais baixa nas três porções, proporcionando deste modo um oligonucleotídeo representado pela seguinte fórmula geral: 5’-Xp-Yq-Zr3’ em que Xp representa uma porção_de especificidade de Tm alta-5’ tendo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, Yq representa uma porção de separação consistindo de bases universais, Zr representa uma porção de especificidade de Tm baixa-3’ possuindo uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, p, q e r representam o número de nucleotídeos; p representa um número inteiro de 15 a 40, q representa um número inteiro de 3 a 10 e r representa um número inteiro de 3 a 15; e X, Y, e Z são desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo; a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5’ varia de 40°C a 80°C, a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3’ varia de 10°C a 40°C e a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C; pelo qual a especificidade de anelamento do oligonucleotídeo para o ácido nucleico alvo é determinada dualmente tanto pela porção de especificidade de Tm alta-5’ quanto pela porção de especificidade de Tm baixa-3’ e o anelamento é realizado em temperatura variando de 40°C a 75°C.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a base universal na porção de separação é selecionada do grupo consistindo de desoxiinosina, inosina, 7-desaza-2'-desoxiinosina, 2-aza-2'-desoxiinosina, 2'-OMe-inosina, 2'-F-inosina, desóxi-3-nitro-pirrol, 3-nitro-pirrol, 2’-OMe-3-nitro-pirrol, 2'-F-3-nitro-pirrol, l-(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol, desóxi-5-nitro-indol, 5-nitro-indol, 2’-OMe-5-nitro-indol, 2’ -F-5-nitro-indol, desóxi-4-nitro-benzimidazol,4-nitro-benzimidazol, desóxi-4-amino-benzimidazol, 4-amino-benzimidazol, desóxi-nebularina, 2’-F-nebularina, 2’-F-4-nitro-benzimidazol, ΡΝΑ-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, ΡΝΑ-4-nitro-benzimidazol, ΡΝΑ-3-nitro-pirrol, morfolino-5-nitro-indol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitro-benzimidazol, morfolino-3-nitro-pirrol, fosforoamidato-5-nitro-indol, fosforoamidato-nebularina, fosforoamidato-inosina, fosforoamidato-4-nitro-benzimidazol, fosforoamidato-3-nitro-pirrol, 2'-0-metóxi-etil-inosina, 2'-0-metóxi-etil-nebularina, 2'-0-metóxi-etil-5-nitro-indol, 2'-0-metóxi-etil-4-nitro-benzimidazol, 2'-0-metóxi-etil-3-nitro-pirrol, e suas combinações.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a base universal é desoxiinosina, l-(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol ou 5-nitro-indol.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a base universal é desoxiinosina.

32. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm alta-5’ é mais longa do que a porção de especificidade de Tm baixa-3’.

33. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm baixa-3’ possui a sequência de nucleotídeos de hibridização perfeitamente complementar ao sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo.

34. Método de acordo com a reivindicação28, caracterizado pelo fato de que p representa um número inteiro de 15 a 25.

35. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a reação de extensão dependente de gabarito é uma reação em cadeia da polimerase.