NO339577B1

NO339577B1 - Oligonukleotid med dobbel spesifisitet, og fremgangsmåter som anvender samme

Info

Publication number: NO339577B1
Application number: NO20074394A
Authority: NO
Inventors: Jong-Yoon Chun
Original assignee: Seegene Inc
Priority date: 2005-03-05
Filing date: 2007-08-29
Publication date: 2017-01-09
Also published as: DK1856257T3; NO20074394L; US20180141970A1; DK2365078T3; ATE529534T1; US9884890B2; KR101440404B1; CN101189336A; KR20140056397A; US20120135473A1; JP4903725B2; PL2365078T3; CN101189336B; US8323895B2; ES2447297T3; JP2008531040A; EP2365078B1; NO20161140A1; BRPI0609031B1; US8092997B2

Description

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse vedrører forskjellige framgangsmåter som benytter en oligonukleotid med dobbel spesifisitet, og en oligonukleotid med dobbel spesifisitet dertil. Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse forskjellige framgangsmåter for en templatavhengig ekstensjonsreaksjon ved anvendelse av dobbel spesifisitets oligonukleotid og en dobbelspesifisitet oligonukleotid dertil.

BESKRIVELSE AV TEKNIKKENS STAND

Nukleinsyremangfoldiggj øring er en sentral framgangsmåte for et bredt spekter av framgangsmåter innen molekylær biologi, og således har forskjellige mangfoldiggjøringsmetoder blitt foreslått. For eksempel, Miller, H. I. et al. (WO 89/06700) mangfoldiggjorde en nukleinsyresekvens basert på hybridisering av en promoter/primersekvens til en enkelttrådet mål-DNA ("ssDNA") etterfulgt av transkripsjon av mange RNA-kopier av sekvensen. Andre kjente nukleinsyremangfoldiggjørings-prosedyrer inkluderer transkripsjonsbaserte mangfoldiggjøringssystemer (Kwoh, D. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A., 86:1173(1989); og Gingeras T.R et al., WO 88/10315).

Den vanligste framgangsmåte for nukleinsyremangfoldiggj øring kjent som polymerase kjedereaksjon (heretter benevnt som "PCR"), er basert på repeterende sykluser av denaturering av dobbelttrådet DNA, etterfulgt av oligonukleotid primer annealing til DNA-templatet, og primer ekstensjon av en DNA-polymerase (Mullis et al. U.S. Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159; Saiki et al.,

(1985) Science 230, 1350-1354). Oligonukleotid primerne anvendt i PCR designes for å anneale til motsatte tråder av DNA-templaten. Primerne forlenges med DNA-polymerase, hvorfra produktet av en primer kan fungere som templattråd for den andre primer i påfølgende reaksjoner. PCR-mangfoldiggjøringsprosessen resulterer i en eksponentiell økning av bestemte DNA-fragmenter hvis lengde er definert av 5'-ender av oligonukleotid primerne.

Suksessen med nukleinsyremangfoldiggj øringer, spesielt PCR-mangfoldiggj øring, er basert på spesifisiteten hvorved en primer annealer til dets mål (og ikke til ikke-mål) sekvenser; og det er derfor viktig å optimere denne molekylære interaksjon. Hvordan en primer kan anneale kun til dets perfekte komplement eller også til sekvenser som er én eller flere mismatcher avhenger kritisk av annealingstemperaturen. Generelt, høyere annealingstemperatur vil føre til mer spesifikk annealing av primeren til dets perfekte matchete templat, som deretter øker sannsynligheten for mangfoldiggj øring av kun målsekvensen. På den andre side, mer mismatch mellom templat og primer kan tolereres ved lavere annealingstemperaturer. Ved vurdering av et slikt fenomen kan justering av annealingstemperaturen endre spesifisiteten av paring av templat og primer. For eksempel, om der ikke er noe produkt, kan temperaturen være for høy for annealing. Dersom der er flere produkter som er av forskjellig størrelse hvor kun én primer foreligger, vil dette indikere at den enkle primer annealer til mer enn én region av templatet. I dette tilfellet bør annealingstemperaturen økes.

I tillegg til annealingstemperatur bør flere "primer søkeparametere", så som primer lengde, GC-innhold og lengde av PCR-produkt vurderes for primer annealingsspesifisitet. En primer som tilfredsstiller alle slike parametre vil resultere i betydelig forbedring av primer annealingspesifisiteten under mål-DNA-mangfoldiggj øring, mens man løser problemene på bakgrunn og ikke-spesifikke produkter som oppstår av primere som anvendes i eksperimentene. Det er vanlig at godt konstruerte primere kan bevirke til å unngå ikke-spesifikk annealing og bakgrunn, og likeledes skille mellom cDNAer eller genomiske templater i RNA-PCR.

Mange løsninger har blitt utviklet for å forbedre primer annealingsspesifisitet og gjennomføringen av mangfoldiggjøringen av det ønskete produkt. Eksempler er "touchdown" PCR (Don et al., (1991) Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res., 19, 4008), "hot start" PCR (DAquila et al., (1991) Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. Nucleic Acids Res., 19, 3749), "nested" PCR (Mullis and Faloona, (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350), og "booster" PCR (Ruano et al., (1989) Biphasic amplification of very dilute DNA samples via booster PCR. Nucleic Acids Res. 17, 540). Andre alternative løsninger har også blitt rapportert der forskjellige "enhancer" forbindelser kan forbedre spesifisiteten av PCR. Enhancer-forbindelsene inkluderer kjemikalier som øker den effektive annealingstemperatur i reaksjonen, DNA-bindingsproteiner, og kommersielt tilgjengelige reagenser. Imidlertid, der er intet "magisk" tilsettingsstoff som vil sikre suksess med hver PCR, og det er svært tidkrevende å teste forskjellige tilsettingsstoffer under forskjellige betingelser så som annealingstemperatur. Selv om disse løsninger har bidratt til forbedring av primer annealingsspesifisiteten i noen tilfeller, har de ikke undersøkt fundamentalt en løsning for de problemer som oppstår fra primere som anvendes i PCR-mangfoldiggjøring, så som ikke-spesifikke produkter og høye bakgrunner.

PCR-baserte teknikker har blitt bredt anvendt ikke kun for mangfoldiggj øring av en mål DNA-sekvens, men også for spesifikke applikasjoner eller framgangsmåter innen feltet biologisk og medisinsk forskning, så som revers transkriptase PCR (RT-PCR), differensiell display PCR (DD-PCR), kloning av kjente eller ukjente gener med PCR, hurtig mangfoldiggj øring av cDNA-ender (RACE), vilkårlig priming PCR (AP-PCR), multipleks PCR, SNP genom typing, og PCR-baserte genomiske analyser (McPherson and Moller, (2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, NY).

Som beskrevet over, alle disse framgangsmåter og teknikker som involverer nukleinsyre mangfoldiggj øring, særskilt PCR mangfoldiggj øring, er ikke fullstendig fri fra begrensninger og problemer som er resultatet av ikke-spesifisitet av primerne som anvendes i hver framgangsmåte, så som falske positive, svak reproduserbarhet, høye bakgrunner, selv om forbedrete løsninger for hver metode kontinuerlig har blitt introdusert. Derfor, der er framdeles et behov for nye primere og framgangsmåter for å forbedre annealingsspesifisitet, som kan gi opphav til sanne mangfoldiggj øirngsresultater.

Samtidig er DNA-hybridisering er fundamental prosess i molekylærbiologi, og er påvirket av ionestyrke, sammensetning av baser, lengde av fragmenter hvortil nukleinsyrene har blitt redusert, grad av mismatching, og nærvær av denaturerende midler. DNA hybridiseirngsbaserte teknologier vil være svært nyttige redskaper i spesifikk nukleinsyresekvensbestemmelser og er klart nyttige i klinisk diagnose, genetisk forskning og rettsvitenskapelig laboratorieanalyse. For eksempel, Wallace og medarbeidere viste at sekvensforskj eller så marginale som en enkelt baseforandring er tilstrekkelig til å muliggjøre diskriminering av korte (for eksempel 14-mer) oligomerer og viste hvordan dette kan anvendes i molekylær analyse av punktmutasjon i P-globin genet (Wallace, B.R., et al., (1981) The use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes. Hybridization of oligonucleotides of mixed sequence to rabbit P-globin DNA. Nucleic Acids Res. 9, 879-894; and Conner, B.J., et al. (1983) Detection of sickle cell P-globin allele by hybridization with synthetic oligonucleotides. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 278-282).

Til tross for effekten av oligonukleotid hybridisering for å korrekt identifisere en komplementær tråd, står forskerne fortsatt ovenfor begrensninger. Hybrider inneholdende oligonukleotider er mindre stabile enn hybrider av lange nukleinsyrer. Dette er reflektert i lavere smeltetemperatur. Denne ustabilitet av hybridene er en av de mest viktige faktorer som må vurderes når man konstruerer oligonukleotid hybridisering. Stabilitetsforskj ellen mellom et perfekt komplement og et komplement som er mismatchet med kun én base kan være ganske liten, korresponderende til så lite som 0,5 °C i forskjell i deres Tms (dupleks smeltetemperatur). Jo kortere den aktuelle oligomer er (som muliggjør identifisering av en komplementær tråd i en mer kompleks blanding), jo sterkere er effekten av en enkel base mismatch på total dupleksstabilitet. Imidlertid, ulempen med å anvende slike korte oligonukleotider er at de hybridiserer svakt, selv til en perfekt komplementær sekvens, og således må anvendes under betingelser av redusert stringens, som alvorlig resulterer i redusert hybridiseringsspesifisitet.

Der har blitt gjort mange forsøk for å forbedre spesifisiteten av oligonukleotid hybridisering. En framgangsmåte for kjemisk å modifisere baser av DNA for høysensitivitetshybridisering (Azhikina et al., (1993) Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 90:11460-11462) og en framgangsmåte hvor vasking etter hybridisering utføres ved lave temperaturer i en lang periode for å forsterke evnen til å diskriminere mismatch (Drmanac et al., (1990) DNA and Cell Biology, 9:527-534) har blitt foreslått. Nylig, en ytterligere framgangsmåte har blitt introdusert for å øke oppløsningseffekten av enkelt nukleotid polymorfisme (SNPer) i DNA-hybridisering ved hjelp av artifisielle mismatcher (Guo et al., (1997) Nature Biotechnology, 15:331-5). I tillegg beskriver mange US-patenter, inkluderende US patenter nr. 6,077,668, 6,329,144, 6,140,054, 6,350,580, 6,309,824, 6,342,355 og 6,268,128 probe for hybridisering, og dets applikasjoner. US 2003/170711 Al omtaler oligonukleotider med 3-nitropyrrol ved siden av som en universal base for mangfoldiggj øring av en målnukleinsyresekvens. Selv om disse forbedrete løsninger til hver framgangsmåte kontinuerlig har blitt introdusert, så er alle disse framgangsmåter og teknikker som involverer oligonukleotidhybridisering ikke fullstendig fri for begrensninger og problemer som oppstår av ikke-spesifisitet av oligonukleotidhybridiseringen.

Der er fremdeles en mulighet for at artifisielle faktorer, så som feil med applisering og immobilisering av oligonukleotid på substrat og etablering av optimale hybridiseringsbetingelser, vil påvirke negativt hybridiseringsdata; effekten av feil resulterer i mer skader på resultatene generert fra høygjennom-strømnings screeningsmetoder. Slike artifisielle faktorer som er en del av applisering og hybridisering, er viktige praktiske ulemper i oligonukleotidbaserte DNA microarrays.

Videre, utvikling av DNA-sekvensbestemmelsesteknikker som forbedrer hastighet, sensitivitet og gjennomstrømming er ytterst viktige for studie av biologiske systemer. Konvensjonelle DNA-sekvenseringsteknikker opprinnelig utviklet for mer enn to tiår siden (Sanger et al. (1977) Proe. Nati. Acad. Sei., 74:5463-5467) står overfor begrensninger både med hensyn til gjennomstrømming og kostnader for framtidige applikasjoner. Derfor har flere nye teknikker blitt foreslått. Tre framgangsmåter som virker lovende er sekvensering med hybridisering (Brain and Smith, (1988) J. Theor. Biol, 135:303-307); Drmanac et al., (1989) Genomics, 4:114-128); and Southern, E.M. (1989) Patent WO/10977), parallell signatursekvensering basert på ligering og spalting (Brenner et al., (2000) Proe. Nati. Acad. Sei., 97:1665-1670), og pyrosekvensering (Ronaghi et al., (1996) Anal. Biochem., 242:84-89; and (1998) Science 281:363-365). For alle disse ovennevnte teknikker er suksessen for sekvensreaksj onene absolutt avhengige av hybridiseringsspesifisiteten av sekvenserende primer til målnukleinsyre. Ved vurdering av hybridiseringsspesifisitet til den sekvenserende primer er gjeldende metoder underlagt begrensning med hensyn til lengde av templatnukleinsyrer som forsynes til sekvenseringsreaksjonene. Generelt, sekvenseringsreaksjoner utføres ved anvendelse av templat nukleinsyrer som fortrinnsvis er mindre enn noen få hundre basepar i lengde slik at den spesifikke hybridisering av sekvenseringsprimeren oppnås i en viss utstrekning.

For avanserte studier bør imidlertid ikke DNA sekvenseringsreaksjoner med forbedret hastighet, sensitivitet og gjennomstrømming hindres av størrelsen av templat nukleinsyren. I lys av dette muliggjøres direkte sekvensering av en målnukleinsyre fra en populasjon av templatnukleinsyrer, noe som tilveiebringer at de sekvenserende primere hybridiseres med målnukleinsyrene med høy spesifisitet.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

For å eliminere problemene og ulempene med slike konvensjonelle oligonukleotider, anvendt som primere eller prober, og forskjellige framgangsmåter som involverer nukleinsyrehybridisering, har oppfinneren av foreliggende oppfinnelse utviklet et dobbeltspesifisitetsoligonukleotid som muliggjør at en templatavhengig reaksjon kan foregå med langt høyere spesifisitet, og dette har funnet utmerkete applikasjoner i et bredt spekter av prosesser som involverer oligonukleotidhybridisering eller annealing.

Således, det er et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for selektiv mangfoldiggj øring av en målnukleinsyresekvens fra et DNA eller en blanding av nukleinsyrer i samsvar med krav 1.

Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for mangfoldiggj øring av to eller flere målnukleotidsekvenser samtidig ved anvendelse av to eller flere par av primere i den samme reaksjon.

Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for å sekvensere et nukleinsyremolekyl fra et DNA eller blanding av nukleinsyrer.

Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for å detektere et nukleinsyremolekyl med genetisk diversitet av en templatavhengig ekstensjonsreaksjon.

Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for å detektere en målnukleotidsekvens i en nukleinsyreprøve ved å anvende en dobbel spesifisitet oligonukleotidimmobilisert microarray.

Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et oligonukleotid med dobbel spesifisitet for syntetisering av et nukleinsyremolekyl med en templatavhengig ekstensjonsreaksjon. Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for å muliggjøre at en annealingsspesifisitet av et oligonukleotid kan bestemmes dobbelt gjennom en struktur i oligonukleotidet.

Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for å forbedre en annealingsspesifisitet av et oligonukleotid.

Andre formål og fordeler med foreliggende oppfinnelse vil bli åpenbare ut fra den detaljerte beskrivelse som følger, sammen med de medfølgende krav og figurer.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Fig. IA og IB representerer skjematisk prinsippet med dobbel spesifisitet (DS) oligonukleotid ifølge oppfinnelsen i en templatavhengig ekstensjonsreaksjon. Fig. IA viser høy hybridiseringsspesifisitet av DS-oligonukleotidet under høye stringensbetingelser. Fig. IB viser mismatch toleranse av DS-oligonukleotidet. Fig. 2 viser skjematisk representasjon for selektiv mangfoldiggj øring av en mål-nukleinsyre av dobbelttrådet DNA ved anvendelse av DS oligonukleotid primere ifølge oppfinnelsen. Fig. 3 viser skjematisk representasjon for selektiv mangfoldiggj øring av en målnukleinsyre av mRNA ved anvendelse av DS oligonukleotid primere ifølge oppfinnelsen. Fig. 4 viser skjematisk representasjon for templatavhengige ekstensjonsreaksjoner i selektiv bestemmelse av en målnukleinsyre ved anvendelse av oligonukleotider med dobbel spesifisitet på oligonukleotid microarray. Fig. 5 er et agarose gel fotografi som viser resultatene av PCR mangfoldiggj øring for cytokinfamilien av gener, IL-ip og IL-19, ved anvendelse av et sett av konvensjonelle primere (IL-lb-5'-0 og IL-lb-3'-0, spor 1; IL-19-5'-0 og IL-19-3'-0, spor 3) og dobbel spesifisitets oligonukleotider (IL-lb-5' og IL-lb-3', spor 2; IL-19-5' og IL-19-3', spor 4). M er en 100-bp størrelsesmarkør generert av Forever 100-bp Ladder Personalizer (Seegene, Inc. Seoul, Korea). Fig. 6A er en agarose gel fotografi som viser resultatene av 3'-RACE (hurtig mangfoldiggj øring av cDNA ender) av DEG 10 genet, som viser PCR spesifisitet av oligonukleotidet med dobbel spesifisitet. Spor 1 representerer en primer med perfekt matchsekvens, sporene 2-4 representerer primere med 3, 2 og 1 base mismatch ved dets 3'-lav Tm spesifisitetsdel, respektivt, og spor 5-7 representerer primere med 5, 3 og 2 base mismatch ved dets 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon, respektivt. M er en 100-bp størrelsesmarkør generert av Forever 100-bp Ladder Personalizer. Fig. 6B er et agarose gel fotografi som viser resultatene av 3'-RACE av DEG 10 genet, som viser mismatch toleranse av dobbel spesifisitetsoligonukleotidet i PCR. Spor 1 representerer en primer med perfekt matchsekvens, sport 2-4 representerer primere med 3,2 og 1 base mismatch og dets 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, respektivt, og sport 5-7 representerer primere med 5, 3 og 2 base mismatch ved dets 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon, respektivt. M er en 100-bp størrelsesmarkør generert av Forever 100-bp Ladder Personalizer. Fig. 7A representer sekvensene av 5' primerne for 3'-RACE av mus placenta-spesifikk homeobox familiegener Psxl og Psx2. Psxl-5'-40 og Psxl-5'-40 er konvensjonelle primere og Psxl-5'-41 og Psx2-5'-41 er primere konstruert i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Fig. 7B er et agarose gel fotografi som viser resultatene av 3'-RACE av Psxl ogPsx2. Sport 1, 3'-RACE av Psxl ved anvendelse av dobbel spesifisitetsoligonukleotid primer Psxl-5'-41; sport 2, 3'-RACE av Psx2 ved anvendelse av dobbel spesifisitetsoligonukleotid primer, Psx2-5'-41, spor 3, 3'-RACE av Psxl ved anvendelse av konvensjonell primer Psxl-5'-40; og sport 4, 3'-RACE av Psx2 ved anvendelse av konvensjonell primer Psx2-5'-40. M er en 100-bp størrelsesmarkør generert av Forever 100-bp Ladder Personalizer. Fig. 8 viser resultatene av direkte syklerende sekvensering for Psxl og Psx2 gener fra mus placenta cDNA pool ved anvendelse av dobbel spesifisitetsoligonukleotid primere Psxl-5'-41 (for Psxl) og Psx2-5'-41 (for Psx2) som en sekvenserende primer. Fig. 9 viser resultatene av multipleks PCR ved anvendelse av 9 sett av cytokinfamilie genspesifikke doble spesifisitetsprimere. Spor 1, multipleks PCR for 9 cytokingener; spor 2, monopleks PCR for IL-3 (200 bp), sport 3, monopleks PCR for IL-15 (250 bp); spor 4, monopleks PCR for IL-18 (300 bp); spor 5, monopleks PCR for IL-25 (350 bp); spor 6, monopleks PCR for IL-2 (400 bp); spor 7, monopleks PCR for IL-6 (450 bP), spor 8, monopleks PCR for IL-19 (500 bp); spor 9, monopleks PCR for IL-ip (550 bp); og spor 10, monopleks PCR for IL-10 (600 bp). M er en 100-bp størrelsesmarkør generert med Forever 100-bp Ladder Personalizer. Fig. 10 viser resultatene av PCR mangfoldiggj øringer av fusjonsglykoprotein (F) genet av human metapneumovirus (hMPV) ved anvendelse av dobbelspesifisitetsoligonukleotid primere. Spor 1, mål PCR ved anvendelse av hMPV5'-585 og hMPV 3'-698 primersett; spor 2, mål PCR ved anvendelse

av hMPV5'-585 og hMPV 3'-1007 primersett; spor 3, mål PCR ved anvendelse av human P-aktin primere; spor 4, mål PCR uten templat; og spor 5, mål PCR uten templat.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for selektivt å mangfoldiggjøre en målnukleinsyresekvens fra en DNA eller en blanding av nukleinsyrer, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter å mangfoldiggjøre målnukleinsyresekvensen ved å utføre minst to sykluser av primer-annealing, primer-forlenging og denaturering, ved anvendelse av et primersett som omfatter et par av dobbelspesifisitetoligonukleotider som forsterker annealingspesifisitet; hvor hvert dobbelspesifisitetoligonukleotid er representert med følgende generelle formel:

hvor, Xp representerer en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på en templatnukleinsyre for å hybridisere dermed, Yq representerer en separasjonsporsjon omfattende minst tre universelle baser, Zrrepresenterer en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på templat nukleinsyren for å hybridisere dermed, p, q og r representerer antallet nukleotider, og p representerer et heltall på minst 15, q representerer et heltall på minst 3, og r representerer et heltall på minst 3; og X, Y og Z er deoksyribonukleotid eller ribonukleotid; hvor Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, hvor separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner; hvor 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er lengre enn 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon; hvor separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparing som ikke fungerer som et hybridiseringssetet og som ikke reagerer med templatet for baseparing, under betingelser hvor 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til templat nukleinsyre, noe som muliggjør at 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon separerer fra 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon i termer av annealingspesifisitet til templat nukleinsyre, hvor annealingspesifisitet av oligonukleotidet bestemmes dobbelt ved 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon slik at den totale annealingspesifisitet av oligonukleotidet økes; hvor annealing i mangfoldiggjøringsreaksjonen utføres under betingelser der annealing kun av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjonen ikke forekommer; hvor en første syklus og en andre syklus av mangfoldiggjøringsreasjonen involverer annealing av både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjonen og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjonen av dobbeltspesifisisitetsoligonukleotidet til målnukleinsyresekvensen og påfølgende sykluser av mangfoldiggjøringsreaksjonen involverer annealing av både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjonen og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjonen av dobbelt-spesifisitetsoligonukleotidet til en sekvens som er avledet fra dobbeltspesifisisitetsoligonukleotidet

inkorporert inn i det mangfoldiggjorte produkt; hvor den universelle base inneholdt i separasjonsporsjonen er deoksyinosin eller inosin.

Det beskrives heri (a) et bredt spekter av framgangsmåter som anvender dobbel spesifisitetsoligonukleotid og (b) en dobbel spesifisitetsoligonukleotid dertil. Dobbel spesifisitetsoligonukleotid beskrevet heri (heretter benevnt som "DS oligo") muliggjør at primere eller prober kan anneales til dets målsekvens med forbedret spesifisitet, slik at spesifisiteten av nukleinsyremangfoldiggj øring (spesielt PCR) og hybridiseringsreaksjoner kan forbedres signifikant.

Oligonukleotid med dobbel spesifisitet (DS Oligo)

Det beskrives heri en dobbelspesifisitet oligonukleotid for syntetisering av et nukleinsyremolekyl med en templatavhengig ekstensjonsreaksjon, som er representert med følgende generelle formel:

hvor, Xp representerer en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på en templat nukleinsyre for å hybridisere dermed, Yq representerer en separasjonsporsjon som omfatter minst to universelle baser, Zrrepresenterer en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på templat nukleinsyren den skal hybridisere med, p, q og r representerer antallet nukleotider, og X, Y og Z er deoksyribonukleotid eller ribonukleotid; Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn den for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, separeringsporsjonen har den laveste Tm i de tre porsjoner; separeringsporsjonen danner en ikke-baseparende boblestruktur under betingelser som 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon anneales til templat nukleinsyren, som muliggjør at 5'-høy Tm spesifisitetsporsjonen separerer fra 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon i termer av annealingsspesifisitet til templat nukleinsyren, hvorved annealingsspesifisiteten av oligonukleotidet bestemmes dobbelt med 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon slik at den totale annealingsspesifisitet av oligonukleotidet forbedres.

Termen "dobbelspesifisitet" med referanse til DS oligonukleotidet (heretter benevnt som "DS oligo") ifølge oppfinnelsen, anvendes heri for å beskrive dets dominerende trekk idet dets annealingsspesifisitet til en målsekvens dobbelt bestemmes av to separate porsjoner, det vil si 5'-høy Tm spesifisitetsporsjonen og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjonen. Generelt, annealingsspesifisiteten av primere eller prober styres av deres totale konsekutive sekvens. I motsetning, annealingsspesifisiteten av DS oligo bestemmes dobbelt med dets to porsjoner (5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon) separert av separeringsporsjonen, hvor disse tre porsjoner er lokalisert i én oligonukleotidsekvens. Slik dobbelspesifisitet muliggjør at DS oligo kan fungere som en primer og probe som oppviser mye større spesifisitet, noe som gjør foreliggende oppfinnelse ny og oppfinnerisk over teknikkens stand.

Oppfinneren av foreliggende oppfinnelse har allerede utviklet ACP (annealing kontroll primer) for å forbedre annealingsspesifisitet som beskrevet i WO 03/050303. DS oligo ifølge foreliggende oppfinnelse er distinkt forskjellig fra ACPen med hensyn til følgende: (i) DS oligo har to spesifisitets-funksjoner som kan hybridiseres med en målsekvens mens ACPen har én spesifisitetsporsjon; (ii) tre porsjoner i DS oligo er distinkt diskriminert i lys av Tm mens porsjoner i ACPen ikke er det; (iii) DS-primere forlenges for å syntetisere et nukleinsyremolekyl som er komplementært til templatet kun idet annealing foregår ved både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, mens ACPen forlenges selv idet annealingen foregår ved 3'-endeporsjon; og (iv) annealing eller hybridiseringsspesifisiteten av DS oligo bestemmes dobbelt av de to separate porsjoner, det vil si 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, mens ACPen styres kun av 3'-endeporsjon. Således, det skal anerkjennes at annealing eller hybridiseringsspesifisitet av DS oligo til dets målsekvens er langt høyere enn for ACPen, noe som gjør at DS oligo er ny og oppfinnerisk over ACPen.

Det påfallende trekk av DS oligo er at den har tre forskjellige porsjoner med distinkte egenskaper innen ett oligonukleotidmolekyl; 5-høy Tm spesifisitetsporsjon, 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon og separeringsporsj on.

DS oligo er nyttig innen et bredt spekter av framgangsmåter og analyser som involverer en templatavhengig ekstensjonsreaksjon. Termen "en templatavhengig ekstensjonsreaksjon" angir en reaksjon for å forlenge et oligonukleotidmolekyl hybridisert til en målsekvens ved å inkorporere suksessive nukleotider inn i dets ende-enhet hvor den forlengete sekvens bestemmes med en komplementær templatssekvens.

En skjematisk representasjon for prinsippene som styrer hybridiseringen (annealing) spesifisitet av DS oligoen er illustrert i fig. IA. Med henvisning til fig. IA, DS oligo vil bli beskrevet i mer detalj.

Hvor kun 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon av DS oligo anneales til et templat kan den ikke fungere som et primingsete for en templatavhengig ekstensjon, noe som resulterer i ingen forekomst av ekstensjon.

Idet 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon av DS oligo anneales til en ikke-målsekvens, vil 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon som har en kortere sekvens sannsynligvis ikke anneale til ikke-målsekvensen. Grunnene for dette er at 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er separert av separasjonsporsjonen i termer av annealingshendelser. Med andre ord, 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er involvert i annealingshendelser i en relativ uavhengig måte fra 5'-høy spesifisitetsporsjon og annealingen av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er mindre påvirket av annealingen av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon. I denne forbindelse, sannsynligheten for annealing av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon til en ikke-målsekvens blir langt lavere.

Idet kun 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon har en sekvens som er komplementær til et ikke-målsete, foregår heller ikke annealing under visse høye stringente betingelser, for eksempel stringent-betingelsere for annealing av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon. I samsvar med en foretrukket utførelse er det fordelaktig å utføre templatavhengig ekstensjonsreaksjoner ved anvendelse av DS oligo under stringente betingelser med annealingstemperatur langt høyere enn Tm av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon.

Idet både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon har en sekvens som i hovedsak er komplementær til et templat, kan DS oligo anneales til templatet og således kan suksessfull ekstensjon forekomme.

Uten å ønske å være bundet av teori antas det at separasjonsporsjonen gjør 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon mer sensitiv til annealingsbetingelser (for eksempel temperatur og sekvenskomplimentaritet). I denne forbindelse, hyppigheten av ikke-spesifikk hybridisering mellom 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon og ikke-målsekvensene blir langt lavere under visse annealing (eller stringenter) betingelser. Der hvor 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon og likeledes 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon anneales til dets målsekvens, vil 3'-enden av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon mer sannsynlig generere et sete som kan forlenges av DNA polymerasen

Termen "oligonukleotid" som anvendt heri benevner en lineær oligomer av naturlige eller modifiserte monomerer eller bindinger, inkluderende deoksyribonukleotider, ribonukleotider og lignende, i stand til spesifikt å hybridisere med en målnukleotidsekvens, enten denne forekommer naturlig eller produseres syntetisk. Oligonukleotidet er fortrinnsvis enkelttrådet for maksimal effektivitet med hensyn til hybridisering. Fortrinnsvis, oligonukleotidet er en oligodeoksyribonukleotid. Oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan utgjøres av naturlige forekommende dNMP (det vil si dAMP, dGM, dCMP og dTMP), nukeotidanaloger, eller nukleotidderivater. Oligonukleotidet kan også inkludere ribonukleotider. For eksempel, oligonukleotidet ifølge oppfinnelsen kan inkludere nukleotider med backbone-modifiseringer så som peptidnukleinsyre (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), fosforotioat DNA, fosforoditioat DNA, fosforamidat DNA, amidkoblet DNA, MMI-koblet DNA, 2'-0-metyl RNA, alfa-DNA og metylfosfonat DNA, nukleotider med sukkermodifikasjoner så som 2'-0-metyl RNA, 2'-fluor RNA, 2'-amino RNA, 2'-0-alkyl DNA, 2'-0-allyl DNA, 2'-0-alkynyl DNA, heksose DNA, pyranosyl RNA, og anhydroheksitol DNA, og nukleotider som har basemodifikasjoner så som C-5-substituerte pyrimidiner (substituenter inkluderer fluor-, brom-, klor-, jod-, metyl-, etyl-, vinyl-, formyl-, etynyl-, propynyl-, alkynyl-, tiazolyl-, imidazolyl-, pyridyl-), 7-deazapuriner med C-7 substituenter (substituenter inkluderer fluor-, brom, klor-, jod-, metyl-, etyl-, vinyl-, formyl-, alkynyl-, alkenyl-, tiazolyl-, imidazolyl-, pyridyl-), inosin og diaminopurin.

Termen "primer" som anvendt heri refererer til et oligonukleotid, som er i stand til å virke som et initieringspunkt for syntese idet det plasseres under betingelser hvor syntese av primerekstensjons-produkt som er komplementær til en nukleinsyretråd (templat) er introdusert, det vil si i nærvær av nukleotider og et polymeriseringsmiddel, så som DNA polymerase, og ved en egnet temperatur og pH. Primeren er fortrinnsvis enkelttrådet for maksimal effektivitet med hensyn til mangfoldiggj øring. Fortrinnsvis, primeren er en oligodeoksyribonukleotid. Primeren ifølge oppfinnelsen kan omfatte naturlig forekommende dNMP (det vil si dAMP, dGM, dCMP og dTMP), modifisert nukleotid, eller ikke-naturlig nukleotid. Primeren kan også inkludere ribonukleotider. Primere må være tilstrekkelige lange til å prime syntese av ekstensjonsprodukter i nærvær av polymeriseringsmidlene. Den eksakte lengde av primere vil avhenge av mange faktorer, inkluderende temperatur, applikasjon og kilde for primer. Termen "annealing" eller "priming" som anvendt heri refererer til nær plassering av (apposisjon) som muliggjør at polymerasene polymeriserer nukleotider til et nukleinsyremolekyl som er komplementær til templatnukleinsyren eller en porsjon derav. Termen "hybridisering" som anvendt heri refererer til dannelse av en dobbelttrådet nukleinsyre fra komplementære enkelttrådete nukleinsyrer. Der er ingen tiltenkt forskjell mellom termene "annealing" og "hybridisering", og disse termer vil anvendes om hverandre.

Termen "probe" refererer til et enkelttrådet nukleinsyremolekyl som omfatter en porsjon eller porsjoner som i hovedsak er komplementære til en målnukleotidsekvens.

Termen "porsjon" som anvendt heri i forbindelse med DS oligo ifølge oppfinnelsen refererer til en nukleotidsekvens separert av separasjonsporsjonen. Termen "5'-høy Tm spesifisitetsporsjon" eller "3'- lav Tm spesifisitetsporsjon" refererer til en nukleotidsekvens ved 5'-enden eller 3'-enden av DS oligoen ifølge oppfinnelsen, respektivt, som er separert av separasjonsporsjonen. Termen "5'-høy Tm spesifisitetsporsjon" i forbindelse med DS oligoen er tiltenkt å referere til en porsjon med den høyeste Tm av disse tre porsjoner og som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på templat nukleinsyren. Termen "3'-lav Tm spesifisitetsporsjon" i forbindelse med DS oligoen angir en porsjon med en lavere Tm enn 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon men høyere Tm enn separasjonsporsjonen og som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på templat nukleinsyren.

Termen "Tm" som anvendt heri referer til smeltetemperaturen hvor halvparten av molekylene i en nukleinsyre dupleks er enkelttrådet. Termene "høy Tm" og "lav Tm" i forbindelse med porsjoner i DS oligoen er tiltenkt å beskrive en relativ Tm-verdi, og ikke en absolutt Tm-verdi. Det vil si, det er kun nødvendig at Tm av 5-'høy Tm spesifisitetsporsjon er høy i forhold til den for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon.

5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er designert til å ha en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på en templat nukleinsyre for å hybridisere dermed. Termen "i hovedsak komplementær" refererer til DS oligoen anvendt heri for å angi at oligonukleotidmolekylet er tilstrekkelig komplementær til å hybridisere selektivt til en templat nukleinsyresekvens under de designerte annealingsbetingelser eller stringente betingelser, slik at det annealete oligonukleotid kan forlenges av en polymerase for å danne en komplementær kopi av templatet. Derfor, denne term har en forskjellig betydning fra "perfekt komplementairtet" eller beslektede termer derav. Det skal anerkjennes at 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon av DS oligo kan ha én eller flere mismatcher til et templat i en slik grad at DS oligo kan fungere som primer eller probe. Mest foretrukket, 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og/eller 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon av DS oligoen har en nukleotidsekvens som er perfekt komplementær til et sete på et templat, det vil si ingen mismatcher.

For suksessfull utførelse av DS oligoen, er det essensielt at Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for den for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon. Det er foretrukket Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er i området fra 40°C til 80°C, mer foretrukket 40°C til 75°C, eller mer foretrukket 50°C til 68°C, og mer foretrukket 50°C til 65°C. Det er foretrukket at Tm av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er i området fra 10°C til 40°C, mer foretrukket 15°C til 40°C, og mer foretrukket 20°C til 35°C. Fortrinnsvis, Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere ved minst 5°C, mer fortrinnsvis ved minst 10°C, mer fortrinnsvis ved minst 15°C, og mest foretrukket ved minst 20°C enn det for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon. Fortrinnsvis, Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere 5-70°C, fortrinnsvis 10-70°C, mer foretrukket 10-60°C, enda mer foretrukket 10-50°C, enda mer foretrukket 10-40°C og mest foretrukket 20-40°C enn den for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon.

I samsvar med en foretrukket utførelse er 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon lengre enn 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon. Lengden av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er fortrinnsvis 15 til 40 nukleotidenheter, mer fortrinnsvis 15 til 30 nukleotidenheter, og mest foretrukket 20 til 40 nukleotidenheter. Lengden av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er fortrinnsvis 3 til 15 nukleotidenheter, mer foretrukket 5 til 15 nukleotidenheter, og mest foretrukket 6 til 12 nukleotidenheter.

Separasjonsporsjonen som omfatter minst to universelle baser er delvis ansvarlig for fordelene og egenskapene med DS oligo. Termen "universell base" som anvendt heri refererer til én som er i stand til å danne basepar med hver av de naturlige DNA/RNA-baser med liten diskriminering der i mellom.

Det er bredt kjent at nukleotider ved noen flertydige posisjoner av degenererte primere har blitt erstattet av universale baser så som deoksyinosin (Ohtsuka, E. et al., (1985) J. Biol. Chem. 260, 2605-2608; and Sakanari, J.A. et al., (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. 86, 4863-4867), l-(2'-deoksy-beta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol (Nichols, R. et al., (1994) Nature 369, 492-493) and 5-nitroindole (Loakes, D. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4039-4043) for å løse designproblemene assosiert med degenererte primere, på grunn av at slike universalbaser er i stand til ikke-spesifikk baseparing med alle fire konvensjonelle baser. Imidlertid, det har ikke blitt rapportert at disse universalbaser muliggjør å danne en porsjon i et oligonukleotidmolekyl for å generere en boblestruktur under annealing (hybridisering) eller mangfoldiggj øring, og deretter separere to motsatte tilgrensende sekvenser, som resulterer i en forbedring av annealingsspesifisiteten av primere eller prober til en målsekvens med dobbel spesifisitet gjennom to separate spesifisitets- (annealing) porsjoner.

I samsvar med en foretrukket utførelse er universalbasen i separasjonsporsjonen valgt blant gruppen omfattende deoksyinosin, inosin, 7-deaza-2'-deoksyinosin, 2-aza-2'-deoksyinosin, 2'-OMe inosin, 2'-F inosin, deoksy 3-nitropyrrol, 3-nitropyrrol, 2'-OMe 3-nitropyrrol, 2'-F 3-nitropyrrol, 1-(2'-deoksy - beta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol, deoksy 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2'-OMe 5-nitroindol, 2'-F 5-nitroindol, deoksy 4-nitrobenzimidazol, 4-nitrobenzimidazol, deoksy 4-aminobenzimidazol, 4-aminobenzimidazol, deoksy nebularin, 2'-F nebularin, 2'-F 4-nitrobenzimidazol, PNA-5-introindol, PNA-nebularin, PNA-inosin, PNA-4-nitrobenzimidazol, PNA-3-nitropyrrol, morfolino-5-nitroindol, morfolinonebularin, morfolinoinosin, morfolino-4-nitrobenzimidazol, morfolino-3-nitropyrrol, fosforamidat-5-nitroindol, fosforamidatnebularin, fosforamidatinosin, fosforamidat-4- nitrobenz imidazol, fosforamidat-3-nitropyrrol, 2'-0-metoksyetylinosin, 2'0-metoksyetylnebularin, 2'-0-metoksyetyl 5-nitroindol, 2'-0-metoksyetyl 4-nitrobenzimidazol, 2'-0-metoksyetyl 3-nitropyrrol, og kombinasjoner derav. Mer fortrinnsvis, den universale base eller ikke-diskirminerende baseanalog er deoksyinosin, l-(2'-deoksy-beta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol eller 5-nitroindol, og mest foretrukket er deoksyinosin.

Slike universalbaser kan være inneholdt i separasjonsporsjonen i en kontigøs måte eller på en avbrutt måte med andre nukleotider så som dMNPer. Det er foretrukket at separasjonsporsjonen omfatter kontigøse nukleotider som har universalbaser, fortrinnsvis deoksyinosin.

Det er kritisk at separasjonsporsjonen i DS oligoen har den laveste Tm i de porsjoner, for at separasjonsporsjonen skal danne en ikke-baseparende boblestruktur under betingelser hvor 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til templat nukleinsyren, noe som muliggjør at 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon kan separere fra 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon med hensyn til annealingsspesifisitet til templatnukleinsyren, hvorved annealingsspesifisiteten av oligonukleotidet bestemmes dobbelt av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon slik at den totale annealingsspesifisitet av oligonukleotidet er betydelig forbedret. Fortrinnsvis, Tm av separasjonsporsjonen er i området fra 3°C til 15°C, mer foretrukket 4°C til 15°C, og mest foretrukket 5°C til 10°C.

I samsvar med en foretrukket utførelse, separasjonsporsjonen mellom 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon inneholder minst 3 universale baser, mer fortrinnsvis minst 4 universale baser, og mest foretrukket minst 5 universale baser. I samsvar med en foretrukket utførelse inneholder spesifisitetsporsjonen 2-10 universelle baser, mer fortrinnsvis 3-10 universelle baser, enda mer foretrukket 4-8 universelle baser, og mest foretrukket 5-7 universelle baser.

Idet det er nødvendig med en primer eller probe med en lengre sekvens er fordelene med DS oligo mest foretrukket. For eksempel, i samsvar men en konvensjonell teknikk, en primer som har en nukleotidsekvens lengre enn 35 bp som en hybridiseirngssekvens er svært disponert for å generere ikke-spesifikke mangfoldiggjøringer. I motsetning, DS oligo kan generere spesifikke mangfoldiggjøringer selv med lengre sekvenser, siden den bærer to hybridiseringssekvenser ( det vil si 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon) separert fra hverandre med hensyn til molekylær interaksjon med templater ( det vil si annealing). For eksempel, DS oligoen kan inneholde 35-45 bp av en hybridiserende sekvens som er komplementær til en målsekvens. I denne sammenhengen skal det anerkjennes at foreliggende oppfinnelse muliggjør at primere kan konstrueres med mye lengre sekvenser som vurderes å være ikke-praktiske i konvensjonelle primer designstrategier.

I samsvar med en foretrukket utførelse, 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er 15 til 25 nukleotider i lengde, separasjonsporsjonen er 3 til 15 nukleotider i lengde, og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er 3 til 15 nukleotider i lengde.

Mer foretrukket, 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er 15 til 25 nukleotider i lengde; spesifisitetsporsjonen er 3 til 10 nukleotider i lengde; og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er 5 til 15 nukleotider i lengde. Mest foretrukket, 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er 15 til 25 nukleotider i lengde; separasjonsporsjonen er 5 til 7 nukleotider i lengde; og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er 6 til 10 nukleotider i lengde. I samsvar med en representerende og illustrerende DS oligo beskrevet i eksempler, er 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon ca. 20 nukleotider i lengde; separasjonsporsjonen er ca. 5 nukleotider i lengde; og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er ca. 8 til 10 nukleotider i lengde.

I den mest foretrukne utførelse er DS oligo representert med følgende generelle formel: 5'-Xp-(dI)q-Zr-3' (definisjoner og karakteristika av Xp og Zrer de samme som beskrevet tidligere, dl representerer deoksyinosin, (dl)q representerer en separasjonsporsjon omfattende kontigøse nukleotider som har universelle baser og q er et heltall mellom 5-7).

Interessant, foreliggende DS oligo har mismatch toleranse under stringente betingelser tilstrekkelig til å tolerere mismatching til dets målsekvens.

En skjematisk representasjon for prinsippene som styrer mismatch toleranse av DS oligo er illustrert i fig. IB. Én eller flere, fortrinnsvis én til tre basemismatcher i 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon kan tolereres under betingelser der både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til templatet. Én eller flere, fortrinnsvis én til to base mismatcher i 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon kan tolereres under betingelser der både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til templatet. Videre, én eller flere, fortrinnsvis én til fem base mismatcher i både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon kan tolereres under betingelsene der både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til templatet.

For å påtvinge mismatch toleranse på DS oligo, er annealingsbetingelsene, spesielt annealingstemperaturen viktig. Annealing utføres under betingelser der annealing kun ved 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon ikke forekommer, men der annealing med alle porsjoner foregår idet 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og/eller 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon har én eller flere, ennå begrenset, mismatchede baser til dets målsete. DS oligoer som har mismatch toleranse er nødvendig for å mangfoldiggjøre eller detektere en nukleotidsekvens med genetisk diversitet. DS oligoen med mismatch toleranse kan anneales til målsekvenser som viser genetisk diversitet og resultere i suksessrik amplifisering og deteksjon av nukleotidsekvenser av interesse. Med andre ord, DS oligo som opprinnelig ble utviklet for dramatisk å forsterke spesifisitet av annealing og hybridisering kan også anvendes i prosesser som krever mismatch toleranse hvor annealing eller stringente betingelser hensiktsmessig illustreres.

Også beskrevet heri er en framgangsmåte for å muliggjøre en annealingsspesifisitet av et oligonukleotid til å dobbelt bestemmes gjennom en struktur av oligonukleotidet, hvor framgangsmåten omfatter trinnene: (a) selektere en målnukleinsyresekvens; (b) designe en sekvens av et oligonukleotid som har (i) en hybridiseringssekvens i hovedsak komplementær til målnukleinsyren og (ii) en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser, slik at separasjonsporsjonen intervenerer i hybridiseringssekvensen og danner tre porsjoner av oligonukleotidet; og (c) bestemme posisjonen av separeringsporsjonen i oligonukleotidet for å muliggjøre at en porsjon ved 5'-retningen av separasjonsporsjonen har en høyere Tm enn en porsjon ved 3'-retningen av separasjonsporsjonen, og for å muliggjøre at separasjonsporsjonen har laveste Tm av de tre porsjoner, for derved å tilveiebringe et oligonukleotid som har tre distinkte porsjoner med forskjellige Tm-verdier fra hverandre, hvor (i) en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon av oligonukleotidet har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til målnukleinsyren, (ii) en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon av oligonukleotidet har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til målnukleinsyren; og (iii) separasjonsporsjonen av oligonukleotidet mellom 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon omfatter minst to universelle baser; og Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, og separasjonsporsjonen som har den laveste Tm av de tre porsjoner, hvor annealingsspesifisitet av oligonukleotidet til målnukleinsyren bestemmes dobbelt med både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon.

Den foreliggende framgangsmåte tilveiebringer en ny løsning for dramatisk å øke annealingsspesifisitet av et oligonukleotid som skal hybridisere med dets målsekvens. Foreliggende framgangsmåte uttrykkes også som en framgangsmåte for å forbedre en annealingsspesifisitet av et oligonukleotid. Videre, foreliggende fremgangsmåte vedrører en framgangsmåte som anvender en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser for å forbedre annealingsspesifisitet av et oligonukleotid hybridisert til en målsekvens.

Den foreliggende framgangsmåte utføres for å framstille DS oligo beskrevet ovenfor. Det er således av interesse å unngå unødvendig overflødighet, og de felles beskrivelser av disse repeteres ikke, men inkorporeres i denne beskrivelse i framgangsmåten som om de ble repetert.

De fleste av de konvensjonelle framgangsmåter for å designe primere eller prober bruker kun en sekvens som er tilgjengelig for å hybridisere til deres målsekvenser. Videre, for å øke annealingsspesifisitet av oligonukleotider, har det konvensjonelt blitt foreslått å justere mangfoldiggj øring eller hybridiseringsbetingelser så som temperatur og ionekonsentrasjon.

I motsetning, foreliggende framgangsmåte tilveiebringer en ny strategi for å øke annealingsspesifisitet ved å introdusere nye karakteristika i oligonukleotidsekvensene per se. Termen "gjennom en struktur av oligonukleotidet" anvendt heri med referanse til å muliggjøre annealingsspesifisitet av oligonukleotidet til å kunne bestemmes dobbelt, betyr at strukturen av oligonukleotidet bidrar sterkt til økningen i annealingsspesifisitet av oligonukleotidene ved å påtvinge på oligonukleotidet en ny egenskap at de dobbelt bestemmes i termer av annealingsspesifisitet.

Det er kritisk med foreliggende framgangsmåte å designe en sekvens av et oligonukleotid som har (i) en hybridiserende sekvens som i hovedsak er komplementær til målnukleinsyren, og (ii) en separasjonsporsjon som omfatter minst to universelle baser. I dette trinn presenteres en strukturell oversikt av oligonukleotidet som en 5'-endeporsjon/separasjonsporsjon/3'-endeporsjon i oligonukleotidet. Både 5'-enden og 3'-endeporsjonene bærer en hybridiseringssekvens i hovedsak komplementær til målnukleinsyren og interveneres av separasjonsporsjonen.

Det mest kritiske trinn i foreliggende fremgangsmåte er å bestemme posisjonen av separasjonsporsjonen i oligonukleotidet for å muliggjøre at en porsjon ved 5'-retningen av separasjonsporsjonen til å ha en høyere Tm enn en porsjon med 3'-retningen av separasjonsporsjonen og å muliggjøre at separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner, for derved å tilveiebringe en oligonukleotid som har tre distinkte porsjoner ved forskjellige Tm-verdier fra hverandre.

De nye strukturelle karakteristika introdusert i oligonukleotidene med foreliggende framgangsmåte er: (i) tre distinkte porsjoner (5'-høy Tm spesifisitetsporsjon, separasjonsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon) i oligonukleotidsekvensene; (ii) forskjellige Tm-verdier av de tre porsjoner; (iii) separasjonsporsjon mellom 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon omfattende minst to universelle baser; (iv) to porsjoner involvert i molekylær interaksjon med målene i annealingstrinn, som er separert i termer av annealingshendelser av separasjonsporsjonen; (v) Tm-verdier følger rekkefølgen av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon, 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon og separasjonsporsjon. Slike strukturelle egenskaper sikrer at annealingsspesifisitet av oligonukleotidene til slutt tilveiebrakt av foreliggende oppfinnelse bestemmes dobbelt med både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, noe som muliggjør den dramatiske økning i annealingsspesifisitet av oligonukleotidene til deres målsekvens.

Oligonukleotidene designet og framsatt i samsvar med foreliggende oppfinnelse oppviser mye høyere annealingsspesifisitet enn de som ikke har tre slike porsjoner.

Egenskapene og fordelene med DS oligo vil nå bli beskrevet som følger:

(a) Separasjonsporsjonen av DS oligo omfatter minst to universelle baser som genererer den laveste Tm-regionen i DS oligoen, slik at den former en ikke-base-parende boblestruktur under betingelser der 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon anneales til templat nukleinsyren. Slik ikke-base-parende boblestruktur muliggjør at 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon separerer fra 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon i termer av annealingsspesifisitet til templat nukleinsyre; (b) Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, og separasjonsporsjonen viser den laveste Tm, noe som muliggjør å etablere stringente betingelser der kun annealing ved 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon ikke forekommer; (c) Således, den totale annealingsspesifisitet av DS oligo bestemmes dobbelt av både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon; og

(d) Som en konsekvens, den totale annealingsspesifisitet av DS oligo forbedres dramatisk.

Det skal anerkjennes at DS oligoen beskrevet heri er svært nyttig i en rekke av (i) primer-basert nukleinsyremangfoldiggjøringsmetoder så som metodene ifølge Miller, H. I. (WO 89/06700) and Davey, C. et al. (EP 329,822), ligase kjedereaksjon (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), polymerase ligase kjedereaksjon (Barany, PCR Methods and Applic, 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), reparasjonskjedereaksjon (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) og NASBA (U.S. Pat. No. 5,130,238), (ii) primer ekstensjonsbaserte teknologier så som syklus sekvensering (Kretz et al., (1994) Cycle sequencing. PCR Methods Appl. 3:S107-S112) og pyrosekvensering (Ronaghi et al., (1996) Anal. Biochem., 242:84-89; and (1998) Science 281:363-365), og (iii) hybridiseringsbaserte teknologier så som deteksjon av en målnukleotidsekvens ved anvendelse av oligonukleotid microarray.

DS oligo som beskrevet heri kan appliseres innen en rekke nukleinsyre mangfoldiggjøringer, sekvenserings- og hybridiseringsbaserte teknologier. Representative eksempler for å bevise effekten av DS oligo er som følger:

I. Anvendelse for syntese av nukleinsyremolekyl

Det beskrives heri en framgangsmåte for å syntetisere et nukleinsyremolekyl ved anvendelse av et dobbelt spesifisitets oligonukleotid med en templatavhengig ekstensjonsreaksjon, som omfatter trinnene:

(a) Annealing av dobbeltspesifisitet oligonukleotidet til et templat nukleinsyremolekyl,

hvor dobbeltspesifisitet oligonukleotidet har tre porsjoner hvor en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på templat nukleinsyren for å hybridisere dermed, en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser og en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på templat nukleinsyren for å hybridisere dermed, Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner; separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparende boblestruktur under betingelser der 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til templat nukleinsyren, hvor annealingen utføres under betingelser der kun annealing ved 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon ikke forekommer; og (b) Forlenge dobbel spesifisitet oligonukleotidet for å syntetisere et nukleinsyremolekyl som er komplementær til templat nukleinsyren.

Siden syntesemetoden ifølge oppfinnelsen benytter DS oligo beskrevet heri, så vil felles beskrivelse av disse utelates for å unngå at kompleksitet av spesifikasjonen fører til unødvendige gjentakelser.

Denne applikasjon som anvender DS oligo som beskrevet heri kan tilveiebringe en forbedret framgangsmåte for selektiv syntese av en nukleinsyresekvens komplementær til en målsekvens med en templatavhengig ekstensjonsreaksjon som involverer annealing og forlengelsestrinn. Nærmere bestemt, syntese av en nukleinsyresekvens komplementær til en målsekvens kan oppnås ved å repetere prosessen av templatavhengig ekstensjonsreaksjon hvor annealing og ekstensjonstrinnene etterfølges av denatureringstrinn.

Framgangsmåten beskrevet heri kan anvendes for å syntetisere et nukleinsyremolekyl som er komplementær til et hvert templat nukleinsyremolekyl. Et slikt molekyl kan være enten DNA eller RNA. Molekylet kan være i enten i en dobbeltrådet eller enkelttrådet form. Hvor nukleinsyren som utgangsmateriale er dobbeltrådet, er det foretrukket å omdanne de to tråder til en enkelttrådet eller partiell enkelttrådet form. Framgangsmåter kjent for å separere tråder inkluderer, men er ikke begrenset til, oppvarming, alkalisk behandling, formamid, urea og glykoksalbehandling, enzymatiske framgangsmåter (for eksempel helicasevirkning), og bindingsproteiner. For eksempel, trådseparering kan oppnås ved oppvarming ved temperaturer i området fra 80°C til 105°C. Generelle framgangsmåter for å utføre slik behandling er tilveiebrakt av Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001).

Idet en mRNA benyttes som utgangsmateriale, er et revers transkripsjonstrinn nødvendig før man utfører annealingstrinnet, og detaljer på dette kan finnes i Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); og Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)). For revers transkripsjon anvendes et oligonukleotid dT primer som er hybridiserbart til poly A hale av mRNA. Oligonukleotid dT primeren utgjøres av dTMPer hvor én eller flere av disse kan erstattes med andre dNMPer så lenge dT primeren kan fungere som primer. Revers transkripsjon kan utføres med revers transkriptase som har RNase H aktivitet. Dersom man anvender et enzym som har RNase H aktivitet, er det mulig å utelate et separat RNase H oppkuttingstrinn ved forsiktig å utvelge reaksjonsbetingelsene.

Foreliggende framgangsmåte krever ikke at templat nukleinsyremolekylene har en bestemt sekvens eller lengde. Nærmere bestemt, molekylene inkluderer enhver naturlig forekommende prokaryot, eukaryot (for eksempel protozoaner og parasitter, fungi, gjær, høyere planter, lavere og høyere dyr, inkluderende pattedyr og mennesker), virale (for eksempel herpesvirus, HIV, influensavirus, Epstein-Barr virus, hepatittvirus, poliovirus, etc), er viroid nukleinsyre. Nukleinsyremolekylet kan også være ethvert nukleinsyremolekyl som har blitt eller kan kjemisk syntetiseres. Således, nukleinsyre-sekvensen kan, eller trenger ikke, finnes i naturen.

DS oligoen anvendt heri hybridiseres eller anneales til et sete på templatet slik at den dobbelttrådete struktur dannes. Betingelser for nukleinsyre annealing egnet for å danne slik dobbelttrådet struktur er beskrevet av Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) and Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985). Sekvensene av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon av DS oligo trenger ikke å oppvise presis komplementaritet, men trenger kun å være i hovedsak komplementær i sekvens slik at det er mulig å danne en stabil dobbeltrådet struktur. Således, avvik fra fullstendig komplemtaritet er mulig, så lenge slike avvik ikke er tilstrekkelig til fullstendig å ødelegge hybridisering i å danne en dobbelttrådet struktur. Annealing av DS oligo til sete på templat nukleinsyren er en forutsetning for dets templatavhengige polymerisering med polymeraser. Faktorer (se Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); and Haymes, B.D., et. al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)) som påvirker baseparing av DS oligo til dets komplementære nukleinsyrer vil deretter påvirke priming effektivitet. Nukleotidsammensetningen av DS oligo kan påvirke temperaturen hvorved annealing er optimal og kan således påvirke priming effektivitet.

5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon av DS oligo under annealingstrinnet kan spille en rolle idet en hybridiseringsporsjon eller et spesifisitetsbestemmende sete ( det vil si dobbel spesifisitetsbestemmende sete), idet separasjonsporsjonen ikke fungerer som et hybridiserende sete og ikke interagerer med templatet for baseparing.

En rekke DNA-polymeraser kan anvendes i ekstensjonstrinnet ifølge foreliggende framgangsmåter, som inkluderer "Klenow"-fragment av E. coli DNA polymerase I, en termostabil DNA-polymerase, og bakteriofag T7 DNA polymerase. Fortrinnsvis, polymerasen er en termostabil DNA-polymerase som kan oppnås fra en rekke bakteriearter, inkluderende Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, og Pyrococcus furiosus (Pfu). Ved utføring av en polymeriseringsreaksjon er det foretrukket å tilveiebringe forbindelser nødvendig for en slik reaksjon i overskudd i reaksjonskaret. Overskudd med henvisning til komponenter av ekstensjonsreaksjon refererer til en mengde av hver komponent slik at tilgjenge-ligheten for å oppnå den ønskede ekstensjon ikke vesentlig begrenses av konsentrasjonen av nevnte komponent. Det er hensiktsmessig å tilveiebringe reaksjonsblandingen av en mengde av nødvendige kofaktorer så som Mg<2+>, dATP, dCTP, dGTP, og dTTP i tilstrekkelig mengde til å støtte den grad av ekstensjon som er ønsket.

Annealing eller hybridisering ifølge foreliggende framgangsmåte utføres under stringente betingelser som muliggjør spesifikk binding mellom DS oligo og templat nukleinsyre. Slike stringente betingelser for annealing vil være sekvensavhengige og varieres avhengig av omgivelsesparametre. I foreliggende framgangsmåte utføres annealingstrinnene under høye stringentbetingelser. Imidlertid, dersom foreliggende framgangsmåte appliseres for framgangsmåter som krever mismatch toleranse, er det foretrukket at annealingstrinnene utføres under stringente betingelser hvor 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til templatet til tross for nærvær av én eller flere, om ennå et begrenset antall, basepar mismatch. Slik mismatch toleranse er svært nyttig i mangfoldiggj øring eller deteksjon av et gen med genetisk diversitet. Stringentbetingelser kan enkelt bestemmes ut fra standard kjente metoder innen feltet.

Det er fordelaktig å utføre annealingstrinnet ved en annealingstemperatur høyere enn Tm for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, som sikret at annealing ved kun 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon ikke forekommer. Fortrinnsvis er annealingstemparaturen høyere med minst 5°C, mer fortrinnsvis ved minst 10°C, enda mer foretrukket ved minst 15°C, og mest foretrukket ved minst 20°C enn Tm av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon.

I en foretrukket utførelse er annealingstemperaturen i området fra ca. 40°C til 75°C, mer foretrukket 45°C til 72°C, enda mer foretrukket 50°C til 68°C, og mest foretrukket 55°C til 65°C. Annealingstemperaturer egnet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bestemmes ved å vurdere uavhengig Tm-verdiene av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon. Med andre ord, annealingstemperaturer ifølge foreliggende framgangsmåte skal ikke bestemmes av den totale lengde av nukleotidsammensetninger av både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, men av den individuelle lengde og nukleotidsammensetning av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og/eller 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon. Vanligvis bestemmes annealingstemperaturen ved å vurdere kun Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon til å være mye høyere enn Tm av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, og denne blir optimal.

Dersom mismatch toleranse er nødvendig i annealingstrinnet, er det foretrukket at annealingstemperaturen justeres til å bli lavere enn de som er angitt over.

Foreliggende framgangsmåte kan kombineres med mange andre framgangsmåter kjent innen fagfeltet for å oppnå et spesifikt mål. For eksempel, isolering (eller rensing) av syntetisert produkt kan følge ekstensjonsreaksjonen. Dette kan utføres med gel elektroforese, kolonnekromatografi, affinitets-kromatografi eller hybridisering. I tillegg, det syntetiserte produkt ifølge oppfinnelsen kan innsettes i en egnet vehikkel for kloning. Videre, det syntetiserte produkt beskrevet heri kan uttrykkes i en egnet vert-omsluttende ekspresjonsvektor.

II. Anvendelse for mangfoldiggjøring av målnukleinsyresekvens

I et ytterligere aspekt beskrives en framgangsmåte for selektiv mangfoldiggjøring av en målnukleinsyresekvens fra et DNA eller en blanding av nukleinsyrer, som omfatter å mangfoldiggjøre målnukleinsyresekvensen ved å utføre minst to sykluser av primer annealing, primer forlenging, og denaturering, ved anvendelse av et par av dobbeltspesifisitets oligonukleotider som en primer; hvor dobbeltspesifisitets oligonukleotidene har tre porsjoner hvor en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på målnukleinsyren for å hybridisere dermed, en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser og en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på målnukleinsyren for å hybridisere dermed, Tm av 5'-høy spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner; separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparende boblestruktur under betingelser hvor 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til målnukleinsyren; hvor annealing i mangfoldiggjøringsreaksjonen utføres under betingelser hvor kun annealing av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon ikke forekommer.

Siden mangfoldiggj ørmgsframgangsmåten benytter DS oligo som beskrevet heri, så vil felles beskrivelser av disse utelates for å unngå kompleksitet av beskrivelsen, noe som fører til unødige gjentakelser. I tillegg, siden denne framgangsmåte involverer annealings- og ekstensjonsprosesser, utelates beskrivelser av de to prosesser for å unngå kompleksitet av denne beskrivelse og unødige gjentakelser. For eksempel, sammensetningen og strukturen av DS oligoen som anvendes og betingelsene for annealing og ekstensjon er felles for denne prosess og framgangsmåten for å syntetisere nukleinsyremolekyl til det som er beskrevet.

Denne applikasjon som anvender DS oligo som beskrevet heri kan tilveiebringe en forbedret framgangsmåte for selektivt å mangfoldiggjøre en målnukleinsyresekvens fra en nukleinsyre eller en blanding av nukleinsyrer (DNA eller mRNA) ved å utføre nukleinsyremangfoldiggj øringer, fortrinnsvis PCR (polymerase kjedereaksjon).

En skjematisk representasjon for selektiv mangfoldiggjøring av målnukleinsyrer av dobbelttrådet DNA ved anvendelse av DS oligo som beskrevet over er illustrert i fig. 2. Som vist i fig. 2, et par av DS oligoer anneales til en denaturert dobbelttrådet DNA templat. 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon under annealingen spiller en funksjon som en hybridiseringsporsjon eller som et spesifisitetsbestemmende sete ( det vil si dobbel spesifisitetsbestemmende sete), mens separasjonsporsjonen ikke fungerer som et hybridiseringssete og interagerer ikke med templatet for baseparing. Ved dette tidspunkt danner separasjonsporsjonen en boblestruktur i DS oligo, for at to endeporsjoner, det vil si 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon rommelig kan spesifiseres for dobbelt å bestemme den totale spesifisitet til DS oligo. Detaljer av påfølgende reaksjoner er lik for konvensjonelle primerbaserte nukleinsyre mangfoldiggj øringer kjent innen fagfeltet beskrevet ovenfor.

Foreliggende framgangsmåte for å mangfoldiggjøre en nukleinsyresekvens kan utføres i samsvar med forskjellige primerbaserte nukleinsyremangfoldiggj øringer kjent innen fagfeltet. Fortrinnsvis, framgangsmåten utføres i samsvar med PCR-prosesser beskrevet i US 4,683,195, 4,683,202 og 4,800,159, mer fortrinnsvis, "hot start" PCR-metode.

Fig. 3 illustrerer en skjematisk representasjon for selektivt å mangfoldiggjøre en målnukleinsyre av mRNA ved anvendelse av DS oligo. I det første trinn blir mRNA oppnådd fra forskjellige biologiske prøver revers transkribert ved anvendelse av oligo dT primer hybridiserbare til poly A hale av mRNA og revers transkriptase. Detaljer for revers transkripsjon finnes i Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); and Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)). Beskrivelsen av påfølgende reaksjoner er lik til den for konvensjonelle primerbaserte nukleinsyremangfoldiggj øringer kjent innen fagfeltet, og beskrevet tidligere.

III. Anvendelse ved multipleks DNA mangfoldiggjøring

I et ytterligere aspekt beskrives en framgangsmåte for mangfoldiggjøring av to eller flere målnukleotidsekvenser samtidig ved anvendelse av to eller flere par av primere i den samme reaksjon, som omfatter mangfoldiggjøring av målnukleotidsekvensene ved å utføre minst to sykluser av primer annealing, primerforlenging og denaturering, ved anvendelse av to eller flere par av dobbelt spesifisitets oligonukleotider som en primer,karakterisert vedat dobbeltspesifisitets oligonukleotidene har tre porsjoner hvor en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på målnukleotidsekvensen for å hybridisere dertil, en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser og en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på målnukleotidsekvensen for å hybridisere dertil, Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner; separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparende boblestruktur under betingelser hvor 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til målnukleotidsekvensen; hvor annealing i mangfoldiggjøringsreaksjonen utføres under betingelser der annealing kun av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon ikke forekommer.

Denne applikasjon som anvender DS oligoensom beskrevet heri kan også tilveiebringe en forbedret framgangsmåte for mangfoldiggjøring av mer enn én målsekvens ved anvendelse av mer enn et par av primere i samme reaksjon. Generelt er det ekstremt vanskelig å sette opp multipleks PCR betingelser for å mangfoldiggjøre mer enn 10 målsekvenser parallelt, på grunn av at en optimal PCR reaksjon er nødvendig for å mangfoldiggjøre selv et spesifikt locus uten noen ikke-spesifikke biprodukter. Siden annealing må foregå ved en tilstrekkelig høy temperatur til å muliggjøre perfekt DNA-DNA matching for å forekomme i reaksjonen, er DS oligoen ifølge foreliggende oppfinnelse ideell for optimalisering av multipleks DNA mangfoldiggjøring på grunn av dets funksjon i forbedring av spesifisiteten av mangfoldiggj øringen. "Multipleks PCR" som anvendt heri refererer til samtidig mangfoldiggjøring av multipleks DNA mål i én enkelt polymerase kjedereaksjon (PCR) blanding.

I en spesifikk utførelse omfatter denne multipleksing prosess å utføre en mangfoldiggj øringsreaksjon omfattende minst to sykluser av primer annealing, primer forlenging og denaturering, ved anvendelse av primerpar av DS oligoen, kjennetegnet ved at primerne er av dobbel spesifisitet oligonukleotid som har tre porsjoner hvor en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på målnukleotidsekvensen for å hybridisere dertil, en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser og en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på målnukleotidsekvensen for å hybridisere dertil, Tm av 5-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner; separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparende boblestruktur under betingelser hvor 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til målnukleotidsekvensen; hvor annealing i mangfoldiggjørings-reaksjonen utføres under betingelser der kun annealing ved 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon ikke forekommer.

Siden denne applikasjon som anvender DS oligoen som beskrevet heri utføres i samsvar med foreliggende framgangsmåter for mangfoldiggjøring av nukleinsyresekvenser tidligere beskrevet, med unntak av anvendelse av mer enn én målnukleotidsekvens og primerpar, så vil felles beskrivelse mellom disse utelates for å unngå kompleksitet av spesifikasjonen, noe som fører til unødvendig gjentakelse. For eksempel, sammensetningen og strukturen av DS oligoen anvendt og betingelsene for mangfoldiggjøring er felles mellom denne framgangsmåte og foreliggende framgangsmåte for amplifisering av nukleinsyresekvens tidligere beskrevet.

I samsvar med en foretrukket utførelse, annealingstemperaturen er i området fra ca. 40°C til 70°C, mer fortrinnsvis 45°C til 68°C, enda mer foretrukket 50°C til 65°C, og mest foretrukket 55°C til 65°C.

I en foretrukket utførelse er mangfoldiggj øringsproduktene fra hver av målnukleotidsekvensene forskjellige i størrelse for påfølgende analyse. I samsvar med en foretrukket utførelse, mangfoldiggj øringsproduktene av multipleks mål nukleotidsekvenser kan analyseres ved størrelsesseparasjon. Størrelsesseparasjonssammenlikning utføres ved anvendelse av en rekke framgangsmåter kjent innen fagfeltet, så som elektroforese gjennom en polyakrylamid gel matriks eller agarose gel matriks og nukleotidsekvensering. Nukleotidsekvenseringen kan hurtig utføres med en automatisk sekvenserer tilgjengelig fra forskjellige leverandører.

Som eksemplifisert i eksempelet nedenfor, multipleksering av denne oppfinnelse muliggjør at de finale mangfoldiggjorte produkter kan være fri for bakgrunnsproblemer og likeledes ikke-spesifisitet som oppstår fra konvensjonelle multipleksprosesser kjent innen fagfeltet.

Fordelen med multipleks mangfoldiggjøring er at et antall sykdommer eller spesifikke nukleotid-sekvensforandringer (for eksempel enkel nukleotidpolymorfisme eller punktmutasjon) kan analyseres i samme reaksjon. Antallet analyser som kjøres samtidig er ubegrenset; imidlertid er øvre grense sannsynligvis ca. 20 og er sannsynligvis avhengig av størrelsesforskj ellen som er nødvendig for oppløsning og framgangsmåter som er tilgjengelig for å oppløse de mangfoldiggjorte produktene.

Framgangsmåten som beskrevet kan appliseres for diagnose av genetiske og infeksiøse sykdommer, kjønnskoblingsanalyse og rettsvitenskapelige studier.

IV. Anvendelse for DNA sekvensering

Den forbedrete spesifisitet muliggjør at DS oligo kan anvendes i direkte sekvensering som en primer av løsningsfase sekvensering (spesielt syklisk sekvensering) eller som en probe av faststoff-fase-sekvensering (spesielt oligonukleotid chip sekvensering) ved anvendelse av prinsippet med templatavhengig ekstensjon av DS oligo.

I et ytterligere aspekt beskrives en framgangsmåte for å sekvensere et målnukleinsyremolekyl ved anvendelse av dobbel spesifisitet oligonukleotid fra et DNA eller en blanding av nukleinsyrer, som omfatter trinnene: (a) syntetisere et komplementært nukleinsyremolekyl til målnukleinsyremolekylet som skal sekvenseres ved å utføre minst to sykluser av primer annealing, primer forlenging og denaturering, ved anvendelse av dobbel spesifisitets oligonukleotidet som en sekvenseringsprimer; hvor dobbelt spesifisitets oligonukleotidet har tre porsjoner hvor en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på målnukleinsyremolekylet det skal hybridisere til, en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser og en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på målnukleinsyremolekylet for å hybridisere dertil, Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav T spesifisitetsporsjon, separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner; separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparende boblestruktur under betingelser der 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til målnukleinsyremolekylet; hvor annealing i syntesereaksjonen utføres under betingelser der annealing kun ved 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon ikke forekommer; og

(b) bestemme en nukleotidsekvens av det syntetiserte komplementære nukleinsyremolekyl.

Generelt, DNA-sekvensering har blitt utført med forskjellige metoder så som Maxam-Gilbert sekvensering, Sanger sekvensering, pyrosekvensering og exonuclease oppkuttingsekvensering. Foreliggende sekvenseringsmetode søker å forbedre pyrosekvensering og likeledes termisk syklisk sekvensering.

Foreliggende framgangsmåte kan utføres i samsvar med variasjoner av Sanger dideoksymetoden. Termal syklisk sekvensering ifølge oppfinnelsen kan utføres på PCR mangfoldiggjorte nukleinsyretemplater. I tillegg, termal syklisk sekvensering vil kunne utføres på et nukleinsyretemplat som ikke har blitt PCR mangfoldiggjort like før sekvensering.

Kort forklart, Sanger-sekvensering er basert på prinsippet at DNA polymerase vil inkorporere 2',3'-dideoksynukleotider inn i nukleinsyrekjeder resulterende i kjedeterminering (Sanger et al., (1977) PNAS. USA 74:5463). Framgangsmåten som ble utviklet av Sanger refereres til som dideoksy kjedetermineringsmetode. I det mest tradisjonelle av denne metode blir et DNA-segment for hvilken sekvensen er ønsket, klonet inn i en enkelttrådet DNA-fag, så som M13. Disse fag DNAer kan fungere som templater for den primete syntese av den komplementære tråd med Klenow-fragment av DNA polymerase I. Primeren er et syntetisk oligonukleotid som hybridiseres spesifikt med en region av M13-vektoren nær 3'-enden av kloninnskuddet. I hver av de fire sekvenseringsreaksjoner utføres den primete syntese i nærvær av tilstrekkelig dideoksy analog av én av de fire mulige deoksy - nukleotider, slik at de voksende kjeder vilkårlig termineres ved inkorporering av disse avslutnings-nukleotider. Den relative konsentrasjon av dideoksy til deoksyformer justeres for å gi spredning av termineringshendelser korresponderende til alle mulige kjedelengder som kan resolveres med gel elektroforese. Markører inkorporert i de voksende kjeder anvendes for å utvikle et autoradiogrambilde av mønsteret av DNAen i hvert elektroforesespor. Sekvensen av deoksynukleotidene i det klonede nukleinsyretemplat bestemmes ut fra undersøkelser av mønsteret av bånd i de fire spor.

Som en variasjon av Sanger-metoden, involverer termal syklus sekvenseringsmetoden anvendelse av løsninger inneholdende en nukleinsyre sekvenseringsprimer, deoksynukleosid trifosfater, én eller flere dideoksynukleosid trifosfater (ddNTPer), en egnet bufferløsning, en termisk stabil DNA polymerase

(for eksempel Taq polymerase), og nukleinsyretemplatet som skal sekvenseres. Detaljene i den termiske sykliske sekvensering kan finnes i US patenter nr. 5,432,065, 5,723,298, 5,756,285, 5,817,797 og 5,831,065. Framgangsmåtene i metoden utføres generelt under termisk syklerings-betingelser tilsvarende til vanlig PCR.

Straks en sekvenseringsreaksjon har blitt utført på et nukleinsyretemplat, krever bestemmelsen av sekvensene av molekylet at reaksjonsproduktene identifiseres. Et betydelig antall deteksjonsmetoder er kjent innen fagfeltet. Disse metoder involverer generelt deteksjon av markører inkluderende radionukleotid, fluorescent, infrarød og kjemiluminiscente markører som beskrevet i Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1993) John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y. Markørene kan være merket med primere eller ddNTP, fortrinnsvis ddNTP. Den mest foretrukne markør er en fluoroscent som inkluderer 6-karboksyfluorescein, 6-karboxyksy-X-rodamin, 3-(e-karboksypentyl)-3 '-etyl-5,5 '-dimetyloksykarbocyanin, 6-karboksy-X-rodamin, 4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionisk syrederivater, og 4,7-diklororhodamin farger.

Fortrinnsvis er annealingstemperaturene i området fra ca. 40°C til 70°C, mer foretrukket 45°C til 68°C, og mest foretrukket 50°C til 65°C.

Foreliggende framgangsmåte tilveiebringer en høy spesifikk sekvensering av et målnukleinsyremolekyl som demonstrert i eksemplene nedenfor. Nærmere bestemt, mus placenta-spesifikke homeoboks familiegener, Psxl og Psx2 kan differensielt sekvenseres ved anvendelse av deres sekvenseringsprimer konstruert til å ha en unik struktur av DS oligoen. Slik differensiert sekvensering er uvurderlig idet de totale sekvenser av sekvenseringsprimerne er forskjellige i kun én base i 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon.

Overraskende, foreliggende fremgangsmåte muliggjør at et målnukleinsyremolekyl inneholdt i et genomisk DNA eller en populasjon av cDNAer direkte kan sekvenseres uten rensing eller isolering. En slik suksess med direkte sekvensering av et mål nukleinsyremolekyl i et genomisk DNA eller en populasjon av cDNAer har til nå ikke vært rapportert. Idet foreliggende sekvenseringsframgangsmåte benyttes for direkte å sekvensere et målnukleinsyremolekyl inneholdt i en populasjon av cDNAer fra en total RNA, omfatter denne framgangsmåte trinnene: (a) sette en populasjon av mRNAer i kontakt med en oligonukleotid dT primer som hybridiseres til poly A hale av mRNAene under betingelser tilstrekkelig for templatdrevet enzymatisk deoksyribonukleinsyresyntese kan foregå; (b) revers transkribere mRNAene hvortil oligonukleotid dT primerne hybridiserer for å produsere en populasjon av en første cDNA tråder som er komplementære til mRNAene hvortil oligonukleotid dT primerne hybridiseres; (c) syntetisere et komplementært nukleinsyremolekyl til den første cDNA tråd som skal sekvenseres ved å utføre minst to sykluser av primer annealing, primer forlenging og denaturering, ved anvendelse av dobbel spesifisitets oligonukleotid som en sekvenseringsprimer; hvor dobbelt spesifisitets oligonukleotidet har tre porsjoner hvor en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på den første cDNA tråd for å hybridisere dermed, en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser og en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til setet på den første cDNA tråd for å hybridisere dertil, Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner; separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparende boblestruktur under betingelser hvor 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til den første cDNA tråd; hvor annealing i syntesereaksjonen utføres under betingelser der annealing kun ikke foregår ved 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon; og

(b) bestemme en nukleotidsekvens av den syntetiserte første cDNA tråd.

V. Anvendelse for deteksjon av nukleinsyremolekyl med genetisk diversitet

I et ytterligere aspekt beskrives en framgangsmåte for å detektere et nukleinsyremolekyl med genetisk diversitet med en templatavhengig ekstensjonsreaksjon av et dobbelt spesifisitets oligonukleotid, som omfatter trinnene;

(a) annealing av dobbelt spesifisitets oligonukleotider til et templat nukleinsyremolekyl, hvor dobbelt spesifisitets oligonukleotidet har tre porsjoner hvor en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på templat nukleinsyren for å hybridisere dertil, en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser og en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på templat nukleinsyren for å hybridisere dertil, Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner; separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparende boblestruktur under betingelser hvor 5'-høy Tmm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til templat nukleinsyren, hvor annealing utføres under betingelser der annealing kun ikke foregår ved 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon og annealing foregår idet 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og/eller 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon har én eller flere mismatchede baser til dets målsete; og (b) forlenge dobbelt spesifisitets oligonukleotider for å syntetisere nukleinsyremolekylet som er komplementært til templatet, (c) detektere forekomst av templatavhengig ekstensjon av dobbelt spesifisitets oligonukleotidet.

Siden denne applikasjon ved anvendelse av DS oligo som beskrevet heri utføres i samsvar med foreliggende framgangsmåte for å syntetisere nukleinsyresekvens tidligere beskrevet, blir felles beskrivelser disse imellom utelatt for å unngå kompleksitet av beskrivelsen, noe som fører til unødvendig gjentakelse.

Denne applikasjon ved anvendelse av DS oligo som beskrevet heri kan tilveiebringe en forbedret framgangsmåte for selektivt å detektere en nukleinsyresekvens med genetisk diversitet av en templatavhengig ekstensjonsreaksjon som involverer annealing og forlengelsestrinn. Nærmere bestemt, deteksjon av en målnukleinsyresekvens med genetisk diversitet kan oppnås ved å repetere prosessen av templatavhengig ekstensjonsreaksjon hvor annealing og ekstensjonstrinnene etterfølges av denatureirngstrinn.

Foreliggende fremgangsmåte er basert på mismatch toleranse av DS oligo.

Genetisk diversitet har blitt rapportert for forskjellige genomer. Dette fenomen har blitt vurdert som et hinder for å detektere et gen eller genom av interesse uten feil. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en løsning for å overvinne slike konvensjonelle problemer ved anvendelse av DS oligo med mismatch toleranse. DS oligo med en definert sekvens kan anneales til flere målsekvenser som viser genetisk diversitet og resultere i suksessfull mangfoldiggjøring og deteksjon av nukleotidsekvenser av interesse. Med andre ord, DS oligo som opprinnelig ble utviklet for dramatisk å forbedre spesifisitet av annealing og hybridisering, kan også anvendes i prosesser som krever mismatch toleranse hvor annealing eller stringente betingelser hensiktsmessig justeres.

For å tilveiebringe DS oligo som viser mismatch toleranse, bør disse konstrueres på basis av en konserveirngsregion av nukleinsyremolekyler generert ved aligning av alle tilgjengelige nukleotidsekvenser. Termen "konservert region" som anvendt heri, refererer til et segment av nukleotidsekvens av et gen eller aminosyresekvens av et protein som er signifikant lik mellom forskjellige nukleotidsekvenser av et gen. Termen anvendes om hverandre med termen "konservert sekvens".

I en foretrukket utførelse, den mest konserverte sekvens innen den konserverte region er lokalisert i 3'-endeporsjon av DS oligo og den lavest konserverte sekvens i separasjonsporsjonen. 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og/eller 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, fortrinnsvis 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon kan inneholde én eller flere, eller fortrinnsvis én til tre, mer fortrinnsvis én eller to mismatchede baser til dets målsete på grunn av mismatch toleranse av DS oligo.

For å påtvinge mismatch toleranse på DS oligo, er annealingsbetingelser, spesielt annealingstemperatur, viktig. Annealing utføres under betingelser hvor annealing kun ikke foregår ved 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, men der annealing ved alle porsjoner foregår idet 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og/eller 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon har én eller flere mismatchete baser til dets målsete.

Fortrinnsvis, annealingstemperaturen er i området fra ca. 40°C til 70°C, mer foretrukket 45°C til 68°C, og mest foretrukket 50°C til 65°C.

I samsvar med en foretrukket utførelse, foreliggende fremgangsmåte utføres i samsvar med polymerase kjedereaksjon (PCR).

Deteksjonstrinnet i foreliggende oppfinnelse kan utføres med en rekke konvensjonelle teknikker. For eksempel, deteksjon av produktet av templatavhengig ekstensjon kan enkelt utføres ved konvensjonell gel elektroforese dersom foreliggende framgangsmåte utføres på en repetert måte for å generere produkter som er tilstrekkelige til å kunne detekteres i en gel. Dersom merkete materialer benyttes, inkluderende de som er detekterbare med spektroskopiske målinger, fotokjemiske målinger, biokjemiske målinger, bioelektroniske målinger, immunokjemiske målinger, elektroniske målinger og kjemiske målinger, kan en egnet måling utføres for deteksjon av forekomst av templatavhengig ekstensjon.

Genetisk diversitet finnes mest hyppig i, og er generert i viral genom (Nathalie B. et al., (2004) Journal of ClinicalMicrobiology, 42, 3532; Tersa C. et al., (2002) Journal oflnfectious Diseases, 185, 1660; Takashi E. et al., (2004) Journal of Clinical Microbiology, 42, 126; and Elizabeth R. et al.,

(2001) Clinical Infectious Diseases, 32, 1227). I denne forbindelse er det foretrukket at nukleinsyremolekylet med genetisk diversitet som detekteres er en nukleinsyre av et virus som oppviser genetisk diversitet. For eksempel, idet foreliggende oppfinnelse appliseres for å detektere humane metapneumovirus som oppviser genetisk diversitet med PCR, er det mest foretrukne primersett konstruert til å ha strukturen til DS oligo angitt i SEQ ID NO 39 (for 5' primer) og 40 (for 3' primer) eller SEQ ID NO 39 og 41 (for 3' primer).

VI. Anvendelse for deteksjon av målnukleotidsekvens ved anvendelse av DS oligo immobilisert på microarrav

Denne applikasjon er en ny fremgangsmåte for å detektere målnukleotidsekvens ved repeterende templatavhengig reaksjon på DS oligo immobilisert microarray.

I et ytterligere aspekt tilveiebringes en framgangsmåte for å detektere en målnukleotidsekvens i en nukleinsyreprøve med templatavhengig ekstensjonsreaksjon, omfattende trinnene: (a) Forlenge en dobbelt spesifisitets oligonukleotid som en probe immobilisert på et substrat omfattende minst én syklus av en hybridisering, en templatavhengig ekstensjon og en denaturering, hvor hybridiseringen utføres ved å sette dobbelt spesifisitets oligonukleotidet i kontakt med nukleinsyreprøven, hvor dobbelt spesifisitets oligonukleotidet har tre porsjoner hvor en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på målnukleotidsekvensen for å hybridisere dermed, en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser og en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på målnukleotidsekvensen for å hybridisere dermed, hvor Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, hvor separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner; hvor separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparende boblestruktur under betingelser hvor 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til målnukleotidsekvensen, hvor hybridiseringen utføres under betingelser der hybridisering kun ikke foregår med 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon; og (b) analyserer forekomst av templatavhengig ekstensjon.

En skjematisk representasjon for å detektere en målnukleotidsekvens i en nukleinsyreprøve ved anvendelse av DS oligo immobilisert microarray er illustrert i fig. 4.

Denne framgangsmåte ved anvendelse av DS oligoer kan utføres under egnete hybridiseringsbetingelser som rutinemessig bestemmes ved optimaliseringsprosedyrer. Betingelser så som

temperatur, konsentrasjon av komponenter, hybridisering og vasketider, bufferkomponenter og deres pH og ionestyrke kan varieres avhengig av forskjellige faktorer, inkluderende lengden og GC innhold av oligonukleotid og målnukleotidsekvens. For eksempel, idet et relativt kort oligonukleotid anvendes er det foretrukket at lavstringent betingelser adopteres. De detaljerte betingelser for hybridisering kan finnes i Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); and M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999).

DS oligoer immobiliseres på et substrat. Et foretrukket substrat inkluderer egnete faststoff eller semifaststoff støttemedium, så som membran, filter, chip, preparatglass, oblat, fiber, magnetiske eller ikke-magnetiske kuler, gel, ledninger, plater, makromolekyl, mikropartikkel eller kapillær rørledning. Slik immobilisering kan foregå gjennom kjemisk binding eller kovalent binding med ultrafiolett bestråling. I én utførelse av oppfinnelsen bindes DS oligoer til en glassoverflate modifisert til å inneholde epoksyforbindelser eller aldehydgrupper eller til en polylysinbelagt overflate. Videre, DS oligoer bindes til et substrat gjennom linkere (for eksempel etylenglykololigomer og diamin). Immobiliserte DS oligoer kan framstilles for å produsere array for en gitt applikasjon ved konvensjonelle framstillingsteknologier, så som fotolitografi, ink-jetting, mekanisk mikrospotting og alternativer derav.

I samsvar med foreliggende framgangsmåte, dNTPer anvendt i ekstensjonstrinnet er fortrinnsvis merket. For merking kan materialer som detekteres av spektroskopiske målinger, fotokjemiske målinger, biokjemiske målinger, bioelektroniske målinger, immunkjemikalske målinger, elektroniske målinger, eller kjemiske målinger benyttes. For eksempel, markørene inkluderer, men er ikke begrenset til, radioisotoper så somP32og S35, kj<e>miluminiserende forbindelser, spektroskopiske markører så som fluorescence markører og fargestoff, og magnetiske markører. Fargestoffene, for eksempel inkluderer, men er ikke begrenset til, quinolin farge, triarylmetanfarge, ftalein, azo farge og cyanin farge. Fluorescence markørene inkluderer, men er ikke begrenset til, fluorescein, fykoerytrin, rodamin, lissamin, Cy3 og Cy5 (Pharmacia). Merking utføres i samsvar med forskjellige framgangsmåter kjent innen fagfeltet.

Målnukleotidsekvensene i en nukleinsyreprøve hybridiseres med DS oligoer som prober immobilisert i et substrat, fortrinnsvis et faststoff substrat, og deretter forlenges DS oligoene som er hybridisert med målnukleotidsekvenser ved anvendelse av dNTPer, fortrinnsvis fluorescence merkete dNTPer og DNA polymerase på en templatavhengig måte. Trinnene (a) repeteres fortrinnsvis for å utføre hybridiseringsreaksjoner i den grad at alle eller de fleste av DS oligoene er hybridisert med målnukleotidsekvensene, noe som gjør resultatet av hybridiseringsanalysen mer reproduserbar.

Forekomst av hybridisering verifiseres med forskjellige framgangsmåter kjent innen fagfeltet avhengig av type markører som anvendes. For eksempel, fluorescence mikroskopi, fortrinnsvis konfokal fluorescence mikroskopi anvendes for fluorescence markører, og intensiteten av signalet som detekteres med slike instrumenter øker proporsjonalt med graden av hybridisering. Fluorescence mikroskoper, generelt, er utstyrt med en scanningsanordning som bygger opp et kvantitativt todimensjonalt bilde av hybridiseringsintensitet. Intensiteten av signalet som er detektert med slike instrumenter øker proporsjonalt i forhold til graden av hybridisering og også graden av en

templatavhengig ekstensjon.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet i ytterligere detalj ved hjelp av eksempler. Disse eksempler er illustrerende, og rammen av foreliggende oppfinnelse er angitt i de medfølgende krav.

Eksempel 1: PCR-spesifisitet ved anvendelse av dobbel spesifisitet (DS) oligonukleotider

DS oligonukleotidene utviklet med foreliggende oppfinnelse ble applisert som primere for å mangfoldiggjøre målnukleotidsekvenser av cytokin familiegenene IL-19 og IL-lbeta fra mus. Framgangsmåten og resultatene for mangfoldiggj øringen av målnukleotidsekvensene av IL-19 og IL-lbeta ved anvendelse av DS primere er beskrevet heri.

De følgende konvensjonelle primersekvenser ble valgt og anvendt for sammenlikning med DS oligonukleotider i lys av PCR spesifisitet:

IL-19-spesifikke konvensjonelle primere anvendt i eksemplene (500 bp) er:

og IL-lbeta spesifikke konvensjonelle primere anvendt i eksemplet (550 bp) er:

og

DS oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse ble applisert til disse konvensjonelle primersekvenser for å demonstrere om DS oligonukleotidet kan overvinne hovedproblemene som kan oppstå av disse konvensjonelle primersekvenser, så som generering av bakgrunn og ikke-spesifikke produkter.

De følgende DS primere omfatter sekvenser som er identiske til de ovennevnte konvensjonelle

primere med unntak av at separeringsporsjonen har en polydeoksyinosin [poly(dl)] linker mellom 5' porsjonen og 3' porsjonen. DS primerne er konstruert til å omfatte en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon på en måte slik at Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, mens separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner.

DS primerne for IL-19 anvendt i eksemplet (500 bp) er:

og

hvor I er deoksyinosin.

DS primerne for IL-lbeta anvendt i eksemplet (500 bp) er: og

hvor I er deoksyinosin.

Mål PCR mangfoldiggj øringen ble utført i et finalt volum av 20 ul inneholdende 2 ul (50 ng) av genomisk DNA isolert fra placentavev av musestamme ICR, 2 ul av 10 x PCR reaksjonsbuffer inneholdende 15 mM MgCl2(Roche), 2 ^ dNTP (2 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP), 1 jd av 5' DS eller konvensjonell primer (10^M), 1 (xl av 3' DS eller konvensjonell primer (10 \ iM), og 0,5 \ il av Taq polymerase (5 enheter/^; Roche); hvor reagensrøret som inneholder reaksjonsblandingen ble presentert i en forvarmet (94°C) termisk syklerer; prøvene ble denaturert i 5 min. ved 94°C, og underlagt 30 sykluser av 1 min. ved 94°C, 1 min. ved 60°C, og 1 min. ved 72°C, etterfulgt av en 7 minutters inkubering ved 72°C.

Mangfoldiggj øringsproduktene ble analysert ved elektroforese i en 2% agarosegel, og ble detektert med farging med etidiumbromid. De resulterende PCR-produkter kunne også detekteres på en denaturerende polyakrylamid gel med autoradiografi eller ikke-radioaktive deteksjonsmetoder, så som sølvfarging (Gottschlich et al., (1997) Res. Commun. Mol. Path. Pharm. 97, 237-240; Kociok, N., et al. (1998) Mol. Biotechnol. 9, 25-33), eller ved anvendelse av fluorescent merkede oligonukleotider (Bauer D., et al., (1993) Nucleic Acids Res. 21, 4272-4280; Ito, T. et al., (1994) FEBSLett. 351, 231-236. Luehrsen, K.R. et al., (1997) BioTechniques 22, 168-174; Smith, N.R. et al., (1997) BioTechniques 23, 274-279), og anvendelse av biotinylerte primere (Korn, B. et al., (1992) Hum. Mol. Genet. 1, 235-242; Tagle, D.A. et al., (1993) Nature 361. 751-753; Rosok, O. et al., (1996) BioTechniques 21, 114-121).

Som vist i fig. 5, mål PCR mangfoldiggjøringene for cytokin familiegenene IL-lb og IL-19 ved anvendelse av hvert primersett av ILlb-5' og ILlb-3', og IL19-5' og IL19-3' genererte et enkelt bånd som korresponderer til den forventede størrelse av 550-bp for IL-lbeta (spor 2) og den forventede størrelse på 500-bp for IL-19 (spor 4) respektivt. Påfølgende kloning og sekvensanalyse av klonene bekreftet at båndene er IL-lbeta og IL-19 fragmenter. I motsetning, det konvensjonelle primersett (IL19-5'-0 og IL19-3'-0; ILlb-5'-0 og ILlb-3'-0), som ikke inneholder [poly(dl)], produserte ikke-spesifikke produkter (fig. 5, spor 1 og 3). Disse resultater indikerer at DS primerne som er konstruert til å ha tre forskjellige Tm porsjoner (5'-høy Tm spesifisitetsporsjon, 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon og separeringsporsjon) kan overvinne hovedproblemene som oppstår fra konvensjonelle primersekvenser så som bakgrunn og ikke-spesifikke produkter og forbedre PCR spesifisiteten betydelig.

EKSEMPEL 2: Evaluering av PCR-spesifisitet ved anvendelse av dobbel spesifisitet (DS) oligonukleotider

Dobbelt spesifisitets oligonukleotidene erkarakterisertmed høy hybridiseringsspesifisitet og mismatch toleranse som er opphav i deres unike struktur, avhengig av hybridiseringsstringens. Høy hybridiseringsspesifisitet av DS oligonukleotidene oppnås under høye stringensbetingelser der både 5'- og 3'-porsjonene anneales til templatet. Mismatch toleranse av DS oligonukleotidene oppnås under stringentbetingelser der både 5'- og 3'-porsjonene anneales til templatet til tross for nærvær av én eller flere, allikevel et begrenset antall, basepar mismatcher.

Dobbeltspesifisiteten av DS oligonukleotider utviklet i samsvar med foreliggende oppfinnelse ble evaluert i termer av hybridiseringsspesifisitet og mismatch toleranse av 3'-RACE av et nytt gen, DEG10, som ble identifisert til å være uttrykt i museplacenta (Kim, Y.J. et al., (2004) Annealing control primer system for identification of differentially expressed genes on agarose gels. BioTechniques 36:424-434; XM 129567). For denne evaluering ble noen få nukleotider i begge porsjoner erstattet med andre nukleotider for å bli mismatchet til måltemplatsekvensen.

5'-DEG10-spesifikke DS-primere anvendt i eksemplet er:

og

hvor de erstattede nukleotider er understreket og uthevet og I er deoksyinosin.

A. Forbedring i PCR spesifisitet under høv stringens

Totale RNAer fra 17.5-dpc (E17.5) placentavev og musestamme ICR ble isolert og anvendt for syntese av første tråd cDNAer ved revers transkriptase, som beskrevet tidligere (Hwang, I.T., et al.,

(2003) Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplification. BioTechniques 35:1180-1184). Revers transkripsjonsreaksjon ble utført ved anvendelse av totale

RNAer i 1,5 t ved 42°C i et reaksjonsvolum på 20 ul sammensatt av følgende: 3 \ ng av total RNA, 4 \ A 5 x reaksjonsbuffer (Promega, USA), 5fol av dNTPer (jver 2 mM), 2 \ il 10 \ iM cDNA synteseprimer (oligo (dT)20-Adaptor), 0,5 RNase inhibitor (40 enheter/^, Promega), og 1 |xl revers transkriptase (200 enheter/ul, Promega). Første tråd cDNAer ble fortynnet ved tilsetting av 180 \ il ultrarenset H20. cDNA syntese primer oligo (dT)18-ACPl er: 5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIII(T)18-3', hvor I er deoksyinosin.

3'-RACE av DEG10 ble utført i et finalt volum av 20 ul inneholdende 2 ul (30 ng) av fortynnet første tråd cDNA, 2^10 x PCR reaksjonsbuffer inneholdende 15 mM MgCl2(Roche), 2^1 dNTP (2 mM av hver av dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 jil av hver av DEGlO-spesifikke DS primere (10 pM), 1 jil oligo (dT)i5-ACP2 (10^M), og 0,5 \ il Taq polymerase (5 enheter/jJ; Roche); reagensglassene som inneholder reaksjonsblanding ble plassert i et forvarmet (94°C) termisk syklerer; prøvene ble denaturert i 5 min. ved 94°C, og underlagt 30 sykluser av 1 min. ved 94°C, 1 min. ved 68°C og 1 min. ved 72°C, etterfulgt av en 7 minutters inkubering ved 72°C. Oligo (dT)15-ACP2 er: 5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIII(T)15-3', hvor I er deoksyinosin.

B. Mismatch toleranse av DS oligonukleotider

Prøven DS primere, templat og PCR betingelser for 3'-RACE av DEG10 anvendt i eksempel 2A ble benyttet med unntak av annealingstemperaturen. PCR mangfoldiggj øringer ble utført under følgende betingelser: en syklus på 94°C i 5 min., 60°C i 3 min. og 72°C i 3 min.; etterfulgt av 29 sykluser av 94°C i 40 s, 65°C i 1 min., og 72°C i 40 s, og en 7 minutters final ekstensjonssyklus ved 72°C.

Som et resultat viser fig. 6A høy hybridiseringsspesifisitet av DS oligonukleotid primere med 3'-RACE av DEG10. Den intakte 5'-DEG10-spesifikke DS primer (DEG10-5'-108) genererte et forventet 677-bp produkt av DEG10 3'-RACE (spor 1). I motsetning, de andre primere (DEG10-5'-103, DEG10-5'-102, DEG10-5'-101, DEG10-5'-158, DEG10-5'-138 og DEG10-5'-128) med mismatchede sekvenser ved 5' porsjonen eller 3' porsjonen genererte ikke noe produkt: mismatch av tre (spor 2), to (spor 3) eller en (spor 4) baser ved 3' porsjonen; mismatch av fem (spor 5), tre (spor 6) eller to (spor 7) baser ved 5' porsjon.

Disse resultatene viste at dobbeltspesifisiteten av DS primerne kan diskriminere de mismatchede baser ikke kun ved 3'-enden men også ved 5'-enden under slike høye stringentbetingelser.

Generelt, regionen av primerne som bør være perfekt komplementære til templatet er 3'-enden, på grunn av at denne ende er den region som forlenges med DNA polymerase og derfor er mest viktig for å sikre annealing til den korrekte målsekvens. 5'-enden av primerne er mindre viktige i bestem-melser av spesifisiteten av annealingen til målsekvensen og kan modifiseres til å bære ytterligere sekvens så som restriksjonssete og promotorsekvenser som ikke er komplementære til templatet (McPherson, M.J., Moller, S.G. (2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y.). I motsetning til disse, den eksepsjonelle fordel med DS primerne vises av dobbeltspesifisiteten på grunn av deres unike struktur, som muliggjør diskriminering av mismatch baser i 5'-enden og også i 3'-enden.

Fig. 6B viser et eksempel på mismatch toleranse av DS oligonukleotid primere med 3'-RACE av DEG10. Selv om DS primerne (DEG10-5'-108, DEG10-5'-101, DEG10-5'-128, og DEG10-5'-138) har ingen eller noen få mismatch nukleotider ved deres 5' - eller 3'-endeporsjoner framdeles genererte en forventet 677 bp produkt av DEG10 3'-RACE (spor 1, 4, 6 og 7). I motsetning, de andre primere (DEG10-5'-103, DEG10-5'-102, og DEG10-5'-158) med mer mismatch nukleotider ved deres 5'-eller 3'-porsjoner genererte ikke noe produkt (spor 2, 3 og 5). Disse resultater indikerer at DS primerne også kan anvendes i mangfoldiggj øringer av diverse nukleotidsekvenser som krever mismatch toleranse.

I sum støtter disse resultater følgende prinsipper med DS primere:

1) Kun idet annealing foregår ved både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon forlenges DS primer for å syntetisere et nukleinsyremolekyl komplementært til templatet (spor 1); imidlertid, 2) idet annealing foregår kun ved 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og ikke ved 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon forlenges DS primer ikke for å syntetisere et nukleinsyremolekyl komplementært til templatet (spor 2-4); og 3) selv om sekvensen av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon har en perfekt match til templatet, vil annealing kun med 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon ikke forekomme under høye stringente betingelser (spor 5-7). Avhengig av annealingsporsjon er DS primer distinkt forskjellig fra annealingskontroll primer (ACP) som forlenges kun ved annealing av 3'-endeporsjonen i et innledende PCR trinn (Hwang, I.T., et al.,

(2003) Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplification. BioTechniques 35:1180-1184).

EKSEMPEL 3: Enkeltbase diskriminering ved anvendelse av dobbeltspesifisitet (DS) oligonukleotidet

For å demonstrere dobbeltspesifisiteten til DS oligonukleotider på enkeltbase diskriminering, ble placentaspesifikke homeoboks familiegener Psxl og Psx2 cDNAer fra mus mangfoldiggjort med enten konvensjonelle primere eller DS primere. Total sekvensidentitet mellom de to Psx cDNAer var 91% på nukleotidnivå (Han, Y.J., et al., (2000) Identification and characterization of Psx2, a novel member of the Psx (placenta-specific homeobox) family. Gene 241:149-155). 5'-primerne ble konstruert for å skille Psxl og Psx2 med en- eller to-basediskriminering (fig. 7A). Imidlertid, 3'-primeren ble konstruert til å ha en konservert sekvens for begge Psx cDNAer. Psxl- og Psx2-spesifikke konvensjonelle og DS primersekvenser er:

hvor Psxl- eller Psx2-spesifikke nukleotider er understrekt og uthevet.

A. Førstetråd cDNA syntese

Placenta førstetråd cDNA fra mus syntetisert i eksempel 2 ble anvendt som et utgangsmateriale for 3'-RACE og en mål PCR for Psx cDNA.

B.. 3'- RACE av Psxl og Psx2 ved anvendelse av Psxl - og . P, sx2- spesifikke DS primer

3'-RACE av Psxl og Psx2 ble utført i et finalt volum på 20 ul inneholdende 2 ul (30 ng) av fortynnet førstetråd cDNA, 2 ul 10 x PCR reaksjonsbuffer inneholdende 15 mM MgCl2(Roche), 2 ul dNTP (2 mM av hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP), 1^1 av én av 5! - Psxl- eller S^P^-spesifikk DS eller konvensjonelle primere (10 \ iM), 1^1 oligo (dT)15-ACP2 (10^M), og 0,5^1 Taq polymerase (5 enheter/ul; Roche); hvor reagensglasset inneholdende reaksjonsblandingen ble plassert i en forvarmet (94°C) termal sykluser; prøvene ble denaturert i 5 min. ved 94°C og underlagt 30 sykluser av 1 min. ved 94°C, 1 min. ved 60-65°C, og 1 min. ved 72°C, etterfulgt av en 7 minutters inkubering ved 72°C.

C. Målnukleinsvremangfoldiggjøring av Psxl og Psx2 ved anvendelse av Psxl - og . P, sx2- spesifikke DS primere

Mål PCR mangfoldiggjøring av Psxl og Psx2 ble utført i et finalt volum a 20 ul inneholdende 2 ul (30 ng) av fortynnet førstetråd cDNA, 2 ul 10 x PCR reaksjonsbuffer inneholdende 15 mM MgCl2(Roche), 2 ul dNTP (2 mM av hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP), 1^1 av en av 5'- Psxl- eller 5'-.<P>,sx2-spesifikk DS eller konvensjonelle primere (10 (xM), 1^1 Psx-3'-2 (10 \ iM), og 0,5^1 Taq polymerase (5 enheter/ul; Roche); hvor reagensrøret inneholdende reaksjonsblandingen ble plassert i en forvarmet (94°C) termal sykluser; prøvene ble denaturert i 5 min. ved 94°C og underlagt 30 sykluser 1 min. ved 94°C, 1 min. ved 60-65°C og 1 min. ved 72°C, etterfulgt av en 7 minutters inkubering ved 72°C.

Som et resultat, fig. 7B viser produktene av 3'-RACE og mål PCR generert med 5'- Psxl- eller Psx2-sepsifikke primere. Siden de to Psx cDNAer avviker fra hverandre med 29-bp deletering eller inn-skudd mot deres 3'-ende, er produktforskjellene i størrelse med 29-bp forventet å mangfoldiggjøres av deres 3'-RACE. 3'-RACE av Psxl cDNA ved anvendelse av Psxl-eller .P,sx2-spesifikke DS primere Psxl-5'-41 og Psx2-5'-41 genererte hver et enkelt bånd som korresponderer til den forventede stør-relse 311-bp (spor 1) og 282-bp (spor 2), respektivt. Påfølgende sekvensanalyse av produktene generert av 3'-RACE bekreftet at 5'- Psxl- og -P^-spesifikke primere mangfoldiggj orde Psxl og Psx2 cDNAer, respektivt. I motsetning, de konvensjonelle primere (Psxl-5'-40 og Psx2-5'-40), som ikke er i samsvar med prinsippene til DC oligonukleotider, skilte ikke de to Psx cDNAer (spor 3 og 4).

Disse resultater indikerer at DS primere i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan diskriminere en enkelt base mismatch. Derfor, DS oligonukleotider kan mangfoldiggjøres for å identifisere punkt-mutasjoner eller enkel nukleotid polymorfisme genotyping.

EKSEMPEL 4: Direkte sekvensering av en mål cDNA fra cDNA pool ved anvendelse av dobbelt spesifisitet (DS) oligonukleotider

De fleste forsøk for å identifisere og isolere en ny cDNA resulterer i ervervelse av kloner som representerer kun en del av mRNAenes sekvens. Straks den partielle sekvens har blitt identifisert kan det resterende av transkriptet ofte oppnås gjennom enten typisk cDNA bibliotekscreening eller PCR-baserte metoder så som RACE (hurtig mangfoldiggjøring av cDNA ender), etterfulgt av sekvensering av oppnådd cDNA. Således, alle gjeldende metoder er et forutsettende trinn for å oppnå sekvensinformasjon for det resterende av transkriptet. Dersom den manglende sekvensinformasjon direkte kan oppnås fra en populasjon av cDNAer generert fra en målcelle, kan disse tidskrevende nødvendige trinn fullstendig omgås og sekvensen av mål cDNA kan bestemmes direkte fra en ubearbeidet biologisk prøve.

DS oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse ble anvendt som primere for direkte å sekvensere placentaspesiflkk homeoboks gen Psx cDNAer fra mus ved anvendelse av placenta førstetråd cDNA pool. Framgangsmåten og resultatene for direkte sekvensering av placentaspesiflkke gen cDNAer fra placenta cDNA pool er beskrevet heri. De samme S^Psx-spesifikke DS primere som ble anvendt i eksempel 3 ble benyttet. Disse er Psxl-5'-ll, Psx2-5'-ll, Psxl-5'-41 og Psx2-5'-41.

A. Førstetråd cDNA syntese

Placenta førstetråd cDNA fra mus som syntetisert i eksempel 2 ble anvendt som et templat for direkte sekvensering av Psx cDNAer.

B. Direkte sekvensering av Psx cDNA fra placenta cDNA pool ved anvendelse av Psx spesifisitets DS primer

Syklussekvenseringsreaksjonen ble utført i et finalt volum av 20 \ il inneholdende 13 \ il (150 ng) av fortynnet førstetråd cDNA, 2\il ABIPRISM Big Dye terminatorreaksjon miks (Applied Biosystems, USA), 3 (j,lf 5 x sekvensreaksjonsbuffer (Applied Biosystems), og 1,6 \ il av en av 5'- Psxl- eller 5'-P^-spesifikke DS primere (1 jxM); reaksjonsrøret inneholdende reaksjonsblandingen ble plassert i en forvarmet (94°C) termisk sykluser; prøvene ble denaturert i 5 min. ved 94°C og underlagt 40-50 sykluser av 10 sec ved 94°C, 3 min. ved 50-60°C, og 4 min. ved 60-65°C. Sekvenseringsproduktene ble renset som følger: 1) tilsett 2^1 3M natriumacetat (pH 4,6) og 50 ^ fersk kald 100% EtOH, 2) oppbevaring ved -75°C i 30 min. 3) sentrifugering i 15-30 min. ved 13.000 g og fjerning av supernatant, 4) vask med 200 \ A 70% EtOH, 5) sentrifugering i 15-30 min. ved 13.000 g og fjerning av supernatant forsiktig, og tørking. Pelleten ble resuspendert i 10 (xl HiDi formamid like før sekvens-produktene ble kjørt på ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer.

Overraskende, Psx DS primerne sekvenserte presist deres spesifikke Psx cDNAer. Med andre ord, Psxl -spesifikk DS-primer (Psxl-5'-41) sekvenserte kun Psxl cDNA og Ps^-spesifikk DS-primer (Psx2-5'-41) sekvenserte kun Psx2 cDNA (fig. 8). Deleteringsregionen på 29-bp i Psx2 er vist med en svart stolpe. I motsetning, de konvensjonelle primere (Psxl-5'-40 og Psx2-5'-40), som ikke er i samsvar med prinsippene til DS oligonukleotidene, skilte ikke de to Psx cDNAer.

Disse resultater indikerer at DS primere kan diskriminere enkeltbaser mismatch selv i syklisk sekvensering, og også i PCR mangfoldiggjøring.

EKSEMPEL 5: Multipleks PCR ved anvendelse av dobbelt spesifisitet (DS) oligonukleotider

For å demonstrere applisering av DS oligonukleotid primere i multipleks PCR ble ni forskjellige cytokin familiegener mangfoldiggjort med DS primere. Framgangsmåten og resultatene for multipleks PCR mangfoldiggjøring ved anvendelse av DS primere er beskrevet heri. Cytokin familiegenspesifikke DS primere ble konstruert for å generere en 50 bp stige ved anvendelse av den lengste exon-sekvens av hvert cytokin-gen.

DS primere for IL-3 anvendt i eksemplet (200 bp) er:

DS primere for IL-15 anvendt i eksempelet (250 bp) er:

DS primere for IL-18 anvendt i eksempelet (300 bp) er:

DS primere for IL-25 anvendt i eksempelet (350 bp) er:

DS primere for IL-2 anvendt i eksempelet (400 bp) er:

DS primere for IL-6 anvendt i eksempelet (450 bp) er:

DS primere for IL-19 anvendt i eksemplet (500 bp) er:

DS primere for IL-lbeta anvendt i eksempelet (550 bp) er:

DS primere for IL-10 anvendt i eksempelet (600 bp) er:

A. Monopleks PCR ved anvendelse av ett sett av cytokin familiegenspesifikke DS primere

Enkelt mål PCR mangfoldiggj øringer for hver cytokin familiegen ble utført i et finalt volum av 20 \ il inneholdende 2 \ il (50 ng) av genomisk DNA fra mus, 2 \ il 10 x PCR reaksjonsbuffer inneholdende 15 mM MgCl2(Roche), 2^1 dNTP (2 mM av hver av dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1^1 av hver cytokin familiegenspesifikk 5' DS primer (10 \ iM), 1fxl av hver cytokin familiegenspesifikk 3' DS primer (10 \ iM), og 0,5 \ il Taq polymerase (5 enheter/^; Roche); hvor reagensrøret som inneholder reaksjonsblandingen ble plassert i en forvarmet (94°C) termal sykluser; prøvene ble denaturert i 5 min. ved 94°C, og underlagt 30 sykluser av 1 min. ved 94°C, 1 min. ved 60-65°C og 1 min. ved 72°C, etterfulgt av en 7 minutters inkubering ved 72°C.

B. Multipleks PCR ved anvendelse av 9 sett cytokin familiegenspesifikke DS primere

Multipleks PCR mangfoldiggjøring ble utført i et enkelt rør ved anvendelse av 9 sett cytokin familiegenspesifikke DS primere; reaksjonsblandingen var i finalt volum på 50 ul inneholdende 100 ng genomisk DNA fra mus, 5 ul 10 x PCR reaksjonsbuffer inneholdende 15 mM MgCl2(Roche), 5 \ d dNTP (2 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP), 1 \ il av hver av cytokin familiegenspesifikk 5' DS primer (0,2-5 \ iM), 1 \ A av hver cytokin familiegenspesifikk 3' DS primer (0,5-5 \ iM), og 0,5fxl Taq polymerase (5 enheter/^; Roche); hvor reaksjonsrørene inneholdende reaksjonsblandingen ble plassert i forvarmet (94°C) termisk sykluser; PCR betingelsene er én syklus på 94°C i 5 min., 50°C i 3 min., og 72°C i 3 min.; etterfulgt av 29 sykluser av 94°C i 40 sek, 60°C i 1 min., og 72°C i 40 sek, og en 5 minutters final ekstensjonssyklus ved 72°C.

Som vist i fig. 9, multipleks PCR mangfoldiggjøring generer multiple bånd som korresponderer til de forventede størrelser fra 200 bp til 600 bp for 9 forskjellige cytokin genprodukter (fig. 4, spor 1). Hver monopleks PCR mangfoldiggjøring genererte et enkelt bånd som korresponderer til den forventede størrelse på 200 bp for IL-3 (fig. 4, spor 2), 250 bp for IL-15 (fig. 4, spor 3), 300 bp for IL-18 (fig. 4, spor 4), 350 bp for IL-25 (fig. 4, spor 5), 400 bp for IL-2 (fig. 4, spor 6), 450 bp for IL-6 (fig. 4, spor 7), 500 bp for IL-19 (fig. 4, spor 8), 550 bp for IL-lbeta (fig. 4, spor 9) og 600 bp for IL-10 (fig. 4, spor 10), respektivt.

Således skal det anerkjennes at DS primere utviklet med foreliggende oppfinnelse med suksess kan anvendes med multipleks PCR. Den unike struktur av DS oligonukleotider muliggjør å komme rundt de vanlige problemer med konvensjonell multipleks PCR, nemlig primerinterferens og dimerdannelse.

EKSEMPEL 6: Deteksjon av human metapneumovirus ved anvendelse av mismatch toleranse av dobbelspesifisitet (DS) oligonukleotider

For å demonstrere anvendelse av DS oligonukleotidprimere i mismatch toleranse, ble DS-primere anvendt for å detektere human metapneumovirus (Hmpv) i kliniske prøver. Fremgangsmåten og resultatene for deteksjon av human metapneumovirus ved anvendelse av DS-primere er beskrevet heri. Dette eksempelet skal ikke vurderes som begrensende for applikasjonene ifølge oppfinnelsen for deteksjon av spesifikke virus.

DS-primere ble konstruert basert på den konserverte region av fusjonsglukoprotein (F) genet generert ved aligning av sekvenser av alle tilgjengelige hMPV-isolater (se Tabell 1). For å tolerere den genetiske diversitet av disse isolater ble primerene konstruert basert på følgende kriterier: (a) konserverte regioner skal være minst 30 nukleotider i lengde til tross for nærvær av én eller flere, om enn begrenset antall, basepar mismatch (Tabell 1); (b) de fleste mismatchede sekvenser innen de konstruerte regioner er fortrinnsvis lokalisert i separeringsporsjonen i DS-primeren (f.eks. hMPV 5'-585, hMPV 3'-698, og hMPV 3'-1007); (c) og ellers er de mismatchede nukleotider lokalisert i 5'-endeporsjon, og noen av disse kan erstattes med universale baser så som deoksyinosiner (f.eks. hMPV 3'-698 og hMPV 3'-1007); og (d) en eller to mismatchede nukleotid(er) i 3'-endeporsjon kan erstattes med degenererte nukleotid(er) eller universelle base(r) (f.eks. hMPV 3'-1007).

DS-primerne spesifikke til hMPV F-genet anvendt i eksempelet er:

hvor W kan være A eller I, og I er deoksyinosin.

Viral total RNA ble ekstrahert ved anvendelse av RNAzol B fremgangsmåten i samsvar med leverandørens protokoll (RNAzol LS; Tel-Test, Inc.). Revers transkripsjonsreaksjon ble utført for å syntetisere cDNA ved anvendelse av viral RNA i 1,5 t ved 42°C i et reaksjonsvolum av 20 ul sammensatt av følgende: 5 ul total RNA (tilnærmet 100 ng), 4 ul 5 x reaksjonsbuffer (Invitrogen, USA), 5 ul dNTPer (hver 5 mM), 2 ul 20 uM vilkårlig heksadeoksynukleotider, 0,5 ul RNase inhibitor (40 enheter/ul, Promega), og 1 ul Moloney murin leukemivirus revers transkriptase (200 enheter/ul, Promega).

Mål PCR mangfoldiggjøring av hMPV F genet ble utført i et finalt volum av 20fo.1 inneholdende 2fxl (30 ng) av den første tråd cDNA, 2fxl av 10 x PCR reaksjonsbuffer inneholdende 15 mM MgCl2(Roche), 2 ul dNTP (2 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP), 1^1 av 5' hMPV-spesifikk DS-primer (hMPV 5'-585; 10 nM), 1 ul av 3' hMPV-spesiifkk DS-primer (hMPV 3'-698 eller hMPV 3'-1007; 10 \ iM), og 0.5 \ il Taq polymerase (5 enheter/^; Roche); hvor reaksjonsrøret inneholdende reaksjonsblandingen ble plassert i en forvarmet (94°C) termisk sykluser; prøvene ble denaturert i 5 min ved 94°C og underlagt 30 sykluser av 1 min ved 94°C, 1 min ved 60-65°C, og 1 min ved 72°C, etterfulgt av en 7 minutters inkubering ved 72°C.

Som vist i Fig. 10B, hvert par av hMPV-spesifikke DS-primere (hMPV 5'-585 og hMPV 3'-698, og hMPV 5'-585 og hMPV 3'-1007) genererer et enkelt bånd som korresponderer til de forventede størrelser av 150-bp og 459-bp, respektivt (bord 1 og 2). Påfølgende sekvensanalyse av produktene bekreftet at de er de partielle sekvenser av hMPV fusjonsglukoprotein (F) genet. I motsetning, disse primere genererer intet produkt i en negativ kontroll PCR uten templat (bord 4 og 5). Som en positiv kontroll ble human beta-aktin-spesifikt primersett anvendt (bord 3).

Disse resultater indikerer at DS-primere kan appliseres for å detektere hMPVer fra pasient med respiratoriske infeksjoner. Således, det kan realiseres at DS oligonukleotider kan tilpasses, som primere i PCR mangfoldiggjøring eller prober i oligonukleotid chip, til alle potensielle situasjoner som man møter innen feltet.

EKSEMPEL 7: Deteksjon av målnukleotidsekvens ved anvendelse av DS oligo-immobiliserte microarray

DS oligoer komplementære til en region av en målnukleinsyremolekyl syntetiseres ved hjelp av en DNA syntetiserer (Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems (ABI)) i samsvar med en standardprotokoll. De syntetiserte DS oligoer immobiliseres på et separat glass for microarray. Deretter, en templatavhengig ekstensjonsreaksjonsblanding inneholdende 50-200 ng DNA-prøve, 5 \ A 10 x PCR reaksjonsbuffer (Promega), 5 \ A 15 mM MgCl2, 5 \ il fluorescensmerket dNTP (2 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP) pg 0,5^1 Taq polymerase (5 enheter/^1; Promega) tilsettes til miroarrayet, hvoretter mikroarrayet plasseres i en forvarmet (94°C) termisk sykluser. Den templatavhengige ekstensjonsreaksjon utføres i samsvar med følgende termiske syklus: denaturering i 5 min ved 94°C, og 15-50 sykluser av 1 min ved 94°C, 1-3 min ved 50-65°C og 1-4 min ved 60-72°C, etterfulgt av 5 min ekstensjon ved 72°C. Etter templatavhengig ekstensjonsreaksjon blir de forlengete DS oligoer vasket og detektert med dets fluorescentbilder gjennom en microarray skanner, etterfulgt av analyse av bildene.

EKSEMPEL 8: SNP (Enkelt nukleotid polymorfisme) genotyping ved anvendelse av DS oligonukleotider

DS oligoer syntetiseres ved hjelp av en DNA syntetiserer (Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems (ABI)) i samsvar med en standard protokoll ved å plassere en polymorf base (interrogeringssete) i senteret av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon. De syntetiserte oligonukleotider immobiliseres på et glasspreparat for microarray. Deretter, en templatavhengig ekstensjonsreaksjonsblanding inneholdende 50-200 ng DNA-prøve, 5 fxl 10 x PCR reaksjonsbuffer (Promega), 5 fxl 15 mM MgCl2, 5 m1 fluorescensmerket dNTP (2 mM hver dATP, dCTP, dGTP og dTTP) og 0,5^1 Taq polymerase (5 enheter/jd; Promega) tilsettes til mikroarrayet, hvoretter mikroarrayet plasseres i en forvarmet (94°C) termisk sykluser. Den templatavhengige ekstensjonsreaksjon utføres i samsvar med følgende termiske syklus: Denaturering i 5 min ved 94°C, og 15-50 sykluser av 1 min ved 94°C, 1-3 min ved 50-65°C og 1-4 min ved 60-72°C, etterfulgt av en 5 minutters ekstensjon ved 72°C. Etter den templatavhengige ekstensjonsreaksjon vaskes de forlengede DS oligoer og detekteres ved deres fluorescentbilder igjennom en microarrayskanner, etterfulgt av analyse av bildene.

Idet vi har beskrevet en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse skal det forstås at varianter og modifiseringer derav er innenfor rammen av oppfinnelsen og vil være åpenbare for fagkyndige, idet rammen av oppfinnelsen bestemmes av de medfølgende patentkrav og deres ekvivalenter.

Claims

1. Fremgangsmåte for selektivt å mangfoldiggjøre en målnukleinsyresekvens fra en DNA eller en blanding av nukleinsyrer,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter å mangfoldiggjøre målnukleinsyresekvensen ved å utføre minst to sykluser av primer-annealing, primer-forlenging og denaturering, ved anvendelse av et primersett som omfatter et par av dobbelspesifisitetoligonukleotider som forsterker annealingspesifisitet; hvor hvert dobbelspesifisitetoligonukleotid er representert med følgende generelle formel:

hvor, Xp representerer en 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på en templatnukleinsyre for å hybridisere dermed, Yq representerer en separasjonsporsjon omfattende minst tre universelle baser, Zrrepresenterer en 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på templat nukleinsyren for å hybridisere dermed, p, q og r representerer antallet nukleotider, og p representerer et heltall på minst 15, q representerer et heltall på minst 3, og r representerer et heltall på minst 3; og X, Y og Z er deoksyribonukleotid eller ribonukleotid; hvor Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon, hvor separasjonsporsjonen har den laveste Tm av de tre porsjoner; hvor 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er lengre enn 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon; hvor separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparing som ikke fungerer som et hybridiseringssetet og som ikke reagerer med templatet for baseparing, under betingelser hvor 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er annealet til templat nukleinsyre, noe som muliggjør at 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon separerer fra 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon i termer av annealingspesifisitet til templat nukleinsyre, hvor annealingspesifisitet av oligonukleotidet bestemmes dobbelt ved 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon slik at den totale annealingspesifisitet av oligonukleotidet økes; hvor annealing i mangfoldiggjøringsreaksjonen utføres under betingelser der annealing kun av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjonen ikke forekommer; hvor en første syklus og en andre syklus av mangfoldiggjøringsreasjonen involverer annealing av både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjonen og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjonen av dobbeltspesifisisitetsoligonukleotidet til målnukleinsyresekvensen og påfølgende sykluser av mangfoldiggjøringsreaksjonen involverer annealing av både 5'-høy Tm spesifisitetsporsjonen og 3'-lav Tm spesifisitetsporsjonen av dobbelt-spesifisitetsoligonukleotidet til en sekvens som er avledet fra dobbeltspesifisisitetsoligonukleotidet inkorporert inn i det mangfoldiggjorte produkt; hvor den universelle base inneholdt i separasjonsporsjonen er deoksyinosin eller inosin.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat annealing utføres ved en temperatur i området fra 45°C til 68°C.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat mangfoldiggjøring er en polymerase kjedereaksjon.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat 3'-lavTmspesifisitetsporsjon har den hybridiserende nukleotidsekvens perfekt komplementær til setet på templat nukleinsyren for å hybridisere dermed.

5.. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat p representerer et heltall av 15 til 40.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat p representerer et heltall av 15 til 25.

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat q representerer et heltall av 3 til 10.

8. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat r representerer et heltall av 3 til 15.

9. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat p er et heltall av 15 til 25, q er et heltall av 3 til 10, og r er et heltall av 3 til 15.

10. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat Tm av 5'-høy Tm spesifisitetsporsjon er i området fra 40°C til 80°C

11. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat Tm av 3'-lav Tm spesifisitetsporsjon er i området fra 10°C til 40°C.

12. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat Tm av separasjonsporsjonen er i området fra 3°C til 15°C.

13. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat målnukleinsyresekvensen omfatter to eller flere målnukleinsyresekvenser og at primersettet omfatter to eller flere primersett for multipleks mangfoldiggjøring.