CN103993103A - 一种水貂阿留申病毒的lamp检测方法 - Google Patents

一种水貂阿留申病毒的lamp检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水貂阿留申病毒的LAMP检测方法，包括DNA模板的提取；LAMP反应引物的设计；LAMP反应；LAMP反应结果检测,经试验得知，特异性好、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备的优点。

Description

一种水貂阿留申病毒的LAMP检测方法
技术领域
本发明涉及一种动物疫病的检测方法，具体地说，涉及一种水貂阿留申病
毒的LAMP检测方法，属于动物检验检疫技术领域。
背景技术
水貂阿留申病（Aleutian disease, AD）是由水貂阿留申病毒（Aleutian disease parvovirus, ADV）侵害水貂引起的一种慢性、进行性传染病，一直是危害着世界养貂业健康发展的最重要的疫病之一。该病几乎存在于所有养貂的国家和地区，呈现世界分布性的特点。从发现AD以来世界各地所报道的与AD研究相关的文章中，我们也可从侧面了解AD感染的全球化趋势。就可查阅到的文献来看，美洲的美国、加拿大、阿根廷等国家，欧州的丹麦、芬兰、英国、西班牙、德国等国家，亚洲的中国、日本等国，均有该病的相关研究报道。
我国水貂的主要养殖区在山东、辽宁和黑龙江三地，现在国际上ADV的流行情况还没有相关报道，国内根据闫喜军等2006-2007年的初步调查，在全国送检的221只水貂病例中检出水貂阿留申病貂22只，占剖检总数的约10% ；送检的阿留申病例以9-11月居多，说明其发病具有明显的季节性。因为水貂阿留申病潜伏期长，阿留申病貂多不表现明显的临床症状，故养殖户可能会忽视对阿留申病貂的检疫和淘汰，而且近年来我国毛皮动物市场的扩大，流通渠道增多，频繁引种和倒种及其动物产品数量增加，但配套措施不够健全，不同地区的饲养条件，管理水平参差不齐，一些饲养场疾病防治观念淡薄，对水貂阿留申病重视不够所以我国水貂阿留申病毒的感染率应高于10%。以上检测结果是通过对流免疫电泳（CIEP）检测得到，该法操作简便，对试验条件要求不高，有较高的特异性，但随着技术的进步和检测标准的提高，该方法的结果判定的误差较大，易散毒，耗时长的缺点已不能适应我国水貂养殖业发展的要求，所以，为了阻断水貂阿留申病的传播，净化水貂养殖环境，亟待更加安全，高效的方法来代替。
水貂阿留申病毒的LAMP检测方法的建立，必将为我国水貂阿留申病感染率的降低、经济效益的提升带来巨大的帮助。目前，还没有见到对水貂阿留申病毒LAMP检测方法的研究报道。
发明内容
本发明要解决的问题是针对以上不足，提供一种水貂阿留申病毒的LAMP检测方法，克服了现有检测方法误差大、易散毒、耗时长的缺陷，采用本发明的LAMP检测方法，可以快速诊断水貂是否感染水貂阿留申病毒，具有检测成本低，检测效率高的优点。
LAMP，为loop-mediated isothermal amplification的简称，中文名称为环介导等温扩增。
为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案为：一种水貂阿留申病毒的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP检测方法包括以下步骤：
a.DNA模板的提取；
b.LAMP反应引物的设计；
c. LAMP反应；
d. LAMP反应结果检测。
一种优化方案，所述步骤a包括：利用病毒DNA提取纯化试剂盒进行提取水貂阿留申病毒DNA，得样本DNA。
进一步地，所述步骤b包括：选择水貂阿留申病毒VP2基因作为靶基因；
根据LAMP引物设计软件网址：http://primerexplorer.jp/e/，将待扩增的DNA 分为六个独立的区域，根据这六个区域分别设计LAMP 反应所需的引物，所述引物包括内引物FIP 和BIP、外引物F3 和B3、环引物LB、LF，共设计五套LAMP引物扩增VP2基因。
进一步地，所述五套LAMP引物扩增VP2基因包括：  
第一套为：
ADV55-F3：CCAACCAAGGTAACGCAT
ADV55-B3：TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV55-FIP：GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTTCAACAATGACTTAACTGCG
ADV55-BIP：CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV55-LF：GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGA；
第二套为：
ADV8-F3：GTTTGGTTACTTTAGAACAAGAG
ADV8-B3：TGCTCTCCAAGGAACAAAG
ADV8-FIP：TGCTTGGTAGATGCGTTACCTTTTTTATAGACAATGTAACCATAAAGACTG
ADV8-BIP：TAACTGCGTCGTTACAGGTTGCTTTTCCCAGTGTTTCTCCCAAC
ADV8-LB：  ACAACATATTGCCATATACTCCAGC；
第三套为：
ADV21-F3：GATAGACAATGTAACCATAAAGACT
ADV21-B3：TTGGTTTGGTTGCTCTCC
ADV21-FIP：CGACGCAGTTAAGTCATTGTTGATTTTGTAACAGAAACCAACCAAGGTA
ADV21-BIP：TACAGGTTGCTTTAGACACTAACAATTTTAAGGAACAAAGCCCAGTG
ADV21-LB：CATATACTCCAGCTGCGCCGTT；
第四套为：
ADV37-F3：ACCATAAAGACTGTAACAGAAAC
ADV37-B3：TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV37-FIP：GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGATTTTTAACGCATCTACCAAGCA
ADV37-BIP：CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG；
第五套为：
ADV46-F3：AACCAAGGTAACGCATCT
ADV46-B3：TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV46-FIP：GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTACCAAGCAATTCAACAATGA
ADV46-BIP：CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV46-LF：AACCTGTAACGACGCAGTTAAG。
进一步地，所述步骤c包括：根据环介导等温扩增法FDR荧光检测试剂盒配制26μl 反应混合物。
进一步地，所述反应混合物包括：
2×反应混合液，用量为12.5μl；
引物混合液：40 pmol FIP 和40 pmol BIP, 5 pmol F3 和 5 pmol B3，20 pmol LB和20 pmol LF，用量为2.6μl；
双蒸水，用量为6.9μl；
样本DNA，用量为2μl
Bst DNA聚合酶，用量为1μl；
显色液，1μl；
封闭剂，一个。
进一步地，所述步骤d包括浊度法检测：采用实时浊度仪检测，每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性。
进一步地，所述步骤d包括显色法检测：基于钙黄绿素颜色改变检测，钙黄绿素是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性时为橙色，阳性时为绿色。
进一步地，所述LAMP检测方法包括步骤e：LAMP方法敏感性；
所述LAMP方法敏感性包括：以含VP2片段的质粒为检测对象，定量后将总DNA进行10 倍稀释度稀释，使得最终稀拷贝数为105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、100拷贝/μl，并以双蒸水作为阴性对照。然后进行LAMP反应，分别采用浊度法和显色法来检测结果。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：经试验得知，特异性好、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
附图说明
附图1为本发明实施例中最佳引物筛选的试验结果；
附图2为本发明实施例中最佳引物的特异性浊度法的试验结果；
附图3为本发明实施例中最佳引物的特异性显色法的试验结果；
附图4为本发明实施例中最佳引物检测的敏感性浊度法的试验结果；
附图5为本发明实施例中最佳引物检测的敏感性显色法的试验结果；
附图6为本发明实施例中 PCR敏感性的试验结果。
具体实施方式
实施例，一种水貂阿留申病毒的LAMP检测方法，包括以下步骤：
a、DNA 模板的提取
利用病毒DNA提取纯化试剂盒进行提取水貂阿留申病毒DNA，得样本DNA；
b、LAMP 反应引物的设计
选择水貂阿留申病毒VP2基因作为靶基因，序列如下：AACAAGTAATGACACCTTGGTTTTTGGTAGATAGCAACGCTTGGGGTGTGTGGATGAGTCCTAAAGACTTTCAACAAATGAAAACACTATGTAGTGAAATTAGTTTGGTTACTTTAGAACAAGAGATAGACAATGTAACCATAAAGACTGTAACAGAAACCAACCAAGGTAACGCATCTACCAAGCAATTCAACAATGACTTAACTGCGTCGTTACAGGTTGCTTTAGACACTAACAACATATTGCCATATACTCCAGCTGCGCCGTTGGGAGAAACACTGGGCTTTGTTCCTTGGAGAGCAACCAAACCAACCCAATATAGGTATTATCATCCATGTTACATTTACAACAGATATCCTAACATTCAAAAAAAAGGACAGGAAGAACTTGAATGGCAAGCAATACAAGATGATTACCTTAGTGTGGATGAGCAGTACTTTAACTTTATTACTATAGAGAACAACATACCTATTAACATTCTCAGAACGGGAGATAACTTTCATTCAGGCATATATGAGTTTAAAAGTA；
根据LAMP引物设计软件网址：http://primerexplorer.jp/e/，将待扩增的DNA 分为六个独立的区域，根据这六个区域分别设计LAMP 反应所需的引物（包括内引物FIP 和BIP、外引物F3 和B3、环引物LB、LF），共设计五套LAMP引物扩增VP2基因； 
第一套为：
ADV55-F3：CCAACCAAGGTAACGCAT
ADV55-B3：TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV55-FIP：GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTTCAACAATGACTTAACTGCG
ADV55-BIP：CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV55-LF：GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGA；
第二套为：
ADV8-F3：GTTTGGTTACTTTAGAACAAGAG
ADV8-B3：TGCTCTCCAAGGAACAAAG
ADV8-FIP：TGCTTGGTAGATGCGTTACCTTTTTTATAGACAATGTAACCATAAAGACTG
ADV8-BIP：TAACTGCGTCGTTACAGGTTGCTTTTCCCAGTGTTTCTCCCAAC
ADV8-LB：  ACAACATATTGCCATATACTCCAGC；
第三套为：
ADV21-F3：GATAGACAATGTAACCATAAAGACT
ADV21-B3：TTGGTTTGGTTGCTCTCC
ADV21-FIP：CGACGCAGTTAAGTCATTGTTGATTTTGTAACAGAAACCAACCAAGGTA
ADV21-BIP：TACAGGTTGCTTTAGACACTAACAATTTTAAGGAACAAAGCCCAGTG
ADV21-LB：CATATACTCCAGCTGCGCCGTT；
第四套为：
ADV37-F3：ACCATAAAGACTGTAACAGAAAC
ADV37-B3：TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV37-FIP：GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGATTTTTAACGCATCTACCAAGCA
ADV37-BIP：CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG；
第五套为：
ADV46-F3：AACCAAGGTAACGCATCT
ADV46-B3：TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV46-FIP：GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTACCAAGCAATTCAACAATGA
ADV46-BIP：CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV46-LF：AACCTGTAACGACGCAGTTAAG；
c、LAMP 反应
根据环介导等温扩增法FDR荧光检测试剂盒配制26μl反应混合物：
包括：
2×反应混合液，用量为12.5μl；
引物混合液：40 pmol FIP 和40 pmol BIP, 5 pmol F3 和 5 pmol B3，20 pmol LB和20 pmol LF，根据设计的引物序列，由试剂公司合成引物，用量为2.6μl；
双蒸水，用量为6.9μl；
样本DNA，用量为2μl
Bst DNA聚合酶，用量为1μl；
显色液，1μl；
封闭剂，一个；
环介导等温扩增法FDR荧光检测试剂盒包括：除引物混合液、样本DNA外成分；将反应混合物置于65℃恒温反应60min，以双蒸水为阴性对照；
d、LAMP反应结果检测
    浊度法检测：采用实时浊度仪检测，LAMP 在反应过程中发生以下反应式：
（DNA）n-1+dNTP → （DNA）n+P2O7 4-
P2O7 4-+2Mg2+ → Mg2P2O7↓
其中Mg2P2O7即焦磷酸镁，为白色沉淀。依据这个原理，日本荣研化学株式会社开发出实时浊度仪LA-320c，每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性；
    显色法检测：基于钙黄绿素颜色改变检测，钙黄绿素是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性时为橙色，阳性时为绿色；
LAMP 方法敏感性试验
为了验证LAMP 方法的检测灵敏度，以含VP2片段的质粒为检测对象，定量后将总DNA进行10 倍稀释度稀释，使得最终稀拷贝数为105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、100拷贝/μl，并以双蒸水作为阴性对照。然后进行LAMP反应，分别采用浊度法和显色法来检测结果。
材料：水貂阿留申病病毒、水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒由中国农业科学院特产研究所提供；人基因组、鼠基因组由北京蓝谱生物科技有限公司提供。
阳性质粒标准品的制备：根据水貂阿留申病毒VP2基因序列，由大连宝生物公司纯人工合成质粒，基因全长528bp。
    仪器：
实时浊度仪：日本荣研LA-320c；
恒温金属浴：杭州博日CHB-100；
核酸蛋白分析仪：Beckman DU800；
台式高速离心机：Eppendorf 5417R;
PCR仪：ATC401；
凝胶成像仪：法国VILBER 3026。
    试剂：
环介导等温扩增法FDR荧光检测试剂盒：北京蓝谱生物科技有限公司（试剂盒组成：2×反应混合液，Bst DNA聚合酶，显色液，封闭剂）；
病毒DNA提取纯化试剂盒：Promega，Wizard Genomic DNA Purification Kit，货号：A1120。
2xTaq PCR Master mix：TIANGEN 货号：KT201
引物合成由大连宝生物工程有限公司完成。
结果与分析
最佳引物的筛选：
附图1所示，以本研究设计的五套引物对含VP2片段的质粒(质粒浓度108拷贝/ul)进行LAMP扩增，最先发生LAMP反应的引物组合为最佳引物，从图中可以看出ADV21、 ADV8、ADV55、ADV46、ADV37引物组开始发生LAMP反应的时间是分别是第16min、22min、24min、29min、40min，故将ADV21引物组选为最佳引物。
最佳引物的特异性试验：
附图2所示，阴性对照以水作为模板，阳性对照用含VP2的质粒作为模板，并用人基因组、鼠基因组、细小病毒、犬瘟热病毒作为对照以检测特异性。当反应体系中存在VP2基因时，便发生LAMP 扩增反应，产生大量的焦磷酸镁白色沉淀，反应液的浊度上升，在图中表现为曲线上升，从图中可以看出只有阳性对照的曲线发生了上升，其他曲线均没有变化，表明设计的引物具有良好的特异性。采用钙黄绿素染色来观察结果，与浊度法一致，如图3所示，图中：1、阴性对照；2、阳性对照；3、人基因组；4、鼠基因组；5、细小病毒；6、犬瘟热
病毒。   
最佳引物的敏感性试验与PCR方法的比较：
将10倍梯度稀释的含VP2基因的质粒模板用于LAMP 反应，检测结果见图4，图中：模板浓度分别为：1、105拷贝/μl；2、104拷贝/μl；3、103拷贝/μl；4、102拷贝/μl；5、101拷贝/μl；6、100拷贝/μl；7、0拷贝/μl；8、阴性对照。显色法与浊度法试验结果一致，LAMP最低检测浓度为10拷贝/μl，如图5所示。
将10倍梯度稀释的含VP2基因的质粒模板用于PCR反应，检测结果见图6，图中，模板浓度分别为：1、105拷贝/μl；2、104拷贝/μl；3、103拷贝/μl；4、102拷贝/μl；5、101拷贝/μl；6、100拷贝/μl；7、0拷贝/μl；8、阴性对照。引物为ADV21-F3，ADV21-B3。25μl PCR 反应总体积的组成： 2×Taq MIX12.5μl 、各10pmol引物、模板1μl，补水至25ul。扩增循环条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；最后延伸7min。取PCR 产物5μl，在1% 含EB琼脂糖凝胶电泳上120V 电泳35min，在凝胶成像系统下照像检测。从图6可以看出，PCR最低检测浓度为100拷贝/μl。
LAMP最佳反应时间的确定：
LAMP反应时间定为能检测到质粒103拷贝/微升的时间为最佳，但是不能过分追求其敏感性以防止假阳性的出现，故结合本试验最佳引物的敏感性，将LAMP反应时间定为50分钟。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。 
<120>一种水貂阿留申病毒的LAMP检测方法
<140> 2014101465684
<141> 2014-05-09
<160>1
<210> 1
<211> 528
<212> DNA
<213> 水貂阿留申病毒VP2基因
<400> 1
AACAAGTAAT GACACCTTGG TTTTTGGTAG ATAGCAACGC TTGGGGTGTG TGGATGAGTC  60
CTAAAGACTT TCAACAAATG AAAACACTAT GTAGTGAAAT TAGTTTGGTT ACTTTAGAAC 120
AAGAGATAGA CAATGTAACC ATAAAGACTG TAACAGAAAC CAACCAAGGT AACGCATCTA 180
CCAAGCAATT CAACAATGAC TTAACTGCGT CGTTACAGGT TGCTTTAGAC ACTAACAACA 240
TATTGCCATA TACTCCAGCT GCGCCGTTGG GAGAAACACT GGGCTTTGTT CCTTGGAGAG 300
CAACCAAACC  AACCCAATAT AGGTATTATC ATCCATGTTA CATTTACAAC AGATATCCTA 360
ACATTCAAAA AAAAGGACAG GAAGAACTTG AATGGCAAGC AATACAAGAT GATTACCTTA 420
GTGTGGATGA GCAGTACTTT AACTTTATTA CTATAGAGAA CAACATACCT ATTAACATTC 480
TCAGAACGGG  AGATAACTTT  CATTCAGGCA  TATATGAGTT  TAAAAGTA        528

Claims (9)

1.一种水貂阿留申病毒的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP检测方法包括以下步骤：
a.DNA模板的提取；
b.LAMP反应引物的设计；
c. LAMP反应；
d. LAMP反应检测。
2.如权利要求1所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述步骤a包括：利用病毒DNA提取纯化试剂盒进行提取水貂阿留申病毒DNA，得样本DNA。
3.如权利要求1所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述步骤b包括：选择水貂阿留申病毒VP2基因作为靶基因；
根据LAMP引物设计软件网址：http://primerexplorer.jp/e/，将待扩增的DNA 分为六个独立的区域，根据这六个区域分别设计LAMP 反应所需的引物，所述引物包括内引物FIP 和BIP、外引物F3 和B3、环引物LB、LF，共设计五套LAMP引物扩增VP2基因。
4.如权利要求3所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述五套LAMP引物扩增VP2基因包括：  
第一套为：
ADV55-F3：CCAACCAAGGTAACGCAT
ADV55-B3：TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV55-FIP：GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTTCAACAATGACTTAACTGCG
ADV55-BIP：CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV55-LF：GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGA；
第二套为：
ADV8-F3：GTTTGGTTACTTTAGAACAAGAG
ADV8-B3：TGCTCTCCAAGGAACAAAG
ADV8-FIP：TGCTTGGTAGATGCGTTACCTTTTTTATAGACAATGTAACCATAAAGACTG
ADV8-BIP：TAACTGCGTCGTTACAGGTTGCTTTTCCCAGTGTTTCTCCCAAC
ADV8-LB：       ACAACATATTGCCATATACTCCAGC；
第三套为：
ADV21-F3：GATAGACAATGTAACCATAAAGACT
ADV21-B3：TTGGTTTGGTTGCTCTCC
ADV21-FIP：CGACGCAGTTAAGTCATTGTTGATTTTGTAACAGAAACCAACCAAGGTA
ADV21-BIP：TACAGGTTGCTTTAGACACTAACAATTTTAAGGAACAAAGCCCAGTG
ADV21-LB：CATATACTCCAGCTGCGCCGTT；
第四套为：
ADV37-F3：ACCATAAAGACTGTAACAGAAAC
ADV37-B3：TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV37-FIP：GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGATTTTTAACGCATCTACCAAGCA
ADV37-BIP：CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG；
第五套为：
ADV46-F3：AACCAAGGTAACGCATCT
ADV46-B3：TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV46-FIP：GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTACCAAGCAATTCAACAATGA
ADV46-BIP：CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV46-LF：AACCTGTAACGACGCAGTTAAG。
5.如权利要求1所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述步骤c包括：根据环介导等温扩增法FDR荧光检测试剂盒配制26μl 反应混合物。
6.如权利要求5所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述反应混合物包括：
2×反应混合液，用量为12.5μl；
引物混合液：40 pmol FIP 和40 pmol BIP, 5 pmol F3 和 5 pmol B3，20 pmol LB和20 pmol LF，用量为2.6μl；
双蒸水，用量为6.9μl；
样本DNA，用量为2μl
Bst DNA聚合酶，用量为1μl；
显色液，1μl；
封闭剂，一个。
7.如权利要求1所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述步骤d包括浊度法检测：采用实时浊度仪检测，每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性。
8.如权利要求1或7所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述步骤d包括显色法检测：基于钙黄绿素颜色改变检测，钙黄绿素是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性时为橙色，阳性时为绿色。
9.如权利要求1所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP检测方法包括步骤e：LAMP方法敏感性；
所述LAMP方法敏感性包括：以含VP2片段的质粒为检测对象，定量后将总DNA进行10 倍稀释度稀释，使得最终稀拷贝数为105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、100拷贝/μl，并以双蒸水作为阴性对照；
 然后进行LAMP反应，分别采用浊度法和显色法来检测结果。
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