CN105112566A - 基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂盒 - Google Patents

基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂盒 Download PDF

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CN105112566A CN201510581528.7A CN201510581528A CN105112566A CN 105112566 A CN105112566 A CN 105112566A CN 201510581528 A CN201510581528 A CN 201510581528A CN 105112566 A CN105112566 A CN 105112566A
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张晓文
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Abstract

本发明公开了基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂盒。本发明所提供的基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂盒，依赖于传染性造血器官坏死病毒指纹序列，所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列为序列表中SEQ？ID？No.9的第553-565位核苷酸；所述试剂盒包括传染性造血器官坏死病毒指纹序列的测序引物和扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对；所述测序引物为名称为IHNV-S的序列表中SEQ？ID？No.12所示的单链DNA；所述扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对为名称为IHNV-P的由序列表中SEQ？ID？No.10所示的单链DNA和SEQ？ID？No.11所示的单链DNA组成的引物对。

Description

基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域中基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂盒。
背景技术
鲤春病毒血症(SVC)、病毒性出血性败血症(VHS)、传染性造血器官坏死病(IHN)是同被列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》的二类传染病，SVC、VHS和IHN分别是《中华人民共和国动物防疫法》规定的二类和三类疫病，这三种疫病都是国际兽疫局OIE名录中的重要疫病。
VHS困扰欧洲虹鳟鱼达50多年，被认为是欧洲虹鳟鱼养殖业经济损失的头号杀手，VHS逐渐在其他品种中也有报道。这3种疫病均是由RNA病毒引起的急性高度传染性疾病，可侵害多种海水和淡水养殖鱼类，在欧、美、日、韩及部分亚洲国家流行，可通过鱼体及所产卵、精液、尿、粪便以及污染的饲料、水等传播，对养殖场造成致命打击，危害非常严重。
鲤春病毒血症病毒(SVCV)引起包括鲤鱼在内的很多水生动物的急性高度传染性疾病；传染性造血器官坏死病毒(IHNV)引起鲑科多种鱼的致死性疾病，通过污染的水、饲料和粪便等传播，幼鱼和鱼苗死亡率可达100％，成鱼感染可终身带毒并散毒；病毒性出血性败血症病毒(VHSV)可引起各种年龄的鲑科多种鱼发病，死亡率达80-100％，特别是幼鱼和鱼苗。
目前传统的病毒分离及血清学诊断方法操作繁琐，无法实现对不同亚型病毒的同步检测，RT-PCR方法也无法达到对病毒进行快速、准确、高通量检测分型的目的，因而目前急需一种能够对SVCV、VHSV和IHNV进行高通量快速排查的集成化诊断技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定传染性造血器官坏死病毒。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质在制备基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明所提供的检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质在制备基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂或试剂盒中的应用中，所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列为序列表中SEQIDNo.9的第553-565位核苷酸。
上述应用中，所述检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质可包括传染性造血器官坏死病毒指纹序列的测序引物和/或扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对。
上述应用中，所述测序引物可为名称为IHNV-S的序列表中SEQIDNo.12所示的单链DNA；所述扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对可为名称为IHNV-P的由序列表中SEQIDNo.10所示的单链DNA和SEQIDNo.11所示的单链DNA组成的引物对。
上述应用中，所述SEQIDNo.10所示的单链DNA和/或SEQIDNo.11所示的单链DNA可用生物素标记。
在本发明的一个实施例中，SEQIDNo.11所示的单链DNA的5′端有生物素标记。
为解决上述技术问题，本发明还提供了基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂或试剂盒。
本发明所提供的基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂或试剂盒，包括检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质；所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列为序列表中SEQIDNo.9的第553-565位核苷酸。
上述试剂或试剂盒中，所述检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质可包括传染性造血器官坏死病毒指纹序列的测序引物和/或扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对。
上述试剂或试剂盒中，所述测序引物可为名称为IHNV-S的序列表中SEQIDNo.12所示的单链DNA；所述扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对可为名称为IHNV-P的由序列表中SEQIDNo.10所示的单链DNA和SEQIDNo.11所示的单链DNA组成的引物对。
上述试剂或试剂盒中，所述SEQIDNo.10所示的单链DNA或SEQIDNo.11所示的单链DNA可用生物素标记。
在本发明的一个实施例中，SEQIDNo.11所示的单链DNA的5′端有生物素标记。
为解决上述技术问题，本发明还提供了基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂或试剂盒的制备方法。
本发明所提供的基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂或试剂盒的制备方法中，所述基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂或试剂盒为上文所述基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂或试剂盒；所述基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂或试剂盒的制备方法，包括将所述测序引物和/或所述扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对的两条单链DNA独立包装的步骤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质。
本发明所提供的检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质，为上述应用中或上述试剂或试剂盒中所述检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质。
上述检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质，可包括下述P1和/或P2：
P1、所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列的测序引物；
P2、所述扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对。
上述检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质中，所述测序引物可为名称为IHNV-S的序列表中SEQIDNo.12所示的单链DNA；所述扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对可为名称为IHNV-P的由序列表中SEQIDNo.10所示的单链DNA和SEQIDNo.11所示的单链DNA组成的引物对。
为解决上述技术问题，本发明还提供了传染性造血器官坏死病毒的检测方法1。
本发明所提供的传染性造血器官坏死病毒的检测方法1，包括下述H1)和H2)的步骤：
H1)以待测生物样品的核酸(RNA或DNA)为模板，选用54℃的退火温度，用所述IHNV-P进行PCR扩增得到PCR产物；
H2)检测步骤H1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有61bp的DNA片段，所述待测样品含有传染性造血器官坏死病毒或候选含有传染性造血器官坏死病毒；如果所述PCR产物中不含61bp的DNA片段，所述待测样品不含传染性造血器官坏死病毒或候选不含传染性造血器官坏死病毒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了传染性造血器官坏死病毒的检测方法2。
本发明所提供的传染性造血器官坏死病毒的检测方法2，包括下述H3)和H4)的步骤：
H3)以待测生物样品的核酸(RNA或DNA)为模板，选用54℃的退火温度，用所述IHNV-P进行PCR扩增得到PCR产物；
H4)检测步骤H3)得到的PCR产物，如果所述PCR产物中含有所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列，所述待测样品含有传染性造血器官坏死病毒或候选含有传染性造血器官坏死病毒；如果所述PCR产物中不含所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列，所述待测样品不含传染性造血器官坏死病毒或候选不含传染性造血器官坏死病毒。
上述传染性造血器官坏死病毒的检测方法2中，所述检测步骤H3)得到的PCR产物为以所述IHNV-S为测序引物进行焦磷酸测序。
上文中，所述检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质可只由所述IHNV-S和所述IHNV-P组成，也可只由所述IHNV-P组成，也可只由所述IHNV-S组成。
上文中，所述检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质，还可包括检测所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列所需要的其他试剂和/或仪器，如通过焦磷酸测序检测所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列所需的试剂和仪器。
具体来说，进行焦磷酸测序所需要的其它试剂和仪器可为5×PCRbuffer和/或Taq热启动酶和/或变性缓冲液(denatureationbuffer)和/或冲洗缓冲液(washingbuffer)和/或链霉亲和素包被的磁珠和/或真空吸附泵(vacuumpreptool)和/或PCR仪和/或PYROMARKID仪器。
其中，所述5×PCRbuffer和所述Taq热启动酶均可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为DRR019A)；
所述链霉亲和素包被的磁珠可为北京思尔成生物技术有限公司的货号为142-03的M-280Tosylactivated。
所述真空吸附泵(vacuumpreptool)可为德国QIAGEN产品。
所述变性缓冲液(denatureationbuffer)可为为德国QIAGEN产品，货号为19083。
所述冲洗缓冲液(washingbuffer)可为德国QIAGEN产品，货号为19086。
上述检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质均可独立包装。
实验证明，基于本发明的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)指纹序列，可利用本发明的检测传染性造血器官坏死病毒(IHNV)指纹序列的物质通过焦磷酸测序法对传染性造血器官坏死病毒进行鉴定，其中IHNV-P可扩增出含有IHNV指纹序列的DNA片段，IHNV-S可通过焦磷酸测序法测定IHNV指纹序列的序列；本发明的IHNV-P和IHNV-S可特异识别传染性造血器官坏死病毒的核酸序列；本发明的IHNV-P具有较高的灵敏度，可识别浓度为1拷贝/μL的传染性造血器官坏死病毒。依赖于本发明的IHNV指纹序列及IHNV-P与IHNV-S的鉴定IHNV的焦磷酸测序法与普通PCR鉴定IHNV的结果是一致的，并可避免普通PCR鉴定IHNV时的假阳性的问题；常规的DNA测序技术对大片段的DNA进行序列测定速度慢、消耗大，更不易于进行大规模样本的检测，而依赖于本发明的IHNV-P与IHNV-S的鉴定IHNV的焦磷酸测序法则可克服这一缺点，可快速检测大规模样本，在4小时内即可完成检测过程。实验证明，与普通PCR鉴定IHNV相比，依赖于本发明的IHNV指纹序列及IHNV-P与IHNV-S的鉴定IHNV的焦磷酸测序法具有自动化程度高、准确性高、灵敏度高、可靠性好、重复性好、稳定性好、操作简便、耗时短、高通量、成本低的特点。
附图说明
图1为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道M为DL2000Marker；泳道1为用SVCV-P以SVCV的RNA为模板的PCR扩增产物的电泳图；泳道2为用VHSV-P以VHSV的RNA为模板的PCR扩增产物的电泳图；泳道3为用IHNV-P以IHNV的RNA为模板的PCR扩增产物的电泳图。
图2为SVCV测序结果。
图3为VHSV测序结果。
图4为IHNV测序结果。
图5为SVCV-P的特异性检测结果。其中，泳道M为DL2000Marker；泳道1的模板为SVCV；泳道2的模板为VHSV；泳道3的模板为IHNV；泳道4的模板为EHNV；泳道5的模板为HRV；泳道6的模板为IPNV；泳道7的模板为VNNV；泳道8的模板为KHV；泳道9为阴性对照。
图6为VHSV-P的特异性检测结果。其中，泳道M为DL2000Marker；泳道1的模板为VHSV；泳道2的模板为SVCV；泳道3的模板为IHNV；泳道4的模板为EHNV；泳道5的模板为HRV；泳道6的模板为IPNV；泳道7的模板为VNNV；泳道8的模板为KHV；泳道9为阴性对照。
图7为IHNV-P的特异性检测结果。其中，泳道M为DL2000Marker；泳道1的模板为IHNV；泳道2的模板为SVCV；泳道3的模板为VHSV；泳道4的模板为EHNV；泳道5的模板为HRV；泳道6的模板为IPNV；泳道7的模板为VNNV；泳道8的模板为KHV；泳道9为阴性对照。
图8为SVCV-P的灵敏度实验结果。其中，泳道M为DNA分子量Marker，各条带分子量大小从上至下依次为2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；泳道1的模板为1000拷贝/50μL的PMD18-T-SVCV；泳道2的模板为100拷贝/50μL的PMD18-T-SVCV；泳道3的模板为10拷贝/50μL的PMD18-T-SVCV；泳道4的模板为1拷贝/50μL的PMD18-T-SVCV；泳道5和6为阴性对照。
图9为VHSV-P的灵敏度实验结果。其中，泳道M为DNA分子量Marker，各条带分子量大小从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；泳道1的模板为1000拷贝/50μL的PMD18-T-VHSV；泳道2的模板为100拷贝/50μL的PMD18-T-VHSV；泳道3的模板为10拷贝/50μL的PMD18-T-VHSV；泳道4的模板为1拷贝/50μL的PMD18-T-VHSV；泳道5、6、7、8和9为阴性对照。
图10为IHNV-P的灵敏度实验结果。其中，泳道M为DNA分子量Marker，各条带分子量大小从上至下依次为2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；泳道1的模板为1000拷贝/50μL的PMD18-T-IHNV；泳道2的模板为100拷贝/50μL的PMD18-T-IHNV；泳道3的模板为10拷贝/50μL的PMD18-T-IHNV；泳道4的模板为1拷贝/50μL的PMD18-T-IHNV；泳道5和6为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的鲤春病毒血症病毒(SVCV)(付峰；刘荭；黄倢；蔡生力.鲤春病毒血症病毒(SVCV)的研究进展[J].中国水产科学，2006(02))公众可从中华人民共和国山东出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的病毒性出血性败血症病毒(VHSV)(倪穗；余晓巍；王建平等.应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV)[J].海洋与湖沼，2009(07))公众可从中华人民共和国山东出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)(岳志芹；刘荭；梁成珠等.实时定量RT-PCR检测鱼类传染性造血器官坏死病毒方法的建立与应用[J].水生生物学报，2008(01))公众可从中华人民共和国山东出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的流行性造血器官坏死病毒(EHNV)(黄辉三；李明玉；母尹楠等.流行性造血器官坏死病毒(EHNV)PCR快速检测试剂盒的研制.台湾海峡，2011(01))公众可从中华人民共和国山东出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)(徐晔；段宏安；周毅.实时荧光定量RT-PCR检测鱼类传染性胰脏坏死病病毒方法的建立.安徽农业科学，2011(11))公众可从中华人民共和国山东出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的牙鲆弹状病毒(HRV)(孙颖杰,岳志芹,刘荭等.牙鲆弹状病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用[J].华中农业大学学报,2010,29(2))公众可从中华人民共和国山东出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的病毒性神经坏死病病毒(VNNV)(刘荭；史秀杰；高隆英等.鱼病毒性神经坏死病病毒(VNNV)不同基因型鉴别方法的建立及在VNN检疫和监测中的应用.水产学报，2004(06))公众可从中华人民共和国山东出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的锦鲤疱疹病毒(KHV)(李俊超,马杰,曾令兵等.抗锦鲤疱疹病毒的植物药物筛选及其效果比较[J].淡水渔业,2014,(3):62-67)公众可从中华人民共和国山东出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pMD18-Tsimple载体为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为。
下述实施例中的链霉亲和素包被的磁珠为M-280Tosylactivated(Dynabeads品牌产品)，在北京思尔成生物技术有限公司的货号为142-03。
下述实施例中的真空吸附泵(vacuumpreptool)为德国QIAGEN产品。
下述实施例中的变性缓冲液(denatureationbuffer)为德国QIAGEN产品，货号为19083。
下述实施例中的冲洗缓冲液(washingbuffer)为德国QIAGEN产品，货号为19086。
实施例1、用于检测鲤春病毒血症病毒、病毒性出血性败血症病毒和传染性造血器官坏死病毒的引物的制备
检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)指纹序列的物质包括鲤春病毒血症病毒指纹序列的测序引物SVCV-S和扩增鲤春病毒血症病毒指纹序列的引物对SVCV-P。所述鲤春病毒血症病毒指纹序列为序列表中SEQIDNo.1的第511-526位核苷酸。所述SVCV-S为序列表中SEQIDNo.4所示的单链DNA；所述SVCV-P为由序列表中SEQIDNo.2所示的单链DNA(SVCV-P-F)和SEQIDNo.3所示的单链DNA(SVCV-P-R)组成的引物对，所述SVCV-P-R的5′端有生物素标记，SVCV-P的扩增产物为序列表中SEQIDNo.1的第454-591位核苷酸所示的DNA分子，扩增产物为138bp。其中，SEQIDNo.1为鲤春病毒血症病毒G基因的DNA序列(NCBI中的登录号为AJ318079.1)。
检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)指纹序列的物质包括病毒性出血性败血症病毒指纹序列的测序引物VHSV-S和扩增病毒性出血性败血症病毒指纹序列的引物对VHSV-P。所述病毒性出血性败血症病毒指纹序列为序列表中SEQIDNo.5的第451-467位核苷酸。所述VHSV-S为序列表中SEQIDNo.8所示的单链DNA；所述VHSV-P为由序列表中SEQIDNo.6所示的单链DNA(VHSV-P-F)和SEQIDNo.7所示的单链DNA(VHSV-P-R)组成的引物对，所述VHSV-P-R的5′端有生物素标记，VHSV-P的扩增产物为序列表中SEQIDNo.5的第427-631位核苷酸所示的DNA分子，扩增产物为205bp。其中，SEQIDNo.5为病毒性出血性败血症病毒G基因的DNA序列(NCBI中的登录号为AB672616.1)。
检测传染性造血器官坏死病毒(IHNV)指纹序列的物质包括传染性造血器官坏死病毒指纹序列的测序引物IHNV-S和扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对IHNV-P。所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列为序列表中SEQIDNo.9的第553-565位核苷酸。所述IHNV-S为序列表中SEQIDNo.12所示的单链DNA；所述IHNV-P为由序列表中SEQIDNo.10所示的单链DNA(IHNV-P-F)和SEQIDNo.11所示的单链DNA(IHNV-P-R)组成的引物对，所述IHNV-P-R的5′端有生物素标记，IHNV-P的扩增产物为序列表中SEQIDNo.9的第532-592位核苷酸所示的DNA分子，扩增产物为61bp。其中，SEQIDNo.9为传染性造血器官坏死病毒N基因的DNA序列(NCBI中的登录号为FJ265710.1)。
表1、SVCV、VHSV和IHNV的指纹序列和引物
实施例2、SVCV-P、VHSV-P和IHNV-P扩增条件的优化
1、重组载体的构建
将pMD18-Tsimple载体BamHⅠ和HindⅢ识别位点间的序列替换为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列(即SVCVG基因)，保持pMD18-Tsimple载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重载载体命名为PMD18-T-SVCV。
将pMD18-Tsimple载体HindⅢ和XhoⅠ识别位点间的序列替换为SEQIDNo.5所示的核苷酸序列(即VHSVG基因)，保持pMD18-Tsimple载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重载载体命名为PMD18-T-VHSV。
将pMD18-Tsimple载体HindⅢ和BamHⅠ识别位点间的序列替换为SEQIDNo.9所示的核苷酸序列(即IHNVN基因)，保持pMD18-Tsimple载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重载载体命名为PMD18-T-IHNV。
2、SVCV-P扩增条件的优化
以下述PCR扩增体系对SVCV-P的扩增条件进行优化：浓度为50ng/μl的PMD18-T-SVCV载体2μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μlTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μl的SVCV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μl的SVCV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
优化的SVCV-P扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。
3、VHSV-P扩增条件的优化
以下述PCR扩增体系对VHSV-P的扩增条件进行优化：浓度为50ng/μL的PMD18-T-VHSV载体2μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为50ng/μL的VHSV-P-F0.5μL，浓度为50ng/μL的VHSV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
优化的VHSV-P扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。
4、IHNV-P扩增条件的优化
以下述PCR扩增体系对IHNV-P的扩增条件进行优化：浓度为50ng/μL的PMD18-T-IHNV载体2μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为50ng/μL的IHNV-P-F0.5μL，浓度为50ng/μL的IHNV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
优化的IHNV-P扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。
实施例3、焦磷酸测序法鉴定SVCV、VHSV和IHNV
提取SVCV、VHSV和IHNV的RNA，分别得到浓度均为40ng/μL的SVCV总RNA、VHSV总RNA和IHNV总RNA。
1、焦磷酸测序法鉴定SVCV
1.1PCR扩增
50μLPCR扩增体系：浓度为40ng/μL的SVCV总RNA2μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的SVCV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的SVCV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。
将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，结果表明，PCR扩增得到了138bp的PCR产物。
1.2焦磷酸测序
将50μL步骤1.1的PCR产物与200μg的链霉亲和素包被的磁珠混合后，在室温(25℃)下孵育20分钟。用真空吸附泵(vacuumpreptool)将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后依次在70％乙醇中清洗5s，在变性缓冲液(denatureationbuffer)中清洗5s，在冲洗缓冲液(washingbuffer)中清洗10s，最后放入含有测序引物SVCV-S的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。
测序反应在28℃下自动在PYROMARKID仪器上检测，加样使用600mbar/8msec的加样压力和时间，每轮反应时间65秒。引物链随着不同dNTP的加入而延伸。随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列(图2)。经PyrosequencingTMIdentifireSoftware分析，所测序列包含SVCV指纹序列“TGGGGGCGAATGCAGA”
结果表明，SVCV指纹序列、SVCV-P及SVCV-S可用来鉴定SVCV。
2、焦磷酸测序法鉴定VHSV
2.1PCR扩增
50μLPCR扩增体系：浓度为40ng/μL的VHSV总RNA2μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的VHSV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的VHSV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。
将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，结果表明，PCR扩增得到了205bp的PCR产物。
2.2焦磷酸测序
按照步骤1的1.2的焦磷酸测序，将步骤1.1的PCR产物替换为步骤2.1的PCR产物，其他步骤不变，得到VHSV的焦磷酸测序结果(图3)。经PyrosequencingTMIdentifireSoftware分析，所测序列包含VHSV指纹序列“TCCTGCATTTGGATGAA”。
结果表明，VHSV指纹序列、VHSV-P及VHSV-S可用来鉴定VHSV。
3、焦磷酸测序法鉴定IHNV
3.1PCR扩增
50μLPCR扩增体系：浓度为40ng/μL的IHNV总RNA2μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的IHNV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的IHNV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。
将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，结果表明，PCR扩增得到了61bp的PCR产物。
3.2焦磷酸测序
按照步骤1的1.2的焦磷酸测序，将步骤1.1的PCR产物替换为步骤3.1的PCR产物，其他步骤不变，得到IHNV的焦磷酸测序结果(图4)。经PyrosequencingTMIdentifireSoftware分析，所测序列包含IHNV指纹序列“GGACAGAAGCTCA”。
结果表明，IHNV指纹序列、IHNV-P及IHNV-S可用来鉴定IHNV。
实施例4、SVCV-P与SVCV-S、VHSV-P与VHSV-S、IHNV-P与IHNV-S的特异性实验
提取流行性造血器官坏死病毒(EHNV)和锦鲤疱疹病毒(KHV)的DNA，得到浓度均为40ng/μL的EHNV总DNA和KHV总DNA，提取传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、牙鲆弹状病毒(HRV)和病毒性神经坏死病毒(VNNV)的RNA，分别得到浓度均为40ng/μL的IPNV总RNA、HRV总RNA和VNNV总RNA。
1、SVCV-P与SVCV-S的特异性
1.1PCR扩增
50μLPCR扩增体系：实施例3的SVCV总RNA2μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的SVCV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的SVCV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后得到SVCV的PCR产物。
按照上述方法，将实施例3的SVCV总RNA分别替换为实施例3的VHSV总RNA、IHNV总RNA及上述EHNV总DNA、IPNV总RNA、HRV总RNA、VNNV总RNA和KHV总DNA，其他步骤均不变，分别得到VHSV的PCR产物、IHNV的PCR产物、EHNV的PCR产物、IPNV的PCR产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物。
将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳(图5)，结果表明，只有SVCV的PCR产物中有138bp的条带，表明SVCV-P只有以SVCV的RNA为模板才能扩出目的条带。
1.2焦磷酸测序
按照实施例3步骤1中1.2的焦磷酸测序的方法，分别以SVCV-S为测序引物对本实施例步骤1的1.1得到的SVCV的PCR产物、VHSV的PCR产物、IHNV的PCR产物、EHNV的PCR产物、IPNV的PCR产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物进行测序。结果显示，只有SVCV的PCR产物的测序结果有如图2所示的测序峰型，其余的PCR产物均没有图2所示的测序峰型，表明只有SVCV的PCR产物含有SVCV指纹序列，其余的PCR产物均不含SVCV指纹序列。
结果表明，SVCV-P及SVCV-S可特异识别SVCV。
2、VHSV-P与VHSV-S的特异性
2.1PCR扩增
50μLPCR扩增体系：实施例3的VHSV总RNA2μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的VHSV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的VHSV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后得到VHSV的PCR产物。
按照上述方法，将实施例3的VHSV总RNA分别替换为实施例3的SVCV总RNA、IHNV总RNA及上述EHNV总DNA、IPNV总RNA、HRV总RNA、VNNV总RNA和KHV总DNA，其他步骤均不变，分别得到SVCV的PCR产物、IHNV的PCR产物、EHNV的PCR产物、IPNV的PCR产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物。
将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳(图6)，结果表明，只有VHSV的PCR产物中有205bp的条带，表明VHSV-P只有以VHSV的RNA为模板才能扩出目的条带。
2.2焦磷酸测序
按照实施例3步骤1中1.2的焦磷酸测序的方法，分别以VHSV-S为测序引物对本实施例步骤2的2.1得到的VHSV的PCR产物、SVCV的PCR产物、IHNV的PCR产物、EHNV的PCR产物、IPNV的PCR产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物进行测序。结果显示，只有VHSV的PCR产物的测序结果有如图3所示的测序峰型，其余的PCR产物均没有图3所示的测序峰型，表明只有VHSV的PCR产物含有VHSV指纹序列，其余的PCR产物均不含VHSV指纹序列。
结果表明，VHSV-P及VHSV-S可特异识别VHSV。
3、IHNV-P与IHNV-S的特异性
3.1PCR扩增
50μLPCR扩增体系：实施例3的IHNV总RNA2μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的IHNV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的IHNV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后得到IHNV的PCR产物。
按照上述方法，将实施例3的IHNV总RNA分别替换为实施例3的SVCV总RNA、VHSV总RNA及上述EHNV总DNA、IPNV总RNA、HRV总RNA、VNNV总RNA和KHV总DNA，其他步骤均不变，分别得到SVCV的PCR产物、VHSV的PCR产物、EHNV的PCR产物、IPNV的PCR产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物。
将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳(图7)，结果表明，只有IHNV的PCR产物中有61bp的条带，表明IHNV-P只有以IHNV的RNA为模板才能扩出目的条带。
3.2焦磷酸测序
按照实施例3步骤1中1.2的焦磷酸测序的方法，分别以IHNV-S为测序引物对本实施例步骤3的3.1得到的IHNV的PCR产物、SVCV的PCR产物、VHSV的PCR产物、EHNV的PCR产物、IPNV的PCR产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物进行测序。结果显示，只有IHNV的PCR产物的测序结果有如图4所示的测序峰型，其余的PCR产物均没有图4所示的测序峰型，表明只有IHNV的PCR产物含有IHNV指纹序列，其余的PCR产物均不含IHNV指纹序列。
结果表明，IHNV-P及IHNV-S可特异识别IHNV。
实施例5、SVCV-P、VHSV-P和IHNV-P的灵敏度实验
1、SVCV-P的灵敏度
将实施例2步骤1的重载载体PMD18-T-SVCV用DEPC水进行稀释，分别得到1000拷贝/μL的PMD18-T-SVCV、100拷贝/μL的PMD18-T-SVCV、10拷贝/μL的PMD18-T-SVCV和1拷贝/μL的PMD18-T-SVCV。
50μLPCR扩增体系：1000拷贝/μL的PMD18-T-SVCV1μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的SVCV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的SVCV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后得到SVCV的1000拷贝PCR产物。
按照上述方法，将1000拷贝/μL的PMD18-T-SVCV分别替换为100拷贝/μL的PMD18-T-SVCV、10拷贝/μL的PMD18-T-SVCV、1拷贝/μL的PMD18-T-SVCV和DEPC水，其他步骤均不变，分别得到SVCV的100拷贝PCR产物、SVCV的10拷贝PCR产物、SVCV的1拷贝PCR产物和阴性对照PCR产物。
将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳(图8)，结果显示，SVCV的1000拷贝PCR产物、SVCV的100拷贝PCR产物、SVCV的10拷贝PCR产物和SVCV的1拷贝PCR产物中均有138bp的条带，阴性对照PCR产物中无该条带，表明，SVCV-P最低能检测到浓度为1拷贝/μL的SVCV，说明SVCV-P最低能检测到浓度为1个SVCV基因组拷贝数/μL(即3fgSVCV基因组/μL)。
2、VHSV-P的灵敏度
将实施例2步骤1的重载载体PMD18-T-VHSV用DEPC水进行稀释，分别得到1000拷贝/μL的PMD18-T-VHSV、100拷贝/μL的PMD18-T-VHSV、10拷贝/μL的PMD18-T-VHSV和1拷贝/μL的PMD18-T-VHSV。
50μLPCR扩增体系：1000拷贝/μL的PMD18-T-VHSV1μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的VHSV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的VHSV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后得到VHSV的1000拷贝PCR产物。
按照上述方法，将1000拷贝/μL的PMD18-T-VHSV分别替换为100拷贝/μL的PMD18-T-VHSV、10拷贝/μL的PMD18-T-VHSV、1拷贝/μL的PMD18-T-VHSV和DEPC水，其他步骤均不变，分别得到VHSV的100拷贝PCR产物、VHSV的10拷贝PCR产物、VHSV的1拷贝PCR产物和阴性对照PCR产物。
将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳(图9)，结果显示，VHSV的1000拷贝PCR产物、VHSV的100拷贝PCR产物、VHSV的10拷贝PCR产物和VHSV的1拷贝PCR产物中均有205bp的条带，阴性对照PCR产物中无该条带，表明，VHSV-P最低能检测到浓度为1拷贝/μL的VHSV，说明VHSV-P最低能检测到浓度为1个VHSV基因组拷贝数/μL(即5fgVHSV基因组/μL)。
3、IHNV-P的灵敏度
将实施例2步骤1的重载载体PMD18-T-IHNV用DEPC水进行稀释，分别得到1000拷贝/μL的PMD18-T-IHNV、100拷贝/μL的PMD18-T-IHNV、10拷贝/μL的PMD18-T-IHNV和1拷贝/μL的PMD18-T-IHNV。
50μLPCR扩增体系：1000拷贝/μL的PMD18-T-IHNV1μL，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的IHNV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的IHNV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后得到IHNV的1000拷贝PCR产物。
按照上述方法，将1000拷贝/μL的PMD18-T-IHNV分别替换为100拷贝/μL的PMD18-T-IHNV、10拷贝/μL的PMD18-T-IHNV、1拷贝/μL的PMD18-T-IHNV和DEPC水，其他步骤均不变，分别得到IHNV的100拷贝PCR产物、IHNV的10拷贝PCR产物、IHNV的1拷贝PCR产物和阴性对照PCR产物。
将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳(图10)，结果显示，IHNV的1000拷贝PCR产物、IHNV的100拷贝PCR产物、IHNV的10拷贝PCR产物和IHNV的1拷贝PCR产物中均有61bp的条带，阴性对照PCR产物中无该条带，表明，IHNV-P最低能检测到浓度为1拷贝/μL的IHNV，说明IHNV-P最低能检测到浓度为1个IHNV基因组拷贝数/μL(即6fgIHNV基因组/μL)。
实施例6、依赖于SVCV-P与SVCV-S、VHSV-P与VHSV-S、IHNV-P与IHNV-S鉴定SVCV、VHSV、IHNV的焦磷酸测序法与普通PCR鉴定SVCV、VHSV、IHNV的比较
1、样品采集
分别从山东烟台、山东莱州、山东龙口、山东青岛、广东深圳、上海、福建、江苏采集不同品种的鱼的心、脾、肾、脑组织，共40个样品，即样品1-40，分别提取RNA，分别得到样品1-40的总RNA，这40份样品的总RNA的浓度均为40ng/μL。
2、焦磷酸测序法鉴定SVCV、VHSV和IHNV
2.1焦磷酸测序法鉴定SVCV
按照如下PCR扩增体系进行焦磷酸测序法鉴定SVCV的PCR扩增：步骤1的样品总RNA2μL(每个体系中加入一个样品的总RNA)，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的SVCV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的SVCV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件均为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的SVCVPCR产物。
按照实施例3步骤1中1.2的焦磷酸测序的方法，分别以SVCV-S为测序引物对样品1-40的SVCVPCR产物进行测序。结果显示(表2)，样品4、10、12、15、21、23和39的SVCVPCR产物中均含有SVCV指纹序列，其余的PCR产物均不含SVCV指纹序列，表明样品4、10、12、15、21、23和39均含有SVCV，其余的样品均不含SVCV。
2.2焦磷酸测序法鉴定VHSV
按照如下PCR扩增体系进行焦磷酸测序法鉴定VHSV的PCR扩增：步骤1的样品总RNA2μL(每个体系中加入一个样品的总RNA)，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的VHSV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的VHSV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件均为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的VHSVPCR产物。
按照实施例3步骤1中1.2的焦磷酸测序的方法，分别以VHSV-S为测序引物对样品1-40的VHSVPCR产物进行测序。结果显示(表2)，样品37的VHSVPCR产物中含有VHSV指纹序列，其余的PCR产物均不含VHSV指纹序列，表明样品37含有VHSV，其余的样品均不含VHSV。
2.3焦磷酸测序法鉴定IHNV
按照如下PCR扩增体系进行焦磷酸测序法鉴定IHNV的PCR扩增：步骤1的样品总RNA2μL(每个体系中加入一个样品的总RNA)，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的IHNV-P-F0.5μL，浓度为10pmol/μL的IHNV-P-R0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件均为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的IHNVPCR产物。
按照实施例3步骤1中1.2的焦磷酸测序的方法，分别以IHNV-S为测序引物对样品1-40的IHNVPCR产物进行测序。结果显示(表2)，样品17、19、27、32和34的VHSVPCR产物中均含有IHNV指纹序列，其余的PCR产物均不含IHNV指纹序列，表明样品17、19、27、32和34均含有IHNV，其余的样品均不含IHNV。
3、普通PCR鉴定SVCV、VHSV和IHNV
3.1普通PCR鉴定SVCV
按照如下PCR扩增体系鉴定SVCV：步骤1的样品总RNA2μL(每个体系中加入一个样品的总RNA)，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的正向引物(正向引物的序列为5’-TCT-TGG-AGC-CAA-ATA-GCT-CAR-RTC-3’(R表示A/G))0.5μL，浓度为10pmol/μL的反向引物(反向引物的序列为5’-AGA-TGG-TAT-GGA-CCC-CAA-TAC-ATH-ACN-CAY-3’(H表示A/C/T；N表示A/C/G/T；Y表示C/T))0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的SVCVPCR产物。
将样品1-40的SVCVPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，样品4、10、12、15、21、23和39的SVCVPCR产物中均含有目的条带，表明，样品4、10、12、15、21、23和39均含有SVCV。
3.2普通PCR鉴定VHSV
按照如下PCR扩增体系鉴定VHSV：步骤1的样品总RNA2μL(每个体系中加入一个样品的总RNA)，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的正向引物(正向引物的序列为5’-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3’)0.5μL，浓度为10pmol/μL的反向引物(反向引物的序列为5’-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3’)0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的VHSVPCR产物。
将样品1-40的VHSVPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳结果显示，样品37的VHSVPCR产物中含有目的条带，表明，样品37含有VHSV。
3.3普通PCR鉴定IHNV
按照如下PCR扩增体系鉴定IHNV：步骤1的样品总RNA2μL(每个体系中加入一个样品的总RNA)，5×PCRbuffer10μL，5U/μLTaq热启动酶0.25μL，浓度为10pmol/μL的正向引物(正向引物的序列为5’-AGA-GAT-CCCTAC-ACC-AGA-GAC-3’)0.5μL，浓度为10pmol/μL的反向引物(反向引物的序列为5’-GGT-GGT-GTT-GTTTCC-GTG-CAA-3’)0.5μL，DEPC水补足体积至50μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，50次循环；72℃延伸10min，4℃结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的IHNVPCR产物。
将样品1-40的IHNVPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，样品17、19、27、32和34的IHNVPCR产物中均含有目的条带，表明，样品17、19、27、32和34均含有IHNV。
表2、焦磷酸测序法与普通PCR鉴定SVCV、VHSV和IHNV的结果比较
注：表2中，“—”表示待测样品不含SVCV、VHSV和IHNV。
实验结果表明，依赖于SVCV-P与SVCV-S、VHSV-P与VHSV-S、IHNV-P与IHNV-S鉴定SVCV、VHSV、IHNV的焦磷酸测序法与普通PCR鉴定SVCV、VHSV、IHNV的结果是一致的。普通PCR鉴定SVCV时样品10的条带较弱，普通PCR鉴定IHNV时样品17的条带较弱，普通PCR鉴定IHNV时样品37的条带较弱，较难辨别，而本发明的依赖于SVCV-P与SVCV-S、VHSV-P与VHSV-S、IHNV-P与IHNV-S鉴定SVCV、VHSV、IHNV的焦磷酸测序法则可以避免这一问题。

Claims (10)

1.检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质在制备基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂或试剂盒中的应用；所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列为序列表中SEQIDNo.9的第553-565位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质包括传染性造血器官坏死病毒指纹序列的测序引物和/或扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对。
3.基于焦磷酸测序的传染性造血器官坏死病毒检测试剂或试剂盒，包括检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质；所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列为序列表中SEQIDNo.9的第553-565位核苷酸。
4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质包括传染性造血器官坏死病毒指纹序列的测序引物和/或扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对。
5.根据权利要求2所述的应用或权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述测序引物为名称为IHNV-S的序列表中SEQIDNo.12所示的单链DNA；所述扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对为名称为IHNV-P的由序列表中SEQIDNo.10所示的单链DNA和SEQIDNo.11所示的单链DNA组成的引物对。
6.权利要求4或5所述的试剂或试剂盒的制备方法，包括将所述测序引物和/或所述扩增传染性造血器官坏死病毒指纹序列的引物对的两条单链DNA独立包装的步骤。
7.权利要求1-5中任一所述的检测传染性造血器官坏死病毒指纹序列的物质。
8.传染性造血器官坏死病毒的检测方法，包括下述H1)和H2)的步骤：
H1)以待测生物样品的核酸为模板，选用54℃的退火温度，用权利要求5所述IHNV-P进行PCR扩增得到PCR产物；
H2)检测步骤H1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有61bp的DNA片段，所述待测样品含有传染性造血器官坏死病毒或候选含有传染性造血器官坏死病毒；如果所述PCR产物中不含61bp的DNA片段，所述待测样品不含传染性造血器官坏死病毒或候选不含传染性造血器官坏死病毒。
9.传染性造血器官坏死病毒的检测方法，包括下述H3)和H4)的步骤：
H3)以待测生物样品的核酸为模板，选用54℃的退火温度，用权利要求5所述IHNV-P进行PCR扩增得到PCR产物；
H4)检测步骤H3)得到的PCR产物，如果所述PCR产物中含有权利要求1或3所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列，所述待测样品含有传染性造血器官坏死病毒或候选含有传染性造血器官坏死病毒；如果所述PCR产物中不含权利要求1或3所述传染性造血器官坏死病毒指纹序列，所述待测样品不含传染性造血器官坏死病毒或候选不含传染性造血器官坏死病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述检测步骤H3)得到的PCR产物为以权利要求5所述IHNV-S为测序引物进行焦磷酸测序。
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