CN110592290B - 一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒，其包括实时荧光定量RT‑PCR反应体系，所述实时荧光定量RT‑PCR反应体系包括一对引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针包括序列如SEQ ID NO.3所示的核酸、荧光报告基团和荧光淬灭基团。本发明还提供了一种非诊断目的的检测猫杯状病毒的方法、引物对、探针及其应用。利用本发明的试剂盒、引物对、探针或者检测方法检测猫杯状病毒时，特异性高、重复性好的同时灵敏度更高，所得达到的最低检测限近乎接近现有技术中检测猫杯状病毒的最高水平，操作简单快速、准确，安全无污染。

Description

一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒及检测方法，本发明还涉及一种引物对、探针及其应用。

背景技术

猫杯状病毒（Feline Calicivirus，FCV）属于杯状病毒科（Calicivirudae）疱疹病毒属（Vesivirus）。猫感染该病毒后，主要表现为上呼吸道症状，部分病例伴有跛行和全身性疾病。FCV不仅可以感染猫，也可感染虎、狮等野生猫科动物，是流行于猫科动物中的一种重要的病原。最新研究发现，从犬身上分离出了猫杯状病毒，在一个研究中发现猫杯状病毒可以感染猫和犬。与此同时，猫源的杯状病毒能引起犬的感染。目前，欧洲、美洲、亚洲大多数国家和地区具有FCV的相关报道。

FCV的主要传染源是带毒猫和临床康复猫，感染后发病率较高，但死亡率一般较低。通常死亡的以幼猫为主，病毒感染引起的并发症和免疫系统不健全是其死亡的主要原因，成年猫感染该病毒后一般可以耐过。然而，近期一些报道认为，FCV这种RNA病毒的致病性呈逐渐增强趋势。近几年来，FCV强毒变异株不断爆发，不仅会引起上呼吸道疾病，还可引起脾脏、肝脏的病变，更严重者还可引起致命的全身性疾病（Virulent systemic disease，VSD）。FCV通过口、鼻、结膜感染宠物猫，由于病毒的组织嗜性和致病性，该病毒主要在口腔和呼吸系统中复制增殖，此外在内脏组织、粪便、尿液中也可以被检测到。

感染FCV的猫出现明显的症状，绝大多数猫感染30天内可通过喉咙排毒，超出30天仍向外界排毒的猫成为病毒的携带者。FCV可以在室温、干燥的环境中生存数周，在没有放射性的条件下可以生存更久，病毒通过污染环境而进行间接传播。特别是在密闭的笼舍中，分泌物通过污染猫笼饲料、清洁用具和饲养人员进行传播。

疫苗免疫可以在一定程度上控制猫杯状病毒的感染。但由于疫苗株与各国野毒株的交叉免疫保护反应逐渐变弱，使疫苗免疫保护效率降低，该病发病率升高。

FCV、猫疱疹病毒（FHV）与猫传染性鼻支气管炎（FHV-1）经常发生混合感染。此时，根据临床情况很难进行准确的诊断，而使用实验室方法更能准确的进行确诊，目前实验室诊断FCV的方法有：免疫扩散、病毒分离鉴定、免疫荧光、PCR、ELISA、电镜镜检等。其中临床常用的检测方法为RT–PCR。PCR技术因其敏感性高、特异性强、费用较低等优点已成为一种经典的检测方法，广泛应用于猫杯状病毒的检测。荧光TaqMan技术的基本原理是利用Taq酶的5’外切酶活性，合成一个能与PCR产物杂交的探针，一般情况下，该探针的5’端标记荧光报告基团(R)，3’端标记荧光淬灭基团。探针在无特异性PCR发生时，3’端荧光淬灭基团能够吸收或抑制5’端荧光报告基团(R)发出的荧光，荧光信号不改变；当有特异性PCR发生时，探针会在PCR过程中被Taq酶的5’—>3’的外切酶活性作用切断（切口平移效应），荧光淬灭基团的抑制作用消失，从而引起报告基团荧光信号的增长。切出的荧光报告基团与PCR产物的数目是一对一的，随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光报告基团不断积累。利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。一般来说，实时荧光定量PCR法的灵敏度比普通RT-PCR（逆转录PCR）高100倍。

针对FCV的检测，荧光定量PCR是近年来被采用的一种新技术，2013年姜雪等（姜雪, 高玉伟, 胡桂学,等.猫杯状病毒荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用[J]. 吉林大学学报（理学版）, 2013, 51(5):973-977）针对FCV的ORF2建立了荧光定量PCR的检测方法，检测到的最低浓度为2.26×10¹ 拷贝/μL。此外，现有技术还有针对FCV的ORF1设计引物和探针的报道（Development and validation of a TaqMan real-time reversetranscription-PCR for rapid detection of feline calicivirus），然而其最低检测限仅约为70拷贝/μL。虽然各研究小组已建立了不同的FCV实验室检测方法，也成功得到了部分国家地区的FCV流行情况数据，但到目前为止仅有极少数商品化荧光RT（ReverseTranscription）-PCR检测试剂盒可供使用，且灵敏度均较低，大范围的临床检测仍有困难。基于此，需要建立一种快速、灵敏、特异性强的荧光定量PCR检测方法，并使其成为掌握FCV流行病学资料的一个重要手段显得尤其必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服目前对猫杯状病毒（FCV）的检测的灵敏度低等缺陷，而提供一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒、引物对、探针以及检测方法、应用。本发明的引物对、探针用于检测猫杯状病毒时，特异性高、重复性好的同时灵敏度更高，所得达到的最低检测限近乎接近现有技术中检测猫杯状病毒的最高水平；将其用于制备检测猫杯状病毒的试剂或试剂盒时，对样品中含微量FCV基因组的检测效果良好，可用于FCV的实验室检测和分子流行病学调查以及大范围的临床检测。利用本发明的试剂盒、引物对、探针或者检测方法检测猫杯状病毒时，操作简单快速、准确，安全无污染。

本发明中，在FCV本身变异很大、设计引物探针难度增大的情况下，发明人通过大量实验摸索，意外性地设计了特异性极强的引物和探针，结合RT-PCR的优势，其检测病毒的灵敏度大大提高，近乎接近现有技术中检测猫杯状病毒的最高水平（在本发明某一较佳实施例中，其最低检测限低至7.6拷贝/μL，比现有荧光定量RT-PCR（荧光定量逆转录PCR）技术的灵敏度高达3倍）。此外，本发明人还进一步优化了反应体系和反应程序，使得操作更简便、配制试剂更简单、反应时间大大缩短，节省了约30min。

为了解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒，其包括实时荧光定量RT-PCR（real-time fluorescent quantitativereversetranscription-polymerase chain reaction，FQ RT-PCR，实时荧光定量反转录聚合酶链式反应）反应体系，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系包括一对引物对和探针，

所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，

所述探针包括序列如SEQ ID NO. 3所示的核酸、荧光报告基团和荧光淬灭基团。

较佳地，所述荧光报告基团为FAM（5-羧基荧光素）、HEX、VIC或Cy5。

较佳地，所述荧光淬灭基团优选为TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3。

较佳地，所述荧光报告基团位于所述探针的核酸序列的5’末端，所述荧光淬灭基团位于所述探针的核酸序列的3’末端。

在本发明某一较佳实施例中，所述探针为5’-FAM- CCTGGGCTCTTCGCCGTCACC -TAMRA-3’。

此外，为提高扩增效率，本发明可以进一步优化所述实时荧光定量RT-PCR反应体系，例如：

较佳地，所述引物对的浓度分别为200~400 nM。

较佳地，所述探针的浓度为200~400 nM。

在本发明某一较佳实施例中，所述引物的浓度为200 nM/反应，和所述探针的浓度为400 nM/反应。

较佳地，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系还包括RT-PCR反应液和酶混合液，所述RT-PCR反应液包括Mg²⁺、dNTP和PCR反应缓冲液，所述酶混合液包括逆转录酶（RT酶）、热启动Taq酶和RNA酶抑制剂（RNasin）；

本发明中，所述dNTP（2’-脱氧核糖核苷三磷酸）为本领域常规，通常是包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP等在内的统称，N通常指代A、T、G、C等中的一种，A、T、G、C分别指代本领域常规的碱基。

更佳地，所述Mg²⁺的浓度为1~2.5 mmol/L，优选2.0 mmol/L；

更佳地，所述dNTP的浓度为0.1~0.25mmol/L，优选0.2 mmol/L；

更佳地，所述PCR反应缓冲液为2×一步法RT-PCR缓冲液（One Step RT-PCRBuffer）（无Mg²⁺）；

更佳地，所述逆转录酶的用量为0.5~2 U/反应；

更佳地，所述热启动Taq酶的用量为0.1~0.5 U/反应；

更佳地，所述RNA酶抑制剂的用量为1~3 U/反应。

在本发明某一较佳实施例中，使用上述优化的反应体系，即一步法反应体系并且配合本发明第四方面所述的实时荧光定量RT-PCR的反应程序设置时间，比现有技术（姜雪,高玉伟, 胡桂学,等.猫杯状病毒荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用[J]. 吉林大学学报（理学版）, 2013, 51(5):973-977.）等报道的荧光RT-PCR的二步法反应体系更简单、试剂配制更方便，反应时间更短，约节省30 min。该实施例中采用Taqman探针法，在闭管状态下进行扩增反应及产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性。且PCR后无需后续处理，安全无污染。

本领域技术人员应当理解地是，本发明的引物对和/或探针在一步法或者二步法的反应体系中均可使用。

较佳地，所述试剂盒包括独立包装试剂，每份所述独立包装试剂由0.5 μL 10 μM的上游引物和0.5 μL 10 μM的下游引物、1 μL 10 μM的探针、RT-PCR反应液和酶混合液组成，所述RT-PCR反应液由10 μL 2×一步法RT-PCR缓冲液、2 μL 25 mM 的MgCl₂、1 μL10 mM的dNTP和2 μL DEPC-H₂O组成，所述酶混合液由1 μL 40 U/μL的RNA酶抑制剂、1 μL 25 U/μL的逆转录酶和1 μL 5 U/μL的Taq酶组成；所述试剂盒优选包括48份的独立包装试剂。一般情况下，对应于上述独立包装试剂的实时荧光定量RT-PCR反应体系可以为25 μL的反应体系。

较佳地，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照；所述阳性对照优选为含有FCV ORF1基因序列的重组质粒；质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列优选为SEQ ID NO. 1 和SEQ ID NO. 2。所述阳性对照的浓度优选为7.6×10⁵拷贝/μL；所述阴性对照优选为去离子水，例如DEPC-H₂O。

较佳地，所述试剂盒还包括提取待检测样品的总RNA的试剂；所述试剂优选包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H₂O；所述样品裂解液优选为Trizol，所述DEPC-乙醇优选为质量百分数为75%的DEPC-乙醇。

较佳地，所述检测的待检样品为来自猫科动物或犬科动物的猫杯状病毒，优选为来自猫科动物或犬科动物的口、鼻、结膜、内脏组织、粪便和/或尿液的样品；所述猫科动物优选为猫、豹、虎或狮；所述犬科动物优选为犬。

较佳地，所述试剂盒还可以包括使用说明书，其用来说明使用所述试剂盒组分来实施主题方法的说明书。用于实行主题方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基材上，例如纸或塑料等。因此，说明书可以作为包装说明书存在于试剂盒中、在试剂盒的容器或其组件的标签中（即，与包装或者子包装相关联）等。在其他实施例中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质（例如，CD-ROM、磁盘等）上的电子存储数据文件存在。在其他实施例中，实际上的说明书还可以是不存在于试剂盒中，但提供了用于从远程来源（例如，通过互联网）获得说明书的装置。该实施例的示例是包括网址的试剂盒，其中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，这种用于获得说明书的装置记录在合适的基质上。

为了解决上述技术问题，本发明的第二方面提供了一种用于检测猫杯状病毒的引物对和/或探针，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示；和/或，所述探针包括序列如SEQ ID NO. 3所示的核酸、荧光报告基团和荧光淬灭基团。

荧光报告基团和荧光淬灭基团均可为本领域常规，较佳地，所述荧光报告基团为FAM（5-羧基荧光素）、HEX、VIC或Cy5；和/或，所述荧光淬灭基团优选为TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3。

较佳地，所述荧光报告基团位于所述探针的核酸序列的5’末端，所述荧光淬灭基团位于所述探针的核酸序列的3’末端。

较佳地，所述检测为实时荧光定量RT-PCR检测。

较佳地，所述检测的待检样品为来自猫科动物或犬科动物的猫杯状病毒，优选为来自猫科动物或犬科动物的口、鼻、结膜、内脏组织、粪便和/或尿液的样品；所述猫科动物优选为猫、豹、虎或狮；所述犬科动物优选为犬。例如，可以采集其鼻拭（子）样品。

为了解决上述技术问题，本发明的第三方面提供了如本发明第二方面所述的引物对和/或探针在制备检测猫杯状病毒的试剂或试剂盒中的应用。

较佳地，所述试剂盒为实时荧光定量RT-PCR试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明的第四方面提供了一种非诊断目的的检测猫杯状病毒的方法，其包括如下步骤：

1）以待检样品的总RNA为模板，利用如本发明第一方面所述试剂盒中的实时荧光定量RT-PCR反应体系或者利用如本发明第二方面所述的引物对和/或探针进行实时荧光定量RT-PCR反应；

2）分析检测结果。

较佳地，步骤1）中所述待检样品的总RNA通过使用RNA提取试剂提取待检样品的总RNA获得；所述RNA提取试剂优选包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H₂O；所述样品裂解液优选为Trizol，所述DEPC-乙醇优选为质量百分数为75%的DEPC-乙醇。

较佳地，步骤1）中所述实时荧光定量RT-PCR反应体系的反应程序为：

（1）42~50℃逆转录10~15 min；（2）94~95℃ 10~15 min；（3）94~95 ℃ 10~15 s；（4）55~60 ℃ 35~60 s；（3）-（4）循环40~45次。

较佳地，步骤1）所述的荧光RT-PCR反应的反应过程为：分别取引物探针混合液1~3μL、RT-PCR 反应液14~16 μL、酶混合液（Enzyme Mix）2~4 μL 配制成17~22 μL反应体系，再加入2~8 μL步骤（1）所得的RNA。将FCV阳性质粒作为阳性对照样品，DEPC-H₂O作为阴性对照样品，与待检样品RNA同时进行荧光RT-PCR反应；

步骤（3）所述的分析检测结果的操作过程可为本领域常规，较佳地，所述的分析检测结果的操作过程如下：反应结束后，当阳性对照呈典型的S型扩增曲线，阴性对照无扩增曲线时，判定检测反应成立；若检测样品也出现S型扩增曲线或扩增曲线有明显指数增长期，则判定为检测阳性，否则判定为阴性。

本发明的一较佳实例中提供了一种用于检测FCV的试剂盒，其包括：

（1）RNA提取试剂，包括：

样品裂解液管：Trizol 750 μL；氯仿管：氯仿200 μL；75%乙醇管：75% DEPC-乙醇800 μL；异丙醇管：异丙醇 600 μL；DEPC-H₂O管：11 μL；以上为适合提取1个样本的总RNA的试剂用量；所述的RNA提取试剂一般需要在4 ℃保存；

（2）RT-PCR反应体系，包括：

引物探针混合液管：10 μM上、下游引物各0.5 μL，10 μM探针1 μL，合计2 μL；

RT-PCR反应液管：2×一步法RT-PCR缓冲液（One Step RT-PCR Buffer）（无Mg²⁺）10μL，25 mM MgCl₂ 2 μL，10 mM dNTP 1 μL，DEPC-H₂O 2 μL，合计15 μL；

酶混合液（Enzyme Mix）管：40 U/μL RNasin 1 μL，25 U/μL RT酶1 μL，5 U/μLTaq酶1 μL，合计3 μL；

以上为单次反应的试剂用量，所述的反应体系一般需要在-20℃保存；本领域技术人员应当理解地是，所述试剂盒中一般包括以上述单次反应为基本单位的多次反应的试剂剂量。

（3）阳性对照管：浓度为7.6×10⁵ 拷贝/μL的FCV阳性质粒 5 μL；

（4）阴性对照管：DEPC-H₂O 5 μL。

上述较佳实例中，所述的2×一步法RT-PCR缓冲液（One Step RT-PCR Buffer）（无Mg²⁺）、25 mM MgCl₂、2.5 mM dNTP 混合物和Taq酶也可以使用本领域常规的试剂盒产品，如可以使用一步法荧光RT-PCR试剂盒（One Step Real Time RT-PCR Kit）替代上述几种试剂，优选TaKaRa公司产品一步法荧光RT-PCR试剂盒（One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit(Perfect Real Time)）。

本发明的一较佳实例中提供了一种非诊断目的的用于检测FCV的方法，其是一种采用实时荧光定量RT-PCR检测FCV的方法，其包括如下步骤：

（1）样品总RNA的提取；

（2）PCR反应与结果分析：分别取引物探针混合液2 μL、RT-PCR 反应液15 μL、酶混合液（Enzyme Mix）3 μL 配制成反应体系。

取阴性对照、标本和阳性对照的核酸各5 μL，分别加入反应体系中使用市售的荧光定量PCR仪（如Vii7实时荧光定量PCR）进行PCR扩增。PCR反应条件为：①42℃逆转录10min；②94℃ 15 min；③95 ℃ 15 s；④60 ℃ 45 s，③-④循环40次（收集荧光信号）。

反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线，分析实验结果。如扩增曲线有明显指数增长期，则判定为阳性（一般Ct值≤35.0），否则为阴性（一般Ct值＞35.0）。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述的试剂盒或者上述的引物对和/或探针在检测猫杯状病毒中的应用。

本发明中若无特殊说明，所提及的“浓度”均为试剂盒中各成分占整个反应体系中的浓度，例如“引物的浓度均为200~400 nM”指的是其占整个反应体系中的浓度；探针、dNTP等成分的浓度亦是如此。

如本文使用的，术语“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素，但根据上下文的理解，也包括“由……组成”的情况。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J. biol. Chem, 243, p3558(1968)中所述。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的引物对、探针用于检测猫杯状病毒时特异性高、重复性好的同时灵敏度更高，所得达到的最低检测限近乎接近现有技术中检测猫杯状病毒的最高水平（在本发明某一较佳实施例中，其最低检测限低至7.6拷贝/μL，比现有荧光定量RT-PCR（荧光定量逆转录PCR）技术的灵敏度高达3倍）；将其用于制备检测猫杯状病毒的试剂或试剂盒时，对样品中含微量FCV基因组的检测效果良好，可用于FCV的实验室检测和分子流行病学调查以及大范围的临床检测。利用本发明的试剂盒、引物对、探针或者检测方法检测猫杯状病毒时，操作简单快速、准确，安全无污染。

附图说明

图1为以引物（F1和R1）和探针P1组合的组合1的荧光RT-PCR的标准曲线结果，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5 μL 检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³拷贝/μL进行扩增，3个重复，标准品起始模板浓度与Ct值呈现良好的线性关系，斜率接近-3.52，相关系数r²为0.998。

图2为以引物（F1和R1）和探针P1组合的组合1的荧光RT-PCR的扩增曲线结果，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5 μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³ 拷贝/μL进行扩增后出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显。

图3为以引物（F2和R2）和探针P2组合的组合2的荧光RT-PCR的标准曲线结果，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5 μL 检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³拷贝/μL进行扩增，3个重复，标准品起始模板浓度与Ct值呈现较好的线性关系，斜率接近-3.34，相关系数r²为0.981。

图4为以引物（F2和R2）和探针P2组合的组合2的荧光RT-PCR的扩增曲线结果，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5 μL 检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³拷贝/μL进行扩增后出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显。

图5为以引物（F3和R3）和探针P3组合的组合3的荧光RT-PCR的标准曲线结果，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5 μL 检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³拷贝/μL进行扩增，3个重复，标准品起始模板浓度与Ct值呈现良好的线性关系，斜率接近-3.26，相关系数r²为0.985。

图6为以引物（F3和R3）和探针P3组合的组合3的荧光RT-PCR的扩增曲线结果，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5 μL 检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³ 拷贝/μL进行扩增后出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显。

图7为本发明组合1荧光RT-PCR的特异性试验结果，7份特异性参考品中，仅FCV疫苗株的扩增曲线为S型扩增曲线，其他6份特异性参考品的扩增曲线为平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性；6份特异性参考品分别为RV疫苗株、FHV疫苗株、FPV疫苗株、CIV、FIPV阳性样品、CDV阳性样品等猫的常见病原体。

图8为本发明组合2荧光RT-PCR的特异性试验结果，7份特异性参考品中，仅FCV疫苗株的扩增曲线为S型扩增曲线，其他6份特异性参考品的扩增曲线为平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性；6份特异性参考品分别为RV疫苗株、FHV疫苗株、FPV疫苗株、CIV、FIPV阳性样品、CDV阳性样品等猫的常见病原体。

图9为本发明组合3荧光RT-PCR的特异性试验结果，7份特异性参考品中，仅FCV疫苗株的扩增曲线为S型扩增曲线，其他6份特异性参考品的扩增曲线为平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性；6份特异性参考品分别为RV疫苗株、FHV疫苗株、FPV疫苗株、CIV、FIPV阳性样品、CDV阳性样品等猫的常见病原体。

图10为本发明组合1荧光RT-PCR的敏感性试验结果，8份灵敏度参考品中浓度为7.6×10^-1拷贝/μL的样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。浓度为7.6×10⁰ 拷贝/μL的样本扩增曲线的33 ≤ Ct ≤ 35，判为可疑，复检后Ct值仍为33 ≤ Ct ≤ 35，判为阳性；其余样本均可明确判定为阳性。

图11为本发明组合2荧光RT-PCR的敏感性试验结果，8份灵敏度参考品中浓度为7.6×10¹拷贝/μL和7.6×10⁰拷贝/μL的样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性；其余样本均可明确判定为阳性。

图12为本发明组合3荧光RT-PCR的敏感性试验结果，8份灵敏度参考品中浓度为7.6×10¹拷贝/μL和7.6×10⁰拷贝/μL的样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性；其余样本均可明确判定为阳性。

图13为某宠物医院FCV荧光RT-PCR检测图，其中，P为阳性对照；N为阴性对照；S1~S3为3份猫鼻拭样品。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中所用引物、探针由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

部分试剂和仪器来源如下：

2×一步法RT-PCR缓冲液（One Step RT-PCR Buffer）（无Mg²⁺）、25 mM MgCl₂、10mM dNTP 混合物、40 U/μL RNA酶抑制剂（RNasin）、5 U/μL Taq酶、25 U/μL RT酶、PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver 2.0 (Dye Plus)、以及一步法荧光RT-PCR试剂盒（One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time)）均购自宝生物工程（大连）有限公司；

Vii7实时荧光定量PCR为美国应用生物系统公司产品；

狂犬病毒疫苗株（RV）、猫疱疹病毒疫苗株（FHV）、杯状病毒疫苗株（FCV）、猫细小病毒疫苗株（FPV）、犬瘟热病毒疫苗株（CDV）均为荷兰英特威疫苗；FIPV（猫传染性腹膜炎病毒）购于ATCC（WSU 79-1146）；CIV（犬流感病毒）阳性样品为上海市动物疫病预防控制中心实验室保存。

实施例1 特异性引物和探针的设计

下载GenBank中FCV的所有全基因序列，用DNAstar软件中的MegAlign进行比对，选取ORF1基因中的保守序列，参照一条FCV的基因（GenBank号为KM016908）设计1对特异性引物和探针，并在NCBI中进行BLAST比对验证引物和探针的特异性。此外，为了增加引物的特异性，本发明参考密码子使用表，采用简并引物策略对3个位置上出现的两个或两个以上不同的碱基进行简并。经反复大量试验，设计出很多引物对和探针，最终得到特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合如下表1所示，按照以下序列，合成特异性荧光RT-PCR引物和探针。以DEPC-H2O稀释引物至10 μM，-20℃保存备用。

其中，Y代表核苷酸C或T，R代表A或G，D代表A、G或T。

表1中F1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，R1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示，P1中的核苷酸部分的序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示。

实施例2 反应体系的建立和优化（优化时使用的25 μL体系同下述实施例4）

1、样品的准备：构建1个含有目的扩增区域（即FCV ORF1基因）的质粒作为FCV检测的阳性对照（其制备方法见实施例5中FCV阳性质粒的制备方法部分）；以上述RV疫苗株、FHV疫苗株、FPV疫苗株、CIV（犬流感病毒）阳性样品、FIPV（猫传染性腹膜炎病毒）阳性样品、CDV（犬瘟热病毒）阳性样品作为特异性参考品；以去离子水作为阴性对照，分别用Trizol提取上述阳性对照与特异性参考品的RNA，阴性对照待用。

2、引物探针的筛选：以实施例1中设计的引物对探针分别检测上述的阳性对照与阴性对照的RNA，经反复大量试验，得到特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合（如SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 3所示）。

3、引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从100nM/反应至400 nM/反应梯度的引物和探针进行PCR反应，经多次重复试验发现引物和探针浓度在200~400 nM/反应之间均可，其中最佳的引物浓度为200 nM/反应、探针浓度为400nM/反应。

4、镁离子浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1 mmol/L至2.5 mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为2.0 mmol/L。

5、dNTP浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1 mmol/L至0.25 mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTP浓度为0.2 mmol/L。

6、热启动Taq酶用量的优化：在25 μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1 U（酶单位）至8 U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的热启动Taq酶用量为0.1~0.5 U/反应。

7、RT酶（reverse transcriptase，反转录酶）用量的优化：在25 μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1 U（酶单位）至8 U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RT酶用量为0.5~2 U/反应。

8、RNasin（RNA酶抑制剂）用量的优化：在25 μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从5 U（酶单位）至40 U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RNasin用量为1~3 U/反应。

9、反应温度的优化：根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定PCR反应条件为：（1）42℃逆转录10 min；（2）94℃ 15 min；（3）95 ℃ 15 s；（4）55~60 ℃ 45 s，（3）-（4）循环45次（收集荧光信号）。

实施例3 标准曲线的建立

将FCV阳性质粒（即实施例2中所述的FCV检测的阳性对照）DNA用分光光度计测定浓度后，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5 μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁷、7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³拷贝/μL，设置3个重复，进行扩增（扩增体系同下述实施例4），反应结束后，利用Vii7实时荧光定量PCR分析软件自动得到标准曲线。结果显示：

以引物（F1和R1）和探针P1组合的组合1建立的荧光RT-PCR方法，出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显，标准品起始模板浓度与Ct值呈现具有良好的线性范围，斜率接近-3.52，相关系数r²为0.998（见图1、2）。根据Ct值和标准曲线即可对样品进行准确定量（Ct值≤35.0时，判定为+；Ct值＞35.0时，判定为-）。

实施例4 特异性和敏感性试验

（1）特异性试验

采用实施例2中所述优化的体系及扩增条件，取7份特异性参考品分别为狂犬病毒疫苗株（RV）、猫疱疹病毒疫苗株（FHV）、杯状病毒疫苗株（FCV）、猫细小病毒疫苗株（FPV）、犬流感病毒（CIV）、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）阳性样品、犬瘟热（CDV）阳性样品等7个样本，提取RNA，采用荧光RT-PCR进行试剂盒的特异性试验。

其中，样品总RNA提取的步骤如下：①于750 μL Trizol裂解液中加入待测样品200μL，混匀，15~25℃静置5 min；②加入200 μL氯仿，振荡混匀，于4℃、12000 r/min离心15min；③取水相上清，加入600 μL于-20℃预冷的异丙醇，混匀后，12000 r/min离心10min；④弃上清，加入800 μL 75% DEPC-乙醇，12000 r/min离心10 min；⑤弃上清并于15~25℃干燥后加入11 μL DEPC-H₂O溶解，得样品RNA，备用。

荧光RT-PCR（荧光定量反转录PCR）反应体系：引物探针混合液2 μL、RT-PCR反应液15 μL以及酶混合液（Enzyme Mix）3 μL。上述制得的RNA样品5 μL。试剂的浓度均为实施例2中优化后的浓度。

荧光RT-PCR的反应条件如下：

（1）42℃逆转录10 min；（2）94℃ 15 min；（3）95 ℃ 15 s；（4）60 ℃ 45 s；（3）-（4）循环40次（收集荧光信号）。

结果显示：

组合1的荧光RT-PCR结果表明仅FCV疫苗株扩增曲线为S型扩增曲线。而狂犬病毒疫苗株（RV）、猫疱疹病毒疫苗株（FHV）猫细小病毒疫苗株（FPV）、流感病毒、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）阳性样品、犬瘟热（CDV）阳性样品均没有出现特异性扩增曲线（见图7），说明本组合的特异性很高。此外，本发明的反应体系为一步法反应体系和反应程序设置时间比姜雪（姜雪, 高玉伟, 胡桂学,等.猫杯状病毒荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用[J].吉林大学学报（理学版）, 2013, 51(5):973-977.）等报道的荧光RT-PCR的二步法反应体系更简单、试剂配制更方便，反应时间更短，约节省30 min。

（2）敏感性（灵敏度）试验

分别将3个FCV阳性质粒DNA用分光光度计测定浓度后，用DEPC-H₂O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5 μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×10⁶、7.6×10⁵、7.6×10⁴、7.6×10³、7.6×10²、7.6×10¹、7.6×10⁰ 、7.6×10^-1拷贝/μL进行荧光RT-PCR扩增。荧光RT-PCR反应体系以及反应条件同（1）特异性试验中所示。

结果表明：

组合1的荧光RT-PCR方法的最低检测限约为7.6×10⁰拷贝/μL（见图10）。而姜雪（姜雪, 高玉伟, 胡桂学,等.猫杯状病毒荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用[J].吉林大学学报（理学版）, 2013, 51(5):973-977.）等针对FCV ORF2基因片段设计特异性引物和探针建立的荧光RT-PCR方法，最低可检出量为2.26×10¹ 拷贝/μL。而组合1的敏感性是现有技术（可检出量为2.26×10¹拷贝/μL）的3倍。而本发明经过大量序列筛选和比对，选取针对FCV ORF1基因片段设计一对更特异的引物和探针，经过优化组合，大大提高了实验的敏感性。由此可见，本发明的敏感性高于现已报道的荧光RT-PCR方法。

实施例5 试剂盒的组装

按照总RNA提取和荧光RT-PCR两个部分完成试剂盒组分的配制，以下提供的数据及试剂组成为单次套式RT-PCR检测所需试剂：

（1）总RNA提取（4 ℃保存）

样品裂解液管：Trizol 750 μL；

氯仿管：氯仿200 μL；

75%乙醇管：75% DEPC-乙醇 800 μL；

异丙醇管：异丙醇 600 μL；

DEPC-H₂O管：11 μL；

（2）荧光RT-PCR（-20 ℃保存）

引物探针混合液管：10 μM上、下游引物各0.5 μL，10 μM探针1 μL，合计2 μL；

RT-PCR反应液管：

2×一步法RT-PCR缓冲液（One Step RT-PCR Buffer）（无Mg²⁺） 10 μL；25 mMMgCl₂ 2 μL；10 mM dNTP 1 μL；DEPC-H₂O 2 μL；合计15 μL；

酶混合液（Enzyme Mix）管：40 U/μL RNasin 1 μL，25 U/μL RT酶1 μL，5 U/μLTaq酶1 μL；

阳性对照管：浓度为7.6×10⁵拷贝/ μL的FCV阳性质粒5 μL；

其中，FCV阳性质粒的制备方法为：阳性质粒由上海佑隆生物科技有限公司构建，具体为合成FCV ORF1基因（NCBI登录号为KM016908），并利用上下游引物序列（即为上述引物F1、R1，如SEQ ID NO. 1~2所示）扩增该基因，并克隆至载体pET30a（上海佑隆生物科技有限公司），经转化、筛选、鉴定，获得FCV阳性质粒。

阴性对照管：DEPC-H₂O 5 μL。

按照48份检测剂量为一个包装，将上述配制好的试剂分别装入10个无RNase酶的瓶或管中，并按照相应的储存温度保存运送。

实施例6 试剂盒的应用

采用本发明的FCV荧光定量RT-PCR检测试剂盒对上海某宠物医院送检的3只临床疑似猫杯状病毒感染的猫鼻拭样品（标本S1、S2和S3，3个标本已经经过胶体金试纸条检测为阳性）进行检测。

（1）RNA的提取

①于750 μL Trizol裂解液中加入待测鼻拭样品200 μL，混匀，室温静置5 min；②加入200 μL氯仿，振荡混匀，于4 ℃ 12000 r/min离心15min；③取水相上清，加入600 μL异丙醇（-20℃预冷），混匀后，12000 r/min离心10 min；④弃上清，加入800 μL 75% DEPC-乙醇，12000 r/min离心10 min；⑤弃上清并于室温干燥后加入11 μL DEPC-H₂O溶解，得标本RNA，备用。

（2）荧光RT-PCR 反应与结果分析

分别取引物探针混合液2 μL、RT-PCR 反应液15 μL、酶混合液（Enzyme Mix） 3 μL配制成反应体系。

取阴性对照（N）、标本（S1、S2、S3）和阳性对照（P）的核酸各5 μL，分别加入反应体系中使用市售的荧光定量PCR仪进行PCR扩增。PCR 反应条件：（1）42℃逆转录10 min；（2）94℃ 15 min；（3）95 ℃ 15 s；（4）60 ℃ 45 s；（3）-（4）循环40次（收集荧光信号），整个反应共需85 min。

反应结束后保存检测数据文件。根据PCR 扩增结果所得到的曲线，分析实验结果，结果如图13所示。检测结果表明，设定的对照全部成立，S1、S2、S3份样品的Ct值分别为24.12、19.87、21.03，且出现典型的S型扩增曲线，表明检测样品中有3份存在阳性扩增。

由此可见，采用荧光RT-PCR大大节约了时间，节省劳力，操作更简单，安全无污染，适用于FCV感染的快速诊断和大规模的流行病学调查研究，有非常好的应用前景。

对比例

（1）特异性引物和探针的设计

针对GenBank中FCV的保守序列设计2对不同于上述实施例的特异性引物和探针，如下表2所示，按照以下序列，合成特异性荧光RT-PCR引物和探针。以DEPC-H₂O稀释引物至10 μM，-20℃保存备用。

上述F2~P3的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 4~9所示。其中F2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示，R2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 5所示，P2中的核苷酸部分的序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示。F3的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 7所示，R3的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 8所示，P3中的核苷酸部分的序列如序列表中SEQ ID NO. 9所示。

（2）标准曲线的建立

使用实施例2建立和优化的体系进行标准曲线的建立，建立方法同实施例3。结果显示：

以引物（F2和R2）和探针P2组合的组合2建立的荧光RT-PCR方法，出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显，标准品起始模板浓度与Ct值呈现具有较好的线性范围，斜率接近-3.34，相关系数r²为0.981（见图3、4）。

以引物（F3和R3）和探针P3组合的组合3建立的荧光RT-PCR方法，出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显，标准品起始模板浓度与Ct值呈现具有较好的线性范围，斜率接近-3.26，相关系数r²为0.985（见图5、6）。

根据Ct值和标准曲线即可对样品进行准确定量。

（3）特异性和敏感性试验

①特异性试验

具体操作步骤同实施例4，结果显示：

组合2的荧光RT-PCR FCV阳性质粒扩增曲线为S型扩增曲线，狂犬病毒疫苗株（RV）、猫疱疹病毒疫苗株（FHV）、杯状病毒疫苗株（FCV）、猫细小病毒疫苗株（FPV）、流感病毒、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）阳性样品、犬瘟热（CDV）阳性样品均没有出现特异性扩增曲线（见图8），说明本组合的特异性较好。

组合3的荧光RT-PCR结果表明FCV阳性质粒扩增曲线为S型扩增曲线，狂犬病毒疫苗株（RV）、猫疱疹病毒疫苗株（FHV）、杯状病毒疫苗株（FCV）、猫细小病毒疫苗株（FPV）、流感病毒、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）阳性样品、犬瘟热（CDV）阳性样品均没有出现特异性扩增曲线（见图9），说明本组合的特异性较好。由此可见，组合2和组合3的荧光RT-PCR特异性与组合1的荧光RT-PCR特异性无显著差异。

②敏感性试验

具体操作步骤同实施例4，结果显示：

组合2的荧光RT-PCR方法的最低检测限约为7.6×10²拷贝/μL（见图11），组合3的荧光RT-PCR方法的最低检测限约为7.6×10²拷贝/μL（见图12）；由此可见，组合2和组合3的荧光RT-PCR方法的检测限远高于组合1。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市动物疫病预防控制中心

<120> 一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒及检测方法

<130> P19013583C

<140> CN2019110651995

<141> 2019-10-31

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F1

<400> 1

ccgttaaytc rgtgtttgat ttg 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1

<400> 2

ggctctgatd gcttgaaact g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1

<400> 3

cctgggctct tcgccgtcac c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F2

<400> 4

ayaagtcygt tggagcaatt ga 22

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R2

<400> 5

tactgaagwt cgcgyct 17

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P2

<400> 6

caaactctga gcttcgtgct taaa 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F3

<400> 7

tcaacatgtg gtaaccgtta 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R3

<400> 8

gtctcatcca tccagtgtcg ca 22

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P3

<400> 9

tcagagccgc atatgatgtg cttactg 27

Claims (21)

1.一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒，其包括实时荧光定量RT-PCR反应体系，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系包括一对引物对和探针，

所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，

所述探针包括序列如SEQ ID NO. 3所示的核酸、荧光报告基团和荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC或Cy5；和/或，所述荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3；

和/或，所述荧光报告基团位于所述探针的核酸序列的5’末端；所述荧光淬灭基团位于所述探针的核酸序列的3’末端；

和/或，所述引物对的浓度为200~400 nM；和/或，所述探针的浓度为200~400 nM。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系还包括RT-PCR反应液和酶混合液，所述RT-PCR反应液包括Mg²⁺、dNTP和PCR反应缓冲液，所述酶混合液包括逆转录酶、热启动Taq酶和RNA酶抑制剂。

4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述Mg²⁺的浓度为1~2.5 mmol/L；

和/或，所述dNTP的浓度为0.1~0.25mmol/L；

和/或，所述PCR反应缓冲液为2×一步法RT-PCR缓冲液；

和/或，所述逆转录酶的用量为0.5~2 U/反应；

和/或，所述热启动Taq酶的用量为0.1~0.5 U/反应；

和/或，所述RNA酶抑制剂的用量为1~3 U/反应。

5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述Mg²⁺的浓度为2.0 mmol/L；所述dNTP的浓度为0.2 mmol/L。

6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括独立包装试剂，每份所述独立包装试剂由0.5 μL 10 μM的上游引物和0.5 μL 10 μM的下游引物、1 μL 10 μM的探针、RT-PCR反应液和酶混合液组成，所述RT-PCR反应液由10 μL 2×一步法RT-PCR缓冲液、2μL 25 mM 的MgCl₂、1 μL10 mM的dNTP和2 μL DEPC-H₂O组成，所述酶混合液由1 μL 40 U/μL的RNA酶抑制剂、1 μL 25 U/μL的逆转录酶和1 μL 5 U/μL的Taq酶组成。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括48份的独立包装试剂。

8.如权利要求1~7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照；

和/或，所述试剂盒还包括提取待检测样品的总RNA的试剂；

和/或，所述检测的待检样品为来自猫科动物或犬科动物的猫杯状病毒；

和/或，所述试剂盒还包括使用说明书。

9. 如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有FCV ORF1基因序列的重组质粒；和/或，所述阳性对照的浓度为7.6×10⁵拷贝/μL；所述阴性对照为去离子水；

所述试剂包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H₂O；

所述检测的待检样品为来自猫科动物或犬科动物的口、鼻、结膜、内脏组织、粪便和/或尿液的样品。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为DEPC-H₂O；

所述样品裂解液为Trizol；和/或，所述DEPC-乙醇为质量百分数为75%的DEPC-乙醇；

所述猫科动物为猫、豹、虎或狮；所述犬科动物为犬。

11. 一种用于检测猫杯状病毒的引物对和探针，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示；所述探针包括序列如SEQ ID NO. 3所示的核酸、荧光报告基团和荧光淬灭基团。

12.如权利要求11所述的引物对和探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC或Cy5；和/或，所述荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3；和/或，所述荧光报告基团位于所述探针的核酸序列的5’末端，所述荧光淬灭基团位于所述探针的核酸序列的3’末端；和/或，所述检测为实时荧光定量RT-PCR检测；和/或，所述检测的待检样品为来自猫科动物或犬科动物的猫杯状病毒。

13.如权利要求12所述的引物对和探针，其特征在于，所述检测的待检样品为来自猫科动物或犬科动物的口、鼻、结膜、内脏组织、粪便和/或尿液的样品。

14.如权利要求13所述的引物对和探针，其特征在于，所述猫科动物为猫、豹、虎或狮；所述犬科动物为犬。

15.如权利要求11~14任一项所述的引物对和探针在制备检测猫杯状病毒的试剂盒中的应用。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为实时荧光定量RT-PCR试剂盒。

17.一种非诊断目的的检测猫杯状病毒的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1）以待检样品的总RNA为模板，利用如权利要求1~10任一项所述试剂盒中的实时荧光定量RT-PCR反应体系或者利用如权利要求11~14任一项所述的引物对和探针进行实时荧光定量RT-PCR反应；

2）分析检测结果。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述待检样品的总RNA通过使用RNA提取试剂提取待检样品的总RNA获得。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述RNA提取试剂包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H₂O。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述样品裂解液为Trizol；和/或，所述DEPC-乙醇为质量百分数为75%的DEPC-乙醇。

21.如权利要求17~20任一项所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述实时荧光定量RT-PCR反应体系的反应程序为：

（1）42~50℃逆转录10~15 min；（2）94~95℃ 10~15 min；（3）94~95 ℃ 10~15 s；（4）55~60 ℃ 35~60 s；（3）-（4）循环40~45次。

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