CN113604557A - 一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组、试剂盒和应用 - Google Patents

一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组、试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组、试剂盒和应用，涉及生物检测技术领域。本发明所述引物探针组包括HRH1‑F、HRH1‑R和探针H1‑Probe；所述HRH1‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HRH1‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针H1‑Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提供了包含所述引物探针组的试剂盒和检测方法，可利用RNA一步法检测HRH1 mRNA表达水平，为HRH1蛋白的检出提供准确度高、检测范围广、灵敏度高的检测手段。

Description

一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组、试剂盒和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组、试剂盒和应用。
背景技术
组织胺(Histamine)是一种活性胺化合物，是广泛存在于动植物体内的一种生物胺，是由组氨酸脱羧而形成的，通常贮存于组织的肥大细胞中。是身体内的一种重要的化学传导物质，可以影响许多细胞的反应，包括过敏、炎性反应、胃酸分泌等，当机体受到某种刺激引发抗原-抗体反应时，引起肥大细胞的细胞膜通透性改变，释放出组胺，与组胺受体作用产生病理生理效应。组胺合成过程主要发生在肥大细胞、嗜碱性粒细胞、肺部、皮肤和胃肠粘膜中，和储存组胺的组织相一致。组胺与其他递质一样，先和靶细胞上特异性受体结合，从而改变细胞的生物活性，并发挥广泛的生理或病理作用。组胺的炎症作用，即组胺对体内的免疫动态平衡的影响依赖于现行已知的4个组胺受体的表达和活性。这4个组胺受体按被发现顺序命名为：组胺1型受体(H1)、组胺2型受体(H2)、组胺3型受体(H3)、组胺4型受体(H4)，其中，H1受体在介导过敏性炎症的发生中起着非常重要的作用，包括促进树突细胞成熟，调节Th1/Th2细胞之间平衡。H1受体属于G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors，GPCR)的类视紫红质家族成员，主要在内皮、平滑肌、血管内皮细胞，心脏和中枢神经系统中表达，调节血管舒张和支气管收缩，是变态反应主要的治疗靶位。当组胺作用于H1受体后，细胞内环磷酸鸟苷(C-GMP)增多，表现心率加快，血管收缩，支气管、小肠平滑肌收缩和微血管通透性增高。一般情况下，H1受体的活化形式与非活化形式处于一种平衡状态。在过敏性疾病中，大量的IgE刺激肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺，使组胺受体活化导致过敏性疾病的症状。组胺受体mRNA在过敏患者体内的表达水平高于健康人的表达水平。
H1抗组胺药物广泛用于季节性和常年过敏性鼻炎、荨麻疹及特应性皮炎等过敏性疾病的治疗，主要通过反向激动H1受体的非活化形式发挥其抗组胺作用。H1抗组胺药物不仅能够下调组胺诱导的H1受体mRNA的表达水平，在没有组胺刺激的情况下，也可以下调H1受体基础表达水平，降低其固有活性。
大部分过敏性疾病患者的治疗方式都是医生凭经验采用对症治疗，用抗组胺药来减轻过敏症状，但抗组胺治疗并非对所有患者有效，也无法量化治疗效果，但是目前没有相关的研究和记载。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组、试剂盒和应用，可一步法定量检测HRH1 mRNA的表达水平，为该蛋白的检出提供准确度高、检测范围广及灵敏度高的检测手段。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组，所述引物探针组包括HRH1-F、HRH1-R和探针H1-Probe；
所述HRH1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HRH1-R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述探针H1-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述引物探针组还包括内参基因GAPDH的引物对和探针，所述GAPDH的引物对包括GAPDH-F和GAPDH-R，所述探针包括G-Probe；
所述GAPDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述GAPDH-R的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，所述G-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，在所述探针H1-Probe和G-Probe的5’端各标记不同的荧光标记基团，3’端标记相同或不同的淬灭基团。
优选的，所述荧光标记基团包括FAM或JOE，所述淬灭基团包括BHQ1。
本发明还提供了一种一步法检测人组胺受体HRH1 mRNA表达水平的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物探针组的混合液、PCR反应液、酶混合液、人组胺受体HRH1标准品、ROX参比染料和无核酶水。
优选的，所述混合液中HRH1-F、HRH1-R、探针H1-Probe、GAPDH-F、GAPDH-R和G-Probe的浓度分别为1nM、1nM、1.5nM、2nM、2nM和3nM。
优选的，所述PCR反应液包括dNTP mix、MgCl2和缓冲液；
所述酶混合液包括Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体；所述Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体的质量比为15:6:3:1。
本发明还提供了一种基于上述试剂盒的一步法检测人组胺受体HRH1mRNA表达水平的方法，包括以下步骤：以人组胺受体HRH1标准品为模板，利用所述试剂盒配制反应体系，进行qRT-PCR反应，以拷贝数对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标构建标准曲线；
以样品提取的RNA为模板配制相同的反应体系，进行相同的qRT-PCR反应，利用所述标准曲线，测算人组胺受体HRH1 mRNA的表达水平。
优选的，所述反应体系以20μL计，包括：无核酶水2.4μL，PCR反应液10μL，酶混合液0.5μL，ROX参比染料0.5μL，引物探针组的混合液2μL和模板5μL。
优选的，所述qRT-PCR反应的程序包括：42℃30min；95℃1min；95℃5s，60℃31s，40个循环。
优选的，所述标准曲线为y＝-3.177x+34.178，R2＝0.996。
本发明还提供了上述引物探针组或上述试剂盒在制备免疫性疾病治疗用药依据或动态监测治疗效果的工具中的应用。
本发明提供了一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组，并提供了一种包含所述引物探针组的试剂盒，可利用RNA一步法检测人组胺受体HRH1(HRH1)mRNA表达水平，一方面可以判断患者的过敏症状是否由通过组胺途径引起(非组胺途径引起的过敏症状不表达组胺受体)和指导用药量(H1受体表达量高的需要更高剂量的H1抗组胺药物)，另一方面可以动态监测H1抗组胺药物治疗的效果，为HRH1蛋白的检出提供准确度高、检测范围广及灵敏度高的检测手段。
本发明所述引物探针组成试剂盒，并基于所述试剂进行一步法检测，无需单独进行反转录操作，极大降低了造成气溶胶污染的风险；与免疫学检测方法相比，本发明检测的灵敏度高，灵敏度高，可以检测低浓度的临床样本，能够灵敏地探测到HRH1的含量变化，检测范围可跨越至少6个数量级，增加了检测结果的准确性，能在1小时之内完成至少80人份检测，从而更早期、更准确、更快速地对治疗效果进行动态监测和疗效评估。
附图说明
图1为HRH1 mRNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR标准曲线；
图2为精密度检测结果图，其中1：1.0×107copies/μL，2：1.0×104copies/μL；
图3为准确度检测结果图；
图4为灵敏度检测结果图；
图5为临床样本检测结果图，其中1：病例1治疗前GAPDH mRNA；2：病例1治疗后GAPDH mRNA；3：病例1治疗前HRH1 mRNA；4：病例1治疗后HRH1 mRNA；
图6为在非最佳引物、探针设计的情况下，低值精密度扩增曲线图；
图7为酶混合液对扩增的影响；
图8为pGM-T载体的质粒图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组，所述引物探针组包括HRH1-F、HRH1-R和探针H1-Probe；
所述HRH1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HRH1-R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述探针H1-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明所述引物探针组优选还包括内参基因GAPDH的引物对和探针，所述GAPDH的引物对优选包括GAPDH-F和GAPDH-R，所述探针优选包括G-Probe；所述GAPDH-F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示，所述GAPDH-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示，所述G-Probe的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示。在本发明中，在所述探针H1-Probe和G-Probe的5’端优选各标记不同的荧光标记基团，3’端标记相同或不同的淬灭基团，且所述荧光标记基团优选包括FAM或JOE，所述淬灭基团包括BHQ1。在本发明实施例中，在所述探针H1-Probe的5’端标记FAM，3’端标记BHQ1；在所述G-Probe的5’端标记JOE，3’端标记BHQ1。本发明优选委托上海桑尼生物科技有限公司合成上述引物(表1)。
表1 TaqMan实时荧光定量PCR引物探针
Figure BDA0003196334290000051
本发明所述引物探针组在使用时，优选以混合液形式存在，且所述混合液中HRH1-F、HRH1-R、探针H1-Probe、GAPDH-F、GAPDH-R和G-Probe的浓度分别为1nM、1nM、1.5nM、2nM、2nM和3nM。
本发明还提供了一种一步法检测人组胺受体HRH1 mRNA表达水平的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物探针组的混合液、PCR反应液、酶混合液、人组胺受体HRH1标准品、ROX参比染料和无核酶水。
本发明所述混合液优选与上述混合液相同，在此不再赘述。
本发明所述PCR反应液优选包括dNTP mix、MgCl2和缓冲液，所述dNTP mix优选为dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合物，购自ThermoFisher公司(货号：R0192)，工作浓度优选为0.1-1mM；MgCl2的使用浓度优选为5-20mM；缓冲液为10-50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。本发明所述酶混合液优选包括Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体，所述Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体的质量比优选为15:6:3:1，在此比例下可达到最优的扩增效率。本发明所述组胺受体HRH1标准品优选为RNA标准品，用以配制标准曲线。
在本发明中，Taq酶为耐热的Taq DNA聚合酶，利用其3′→5′聚合酶活性以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端；同时利用其5′→3′外切酶活性即能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关，又可以从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸，由此在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断；逆转录酶可将mRNA逆转录成cDNA以进行PCR反应；RNA酶抑制剂用来抑制外源性RNase的活性；Taq酶抗体是热启动PCR用抗Taq抗体，其与Taq酶结合后抑制DNA聚合酶活性，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增，Taq酶抗体在PCR反应最初的DNA变性步骤中变性，Taq酶恢复活性，实现PCR扩增。
本发明还提供了一种基于上述试剂盒的一步法检测人组胺受体HRH1mRNA表达水平的方法，包括以下步骤：以人组胺受体HRH1标准品为模板，利用所述试剂盒配制反应体系，进行qRT-PCR反应，以拷贝数对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标构建标准曲线；
以样品提取的RNA为模板配制相同的反应体系，进行相同的qRT-PCR反应，利用所述标准曲线，测算人组胺受体HRH1 mRNA的表达水平。
本发明所述反应体系以20μL计，优选包括：无核酶水2.4μL，PCR反应液10μL，酶混合液0.5μL，ROX参比染料0.5μL，引物探针组的混合液2μL和标准品或RNA 5μL。本发明所述qRT-PCR反应的程序优选包括：42℃30min；95℃1min；95℃5s，60℃31s，40个循环。本发明在构建所述标准曲线时，以拷贝数对数值为横坐标(x)，Ct值为纵坐标(y)：y＝-3.422x+37.235(R2＝1.000)。本发明对所述RNA的来源并没有特殊限定，可提取自人血液、鼻腔分泌物、支气管冲洗液、唾液或泪液样本。
本发明还提供了上述引物探针组或上述试剂盒在制备免疫性疾病治疗用药依据或动态监测治疗效果的工具中的应用。
本发明所述应用优选与上述方法相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组、试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所涉及的试剂、试剂盒和仪器，如未特殊说明，均为本领域的常规市售产品：
全血总RNA试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司，货号：5201050)；
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit(New England Biolabs，货号：E2050S)；
Applied BiosystemsTM 7300荧光定量PCR仪(ThermoFisher，美国)；
-80℃低温冰箱(ThermoFisher，美国)；
高速低温台式离心机(Eppendorf，德国)；
Qubit 3荧光计(ThermoFisher，美国)。
实施例1
1、委托上海桑尼生物科技有限公司合成表1所示的引物和探针。
2、标准品制备
体外转录。采用pGM-T连接试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，货号：VT202-01]，以pGM-T为载体构建HRH1质粒DNA(委托南京金斯瑞生物科技有限公司构建及合成，图8)，将HRH1质粒DNA用HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEW ENGLANDBioLabs公司生产，货号：E2040S)体外转录成mRNA。
根据拷贝数计算公式：拷贝数＝[6.02×1023×RNA浓度(ng/μL)×10-9]/[RNA长度(bp)×340]，计算RNA初始拷贝数。用无核酶水稀释至1.0×1010copeies/μL，即为HRH1标准品。
3、全血RNA提取及稀释：EDTA抗凝全血样本用全血总RNA试剂盒提取全血总RNA，采用Qubit 3荧光计定量后，用无核酶水稀释至20ng/μL。
4、TaqMan实时荧光定量PCR
以标准品/全血RNA为模板，配制20μL体系：无核酶水2.4μL，PCR反应液10μL，酶混合液0.5μL，ROX参比染料0.5μL，引物探针组的混合液2μL和标准品或RNA 5μL。
程序：42℃30min；95℃1min；95℃5s，60℃31s，40个循环。并设置检测荧光素：FAM、JOE，参比荧光：ROX，反应体系：20μL，荧光信号收集：60℃31sec。
5、标准曲线的生成
将HRH1标准品按10倍梯度进行稀释，选择1.0×108～1.0×103copeies/μL作为模板，每个稀释度3个重复，进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，生成标准曲线。
结果如图1所示，以拷贝数对数值为横坐标(x)，Ct值为纵坐标(y)，得到回归方程式：y＝-3.422x+37.235(R2＝1.000)，说明标准方程的拷贝数对数值与Ct值具有极高的相关性。
6、精密度检测
选择1.0×107copies/μL、1.0×104copies/μL的标准品作为模板，每个浓度10个重复量，进行10次TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，分别计算每个浓度对数值的变异系数进行统计学分析，分析该检测方法的精密度。
结果如表2和图2所示，每个浓度对数值的变异系数分别为0.380％、0.539％，小于5％，表明本发明建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法具有极好的精密度。
表2精密度检测结果
Figure BDA0003196334290000081
7、准确度检测
选择1.0×106copies/μL标准品进行30倍稀释(2μL 1.0×106copies/μL标准品+58μL无核酶水)作为模板，3个重复量，进行3次TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，计算每个浓度对数值的绝对偏差。结果如表3所示，每个浓度对数值的绝对偏差分别为0.013、-0.004、-0.010，在±0.5范围内，表明本发明建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法具有极好的准确度。
表3准确度检测数据
Figure BDA0003196334290000082
Figure BDA0003196334290000091
8、灵敏度检测
选择10.0copies/μL标准品作为模板，25个重复量，进行25次TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，查看是否有扩增抬头，分析该检测方法的灵敏度。
结果如表4和图4所示，共计25次检测出结果，达100％，表明本发明建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法具有很高的灵敏度，最低检出拷贝数＜10copies/μL。
表4灵敏度检测Ct值结果
32.435 32.450 32.998 33.082 31.590
32.149 31.957 32.612 32.142 31.225
31.892 32.739 32.496 32.059 32.104
31.829 32.396 32.925 32.076 31.819
33.021 31.887 32.168 32.670 31.634
9、临床样本检测
取患者和正常人全血样本按上述步骤进行全血RNA提取和稀释，并按照上述步骤进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测。
和国内某品牌人组胺H1受体(HRH1)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)比对，结果如表5和图5所示，本发明建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法具有比对试剂更好的灵敏度和特异性，同时可以有效监测治疗效果。
表5临床样本检测实验对比
Figure BDA0003196334290000092
Figure BDA0003196334290000101
对比例1、采用其它非最佳引物、探针进行扩增的结果
将实施例6中本发明所用体系中的引物、探针替换成其它非最佳引物、探针。结果如表6和图6所示，低值精密度的浓度对数值的变异系数结果超出5％，达8.006％。
采用非最佳的HRH1引物、探针序列：
HRH1-F(SEQ ID NO.7)：CAGGGACTATGTAGCCGTCA；
HRH1-R(SEQ ID NO.8)：AGAGAAGGATTGGCTATCACC；
H1-Probe(SEQ ID NO.9)：(FAM)-CTGATATCTCGCTGGCCCCATG-(BHQ1)。
表6非最佳引物、探针进行扩增
理论拷贝数 拷贝数对数值均值 SD C.V
1.0×10<sup>4</sup> 3.657 0.293 8.006％
对比例2、酶混合液效果比较
用非最佳配比的酶混合液(Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体的质量比为13:7:4:1)和最佳配比的酶混合液分别扩增4例全血RNA样本，采用非最佳的酶混合液配比的扩增结果如图7中A所示，采用最佳的酶混合液配比的扩增结果如图7中B所示。可见最佳酶混合液重复性较佳，扩增效果较好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司
<120> 一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组、试剂盒和应用
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<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
ctgatatctc gctggcccca tg 22

Claims (10)

1.一种人组胺受体HRH1 mRNA检测引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括HRH1-F、HRH1-R和探针H1-Probe；
所述HRH1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HRH1-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述探针H1-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括内参基因GAPDH的引物对和探针，所述GAPDH的引物对包括GAPDH-F和GAPDH-R，所述探针包括G-Probe；
所述GAPDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述GAPDH-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述G-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1或2所述引物探针组，其特征在于，在所述探针H1-Probe和G-Probe的5’端各标记不同的荧光标记基团，3’端标记相同或不同的淬灭基团。
4.根据权利要求3所述引物探针组，其特征在于，所述荧光标记基团包括FAM或JOE，所述淬灭基团包括BHQ1。
5.一种一步法检测人组胺受体HRH1 mRNA表达水平的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～4任一项所述引物探针组的混合液、PCR反应液、酶混合液、人组胺受体HRH1标准品、ROX参比染料和无核酶水。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述混合液中HRH1-F、HRH1-R、探针H1-Probe、GAPDH-F、GAPDH-R和G-Probe的浓度分别为1nM、1nM、1.5nM、2nM、2nM和3nM。
7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括dNTP mix、MgCl2和缓冲液；
所述酶混合液包括Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体；所述Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体的质量比为15:6:3:1。
8.权利要求1～4任一项所述引物探针组或权利要求5～7任一项所述试剂盒在制备免疫性疾病治疗用药依据或动态监测治疗效果的工具中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，利用所述引物探针组或所述试剂盒配制反应体系，并进行qRT-PCR反应；
所述反应体系以20μL计，包括：无核酶水2.4μL，PCR反应液10μL，酶混合液0.5μL，ROX参比染料0.5μL，引物探针组的混合液2μL和标准品或RNA5μL。
10.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述qRT-PCR反应的程序包括：42℃30min；95℃1min；95℃5s，60℃31s，40个循环。
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