CN114438259A - 同步检测sglv与yezv双重荧光定量rt-pcr核酸组、试剂盒及方法 - Google Patents

同步检测sglv与yezv双重荧光定量rt-pcr核酸组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病毒检测领域，为解决现有现有技术下缺少SGLV、YEZV两种蜱传病毒的检测方法的问题，公开了一种用于同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT‑PCR核酸组、一种同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT‑PCR试剂盒和检测方法。本发明建立了一种同步检测SGLV与YEZV的方法，检测速度快，为患者的治疗争取了宝贵的时间，并且一次性检测两种病毒省时省力，试剂成本低，该检测方法灵敏度高、特异性好、可重复，能有效排除其他病毒的干扰，本发明的试剂盒使用方便，操作简单，检测结果可靠。

Description

同步检测SGLV与YEZV双重荧光定量RT-PCR核酸组、试剂盒及 方法
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种同步检测SGLV与YEZV双重荧光定量RT-PCR核酸组、试剂盒及方法。
背景技术
蜱为人、家畜及野生动物的体外寄生虫，在叮咬宿主时会将其携带的多种病毒传染给宿主，导致宿主出现发热、头痛、脏器衰竭等临床症状。在传染病控制中，及时正确诊断最为关键，是有效治疗的基础也是制定正确预防策略的依据，蜱传病毒引起的疾病的临床表现特异性不强，对于此类疾病的早期诊断尚存在困难，因此建立一种快速、灵敏、特异，可同时对多种蜱传病毒进行鉴别诊断的检验方法具有重要意义。近日，研究人员又分离鉴定出两蜱传病毒——Songling virus(SGLV)以及Yezo virus(YZEV)，尚未有针对这两种病毒的可同时检测方法。
目前，用于蜱传病毒的检测方法主要有酶联免疫吸附测定(ELISA)，聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时RT-PCR、二代测序(NGS)和第3代测序技术(Nanopore sequencing)等。ELISA是采用分离出未知病原体中的抗原与含有已知特异性抗体的免疫血清进行血清学反应，以此来确定病原体种类的一种技术，该方法完成时间相对较短且特异性强，缺点是在操作过程中可能出现假阳性反应，影响结果的判定，而且制备抗血清的时间较长且一次只能检测一种病毒，具有一定的局限性。PCR是一种在DNA酶的作用下对DNA进行特异扩增的技术，是实验室常用的检测方法，引物为一对上/下游特异性引物，此方法只能简单的对核酸进行检测，不能实时监控核酸扩增量。NGS以及第3代测序技术是将患者标本中大量的基因序列全部测定，将测序结果与Gen Bank上已有的病毒序列进行比对，以此来判定患者体内是否含有该病毒，此种方法费用昂贵，对仪器和实验室人员要求很高，不适合病毒的快速诊断。
发明内容
本发明为了克服现有技术下缺少SGLV、YEZV两种蜱传病毒的检测方法的问题，提供一组用于同步检测SGLV与YEZV双重荧光定量RT-PCR核酸，本发明还提供一种同步检测SGLV与YEZV双重荧光定量RT-PCR试剂盒及方法，该方法可同时检测SGLV、YEZV两种蜱传病毒，具有操作简单、实时快速、定性定量、特异敏感、重复性好、不易污染的优点。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一组用于同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR核酸，所述核酸包括SGLV引物对、YEZV引物对、SGLV荧光探针和YEZV荧光探针；
所述SGLV引物对包括SGLV上游引物和SGLV下游引物，SGLV上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，SGLV下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
所述YEZV引物对中包括YEZV上游引物和YEZV下游引物，YEZV上游引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示，YEZV下游引物的核苷酸序列如序列表中序列4所示；
所述SGLV荧光探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，SGLV荧光探针的5’端链接HEX荧光基团，3’端链接BQ1荧光猝灭基团；
所述YEZV荧光探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，YEZV荧光探针的5’端链接CY5荧光基团，3’端链接BQ2荧光猝灭基团。
发明人设计的引物对能有效识别并扩增SGLV与YEZV，并且特异性好，不会响应非目标RNA的序列。SGLV荧光探针和YEZV荧光探针可特异性识别SGLV和YEZV的PCR的扩增产物，HEX荧光基团与CY5荧光基团，两者的荧光波长不同，HEX波长为556nm，CY5波长为670nm，可通过不同波长的荧光标记实时监控SGLV和YEZV的扩增过程，对检测目标进行定量分析。
一种同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒。
该试剂盒包括上述用于同步定量检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR核酸组，可用于SGLV和YEZV同步检测。
作为优选，所述试剂盒还包括2X RT-PCR试剂、Taq酶、引物逆转录酶、阴性对照、阳性对照和RNase-free水。
作为优选，所述SGLV上游引物为20μM，所述SGLV下游引物的浓度为20μM，所述YEZV上游引物的浓度为10μM，所述YEZV下游引物的浓度为10μM。
作为优选，所述SGLV荧光探针浓度为10μM，所述YEZV荧光探针浓度为5μM。
作为优选，所述阳性对照为包含有如序列表中序列7和序列8所示的核苷酸序列的质粒，所述阴性对照为正常人群血清提取的RNA液。
一种同步检测SGLV与YEZV双重荧光定量RT-PCR方法，包括以下步骤：
A、提取待检样品的RNA；
B、使用试剂盒中试剂将待检样品的RNA进行荧光PCR扩增反应；
C、设立阳性对照和阴性对照，将阳性对照和阴性对照分别进行荧光PCR扩增反应；
D、根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集待检样品RNA的荧光曲线形态和Ct值判定结果。
该检测使用上文所述的定量同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒，以蜱咬伤病人的血清作为样品，将血清中RNA进行扩增，一次性检测其中是否含有SGLV或YEZV。荧光探针没有与目标物结合时，没有荧光信号，当荧光探针结合至目标物序列后，荧光探针被折断，荧光猝灭基团远离荧光基团，荧光信号增强；HEX荧光基团和CY5荧光基团的波长不同，可从荧光信号区分SGLV和YEZV。通过设置阴性对照和阳性对照可排除背景干扰并且及时发现污染的发生。
作为优选，所述步骤B中，荧光PCR的反应参数为42℃5min，95℃15s，1个循环；95℃5s，55℃30s，45个循环。
作为优选，所述步骤D中判定结果的方法为Ct值＞38的样品为阴性，Ct值＜32的样品为阳性，Ct值在32-38之间的样品需重新做3次检测，重做得到的测定结果有2次及以上Ct值＜38的为阳性，有2次及以上Ct值均＞38的为阴性，Ct值为其它情况需重新采样检测。
因此，本发明具有如下有益效果：(1)建立了一种同步检测SGLV与YEZV的方法，检测速度快，为患者的治疗争取了宝贵的时间，并且一次性检测两种病毒省时省力，试剂成本低；(2)该检测方法灵敏度高、特异性好、可重复，能有效排除其他病毒的干扰；(3)试剂盒使用方便，操作简单，检测结果可靠。
附图说明
图1是本发明同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒检测SGLV的扩增曲线，图中1-7分别为浓度为5.0×106-5.0×100拷贝/μL的样品组。
图2是本发明同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒检测YEZV的扩增曲线，图中1-7分别为浓度为5.0×106-5.0×100拷贝/μL的样品组。
图3是本发明同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒检测SGLV的定量标准曲线。
图4是本发明同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒检测YEZV的定量标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方法对本发明做进一步的描述。
总实施例
一种用于同步检测SGLV与YEZV双重荧光定量RT-PCR方法，使用定量同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒，每次检测使用如下表所示的试剂：
试剂 体积(μL)
2X One Step RT-PCR试剂 12.5
TaKaRa Ex Taq酶 0.5
PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5
SGLV上游引物(20μM) 0.5
SGLV下游引物(20μM) 0.5
YEZV上游引物(10μM) 0.5
YEZV下游引物(10μM) 0.5
SGLV荧光探针(10μM) 0.5
YEZV荧光探针(5μM) 0.5
RNase-free水 3.5
阴性对照
阳性对照
其中上述引物和荧光探针的核酸序列如下表所示：
项目 核酸序列
SGLV上游引物 5’-GAGAAGAACAAGGACCACAAGA-3’
SGLV下游引物 5’-CAGCTTCCTGATACTGAAGGAC-3’
YEZV上游引物 5’-TGGAGTCAAGGGCTGTTATG-3’
YEZV下游引物 5’-CACCAGGCATTTACCTCTACTT-3’
SGLV荧光探针 5’-HEX-TTTCAGGCTTTCGTACTCCTTGGACC-BQ1-3’
YEZV荧光探针 5’-CY5-TGCCAGGGCTACTGTGATGCATAA-BQ2-3’
阳性对照由如下方法构建：
将CGACTGGTTTGAGAAGAACAAGGACCACAAGAACATGAAGTGGTCCAAGGAGTACGAAAGCCTGAAAAAGGCAGTTCCTTCTTCTGACCAGGTCCTTCAGTATCAGGAAGCTGCCCTTGAGTGG序列合成成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链DNA片段，双链DNA片段连接到质粒pMD18-T上构建成pMD18-T-SGLV，将pMD18-T-SGLV导入JM109感受态细胞增殖，提取JM109感受态细胞中的pMD18-T-SGLV质粒即得到SGLV阳性对照；
将AAGACCTCAGTGGAGTCAAGGGCTGTTATGTCGTTGCCAGGGCTACTGTGATGCATAACTGTAAGCAGGCTGACATGGAGCCTTTTGAAAGTAGAGGTAAATGCCTGGTGG序列合成成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链DNA片段，双链DNA片段连接到质粒pMD18-T上构建成pMD18-T-YEZV，将pMD18-T-YEZV导入JM109感受态细胞增殖，提取JM109感受态细胞中的pMD18-T-YEZV质粒即得到YEZV阳性对照。
阴性对照由如下方法构建：将5份正常人群的血清等量混合后提取RNA液即得阴性对照。
检测标准曲线的建立：
A、将SGLV阳性对照和YEZV阳性对照分别稀释得到浓度分别为5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103、5.0×102、5.0×101、5.0×100拷贝/μL的样品组；
B、将试剂盒中2X One Step RT-PCR试剂、TaKaRa Ex Taq酶、PrimeScript RTEnzyme Mix、SGLV上游引物、SGLV下游引物、YEZV上游引物、YEZV下游引物、SGLV荧光探针、YEZV荧光探针和RNase-free水充分混匀后分装到Q7荧光PCR仪专用板孔中，其中每孔包含有2XOne Step RT-PCR试剂12.5μL、TaKaRa Ex Taq酶0.5μL、PrimeScript RT Enzyme Mix0.5μL、RNase-free水3.5μL和SGLV上游引物、SGLV下游引物、YEZV上游引物、YEZV下游引物、SGLV荧光探针和YEZV荧光探针各0.5μL；
C、每孔加待测RNA模板5μL，再离心1分钟后放入Q7荧光PCR仪，在96孔板内分别加入含SGLV阳性对照浓度不同的样品和含YEZV阳性对照浓度不同的样品后进行扩增反应并记录荧光信号，反应参数：42℃5min，95℃15s，1个循环；95℃5s，55℃30s，45个循环后停止扩增。
含SGLV阳性对照浓度不同的样品的荧光曲线如图1所示，含YEZV阳性对照浓度不同样品的荧光曲线如图2所示，Ct值与SGLV浓度之间的线性关系如图3所示，Ct值与YEZV浓度之间的线性关系如图4所示。
检验检测方法的灵敏度：将SGLV阳性对照和YEZV阳性对照分别稀释得到浓度分别为5.0×103、5.0×102、5.0×101、5.0×100、5.0×10-1拷贝/μL的样品组，以上述实验参数进行检测，重复5次。
由检测结果可知，同步检测SGLV与YEZV双重荧光定量RT-PCR方法的灵敏度好，5.0×101拷贝/μL浓度5个重复标本均检出阳性，SGLV的5.0×100拷贝/μL浓度5个重复标本仅有2个检出阳性，YEZO的5个重复标本仅有1个检出阳性，因此本发明检测方法的检测限为5.0×101拷贝/μL，也就是在每1微升的待检样本中有1个拷贝就能检出。
检验检测方法的重复性：将SGLV阳性对照和YEZV阳性对照分别稀释得到浓度分别为5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103、5.0×102拷贝/μL的样品组，以上述实验参数进行检测，每组样品重复检测5次。
检测结果如下表所示：
Figure BDA0003413210630000051
Figure BDA0003413210630000061
由表中数据可知，本发明检测方法对不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差分别在0.06-0.1和0.07-0.16之间，变异系数(cv)在0.27％-0.52％和0.26％-0.63％之间，具有良好的重复性。
检验检测方法的特异性：分别提取新型布尼亚病毒株(ZJZS1/China/2012)、汉城病毒、汉滩病毒、甲型H1N1病毒、鼻病毒、乙型流感病毒、肠道病毒EV71型、柯萨奇病毒A16、腹地病毒、札如病毒、登革热病毒、诺如病毒中RNA，以上述实验参数进行检测。
当样本Ct值＞38可认定样品为阴性，当样品Ct值＜30且扩增曲线形态良好为阳性，各组的检测结果如下表所示：
项目 检测结果
新型布尼亚病毒 -
汉城病毒 -
汉滩病毒 -
甲型H1N1病毒 -
鼻病毒 -
乙型流感病毒 -
肠道病毒EV71型 -
柯萨奇病毒A16 -
腹地病毒 -
札如病毒 -
登革热病毒 -
诺如病毒 -
阴性对照 -
阳性对照 +
上述病毒均会引起被感染者发热，其导致的临床症状相似。由检测结果可知，本发明的检测方法对SGLV和YEZV的特异性良好。
实施例1
A、收集2018年-2020年有蜱虫咬伤流行病学史，且新型布尼亚病毒检测结果为阴性的患者血清标本50份，提取血清样本中RNA；
B、将试剂盒中2X One Step RT-PCR试剂、TaKaRa Ex Taq酶、PrimeScript RTEnzyme Mix、SGLV上游引物、SGLV下游引物、YEZV上游引物、YEZV下游引物、SGLV荧光探针、YEZV荧光探针和RNase-free水充分混匀后分装到Q7荧光PCR仪专用板孔中，其中每孔包含有2X One Step RT-PCR试剂12.5μL、TaKaRa Ex Taq酶0.5μL、PrimeScript RT Enzyme Mix0.5μL、RNase-free水3.5μL和SGLV上游引物、SGLV下游引物、YEZV上游引物、YEZV下游引物、SGLV荧光探针和YEZV荧光探针各0.5μL；
C、每孔加待测RNA模板5μL，再离心1分钟后放入Q7荧光PCR仪，在96孔板内分别加入SGLV和YEZV的RNA提取液以及阴性对照和阳性对照后进行扩增反应并记录荧光信号，反应参数：42℃5min，95℃15s，1个循环；95℃5s，55℃30s，45个循环后停止扩增。
在45个循环后，阴性对照未达到荧光阈值，阳性对照的Ct值为26.48，因此Ct值＞38的样本为阴性，Ct值<38的样本为阳性，由检测结果可知，50份样品均为阴性。
实施例2
A、随机选取实施例1步骤A中提取到的50份血清样本RNA中10份样本，其中5份样本加入SGLV阳性对照使样本中SGLV阳性对照浓度分别为5.0×105、5.0×104、5.0×103、5.0×102、5.0×101拷贝/μL，5份样本加入YEZV阳性对照使样本中YEZV阳性对照浓度分别为5.0×105、5.0×104、5.0×103、5.0×102、5.0×101拷贝/μL，然后将50份样本打乱顺序；
B、将试剂盒中2X One Step RT-PCR试剂、TaKaRa Ex Taq酶、PrimeScript RTEnzyme Mix、SGLV上游引物、SGLV下游引物、YEZV上游引物、YEZV下游引物、SGLV荧光探针、YEZV荧光探针和RNase-free水充分混匀后分装到Q7荧光PCR仪专用板孔中，其中每孔包含有2X One Step RT-PCR试剂12.5μL、TaKaRa Ex Taq酶0.5μL、PrimeScript RT Enzyme Mix0.5μL、RNase-free水3.5μL和SGLV上游引物、SGLV下游引物、YEZV上游引物、YEZV下游引物、SGLV荧光探针和YEZV荧光探针各0.5μL；
C、每孔加待测RNA模板5μL，再离心1分钟后放入Q7荧光PCR仪，在96孔板内分别加入SGLV和YEZV的RNA提取液以及阴性对照和阳性对照后进行扩增反应并记录荧光信号，反应参数：42℃5min，95℃15s，1个循环；95℃5s，55℃30s，45个循环后停止扩增。
50份样品中共检测5例SGLV阳性，5例YEZV阳性。
序列表
<110> 岱山县疾病预防控制中心
<120> 同步检测SGLV与YEZV双重荧光定量RT-PCR核酸组、试剂盒及方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagaagaaca aggaccacaa ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcttcctg atactgaagg ac 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggagtcaag ggctgttatg 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccaggcat ttacctctac tt 22
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttcaggctt tcgtactcct tggacc 26
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgccagggct actgtgatgc ataa 24
<210> 7
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgactggttt gagaagaaca aggaccacaa gaacatgaag tggtccaagg agtacgaaag 60
cctgaaaaag gcagttcctt cttctgacca ggtccttcag tatcaggaag ctgcccttga 120
gtgg 124
<210> 8
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagacctcag tggagtcaag ggctgttatg tcgttgccag ggctactgtg atgcataact 60
gtaagcaggc tgacatggag ccttttgaaa gtagaggtaa atgcctggtg g 111

Claims (9)

1.一组用于同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR核酸，其特征是，所述核酸包括SGLV引物对、YEZV引物对、SGLV荧光探针和YEZV荧光探针；
所述SGLV引物对包括SGLV上游引物和SGLV下游引物，SGLV上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，SGLV下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
所述YEZV引物对中包括YEZV上游引物和YEZV下游引物，YEZV上游引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示，YEZV下游引物的核苷酸序列如序列表中序列4所示；
所述SGLV荧光探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，SGLV荧光探针的5’端链接HEX荧光基团，3’端链接BQ1荧光猝灭基团；
所述YEZV荧光探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，YEZV荧光探针的5’端链接CY5荧光基团，3’端链接BQ2荧光猝灭基团。
2.一种包括如权利要求1所述核酸组的同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒。
3.根据权利要求2所述的一种同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括2X RT-PCR试剂、Taq酶、引物逆转录酶、阴性对照、阳性对照和RNase-free水。
4.根据权利要求2或3所述的一种同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述SGLV上游引物为20μM，所述SGLV下游引物的浓度为20μM，所述YEZV上游引物的浓度为10μM，所述YEZV下游引物的浓度为10μM。
5.根据权利要求2或3所述的一种同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述SGLV荧光探针浓度为10μM，所述YEZV荧光探针浓度为5μM。
6.根据权利要求3所述的一种定量同步检测SGLV与YEZV的双重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述阳性对照为包含有如序列表中序列7和序列8所示的核苷酸序列的质粒，所述阴性对照为正常人群血清提取的RNA液。
7.一种使用如权利要求2所述试剂盒的同步检测SGLV与YEZV双重荧光定量RT-PCR方法，其特征是，包括以下步骤：
A、提取待检样品的RNA；
B、使用试剂盒中试剂将待检样品的RNA进行荧光PCR扩增反应；
C、设立阳性对照和阴性对照，将阳性对照和阴性对照分别进行荧光PCR扩增反应；
D、根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集待检样品RNA的荧光曲线形态和Ct值判定结果。
8.根据权利要求7所述的一种同步检测SGLV与YEZV双重荧光定量RT-PCR方法，其特征是，所述步骤B中，荧光PCR的反应参数为42℃ 5min，95℃ 15s，1个循环；95℃ 5s，55℃30s，45个循环。
9.根据权利要求7所述的一种同步检测SGLV与YEZV双重荧光定量RT-PCR方法，其特征是，所述步骤D中判定结果的方法为Ct值＞38的样品为阴性，Ct值＜32的样品为阳性，Ct值在32-38之间的样品需重新做3次检测，重做得到的测定结果有2次及以上Ct值＜38的为阳性，有2次及以上Ct值均＞38的为阴性，Ct值为其它情况需重新采样检测。
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