TWI243855B

TWI243855B - Oligonucleotides and process for detecting mycobacterium tuberculosis

Info

Publication number: TWI243855B
Application number: TW091116495A
Authority: TW
Inventors: Shigeo Tsuchiya; Noriyoshi Masuda; Takahiro Maruyama; Takao Matsuba; Takahiko Ishiguro
Original assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2001-07-25
Filing date: 2002-07-24
Publication date: 2005-11-21
Also published as: EP1411117A1; EP1411117A4; CN1464906A; WO2003010309A1; ATE470710T1; KR20040017796A; DE60236659D1; CN100351374C; US20040087782A1; EP1411117B1; US7105319B2; KR100984264B1

Description

1243855 A7 B7 _ 五、發明説明（彳）技術領域 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明是關於臨床檢查中，檢測結核菌（ Mycrobacterium tuberculosis)用之低聚核普酸及結核菌之檢測方法。本發明中所提供之低聚核苷酸爲基因診斷用試藥，有效地進行RNA或DNA之切斷、增幅（ amplification)以及檢測之操作，以及爲有效地阻礙 R N A之反轉錄或轉譯之試藥。特別是本發明中所提供之低聚核苷酸之配列，有效地作爲結核菌之定量或診斷用之試藥等。技術背景不管結核病已明顯地減少，最近，高齡者之罹患率上升，未經驗過結核感染之年少層，一旦感染時，則會引起集團感染等之深刻問題。至目前爲止之結核菌之檢查法，基本上是塗抹檢查或培養檢查。然而，結核菌之發育遲緩，須4週以上才能得到結果。經濟部智慧財產笱員工消費合作社印製近年，市售檢測結核菌群之基因檢測用試劑。進行 D N A增幅用試劑，如以聚合酵素鏈鎖反應法（P C R法 )增幅編碼1 6 S r RNA之基因體DNA，與特異之 D N A探針雜交（hybridize )後，檢測之試劑，或是以接合酵素鏈鎖反應法（L C R法）增幅編碼結核菌之抗原蛋白中之抗原蛋白b (以下稱爲p a b )之已知序列之 p a b 基因（Inf. And Immun. 57,248 1 -2488,1 989 年），以快速結核檢驗試劑（E I A )檢測等。（美國特許第本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） -4- 1243855 A7 _______B7_ 五、發明説明（2) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 6 3 1 1 3 0號）。這些檢測方法雖然是自動化或半自動化，檢查所需時間爲4至6小左右時，對治療用而言是緩不濟急。而且，D N A增幅法中，活菌、死菌並無區別，不適宜觀察抗生物質等之治療效果。RNA之特定序列之增幅法，如已知之反轉錄聚合酵素鏈鎖反應法（尺丁一 P C R )。此法爲於反轉錄步驟中合成標的r n A之 c D N A，接著於c D N A之特定序列之兩末端部份，互補的及相同之一組引子（primer)(反義引子 (antisense primer )亦可與反轉錄步驟共用）以及耐熱性d N A聚合酵素存在下，進行重覆操作熱變性、引子煉合 (primer anneal )及延長反應所成之循環，增幅特定D N A序列之方法。然而，RT — PCR法，爲2階段之操作（反轉錄步驟及P C R步驟），以及必須重覆地急速升溫、降溫之操作，成爲自動化之障礙。經濟部智悲財4局工消費合作社印製如上所述，現在所利用之檢查法，不一定能符合實際之醫療現場所必須之迅速地檢測或確認治療效果之用途，希望出現只檢測出活菌且更高感度、迅速的檢查法。另外，爲使檢查更爲簡便，要求開發自動化之檢查裝置。可利用增幅標的核酸之方法作爲高感度之檢測法。特定R N A序列之增幅法，如已知之核酸序列基礎增幅法（ N A S B A 法：Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)或自主序歹!j複製系統（3 S R法，self-sustained sequence replication) 等，依照反轉錄酵素及 R N A聚合酶之協和作用，增幅特定R N A序列。此法， 1紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -5- 1243855 A7 __B7 五、發明説明（3) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 是以標的R N A爲模板，由含有啓動子（proin〇tor )序列之引子、反轉錄酵素及核糖核酸酶Η，合成含有啓動子序列之雙股D N A，以該雙股D Ν Α爲模板，以R Ν Α聚合酶，合成含有標的RNA之特定鹼基序列，該RNA接著又成爲合成含有啓動子序列之雙股DNA之模板，進行連鎖反應。因此，認爲NA S BA法及3 S R法於一定溫度可增幅核酸，爲適合自動化之方法。然而，因爲這些增幅法於較低溫（如4 1 °C )下進行反應，認爲標的R N A會形成分子內構造，阻礙引子之結合，而有降低反應效率之可能性。因此，於增幅反應之前，進行標的R N A的熱變性，破壞標的分子內構造，提升引子之結合效率之操作是必要的。更進一步而言，於低溫下進行R N A的檢測時，對於形成如上述之分子構造之 R N A，得以結合之低聚核苷酸是必要的。經濟部智慧时/i^7a(工消費合作Ti印製因此，本發明是提供低聚核苷酸，特異地切斷、增幅編碼結核菌之抗原蛋白p a b之p a b基因或是源自這些基因之RNA，且有效地高感度地進行這些檢測及同定爲第一目的。另外，提供有效的低聚核苷酸之序列爲阻礙 R N A反轉錄或轉譯之藥劑。更進一步，本發明是使上述之源自P a b基因之RNA於較低溫（如4 It)下，特異地增幅，提供有效地高感度地進行這些檢測及同定之低聚核苷酸之適宜的組成爲第二目的。發明之說明本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1243855 A7 B7_ 五、發明説明（4) 爲達成上述之第一目的之第一形式之發明是’切斷、檢測或增幅結核菌之基因要素之P a b基因，或是源自該基因之RNA時之有效的低聚核苷酸；可與P a b基因或是源自該基因之R N A作特異地結合，如序列號碼1至 2 0所示之任一個序列中，至少連續1 〇個鹼基以上所形成之低聚核苷酸或是與這些低聚核苷酸成互補之低聚核苷酸。爲達成上述之第一目的之第二形式之發明之特徵爲，於上述之第一形式之發明中，上述之低聚核苷酸是延長 D NA反應之低聚核苷酸引子。爲達成上述之第一目的之第三形式之發明之特徵爲，於第一形式之發明中，修飾上述部份之低聚核苷酸，或是以可檢測之標識物質，成爲標識低聚核苷酸探針。爲達成上述之第一目的之第四形式之發明之特徵爲，於上述之第一形式之發明中，在不損其爲低聚核苷酸探針機能之範圍內，變換上述之低聚核苷酸之部份鹼基，而成爲合成低聚核苷酸。爲達成上述之第二目的之第一形式之發明，其特徵爲，以源自結核菌之p a b基因之R N A之特定序列爲模板，使用具有與該特定序列相同序列之第1引子，以及使用具有與該特定序列成互補序列之第2引子（此時，第1或第2之引子之任一方，在其5 /側含有RNA聚合酶之啓動子序列），以反轉錄酵素（R N A - dependent DNA polymerase)合成 cDNA 而形成雙股 RNA — DNA，以核糖核酸酶Η分解RNA—DNA雙股之RNA而生成本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) J·衣·

、1T 1243855 A7 _B7___ 五、發明説明（5 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 單股之D N A，使該單股之D N A爲模板，以D N A聚合酶（D N A — dependent DNA polymerase)生成具有啓動子序列之雙股D ΝΑ，可轉錄上述之特定序列或與上述之特定序列成互補之序列所形成之R N A，然後該雙股 DNA於RNA聚合酶的存在下，生成RNA轉錄產物，接著該R N A轉錄產物成爲上述之反轉錄酵素合成 c D N A之模板，在如此之R N A增幅步驟中，使用如序列號碼2 8至3 3所示之任一個序列中，至少連續1 0個鹼基以上所形成之第1引子，以及如序列號碼3 4至4 1 所示之任一個序列中，至少連續1 0個鹼基以上所形成，具有與部份之已增幅之結核菌之p a b基因之RNA序列成互補之序列之第2引子（此時，第1或第2之引子之任一方，在其5/側含有RNA聚合酶之啓動子序列）。經濟部智慧財產局B(工消費合作社印製爲達成上述之第二目的之第二形式之發明，其特徵爲，關於上述之第一形式之發明中之上述之增幅RNA步驟，可與增幅所生成之R N A轉錄產物作特異的結合，而且，於以嵌合性（intercalates)螢光色素標識之低聚核苷酸之存在下實施，測定反應液之螢光特性之變化而成（但是，該螢光色素標識之低聚核苷酸之序列與上述之第1及第 2引子不同）。爲達成上述之第二目的之第三形式之發明中，其特徵爲，設定上述之低聚核苷酸，與RNA轉錄產物至少有部份序列成互補結合，與不形成複合體時相比較，其螢光特性會產生變化。爲達成上述之第二目的之第四形式之發明之特徵爲，於上述之第三形式之發明中，上述本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8- 1243855 A7 B7 經齊部智^时產^肖工消費合作钍印製五、發明説明 ( 6 ) 1 1 之低聚核甘酸是由序列號碼 4 2 至4 4 所表示之任一個序 1 1 列中至少連續 1 0 個驗基以上所形成，或是其互補序列 1 1 〇請 1 閲 1 I 讀 1 I 圖面之簡單說明 & 之 1 1 圖 1 是使用 Μ Ρ — 1 至 Μ Ρ -20 R之低聚核苷酸，注意事 1 1 在 4 1 °c 下進行與結核菌 P a b 基因之標準R Ν A之結合 1 再 ά. 1 i 試驗後試樣之尿素變性 6 % 聚丙稀醯胺電泳照片（黑白 ’长本 gr 裝 I 相反 ) 0 m 頭方向是指特異條帶 (b a n d )的位置。第 Ά 1 1 1 至第 2 0 行分別爲使用 Μ P — 1至Μ P - 2 0 R進行結 1 1 合試驗時之結果 Ν 行爲 Ν e g a (使用稀釋液以取代低 1 1 聚核 -I-+- 甘酸 ) 0 另外，使用 R Ν A Maker ( 〇 · 1 至訂 I 1 k b 及 0 • 2 至 1 0 k b ) 爲分子量標誌（Μ 1行， 1 I Μ 2 行 ) 0 1 1 I 圖 2 爲關於實施例 2 中使用如表 2之組成（a )至 1 ( m ) 之低聚核甘酸進行 R Ν A之增幅反應時之電泳照 m 1 片 0 圖中表示 Ρ 爲初期 R N A 量1 0 3複製/試驗爲 1 1 R N A 試樣 Ν 爲陰性對照 ( 使用稀釋液以取代R Ν A試 1 I 樣 ) 0 使用 Ψ X 1 7 4 / Haellld ligest ( Maker 4)爲分子 1 1 量標誌 ( Μ 行 ) 〇圖 3 爲關於實施例3 中所進行之初期 1 1 R N A 量 1 0 1複製/ /試驗至] R 1 NT A 量： 1 0 5複製/試驗 1 1 ，隨反應時間與 R Ν A 之生成螢光增加比也增大之圖（A 1 I ) 以及初期 R Ν A 量之對數値及完成時間之間所得到之 1 1 I 檢量線 ( Β ) 〇初期複製數 1 0 2複製/ /試驗之R Ν A， 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 -9 - 1243855 A7 _ B7____ 五、發明説明（7) 約1 5分鐘可檢測，表示初期r N A量及完成時間之間之相關關係。 (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施發明之最佳形態如上所述，本發明之第一目的爲，提供低聚核苷酸，特異地切斷、增幅編碼結核菌之抗原蛋白p a b之p a b 基因或是源自這些基因之R ΝΑ，且有效地高感度地進行這些檢測及同定。經濟部智慧財4^78工消費合作Ti印製關於本發明之上述之低聚核苷酸，是於上述之RNA 增幅時，對於標的R Ν Α之分子內構造之自由空間，形成特異地互補結合之低聚核苷酸，不進行如上述之熱變性，與標的R Ν A特異地結合。因此本發明是提供，以較低溫度且一定溫度（3 5至5 0 °C，以4 1 °C爲宜）下，於結核菌RNA之分子內構造之自由空間結合之低聚核苷酸，將結核菌R Ν A特異地切斷、增幅或對檢測等有用之低聚核苷酸。更具體而言，本發明是以切斷上述標的RNA之低聚核苷酸探針，以P C R法增幅上述標的R Ν A之低聚核苷酸引子，以NASBA法增幅上述標的RNA之低聚核苷酸引子，然後作爲檢測未增幅或已增幅後之標的核酸之低聚核苷酸探針使用，提供達成迅速且高感度地檢測之低聚核苷酸。以切斷，增幅或檢測源自結核菌之序列號碼1至2 0 有用之本發明之低聚核苷酸之一例作示範。這裡所說之源自結核菌之RNA包含以此基因爲模板所製成之RNA。本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐〉 -10- 1243855 A7 ____B7^_____ 五、發明説明（8) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之低聚核苷酸是以包含全部序列號碼1至2 0中分別記載之鹼基序列爲宜，但因爲與源自結核菌之R N A作特異結合時，有1 〇個鹼基左右即足夠，因此於分別記載之鹼基序列之中，包含至少連續1 〇個鹼基以上所成之低聚核苷酸爲宜。本發明之低聚核苷酸，例如可作爲切斷R N A用之探針使用。於特定位置切斷標的R N A時，雜交本發明之低聚核苷酸與單股之標的RNA，使用只切斷RNA — D NA中雙股部份之RNA之酵素作用爲宜。作爲該酵素，通常使用已知具有核糖核酸酶Η活性之酵素爲宜。經濟部智慈財凌苟員工消費合作社印災本發明之低聚核苷酸，例如可作爲核酸增幅用之低聚核苷酸引子。以本發明之低聚核苷酸作爲引子，實施核酸增幅法時，可只增幅標的核酸即結核菌之核酸。增幅法中之可以PCR法、LCR法、NASBA法及3 SR法等爲例，但是其中以L C R法、N A S Β Α法及3 S R法等之可以一定溫度實施之核酸增幅法爲宜。以各種方法檢測此增幅產物，可檢測結核菌。此時，於增幅時所使用之低聚核苷酸以外，上述之低聚核苷酸亦可作探針使用，亦可以電泳確認增幅後之特定序列之斷片。本發明之低聚核苷酸，例如修飾其一部份或是以可檢測標識物質標識，而可作爲探針使用。欲檢測標的核酸時 ’以可檢測標識物質標識本發明之低聚核苷酸與單股之標的核酸雜交，關於雜交後之探針，檢測其上述之標識等即可。標識之檢測等，以適用標識物質之方法即可，例如使本&張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） "— -11 - 1243855 A 7 -7

_ Ο I 五、發明説明（Q ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用嵌合性螢光色素於標識低聚核苷酸時，若使用增加螢光強度性質之色素等，與標的核酸與低聚核苷酸探針所形成之雙股核酸嵌合’不除去標的核酸及未雜交之探針，亦可易於實施只檢測已雜交之探針。通常螢光色素等作爲標識使用時’除去標的核酸及未雜交之探針後檢測爲宜。關於檢測，要求以P C R法、N A S B A法及3 S R法等各種核酸增幅法，增幅試樣中之標的核酸至可測出之量。其中尤其是要求NA S B A法及3 S R法等之一定溫度核酸增幅法。其他方面，上述之已標識之低聚核苷酸探針，於反應液中共存時，爲不使探針作低聚核苷酸引子之機能，特別要求例如於3 /末端進行附加羥基乙酸等之修飾。經濟部智慧財走^資工消费合作社印^ 如上所述，本發明之第二目的爲，提供增幅試樣中源自P a b基因之R N A之增幅核酸步驟或增幅核酸步驟中所生成之R N A轉錄產物之檢測法。本發明之增幅步驟是 PCR法、NASBA法及及3SR法，其中由於反轉錄酵素及R N A聚合酶之協和作用（使反轉錄酵素及 R N A聚合酶於可協和地作用下之條件下反應），以增幅源自p a b基因之RNA序列之NASBA法及3 SR法等之一定溫度核酸增幅法爲宜。例如N A S B A法是以試樣中存在之源自結核菌 P a b基因之R N A之特定序列爲模板，以反轉錄酵素（ R N A — dependent DNA polymerase)合成 c D N A，以核糖核酸酶Η分解RNA-DMA雙股之RNA而生成單股之D N A，使該單股之D N A爲模板，以D N A聚合酶衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -12- 1243855 A7 ____B7___ 五、發明説明（1() (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (D N A — dependent DNA polymerase)生成具有啓動子序列之雙股D N A，可轉錄上述之特定序列或與前序列成互補之序列所形成之R N A，然後該雙股D N A於 RNA聚合酶的存在下，生成RNA轉錄產物，接著該 RNA轉錄產物成爲上述之反轉錄酵素合成c DNA之模板之增幅步驟。本發明是以，與源自結核菌P a b基因之 R N A具有相同序列，如序列號碼2 8至3 3所示之任一個序列中，至少連續1 0個鹼基以上所形成之第1引子，以及如序列號碼3 4至4 1所示之任一個序列中，至少連續1 0個鹼基以上所形成，具有與部份之已增幅之結核菌之p a b基因之RNA序列成互補之序列之第2引子。以使用此二引子（此時，第1或第2之引子之任一方，在其 5 >端含有RNA聚合酶之啓動子序列）爲特徵。經濟部智慈时/l^a(工消費合作fi印製而且，對於反轉錄酵素、DNA聚合酶及核糖核酸酶 Η並無特別限制，但以皆具有這些活性之A Μ V反轉錄酵素爲宜。另外，關於R Ν Α聚合酶亦無特別限制，但以 T 7噬菌體RNA聚合酶及S P 6噬菌體RNA聚合酶爲宜。在上述之增幅步驟，源自結核菌p a b基因之RNA 序列中之5 >端領域爲特定序列領域，添加與其重覆複製 (1至1 0個鹼基）之鄰接領域相互補之低聚核苷酸，切斷上述之源自結核菌p a b基因之RNA之特定序列之 5 /端領域，作爲核酸增幅初期之模板，亦可增幅特定序列不在5 >端領域之源自結核菌p a b基因之R N A序列本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -13- 1243855 A7 _B7 _ 五、發明説明（11) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 。此時例如可使用序列號碼2 2至2 7之低聚核苷酸切斷 (但是，使用上述之增幅步驟中第2引子以外之低聚核苷酸之序列）。並且，上述切斷用之低聚核苷酸，爲抑制 3 /端之延長反應，將3 /末端之羥基以化學修飾（如胺化）爲宜。以上之核酸增幅法所得到之增幅產物是，可以既知之核酸檢測方法檢測，但適合之形式，以嵌合性螢光色素所標識之低聚核苷酸之存在下，實施上述之核酸增幅，測定反應液之螢光特性之變化爲宜。該低聚核苷酸之特徵爲，以低聚核苷酸中之磷介由連結子（linker)與嵌合性螢光色素結合，因爲標的核酸（互補之核酸）形成雙股時，嵌合劑部份嵌合於雙股部份，使其螢光特性變化，所以不需要分離分析（Ishiguro，T·等（1996)Nucleic Acids Res. 24(24)4992-4997)。經濟部智惡財4^員工消費合作钍印製關於該低聚核苷酸之序列，只要是對於其增幅產物之至少一部份，具有互補之序列時，並無特別限制，如序列號碼4 2至4 4所示之序列中，至少有連續1 〇個鹼基所成之序列，或是其互補序列爲宜。另外，爲抑制該低聚核苷酸成引子之延長反應，將該低聚核普酸3 /端之羥基以化學修飾（如附加羥基乙酸）爲宜。因此，源自結核菌p a b基因之RNA中之特定序列及相同序列所成之RNA，可於同一管內，以一定溫度、單一階段增幅及檢測，易適用於自動化。以下，以實施例詳細說明本發明，但本發明並只限於本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14- 1243855 A7 _B7_ ____ 五、發明説明（12) 這些實施例。實施例1 選擇在4 1°C下，與結核菌p a b - RNA特異結合之低聚核脊酸。並且，p a b — RNA爲，以包含P a b 之鹼基序列之雙股D N A爲模板之體外轉錄（invitro transcription)，合成、精製而成之R N A。 (1)包含源自結核菌p a b基因之P a b — RNA 之鹼基號碼1 1 1至1 4 3 6 ( R N A之鹼基號碼是依照 Inf. And Immun. 57,2481-2488，1989 )之標準 R N A，以 2 6 0 n m之紫外部吸收定量後，使用R N A稀釋液（ 10mM之Τι: is—鹽酸緩衝溶液（pH8 · 0)、 0 · ImM 之 EDTA、〇 · ImM 之 DTT 及 0 · 5U / // L之RNase inhibitor (寶酒造（株）製））稀釋成 1.53pmol///L〇 (2 )分注如以下組成之反應液1 4 // L於P C R管 (容量 0 · 5 m 1 ; Gene Amp Thin-Walled Reaction Tube，Perkin Elmer 製）。反應之組成（各濃度爲於1 5 // L之最終反應液量之濃度） 6 0 m M Tri s -鹽酸緩衝溶液（ph8 . 6) 1 7 m Μ 氯化鎂 9 0 m Μ 氯化鉀 3 9 U RNase inhibitor (寶酒造（株）製）本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .!·裝· 訂經濟部智总財凌局資工消費合作社印製 -15- 1243855 A7 B7 _ 五、發明説明（13> 1 m M D Τ Τ

Ο . Ο 6 6 // Μ 標準 RNA (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 容量調整用蒸餾水 Ο · 2 // Μ低聚核苷酸（使用以下任何一種低聚核苷酸） ΜΡ - 1 R (與結核菌P a b基因之鹼基號碼2 1 6 至2 3 6成互補之低聚核苷酸，序列號碼1 ) MP — 2R (與結核菌P a b基因之鹼基號碼2 6 8 至2 8 8成互補之低聚核苷酸，序列號碼2 ) MP — 3R (與結核菌P a b基因之鹼基號碼3 1 9 至3 3 9成互補之低聚核苷酸，序列號碼3 ) MP — 4R (與結核菌pa b基因之鹼基號碼4 4 5 至4 7 6成互補之低聚核苷酸，序列號碼4 ) MP - 5R (與結核菌pab基因之鹼基號碼484 至5 0 4成互補之低聚核苷酸，序列號碼5 ) MP - 6R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼4 9 8 至5 1 7成互補之低聚核苷酸，序列號碼6 ) 經濟部智慧財產苟員工消費合作社印製 MP — 7R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼5 3 5 至5 5 4成互補之低聚核苷酸，序列號碼7 ) MP — 8R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼6 7 5 至6 9 7成互補之低聚核苷酸，序列號碼8 ) MP - 9R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼7 1 2 至7 3 1成互補之低聚核苷酸，序列號碼9 ) MP - 1 OR (與結核菌p a b基因之鹼基號碼本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） • 16 - 1243855 A7 B7 _ 五、發明説明（^ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 7 2 4至7 4 3成互補之低聚核苷酸，序列號碼1 0 ) MP - 1 1 R (與結核菌p a b基因之驗基號碼 7 5 7至7 7 8成互補之低聚核苷酸，序列號碼1 1 ) MP - 1 2R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼 7 9 0至8 0 9成互補之低聚核苷酸，序列號碼1 2 ) MP — 1 3R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼 9 3 7至9 5 6成互補之低聚核苷酸，序列號碼1 3 ) MP — 1 4R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼 9 6 1至9 8 2成互補之低聚核苷酸，序列號碼1 4 ) MP - 1 5R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼 1 0 1 1至1 0 3 0成互補之低聚核苷酸，序列號碼1 5 ) MP — 1 6R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼 1 0 7 1至1 0 9 3成互補之低聚核苷酸，序列號碼1 6 ) MP - 1 7R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼 1 1 0 3至1 1 2 3成互補之低聚核苷酸，序列號碼1 7 經濟部智慧財/i^M工消費合作社印製 ) MP - 1 8R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼 1 1 6 6至1 1 8 5成互補之低聚核苷酸，序列號碼1 8 ) MP - 1 9R (與結核菌p a b基因之鹼基號碼 1 2 5 6至1 2 7 8成互補之低聚核苷酸，序列號碼1 9 ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） -17- 1243855 A7 B7 _ 五、·發明説明（ig) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) MP - 2 OR (與結核菌p a b基因之鹼基號碼 1 2 7 0至1 2 9 0成互補之低聚核苷酸，序列號碼2 0 ) (3 )於4 1 °C下，保溫上述之反應液5分鐘後，添 '~~挪—… .................〜一,……〜加1 /zL之含有8U///L之AMV反轉錄酵素（寶酒造 (株）製，本酵素可切斷DNA/RNA之雙股RNA之酵素）之溶液。 (4 )其次，於4 1 °C下，保溫P C R管1 〇分鐘。 (5 )爲確定反應後之切斷斷片，實施尿素變性聚丙烯醯胺膠體（6%濃度之聚丙烯醯胺，尿素7M)電泳。電泳後使用SYBR Green Π(寶酒造（株）製）進行染色。結合低聚核苷酸於標的R Ν Α之特定部位時，由於 A Μ V反轉錄酵素之核糖核酸酶Η活性，切斷D N A / R N A之雙股R N A，檢測特定條帶。電泳結果如圖1 (黑白相反）所示。低聚核苷酸與標經濟部智慈財凌局Μ工消費合作社印製準R N A特異地結合時，標準R N A於此領域分解，生成特定鏈長之分解產物。表1是表示，低聚核苷酸與標準 R N A特異結合時之位置，以及所期待之條帶鏈長。於 MP-1R、MP-2R、MP — 4R、MP — 6R、 MP-7R、MP-8R、MP — 9R、MP - 12R、 MP — 13R、MP — 14R、MP — 15R、MP 〜 1 了 R及MP — 1 8 R時，確認出特定之條帶二—之後，顯示出這些低聚核苷酸於4 1 °C 一定之狀態下，與結核菌卜—.......— 上a b基因RNA強力結合。另外，表1中之鹼基號碼爲本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） ^ -18- 1243855 A7 B7 五、發明説明（1Θ> 結核菌p a b基因之鹼基序列號碼。而且，表中分別表示，〇是認爲只有特異條帶，X是表示雖看到特異條帶，亦看到非特異條帶。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財凌局Μ工消费合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） -19- 1243855 A7 B7 五、發明説明（17) 經濟部智慈財/i局a(工消費合作社印製

表 1 低聚核苷酸鹼基位置推定切斷條帶鏈長（鹼基）結果 MP-1R 206-236 111,1200 〇 MP-2R 268-288 163,1148 〇 MP-3R 319-339 214,1097 X MP-4R 454-476 350,960 〇 MP-5R 484-504 379,932 X MP-6R 498-517 393,919 〇 MP-7R 535-554 430,882 〇 MP-8R 674-697 570,739 〇 MP-9R 712-730 607,705 〇 MP-10R 724-743 619,693 X MP-1 1R 757-778 652,658 X MP-12R 790-809 685,627 〇 MP-13R 937-956 832,343 〇 MP-14R 961-982 856,454 〇 MP-15R 1011-1030 906,406 〇 MP- 16R 1071-1093 966,343 X MP-17R 1103-1123 998,313 〇 MP-18R 1166-1185 1061,251 〇 MP-19R 1256-1278 1151,158 X MP-20R 1270-1290 1165,146 X (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20- 1243855 A7 B7 五、發明説明（18) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 如上述之說明，即使r N A形成分子內構造，很可肯g 阻礙引子或探針的結合，在較低溫且一定溫度（3 $至 5 0 C ’以4 1 °C爲宜）之條件下，本發明之低聚核苷酸是結核菌基因要素之源自p a b基因之RNA成互補結合之低聚核苷酸。因此，不使標的r N A熱變性，可與低聚核苔酸特異地結合。如此，本發明之低聚核：g：酸，於切斷、增幅或檢測源自結核菌p a b基因之R N A等時，即是於R Μ A增幅時’有效地作爲低聚核苷酸引子或低聚核苔酸探針使用。除上述以外，本發明之低聚核苷酸於增幅或檢測結核菌p a b基因等是有用的。另外，上述之具體的低聚核普酸及互補之低聚核苷酸亦有用於，以P C R法等增幅雙股 D N A及檢測反轉錄R N A而得到c D N A等。經濟部智慧財4局a(工消費合作社印製本發明之低聚核苷酸，不只限於序列表所記載之鹼基序列（2 0鹼基至2 3鹼基），這些序列中，至少有連續 1 0個鹼基所成之序列，或是其互補序列即可。可淸楚地知道，這些於較低溫（以4 1 °C爲宜）條件下，只需要 1 0個鹼基左右之鹼基序列就足以確保引子或探針於標的核酸之特異性。實施例2 使用與源自結核菌p a b基因之RNA特異地結合之低聚核苷酸，進行增幅反應。 (1 )將含有源自結核菌P a b基因之p a b - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -21 - 1243855 A7 _ B7 五、發明説明（19) rNa之鹼基號碼1 1 1至1 4 3 6之標準RNA ( 1 3 2 6 m e r )(序列號碼2 1 )，使用R N A稀釋液 (l〇mM 之 Tris- nCI ( ρ Η 8 . Ο )、lmM 之 EDTA、〇 · 5U///L 之 RNase inhibitor (寶酒造製）及5mM之DTT)稀釋成1 03複製/5//L。 (2 )分注如以下組成之反應液2 0 // L於〇 . 5 容量之 PCR 管（Gene Amp Thin-Walled Reaction Tube，Perkin Elmer製），並添加5//L上述之RNA試樣 ο 反應之組成（各濃度爲於30 // L之最終反應液量之濃度） 6 0 m M Tr i s —鹽酸緩衝溶液（ph8 · 6) 1 7 m M 氯化鎂 9 0 m M 氯化鉀 3 9 U RNase inhibitor

1 m M D T T 各 0 · 2 5mM 之 dATP 、dCTP 、GTP 、

U T P

3 · 6 m Μ I T P

各 3 · OmM之 ATP 、CTP 、GTP 、UTP 0 . 1 6 // M 之第1低聚核苷酸 1 . 0 β M 之第2低聚核苷酸 1 . 0 // Μ 之第3低聚核苷酸 13% D M S 〇容量調整用蒸餾水本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 、1Τ 經濟部智慧財產局肖工消費合作社印製 -22- 1243855 A7 ___ B7 五、發明説明（2〇) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (3 )以第1低聚核苷酸、第2低聚核苷酸及第3低聚核苷酸爲表2之說明中所示之序列之低聚核苷酸，進行 R N A增幅反應。另外，如表2所示之組成之溶液，調製第1低聚核苷酸、第2低聚核苷酸及第3低聚核苷酸之組成。 (4 )於4 1 °C下，保溫上述之反應液5分鐘後，添加5 /z L如以下組成之酵素液。酵素液之組成（各濃度爲3 0 // L之最終反應液量之濃度） 1.7% 山梨糖醇 3 β g 牛血淸白蛋白 1 4 2 U T7RNA 聚合酶（Gibco) 8 U AMV反轉錄酵素（寶酒造製）容量調整用蒸餾水 (5)其次，於41 °C下，保溫PCR管30分鐘。 (6 )爲確定反應後之R N A增幅部份，實施洋菜糖膠体（agarose gel ) ( 4 %濃度之洋菜糖）電泳。電泳後經濟部智慈財產局資工消費合作社印製使用SYBR Green Π (寶酒造製）進行染色。結合低聚核苷酸於標的R N A之特定部位時，增幅第2低聚核苷酸及第3低聚核苷酸所包圍部份之RNA，觀察特定之條帶〇電泳結果之照片如圖2所示，此反應中所增幅之特定條帶之鏈長如表2所示。使用如表2所示之低聚核苷酸之組成，於R N A增幅反應中，能確定組成（c ) 、( h ) 及（m )中特定之條帶，所以表示使用這些組成之低聚核本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23- 1243855 A7 _B7 五、發明説明（21) 苷酸可有效地檢測結核菌。組成第1低聚第2低聚第3低聚增幅產物長度核脊酸核苷酸核苷酸 (驗基數） ⑷ -----—™ MP-4S MP-4F MP-9R 270 (b) MP-4S MP-4F MP-12R 348 (c) MP-13S MP-13F MP-17R 182 (d) MP-1S MP-1F MP-3R 118 (e) MP-4S MP-4F MP-10R 282 (f) MP-4S MP-4F MP-11R 317 (g) MP-6S MP-6F MP-10R 241 (h) MP-6S MP-6F MP-1 1R 276 (i) MP-9S MP-9F MP-16R 377 (j) MP-12S MP-12F MP-16R 299 (k) MP-13S MP-13F MP-16R 152 (1) MP-13S MP-13F MP-20R 349 (m) MP-6S MP-6F MP-9R 229 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局肖工消費合作社印製表2是表示本實驗系中所使用第1、第2、第3低聚核苷酸之組成，以及使用其組成進行R N A增幅反應時，所增幅之特定條帶之鏈長。第1低聚核苷酸之鹼基序列中，將3 /末端之羥基胺化。第2低聚核苷酸之鹼基序列中，將5 /末端之第1號之「A」至第28號之「A」之領本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） -24- 1243855 A7 B7五、發明説明（22) 域附加T 7聚合酵素之引子之序列。另外，鹼基號碼是結核菌P a b基因之鹼基序列之號碼。苷 Ms s s S 2 3 聚 1 4 6 9 1 1 低 i - - I I -1± p p p p p P第 MMMMM Μ

/IV Γν ^' /IV 馬馬馬馬碼碼號號號號 0 0 酸序序序序(0谓鹼鹼鹼鹼鹼鹼碼碼碼碼碼碼號號^號號5¾ 其土基 s S»σδπ 3 7 13)-) ο 5 2 4 5 7 8 9 至至至至至至 3 3 4 8 6 3 8 3 15 9 0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慈財凌局資工消費合作社印製

苷 c .广核 F F F F 2 3 聚 1 4 6 9 1 1 低-- I I - - CXI Ph p p p p Di第 Μ Μ Μ Μ MM Γ\ Γ\ 碼㈣碼ΪΙ碼碼號號號號_ _ 酸序序序序()?(/? 碼碼碼碼基基基基鹼鹼鹼鹼 5 9 3 4 2 4 5 7 至至至至 8 8 9 3 2 6 0 2 2 8 至 ο ο 8 碼 If 基鹼 2 碼基鹼 7 9 至 8 辱辱馬辱 5 在號號歹歹歹歹 ;酸序序浪浪 ^ ( ( R R 核 R R ο 1 聚 3 9 1—II 低- I - I 3 ρ ρ ρ Ρ 第 ΜΜΜΜ 碼碼碼碼 5is^^§f 基基基基驗驗鹼鹼

9 2 TX 2 5 至至至至 4 7 3 3 3 7 4 7 7 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -25- 1243855 A7 B7 五、發明説明（23) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} M p - 1 2 R (序列號碼3 8，鹼基號碼7 9 0至8 0 9 ) Mp — 16R (序列號碼3 9，鹼基號碼107 1至 1 0 9 3 ) 7R (序列號碼4〇，鹼基號碼1 1 03至 112 3)

Mp - 2 0R (序列號碼4 1，驗基號碼1 2 7 0至 1 2 9 0 ) 實施例3 本發明中，使用低聚核苷酸之組成，進行關於源自結核菌p a b基因之p a b — RNA之各種初期複製數之檢測。 (1 )將與實施例2相同的源自結核菌p a b基因之 P a b— RNA之標準RNA，使用RNA稀釋液（ l〇mM 之 Tr i s — nCi (pH8 · 0) 、ImM 之 EDTA、〇 · 5U///L 之 RNaseinhibitor (寶酒造製 )及5mM之DTT)稀釋成1 01複製/ 5 //L至經濟部智慧財凌笱8工消費合作社印製 1 0 5複製/ 5 // L。對照試驗區（陰性）只使用稀釋液〇 (2 )分注如以下組成之反應液2 0 // L於P C R管 (容量 0 · 5 m 1 i Gene Amp Thin-Walled Reaction Tube，Pei*kin Elmer製），並添加5"L上述之RNA試樣 ο 反應之組成（各濃度爲於3 0 // L之最終反應液量之濃度）本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26- I243855 A7

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 7 m M 氯化鎂 1 5 0 m M 氯化鉀 3 9 U RNase inhibitor

1 m M D T T 各〇 . 2 5mM 之 dATP、dCTP、GTP、

U T P

3 . 6 m Μ I T P

各 3 .〇mM 之 ATP、CTP、GTP、UTP

0 . 6 μ M 之第1低聚核苷酸（MP — i3s，序歹U 號碼6，3 /末端之羥基已胺化）訂 1 . 0 β Μ 之第2低聚核苷酸（MP — i3f，序歹ij 號碼3 3 ) 1 . 〇 β Μ 之第3低聚核苷酸（ΜΡ — i7f，序歹ij 號碼4 0 ) 經濟部智慧財凌局S工消費合作社印製以2 5 η Μ之嵌合性螢光色素，標識低聚核苷酸（γ〇 — Pabl076_S — G’序列號碼42，嵌合性螢光色素標識5 /末端之第1 〇號之「A」至第1 χ號之「τ 」之間之磷。另外，以羥基乙酸修飾3 /末端之羥基。） 1 3 % D M S 0 容量調整用蒸餾水 (3 )於4 1°C下’保溫上述之反應液5分鐘後，添加5 // L如以下組成且預先以4 1 °C保溫2分鐘之酵素液本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X 297公董） -27- 1243855 A7 B7 _ 五、發明説明（25) 1.7% 山梨糖醇 3 β g 牛血淸白蛋白 1 4 2 U 丁 7RNA 聚合酶（Gibco) 8 U AMV反轉錄酵素（寶酒造製）容量調整用蒸餾水 (4 )其次，使用可直接測定P C R管之附溫度調節機能之螢光光度計，於4 1 t下保溫，以激發波長4 7 〇 n m，螢光波長5 1 0 n m，隨時間經過，測定其反應溶如圖3 ( A )所示，以酵素添加時刻爲〇，試樣之螢光增加比（所定時刻之螢光強度値+背景之螢光強度値）之經時變化。另外，初期R N A量之對數値及完成時間（當螢光增加比，即陰性之平均値加上3倍標準偏差値之値，成1 . 2時之時間）之關係之結果如圖3 ( B )所示。另外，初期RNA量爲1 01複製/試驗至1 05複製/ 試驗。圖3 (A)中，1 02複製約1 5分鐘檢出。得到標的RNA之初期濃度與其相關之螢光輪廓（profile )之檢量線，表示可定量未知試樣中存在之源自結核菌P a b基因之R N A。由上述所示，本發明可迅速且高感度地檢測結核菌。如上述之說明，關於本發明中，即使RNA形成分子內構造，很可能阻礙引子或探針的結合，在較低溫且一定溫度（3 5至5 0 °C，以4 1 °C爲宜）之條件下，使用與本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 訂經濟部智慧財4局員工消費合作社印製 -28- 1243855 A7 B7 五、發明説明（2Θ^ 源自結核菌p a b基因之R Ν Α作特異地結合，迅速地增幅且檢測標的R N A等之低聚核苷酸引子或低聚核苷酸探針之組成是非常有用的。關於本發明之低聚核苷酸之鹼基長度，不只限於具體記載之鹼基序列，這些序列中，至少含有連續1 0個鹼基以上所成之低聚核苷酸。可淸楚地知道，這些於較低溫（以4 1°C爲宜）條件下，只需要1 0個鹼基左右之鹼基序列就足以確保引子或探針於標的核酸之特異性。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·>·裝. 訂經濟部智慧財/i^7R工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -29- 1243855 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（2 ) <400> 2 ggggtagtcg cgacagtacc g 21 <210〉 3 <211> 21 <212> DNA<213〉人工.序列 <220> <223> MP-3R <400> 3 gggtagagca gcgtgctacc g 21 <210> 4 <211> 22 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223> MP-4R <400> 4 gataggcgtc ggaggcccca at 22 <210〉 5 (請先閱讀背面之注意事- J· 項再填· 裝-- :寫本頁)

、1T 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -2- 1243855 A7 B7 五、發明説明（3)

〈211> 21 <212> DNA <213〉人工序歹ij <220〉 <223> MP-5R <400〉 5 ttgtgcgcgg ccatatcacc t 21

<210〉 6 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序歹丨J <220> <223〉 MP-6R <400> 6 gttcatcagc cccttgtgcg 20

<210> 7 <211> 20 〈212> DNA <213〉人工序列 <220〉本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -«^-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -3- 1243855 A7 B7 五、發明説明（4 ) 〈223> MP-7R <400〉 7 tgtagttgac ctgctgagcg 20

<210〉 8 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223> MP-8R <400〉 8 cggaactacc gcggtgccgg gca 23

<210> 9 <211> 20 〈212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> MP-9R <400> 9 agaaggtgtc accggacccg 2〇本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -4- 1243855 A7 B7 五、發明説明（5 )

<210> 10 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> MP-10R <400〉 10 actgggtgaa caagaaggtg 20

<210> 11 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> MP-11R <400> 11 cttgccccag ccctcgggat ct 22

<210> 12 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'〆297公釐） c •辦衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智葸財產局員工消費合作社印製 1243855 A7 B7 五、發明説明（6 ) <220> <223> MP-12R <400> 12 ggaagtcgac ggtggtgccg 20

<210> 13 <211〉 20 <212〉 DNA 〈213>人工序歹丨J <220> <223> MP-13R <400> 13 tattgcctag ttgggcctcg 20

<210> 14 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> MP-14R <400> 14 gtcgggcaac aagaaattgc ca 22 ,·^-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本瓦) 訂 4 經濟部智惡財產局Β工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -6 - 1243855 A7 B7 五、發明説明（7 )

<210〉 15 <211〉 20 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223> MP-15R <400> 15 cggggttttc gatgcgaagc 20

<210〉 16 <211〉 23 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉 MP-16R <400> 16 gtagttgatg atcgggtagc cgt 23

<210〉 17 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工序列本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) |裝. 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243855 A7 B7 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製五、發明説明（8) <220〉 <223> MP-17R <400> 17 cttttgccgg ttgttgacga t <210> 18 <211〉20· <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223> MP-18R <400> 18 ttgttgccgt cggtgatcgc <210〉 19 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> MP-19R <400> 19 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ;裝. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8 - 1243855 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（9) ggctagctgg aaatcgtcgc gat 23 <210〉 20 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉 MP-20R <400〉 20 ggtggtcaac gaggctagct g 21 <210> 21 〈211〉 1326 〈212〉 RNA 〈213>結核菌 <220〉 <223〉結核菌之pad遺傳子之標準RNA <400> 21 gacgccaagc gcggaaauug aagagcacag aaagguaugg cgugaaaauu cguuugcaua 60 cgcuguuggc cguguugacc gcugcgccgc ugcugcuagc agcggcgggc uguggcucga 120 aaccaccgag cgguucgccu gaaacgggcg ccggcgccgg uacugucgcg acuacccccg 180 cgucgucgcc ggugacguug gcggagaccg guagcacgcu gcucuacccg cuguucaacc 240 uguggggucc ggccuuucac gagagguauc cgaacgucac gaucaccgcu cagggcaccg 300 -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -1¾. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） -9- 1243855 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印敗

五、發明説明（1C)) guucuggugc cgggaucgcg caggccgccg ccgggacggu caacauuggg gccuccgacg 360 ccuaucuguc ggaaggugau auggccgcgc acaaggggcu gaugaacauc gcgcuagcca 420 ucuccgcuca gcaggucaac uacaaccugc ccggagugag cgagcaccuc aagcugaacg 480 gaaaaguccu ggcggccaug uaccagggca ccaucaaaac cugggacgac ccgcagaucg 540 cugcgcucaa ccccggcgug aaccugcccg gcaccgcggu aguuccgcug caccgcuccg 600 acggguccgg ugacaccuuc uuguucaccc aguaccuguc caagcaagau cccgagggcu 660 ggggcaaguc gcccggcuuc ggcaccaccg ucgacuuccc ggcggugccg ggugcgcugg 720 gugagaacgg caacggcggc auggugaccg guugcgccga gacaccgggc ugcguggccu 780 auaucggcau cagcuuccuc gaccaggcca gucaacgggg acucggcgag gcccaacuag 840 gcaauagcuc uggcaauuuc uuguugcccg acgcgcaaag cauucaggcc gcggcggcug 900 gcuucgcauc gaaaaccccg gcgaaccagg cgauuucgau gaucgacggg cccgccccgg 960 acggcuaccc gaucaucaac uacgaguacg ccaucgucaa caaccggcaa aaggacgccg 1020 ccaccgcgca gaccuugcag gcauuucugc acugggcgau caccgacggc aacaaggccu 1080 cguuccucga ccagguucau uuccagccgc ugccgcccgc gguggugaag uugucugacg 1140 cguugaucgc gacgauuucc agcuagccuc guugaccacc acgcgacagc aaccuccguc 1200 gggccaucgg gcugcuuugc ggagcaugcu ggcccgugcc ggugaagucg gccgcgcugg 1260 cccggccauc cggugguugg gugggauagg ugcggugauc ccgcugcuug cgcuggucuu 1320 ggugcu 1326 <210〉 22 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序歹丨J <220> <223〉 MP-IS (請先閲讀背面之注意事 ι· •項再填」裝-- :寫本頁) 訂 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10- 1243855 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（11) <400〉 22 gtggtttcga gccacagccc gccg <210> 23 <211> 24 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223> MP-4S <400> 23 gataggcgtc ggaggcccca atgt <210〉 24 <211〉 24 <212> DNA<213〉人工序列 <220> <223〉 MP-6S <400〉 24 gttcatcagc cccttgtgcg cggc <210〉 25 <211> 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 24 24 24 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝- 訂 -11 - 1243855 A7 B7 五、發明説明（12)

<212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> MP-9S <400> 25 agaaggtgtc accggacccg tcgg 24

<210〉 26 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> MP-12S <400〉 26 ggaagtcgac ggtggtgccg aagc 24

<210〉 27 <211〉 24 <212> DNA <213>人工序列 <220>

<223〉 MP-13S 衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局S工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -12- 1243855 A7 B7 五、發明説明（13) · <400> 27 tattgcctag ttgggcctcg ccga 24

<210〉 28 <211> 51 <212〉 DNA 〈213>人工序歹丨J <220〉 <223> MP-1F <400〉 28 aattctaata cgactcacta tagggagacg aaaccaccga gcggttcgcc t 51 <210> 29 .

<211〉 51 <212〉 DNA 〈213>人工序歹!J <220> <223> MP-4F <400> 29 aattctaata cgactcacta tagggagaac gcctatctgt cggaaggtga t 51 <210> 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0><297公釐） m^-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局S工消費合作社印製 -13- 1243855 A7 B7 五、發明説明（14)

<211> 51 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> MP-6F <400> 30 aattctaata cgactcacta tagggagact gatgaacatc gcgctagcca t 51

<210〉 31 <211〉 51 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉 MP-9F <400〉 31 aattctaata cgactcacta tagggagaac accttcttgt tcacccagta c 51

<210> 32 <211> 51 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i裝·

、1T 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 -14- 1243855 A7 B7 五、發明説明（15)

<223> MP-12F <400> 32 aattctaata cgactcacta tagggagatc gacttcccgg cggtgccggg t 51

〈210〉 33 <211〉 51 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> MP-13F 〈400〉 33 aattctaata cgactcacta tagggagata ggcaatagct ctggcaattt c 51

<210> 34 <211〉 21 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> MP-3R <400〉 34 gggtagagca gcgtgctacc g 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2l〇X297公釐） _ 15_ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

*1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印災 1243855 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（16) <210> 35 <211> 20 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223> MP-9R <400〉 35 agaaggtgtc accggacccg 20 <210> 36 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉 MP-10R <400〉 36 actgggtgaa caagaaggtg 20 <210〉 37 <211> 22 <212〉 DNA <213> 人工序列 (請先閲讀背面之注意事- J· >項再填· 裝-- 寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- 1243855 A7 B7 五、發明説明（17) <220> (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <223> MP-11R <400> 37 cttgccccag ccctcgggat ct 22

<210〉 38 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> MP-12R <400> 38 ggaagtcgac ggtggtgccg 20

<210〉 39 <211> 23 <212〉 DNA 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製〈213>人工序列 <220〉 <223> MP-16R <400〉 39 gtagttgatg atcgggtagc cgt 23 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1243855 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（18) <210〉 40 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序歹[J <220> <223> MP-17R <400> 40 cttttgccgg ttgttgacga t 21 <210〉 41 <211> 21 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223> MP-20R <400> 41 ggtggtcaac gaggctagct g 21 <210〉 42 <211〉 20 <212〉 DNA <213>人工序歹Ij (請先閲讀背面之注意事 I# ▼項再填· 裝-- :寫本頁)

*1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -18- 1243855 A7 B7 五、發明説明（19) <220> (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 〈223> YO-Pab 1076-S-G <400> 42 tcgtagttga tgatcgggta 20

<210> 43 <211〉 20 <212> DNA <213>人工序歹lj : <220〉 <223> Y〇-Pab 537-S-G <400〉 43 gttgtagttg acctgctgag 20 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

<210> 44 <211> 20 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220> <223〉 Y〇-Pab 978-S-G <400> 44 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -19- 1243855 A7 B7 五、發明説明（2〇) ctgaatgctt tgcgcgtcgg 20 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局®工消費合作杜印製本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20-

Claims

A8 B8 C8 D8 夂、申請專利範圍1 第9 1 1 1 6495號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國94年7月22日修正 1 · 一種低聚核苷酸，其爲使用於切斷、檢測或增幅結核菌之基因要素的p a b基因或來自該基因之RNA時的低聚核苷酸，其特徵爲可與p a b基因或來自該基因之 R N A作特異性鍵結，如序列號碼1至2 〇所示之任一個序列所形成之低聚核苷酸或與這些低聚核苷酸成互補之低聚核苷酸。 2 ·如申請專利範圍第1項之低聚核苷酸，其中該低聚核苷酸爲欲進行D N A延長反應之低聚核苷酸引子。 3 ·如申請專利範圍第1項之低聚核苷酸，其中該低聚核苷酸爲，其一部份被修飾或經可檢測的標識物質作標識之低聚核苷酸探針。 4 ·如申請專利範圍第1項之低聚核苷酸，其中該低聚核苷酸爲，未損害作爲低聚核苷酸探針的機能之範圍內，變換其部份驗基，而成爲合成低聚核苔酸。 5 · —種結核菌之P a b基因增幅步驟，其特徵爲利用以來自試樣中存在之結核菌基因要素之p a b基因之 R N A之特定序列爲模板，使用具有與該特定序列相同序列之第1引子，以及具有與該特定序列成互補序列之第2 引子，藉由RNA依賴DNA聚合酶（RNA — dependent DNA polymerase)合成 c D N A，以核糖核酸本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） --------會—I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、π 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243855 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 酶Η分解RNA-DNA雙股之RNA而生成單股之 DNA，以該單股之DNA爲模板，藉由DNA依賴 D Ν Α 聚合酶（D N A — dependent DNA polymerase)生成具有可轉錄該特定序列或與該特定序列成互補序列所形成之RNA的啓動子序列之雙股DNA，然後該雙股 DNA於RNA聚合酶的存在下，生成RNA轉錄產物，接著該RNA轉錄產物成爲該反轉錄酵素合成c DNA之模板之R Ν A增幅步驟的檢測法中，使用如序列號碼2 8 至3 3所示之任一個序列所形成，具有與欲增幅之結核菌之p a b基因的R Ν A序列一部份相同之序列的第1引子，以及如序列號碼3 4至4 1所示之任一個序列所形成的具有與欲增幅之結核菌之p a b基因的R Ν A序列一部份成互補序列之第2引子，其中第1引子或第2引子之任一引子爲5 /側上具有附加R Ν A聚合酶的啓動子序列之序列。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 ·如申請專利範圍第5項之增幅步驟，其中該第1 引子爲序列號碼3 3所示序列所成、且該第2引子爲序列號碼4 0所示序列所成、或該第1引子爲序列號碼3 0所示序列所成、且該第2引子爲序列號碼3 7所示序列所成、或該第1引子爲序列號碼3 0所示序列所成、且該第2 引子爲序列號碼3 5所示序列所成。 7 ·如申請專利範圍第5項之增幅步驟，其中關於該 RNA增幅步驟，可藉由與增幅所生成之RNA轉錄產物作特異性鍵結，且於以嵌合性螢光色素所標識之低聚核苷本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) 1243855 B8 C8 D8 六、申請專利範圍3 酸之存在下實施’測定反應液之螢光特性之變化而成但該經標識之低聚核脊酸係與該第1及第2引子相異之序列）〇 8 ·如申請專利範圍第7項之增幅步驟，其中該經標識之低聚核苷酸爲設計成與r N A轉錄產物的至少一部份序列成互補鍵結，與不形成複合體時相比較，其螢光特性會產生變化者。 9 ·如申請專利範圍第8項之增幅步驟，其中該經標識之低聚核苷酸係由序列號碼4 2至4 4所表示之任一個序列中之至少連續1 〇個鹼基所形成之序列，或爲其互補序列。 9^II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I 適準標家一國一國釐公 7 29