JPH114693A - 炭疽菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
炭疽菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH114693A JPH114693A JP9264059A JP26405997A JPH114693A JP H114693 A JPH114693 A JP H114693A JP 9264059 A JP9264059 A JP 9264059A JP 26405997 A JP26405997 A JP 26405997A JP H114693 A JPH114693 A JP H114693A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 配列番号５から得られる核酸配列を持
ち、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る部位を１つ
以上含むオリゴヌクレオチド。配列番号１及び配列番号
３から得られる核酸配列を持っていない該オリゴヌクレ
オチド。バチラスセレウス又はバチラスチュウリンジェ
ンシスに由来する核酸配列を増幅し得る部位を持ってい
ない該オリゴヌクレオチド。配列ＡＡＴＣＧＴＡＡＴＡ
ＴＴＡＡＡＣＴＧＡＣＧ又は配列ＣＣＴＴＣＡＴＡＣＧ
ＴＧＴＧＡＡＴＧＴＴＧである該オリゴヌクレオチド。
上記のいずれかを２種類組み合わせたプライマーセット
を用いて、検体中に炭疽菌に特異的なｇｙｒＢが存在す
るか否かを決定して炭疽菌の検出を行う方法。 【効果】 炭疽菌のｇｙｒＢ遺伝子を特異的に増幅し
て、他のバチラス属およびバチラス属以外の菌株から区
別、同定できる。
ち、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る部位を１つ
以上含むオリゴヌクレオチド。配列番号１及び配列番号
３から得られる核酸配列を持っていない該オリゴヌクレ
オチド。バチラスセレウス又はバチラスチュウリンジェ
ンシスに由来する核酸配列を増幅し得る部位を持ってい
ない該オリゴヌクレオチド。配列ＡＡＴＣＧＴＡＡＴＡ
ＴＴＡＡＡＣＴＧＡＣＧ又は配列ＣＣＴＴＣＡＴＡＣＧ
ＴＧＴＧＡＡＴＧＴＴＧである該オリゴヌクレオチド。
上記のいずれかを２種類組み合わせたプライマーセット
を用いて、検体中に炭疽菌に特異的なｇｙｒＢが存在す
るか否かを決定して炭疽菌の検出を行う方法。 【効果】 炭疽菌のｇｙｒＢ遺伝子を特異的に増幅し
て、他のバチラス属およびバチラス属以外の菌株から区
別、同定できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、炭疸菌（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に特徴的な核酸標的配
列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーに関す
る。本発明は、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝
子（ｇｙｒＢ）特異的プライマーを用いたポリメラーゼ
チェインリアクション（ＰＣＲ）による炭疽菌の検出に
関する。本発明は、検体中のバチラスセレウスをバチラ
スセレウスをバチラスチュウリンジエンシスおよび炭疽
菌と遺伝子レベルで区別して検出する方法に関する。
ｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に特徴的な核酸標的配
列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーに関す
る。本発明は、ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝
子（ｇｙｒＢ）特異的プライマーを用いたポリメラーゼ
チェインリアクション（ＰＣＲ）による炭疽菌の検出に
関する。本発明は、検体中のバチラスセレウスをバチラ
スセレウスをバチラスチュウリンジエンシスおよび炭疽
菌と遺伝子レベルで区別して検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】炭疸菌はグラム陽性桿菌で胞子を形成す
るため耐熱性を示す。また、炭疸菌は人畜共通感染症で
ある炭疸の病原体であり、臨床的に重要である。
るため耐熱性を示す。また、炭疸菌は人畜共通感染症で
ある炭疸の病原体であり、臨床的に重要である。
【０００３】炭疸菌を単離、同定するには、通常、Ｍａ
ｎｎｉｔｏｌ Ｅｇｇ−ｙｏｌｋＰｏｌｙｍｙｘｉｎ
（ＭＹＰ）寒天培地やＮａＣｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｋｉ
ｍａｎｄ Ｇｏｅｐｆｅｒｔ（ＮＧＫＧ）寒天培地に卵
黄液を加えた選択培地を用い、卵黄反応を生じた集落を
陽性とする。さらに、硝酸塩還元、クエン酸塩利用、ゼ
ラチン分解性、ＶＰ反応、ブドウ糖分解は陽性で、マン
ニット、アラビノース、キシロース分解は陰性であるこ
とを確認しなければいけない。
ｎｎｉｔｏｌ Ｅｇｇ−ｙｏｌｋＰｏｌｙｍｙｘｉｎ
（ＭＹＰ）寒天培地やＮａＣｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｋｉ
ｍａｎｄ Ｇｏｅｐｆｅｒｔ（ＮＧＫＧ）寒天培地に卵
黄液を加えた選択培地を用い、卵黄反応を生じた集落を
陽性とする。さらに、硝酸塩還元、クエン酸塩利用、ゼ
ラチン分解性、ＶＰ反応、ブドウ糖分解は陽性で、マン
ニット、アラビノース、キシロース分解は陰性であるこ
とを確認しなければいけない。
【０００４】上記確認試験での性状は、炭疸菌と類縁菌
であるバチラスチュウリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチラスチュウセ
レウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチラス
マイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）
でも同じである。バチラスセレウスと炭疸菌の区別は、
前者が運動性を示すのが多いのに対し、後者は非運動性
でガンマファージによる溶菌が起こる。前者が羊血球に
対する溶血性、チロシン分解を示すのに対し、後者は示
さない。
であるバチラスチュウリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチラスチュウセ
レウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチラス
マイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）
でも同じである。バチラスセレウスと炭疸菌の区別は、
前者が運動性を示すのが多いのに対し、後者は非運動性
でガンマファージによる溶菌が起こる。前者が羊血球に
対する溶血性、チロシン分解を示すのに対し、後者は示
さない。
【０００５】バチラスセレウスとバチラスマイコイデス
は、バチラスマイコイデスが非運動性で溶血性、チロシ
ン分解陰性で足根状集落を形成することで区別できる。
これら確認試験は判定までに時間がかかり、多くの労力
を要する。
は、バチラスマイコイデスが非運動性で溶血性、チロシ
ン分解陰性で足根状集落を形成することで区別できる。
これら確認試験は判定までに時間がかかり、多くの労力
を要する。
【０００６】類縁菌であるバチラスチュウリンジェンシ
スは、殺虫性タンパク質を産生する点でバチラスセレウ
スと区別されているが、その他の生化学的性状はバチラ
スセレウスと同一である。現在の分類では、この殺虫性
タンパク質が顕微鏡で確認されたものをバチラスチュウ
リンジェンシスとすることとしているが、血清型での両
者の区別も明確でない。また、バチラスチュウリンジェ
ンシスの中には、バチルスセレウス様のエンテロトキシ
ンを産生するという報告もある〔ＷｏｒｌｄＪ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（１９９
４）ｐ４０６−４０９〕。バチラスセレウスとバチルス
チュウリンジェンシスの間では、プラスミドの受け渡し
が行われるという報告があることから〔Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９（１９８２）ｐ６
９５１−６９５５〕、恐らく、もともとバチラスセレウ
スであったものに、殺虫性タンパク質をコードするプラ
スミドがなんらかの影響を受けて導入されたものと推測
される。従って、殺虫性タンパク質の有無による現在の
分類でバチラスチュウリンジェンシスとされているもの
の中にも、食中毒を起こす可能性のある菌が存在するこ
とが考えられる。また、バチラスチュウリンジェンシス
は生物農薬として土壌に散布されており、上記の理由か
らも安全性が危惧される。このような背景のもと、殺虫
性タンパク質とは別の観点から、バチラスセレウスとバ
チルスチュウリンジェンシスを区別する必要がでてき
た。
スは、殺虫性タンパク質を産生する点でバチラスセレウ
スと区別されているが、その他の生化学的性状はバチラ
スセレウスと同一である。現在の分類では、この殺虫性
タンパク質が顕微鏡で確認されたものをバチラスチュウ
リンジェンシスとすることとしているが、血清型での両
者の区別も明確でない。また、バチラスチュウリンジェ
ンシスの中には、バチルスセレウス様のエンテロトキシ
ンを産生するという報告もある〔ＷｏｒｌｄＪ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（１９９
４）ｐ４０６−４０９〕。バチラスセレウスとバチルス
チュウリンジェンシスの間では、プラスミドの受け渡し
が行われるという報告があることから〔Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９（１９８２）ｐ６
９５１−６９５５〕、恐らく、もともとバチラスセレウ
スであったものに、殺虫性タンパク質をコードするプラ
スミドがなんらかの影響を受けて導入されたものと推測
される。従って、殺虫性タンパク質の有無による現在の
分類でバチラスチュウリンジェンシスとされているもの
の中にも、食中毒を起こす可能性のある菌が存在するこ
とが考えられる。また、バチラスチュウリンジェンシス
は生物農薬として土壌に散布されており、上記の理由か
らも安全性が危惧される。このような背景のもと、殺虫
性タンパク質とは別の観点から、バチラスセレウスとバ
チルスチュウリンジェンシスを区別する必要がでてき
た。
【０００７】一方、バチラスセレウスの毒素について
は、下痢性のエンテロトキシンはクローン化され塩基配
列が決定されている〔Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｉｇｙ，１４
１（１９９５），ｐ９８３−９８８〕。しかし、下痢性
のエンテロトキシンはこれだけかどうかは明らかでな
い。このエンテロトキシンに対応するキットも市販され
ているが、バチラスセレウスのエンテロトキシンが全て
明らかにされていないため、十分な評価は受けていない
〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
６０（１９９４），ｐ４６１４−４６１６〕。一方、嘔
吐型毒素はサイクリックペプチドという報告がある〔Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２８
（１９９５），ｐ１２９−１４４〕。また、バチラスセ
レウスの中には毒素を産生しないものもあり、毒素のみ
を指標としたバチラスセレウスの検出は確実でない。
は、下痢性のエンテロトキシンはクローン化され塩基配
列が決定されている〔Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｉｇｙ，１４
１（１９９５），ｐ９８３−９８８〕。しかし、下痢性
のエンテロトキシンはこれだけかどうかは明らかでな
い。このエンテロトキシンに対応するキットも市販され
ているが、バチラスセレウスのエンテロトキシンが全て
明らかにされていないため、十分な評価は受けていない
〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
６０（１９９４），ｐ４６１４−４６１６〕。一方、嘔
吐型毒素はサイクリックペプチドという報告がある〔Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２８
（１９９５），ｐ１２９−１４４〕。また、バチラスセ
レウスの中には毒素を産生しないものもあり、毒素のみ
を指標としたバチラスセレウスの検出は確実でない。
【０００８】また、遺伝子レベルでの解析に用いられて
いる１６Ｓ ｒＲＮＡでは、バチラスセレウスと炭疸菌
は９９％以上の相同性を示すため、これは同定の指標と
なり得ない。
いる１６Ｓ ｒＲＮＡでは、バチラスセレウスと炭疸菌
は９９％以上の相同性を示すため、これは同定の指標と
なり得ない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】いわゆるバチラスセレ
ウスグループにはバチラスセレウスはじめバチラスチュ
ウリンジエンシス、炭疽菌、バチラスマイコイデスが含
まれている。その際、人畜に対する危険性を考慮する
と、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシ
ス、炭疽菌は毒素を産出する好ましくない菌である。一
方バチラスマイコイデスはそのような毒素を産出しない
ため、前述の３種とは安全性の面から区別してもよいと
考えられ、上記のようにバチラスセレウス、バチラスチ
ュウリンジエンシス、炭疽菌を検出できることは大きな
意義があると思われる。例えば、セレウスグループの食
中毒関連菌を食品から検出する場合、危険性を考慮して
セレウス特異的なプライマーだけでなく、チュウリンジ
ェンシスおよび炭疽菌特異的プライマーを用いて検出す
ることにより、安全性を確実に確認できる。本発明は、
炭疽菌を他の微生物と区別できる検査法の提供を目的と
する。炭疽菌特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出操
作をしなくても、菌から炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇ
ｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法により検出する方法の提供
を目的とする。
ウスグループにはバチラスセレウスはじめバチラスチュ
ウリンジエンシス、炭疽菌、バチラスマイコイデスが含
まれている。その際、人畜に対する危険性を考慮する
と、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシ
ス、炭疽菌は毒素を産出する好ましくない菌である。一
方バチラスマイコイデスはそのような毒素を産出しない
ため、前述の３種とは安全性の面から区別してもよいと
考えられ、上記のようにバチラスセレウス、バチラスチ
ュウリンジエンシス、炭疽菌を検出できることは大きな
意義があると思われる。例えば、セレウスグループの食
中毒関連菌を食品から検出する場合、危険性を考慮して
セレウス特異的なプライマーだけでなく、チュウリンジ
ェンシスおよび炭疽菌特異的プライマーを用いて検出す
ることにより、安全性を確実に確認できる。本発明は、
炭疽菌を他の微生物と区別できる検査法の提供を目的と
する。炭疽菌特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出操
作をしなくても、菌から炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇ
ｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ法により検出する方法の提供
を目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号５か
ら得られる核酸配列を持ち、炭疽菌に特徴的な核酸配列
を増幅し得る少なくとも一つの部位を含むことを特徴と
するオリゴヌクレオチドであることを要旨としている。
また本発明は、配列番号５から得られる核酸配列を持
ち、配列番号１及び配列番号３から得られる核酸配列を
持っていない、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る
少なくとも一つの部位を含むことを特徴とするオリゴヌ
クレオチドであることを要旨としている。さらにまた本
発明は、配列番号５から得られる核酸配列を持ち、配列
番号１及び配列番号３から得られる核酸配列を持ってい
ない、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る少なくと
も一つの部位を含むが、バチラスセレウスまたはバチラ
スチュウリンジェンシスに由来する核酸配列を増幅し得
る部位を持っていないことを特徴とするオリゴヌクレオ
チドであることを要旨としている。好ましくは本発明
は、配列番号１１または配列番号１２で示される核酸配
列を持っているオリゴヌクレオチドであることを要旨と
している。配列番号２のアミノ酸配列は、上記配列番号
１の核酸配列がコードするアミノ酸配列であり、配列番
号４のアミノ酸配列は、配列番号３の核酸配列がコード
するアミノ酸配列であり、配列番号６のアミノ酸配列
は、配列番号５の核酸配列がコードするアミノ酸配列で
ある。
ら得られる核酸配列を持ち、炭疽菌に特徴的な核酸配列
を増幅し得る少なくとも一つの部位を含むことを特徴と
するオリゴヌクレオチドであることを要旨としている。
また本発明は、配列番号５から得られる核酸配列を持
ち、配列番号１及び配列番号３から得られる核酸配列を
持っていない、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る
少なくとも一つの部位を含むことを特徴とするオリゴヌ
クレオチドであることを要旨としている。さらにまた本
発明は、配列番号５から得られる核酸配列を持ち、配列
番号１及び配列番号３から得られる核酸配列を持ってい
ない、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る少なくと
も一つの部位を含むが、バチラスセレウスまたはバチラ
スチュウリンジェンシスに由来する核酸配列を増幅し得
る部位を持っていないことを特徴とするオリゴヌクレオ
チドであることを要旨としている。好ましくは本発明
は、配列番号１１または配列番号１２で示される核酸配
列を持っているオリゴヌクレオチドであることを要旨と
している。配列番号２のアミノ酸配列は、上記配列番号
１の核酸配列がコードするアミノ酸配列であり、配列番
号４のアミノ酸配列は、配列番号３の核酸配列がコード
するアミノ酸配列であり、配列番号６のアミノ酸配列
は、配列番号５の核酸配列がコードするアミノ酸配列で
ある。
【００１１】本発明は、上記のいずれかのオリゴヌクレ
オチドを２種類組合せたプライマーセットを用いて、検
体中のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子配列を
標的とし、当該標的遺伝子を選択的に増幅させ、検体中
に炭疽菌に特異的なｇｙｒＢが存在するか否かを決定す
ることで、炭疽菌の検出を行う方法であることを要旨と
している。
オチドを２種類組合せたプライマーセットを用いて、検
体中のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子配列を
標的とし、当該標的遺伝子を選択的に増幅させ、検体中
に炭疽菌に特異的なｇｙｒＢが存在するか否かを決定す
ることで、炭疽菌の検出を行う方法であることを要旨と
している。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、炭疽菌に特異的な核酸
標的配列の在否を決定するために有用なオリゴヌクレオ
チドプライマーを基礎とするが、そのような決定を行う
ための方法は、ＰＣＲを用いた遺伝子増幅法にとどまら
ず、従来技術であるサザンハイブリダイゼーション法等
のプローブとしての使用も含む。
標的配列の在否を決定するために有用なオリゴヌクレオ
チドプライマーを基礎とするが、そのような決定を行う
ための方法は、ＰＣＲを用いた遺伝子増幅法にとどまら
ず、従来技術であるサザンハイブリダイゼーション法等
のプローブとしての使用も含む。
【００１３】本発明において、「プライマー」は、標的
核酸配列へのハイブリダイズを許す特異的ヌクレオチド
配列をデザインまたは生物学的に生産されたオリゴヌク
レオチドである。プライマーは、ポリメラーゼまたは同
様な酵素により、伸長合成されて完全な標的核酸配列に
ハイブリダイズすることができる。プライマーは、核酸
配列増幅法、例えばＰＣＲ法及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）
において利用される。特定のプライマーに、特にＳＤＡ
技術において有用なものは、標的核酸にハイブリダイズ
可能な配列に加えて、制限エンドヌクレアーゼの認識配
列、及びポリメラーゼまたはポリメラーゼ様活性を継続
する他の酵素がそれ自身その鋳型特異的オリゴヌクレオ
チド合成の開始を指示するための任意の配列を含む。
核酸配列へのハイブリダイズを許す特異的ヌクレオチド
配列をデザインまたは生物学的に生産されたオリゴヌク
レオチドである。プライマーは、ポリメラーゼまたは同
様な酵素により、伸長合成されて完全な標的核酸配列に
ハイブリダイズすることができる。プライマーは、核酸
配列増幅法、例えばＰＣＲ法及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）
において利用される。特定のプライマーに、特にＳＤＡ
技術において有用なものは、標的核酸にハイブリダイズ
可能な配列に加えて、制限エンドヌクレアーゼの認識配
列、及びポリメラーゼまたはポリメラーゼ様活性を継続
する他の酵素がそれ自身その鋳型特異的オリゴヌクレオ
チド合成の開始を指示するための任意の配列を含む。
【００１４】本発明において、「ハイブリダイゼーショ
ン」は、予め決定された反応条件下にて、部分的または
完全に相補的な核酸鎖が、逆平行（アンチパラレル）様
式にて向かい合うようにして、特異的かつ安定な水素結
合により、二本鎖の核酸を形成する工程である。
ン」は、予め決定された反応条件下にて、部分的または
完全に相補的な核酸鎖が、逆平行（アンチパラレル）様
式にて向かい合うようにして、特異的かつ安定な水素結
合により、二本鎖の核酸を形成する工程である。
【００１５】本発明の炭疽菌に特徴的な核酸標的配列の
増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、好まし
くは配列番号１１および配列番号１２を含み、そしてこ
れらはプライマーセットとして、炭疽菌に特徴的な核酸
標的配列の在否の決定に関する方法に使用する。炭疽菌
特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出等の操作なし
で、菌からの炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝
子断片が、ＰＣＲ法により検出できる。本発明のプライ
マーは、バチラスセレウスのｇｙｒＢ遺伝子配列に特異
的である。プローブは、プライマー増幅産物内の内部コ
ンセンサス配列に特異的である。
増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、好まし
くは配列番号１１および配列番号１２を含み、そしてこ
れらはプライマーセットとして、炭疽菌に特徴的な核酸
標的配列の在否の決定に関する方法に使用する。炭疽菌
特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出等の操作なし
で、菌からの炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇｙｒＢ遺伝
子断片が、ＰＣＲ法により検出できる。本発明のプライ
マーは、バチラスセレウスのｇｙｒＢ遺伝子配列に特異
的である。プローブは、プライマー増幅産物内の内部コ
ンセンサス配列に特異的である。
【００１６】上記配列番号１１または配列番号１２で示
される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを組み合わせ
たプライマーセットの製造方法について説明する。高特
異性プローブとして、ＤＮＡジャイレース（トポイソメ
ラーゼＩＩ）のＢサブユニットタンパク質をコードする
ｇｙｒＢ遺伝子を用いる。ｇｙｒＢ遺伝子を直接塩基配
列を決定したユニバーサルプライマーでＰｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓｐｕｔｉｄａを検出、分類する方法が報告され
ている〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，６１（１９９５），ｐ１１０４−１１０９〕。こ
れらのユニバーサルプライマーは、種々のグラム陽性
菌、陰性菌に共通であり、ｇｙｒＢ遺伝子の一部がＰＣ
Ｒ法により増幅された。
される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを組み合わせ
たプライマーセットの製造方法について説明する。高特
異性プローブとして、ＤＮＡジャイレース（トポイソメ
ラーゼＩＩ）のＢサブユニットタンパク質をコードする
ｇｙｒＢ遺伝子を用いる。ｇｙｒＢ遺伝子を直接塩基配
列を決定したユニバーサルプライマーでＰｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓｐｕｔｉｄａを検出、分類する方法が報告され
ている〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，６１（１９９５），ｐ１１０４−１１０９〕。こ
れらのユニバーサルプライマーは、種々のグラム陽性
菌、陰性菌に共通であり、ｇｙｒＢ遺伝子の一部がＰＣ
Ｒ法により増幅された。
【００１７】これら既存のプライマーを用いて、バチラ
スセレウスＪＣＭ２１５２、バチラスチュリンジエンシ
スＩＡＭ１２０７７、炭疸菌Ｐａｓｔｅｕｒ ｎｏ．２
−Ｈ〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３１（１９８５），ｐ３６３〕
の塩基配列を示した。
スセレウスＪＣＭ２１５２、バチラスチュリンジエンシ
スＩＡＭ１２０７７、炭疸菌Ｐａｓｔｅｕｒ ｎｏ．２
−Ｈ〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３１（１９８５），ｐ３６３〕
の塩基配列を示した。
【００１８】更に、バチラスセレウスのｇｙｒＢ遺伝子
のみを増幅し、同定できるＰＣＲプライマーを作製し
た。これらバチスルセレウス特異的プライマーの感度を
調べるため、１５株のバチラスセレウスとバチラスチュ
ウリンジエンシス、炭疸菌、バチラスマイコイデス、枯
草菌、バチラスブレビス、大腸菌、サルモネラ、黄色ブ
ドウ球菌、腸炎ビブリオについて検討した。
のみを増幅し、同定できるＰＣＲプライマーを作製し
た。これらバチスルセレウス特異的プライマーの感度を
調べるため、１５株のバチラスセレウスとバチラスチュ
ウリンジエンシス、炭疸菌、バチラスマイコイデス、枯
草菌、バチラスブレビス、大腸菌、サルモネラ、黄色ブ
ドウ球菌、腸炎ビブリオについて検討した。
【００１９】山本、原山〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１９９５），ｐ１１０４
−１１０９〕らは、ＤＮＡジャイレースＢサブユニット
の保存された部位２箇所から、ｇｙｒＢ遺伝子の一部を
増幅させるＰＣＲプライマーを作製した。これらのプラ
イマーを用いて、種々の細菌から約１．２ｋｂのｇｙｒ
Ｂ遺伝子部分が増幅された。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１９９５），ｐ１１０４
−１１０９〕らは、ＤＮＡジャイレースＢサブユニット
の保存された部位２箇所から、ｇｙｒＢ遺伝子の一部を
増幅させるＰＣＲプライマーを作製した。これらのプラ
イマーを用いて、種々の細菌から約１．２ｋｂのｇｙｒ
Ｂ遺伝子部分が増幅された。
【００２０】バチラスセレウスＪＣＭ２１５２、バチラ
スチュウリンジエンシスＩＡＭ１２０７７と炭疸菌Ｐａ
ｓｔｅｕｒ ｎｏ．２−Ｈから増幅された１．２ｋｂの
ｇｙｒＢ遺伝子を、遺伝子組換えの常法（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，２ｎ
ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕ
ｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８９）に従って、適当なベ
クターにクローン化した。
スチュウリンジエンシスＩＡＭ１２０７７と炭疸菌Ｐａ
ｓｔｅｕｒ ｎｏ．２−Ｈから増幅された１．２ｋｂの
ｇｙｒＢ遺伝子を、遺伝子組換えの常法（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，２ｎ
ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕ
ｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８９）に従って、適当なベ
クターにクローン化した。
【００２１】好ましいベクターとしてｐＧＥＭｚｆ
（＋）があげられるが、一般的なベクターであれば適宜
選択して用いることができる。
（＋）があげられるが、一般的なベクターであれば適宜
選択して用いることができる。
【００２２】有効なプライマーを作製するため、ＰＣＲ
法により増幅した１．２ｋｂのバチラスセレウス、バチ
ラスチュウリンジエンシスと炭疸菌のｇｙｒＢ遺伝子
を、ｐＧＥＭｚｆ（＋）にクローン化し、ｇｙｒＢ遺伝
子領域をＤＮＡシーケンサーを用いて、常法に従って決
定した。
法により増幅した１．２ｋｂのバチラスセレウス、バチ
ラスチュウリンジエンシスと炭疸菌のｇｙｒＢ遺伝子
を、ｐＧＥＭｚｆ（＋）にクローン化し、ｇｙｒＢ遺伝
子領域をＤＮＡシーケンサーを用いて、常法に従って決
定した。
【００２３】ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を決定するた
め、増幅断片の５′、３′部分をＵＰ−１Ｓ、ＵＰ−２
Ｓｒプライマー〔山本、原山Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１９９５），ｐ１１
０４−１１０９〕を用いて、決定した。この場合、これ
らプライマーから決定できる塩基配列の領域は限られて
いるため、得られた配列をもとに新たなプライマーを作
製し、更に別の領域の塩基配列を決定した。配列番号１
にバチラスセレウスＪＣＭ２１５２を、配列番号３にバ
チラスチュウリンジエンシスを、配列番号５に炭疸菌Ｐ
ａｓｔｅｕｒｎｏ．２−ＨのｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列
を示す。
め、増幅断片の５′、３′部分をＵＰ−１Ｓ、ＵＰ−２
Ｓｒプライマー〔山本、原山Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１９９５），ｐ１１
０４−１１０９〕を用いて、決定した。この場合、これ
らプライマーから決定できる塩基配列の領域は限られて
いるため、得られた配列をもとに新たなプライマーを作
製し、更に別の領域の塩基配列を決定した。配列番号１
にバチラスセレウスＪＣＭ２１５２を、配列番号３にバ
チラスチュウリンジエンシスを、配列番号５に炭疸菌Ｐ
ａｓｔｅｕｒｎｏ．２−ＨのｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列
を示す。
【００２４】この塩基配列の情報を用いて、バチラスセ
レウスを他の細菌から検出、同定する２１ｍｅｒのプラ
イマーを作製した。このプライマーは配列番号７及び配
列番号８で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
であり、プライマーセットとして利用可能である。
レウスを他の細菌から検出、同定する２１ｍｅｒのプラ
イマーを作製した。このプライマーは配列番号７及び配
列番号８で示される核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
であり、プライマーセットとして利用可能である。
【００２５】これらの新規のプライマーは、既存のＰＣ
Ｒを用いたアッセイ法〔Ｓａｉｋｉｅｔ ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２３９（１９８８），ｐ４８７−４９１〕に
おいて有用である。このプライマーは、サンプル中の目
的とするＤＮＡを増幅するのに用いる。増幅段階に続い
て検出段階は、ＤＮＡ検出に有効な方法であればどんな
方法でもよい。例えばアガロースゲル電気泳動し、エチ
ジュウムブロマイド染色する方法もある。
Ｒを用いたアッセイ法〔Ｓａｉｋｉｅｔ ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２３９（１９８８），ｐ４８７−４９１〕に
おいて有用である。このプライマーは、サンプル中の目
的とするＤＮＡを増幅するのに用いる。増幅段階に続い
て検出段階は、ＤＮＡ検出に有効な方法であればどんな
方法でもよい。例えばアガロースゲル電気泳動し、エチ
ジュウムブロマイド染色する方法もある。
【００２６】目的とするＤＮＡはテンペレートとして機
能する。サンプル中のテンペレートＤＮＡの増幅は、プ
ライマーがテンペレートの相補的な領域に結合し、そこ
からテンペレートを鋳型にＤＮＡ伸長が起こる。この伸
長したＤＮＡは、さらにプライマーのテンペレートとし
て機能する。このプロセスはＤＮＡの変性、プライマー
とテンペレートとのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼ
（例、Ｔａｑポリメラーゼ）によるプライマーからの伸
長のサイクルを繰り返し、２組のプライマーを用いるこ
とで最終的には、ある一定の長さの２本鎖のＤＮＡが検
出に必要な量まで増幅される。
能する。サンプル中のテンペレートＤＮＡの増幅は、プ
ライマーがテンペレートの相補的な領域に結合し、そこ
からテンペレートを鋳型にＤＮＡ伸長が起こる。この伸
長したＤＮＡは、さらにプライマーのテンペレートとし
て機能する。このプロセスはＤＮＡの変性、プライマー
とテンペレートとのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼ
（例、Ｔａｑポリメラーゼ）によるプライマーからの伸
長のサイクルを繰り返し、２組のプライマーを用いるこ
とで最終的には、ある一定の長さの２本鎖のＤＮＡが検
出に必要な量まで増幅される。
【００２７】しかしながら、プライマーに相補的な配列
をテンペレートＤＮＡが持っていない場合は、この一定
の長さの２本鎖のＤＮＡが生成されず、サンプル中に目
的とするテンペレートがないと判定できる。すなわち、
サンプル中に対象とする微生物の存在を否定できる。プ
ライマーセット＜ＢＣ１（配列番号７）、ＢＣ２（配列
番号８）＞はｇｙｒＢ遺伝子の一部３６５ｂｐの配列を
増幅する。ＪＣＭ、ＩＡＭ、ＩＦＯ、ＡＴＣＣのコレク
ションから得たバチラスセレウス１５株に３６５ｂｐの
増幅断片が確認された。
をテンペレートＤＮＡが持っていない場合は、この一定
の長さの２本鎖のＤＮＡが生成されず、サンプル中に目
的とするテンペレートがないと判定できる。すなわち、
サンプル中に対象とする微生物の存在を否定できる。プ
ライマーセット＜ＢＣ１（配列番号７）、ＢＣ２（配列
番号８）＞はｇｙｒＢ遺伝子の一部３６５ｂｐの配列を
増幅する。ＪＣＭ、ＩＡＭ、ＩＦＯ、ＡＴＣＣのコレク
ションから得たバチラスセレウス１５株に３６５ｂｐの
増幅断片が確認された。
【００２８】一方、炭疽菌と生化学的性状が極めて類似
している、バチラスセレウス、バチラスチュリンジエン
シス、バチラスマイコイデスでは増幅断片が確認されな
かった。これらの知見から、本発明のプライマーは、炭
疽菌に特異的であり、この食中毒菌を検出するのに用い
ることができる。
している、バチラスセレウス、バチラスチュリンジエン
シス、バチラスマイコイデスでは増幅断片が確認されな
かった。これらの知見から、本発明のプライマーは、炭
疽菌に特異的であり、この食中毒菌を検出するのに用い
ることができる。
【００２９】同様に、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ
球菌、腸炎ビブリオの標準株についても、ｇｙｒＢの存
在は認められたが、バチラスセレウス特異的３６５ｂｐ
の増幅断片は確認されなかった。
球菌、腸炎ビブリオの標準株についても、ｇｙｒＢの存
在は認められたが、バチラスセレウス特異的３６５ｂｐ
の増幅断片は確認されなかった。
【００３０】バチラスセレウス株の中にはバチラスセレ
ウス特異的プライマーを用いても、ＰＣＲ後の電気泳動
で３６５ｂｐのバンドは検出されないものもあった。
ウス特異的プライマーを用いても、ＰＣＲ後の電気泳動
で３６５ｂｐのバンドは検出されないものもあった。
【００３１】それらの株について、ｇｒｙＢ遺伝子を指
標として、新たにバチラスチュウリンジエンシス、炭疽
菌にそれぞれ特異的な２１〜２４ｍｅｒのプライマーを
作成した。バチラスチュウリンジエンシス特異的プライ
マーは配列番号９及び配列番号１０で示される核酸配列
を持つオリゴヌクレオチドであり、炭疽菌特異的プライ
マーは配列番号１１及び配列番号１２で示される核酸配
列を持つオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲ後、ゲル電
気泳動しエチジウムブロマイド染色すると、バチラスチ
ュウリンジエンシスは３６８ｂｐ、炭疽菌は２４５ｂｐ
のバンドが検出できる。
標として、新たにバチラスチュウリンジエンシス、炭疽
菌にそれぞれ特異的な２１〜２４ｍｅｒのプライマーを
作成した。バチラスチュウリンジエンシス特異的プライ
マーは配列番号９及び配列番号１０で示される核酸配列
を持つオリゴヌクレオチドであり、炭疽菌特異的プライ
マーは配列番号１１及び配列番号１２で示される核酸配
列を持つオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲ後、ゲル電
気泳動しエチジウムブロマイド染色すると、バチラスチ
ュウリンジエンシスは３６８ｂｐ、炭疽菌は２４５ｂｐ
のバンドが検出できる。
【００３２】バチラスセレウス特異的プライマーで検出
できなかったバチラスセレウス株について、バチラスチ
ュウリンジエンシスないし炭疽菌特異的プライマーでＰ
ＣＲを行ったところ、いずれかのプライマーで検出でき
た。つまりはｇｒｙＢ遺伝子を指標に、バチラスセレウ
ス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を遺伝子レ
ベルで区別できた。バチラスセレウス、バチラスチュウ
リンジエンシス、炭疽菌を検出できることは大きな意義
があると思われる。
できなかったバチラスセレウス株について、バチラスチ
ュウリンジエンシスないし炭疽菌特異的プライマーでＰ
ＣＲを行ったところ、いずれかのプライマーで検出でき
た。つまりはｇｒｙＢ遺伝子を指標に、バチラスセレウ
ス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を遺伝子レ
ベルで区別できた。バチラスセレウス、バチラスチュウ
リンジエンシス、炭疽菌を検出できることは大きな意義
があると思われる。
【００３３】
【実施例】本発明の詳細を実施例で説明する。本発明は
これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３４】実施例１ プライマーセット＜ＢＣ１（配列番号７）、ＢＣ２（配
列番号８）＞はｇｙｒＢ遺伝子の一部３６５ｂｐの配列
を増幅する。このプライマーセットの感度を調べるた
め、表１に示したＪＣＭ、ＩＡＭ、ＩＦＯ、ＡＴＣＣの
コレクションから得た１５株のバチラスセレウスとバチ
ラスチュウリンジエンシス、炭疸菌、バチラスマイコイ
デス、枯草菌、バチラスブレビス、大腸菌、サルモネ
ラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオについて検討した。
列番号８）＞はｇｙｒＢ遺伝子の一部３６５ｂｐの配列
を増幅する。このプライマーセットの感度を調べるた
め、表１に示したＪＣＭ、ＩＡＭ、ＩＦＯ、ＡＴＣＣの
コレクションから得た１５株のバチラスセレウスとバチ
ラスチュウリンジエンシス、炭疸菌、バチラスマイコイ
デス、枯草菌、バチラスブレビス、大腸菌、サルモネ
ラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオについて検討した。
【００３５】《ＰＣＲ法によるアッセイ》サンプル調製 ＤＮＡを抽出しない、菌をテンペレートに用いた場合を
試験した。この場合ＮａＣｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｋｉｍ
ａｎｄ Ｇｏｅｐｆｅｒｔ（ＮＧＫＧ）寒天培地（日
水製薬製）に卵黄液を加えた選択培地か、トリプトソイ
ブイヨン寒天培地（栄研化学製）で、３５℃１晩培養し
た新鮮な菌を試験に供した。液体培地で生育した菌を用
いる場合には、遠心分離等により菌を分離し、ＰＢＳ緩
衝液（ｐＨ７．５）に一度洗浄し、適当な菌数を用い
た。滅菌水５０μｌに菌量１コロニー程度懸濁し、９５
℃で１０分間熱処理を行う。
試験した。この場合ＮａＣｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｋｉｍ
ａｎｄ Ｇｏｅｐｆｅｒｔ（ＮＧＫＧ）寒天培地（日
水製薬製）に卵黄液を加えた選択培地か、トリプトソイ
ブイヨン寒天培地（栄研化学製）で、３５℃１晩培養し
た新鮮な菌を試験に供した。液体培地で生育した菌を用
いる場合には、遠心分離等により菌を分離し、ＰＢＳ緩
衝液（ｐＨ７．５）に一度洗浄し、適当な菌数を用い
た。滅菌水５０μｌに菌量１コロニー程度懸濁し、９５
℃で１０分間熱処理を行う。
【００３６】ＰＣＲの増幅条件 ＰＣＲアッセイは、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌ
ｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で行った。上記熱処理
菌液５μｌに、反応液１０μｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １
００ｍＭ，ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ，ＫＣｌ ５００ｍ
Ｍ，ｐＨ ８．３、濃度は最終濃度を示す。）を加え
る。この液はゲノムＤＮＡ１００ｎｇ以上、２００μＭ
のｄＮＴＰ、１μＭのプライマーを含む。ＤＮＡ変性は
９４℃、６０秒、アニーリングは５８℃、６０秒、ＤＮ
Ａ伸長反応は７２℃、１２０秒間で３０サイクル繰り返
した。
ｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で行った。上記熱処理
菌液５μｌに、反応液１０μｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １
００ｍＭ，ＭｇＣｌ2 １５ｍＭ，ＫＣｌ ５００ｍ
Ｍ，ｐＨ ８．３、濃度は最終濃度を示す。）を加え
る。この液はゲノムＤＮＡ１００ｎｇ以上、２００μＭ
のｄＮＴＰ、１μＭのプライマーを含む。ＤＮＡ変性は
９４℃、６０秒、アニーリングは５８℃、６０秒、ＤＮ
Ａ伸長反応は７２℃、１２０秒間で３０サイクル繰り返
した。
【００３７】ＰＣＲ産物の検出 増幅に次いで、検出はゲル電気泳動によって行った。Ｐ
ＣＲサンプル１２μｌをアガロースゲル（３％アガロー
ス、Ｎｕｓｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣ
Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に供し
た。ＤＮＡのバンドは、エチジウムブロマイド溶液で１
０分間染色後、紫外線照射して観察し、確認した。結果
を表１に示す。表１中、菌株番号（Ｓｔｒａｉｎ ｎｕ
ｍｂｅｒ）の寄託機関の略称は以下の通りである。 ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＪＣＭ：Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＭｉ
ｃｒｏｒｇａｎｉｓｍｓ ＩＦＯ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔ
ａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ ＩＡＭ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＡｐｐｌｉｅｄＭ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ＣＲサンプル１２μｌをアガロースゲル（３％アガロー
ス、Ｎｕｓｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣ
Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に供し
た。ＤＮＡのバンドは、エチジウムブロマイド溶液で１
０分間染色後、紫外線照射して観察し、確認した。結果
を表１に示す。表１中、菌株番号（Ｓｔｒａｉｎ ｎｕ
ｍｂｅｒ）の寄託機関の略称は以下の通りである。 ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＪＣＭ：Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＭｉ
ｃｒｏｒｇａｎｉｓｍｓ ＩＦＯ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔ
ａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ ＩＡＭ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＡｐｐｌｉｅｄＭ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
【００３８】
【表１】
【００３９】表１に示すとおり、これらバチラスセレウ
スの１５株全てに、３６５ｂｐの増幅断片が確認され
た。一方、バチラスセレウスと生化学的性状が極めて類
似している、バチラスチュリンジエンシス、炭疸菌、バ
チラスマイコイデスでは増幅断片が確認されなかった。
同じバチラス属の枯草菌、バチラスブレビスについても
増幅断片が確認されなかった。これらの知見から、本発
明のプライマーは、バチラスセレウスに特異的であり、
この食中毒菌を検出するのに用いることができる。同様
に、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリ
オの標準株についても、ｇｙｒＢとバチラスセレウス特
異的な３６５ｂｐの検出を行った。結果を表１に示し
た。表１に示したように、いずれの株においても、ｇｙ
ｒＢの存在は認められたが、バチラスセレウス特異的３
６５ｂｐの増幅断片は確認されなかった。
スの１５株全てに、３６５ｂｐの増幅断片が確認され
た。一方、バチラスセレウスと生化学的性状が極めて類
似している、バチラスチュリンジエンシス、炭疸菌、バ
チラスマイコイデスでは増幅断片が確認されなかった。
同じバチラス属の枯草菌、バチラスブレビスについても
増幅断片が確認されなかった。これらの知見から、本発
明のプライマーは、バチラスセレウスに特異的であり、
この食中毒菌を検出するのに用いることができる。同様
に、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリ
オの標準株についても、ｇｙｒＢとバチラスセレウス特
異的な３６５ｂｐの検出を行った。結果を表１に示し
た。表１に示したように、いずれの株においても、ｇｙ
ｒＢの存在は認められたが、バチラスセレウス特異的３
６５ｂｐの増幅断片は確認されなかった。
【００４０】実施例２ バチラスセレウス株の中にはバチラスセレウス特異的プ
ライマーを用いても、ＰＣＲ後の電気泳動で３６５ｂｐ
のバンドは検出されないものもあった。
ライマーを用いても、ＰＣＲ後の電気泳動で３６５ｂｐ
のバンドは検出されないものもあった。
【００４１】それらの株について、ｇｒｙＢ遺伝子を指
標として、新たにバチラスチュウリンジエンシス、炭疽
菌にそれぞれ特異的な２１〜２４ｍｅｒのプライマーを
作成した。バチラスチュウリンジエンシス特異的プライ
マーは配列番号９及び配列番号１０で示される核酸配列
を持つオリゴヌクレオチドであり、炭疽菌特異的プライ
マーは配列番号１１及び配列番号１２で示される核酸配
列を持つオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲ後、ゲル電
気泳動しエチジウムブロマイド染色すると、バチラスチ
ュウリンジエンシスは３６８ｂｐ、炭疽菌は２４５ｂｐ
のバンドが検出できる。
標として、新たにバチラスチュウリンジエンシス、炭疽
菌にそれぞれ特異的な２１〜２４ｍｅｒのプライマーを
作成した。バチラスチュウリンジエンシス特異的プライ
マーは配列番号９及び配列番号１０で示される核酸配列
を持つオリゴヌクレオチドであり、炭疽菌特異的プライ
マーは配列番号１１及び配列番号１２で示される核酸配
列を持つオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲ後、ゲル電
気泳動しエチジウムブロマイド染色すると、バチラスチ
ュウリンジエンシスは３６８ｂｐ、炭疽菌は２４５ｂｐ
のバンドが検出できる。
【００４２】バチラスセレウス特異的プライマーで検出
できなかったバチラスセレウス株について、バチラスチ
ュウリンジエンシスないし炭疽菌特異的プライマーでＰ
ＣＲを行ったところ、いずれかのプライマーで検出でき
た。つまりはｇｒｙＢ遺伝子を指標に、バチラスセレウ
ス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を遺伝子レ
ベルで区別できた。表２に、ｇｒｙＢを指標としたバチ
ラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌
特異的プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。供試株
は、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシ
ス、炭疽菌、バチラスマイコイデスの標準株およびバチ
ラスセレウス特異的プライマーで検出できなかった株を
含むバチラスセレウス血清型、野生株である。
できなかったバチラスセレウス株について、バチラスチ
ュウリンジエンシスないし炭疽菌特異的プライマーでＰ
ＣＲを行ったところ、いずれかのプライマーで検出でき
た。つまりはｇｒｙＢ遺伝子を指標に、バチラスセレウ
ス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を遺伝子レ
ベルで区別できた。表２に、ｇｒｙＢを指標としたバチ
ラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌
特異的プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。供試株
は、バチラスセレウス、バチラスチュウリンジエンシ
ス、炭疽菌、バチラスマイコイデスの標準株およびバチ
ラスセレウス特異的プライマーで検出できなかった株を
含むバチラスセレウス血清型、野生株である。
【００４３】
【表２】
【００４４】ただし、この遺伝子レベルでの分類は、現
状の生化学分類と必ずしも一致しない。生化学分類で
は、バチラスセレウスとバチラスチュウリンジエンシス
との相違点は、殺菌性タンパク質生産の有無のみであ
り、バチラスチュウリンジエンシスが殺菌性タンパク質
を生産する。炭疽菌のみが、γファージによって溶菌す
るのが特徴である。今回の試験のように、遺伝子レベル
での結果と生化学レベルでの結果が必ずしも一致しない
場合は、現状では、生化学的指標の方が優先され、遺伝
子レベルで炭疽菌になったからといって、その株が即病
原菌性の非常に強い炭疽菌になるとは限らない。いわゆ
るバチラスセレウスグループにはバチラスセレウスはじ
めバチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌、バチラスマ
イコイデスが含まれている。その際、人畜に対する危険
性を考慮すると、バチラスセレウス、バチラスチュウリ
ンジエンシス、炭疽菌は毒素を産出する好ましくない菌
である。一方バチラスマイコイデスはそのような毒素を
産出しないため、前述の３種とは安全性の面から区別し
てもよいと考えられ、上記のようにバチラスセレウス、
バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を検出できるこ
とは大きな意義があると思われる。
状の生化学分類と必ずしも一致しない。生化学分類で
は、バチラスセレウスとバチラスチュウリンジエンシス
との相違点は、殺菌性タンパク質生産の有無のみであ
り、バチラスチュウリンジエンシスが殺菌性タンパク質
を生産する。炭疽菌のみが、γファージによって溶菌す
るのが特徴である。今回の試験のように、遺伝子レベル
での結果と生化学レベルでの結果が必ずしも一致しない
場合は、現状では、生化学的指標の方が優先され、遺伝
子レベルで炭疽菌になったからといって、その株が即病
原菌性の非常に強い炭疽菌になるとは限らない。いわゆ
るバチラスセレウスグループにはバチラスセレウスはじ
めバチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌、バチラスマ
イコイデスが含まれている。その際、人畜に対する危険
性を考慮すると、バチラスセレウス、バチラスチュウリ
ンジエンシス、炭疽菌は毒素を産出する好ましくない菌
である。一方バチラスマイコイデスはそのような毒素を
産出しないため、前述の３種とは安全性の面から区別し
てもよいと考えられ、上記のようにバチラスセレウス、
バチラスチュウリンジエンシス、炭疽菌を検出できるこ
とは大きな意義があると思われる。
【００４５】
【発明の効果】炭疽菌のｇｙｒＢ遺伝子に特異的に反応
して、他のバチラス属やバチラス属以外の菌株から区
別、同定できるようなプライマーを提供することができ
た。炭疽菌特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出等の
操作なしに、菌から炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇｙｒ
Ｂ遺伝子断片をＰＣＲ法により検出できる。検体中の炭
疽菌をバチラスセレウスおよびバチラスチュウリンジエ
ンシスと遺伝子レベルで区別して検出することができ
る。
して、他のバチラス属やバチラス属以外の菌株から区
別、同定できるようなプライマーを提供することができ
た。炭疽菌特異的プライマーにより、ＤＮＡの抽出等の
操作なしに、菌から炭疽菌特異的な２４５ｂｐのｇｙｒ
Ｂ遺伝子断片をＰＣＲ法により検出できる。検体中の炭
疽菌をバチラスセレウスおよびバチラスチュウリンジエ
ンシスと遺伝子レベルで区別して検出することができ
る。
配列番号：１ 配列の長さ：１２１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 CATGCAGGAG GCAAATTTGA CGGTGGCGGT TATAAAGTTT CTGGTGGTTT ACATGGTGTT 60 GGGGCATCGG TTGTAAATGC TCTATCAACA GAATTAGAAG TATTTGTACA TCGTGAAGGT 120 AAAATCCATT ACCAAAAATA CGAAAGAGGT ATTCCGGTTG CGGATTTAAA AGTCATTGGT 180 GACACCGATC AAACAGGAAC AATAACTCGA TTTAAACCAG ATCCGGAAAT TTTCCAAGAA 240 ACAACAGTAT ACGATTTTGA TACGCTAGCA ACTCGTATGC GTGAATTAGC GTTTTTAAAT 300 CGTAATATTA AATTAACAAT TGAAGATAAA CGTGAACGTA AGCAAAAGAA AGAATTCCAT 360 TACGAAGGTG GAATTAAATC ATACGTTGAG CATTTAAATC GCTCAAAACA ACCGATTCAT 420 GAAGAGCCTG TGTACGTAGA AGGTTCAAAA GATGGTATTC AGGTTGAGGT TTCTCTTCAA 480 TATAACGAAG GATACACAAA TAATATTTAC TCATTTACGA ATAACATCCA TACGTATGAA 540 GGTGGTACAC ATGAGGTAGG TTTTAAAACA GCTTTAACTC GTGTAATCAA CGACTATGGT 600 CGTAAAAATA GCATTTTAAA AGATGCGGAC AGTAATTTAA CTGGTGAGGA TGTTCGTGAA 660 GGTTTAACAG CAATTGTATC AATCAAGCAT CCAAATCCAC AATTTGAAGG ACAAACGAAG 720 ACAAAACTTG GGAATAGTGA AGCGAGAACA ATTACAGAGT CTGTATTCTC AGAGGCATTT 780 GAAAAGTTCT TACTAGAAAA TCCTAATGTA GCGCGAAAAA TTGTAGAAAA AGGTACGATG 840 GCTGCACGTG CACGTGTAGC TGCGAAAAAA GCGCGTGAAT TGACACGTCG AAAGAGTGCG 900 TTAGAAGTTT CAAGTTTACC TGGTAAATTA GCTGATTGCT CTTCGAAAGA TCCAGCAATT 960 AGTGAAATTT ACATCGTAGA GGGTGACTCT GCGGGTGGAT CTGCAAAACA AGGACGCGAT 1020 CGTCATTTCC AAGCAATTTT ACCGCTGAAG GGTAAAATTA TTAATGTGGA AAAGGCGCGC 1080 TTAGATAAGA TTTTATCAAA TGATGAAGTT CGTACAATTA TTACGGCAAT CGGTACAAAT 1140 ATTGGTGGAG ACTTCGATAT TGAAAAAGCA CGCTATCATA AAGTTATTAT CATGACAGAT 1200 GCAGACGTGG AC 1212 配列番号：２ 配列の長さ：４０４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 配列 HAGGKFDGGG YKVSGGLHGV GASVVNALST ELEVFVHREG KIHYQKYERG IPVADLKVIG 60 DTDQTGTITR FKPDPEIFQE TTVYDFDTLA TRMRELAFLN RNIKLTIEDK RERKQKKEFH 120 YEGGIKSYVE HLNRSKQPIH EEPVYVEGSK DGIQVEVSLQ YNEGYTNNIY SFTNNIHTYE 180 GGTHEVGFKT ALTRVINDYG RKNSILKDAD SNLTGEDVRE GLTAIVSIKH PNPQFEGQTK 240 TKLGNSEART ITESVFSEAF EKFLLENPNV ARKIVEKGTM AARARVAAKK ARELTRRKSA 300 LEVSSLPGKL ADCSSKDPAI SEIYIVEGDS AGGSAKQGRD RHFQAILPLK GKIINVEKAR 360 LDKILSNDEV RTIITAIGTN IGGDFDIEKA RYHKVIIMTD ADVD 404 配列番号：３ 配列の長さ：１２１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 CATGCTGGTG GGAAATTCGA CGGTGGCGGT TATAAAGTTT CTGGTGGTTT GCACGGTGTT 60 GGTGCATCTG TTGTAAATGC CTTATCAACA GAATTAGAAG TATTTGTACA TCGTGATGGC 120 AAAATCCATT ACCAAAAATA CCAAAGAGGT ATTCCGGTTG CAGATTTAAA AGTCATCGGT 180 GATACAGATA AGACTGGAAC AATAACTCGC TTTAAACCGG ATCCAGAAAT TTTTAAAGAG 240 ACGACAGAAT ATGAATTCGA TACGCTCGCG ACTCGTGTGC GTGAGTTGGC GTTTTTAAAT 300 CGTAATATTA AATTAACAAT TGAAGATAAA CGTGAACATA AGCAAAAGAA AGAGTTCCAC 360 TATGAAGGTG GAATTAAATC ATATGTTGAA CATTTAAATC GTTCAAAACA ACCAATTCAT 420 GAAGAGCCTG TATATGTAGA AGGTTCAAAA GATGGTATTC AAGTTGAAGT TGCGCTTCAA 480 TATAACGAAG GATATACAAA TCATATTTAC TCATTTACAA ATAATATTCA TACGTATGAA 540 GGTGGTACAC ATGAGGTAGG ATTTAAAACT GCCTTAACAC GTGTTATTAA CGATTATGGT 600 CGTAAAAATA ACATTTTAAA AGATGCGGAT AGTAATTTGA CTGGTGAAGA TGTTCGTGAA 660 GGTTTAACAG CAATCGTGTC AATTAAACAT CCAAATCCAC AATTTGAAGG GCAAACGAAG 720 ACGAAACTTG GAAATAGTGA AGCGAGAACG ATTACGGAGT CAGTATTCTC TGAGGCTTTT 780 GAAAAATTCT TACTGGAAAA TCCCAATGTT GCACGTAAGG TTGTAGATAA AGGGACGATG 840 GCAGCACGTG CGCGTGTAGC AGCTAAAAAG GCTCGTGAGC TAACTCGCCG AAAGAGTGCT 900 TTAGAAGTTT CAAGTTTACC AGGGAAATTG GCAGATTGTT CTTCTAAAGA TCCAGCAATT 960 AGTGAAATTT ATATCGTAGA GGGTGACTCT GCGGGTGGAT CTGCAAAACA AGGACGCGAT 1020 CGTCATTTTC AAGCAATTTT ACCGCTGAAG GGTAAAATTA TTAATGTTGA AAAGGCACGC 1080 TTAGATAAGA TTTTATCAAA TGATGAAGTT CGTACAATTA TTACGGCGAT TGGTACAAAT 1140 ATTGGTGGGG ACTTCGATAT CGAAAAAGCA CGCTATCATA AAGTTATTAT TATGACCGAC 1200 GCCGACGTTG AT 1212 配列番号：４ 配列の長さ：４０４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 配列 HAGGKFDGGG YKVSGGLHGV GASVVNALST ELEVFVHRDG KIHYQKYQRG IPVADLKVIG 60 DTDKTGTITR FKPDPEIFKE TTEYEFDTLA TRVRELAFLN RNIKLTIEDK REHKQKKEFH 120 YEGGIKSYVE HLNRSKQPIH EEPVYVEGSK DGIQVEVALQ YNEGYTNHIY SFTNNIHTYE 180 GGTHEVGFKT ALTRVINDYG RKNNILKDAD SNLTGEDVRE GLTAIVSIKH PNPQFEGQTK 240 TKLGNSEART ITESVFSEAF EKFLLENPNV ARKVVDKGTM AARARVAAKK ARELTRRKSA 300 LEVSSLPGKL ADCSSKDPAI SEIYIVEGDS AGGSAKQGRD RHFQAILPLK GKIINVEKAR 360 LDKILSNDEV RTIITAIGTN IGGDFDIEKA RYHKVIIMTD ADVD 404 配列番号：５ 配列の長さ：１２１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 CATGCTGGGG GAAAATTTGA CGGCGGCGGT TATAAAGTTT CTGGTGGTTT GCATGGTGTT 60 GGGGCATCTG TAGTAAATGC TCTATCAACA GAACTAGAGG TATTTGTACA TCGTGAAGGT 120 AAAATCCATT ATCAAAAATA CGAAAGAGGT ATTCCGGTTG CGGATTTAAA AGTCATTGGT 180 GATACAGATC AAACGGGAAC GATAACTCGA TTTAAACCAG ATCCAGAAAT TTTTCAGGAA 240 ACAACAGTAT ACGAATTTGA TACACTAGCA ACTCGTATGC GTGAATTAGC ATTTTTAAAT 300 CGTAATATTA AACTGACGAT TGAAGATAAA CGTGAACATA AGCAAAAAAA AGAATTCCAT 360 TGTGAAGGTG GAATTAAATC ATATGTTGAG CATTTAAACC GCTCAAAACA ACCAATCCAT 420 GAAGAGCCTG TATATGTAGA AGGATCAAAA GATGGTATTC AAGTTGAAGT TTCCTTACAG 480 TATAACGAAG GATATACAAA TAATATTTAC TCATTTACGA ACAACATTCA CACGTATGAA 540 GGTGGAACAC ATGAAGTAGG GTTTAAAACA GCTTTAACTC GTGTGATTAA CGATTATGGG 600 CGTAAAAATA GTATTCTAAA AGATGCAGAC AGTAATTTAA CTGGTGAGGA CGTTCGTGAA 660 GGTTTAACTG CAATTGTATC AATTAAACAT CCAGATCCAC AATTTGAAGG ACAAACGAAG 720 ACGAAACTTG GGAATAGTGA AGCGAGAACG ATTACAGAGT CTGTGTTTTC AGAGGCATTT 780 GAAAAGTTCT TACTAGAAAA CCCGAACGTT GCACGAAAAA TCGTAGAAAA AGGTACGATG 840 GCAGCGCGTG CACGTGTTGC AGCGAAAAAA GCACGTGAAT TGACACGTCG TAAGAGCGCG 900 TTAGAAGTTT CAAGTTTACC TGGTAGATTA GCAGATTGCT CTTCAAAAGA TCCAGCAATT 960 AGTGAAATTT ACATTGTAGA GGGTGACTCT GCCGGTGGAT CAGCAAAGCA AGGGCGTGAT 1020 CGTCACTTCC AAGCGATTTT ACCACTGAAA GGTAAAATTA TTAACGTTGA AAAGGCAAGA 1080 TTAGATAAAA TCTTATCTAA CGATGAAGTG CGTACAATTA TTACTGCAAT TGGTACGAAC 1140 ATTGGCGGAG ATTTTGATAT TGAGAAAGCT CGTTATCATA AAGTTATTAT TATGACGGAT 1200 GCCGACGTCG AC 1212 配列番号：６ 配列の長さ：４０４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 配列 HAGGKFDGGG YKVSGGLHGV GASVVNALST ELEVFVHREG KIHYQKYERG IPVADLKVIG 60 DTDQTGTITR FKPDPEIFQE TTVYEFDTLA TRMRELAFLN RNIKLTIEDK REHKQKKEFH 120 CEGGIKSYVE HLNRSKQPIH EEPVYVEGSK DGIQVEVSLQ YNEGYTNNIY SFTNNIHTYE 180 GGTHEVGFKT ALTRVINDYG RKNSILKDAD SNLTGEDVRE GLTAIVSIKH PDPQFEGQTK 240 TKLGNSEART ITESVFSEAF EKFLLENPNV ARKIVEKGTM AARARVAAKK ARELTRRKSA 300 LEVSSLPGRL ADCSSKDPAI SEIYIVEGDS AGGSAKQGRD RHFQAILPLK GKIINVEKAR 360 LDKILSNDEV RTIITAIGTN IGGDFDIEKA RYHKVIIMTD ADVD 404 配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 ATTGGTGACA CCGATCAAAC A 21 配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 TCATACGTAT GGATGTTATT C 21 配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 ATCGGTGATA CAGATAAGAC T 21 配列番号：１０ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 CCTTCATACG TATGAATATT ATTT 24 配列番号：１１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 AATCGTAATA TTAAACTGAC G 21 配列番号：１２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 CCTTCATACG TGTGAATGTT G 21
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 大橋 英治 八王子市北野町559−６ 日本水産株式会 社中央研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 配列番号５から得られる核酸配列を持
ち、炭疽菌に特徴的な核酸配列を増幅し得る少なくとも
一つの部位を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項２】 配列番号１及び配列番号３から得られる
核酸配列を持っていない請求項１のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項３】 バチラスセレウスまたはバチラスチュウ
リンジェンシスに由来する核酸配列を増幅し得る部位を
持っていない請求項１または２のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１１または配列番号１２で示さ
れる核酸配列を持っている請求項１、２または３のオリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれかのオリゴヌ
クレオチドを２種類組合せたプライマーセットを用い
て、検体中のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子
配列を標的とし、当該標的遺伝子を選択的に増幅させ検
体中に炭疽菌に特異的なｇｙｒＢが存在するか否かを決
定することで炭疽菌の検出を行う方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9264059A JPH114693A (ja) | 1997-03-24 | 1997-09-29 | 炭疽菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| US09/046,578 US6087104A (en) | 1997-03-24 | 1998-03-24 | Oligonucleotides for detection of Bacillus cereus group bacteria harmful to mammals, and method of detection with the oligonucleotides |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6990097 | 1997-03-24 | ||
| JP9-69900 | 1997-04-21 | ||
| JP10284397 | 1997-04-21 | ||
| JP9-102843 | 1997-04-21 | ||
| JP9264059A JPH114693A (ja) | 1997-03-24 | 1997-09-29 | 炭疽菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH114693A true JPH114693A (ja) | 1999-01-12 |
Family
ID=27300174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9264059A Withdrawn JPH114693A (ja) | 1997-03-24 | 1997-09-29 | 炭疽菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH114693A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7494774B2 (en) | 2002-11-15 | 2009-02-24 | Gen-Probe Incorporated | Assay and compositions for detection of Bacillus anthracis nucleic acid |
| CN102936621A (zh) * | 2012-08-27 | 2013-02-20 | 上海交通大学 | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 |
| CN104032000A (zh) * | 2012-08-27 | 2014-09-10 | 上海交通大学 | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 |
-
1997
- 1997-09-29 JP JP9264059A patent/JPH114693A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7494774B2 (en) | 2002-11-15 | 2009-02-24 | Gen-Probe Incorporated | Assay and compositions for detection of Bacillus anthracis nucleic acid |
| CN102936621A (zh) * | 2012-08-27 | 2013-02-20 | 上海交通大学 | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 |
| CN104032000A (zh) * | 2012-08-27 | 2014-09-10 | 上海交通大学 | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
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