JPH06253846A - 炭疽菌検出のためのポリヌクレオチドおよびそれを用いた炭疽菌の検出方法 - Google Patents
炭疽菌検出のためのポリヌクレオチドおよびそれを用いた炭疽菌の検出方法Info
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- JPH06253846A JPH06253846A JP5069371A JP6937193A JPH06253846A JP H06253846 A JPH06253846 A JP H06253846A JP 5069371 A JP5069371 A JP 5069371A JP 6937193 A JP6937193 A JP 6937193A JP H06253846 A JPH06253846 A JP H06253846A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明の目的は、炭疽菌（Bacillus anthrac
is）を特異的に検出するためのＤＮＡプロ−ブ用のポリ
ヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドを用いたＤＮＡプ
ローブを提供し、それを用いた炭疽菌の検出方法を提供
することにある。 【構成】 検体中に存在する炭疽菌を選択的に検出する
ためのＤＮＡプロ−ブ、または、炭疽菌のプラズミドの
capA遺伝子をコ−ドするヌクレオチド配列を標的とし、
そのヌクレオチド配列と相補的となるポリヌクレオチド
であって、ポリヌクレオチドが化１で示される配列群ま
たはそれらに対応する相補的配列からなることを特徴と
するポリヌクレオチド。及び該ポリヌクレオチドをＤＮ
Ａプロ−ブとして用いる炭疽菌の検出方法。 【化１】
is）を特異的に検出するためのＤＮＡプロ−ブ用のポリ
ヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドを用いたＤＮＡプ
ローブを提供し、それを用いた炭疽菌の検出方法を提供
することにある。 【構成】 検体中に存在する炭疽菌を選択的に検出する
ためのＤＮＡプロ−ブ、または、炭疽菌のプラズミドの
capA遺伝子をコ−ドするヌクレオチド配列を標的とし、
そのヌクレオチド配列と相補的となるポリヌクレオチド
であって、ポリヌクレオチドが化１で示される配列群ま
たはそれらに対応する相補的配列からなることを特徴と
するポリヌクレオチド。及び該ポリヌクレオチドをＤＮ
Ａプロ−ブとして用いる炭疽菌の検出方法。 【化１】
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、獣医臨床検
査、あるいは食品検査での炭疽菌の検出に用いることの
できるポリヌクレチドおよびそれを用いた検出方法に関
する。
査、あるいは食品検査での炭疽菌の検出に用いることの
できるポリヌクレチドおよびそれを用いた検出方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】炭疽は草食獣における伝染病であるが、
ヒトにも発生し、人獣共通伝染病として公衆衛生上にも
極めて重要な疾病である。日本では、本病は家畜の法定
伝染病として指定されており、ヒトでは届出伝染病とな
っている。炭疽病の発生は近年少なくなってはいるが、
炭疽菌の芽胞で汚染された土壌を持つ地域では、常に炭
疽菌によるヒト及び家畜の汚染をモニタリングする必要
がある。従来、炭疽菌の検出はセレウス菌（Bacillus c
ereus ）の検出法に準じて行なわれていた。つまり、検
体にその９倍量の希釈水を加えストマッカ−あるいはブ
レンダ−で均質化する。生成したホモジネ−トをポリミ
キシン加トリプトケ−スソイブイヨン培地で、３２〜３
５℃、１８〜２４時間、選択増菌培養を行なう。培養
後、その液の１白金耳量を、マンニト−ル卵黄ポリミキ
シン寒天培地、キム・ゲッパ−ト寒天培地などのセレウ
ス菌選択分離培地に塗抹する。それをさらに３２〜３５
℃で１８〜２４時間培養して、寒天上に生じたマンニッ
ト非分解、卵黄反応陽性、灰白色ワックス状、表面が粗
く大きいコロニ−を釣菌する。これをさらに、普通寒天
培地またはハ−トインフュ−ジョン寒天培地に３２〜３
５℃、１８〜２４時間培養して生育した菌体について、
グラム染色、莢膜染色と免疫学的検査を行なう。あるい
はガンマファ−ジの感受性の試験を行なう。
ヒトにも発生し、人獣共通伝染病として公衆衛生上にも
極めて重要な疾病である。日本では、本病は家畜の法定
伝染病として指定されており、ヒトでは届出伝染病とな
っている。炭疽病の発生は近年少なくなってはいるが、
炭疽菌の芽胞で汚染された土壌を持つ地域では、常に炭
疽菌によるヒト及び家畜の汚染をモニタリングする必要
がある。従来、炭疽菌の検出はセレウス菌（Bacillus c
ereus ）の検出法に準じて行なわれていた。つまり、検
体にその９倍量の希釈水を加えストマッカ−あるいはブ
レンダ−で均質化する。生成したホモジネ−トをポリミ
キシン加トリプトケ−スソイブイヨン培地で、３２〜３
５℃、１８〜２４時間、選択増菌培養を行なう。培養
後、その液の１白金耳量を、マンニト−ル卵黄ポリミキ
シン寒天培地、キム・ゲッパ−ト寒天培地などのセレウ
ス菌選択分離培地に塗抹する。それをさらに３２〜３５
℃で１８〜２４時間培養して、寒天上に生じたマンニッ
ト非分解、卵黄反応陽性、灰白色ワックス状、表面が粗
く大きいコロニ−を釣菌する。これをさらに、普通寒天
培地またはハ−トインフュ−ジョン寒天培地に３２〜３
５℃、１８〜２４時間培養して生育した菌体について、
グラム染色、莢膜染色と免疫学的検査を行なう。あるい
はガンマファ−ジの感受性の試験を行なう。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、グラム
染色と莢膜染色は他の類縁菌、例えばバチルス メガテ
リウム（Bacillus megaterium）, バチルス リケニフ
ォルミス（Bacillus licheniformis）, バチルス ズブ
チリス（Bacillus subtilis）等も炭疽菌と同様の反応
を起こすこと、ガンマファ−ジ感受性試験は多量の菌体
を要することと試験に数日間を要することで、炭疽菌の
有効なモニタリングの手段ではない。感受性が高く、信
頼性に富み、迅速で簡便な炭疽菌の検出方法が、公衆衛
生の見地から要請されているのが実状である。
染色と莢膜染色は他の類縁菌、例えばバチルス メガテ
リウム（Bacillus megaterium）, バチルス リケニフ
ォルミス（Bacillus licheniformis）, バチルス ズブ
チリス（Bacillus subtilis）等も炭疽菌と同様の反応
を起こすこと、ガンマファ−ジ感受性試験は多量の菌体
を要することと試験に数日間を要することで、炭疽菌の
有効なモニタリングの手段ではない。感受性が高く、信
頼性に富み、迅速で簡便な炭疽菌の検出方法が、公衆衛
生の見地から要請されているのが実状である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は下記の構成を有
する。 （１）検体中に存在する炭疽菌（Bacillus anthracis）
を選択的に検出するためのポリヌクレオチドまたは炭疽
菌のプラズミドのcapA遺伝子をコ−ドするヌクレオチド
配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となる
ようなポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチ
ドが化２に示す配列群またはそれに対応する相補的配列
からなることを特徴とするポリヌクレチド。
する。 （１）検体中に存在する炭疽菌（Bacillus anthracis）
を選択的に検出するためのポリヌクレオチドまたは炭疽
菌のプラズミドのcapA遺伝子をコ−ドするヌクレオチド
配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となる
ようなポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチ
ドが化２に示す配列群またはそれに対応する相補的配列
からなることを特徴とするポリヌクレチド。
【化２】 （２）前記第１項に示されたポリヌクレオチドを標識し
て、その標識ヌクレオチドをＤＮＡプロ−ブとして検体
中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列とハイブリダイ
ズさせ、ハイブリダイズしていない標識ヌクレオチドを
除去し、ハイブリダイズしている標識ヌクレオチドを検
出し、検体中に認識されるべき配列が存在しているか否
かを判定することを特徴とする炭疽菌の検出方法。
て、その標識ヌクレオチドをＤＮＡプロ−ブとして検体
中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列とハイブリダイ
ズさせ、ハイブリダイズしていない標識ヌクレオチドを
除去し、ハイブリダイズしている標識ヌクレオチドを検
出し、検体中に認識されるべき配列が存在しているか否
かを判定することを特徴とする炭疽菌の検出方法。
【０００５】本発明の炭疽菌の検出方法は、標識ヌクレ
オチドをＤＮＡプロ−ブとして検体のＤＮＡとハイブリ
ダイズすることによって、炭疽菌を選択的に検出するこ
とを特徴としている。
オチドをＤＮＡプロ−ブとして検体のＤＮＡとハイブリ
ダイズすることによって、炭疽菌を選択的に検出するこ
とを特徴としている。
【０００６】検体として、尿、血液、糞便、組織切片な
どの臨床材料、獣医臨床材料、あるいは食肉等の食品材
料でも良い。あるいはそれらの材料から分離した微生物
の菌体またはその培養液でもよい。これらの検体を溶菌
酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処理することに
より、検出に必要なＤＮＡを含んだ試料液を得る。その
試料液に制限酵素を作用させ、それをポリアクリルアミ
ドまたはアガロ−ズを担体とした電気泳動にかけ、サザ
ン・ブロッティング法でＤＮＡフラグメントをニトロセ
ルロ−ズに移し、ＤＮＡプロ−ブとハイブリダイズさせ
る。
どの臨床材料、獣医臨床材料、あるいは食肉等の食品材
料でも良い。あるいはそれらの材料から分離した微生物
の菌体またはその培養液でもよい。これらの検体を溶菌
酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処理することに
より、検出に必要なＤＮＡを含んだ試料液を得る。その
試料液に制限酵素を作用させ、それをポリアクリルアミ
ドまたはアガロ−ズを担体とした電気泳動にかけ、サザ
ン・ブロッティング法でＤＮＡフラグメントをニトロセ
ルロ−ズに移し、ＤＮＡプロ−ブとハイブリダイズさせ
る。
【０００７】ＤＮＡプロ−ブとしては１０塩基以上の長
さを持った核酸フラグメントであれば、化学合成で得ら
れたものでも天然物でも、どちらでも良いが、炭疽菌の
染色体あるいはプラズミドの特定の遺伝子に相補し、炭
疽菌の類縁菌を含めた炭疽菌以外の生物種の遺伝子に相
補しない配列を持つことが好ましい。より好ましくは、
炭疽菌の野生株の持つ病原性プラズミドｐＴＥ７０２中
に存在する莢膜形成の遺伝子capAのいずれか一部の塩基
配列と相補する配列を持つものが良い。
さを持った核酸フラグメントであれば、化学合成で得ら
れたものでも天然物でも、どちらでも良いが、炭疽菌の
染色体あるいはプラズミドの特定の遺伝子に相補し、炭
疽菌の類縁菌を含めた炭疽菌以外の生物種の遺伝子に相
補しない配列を持つことが好ましい。より好ましくは、
炭疽菌の野生株の持つ病原性プラズミドｐＴＥ７０２中
に存在する莢膜形成の遺伝子capAのいずれか一部の塩基
配列と相補する配列を持つものが良い。
【０００８】ＤＮＡプロ−ブの標識方法として、フォス
ファタ−ゼを用いるもの、Ｔ４ヌクレオチドキナ−ゼを
用いるもの、ＤＮＡポリメラ−ゼＩクレノウ（Klenow）
フラグメントを用いるもの、Ｔ４ＤＮＡポリメラ−ゼを
用いるもの等の末端標識、ＤＮＡポリメラ−ゼを用いる
ニックトランスレ−ションと呼ばれる標識法などがあ
り、いずれの標識法でも良い。標識に用いる物質として
32Ｐで標識したヌクレオチドやビオチン、ジゴキシゲニ
ン、ペルオキシダ−ゼ、あるいはN-アセトキシ-N2-アセ
チルアミノフルオレンなどが用いられるが、いずれの物
質でも良い。
ファタ−ゼを用いるもの、Ｔ４ヌクレオチドキナ−ゼを
用いるもの、ＤＮＡポリメラ−ゼＩクレノウ（Klenow）
フラグメントを用いるもの、Ｔ４ＤＮＡポリメラ−ゼを
用いるもの等の末端標識、ＤＮＡポリメラ−ゼを用いる
ニックトランスレ−ションと呼ばれる標識法などがあ
り、いずれの標識法でも良い。標識に用いる物質として
32Ｐで標識したヌクレオチドやビオチン、ジゴキシゲニ
ン、ペルオキシダ−ゼ、あるいはN-アセトキシ-N2-アセ
チルアミノフルオレンなどが用いられるが、いずれの物
質でも良い。
【０００９】ハイブリダイズされた核酸の検出は標識方
法によって異なるが、いかなる方法によっても良い。好
ましくは、オ−トラジオグラフィ−による検出が良い。
法によって異なるが、いかなる方法によっても良い。好
ましくは、オ−トラジオグラフィ−による検出が良い。
【００１０】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００１１】実施例１ 炭疽菌としてバチルス アントラキス デイビス（Baci
llus anthracis Davis）及びバチルス アントラキス
パスツールII（Bacillus anthracis PasteurII）を用い
た。その他、表１に示すようにグラム陽性菌として１６
種、グラム陰性菌として２２種の菌株を用いた。それら
の菌株をそれぞれブイヨン培地で３７℃で１夜培養し、
生成した菌体を遠心分離で集めた。その菌体をリゾチ−
ムが10mg/ml の濃度で入ったＴＥＳバッファ−（ｐＨ8.
0 ）、つまりトリス塩酸塩50ミリモル濃度、ＥＤＴＡ５
ミリモル濃度、塩化ナトリウム50ミリモル濃度に懸濁し
て、炭疽菌については37℃で90分、他の菌株については
37℃で30分間保温したのち、ドデシル硫酸ナトリウムと
プロテイナ−ゼＫを加え、55℃で約１時間保温して溶菌
した。その後リボヌクレア−ゼ処理でＲＮＡを取り除い
た。ＤＮＡをフェノ−ル−クロロフォルム法で除タンパ
クをして３回抽出し、エタノ−ルで沈殿して、集めたＤ
ＮＡをＴＥバッファ−（ｐＨ8.0 ）、つまりトリス塩酸
塩10ミリモル濃度、ＥＤＴＡ１ミリモル濃度に懸濁し
た。
llus anthracis Davis）及びバチルス アントラキス
パスツールII（Bacillus anthracis PasteurII）を用い
た。その他、表１に示すようにグラム陽性菌として１６
種、グラム陰性菌として２２種の菌株を用いた。それら
の菌株をそれぞれブイヨン培地で３７℃で１夜培養し、
生成した菌体を遠心分離で集めた。その菌体をリゾチ−
ムが10mg/ml の濃度で入ったＴＥＳバッファ−（ｐＨ8.
0 ）、つまりトリス塩酸塩50ミリモル濃度、ＥＤＴＡ５
ミリモル濃度、塩化ナトリウム50ミリモル濃度に懸濁し
て、炭疽菌については37℃で90分、他の菌株については
37℃で30分間保温したのち、ドデシル硫酸ナトリウムと
プロテイナ−ゼＫを加え、55℃で約１時間保温して溶菌
した。その後リボヌクレア−ゼ処理でＲＮＡを取り除い
た。ＤＮＡをフェノ−ル−クロロフォルム法で除タンパ
クをして３回抽出し、エタノ−ルで沈殿して、集めたＤ
ＮＡをＴＥバッファ−（ｐＨ8.0 ）、つまりトリス塩酸
塩10ミリモル濃度、ＥＤＴＡ１ミリモル濃度に懸濁し
た。
【００１２】ＤＮＡプロ−ブとして、発明者らが以前に
明らかにした炭疽菌のcapA遺伝子(Makino, S. et al.:
J. Bacteriol. 171, 722-730(1989)) のうち請求項１に
記したフラグメントを、クレノウフラグメントを用いる
ベーリンガー マンハイム社（Boehringer Mannheim
社）のランダム・プライムド・ＤＮＡラベリング・キッ
トを用いて、放射性の［α−32Ｐ］dCTPで標識したもの
を用いた。
明らかにした炭疽菌のcapA遺伝子(Makino, S. et al.:
J. Bacteriol. 171, 722-730(1989)) のうち請求項１に
記したフラグメントを、クレノウフラグメントを用いる
ベーリンガー マンハイム社（Boehringer Mannheim
社）のランダム・プライムド・ＤＮＡラベリング・キッ
トを用いて、放射性の［α−32Ｐ］dCTPで標識したもの
を用いた。
【００１３】試料のＤＮＡをそれぞれ制限酵素EcoRI で
消化したものを、0.7重量／容量％のアガロ−ズの電気
泳動の各レ−ンに入れ、泳動した。泳動したＤＮＡフラ
グメントをアガロ−ズゲルごとアルカリ処理で変性した
後、中和した。このゲルのＤＮＡフラグメントをニトロ
セルロ−ズ膜に移した。
消化したものを、0.7重量／容量％のアガロ−ズの電気
泳動の各レ−ンに入れ、泳動した。泳動したＤＮＡフラ
グメントをアガロ−ズゲルごとアルカリ処理で変性した
後、中和した。このゲルのＤＮＡフラグメントをニトロ
セルロ−ズ膜に移した。
【００１４】ホルムアミド５０容量％からなるハイブリ
ダイゼ−ション溶液に、標識したＤＮＡプロ−ブを入
れ、次にＤＮＡフラグメントを載せたニトロセルロ−ズ
膜を入れた。これを容器ごと４２℃で２時間保温して、
ハイブリダイゼ−ションを促進させたのち、塩化ナトリ
ウム−クエン酸３ナトリウム緩衝液(pH7.0) で５回洗浄
した。洗浄したニトロセルロ−ズ膜をレントゲンフィル
ムと重ねあわせラジオオ−トグラフィ−を行なった。
ダイゼ−ション溶液に、標識したＤＮＡプロ−ブを入
れ、次にＤＮＡフラグメントを載せたニトロセルロ−ズ
膜を入れた。これを容器ごと４２℃で２時間保温して、
ハイブリダイゼ−ションを促進させたのち、塩化ナトリ
ウム−クエン酸３ナトリウム緩衝液(pH7.0) で５回洗浄
した。洗浄したニトロセルロ−ズ膜をレントゲンフィル
ムと重ねあわせラジオオ−トグラフィ−を行なった。
【００１５】炭疽菌であるバチルス アントラキス デ
イビス（Bacillus anthracis Davis）及びバチルス ア
ントラキス パスツールII（Bacillus anthracis Paste
ur II）のレ−ンのみで、capA遺伝子のEcoRＩ消化断片
1.4 キロ塩基対に相当するバンドが検出された。表１に
示す、以下の菌株ではバンドは検出されなかった。
イビス（Bacillus anthracis Davis）及びバチルス ア
ントラキス パスツールII（Bacillus anthracis Paste
ur II）のレ−ンのみで、capA遺伝子のEcoRＩ消化断片
1.4 キロ塩基対に相当するバンドが検出された。表１に
示す、以下の菌株ではバンドは検出されなかった。
【００１６】
【表１】
【００１７】この結果、従来法では炭疽菌との区別が困
難であったバチルス セレウス（Bacillus cereus）,
バチルス リケニフォルミス（Bacillus licheniformi
s）,バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）,
バチルス ズブチリス（Bacillus subtilis）, バチル
ス チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensi
s）では1.4 キロ塩基対に相当するバンドが検出され
ず、この方法で炭疽菌を特異的に検出できることが分か
った。
難であったバチルス セレウス（Bacillus cereus）,
バチルス リケニフォルミス（Bacillus licheniformi
s）,バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）,
バチルス ズブチリス（Bacillus subtilis）, バチル
ス チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensi
s）では1.4 キロ塩基対に相当するバンドが検出され
ず、この方法で炭疽菌を特異的に検出できることが分か
った。
【００１８】
【発明の効果】本発明のポリヌクレオチドは炭疽菌の検
出用のＤＮＡプロ−ブとして特異性が高く，該ＤＮＡプ
ローブを用いた検出方法は炭疽菌を特異的に検出するこ
とができる。
出用のＤＮＡプロ−ブとして特異性が高く，該ＤＮＡプ
ローブを用いた検出方法は炭疽菌を特異的に検出するこ
とができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ 8310−2Ｊ
Claims (2)
- 【請求項１】検体中に存在する炭疽菌（Bacillus anthr
acis）を選択的に検出するためのポリヌクレオチドまた
は炭疽菌のプラズミドのcapA遺伝子をコ−ドするヌクレ
オチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的
となるようなポリヌクレオチドであって、そのポリヌク
レオチドが化１に示す配列群またはそれに対応する相補
的配列からなることを特徴とするポリヌクレチド。 【化１】 - 【請求項２】請求項１に示されたポリヌクレオチドを標
識して、その標識ヌクレオチドをＤＮＡプロ−ブとして
検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズさせ、ハイブリダイズしていない標識ヌクレオチ
ドを除去し、ハイブリダイズしている標識ヌクレオチド
を検出し、検体中に認識されるべき配列が存在している
か否かを判定することを特徴とする炭疽菌の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5069371A JPH06253846A (ja) | 1993-03-04 | 1993-03-04 | 炭疽菌検出のためのポリヌクレオチドおよびそれを用いた炭疽菌の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5069371A JPH06253846A (ja) | 1993-03-04 | 1993-03-04 | 炭疽菌検出のためのポリヌクレオチドおよびそれを用いた炭疽菌の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06253846A true JPH06253846A (ja) | 1994-09-13 |
Family
ID=13400640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5069371A Pending JPH06253846A (ja) | 1993-03-04 | 1993-03-04 | 炭疽菌検出のためのポリヌクレオチドおよびそれを用いた炭疽菌の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06253846A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7494774B2 (en) | 2002-11-15 | 2009-02-24 | Gen-Probe Incorporated | Assay and compositions for detection of Bacillus anthracis nucleic acid |
-
1993
- 1993-03-04 JP JP5069371A patent/JPH06253846A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7494774B2 (en) | 2002-11-15 | 2009-02-24 | Gen-Probe Incorporated | Assay and compositions for detection of Bacillus anthracis nucleic acid |
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