JP3476821B2 - カンピロバクタージュジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のゲノムの核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列 - Google Patents
カンピロバクタージュジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のゲノムの核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はカンピロバクタージュジュニ（以下Campylob
acter jejuniまたはC.jejuniと表記する）に特異的な核
酸の塩基配列と、この塩基配列を用いて生物サンプル中
のCampylobacterjejuniのDNAまたはRNAを増幅させるた
めのヌクレオチドプライマーとしてのCampylobacter je
juniの配列またはその断片を検出するための特異的ヌク
レオチドプローブとしての応用とに関するものである。
acter jejuniまたはC.jejuniと表記する）に特異的な核
酸の塩基配列と、この塩基配列を用いて生物サンプル中
のCampylobacterjejuniのDNAまたはRNAを増幅させるた
めのヌクレオチドプライマーとしてのCampylobacter je
juniの配列またはその断片を検出するための特異的ヌク
レオチドプローブとしての応用とに関するものである。
カンピロバクター感染症は世界中で人および野性動物
または家畜の両方に広く拡がっている感染症である。
または家畜の両方に広く拡がっている感染症である。
現在カンピロバクター（Campylobacter）と呼ばれる
このバクテリアは20世紀初頭には発見されていたが、同
定および培養が困難であったため長い間無視されてき
た。最初に羊および牛から単離された当時はVibrio fet
usと呼ばれ、Campylobacter fetusと呼ばれるようにな
ったのは後である。人間で最初のカンピロバクター症例
が報告されはじめたのは1946年のことであるが、カンピ
ロバクター感染症の重大さが実証され、認識されるよう
になったのはカンピロバクター用の選択的培地が開発さ
れ始めた1972年からである。
このバクテリアは20世紀初頭には発見されていたが、同
定および培養が困難であったため長い間無視されてき
た。最初に羊および牛から単離された当時はVibrio fet
usと呼ばれ、Campylobacter fetusと呼ばれるようにな
ったのは後である。人間で最初のカンピロバクター症例
が報告されはじめたのは1946年のことであるが、カンピ
ロバクター感染症の重大さが実証され、認識されるよう
になったのはカンピロバクター用の選択的培地が開発さ
れ始めた1972年からである。
Campylobacter fetus型の種が命名されて以来、その
他の種および亜種が12種類の発見された。その正確な数
字は命名者および分類法によって変わる。多くの場合、
全く新規な分類基準が提案される。
他の種および亜種が12種類の発見された。その正確な数
字は命名者および分類法によって変わる。多くの場合、
全く新規な分類基準が提案される。
これらの中で人間および／または動物の病理で最も多
く見られるのはCampylobacter jejuniと、Campylobacte
r coliと、Campylobacter fetusとである。現在では、
人間における伝染性下痢の最大の原因はCampylobacter
jejuniであると考えられている。
く見られるのはCampylobacter jejuniと、Campylobacte
r coliと、Campylobacter fetusとである。現在では、
人間における伝染性下痢の最大の原因はCampylobacter
jejuniであると考えられている。
1986年にフランスで設立された「カンピロバクター感
染症監視ネットワーク（reseau de surveillance natio
nale des infections aCampylobacter）」は、報告例に
ついての疫学的データおよび臨床データのレジメを毎年
発行している。例えば、1988年、1989年および1990年で
はこの感染症に関連があるとされた種で最も多かったの
はC.jejuniであった。（分析したケースの60〜75％）。
染症監視ネットワーク（reseau de surveillance natio
nale des infections aCampylobacter）」は、報告例に
ついての疫学的データおよび臨床データのレジメを毎年
発行している。例えば、1988年、1989年および1990年で
はこの感染症に関連があるとされた種で最も多かったの
はC.jejuniであった。（分析したケースの60〜75％）。
人間の腸でのC.jejuni感染症の主要な症状は下痢であ
り、最も深刻なケースでは重度の脱水症状となり、脱水
症に対して弱い子供と幼児には特に危険である。しか
し、多くの場合、C.jejuniによる腸炎は合併症を起こさ
ないまま一週間後に自然に止まる。しかし、糞便培養結
果は数週間後あるいは一ヶ月後でも陽性のままであり、
５〜10％のケースは再発する。すなわちカンピロバクタ
ーは人の体内で日和見バクテリア的に挙動するので、免
疫が抑制されている人および深刻な疾病持つ人（エイ
ズ、肝硬変、癌、白血病等の患者）の場合には徹底した
処置と監視が必要がある。
り、最も深刻なケースでは重度の脱水症状となり、脱水
症に対して弱い子供と幼児には特に危険である。しか
し、多くの場合、C.jejuniによる腸炎は合併症を起こさ
ないまま一週間後に自然に止まる。しかし、糞便培養結
果は数週間後あるいは一ヶ月後でも陽性のままであり、
５〜10％のケースは再発する。すなわちカンピロバクタ
ーは人の体内で日和見バクテリア的に挙動するので、免
疫が抑制されている人および深刻な疾病持つ人（エイ
ズ、肝硬変、癌、白血病等の患者）の場合には徹底した
処置と監視が必要がある。
上記以外にC.jejuni感染結果として報告されているも
のには腸間膜腺炎、胆嚢炎、泌尿器感染、髄膜炎、敗血
症、結節性紅斑またはギラン−バレ症候群などである
が、これらは例外的かつ稀なケースである。
のには腸間膜腺炎、胆嚢炎、泌尿器感染、髄膜炎、敗血
症、結節性紅斑またはギラン−バレ症候群などである
が、これらは例外的かつ稀なケースである。
動物ではカンピロバクターは通常共生物として牛、
羊、豚、家禽、野性の鳥、犬および猫等の多くの種の消
化管内に住んでいる。これらの動物は病気に罹っている
か健康キャリヤーであるかに係わらず巨大な保菌宿主を
構成しているので、感染の危険は高い。牛および羊での
明らかな感染ケースでC.jejuniが「家畜赤痢（dysenter
ie du betail）」の原因であることは1931年の最初の報
告から知られている。その結果、家畜への影響だけでは
なく、微生物が動物の周囲（地面や水）に蔓延して人間
に入る危険がある。無症候動物すなわち「健康キャリヤ
ー」の場合でも、これら動物やその排泄物に直接接触し
たり、汚染された食物や水（調製時に汚染された肉や十
分に調理されていない肉や低温殺菌されていない牛乳、
汚染された水等）を飲食すると、人間に入ることにな
る。
羊、豚、家禽、野性の鳥、犬および猫等の多くの種の消
化管内に住んでいる。これらの動物は病気に罹っている
か健康キャリヤーであるかに係わらず巨大な保菌宿主を
構成しているので、感染の危険は高い。牛および羊での
明らかな感染ケースでC.jejuniが「家畜赤痢（dysenter
ie du betail）」の原因であることは1931年の最初の報
告から知られている。その結果、家畜への影響だけでは
なく、微生物が動物の周囲（地面や水）に蔓延して人間
に入る危険がある。無症候動物すなわち「健康キャリヤ
ー」の場合でも、これら動物やその排泄物に直接接触し
たり、汚染された食物や水（調製時に汚染された肉や十
分に調理されていない肉や低温殺菌されていない牛乳、
汚染された水等）を飲食すると、人間に入ることにな
る。
従って、病原であるC.jejuniを一日でもけ早く同定す
ることは、適当な方法で人と動物の両方でのコンタミネ
ーションを防ぐために予防的側面から極めて重要であ
る。特に、無菌状態の必要とする食品業界の場合に重要
である。また、C.jejuniに感染後した患者の治療後の正
しいモニタリングや再発の完全予防の点で人間の病理学
でも重要である。
ることは、適当な方法で人と動物の両方でのコンタミネ
ーションを防ぐために予防的側面から極めて重要であ
る。特に、無菌状態の必要とする食品業界の場合に重要
である。また、C.jejuniに感染後した患者の治療後の正
しいモニタリングや再発の完全予防の点で人間の病理学
でも重要である。
さらに、感染時に感染の進行と伝染・伝播を防ぐため
の適切かつ効果的な処置が行えるようにするためには、
原因となる微生物を発病後に迅速かつ正確に同定するこ
とが極めて重要である。
の適切かつ効果的な処置が行えるようにするためには、
原因となる微生物を発病後に迅速かつ正確に同定するこ
とが極めて重要である。
しかし、カンピロバクターの同定とその関連種の決定
は容易ではない。すなわち、従来法では、単離に特別な
培地を必要とし、少なくとも48時間培養して濃縮してか
らでないとこの微生物は検出できない。この時間は迅速
な診断を必要とする場合には長過ぎる時間である。ま
た、現在の微生物学的診断は異種間に存在する表現型の
違いを利用する細菌学的および／または生化学的手法で
あり、所定の特性に対して突然変異体が現れた場合には
診断ミスとなる危険性がある。C.jejuniとC.coliとを区
別する唯一の基準は馬尿酸塩を加水分解するか否かであ
り（C.jejuniは加水分解できるが、C.Coliはできな
い）、区別不可能ということも起り得る。事実、馬尿酸
塩に対して陰性のC.jejuni株も存在する（Hebert達、J.
Clin.Microbiol.,1984,20,138−140,Totten達、J.Clin.
Microbiol.,1987,25,1747−1752）。
は容易ではない。すなわち、従来法では、単離に特別な
培地を必要とし、少なくとも48時間培養して濃縮してか
らでないとこの微生物は検出できない。この時間は迅速
な診断を必要とする場合には長過ぎる時間である。ま
た、現在の微生物学的診断は異種間に存在する表現型の
違いを利用する細菌学的および／または生化学的手法で
あり、所定の特性に対して突然変異体が現れた場合には
診断ミスとなる危険性がある。C.jejuniとC.coliとを区
別する唯一の基準は馬尿酸塩を加水分解するか否かであ
り（C.jejuniは加水分解できるが、C.Coliはできな
い）、区別不可能ということも起り得る。事実、馬尿酸
塩に対して陰性のC.jejuni株も存在する（Hebert達、J.
Clin.Microbiol.,1984,20,138−140,Totten達、J.Clin.
Microbiol.,1987,25,1747−1752）。
C.jejuni種の同定に分子ハイブリダイゼーションを用
いる方法は既に提案されている。しかし、公知の方法は
培養後にしか同定が行えず、生物試料中でこのバクテリ
アを検出するには感度が不十分である。そのため、放射
性プローブ（Ng達、Mol.Cell.Probes,1987,１,223−24
3）を用いたり、非放射性プローブ（Chevrier達、J.Cli
n.Microbiol.,1989,27,321−326）を用いたカンピロバ
クターの同定・分離方法が提案されたが、これらの方法
では全ゲノムプローブを使用する必要があり、しかも、
検出閾値が約105バクテリアと非常に高いために培養に
よる濃縮が必要である（Chevrier達、上記）。
いる方法は既に提案されている。しかし、公知の方法は
培養後にしか同定が行えず、生物試料中でこのバクテリ
アを検出するには感度が不十分である。そのため、放射
性プローブ（Ng達、Mol.Cell.Probes,1987,１,223−24
3）を用いたり、非放射性プローブ（Chevrier達、J.Cli
n.Microbiol.,1989,27,321−326）を用いたカンピロバ
クターの同定・分離方法が提案されたが、これらの方法
では全ゲノムプローブを使用する必要があり、しかも、
検出閾値が約105バクテリアと非常に高いために培養に
よる濃縮が必要である（Chevrier達、上記）。
種を判定するためにピッケン達（Picken et.al.Mol.C
ell.Probes,1987,１,245−259）、コロリック達（Korol
ik et.al.J.Gen.Microbiol.,1988,134,521−529）およ
びズーとワング（Zhou and Wang（Zbl.Bakt.,1989,272,
186−190）はC.jejuniの特異的核酸プローブを研究した
が、特異性の問題は残っており、プローブとなる可能性
のある配列は決定されていない。同様に、アルカリホス
ファターゼに結合したオリゴマーで構成された別のC.je
juniの「特異的」プローブも報告されている（Jablonsk
i et.al.,N.A.R.,1986,14,No.15）（配列は公開されて
いない）。しかし、この特異性はC.jejuni由来の断片に
ついてテストされているのみで、C.jejuniとカンピロバ
クター属のその他の種のゲノム全体に対してはテストさ
れていない。
ell.Probes,1987,１,245−259）、コロリック達（Korol
ik et.al.J.Gen.Microbiol.,1988,134,521−529）およ
びズーとワング（Zhou and Wang（Zbl.Bakt.,1989,272,
186−190）はC.jejuniの特異的核酸プローブを研究した
が、特異性の問題は残っており、プローブとなる可能性
のある配列は決定されていない。同様に、アルカリホス
ファターゼに結合したオリゴマーで構成された別のC.je
juniの「特異的」プローブも報告されている（Jablonsk
i et.al.,N.A.R.,1986,14,No.15）（配列は公開されて
いない）。しかし、この特異性はC.jejuni由来の断片に
ついてテストされているのみで、C.jejuniとカンピロバ
クター属のその他の種のゲノム全体に対してはテストさ
れていない。
最近、C.Coli VC167のfla A遺伝子から選択したオリ
ゴヌクレオチドを用いてPCRによってC.jejuniを同定す
る方法が報告された（Oyofo et al.,J.Clin.Microbio
l.,1992,30,No.10,2613−2619）。しかし、この方法で
はC.ColiとC.jejuniとを区別することができない。
ゴヌクレオチドを用いてPCRによってC.jejuniを同定す
る方法が報告された（Oyofo et al.,J.Clin.Microbio
l.,1992,30,No.10,2613−2619）。しかし、この方法で
はC.ColiとC.jejuniとを区別することができない。
本出願人らは、Campylobacter jejuni種に特異的な検
出法に使用可能な核酸の塩基配列を単離した。
出法に使用可能な核酸の塩基配列を単離した。
従って、本発明の対象は、Campylobacter jejuniのゲ
ノムの核酸塩基配列と特異的にハイブリダイズするヌク
レオチド配列において、ヌクレオチド配列No.1と、これ
と相補的な配列と、この配列の少なくとも１つの塩基の
突然変異、挿入、欠失または置換に起因して変化した配
列との中から選択されることを特徴とする塩基配列にあ
る。
ノムの核酸塩基配列と特異的にハイブリダイズするヌク
レオチド配列において、ヌクレオチド配列No.1と、これ
と相補的な配列と、この配列の少なくとも１つの塩基の
突然変異、挿入、欠失または置換に起因して変化した配
列との中から選択されることを特徴とする塩基配列にあ
る。
本発明の他の対象は、上記のヌクレオチド配列の全部
または一部を含むヌクレオチド配列、特にヌクレオチド
配列No.2と、これと相補的な配列と、この配列の少なく
とも１つの塩基の突然変異、挿入、欠失または置換に起
因して変化した配列との中から選択されるヌクレオチド
配列を有するヌクレオチド配列にある。
または一部を含むヌクレオチド配列、特にヌクレオチド
配列No.2と、これと相補的な配列と、この配列の少なく
とも１つの塩基の突然変異、挿入、欠失または置換に起
因して変化した配列との中から選択されるヌクレオチド
配列を有するヌクレオチド配列にある。
「少なくとも１つの塩基の突然変異、挿入、欠失また
は置換に起因して変化した配列」とは、サムブルック、
フリーシュ、およびマニアチスが定義した通常のストリ
ンジェンシーの条件（SAMBROOK J.,FRITSCH E.F.and MA
NIATIS T:Molecular Clonig（1989）,A Laboratory Man
ual,Ed.Cold.Spring Harbor Laboratory 9.47−9.62）
下で、配列No.1、配列No.2またはこれらと相補的な配列
とハイブリダイズする配列を意味する。この条件は培地
のストリンジェンシー温度Tmで決まる。
は置換に起因して変化した配列」とは、サムブルック、
フリーシュ、およびマニアチスが定義した通常のストリ
ンジェンシーの条件（SAMBROOK J.,FRITSCH E.F.and MA
NIATIS T:Molecular Clonig（1989）,A Laboratory Man
ual,Ed.Cold.Spring Harbor Laboratory 9.47−9.62）
下で、配列No.1、配列No.2またはこれらと相補的な配列
とハイブリダイズする配列を意味する。この条件は培地
のストリンジェンシー温度Tmで決まる。
最も有利な配列は（Tm−15℃）から（Tm−20℃）の温
度範囲でハイブリダイズする配列である。
度範囲でハイブリダイズする配列である。
本発明の配列は少なくとも12個のヌクレオチドを有す
るのが有利である。
るのが有利である。
本発明のさらに他の対象は、上記で定義の配列の増幅
生成物（produits d'amplification）にある。
生成物（produits d'amplification）にある。
本発明のさらに他の対象は、上記定義のヌクレオチド
配列を含むクローニングベクターにある。
配列を含むクローニングベクターにある。
上記定義のヌクレオチド配列はDNA配列でもRNA配列で
もよい。
もよい。
配列No.1の断片の正確なサイズは147bpである。この
配列はC.jejuni種に対して特異的で、カンピロバクター
属のその他８つの代表的な種とはハイブリダイズしな
い。
配列はC.jejuni種に対して特異的で、カンピロバクター
属のその他８つの代表的な種とはハイブリダイズしな
い。
配列No.2の断片の長さは1,189bpで、C.coliと極めて
軽くハイブリダイズするが、試験を行ったその他７つの
カンピロバクター種とはハイブリダイズしない。
軽くハイブリダイズするが、試験を行ったその他７つの
カンピロバクター種とはハイブリダイズしない。
データベース「Genebank」および「EMBL」を検索した
が、配列No.1および配列No.2と公知DNA配列との間には
類似性は全くなかった。
が、配列No.1および配列No.2と公知DNA配列との間には
類似性は全くなかった。
配列No.1および配列No.2は、機能的に均等な部分また
は変体で、Campylobacter jejuniを検出および同定する
ための分子ハイブリダイゼーション法で用いることがで
きる。
は変体で、Campylobacter jejuniを検出および同定する
ための分子ハイブリダイゼーション法で用いることがで
きる。
機能的に均等な変体には、これらの断片の特異性に必
須な特性を損わずに塩基対が突然変異、欠失、挿入また
は置換された配列が含まれる。
須な特性を損わずに塩基対が突然変異、欠失、挿入また
は置換された配列が含まれる。
本発明のヌクレオイド配列は医学および獣医学におけ
る診断および疫学的用途で、特にCampylobacter jejuni
の特異的な核酸プローブまたはCampylobacter jejuniの
特異的配列の増幅（amorces）用のオリゴヌクレオチド
プライマーとして用いることができる。
る診断および疫学的用途で、特にCampylobacter jejuni
の特異的な核酸プローブまたはCampylobacter jejuniの
特異的配列の増幅（amorces）用のオリゴヌクレオチド
プライマーとして用いることができる。
本発明プローブは上記配列または配列の断片中に少な
くとも20の連続したヌクレオチドを含んでいるのが有利
である。このプローブはDNAかRNAプローブである。
くとも20の連続したヌクレオチドを含んでいるのが有利
である。このプローブはDNAかRNAプローブである。
本発明のヌクレオチド配列は、生物試料中のCampylob
acter jejuniを特異的かつ直接的な方法で特異的に検出
するためのプローブとして使用することができる。この
プローブはバクテリアが属する生物型とは無関係にCamp
ylobacter jejuni種のバクテリアを検出することができ
る（C.jejuni種のバクテリアは馬尿酸塩を加水分解して
H2SとＤNase Iとを産生する能力に応じてＩ、II、IIIお
よびIV型とよばれる４つに分類されるの“Lior biotyp
e"が存在する）。
acter jejuniを特異的かつ直接的な方法で特異的に検出
するためのプローブとして使用することができる。この
プローブはバクテリアが属する生物型とは無関係にCamp
ylobacter jejuni種のバクテリアを検出することができ
る（C.jejuni種のバクテリアは馬尿酸塩を加水分解して
H2SとＤNase Iとを産生する能力に応じてＩ、II、IIIお
よびIV型とよばれる４つに分類されるの“Lior biotyp
e"が存在する）。
本発明オリゴヌクレオチドプローブは亜種であるC.je
juni subsp.doyleiも検出することができる。
juni subsp.doyleiも検出することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブはC.jejuniと同
じ生物試料中に存在する可能性のあるその他の種類:Bac
teroides fragilis、Enterrococcus faecalis、Enteroc
occus faeciumおよびStreptococcus agalactiaeに属す
るバクテリアからのDNAを検出することはない。
じ生物試料中に存在する可能性のあるその他の種類:Bac
teroides fragilis、Enterrococcus faecalis、Enteroc
occus faeciumおよびStreptococcus agalactiaeに属す
るバクテリアからのDNAを検出することはない。
ラベルしていない配列をプローブとして直接使用する
ことができるが、通常は、多くの用途で使用できるプロ
ーブとするために、配列を放射性元素（32P、35S、3H、
125I）または非放射性分子（ビオチン、アセチルアミノ
フルオレン、ジゴキシゲニン、５−ブロモデオキシウリ
ジン）でラベル化する。
ことができるが、通常は、多くの用途で使用できるプロ
ーブとするために、配列を放射性元素（32P、35S、3H、
125I）または非放射性分子（ビオチン、アセチルアミノ
フルオレン、ジゴキシゲニン、５−ブロモデオキシウリ
ジン）でラベル化する。
後者の場合には、フランス国特許第2,422,956号およ
び第2,518,755号に記載のラベル方法のいずれかを用い
ることができる。ハイブリダイゼーションは種々の方法
で行うことができる（Matthews,J.A.and Kricka,L.J.,A
nal.Biochem.1988,169,1−25）。最も広く採用されてい
る方法は、Campylobacter jejuniの細胞かり抽出した核
酸を担体（ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン
など）に固定し、固定した核酸とプローブとを所定の条
件下で培養する方法である。ハイブリド化させた後、過
剰なプローブを除去し、形成されたハイブリッド分子を
適当な方法で検出する（プローブの放射能、蛍光活性ま
たは酵素活性を測定する等）。
び第2,518,755号に記載のラベル方法のいずれかを用い
ることができる。ハイブリダイゼーションは種々の方法
で行うことができる（Matthews,J.A.and Kricka,L.J.,A
nal.Biochem.1988,169,1−25）。最も広く採用されてい
る方法は、Campylobacter jejuniの細胞かり抽出した核
酸を担体（ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン
など）に固定し、固定した核酸とプローブとを所定の条
件下で培養する方法である。ハイブリド化させた後、過
剰なプローブを除去し、形成されたハイブリッド分子を
適当な方法で検出する（プローブの放射能、蛍光活性ま
たは酵素活性を測定する等）。
本発明の核酸プローブはキャプチャープローブ（sond
ess de capture）として使用することもできる。この場
合にはプローブを担体に固定し、C.jejuniから抽出した
標的の核酸を特異的ハイブリダイゼーションによって捕
獲する。必要な場合にば、固体担体を試料から分離し、
キャプチャープローブと標的核酸との間に形成されたデ
ューブレックス（duplex）を、検出が容易な元素でラベ
ルした第２の検出プローブを用いて検出する。
ess de capture）として使用することもできる。この場
合にはプローブを担体に固定し、C.jejuniから抽出した
標的の核酸を特異的ハイブリダイゼーションによって捕
獲する。必要な場合にば、固体担体を試料から分離し、
キャプチャープローブと標的核酸との間に形成されたデ
ューブレックス（duplex）を、検出が容易な元素でラベ
ルした第２の検出プローブを用いて検出する。
分析試料から十分な量のCampylobacter jejuniの核酸
が抽出できる場合には上記配列を用いて分析試料からCa
mpylobacter jejuniに属する株を直接同定することがで
きる。そうでない場合には、Campylobacter jejuniから
核酸を抽出する前に液体培地中で迅速に培養するか、試
料から抽出できる少量のCampylobacter jejuniの核酸を
増幅（amplification）、例えばPCR法で増幅する。
が抽出できる場合には上記配列を用いて分析試料からCa
mpylobacter jejuniに属する株を直接同定することがで
きる。そうでない場合には、Campylobacter jejuniから
核酸を抽出する前に液体培地中で迅速に培養するか、試
料から抽出できる少量のCampylobacter jejuniの核酸を
増幅（amplification）、例えばPCR法で増幅する。
オリゴヌクレオチドプライマー（amorces oligonucle
otides）特にPCR法用のプライマーは、配列No.1、配列N
o.2またはこれらの配列の断片から選択することができ
る。
otides）特にPCR法用のプライマーは、配列No.1、配列N
o.2またはこれらの配列の断片から選択することができ
る。
この増幅法では増幅すべき断片の両側に付ける（enca
rdant）オリゴヌクレオチドペアを選択する必要がある
（米国特許第4,683,202号）。このオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドのプライマ
ーの長さは18〜30、好ましくは18〜22ヌクレオチドであ
るのが有利である。２つのプライマーの中の１方は鋳型
の（＋）鎖と相補的で、他方のプライマーは（−）鎖と
相補的である。これらのプライマーが二次構造または互
いに相補的な配列を含まないことが重要である。また、
各プライマーの配列の長さはプライマーが原核細胞また
は真核細胞、特にjejuni種に属さないカンピロバクター
由来の核酸および試料中に入り込む可能性のある人間の
DNAまたはRNAとハイブリダイズしないような長さを選択
しなければならない。
rdant）オリゴヌクレオチドペアを選択する必要がある
（米国特許第4,683,202号）。このオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドのプライマ
ーの長さは18〜30、好ましくは18〜22ヌクレオチドであ
るのが有利である。２つのプライマーの中の１方は鋳型
の（＋）鎖と相補的で、他方のプライマーは（−）鎖と
相補的である。これらのプライマーが二次構造または互
いに相補的な配列を含まないことが重要である。また、
各プライマーの配列の長さはプライマーが原核細胞また
は真核細胞、特にjejuni種に属さないカンピロバクター
由来の核酸および試料中に入り込む可能性のある人間の
DNAまたはRNAとハイブリダイズしないような長さを選択
しなければならない。
Campylobacter jejuni株の塩基配列の増幅用の特異的
プライマーとして選択されるアンプリマーは例えばグリ
フェイス達の方法に従って選択される（Griffais et a
l.,Nucleic Acids Res.1991,19,3887−3891）。
プライマーとして選択されるアンプリマーは例えばグリ
フェイス達の方法に従って選択される（Griffais et a
l.,Nucleic Acids Res.1991,19,3887−3891）。
本発明者達はPCR法用に配列No.2からのオリゴヌクレ
オチドを選択した。このオリゴヌクレオチドを用いるこ
とによってCampylobacter jejuniが特異的に増幅され、
その他のカンピロバクター種由来の核酸の増幅は見られ
なかった。
オチドを選択した。このオリゴヌクレオチドを用いるこ
とによってCampylobacter jejuniが特異的に増幅され、
その他のカンピロバクター種由来の核酸の増幅は見られ
なかった。
特に最も好ましいプライマーペアは配列No.2由来の下
記配列のオリゴヌクレオチドVS15およびVS16である： 増幅された断片はアガロースまたはポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を行って同
定するか、クロマトグラフィー法（ゲル濾過、疎水性ク
ロマトグラフィーまたはイオン交換体クロマトグラフィ
ー）を行って同定することができる。増幅特異性はプロ
ーブとしてヌクレオチド配列No.1またはNo.2、その断
片、これらの配列またはその断片を含むプラスミド、こ
れらの配列またはその配列の断片と相補的なオリゴヌク
レオチドまたは増幅生成物を用いた分子ハイブリダイゼ
ーションによって管理することができる。これらのプロ
ーブは放射性元素または非放射性分子でラベルされてい
ても、されていなくてもよい。
記配列のオリゴヌクレオチドVS15およびVS16である： 増幅された断片はアガロースまたはポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を行って同
定するか、クロマトグラフィー法（ゲル濾過、疎水性ク
ロマトグラフィーまたはイオン交換体クロマトグラフィ
ー）を行って同定することができる。増幅特異性はプロ
ーブとしてヌクレオチド配列No.1またはNo.2、その断
片、これらの配列またはその断片を含むプラスミド、こ
れらの配列またはその配列の断片と相補的なオリゴヌク
レオチドまたは増幅生成物を用いた分子ハイブリダイゼ
ーションによって管理することができる。これらのプロ
ーブは放射性元素または非放射性分子でラベルされてい
ても、されていなくてもよい。
本発明のさらに他の対象は、下記段階を特徴とする生
物試料中のCampylobacter jejuniの存在を検出する方法
にある： ｉ）生物試料とプライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチ
ド断片のペアとを、プライマーがCampylobacter jejuni
の核酸にハイブリダイズするような条件下で接触させ、
この場合、必要に応じて、生物サンプル中に含まれるCa
mpylobacter jejuniの核酸を予めハイブリダイゼーショ
ンし易い状態としておき、 ii）Campylobacter jejuniに属する核酸を増幅させ、 iii）プライマーを両側に有する断片に対応するCampylo
bacter jejuniの核酸の断片が増幅されたことを検出
し、 iv）特異的プローブのハイブリダイゼーション、シーケ
ンシングまたは制限部位分析等によって増幅された断片
を必要に応じて確認する。
物試料中のCampylobacter jejuniの存在を検出する方法
にある： ｉ）生物試料とプライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチ
ド断片のペアとを、プライマーがCampylobacter jejuni
の核酸にハイブリダイズするような条件下で接触させ、
この場合、必要に応じて、生物サンプル中に含まれるCa
mpylobacter jejuniの核酸を予めハイブリダイゼーショ
ンし易い状態としておき、 ii）Campylobacter jejuniに属する核酸を増幅させ、 iii）プライマーを両側に有する断片に対応するCampylo
bacter jejuniの核酸の断片が増幅されたことを検出
し、 iv）特異的プローブのハイブリダイゼーション、シーケ
ンシングまたは制限部位分析等によって増幅された断片
を必要に応じて確認する。
アガロースゲルを用いた場合のPCR増幅後の検出限界
は、C.jejuniのバクテリア懸濁液を10倍に順次希釈して
増幅した時に１バクテリアである。
は、C.jejuniのバクテリア懸濁液を10倍に順次希釈して
増幅した時に１バクテリアである。
本発明のさらに他の対象は、下記要素を有することを
特徴とする生物試料中のCampylobacter jejuniの存在を
検出するためのキットにある： １） 上記で定義のオリゴヌクレオチド断片のペア、 ２） Campylobacter jejuni株に由来する核酸を増幅さ
せる試薬、 ３） 必要に応じて増幅した断片の配列を確認するも
の、特に、 上記定義の核酸プローブ。
特徴とする生物試料中のCampylobacter jejuniの存在を
検出するためのキットにある： １） 上記で定義のオリゴヌクレオチド断片のペア、 ２） Campylobacter jejuni株に由来する核酸を増幅さ
せる試薬、 ３） 必要に応じて増幅した断片の配列を確認するも
の、特に、 上記定義の核酸プローブ。
このキットはラベル化されたまたはラベル化されてい
ないプローブを含んでいるのがさらに好ましい。これら
は溶液状態でも、担体に固定されていてもよい。キット
にさらにバクテリアの溶菌および標的核酸の抽出に必要
な試薬と、選択した方法に対応したハイブリッド化溶液
および洗浄液を含めることもできる。
ないプローブを含んでいるのがさらに好ましい。これら
は溶液状態でも、担体に固定されていてもよい。キット
にさらにバクテリアの溶菌および標的核酸の抽出に必要
な試薬と、選択した方法に対応したハイブリッド化溶液
および洗浄液を含めることもできる。
本発明のさらに他の対象は、上記定義の核酸プローブ
の疫学的道具としての分子疫学での利用にある。
の疫学的道具としての分子疫学での利用にある。
実際、C.jejuniのゲノム中に特定の断片が数回存在す
る場合、この反復性は同一の株の同定・分類の道具とな
り、その根源と感染の伝播との関連を調べることができ
る。
る場合、この反復性は同一の株の同定・分類の道具とな
り、その根源と感染の伝播との関連を調べることができ
る。
以下、本発明の実施例を説明する。
添付図面は配列No.2（断片VS1）の配列決定手法を示
している。
している。
実施例１
C.jejuniゲノムライブラリーの作成と、ライブラリーの
スクリーニングと、特定断片の配列決定 パスツール研究所（Pasteur Institute Collection）
提供のC.jejuni CIP 70.2由来のゲノムDNAを制限エンド
ヌクレアーゼHind IIIを用いて部分的に切断する。メー
カーの推奨するバッファー中で37℃で１時間、DNA1μｇ
当たり0.06Uの酵素を反応させる。こうして切断された
ゲノムDNAを0.5％アガロースゲル上で電気泳動で分離
し、長さ30〜40kbの断片を電気的に溶出させ、フェノー
ル／クロロホルム（1/1）で抽出した後、エタノール中
で沈澱させる。
スクリーニングと、特定断片の配列決定 パスツール研究所（Pasteur Institute Collection）
提供のC.jejuni CIP 70.2由来のゲノムDNAを制限エンド
ヌクレアーゼHind IIIを用いて部分的に切断する。メー
カーの推奨するバッファー中で37℃で１時間、DNA1μｇ
当たり0.06Uの酵素を反応させる。こうして切断された
ゲノムDNAを0.5％アガロースゲル上で電気泳動で分離
し、長さ30〜40kbの断片を電気的に溶出させ、フェノー
ル／クロロホルム（1/1）で抽出した後、エタノール中
で沈澱させる。
ベクターはベーリンガー社（Boehringer）から提供さ
れたコスミドref.pHC79である。これを同様の方法で切
断し、セルフリゲーションを完全に避けるために脱リン
酸化する。
れたコスミドref.pHC79である。これを同様の方法で切
断し、セルフリゲーションを完全に避けるために脱リン
酸化する。
リゲーションは、700ngのベクターと30/40kbのDNA断
片1.5μｇとを混合し、この混合物に適当なバッファー
に入れたT4DNAリガーゼ１ユニットを添加した後、14℃
で18時間放置して行った。
片1.5μｇとを混合し、この混合物に適当なバッファー
に入れたT4DNAリガーゼ１ユニットを添加した後、14℃
で18時間放置して行った。
組み換えコスミドをインビトロでカプセル化し、バク
テリア（E.coli HB 101）の形質転換に使用する。形質
転換されたバクテリアはLB培地で37℃で１時間培養した
後、25μg/mのアンピリシンを含む選択的アガー培地
上に置く。アンピシリン耐性のコロニー全に対してテト
ラサイクリンに対する感受性テストする（30/40kbのDNA
断片はテトラサイクリン（Tet）耐性遺伝子を不活化し
てアンピシリン（Amp）耐性遺伝子を保存するようにベ
クターに挿入される）。
テリア（E.coli HB 101）の形質転換に使用する。形質
転換されたバクテリアはLB培地で37℃で１時間培養した
後、25μg/mのアンピリシンを含む選択的アガー培地
上に置く。アンピシリン耐性のコロニー全に対してテト
ラサイクリンに対する感受性テストする（30/40kbのDNA
断片はテトラサイクリン（Tet）耐性遺伝子を不活化し
てアンピシリン（Amp）耐性遺伝子を保存するようにベ
クターに挿入される）。
アルカリ溶菌法でアンピシリン耐性（Ampr）且つテト
ラサイクリン感受性（Tets）の最初の形質転換コロニー
60個から小規模にDNA調製する。この調製物からのDNAを
制限エンドヌクレアーゼHind IIIで切断し、0.8％アガ
ロースゲル上で電気泳動分析し、次いでナイロンフィル
ター上に移す。DNAを254nmの紫外線に３分間曝して不可
逆的に固定する。
ラサイクリン感受性（Tets）の最初の形質転換コロニー
60個から小規模にDNA調製する。この調製物からのDNAを
制限エンドヌクレアーゼHind IIIで切断し、0.8％アガ
ロースゲル上で電気泳動分析し、次いでナイロンフィル
ター上に移す。DNAを254nmの紫外線に３分間曝して不可
逆的に固定する。
各フィルタを、10％のデキストラン硫酸、濃縮された
デンハルド5X溶液（Denhardt,s solution）（1Xのデン
ハルド溶液は0.02％のFicoll、0.02％のポリビニルピロ
リドンおよび0.02％の牛血清アルブミンに相当する）、
10mMのEDTA、0.5％のSDS、100μg/mの変性されたサケ
精子DNAおよび下記３つの種： C.jejuni CIP 70.2、 C.Coli CIP 70.80および C.fetus subsp.fetus CIP 5396 のいずれかを「マルチプライミング（多重増幅、amorca
ge multiple）」で32Pで放射性化したゲノムDNAを含む6
XのSSCバッファー（1XのSSCは0.15Mの塩化ナトリウムお
よび0.015Mのクエン酸ナトリウムとに相当する）中で、
65℃で16〜18時間培養する。
デンハルド5X溶液（Denhardt,s solution）（1Xのデン
ハルド溶液は0.02％のFicoll、0.02％のポリビニルピロ
リドンおよび0.02％の牛血清アルブミンに相当する）、
10mMのEDTA、0.5％のSDS、100μg/mの変性されたサケ
精子DNAおよび下記３つの種： C.jejuni CIP 70.2、 C.Coli CIP 70.80および C.fetus subsp.fetus CIP 5396 のいずれかを「マルチプライミング（多重増幅、amorca
ge multiple）」で32Pで放射性化したゲノムDNAを含む6
XのSSCバッファー（1XのSSCは0.15Mの塩化ナトリウムお
よび0.015Mのクエン酸ナトリウムとに相当する）中で、
65℃で16〜18時間培養する。
ハイブリダイゼーション後、フィルターを例えば65℃
の2XSSCで10分間づつ２回、65℃の2XSSC＋0.1％のSDSで
30分間１回、最後に65℃に0.1XのSCCで10分間１回洗浄
する。湿ったままのフィルタを増感板を用いて−80℃で
15分から３日間オートラジオグラフィーにかける。
の2XSSCで10分間づつ２回、65℃の2XSSC＋0.1％のSDSで
30分間１回、最後に65℃に0.1XのSCCで10分間１回洗浄
する。湿ったままのフィルタを増感板を用いて−80℃で
15分から３日間オートラジオグラフィーにかける。
このハイブリダイゼーションの結果、VS1と名付けら
れる約1.2kbの断片を含むコスミドのクローンが単離さ
れる。この断片をベクターpUC18（ベーリンガー社から
市販）でクローニングして大量調製する。得られたプラ
スミドをpVS20と名付けた。
れる約1.2kbの断片を含むコスミドのクローンが単離さ
れる。この断片をベクターpUC18（ベーリンガー社から
市販）でクローニングして大量調製する。得られたプラ
スミドをpVS20と名付けた。
この断片の特異性は実施例２に記載の方法で確認し
た。
た。
上記VS1断片をM13mp18ファージでクローニングし、シ
ーケンシングキット「シーケナーゼ」（登録商標Sequen
ase 2.0、米国、バイオケミア社（Biochemia Corporati
on）製）を用いてサンガー（Sanger）法で配列決定し
た。断片VS1の幾つかの部分は、２本のDNA鎖をアルカリ
変性した後プラスミドpVS20で直接配列決定された。シ
ーケンシング反応は全て35Sでラベル化したdATPを用い
て行った。
ーケンシングキット「シーケナーゼ」（登録商標Sequen
ase 2.0、米国、バイオケミア社（Biochemia Corporati
on）製）を用いてサンガー（Sanger）法で配列決定し
た。断片VS1の幾つかの部分は、２本のDNA鎖をアルカリ
変性した後プラスミドpVS20で直接配列決定された。シ
ーケンシング反応は全て35Sでラベル化したdATPを用い
て行った。
添付の線図は断片VS1のシーケンシングに用いた手法
を示すもので、２、３、４、５、６、７、14、16、17、
18はシーケンシングで用いた各種プライマーを示してい
る。FPおよびRPはpUC18およびM13mp18のDNAに共通な相
補的プライマーである。
を示すもので、２、３、４、５、６、７、14、16、17、
18はシーケンシングで用いた各種プライマーを示してい
る。FPおよびRPはpUC18およびM13mp18のDNAに共通な相
補的プライマーである。
断片の全体配列が配列No.2である。
こうして決定された断片VS1の1189個のヌクレオチド
をデータベース「Genebank」および「EMBL」と比較した
が、現在公知の配列に類似のものは見出せなかった。
をデータベース「Genebank」および「EMBL」と比較した
が、現在公知の配列に類似のものは見出せなかった。
実施例２
本発明の核酸配列をプローブとして使用したサザン法に
よるDNA分析 本試験で用いたバクテリアの符号リストは以下の通
り： カンピロバクター： C.jejuni CIP 70.2 C.coli CIP 70.80 C.lari CIP 102722 C.fetus subsp.fetus CIP 5395 C.fetus subsp.venerealis CIP 6829 C.hyointestinalis C120 C.curvus（Hopital des Enfants.Bordeaux） C.sputorum subsp.sputorum CCUG 9728 C.sputorum subsp.bubulus CIP 53103 C.concisus 18688 C.facalis CIP 12014 カンピロバクター以外： Escherichia coli HB101 Helicobacter pylori CIP 101260 Salmonella typhimurium CJ 53 A.cryaerophilus CCUG 1780 カンピロバクター属に属さないバクテリアからのDNA 上記バクテリアと陽性コントロールとして用いたC.je
juniとのDNAを制限酵素Hind IIIで加水分解し、得られ
た断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、ナイロン膜
Hybond−Ｎへと移した。各DNA断片をベーリンガー社の
「Random primed DNA Labelling」キットの指示に従っ
て、32Pでラベル化されたVS1断片をプローブとして用い
た分子ハイブリダイゼーションで分析した。オートラジ
オグラフィーで検出された唯一の種はC.jejuniであっ
た。カンピロバクター種以外のDNAでは72時間暴露後で
もバイブリダイゼーションは全く検出されなかった。
よるDNA分析 本試験で用いたバクテリアの符号リストは以下の通
り： カンピロバクター： C.jejuni CIP 70.2 C.coli CIP 70.80 C.lari CIP 102722 C.fetus subsp.fetus CIP 5395 C.fetus subsp.venerealis CIP 6829 C.hyointestinalis C120 C.curvus（Hopital des Enfants.Bordeaux） C.sputorum subsp.sputorum CCUG 9728 C.sputorum subsp.bubulus CIP 53103 C.concisus 18688 C.facalis CIP 12014 カンピロバクター以外： Escherichia coli HB101 Helicobacter pylori CIP 101260 Salmonella typhimurium CJ 53 A.cryaerophilus CCUG 1780 カンピロバクター属に属さないバクテリアからのDNA 上記バクテリアと陽性コントロールとして用いたC.je
juniとのDNAを制限酵素Hind IIIで加水分解し、得られ
た断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、ナイロン膜
Hybond−Ｎへと移した。各DNA断片をベーリンガー社の
「Random primed DNA Labelling」キットの指示に従っ
て、32Pでラベル化されたVS1断片をプローブとして用い
た分子ハイブリダイゼーションで分析した。オートラジ
オグラフィーで検出された唯一の種はC.jejuniであっ
た。カンピロバクター種以外のDNAでは72時間暴露後で
もバイブリダイゼーションは全く検出されなかった。
C.jejuni以外のカンピロバクター属由来のバクテリアの
DNA カンピロバクター種を適当な培地（５％の羊血液アガ
ー、バイオメリュー（Biomerieux）社）で培養した後、
以下の方法で処理する。
DNA カンピロバクター種を適当な培地（５％の羊血液アガ
ー、バイオメリュー（Biomerieux）社）で培養した後、
以下の方法で処理する。
各ペトリ皿からバクテリアを2mのTE−グルコースバ
ッファー（25mMのpH8トリス塩酸、10mMのEDTA、50mMの
グルコース）を用いて回収し、5,000gで５分間遠心分離
する。ケーキを再度懸濁し、TE−グルコースで洗浄し、
再度遠心分離する。バクテリアを100μのTEバッファ
ー（10mMのpH8のトリス塩酸、1mMのEDTA）に再懸濁し、
ピッチャー達の方法でDNAを抽出する（Pitcher et.al.,
Lett.Appl.Microbiol.,1989,８,151−156）。抽出したD
NAを酵素Hind IIIを用いて完全に切断する。得られた断
片を0.8％のTAEアガロースゲル上で電気泳動して分離し
た後、サザン法に従ってナイロン膜上に移す。
ッファー（25mMのpH8トリス塩酸、10mMのEDTA、50mMの
グルコース）を用いて回収し、5,000gで５分間遠心分離
する。ケーキを再度懸濁し、TE−グルコースで洗浄し、
再度遠心分離する。バクテリアを100μのTEバッファ
ー（10mMのpH8のトリス塩酸、1mMのEDTA）に再懸濁し、
ピッチャー達の方法でDNAを抽出する（Pitcher et.al.,
Lett.Appl.Microbiol.,1989,８,151−156）。抽出したD
NAを酵素Hind IIIを用いて完全に切断する。得られた断
片を0.8％のTAEアガロースゲル上で電気泳動して分離し
た後、サザン法に従ってナイロン膜上に移す。
移した断片を分子ハイブリダイゼーションで分析す
る。この実施例で使用したプローブは断片VS2（配列No.
1の）と、断片VS1を酵素Bgl IIで加水分解して得られる
断片VS3とで、これら２つのプローブは32Pでラベル化さ
れている。
る。この実施例で使用したプローブは断片VS2（配列No.
1の）と、断片VS1を酵素Bgl IIで加水分解して得られる
断片VS3とで、これら２つのプローブは32Pでラベル化さ
れている。
プローブVS2はC.jejuni由来のDNAを特異的に検出し、
その他のカンピロバクター種のゲノムDNAとはハイブリ
ダイズしない。
その他のカンピロバクター種のゲノムDNAとはハイブリ
ダイズしない。
プローブVS3はC.jejuni由来のDNAを検出すると同時に
C.coliゲノム上のDNA断片とも極めて軽くハイブリダイ
ズする。このクロスハイブリダイゼーションは16時間暴
露させた後にのみ検出可能である。一方、C.jejuni由来
のDNAはわずか15分の暴露後に検出された。
C.coliゲノム上のDNA断片とも極めて軽くハイブリダイ
ズする。このクロスハイブリダイゼーションは16時間暴
露させた後にのみ検出可能である。一方、C.jejuni由来
のDNAはわずか15分の暴露後に検出された。
これらの結果から、プローブVS1（配列No.2）はそれ
以外の属のバクテリア由来のDNAの中でC.jejuni由来のD
NAを特異的に検出し、断片VS2（配列No.1）はカンピロ
バクター属内で正確に同定した場合にC.jejuniを特異的
に認識するという結論が導かれる。
以外の属のバクテリア由来のDNAの中でC.jejuni由来のD
NAを特異的に検出し、断片VS2（配列No.1）はカンピロ
バクター属内で正確に同定した場合にC.jejuniを特異的
に認識するという結論が導かれる。
実施例３
本発明の核酸の塩基配列からのプライマーを用いたC.je
juni由来のDNAのインビトルでの酵素増幅 プライマーの選択 PCRの特異性を決定するのは基本的にオリゴヌクレオ
チドプライマーの3'末端であることは分かっている（M.
Innis et col.,PCR Protocols,Academic Press In
c.）。従って、このの3'領域が増幅すべき目標物に対し
て完全に特異的であることが重要である。
juni由来のDNAのインビトルでの酵素増幅 プライマーの選択 PCRの特異性を決定するのは基本的にオリゴヌクレオ
チドプライマーの3'末端であることは分かっている（M.
Innis et col.,PCR Protocols,Academic Press In
c.）。従って、このの3'領域が増幅すべき目標物に対し
て完全に特異的であることが重要である。
カンピロバクターのゲノムのグアニンおよびシトシン
の比率は非常に小さいので（Ｇ＋Ｃで28〜30％）、3'末
端がＧ＋Ｃを多く含むプライマーは高い特異性を示すと
考えられた。
の比率は非常に小さいので（Ｇ＋Ｃで28〜30％）、3'末
端がＧ＋Ｃを多く含むプライマーは高い特異性を示すと
考えられた。
本発明者らは、VS1配列中にＧ＋Ｃを多く含みものを
探した結果、VS1中に一度だけ存在した。この領域から
プライマーの配列を決め、長さが約20ヌクレオチドとな
るように終了させた。
探した結果、VS1中に一度だけ存在した。この領域から
プライマーの配列を決め、長さが約20ヌクレオチドとな
るように終了させた。
オリゴヌクレオチドプライマーの合成
VS1配列に由来するOligo VS15およびOligo VS16と名
付けた上記の配列を有する長さがそれぞれ21および22ヌ
クレオチドのプライマーをホスホラミダイト（phosphor
amidites）を基礎にしたミリポア（Millipore）社の自
動装置「サイクロンプラス（Cyclone Plus）」で合成し
た。合成後、オリゴヌクレオチド溶液を試験管に移し、
濃縮した水酸化アンモニウム中で55℃で16時間培養し
た。オリゴヌクレオチドをエタノールで沈澱させた後、
ケーキを70％のエタノールで洗浄し、乾燥し、最後に1m
の滅菌蒸留水に懸濁した。各プライマーの濃度は分光
光度計で測定した。
付けた上記の配列を有する長さがそれぞれ21および22ヌ
クレオチドのプライマーをホスホラミダイト（phosphor
amidites）を基礎にしたミリポア（Millipore）社の自
動装置「サイクロンプラス（Cyclone Plus）」で合成し
た。合成後、オリゴヌクレオチド溶液を試験管に移し、
濃縮した水酸化アンモニウム中で55℃で16時間培養し
た。オリゴヌクレオチドをエタノールで沈澱させた後、
ケーキを70％のエタノールで洗浄し、乾燥し、最後に1m
の滅菌蒸留水に懸濁した。各プライマーの濃度は分光
光度計で測定した。
増幅
増幅法として、例えばサイキ達の手順に従ったインビ
トロ酵素増幅法（PCR）を用いた（Saiki et al.,Scienc
e,1988,239,487−491）。この方法では、１μＭのオリ
ゴヌクレオチドOligo VS15およびOligo VS16と、異なる
カンピロバクター株に由来するDNA30−100ngと、0.5ユ
ニットのTaqポリメラーゼと共に用いて、バッファー（2
5mMのＫCl、pH8.5のトリス塩酸20mM、塩化マグネシウム
1.5mM、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート200
μＭおよび牛血清アルブミン100μM/mを含む）中で最
終的な反応容量を50μにして行う。
トロ酵素増幅法（PCR）を用いた（Saiki et al.,Scienc
e,1988,239,487−491）。この方法では、１μＭのオリ
ゴヌクレオチドOligo VS15およびOligo VS16と、異なる
カンピロバクター株に由来するDNA30−100ngと、0.5ユ
ニットのTaqポリメラーゼと共に用いて、バッファー（2
5mMのＫCl、pH8.5のトリス塩酸20mM、塩化マグネシウム
1.5mM、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート200
μＭおよび牛血清アルブミン100μM/mを含む）中で最
終的な反応容量を50μにして行う。
PCR法の各段階でのパラメータは以下のように選択し
た:94℃で５分、60℃で１分、72℃で１分、次いで（94
℃で１分、60℃で１分、72℃で１分）を28回、そして最
終サイクルを94℃で１分、60℃で１分、72℃で５分。自
動装置を用いてこれを30サイクルを行う。最終サイクル
後、分析まで試料を４℃に維持する。
た:94℃で５分、60℃で１分、72℃で１分、次いで（94
℃で１分、60℃で１分、72℃で１分）を28回、そして最
終サイクルを94℃で１分、60℃で１分、72℃で５分。自
動装置を用いてこれを30サイクルを行う。最終サイクル
後、分析まで試料を４℃に維持する。
増幅させた試料のアガロースゲル上での電気泳動分析
増幅させた試料10μを、１μg/mlのエチジウム臭素
を含むTBEバッファー（0.04Mのトリス硼酸、0.001MのED
TA）中で２％アガロースゲル上に添加する。増幅させた
断片をUV下で視覚化し、ポラロイド（Polaroid 667）フ
ィルムを用いてゲルを撮影する。
を含むTBEバッファー（0.04Mのトリス硼酸、0.001MのED
TA）中で２％アガロースゲル上に添加する。増幅させた
断片をUV下で視覚化し、ポラロイド（Polaroid 667）フ
ィルムを用いてゲルを撮影する。
カンピロバクター由来の各種DNAと、カンピロバクタ
ー属に属さないバクテリア由来の各種DNAと、プライマ
ーOligo VS15およびOligo VS16とを用いて得られた結果
を比較した。このプライマーペアを用いて増幅させた断
片に期待される理論上の長さは358塩基対である。
ー属に属さないバクテリア由来の各種DNAと、プライマ
ーOligo VS15およびOligo VS16とを用いて得られた結果
を比較した。このプライマーペアを用いて増幅させた断
片に期待される理論上の長さは358塩基対である。
そのような断片はC.jejuniから抽出されたDNAのみで
得られる。
得られる。
以下の株:C.coli、C.lari、C.fetus subsp.fetus、C.
fetus subsp.venerealis、C.hyointestinalis、A.cryae
rophilus、C.sputorum subsp.sputorum、C.sputorum su
bsp.bubulus、C.concisus.、C.facalis、E.coli、H.pyl
ori、S.typhimurium、C.curvusおよび人の細胞から抽出
したDNAを分析したものでは、上記の期待されるサイズ
の断片の増幅は見られない。
fetus subsp.venerealis、C.hyointestinalis、A.cryae
rophilus、C.sputorum subsp.sputorum、C.sputorum su
bsp.bubulus、C.concisus.、C.facalis、E.coli、H.pyl
ori、S.typhimurium、C.curvusおよび人の細胞から抽出
したDNAを分析したものでは、上記の期待されるサイズ
の断片の増幅は見られない。
C.fetus subsp.fetusの場合、分子量の大きい断片が
増幅されたが非特異的であった。すなわち、ナイロン膜
に移した後のこの断片は32Pでラベル化したVS1プローブ
とハイブリダイズしない。
増幅されたが非特異的であった。すなわち、ナイロン膜
に移した後のこの断片は32Pでラベル化したVS1プローブ
とハイブリダイズしない。
さらに、ホロホロチョウから単離した15のC.jejuni株
で上記PCR法でC.jejuniの同定テストをした。株を継代
培養した後にDNAを抽出し、増幅した。株は全てC.jejun
iと同定され、これは予め行った生化学試験と一致し
た。
で上記PCR法でC.jejuniの同定テストをした。株を継代
培養した後にDNAを抽出し、増幅した。株は全てC.jejun
iと同定され、これは予め行った生化学試験と一致し
た。
PCRテストの感度の決定
上記オリゴヌクレオチドペアを用いてPCR法でC.jejun
iのDNAの検出時の絶対値閾値を求めるために、C.jejuni
バクテリア懸濁液の10倍に希釈したPCRによる増幅を行
った。増幅は40サイクルを行い、各サイクルは上記条件
と同じにし、希釈液を適当な溶菌バッファーと混合した
後、熱処理（65℃で15分間、続いて95℃で10分間培養）
した。溶菌バッファーの組成は以下の通り：トリス塩酸
10mM、EDTA1mM、pHの0.5％Tween 20、0.5％Nonidet−P4
0および500μg/mのプロテイナーゼＫ。
iのDNAの検出時の絶対値閾値を求めるために、C.jejuni
バクテリア懸濁液の10倍に希釈したPCRによる増幅を行
った。増幅は40サイクルを行い、各サイクルは上記条件
と同じにし、希釈液を適当な溶菌バッファーと混合した
後、熱処理（65℃で15分間、続いて95℃で10分間培養）
した。溶菌バッファーの組成は以下の通り：トリス塩酸
10mM、EDTA1mM、pHの0.5％Tween 20、0.5％Nonidet−P4
0および500μg/mのプロテイナーゼＫ。
溶菌で使ったものと同じ各希釈液の100μ量をカン
ピロバクター用培地を入れたペトリ皿に広げ、48時間培
養後にコロニーを数えた。これらの条件下での検出限界
は７バクテリアであった。
ピロバクター用培地を入れたペトリ皿に広げ、48時間培
養後にコロニーを数えた。これらの条件下での検出限界
は７バクテリアであった。
各希釈液10μを増幅するPCR法での検出限界は統計
的に１バクテリアである（理論上の希釈は、3.5×107バ
クテリア/100μ〜3.5バクテリア/100μで、それぞ
れ100μ当たりのペトリ皿のバクテリアカウント値2.5
×107、106、105、1.5×104、560、32、７および０に対
応する）。
的に１バクテリアである（理論上の希釈は、3.5×107バ
クテリア/100μ〜3.5バクテリア/100μで、それぞ
れ100μ当たりのペトリ皿のバクテリアカウント値2.5
×107、106、105、1.5×104、560、32、７および０に対
応する）。
結論として、このプライマーペアによってC.jejuni種
を特異的に検出できることは重要であり、それによって
C.jejuniに感染した患者や生物試料から単離したものを
同定することができ、臨床細菌学および獣医学の分野で
使用できる。
を特異的に検出できることは重要であり、それによって
C.jejuniに感染した患者や生物試料から単離したものを
同定することができ、臨床細菌学および獣医学の分野で
使用できる。
本発明によるC.jejuniの検出方法は上記のオリゴヌク
レオチドプローブを用いて食品（チキンスカロッピー
ニ、牛肉、牛乳、水）中のC.jejuniの存在を調べるのに
使用することもできる。この場合にはバクテリアの溶菌
前に低速遠心分離によって粗食物組織を除去する必要が
ある。そうすることによってPCRテストの結果を向上さ
せ、増幅反応の阻害に起因して誤って陰性と判断する危
険を避けることができる。
レオチドプローブを用いて食品（チキンスカロッピー
ニ、牛肉、牛乳、水）中のC.jejuniの存在を調べるのに
使用することもできる。この場合にはバクテリアの溶菌
前に低速遠心分離によって粗食物組織を除去する必要が
ある。そうすることによってPCRテストの結果を向上さ
せ、増幅反応の阻害に起因して誤って陰性と判断する危
険を避けることができる。
配列リスト
Ｉ 一般情報
（１） 出願人：パスツール研究所
（２） 発明の名称：
カンピロバクタージュジュニ（Campylobacter jejun
i）のゲノムの核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイ
ズするヌクレオチド配列 （３） 配列の数:4 II 配列No.1に関する情報： 配列特性： タイプ :ヌクレオチド 長さ :147塩基対 鎖の数 :一本鎖 形状 :直線 分子タイプ:DNA 生物体 :Campylobacter jejuni 名称 :VS2 配列： III 配列No.2に関する情報： 配列特性： タイプ :ヌクレオチド 長さ :1,189塩基対 鎖の数 :一本鎖 形状 :直線 分子タイプ:DNA 生物体 :Campylobacter jejuni 名称 :VS1 配列： IV 配列No.3に関する情報： 配列特性： タイプ :ヌクレオチド 長さ :21塩基 鎖の数 :一本鎖 形状 :直線 分子タイプ:DNA 生物体 :Campylobacter jejuni 名称 :Oligo VS15 配列： Ｖ 配列No.4に関する情報： 配列特性： タイプ :ヌクレオチド 長さ :22塩基 鎖の数 :一本鎖 形状 :直線 分子タイプ:DNA 生物体 :Campylobacter jejuni 名称 :Oligo VS16 配列：
i）のゲノムの核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイ
ズするヌクレオチド配列 （３） 配列の数:4 II 配列No.1に関する情報： 配列特性： タイプ :ヌクレオチド 長さ :147塩基対 鎖の数 :一本鎖 形状 :直線 分子タイプ:DNA 生物体 :Campylobacter jejuni 名称 :VS2 配列： III 配列No.2に関する情報： 配列特性： タイプ :ヌクレオチド 長さ :1,189塩基対 鎖の数 :一本鎖 形状 :直線 分子タイプ:DNA 生物体 :Campylobacter jejuni 名称 :VS1 配列： IV 配列No.3に関する情報： 配列特性： タイプ :ヌクレオチド 長さ :21塩基 鎖の数 :一本鎖 形状 :直線 分子タイプ:DNA 生物体 :Campylobacter jejuni 名称 :Oligo VS15 配列： Ｖ 配列No.4に関する情報： 配列特性： タイプ :ヌクレオチド 長さ :22塩基 鎖の数 :一本鎖 形状 :直線 分子タイプ:DNA 生物体 :Campylobacter jejuni 名称 :Oligo VS16 配列：
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フロントページの続き
(56)参考文献 国際公開94／17205（ＷＯ，Ａ１)
Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ,
1992年，30（10），2613−2619
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/00 - 15/90
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (13)
- 【請求項１】下記の（１）〜（４）から成る群の中から
選択される、カンピロバクタージュジュニ（Campylobac
ter jejuni）のゲノムの核酸塩基配列と特異的にハイブ
リダイズする精製された核酸： （１） 配列No.1のヌクレオチド配列、 （２） 配列No.1と完全に相補なヌクレオチド配列、 （３） 下記定義のストリンジェントな条件下で配列N
o.1とハイブリダイズするヌクレオチド配列、 （４） 下記定義のストリンジェントな条件下で配列N
o.1と完全に相補なヌクレオチド配列とハイブリダイズ
するヌクレオチド配列、 （ここで、ストリンジェントな条件とは下記条件を意味
する： 10％のデキストラン硫酸、濃縮されたデンハルド5X溶
液、10mMのEDTA、0.5％のSDSおよび100μg/mlの変性さ
れたサケ精子DNAを含む6XSSCバッファー中で65℃で16〜
18時間ハイブリダイズし、 65℃の2XSSC中で10分間づつ２回、65℃の2XSSC＋0.1％
のSDSで30分間１回、最後に65℃の0.1XSCCで10分間１回
洗浄する） - 【請求項２】下記の（１）〜（４）から成る群の中から
選択される、カンピロバクタージュジュニ（Campylobac
ter jejuni）のゲノムの核酸塩基配列と特異的にハイブ
リダイズする精製された核酸： （１） 配列No.2のヌクレオチド配列、 （２） 配列No.2と完全に相補なヌクレオチド配列、 （３） 下記定義のストリンジェントな条件下で配列N
o.2とハイブリダイズするヌクレオチド配列、 （４） 下記定義のストリンジェントな条件下で配列N
o.2と完全に相補なヌクレオチド配列とハイブリダイズ
するヌクレオチド配列、 （ここで、ストリンジェントな条件とは下記条件を意味
する： 10％のデキストラン硫酸、濃縮されたデンハルド5X溶
液、10mMのEDTA、0.5％のSDSおよび100μg/mlの変性さ
れたサケ精子DNAを含む6XSSCバッファー中で65℃で16〜
18時間ハイブリダイズし、 65℃の2XSSC中で10分間づつ２回、65℃の2XSSC＋0.1％
のSDSで30分間１回、最後に65℃の0.1XSCCで10分間１回
洗浄する） - 【請求項３】請求項１または２に記載のヌクレオチド配
列を含むことを特徴とするクローニングベクター。 - 【請求項４】請求項１または２に記載のヌクレオチド配
列の中から選択された少なくとも20の連続するヌクレオ
チドから成ることを特徴とする、カンピロバクタージュ
ジュニ（Campylobacter jejuni）の核酸に対して特異的
な核酸プローブ。 - 【請求項５】核酸プローブが請求項１または２に記載の
ヌクレオチド配列から選択される、請求項４に記載のカ
ンピロバクタージュジュニ（Campylobacter jejuni）の
核酸に対して特異的な核酸プローブ。 - 【請求項６】担体上に固定されてキャプチャープローブ
として使用される請求項４または５に記載の核酸プロー
ブ。 - 【請求項７】各々が請求項１または２に記載の配列の中
から選択される18〜30のヌクレオチドから成るオリゴヌ
クレオチドのペアから成ることを特徴とする、カンピロ
バクタージュジュニ（Campylobacter jejuni）の核酸配
列の増殖に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーペ
ア。 - 【請求項８】下記配列のオリゴヌクレオチドペアで構成
されることを特徴とする、請求項７に記載のカンピロバ
クタージュジュニ（Campylobacter jejuni）の核酸配列
の増殖に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーペア： - 【請求項９】下記段階を特徴とする生物試料中のカンピ
ロバクタージュジュニ（Campylobacter jejuni）の存在
を検出する方法： ａ） バクテリアの溶菌および／またはDNA抽出によっ
て生物試料と請求項７または８に記載のプライマーペア
とを接触させ、この場合、必要に応じて、予め生物サン
プル中に含まれるカンピロバクタージュジュニ（Campyl
obacter jejuni）の核酸がプライマーペアに接触し易い
状態にしておき、 ｂ） カンピロバクタージュジュニ（Campylobacter je
juni）に属する核酸を増殖させ、 ｃ） プライマーの側部に位置する断片に対応するカン
ピロバクタージュジュニ（Campylobacter jejuni）の核
酸の増殖物を検出し、 ｄ） 必要な場合にはさらに、特異的プローブのハイブ
リダイゼーション、シーケンシングまたは制限部位分析
等によって増殖された断片の配列を確認する。 - 【請求項１０】下記段階を特徴とする食物試料中のカン
ピロバクタージュジュニ（Campylobacter jejuni）の存
在を検出する方法： ａ） 低速遠心分離で粗大な食物組織を除去し、 ｂ） バクテリアの溶菌および／またはDNA抽出によっ
て食物試料と請求項７または８に記載のプライマーペア
とを接触させ、この場合、必要に応じて、食物サンプル
中に含まれるカンピロバクタージュジュニ（Campylobac
ter jejuni）の核酸がプライマーペアに接触し易い状態
にしておき、 ｃ） カンピロバクタージュジュニ（Campylobacter je
juni）に属する核酸を増殖させ、 ｄ） プライマーの側部に位置する断片に対応するカン
ピロバクタージュジュニ（Campylobacter jejuni）の核
酸の増殖物を検出する。 - 【請求項１１】下記要素から成ることを特徴とする生物
試料中または食物試料中のカンピロバクタージュジュニ
（Campylobacter jejuni）の存在を検出するためのキッ
ト： １） 請求項７または８に記載のプライマーペア、 ２） カンピロバクタージュジュニ（Campylobacter je
juni）の核酸を増殖させる試薬、 ３） 必要に応じて用いられる、請求項４〜６のいずれ
か一項に記載の核酸プローブ。 - 【請求項１２】カンピロバクタージュジュニ（Campylob
acter jejuni）株を特定のカンピロバクタージュジュニ
（Campylobacter jejuni）株に対して特定・分類するた
めの疫学的手段としての請求項４〜６のいずれか一項に
記載の核酸プローブの使用。 - 【請求項１３】請求項８に記載のオリゴヌクレオチドペ
アを用いて請求項１または２に記載の精製された核酸を
増幅させて得られることを特徴とする、請求項１または
２に記載の精製された核酸を増幅して得られるもの。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9300978A FR2701028B1 (fr) | 1993-01-29 | 1993-01-29 | Séquences oligonucléotidiques hybridant spécifiquement avec une séquence génonique de campylobacter jejuni. Applications comme sondes et amorces oligonucléotidiques. |
| FR93/00978 | 1993-01-29 | ||
| PCT/FR1994/000122 WO1994017205A1 (fr) | 1993-01-29 | 1994-01-31 | SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES HYBRIDANT SPECIFIQUEMENT AVEC UNE SEQUENCE NUCLEIQUE GENOMIQUE DE $i(CAMPYLOBACTER JEJUNI) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07505535A JPH07505535A (ja) | 1995-06-22 |
| JP3476821B2 true JP3476821B2 (ja) | 2003-12-10 |
Family
ID=9443534
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51676794A Expired - Lifetime JP3476821B2 (ja) | 1993-01-29 | 1994-01-31 | カンピロバクタージュジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のゲノムの核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5691138A (ja) |
| EP (1) | EP0636187B1 (ja) |
| JP (1) | JP3476821B2 (ja) |
| AT (1) | ATE195974T1 (ja) |
| CA (1) | CA2132985C (ja) |
| DE (1) | DE69425708T2 (ja) |
| DK (1) | DK0636187T3 (ja) |
| ES (1) | ES2150981T3 (ja) |
| FR (1) | FR2701028B1 (ja) |
| WO (1) | WO1994017205A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020055101A1 (en) | 1995-09-11 | 2002-05-09 | Michel G. Bergeron | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US20100267012A1 (en) | 1997-11-04 | 2010-10-21 | Bergeron Michel G | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US20030049636A1 (en) | 1999-05-03 | 2003-03-13 | Bergeron Michel G. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| WO1998045473A2 (en) * | 1997-04-08 | 1998-10-15 | Shahnaz Tahihra Al Rashid | Dna probes for campylobacter, arcobacter and helicobacter |
| US6689604B1 (en) * | 1998-03-20 | 2004-02-10 | National Research Council Of Canada | Lipopolysaccharide α-2,3 sialyltransferase of Campylobacter jejuni and its uses |
| EP1246935B1 (en) | 1999-09-28 | 2013-08-14 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| JP2005511014A (ja) * | 2001-08-08 | 2005-04-28 | クアリコン・インコーポレーテツド | カンピロバクターの迅速かつ特異的な検出 |
| CA2474136A1 (en) * | 2002-01-23 | 2003-07-31 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Health | One-step multiplex pcr for the identification and differentiation of campylobacter species |
| CN1914322B (zh) | 2003-12-05 | 2012-05-30 | 扶桑药品工业株式会社 | 细胞致死肿胀毒素及以其为目标的弯曲杆菌属细菌的检测 |
| AU2008292946B2 (en) | 2007-08-24 | 2014-06-05 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
| WO2009028662A1 (ja) | 2007-08-31 | 2009-03-05 | Osaka Prefecture University | 細胞膨張化致死毒を標的としたカンピロバクター属細菌の検出 |
| US9175353B2 (en) | 2008-11-14 | 2015-11-03 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and methods for detection of campylobacter nucleic acid |
| CN112899379B (zh) * | 2020-12-30 | 2022-05-20 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 含有特异性分子靶标的空肠弯曲菌标准菌株及其检测和应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4785086A (en) * | 1985-01-17 | 1988-11-15 | Integrated Genetics, Inc. | Test for Campylobacter |
| JPH03112498A (ja) * | 1989-09-27 | 1991-05-14 | Shimadzu Corp | カンピロバクター検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出方法 |
-
1993
- 1993-01-29 FR FR9300978A patent/FR2701028B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-01-31 AT AT94905767T patent/ATE195974T1/de active
- 1994-01-31 US US08/307,591 patent/US5691138A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-31 WO PCT/FR1994/000122 patent/WO1994017205A1/fr active IP Right Grant
- 1994-01-31 EP EP94905767A patent/EP0636187B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-31 DK DK94905767T patent/DK0636187T3/da active
- 1994-01-31 ES ES94905767T patent/ES2150981T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-31 CA CA002132985A patent/CA2132985C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-31 DE DE69425708T patent/DE69425708T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-31 JP JP51676794A patent/JP3476821B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９２年，３０（１０），２６１３−２６１９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07505535A (ja) | 1995-06-22 |
| EP0636187B1 (fr) | 2000-08-30 |
| EP0636187A1 (fr) | 1995-02-01 |
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