JPH0568597A - ミデイバリアントｄｎａ鋳型の増幅 - Google Patents
ミデイバリアントｄｎａ鋳型の増幅Info
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- JPH0568597A JPH0568597A JP3209029A JP20902991A JPH0568597A JP H0568597 A JPH0568597 A JP H0568597A JP 3209029 A JP3209029 A JP 3209029A JP 20902991 A JP20902991 A JP 20902991A JP H0568597 A JPH0568597 A JP H0568597A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6867—Replicase-based amplification, e.g. using Q-beta replicase
Abstract
(57)【要約】
【目的】 試料中のターゲット核酸配列の存在を検出で
きる様にするための、挿入されたターゲット特異性核酸
配列を含むミディバリアントＤＮＡの増幅方法を提供す
る。 【構成】 それぞれがミディバリアントＤＮＡの異なっ
た複製できない部分およびその試料中のターゲット核酸
配列に対して相補的な異なったターゲット特異性核酸配
列を含む、少なくとも２つのミディバリアントＤＮＡ／
プローブ配合体をターゲット核酸配列に対してハイブリ
ダイゼーションし、それらの配合体を結合させて複製可
能なＤＮＡ鋳型を形成し、この鋳型を複製する。
きる様にするための、挿入されたターゲット特異性核酸
配列を含むミディバリアントＤＮＡの増幅方法を提供す
る。 【構成】 それぞれがミディバリアントＤＮＡの異なっ
た複製できない部分およびその試料中のターゲット核酸
配列に対して相補的な異なったターゲット特異性核酸配
列を含む、少なくとも２つのミディバリアントＤＮＡ／
プローブ配合体をターゲット核酸配列に対してハイブリ
ダイゼーションし、それらの配合体を結合させて複製可
能なＤＮＡ鋳型を形成し、この鋳型を複製する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般的には増幅方法に
関し、より詳しくは、ミディバリアントＤＮＡ／プロー
ブ配合体(conjugate) を含む増幅に関する。
関し、より詳しくは、ミディバリアントＤＮＡ／プロー
ブ配合体(conjugate) を含む増幅に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸を利用した試験評価分析は、特異性
および感度の点で従来の免疫評価分析法よりも明らかに
優れている。核酸を利用した試験評価分析の本質的な特
徴は、ターゲット特異性核酸配列（プローブ）の、試料
中のそれらの相補的なターゲット核酸配列に対するハイ
ブリダイゼーションである。プローブの特異性は、そ
の、ターゲットと非ターゲット核酸配列とを区別する能
力に関連する。プローブ特異性は、絶対的（すなわち、
プローブがターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列
とを区別することができる）である場合もあれば、機能
的（すなわち、プローブがターゲット核酸配列と、その
試料中に通常存在する他のすべての核酸配列とを区別す
ることができる）である場合もある。試験評価分析にお
ける試料のターゲット核酸配列とは、試料中の存在を確
認すべき遺伝要素に相当するヌクレオチド塩基配列を有
する単ストランドポリヌクレオチドの分節を意味する。
試料とは一つ以上のターゲット核酸を含み、精製した、
または精製していない形の試料を指す。試料の供給源
は、生理学的および非生理学的ＤＮＡまたはＲＮＡ（合
成または天然）、等を含むが、これらに限定するもので
はない。
および感度の点で従来の免疫評価分析法よりも明らかに
優れている。核酸を利用した試験評価分析の本質的な特
徴は、ターゲット特異性核酸配列（プローブ）の、試料
中のそれらの相補的なターゲット核酸配列に対するハイ
ブリダイゼーションである。プローブの特異性は、そ
の、ターゲットと非ターゲット核酸配列とを区別する能
力に関連する。プローブ特異性は、絶対的（すなわち、
プローブがターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列
とを区別することができる）である場合もあれば、機能
的（すなわち、プローブがターゲット核酸配列と、その
試料中に通常存在する他のすべての核酸配列とを区別す
ることができる）である場合もある。試験評価分析にお
ける試料のターゲット核酸配列とは、試料中の存在を確
認すべき遺伝要素に相当するヌクレオチド塩基配列を有
する単ストランドポリヌクレオチドの分節を意味する。
試料とは一つ以上のターゲット核酸を含み、精製した、
または精製していない形の試料を指す。試料の供給源
は、生理学的および非生理学的ＤＮＡまたはＲＮＡ（合
成または天然）、等を含むが、これらに限定するもので
はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】２つの個別の、ただし
関連した生物の全抗原決定因子は免疫評価分析では区別
できないのに対し、ユニーク遺伝子配列は核酸試験評価
分析により識別され、区別されることが記載されている
（米国特許第4,851,336 号参照）。また、ウイルス性タ
ーゲット、すなわちＨＩＶ感染の場合は、ウイルス性配
列が宿主遺伝子に挿入されていてもウイルス性抗原に対
する抗体は検出されないことがあるが、必要な感度を有
する検出（増幅）方法論が考案されれば、その挿入によ
り有力な診断上のマーカーが得られる。本発明は、必要
な感度を有する増幅方法論を提供する。
関連した生物の全抗原決定因子は免疫評価分析では区別
できないのに対し、ユニーク遺伝子配列は核酸試験評価
分析により識別され、区別されることが記載されている
（米国特許第4,851,336 号参照）。また、ウイルス性タ
ーゲット、すなわちＨＩＶ感染の場合は、ウイルス性配
列が宿主遺伝子に挿入されていてもウイルス性抗原に対
する抗体は検出されないことがあるが、必要な感度を有
する検出（増幅）方法論が考案されれば、その挿入によ
り有力な診断上のマーカーが得られる。本発明は、必要
な感度を有する増幅方法論を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】さて、核酸を利用した試
験評価分析の感度に関する十分な能力は、試料中にター
ゲット核酸配列が存在することを示唆する検出可能な分
子を増幅するための方法によってのみ達成されることが
分かった。
験評価分析の感度に関する十分な能力は、試料中にター
ゲット核酸配列が存在することを示唆する検出可能な分
子を増幅するための方法によってのみ達成されることが
分かった。
【０００５】ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) は、ターゲッ
ト配列を先ず増幅し、次いで遊離する型の増幅方法であ
る。PCR 増幅はこの過程の早期に起こるので、ターゲッ
ト以外の配列も増幅することがある。実際のターゲット
を識別するには、増幅した配列の分析が必要である（米
国特許第4,683,195 号および4,683,202 号参照）。
ト配列を先ず増幅し、次いで遊離する型の増幅方法であ
る。PCR 増幅はこの過程の早期に起こるので、ターゲッ
ト以外の配列も増幅することがある。実際のターゲット
を識別するには、増幅した配列の分析が必要である（米
国特許第4,683,195 号および4,683,202 号参照）。
【０００６】米国特許第4,786,660 および4,957,858号
はＱＢレプリカーゼによる組換えＲＮＡの自触媒複製を
記載しているが、これはターゲット配列を先ず遊離し、
次いで増幅する、別の型の増幅方法である。ＱＢ増幅の
この方法の欠点は、ターゲット核酸配列にハイブリダイ
ゼーションしていないプローブを分解に対して傷付き易
く、すなわち複製不可能にしておく必要があることであ
る（「Ｑ−ベータレプリカーゼによる増幅プローブ評価
分析」バイオ／テクノロジー1989:7(6)、609-10(Eng.)
および「Ｑ−ベータ増幅」J . Clin. Lab. Anal.4:318(1
990)（レター）参照）。
はＱＢレプリカーゼによる組換えＲＮＡの自触媒複製を
記載しているが、これはターゲット配列を先ず遊離し、
次いで増幅する、別の型の増幅方法である。ＱＢ増幅の
この方法の欠点は、ターゲット核酸配列にハイブリダイ
ゼーションしていないプローブを分解に対して傷付き易
く、すなわち複製不可能にしておく必要があることであ
る（「Ｑ−ベータレプリカーゼによる増幅プローブ評価
分析」バイオ／テクノロジー1989:7(6)、609-10(Eng.)
および「Ｑ−ベータ増幅」J . Clin. Lab. Anal.4:318(1
990)（レター）参照）。
【０００７】最初の工程として２つの異なった複製でき
ないミディバリアントＤＮＡ／プローブ配合体(conjuga
tes)を試料中のターゲット核酸配列にハイブリダイゼー
ションする増幅方法を開示する。試料は、必要であれ
ば、予め処理してターゲット核酸配列を解放しておく。
これらの配合体はそれぞれ少なくとも２つの部分を含む
が、一方の部分は、ハイブリダイゼーション条件下で、
ターゲット核酸配列と相補的なターゲット特異性の核酸
配列（プローブ）からなり、もう一方の部分は、ミディ
バリアントＤＮＡの複製できない部分である。一つの配
合体は、ミディバリアントＤＮＡの一つのストランドの
5'末端の部分を含み、もう一つの配合体はミディバリア
ントＤＮＡの、その3'末端までの残りの複製できない部
分を含む。配合体のプローブは、ターゲット分子に対す
るハイブリダイゼーションにより、２つのプローブが互
いに近接して同列に並ぶ様に選択する。次の工程では、
プローブをＴ４ＤＮＡリガーゼにより共有的に結合し、
複製のための基材を発生させる。酵素ＱＢレプリカーゼ
はミディバリアントＤＮＡを鋳型として使用し、ターゲ
ット特異性配列を挿入したＲＮＡミディバリアント配列
のコピーを作製する。この複製の生成物が検出されれ
ば、試料中にターゲット分子の存在を示すことになる。
ないミディバリアントＤＮＡ／プローブ配合体(conjuga
tes)を試料中のターゲット核酸配列にハイブリダイゼー
ションする増幅方法を開示する。試料は、必要であれ
ば、予め処理してターゲット核酸配列を解放しておく。
これらの配合体はそれぞれ少なくとも２つの部分を含む
が、一方の部分は、ハイブリダイゼーション条件下で、
ターゲット核酸配列と相補的なターゲット特異性の核酸
配列（プローブ）からなり、もう一方の部分は、ミディ
バリアントＤＮＡの複製できない部分である。一つの配
合体は、ミディバリアントＤＮＡの一つのストランドの
5'末端の部分を含み、もう一つの配合体はミディバリア
ントＤＮＡの、その3'末端までの残りの複製できない部
分を含む。配合体のプローブは、ターゲット分子に対す
るハイブリダイゼーションにより、２つのプローブが互
いに近接して同列に並ぶ様に選択する。次の工程では、
プローブをＴ４ＤＮＡリガーゼにより共有的に結合し、
複製のための基材を発生させる。酵素ＱＢレプリカーゼ
はミディバリアントＤＮＡを鋳型として使用し、ターゲ
ット特異性配列を挿入したＲＮＡミディバリアント配列
のコピーを作製する。この複製の生成物が検出されれ
ば、試料中にターゲット分子の存在を示すことになる。
【０００８】変形した増幅方法では、一つの配合体の複
製できないミディバリアントＤＮＡの部分の一つが付加
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。ＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーターは二重ストランド分子として作用す
る。ハイブリダイゼーションおよびリゲーションに続い
て、ＤＮＡ鋳型はＲＮＡに転写される。次いで、このＲ
ＮＡ転写をＱＢレプリカーゼにより複製し、その複製生
成物を検出する。
製できないミディバリアントＤＮＡの部分の一つが付加
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。ＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーターは二重ストランド分子として作用す
る。ハイブリダイゼーションおよびリゲーションに続い
て、ＤＮＡ鋳型はＲＮＡに転写される。次いで、このＲ
ＮＡ転写をＱＢレプリカーゼにより複製し、その複製生
成物を検出する。
【０００９】本発明の増幅方法で使用するための、配合
体および配合体の対を説明する。
体および配合体の対を説明する。
【００１０】ここで説明するミディバリアントＤＮＡ／
プローブ配合体および他の成分は、増幅法を実行するた
めのテストキットに収められる様になっている。
プローブ配合体および他の成分は、増幅法を実行するた
めのテストキットに収められる様になっている。
【００１１】本発明の主目的は、ミディバリアントＤＮ
Ａを含む増幅方法を提供することである。
Ａを含む増幅方法を提供することである。
【００１２】本発明の別の目的は、ミディバリアントＤ
ＮＡの複製できない部分およびターゲット特異性核酸配
列を含む配合体を提供することである。
ＮＡの複製できない部分およびターゲット特異性核酸配
列を含む配合体を提供することである。
【００１３】本発明のもう一つの目的は、それぞれがミ
ディバリアントＤＮＡの異なった複製できない部分およ
び異なったターゲット特異性核酸配列を含む２つの異な
った配合体を提供することであるが、両ターゲット特異
性核酸配列を試料中のターゲット核酸配列にハイブリダ
イゼーションすることにより、プローブが結合され、次
いでミディバリアントＤＮＡの部分が複製のための鋳型
として作用し、その複製生成物を検出する。
ディバリアントＤＮＡの異なった複製できない部分およ
び異なったターゲット特異性核酸配列を含む２つの異な
った配合体を提供することであるが、両ターゲット特異
性核酸配列を試料中のターゲット核酸配列にハイブリダ
イゼーションすることにより、プローブが結合され、次
いでミディバリアントＤＮＡの部分が複製のための鋳型
として作用し、その複製生成物を検出する。
【００１４】本発明の他の目的は、試料中の200 未満の
ターゲット分子を検出できる、ハイブリダイゼーショ
ン、リゲーションおよび複製工程を含む増幅方法を提供
することである。
ターゲット分子を検出できる、ハイブリダイゼーショ
ン、リゲーションおよび複製工程を含む増幅方法を提供
することである。
【００１５】本発明のさらに別の目的は、試料中の１個
のターゲット分子を検出できる、ハイブリダイゼーショ
ン、リゲーション、転写および複製工程を含む変形増幅
方法を提供することである。
のターゲット分子を検出できる、ハイブリダイゼーショ
ン、リゲーション、転写および複製工程を含む変形増幅
方法を提供することである。
【００１６】本発明のもう一つの目的は、試料中のター
ゲット核酸配列の存在を示す複製生成物を検出するため
に、増幅方法を実行するためのテストキットを提供する
ことである。
ゲット核酸配列の存在を示す複製生成物を検出するため
に、増幅方法を実行するためのテストキットを提供する
ことである。
【００１７】本発明の別の目的は、免疫評価分析と比較
して、感度が著しく優れた増幅方法を提供することであ
る。
して、感度が著しく優れた増幅方法を提供することであ
る。
【００１８】本発明の上記の、および他の目的および利
点を、以下に添付の図面を参照しながら詳細に説明す
る。
点を、以下に添付の図面を参照しながら詳細に説明す
る。
【００１９】下記の実施例において、本増幅方法の複製
工程の生成物は放射性同位元素技術により検出する。し
かし、好ましい実施形態では、増幅の複製工程の生成物
は化学発光法により検出する（米国特許第4,745,181 号
参照）。プローブ技術の場合にこの方法論を代表する免
疫評価分析形態は、試料中に存在すると思われる問題の
ターゲット分子に向けられる相補的「試薬」配列を常磁
性粒子(PMP) （チバコーニング ディアグノスティック
ス コーポレーション）、固相、の上に固定し、ターゲ
ット分子に対する第二の相補的「試薬」配列に、アクリ
ジニウムエステル（チバ コーニング ディアグノステ
ィックス コーポレーション）で標識を付ける。これら
の試薬を試料で処理すると、ターゲット分子とサンドイ
ッチ複合体を形成する。磁界をかけてPMP を溶液から分
離するが、これによって、結合していない、アクリジニ
ウムエステル標識を付けた相補的試薬配列が、PMP 上の
分析物に特異的に結合した試薬配列から分離される。こ
の分離工程の後、PMP に結合したままの、標識を付けた
相補的試薬配列の化学発光反応により、ターゲット配列
を検出する。本発明では、この化学発光法、複製生成物
の検出に応用できる。この増幅方法は免疫評価分析にも
応用できる。
工程の生成物は放射性同位元素技術により検出する。し
かし、好ましい実施形態では、増幅の複製工程の生成物
は化学発光法により検出する（米国特許第4,745,181 号
参照）。プローブ技術の場合にこの方法論を代表する免
疫評価分析形態は、試料中に存在すると思われる問題の
ターゲット分子に向けられる相補的「試薬」配列を常磁
性粒子(PMP) （チバコーニング ディアグノスティック
ス コーポレーション）、固相、の上に固定し、ターゲ
ット分子に対する第二の相補的「試薬」配列に、アクリ
ジニウムエステル（チバ コーニング ディアグノステ
ィックス コーポレーション）で標識を付ける。これら
の試薬を試料で処理すると、ターゲット分子とサンドイ
ッチ複合体を形成する。磁界をかけてPMP を溶液から分
離するが、これによって、結合していない、アクリジニ
ウムエステル標識を付けた相補的試薬配列が、PMP 上の
分析物に特異的に結合した試薬配列から分離される。こ
の分離工程の後、PMP に結合したままの、標識を付けた
相補的試薬配列の化学発光反応により、ターゲット配列
を検出する。本発明では、この化学発光法、複製生成物
の検出に応用できる。この増幅方法は免疫評価分析にも
応用できる。
【００２０】別の検出方法では、「全内部反射」により
放射を伝達する光学装置を使用し、その装置と、屈折率
の低い試験媒体との間の界面で凋落波を発生させる。ハ
リック、N.J.、「内部反射分光法」、ハリック サイエ
ンティフィック コーポレーション、オシニングN.Y.
（第三版）(1987)および米国特許第4,880,752 号参照。
凋落波は、一般に波長未満で試験媒体中に達する電磁波
形である。しかし、凋落波成分と試験媒体中のターゲッ
トとの間に相互作用を起こすには、この浸透で十分であ
る。あるいは、ターゲットをセンサーに付けることもで
きる。この方法を本発明に応用すれば、凋落波センサー
に反応物質を被覆し、そこから生成物を凋落区域で感知
することにより、増幅方法の複製生成物の分析を行うこ
とができる。反応物被覆とは、被覆手段により、試験媒
体中の相補的分子に対して受容的な分子を付加し、結合
対を作ることと定義されるが、その被覆過程は非共有結
合または共有結合を含む。
放射を伝達する光学装置を使用し、その装置と、屈折率
の低い試験媒体との間の界面で凋落波を発生させる。ハ
リック、N.J.、「内部反射分光法」、ハリック サイエ
ンティフィック コーポレーション、オシニングN.Y.
（第三版）(1987)および米国特許第4,880,752 号参照。
凋落波は、一般に波長未満で試験媒体中に達する電磁波
形である。しかし、凋落波成分と試験媒体中のターゲッ
トとの間に相互作用を起こすには、この浸透で十分であ
る。あるいは、ターゲットをセンサーに付けることもで
きる。この方法を本発明に応用すれば、凋落波センサー
に反応物質を被覆し、そこから生成物を凋落区域で感知
することにより、増幅方法の複製生成物の分析を行うこ
とができる。反応物被覆とは、被覆手段により、試験媒
体中の相補的分子に対して受容的な分子を付加し、結合
対を作ることと定義されるが、その被覆過程は非共有結
合または共有結合を含む。
【００２１】各種試料中の特定病原体に対して特異性が
あり、それらの病原体を示す核酸配列が報告されてい
る。試料中のターゲット核酸配列の供給源には、細胞、
ウイルスおよび類ウイルス体があるが、これらに限定す
るものではない。定量培養方法により、107 〜109 もの
大量の感染性微生物が含まれることが示されている試料
もあるが、サルモネ ラ試料の中には、グラムあたり1000
個の微生物しか存在しないことが示されているものもあ
る。
あり、それらの病原体を示す核酸配列が報告されてい
る。試料中のターゲット核酸配列の供給源には、細胞、
ウイルスおよび類ウイルス体があるが、これらに限定す
るものではない。定量培養方法により、107 〜109 もの
大量の感染性微生物が含まれることが示されている試料
もあるが、サルモネ ラ試料の中には、グラムあたり1000
個の微生物しか存在しないことが示されているものもあ
る。
【００２２】化学発光による検出方法の現在の感度限界
は約100 amol(6000 万分子）である。この水準の感度
は、化学発光標識を付けたＤＮＡオリゴマーをカンピロ
バクター16S リボソームＲＮＡに対してハイブリダイゼ
ーションした評価分析について観察されている。例え
ば、感染性病原体に対する、これらの評価分析の必要な
感度は1000分子程度なので、化学発光検出法で検出する
には、ターゲット分子は少なくとも104 〜105 増幅する
必要がある。
は約100 amol(6000 万分子）である。この水準の感度
は、化学発光標識を付けたＤＮＡオリゴマーをカンピロ
バクター16S リボソームＲＮＡに対してハイブリダイゼ
ーションした評価分析について観察されている。例え
ば、感染性病原体に対する、これらの評価分析の必要な
感度は1000分子程度なので、化学発光検出法で検出する
には、ターゲット分子は少なくとも104 〜105 増幅する
必要がある。
【００２３】これらの試験評価分析に必要な感度を得る
ための手段には、酵素ＱＢレプリカーゼの使用を含む増
幅方法がある（「組換えＲＮＡの自触媒複製」J. Mol.
Bio.171:281-95(1983)参照）。ＱＢウイルスはＲＮＡフ
ァージであり、そのゲノムは約4400リボヌクレオチドの
ストランドからなる。ブルーメンタール、(1982)「ザエ
ンザイム」（第XV巻、Ｂ章）(P.D. ボイヤー、編集）26
7 ページ、アカデミックプレス、ニューヨーク参照。Ｑ
Ｂレプリカーゼの役目は、このＲＮＡ鋳型からＲＮＡの
相補的ストランドを合成する過程に触媒作用することで
ある。この酵素は４つの小単位からなり、その中の一つ
だけがウイルス性ゲノムにより実際にコード化され、他
の小単位はバクテリア性宿主に由来する。ＱＢレプリカ
ーゼは、複製のための相補的ストランド合成に鋳型とし
てＱＢＲＮＡだけを使用する狭い特異性を示すが（他の
ウイルス性ＲＮＡは複製されない）、より短い、天然の
ＱＢＲＮＡの突然変異体も複製のための鋳型として作用
することができる。これらのより短い鋳型には、長さが
90リボヌクレオチドである「ナノバリアント」ＲＮＡお
よび長さが220 ヌクレオチドである「ミディバリアン
ト」ＲＮＡがある。
ための手段には、酵素ＱＢレプリカーゼの使用を含む増
幅方法がある（「組換えＲＮＡの自触媒複製」J. Mol.
Bio.171:281-95(1983)参照）。ＱＢウイルスはＲＮＡフ
ァージであり、そのゲノムは約4400リボヌクレオチドの
ストランドからなる。ブルーメンタール、(1982)「ザエ
ンザイム」（第XV巻、Ｂ章）(P.D. ボイヤー、編集）26
7 ページ、アカデミックプレス、ニューヨーク参照。Ｑ
Ｂレプリカーゼの役目は、このＲＮＡ鋳型からＲＮＡの
相補的ストランドを合成する過程に触媒作用することで
ある。この酵素は４つの小単位からなり、その中の一つ
だけがウイルス性ゲノムにより実際にコード化され、他
の小単位はバクテリア性宿主に由来する。ＱＢレプリカ
ーゼは、複製のための相補的ストランド合成に鋳型とし
てＱＢＲＮＡだけを使用する狭い特異性を示すが（他の
ウイルス性ＲＮＡは複製されない）、より短い、天然の
ＱＢＲＮＡの突然変異体も複製のための鋳型として作用
することができる。これらのより短い鋳型には、長さが
90リボヌクレオチドである「ナノバリアント」ＲＮＡお
よび長さが220 ヌクレオチドである「ミディバリアン
ト」ＲＮＡがある。
【００２４】図１に関して、ＱＢレプリカーゼの作用は
次の様に説明される。すなわち、予想される二次構造の
ステムおよびループモデルにより記号化したミディバリ
アント(MDV) ＲＮＡの単コピーから出発し、ストランド
は相補的なマイナスストランドの合成に鋳型として使用
される。Ｎ回の複製後、それぞれの初期鋳型ストランド
に対して２N ストランドが造られる。この酵素が、生産
されたＲＮＡストランド全体に渡ってモル量で過剰に存
在する限り、生成物ＲＮＡが指数的に生産される。
次の様に説明される。すなわち、予想される二次構造の
ステムおよびループモデルにより記号化したミディバリ
アント(MDV) ＲＮＡの単コピーから出発し、ストランド
は相補的なマイナスストランドの合成に鋳型として使用
される。Ｎ回の複製後、それぞれの初期鋳型ストランド
に対して２N ストランドが造られる。この酵素が、生産
されたＲＮＡストランド全体に渡ってモル量で過剰に存
在する限り、生成物ＲＮＡが指数的に生産される。
【００２５】本発明の好ましい増幅方法では、ミディバ
リアント(+) ＤＮＡ鋳型は、例えばプラスストランドの
5'末端から塩基61で、２つの複製できない部分に分けら
れる。このミディバリアントＤＮＡの２つの部分のそれ
ぞれに、ターゲット核酸配列と相補的な、異なった特異
性核酸配列が付加する。ミディバリアント(-) ＤＮＡの
類似の相補的配列も同様に使用できる。これら２つの配
合体をそれぞれプローブＡおよびプローブＢとする（図
２参照）。プローブＡはPMP 上に固定してある。しか
し、配合体を固体支持体上に固定することは、本発明の
必要条件でも制限でもない。この試料を溶解してターゲ
ット核酸配列を放出する。放出されたターゲット核酸配
列はハイブリダイゼーション条件下で、プローブＡおよ
びプローブＢとハイブリダイゼーションする。ターゲッ
ト特異性配列は、そのターゲットにハイブリダイゼーシ
ョンすることにより、２つのターゲット特異性配列が互
いに隣接して並ぶ様に選択する。ハイブリダイゼーショ
ン後、PMP は試料成分およびハイブリダイゼーションし
ていないプローブＢおよびターゲットに結合していない
核酸配列から分離する。
リアント(+) ＤＮＡ鋳型は、例えばプラスストランドの
5'末端から塩基61で、２つの複製できない部分に分けら
れる。このミディバリアントＤＮＡの２つの部分のそれ
ぞれに、ターゲット核酸配列と相補的な、異なった特異
性核酸配列が付加する。ミディバリアント(-) ＤＮＡの
類似の相補的配列も同様に使用できる。これら２つの配
合体をそれぞれプローブＡおよびプローブＢとする（図
２参照）。プローブＡはPMP 上に固定してある。しか
し、配合体を固体支持体上に固定することは、本発明の
必要条件でも制限でもない。この試料を溶解してターゲ
ット核酸配列を放出する。放出されたターゲット核酸配
列はハイブリダイゼーション条件下で、プローブＡおよ
びプローブＢとハイブリダイゼーションする。ターゲッ
ト特異性配列は、そのターゲットにハイブリダイゼーシ
ョンすることにより、２つのターゲット特異性配列が互
いに隣接して並ぶ様に選択する。ハイブリダイゼーショ
ン後、PMP は試料成分およびハイブリダイゼーションし
ていないプローブＢおよびターゲットに結合していない
核酸配列から分離する。
【００２６】次いで、ターゲット配列にハイブリダイゼ
ーションしたプローブＡおよびプローブＢは、２つのプ
ローブ間のホスホジエステル結合の形成に触媒作用する
ＤＮＡリガーゼの作用により共有的に結合される（図２
Ｂ参照）。配合体は、リゲーション工程の前または後に
固相から解放することができる。このリゲーション工程
に続いて、試料中のターゲット分子の存在に応じた様式
で、ミディバリアント(+) ＤＮＡ鋳型が生じている。こ
のミディバリアント(+) ＤＮＡ配列には、プローブＡお
よびプローブＢから組み合わせたターゲット特異性配列
が挿入される。これで、ターゲット特異性配列を挿入し
たミディバリアント鋳型をＱＢレプリカーゼで複製する
ことができる。複製生成物は検出可能であり、それによ
って、試料中のターゲットの存在が示される。このリゲ
ーション−複製方法では、プローブＡもプローブＢも単
独では複製可能な鋳型として作用しないのが望ましい。
さらに、選択した位置でミディバリアント鋳型へターゲ
ット特異性配列を挿入することにより、ＱＢレプリカー
ゼがそれを認識するのに必要なこれらの特徴が過度に掻
き乱されてはならない（図２Ｃ参照）。
ーションしたプローブＡおよびプローブＢは、２つのプ
ローブ間のホスホジエステル結合の形成に触媒作用する
ＤＮＡリガーゼの作用により共有的に結合される（図２
Ｂ参照）。配合体は、リゲーション工程の前または後に
固相から解放することができる。このリゲーション工程
に続いて、試料中のターゲット分子の存在に応じた様式
で、ミディバリアント(+) ＤＮＡ鋳型が生じている。こ
のミディバリアント(+) ＤＮＡ配列には、プローブＡお
よびプローブＢから組み合わせたターゲット特異性配列
が挿入される。これで、ターゲット特異性配列を挿入し
たミディバリアント鋳型をＱＢレプリカーゼで複製する
ことができる。複製生成物は検出可能であり、それによ
って、試料中のターゲットの存在が示される。このリゲ
ーション−複製方法では、プローブＡもプローブＢも単
独では複製可能な鋳型として作用しないのが望ましい。
さらに、選択した位置でミディバリアント鋳型へターゲ
ット特異性配列を挿入することにより、ＱＢレプリカー
ゼがそれを認識するのに必要なこれらの特徴が過度に掻
き乱されてはならない（図２Ｃ参照）。
【００２７】この増幅方法の変形では、リゲーションし
たミディバリアントＤＮＡをＲＮＡに転写してから、Ｑ
Ｂレプリカーゼで複製する。転写工程の前に、ポリメラ
ーゼプロモーターをミディバリアントＤＮＡの複製でき
ない部分に付加する。このリゲーション−転写−複製方
法により、単鋳型の検出が可能である（図３参照）。す
べて標準的な方法により、ミディバリアント配列を含む
プラスミド(pMDV)（プロメガ、マディソン、WI) を使用
して微生物細胞(JM107) を形質転換し、その形質転換し
た細胞を培養基中で成長させ、培養した細胞を収穫して
溶解し、プラスミドを精製した（実施例１参照）。pMDV
の試料を制限酵素Pst I 、Sma I 、Xho I 、またはこれ
らの酵素の組合わせで消化し、図４の制限地図に示す様
にpMDVの分節を得た。pMDVは、プラスストランドの位置
61で10塩基対Xho I リンカーを含んでいた。
たミディバリアントＤＮＡをＲＮＡに転写してから、Ｑ
Ｂレプリカーゼで複製する。転写工程の前に、ポリメラ
ーゼプロモーターをミディバリアントＤＮＡの複製でき
ない部分に付加する。このリゲーション−転写−複製方
法により、単鋳型の検出が可能である（図３参照）。す
べて標準的な方法により、ミディバリアント配列を含む
プラスミド(pMDV)（プロメガ、マディソン、WI) を使用
して微生物細胞(JM107) を形質転換し、その形質転換し
た細胞を培養基中で成長させ、培養した細胞を収穫して
溶解し、プラスミドを精製した（実施例１参照）。pMDV
の試料を制限酵素Pst I 、Sma I 、Xho I 、またはこれ
らの酵素の組合わせで消化し、図４の制限地図に示す様
にpMDVの分節を得た。pMDVは、プラスストランドの位置
61で10塩基対Xho I リンカーを含んでいた。
【００２８】他の型のミディバリアント配列を調製し、
それらの複製鋳型として作用する能力を試験した。異な
ったターゲット特異性配列を挿入するには、Xho I 制限
部位の優位性を得た。挿入したターゲット特異性配列に
より組換え分子がＲＮＡ合成のための鋳型として作用で
きる限り、自然のミディバリアント配列中に行った挿入
を使用して、望ましいターゲット配列とハイブリダイゼ
ーションさせ、増幅方法にミディバリアントＤＮＡを使
用し易くすることができる。表ＩにXho I 制限部位で挿
入した配列の例を示す。
それらの複製鋳型として作用する能力を試験した。異な
ったターゲット特異性配列を挿入するには、Xho I 制限
部位の優位性を得た。挿入したターゲット特異性配列に
より組換え分子がＲＮＡ合成のための鋳型として作用で
きる限り、自然のミディバリアント配列中に行った挿入
を使用して、望ましいターゲット配列とハイブリダイゼ
ーションさせ、増幅方法にミディバリアントＤＮＡを使
用し易くすることができる。表ＩにXho I 制限部位で挿
入した配列の例を示す。
【００２９】すべての型のミディバリアントＤＮＡを塩
基処理し、可能なＲＮＡ汚染物を除去してから複製反応
を行った。無傷のプラスミドおよび制限酵素で消化した
プラスミドを、汚染ＲＮＡ鋳型を除去するために、1N N
aOH 中、80℃で15分間処理し、当量のHCl を加えて中和
してからレプリカーゼ反応に投入した。考えられるＤＮ
Ａ鋳型の各試料もDNase（プロメガ）で消化し、消化し
た鋳型を、ＱＢレプリカーゼ用の基材として作用する残
留能力について試験した。
基処理し、可能なＲＮＡ汚染物を除去してから複製反応
を行った。無傷のプラスミドおよび制限酵素で消化した
プラスミドを、汚染ＲＮＡ鋳型を除去するために、1N N
aOH 中、80℃で15分間処理し、当量のHCl を加えて中和
してからレプリカーゼ反応に投入した。考えられるＤＮ
Ａ鋳型の各試料もDNase（プロメガ）で消化し、消化し
た鋳型を、ＱＢレプリカーゼ用の基材として作用する残
留能力について試験した。
【００３０】次いで、ミディバリアントＤＮＡ試料をＱ
ＢレプリカーゼによるＲＮＡ合成のための鋳型として作
用する能力について試験した。レプリカーゼ反応には、
100mMのトリス-HCl、pH7.5 、15 mM のMgCl2 、各１mM
のATP 、GTP 、UTP 、およびCTP を使用した。合成され
たＲＮＡ生成物を検出するための標識としてアルファ32
P-CTP （ニューイングランドニュークリア）を使用し
た。QBレプリカーゼ濃度は20ug/ml で、反応は37℃で１
時間行った。複製反応は、反応のアリコートをGFF フィ
ルター（ホワットマン）上に置き、フィルターを氷冷し
た10% トリクロロ酢酸／1%ピロリン酸ナトリウムに浸漬
して、合成されたＲＮＡを沈殿させた。フィルターを氷
冷した5%トリクロロ酢酸で４回洗浄し、次いで液体シン
チレーションにより計数した。表IIに示すこれらの複製
実験の結果は、直線状でも閉じた円形でも、無傷のミデ
ィバリアントＤＮＡ配列の、ＱＢレプリカーゼによるＲ
ＮＡ合成のための鋳型として作用する能力を立証してい
る。さらに、ミディバリアントＤＮＡ鋳型から合成され
たＲＮＡ生成物はpMDVとハイブリダイゼーションする
が、ナノバリアントＤＮＡ配列を含むプラスミドとはハ
イブリダイゼーションしないことが観察された（データ
は示していない）。
ＢレプリカーゼによるＲＮＡ合成のための鋳型として作
用する能力について試験した。レプリカーゼ反応には、
100mMのトリス-HCl、pH7.5 、15 mM のMgCl2 、各１mM
のATP 、GTP 、UTP 、およびCTP を使用した。合成され
たＲＮＡ生成物を検出するための標識としてアルファ32
P-CTP （ニューイングランドニュークリア）を使用し
た。QBレプリカーゼ濃度は20ug/ml で、反応は37℃で１
時間行った。複製反応は、反応のアリコートをGFF フィ
ルター（ホワットマン）上に置き、フィルターを氷冷し
た10% トリクロロ酢酸／1%ピロリン酸ナトリウムに浸漬
して、合成されたＲＮＡを沈殿させた。フィルターを氷
冷した5%トリクロロ酢酸で４回洗浄し、次いで液体シン
チレーションにより計数した。表IIに示すこれらの複製
実験の結果は、直線状でも閉じた円形でも、無傷のミデ
ィバリアントＤＮＡ配列の、ＱＢレプリカーゼによるＲ
ＮＡ合成のための鋳型として作用する能力を立証してい
る。さらに、ミディバリアントＤＮＡ鋳型から合成され
たＲＮＡ生成物はpMDVとハイブリダイゼーションする
が、ナノバリアントＤＮＡ配列を含むプラスミドとはハ
イブリダイゼーションしないことが観察された（データ
は示していない）。
【００３１】挿入された配列を有するミディバリアント
鋳型の複製感度を試験するために、配列を、上記のミデ
ィバリアント配列を含むプラスミドのXho 部位にクロー
ニングした。これらのミディバリアントＤＮＡ鋳型の複
製反応感度を表III に示す。これらのデータは、ＲＮＡ
複製生成物中への32P-CTP の取り込みを測定して得た。
これらのデータは、リゲーション−複製図（図２参照）
の最終生成物がＱＢレプリカーゼのための鋳型であり、
僅か160 個までの鋳型分子(MDV-SA2) を検出できること
を示している。複製生成物はさらにノーザンブロット法
により定性し、挿入されたターゲット特異性配列は側方
に位置するミディバリアント配列に沿って複製されるこ
とが分かった（データは示していない）。
鋳型の複製感度を試験するために、配列を、上記のミデ
ィバリアント配列を含むプラスミドのXho 部位にクロー
ニングした。これらのミディバリアントＤＮＡ鋳型の複
製反応感度を表III に示す。これらのデータは、ＲＮＡ
複製生成物中への32P-CTP の取り込みを測定して得た。
これらのデータは、リゲーション−複製図（図２参照）
の最終生成物がＱＢレプリカーゼのための鋳型であり、
僅か160 個までの鋳型分子(MDV-SA2) を検出できること
を示している。複製生成物はさらにノーザンブロット法
により定性し、挿入されたターゲット特異性配列は側方
に位置するミディバリアント配列に沿って複製されるこ
とが分かった（データは示していない）。
【００３２】使用したＱＢレプリカーゼ酵素製剤がDNas
e 汚染を含んでいることが分かった。この汚染はＤＮＡ
鋳型を劣化させることにより複製感度を下げることがあ
る。汚染がある場合には、精製によるDNase 汚染物の除
去、またはDNase 防止剤の使用が必要になる場合があ
る。複製感度を高めるための別の方法は、ＱＢレプリカ
ーゼよりもＤＮＡ鋳型をより効率的に複製する酵素を得
ることである。ＱＢレプリカーゼ自体は、部位特異的変
異誘導により変性し、より有効な酵素を生じることが有
ろう。
e 汚染を含んでいることが分かった。この汚染はＤＮＡ
鋳型を劣化させることにより複製感度を下げることがあ
る。汚染がある場合には、精製によるDNase 汚染物の除
去、またはDNase 防止剤の使用が必要になる場合があ
る。複製感度を高めるための別の方法は、ＱＢレプリカ
ーゼよりもＤＮＡ鋳型をより効率的に複製する酵素を得
ることである。ＱＢレプリカーゼ自体は、部位特異的変
異誘導により変性し、より有効な酵素を生じることが有
ろう。
【００３３】ＱＢレプリカーゼと各種ミディバリアント
ＤＮＡ鋳型の反応生成物は、さらに変性ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により定性した。幾つかの32P 標識を
付けたミディバリアント複製生成物の電気泳動結果を図
５に示す。ミディバリアントＤＮＡ鋳型はＱＢレプリカ
ーゼで30℃で２時間処理した。各反応から得た試料は、
7M尿素を含む緩衝液中で70℃で５分間処理した。試料
は、トリスホウ酸塩EDTA緩衝液中に7M尿素を含む6%ポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。電気泳動の
後、これらのバンドをオートラジオグラフィーで目に見
える様にした。図５に関して、各レーン（左から右へ）
に付けた試料は、レーン１がサイズマーカーとして123
bpラダー(BRL) 、レーン２がゼロ鋳型比較、レーン３が
pMDV鋳型からの複製生成物、レーン４がMDV 鋳型からの
複製生成物、レーン５がMDV-CA 116鋳型からの複製生成
物、レーン６がMDV-CA 29 鋳型からの複製生成物、レー
ン７がMDV-ポリ鋳型からの複製生成物である。予想され
たサイズの全長複製生成物に加えて、各鋳型について、
全長生成物よりも速く移動した他の多くの生成物が観察
された。より速く移動したバンドは、ミディバリアント
プラスストランドおよびマイナスストランドの部分と相
補的なプローブとハイブリダイゼーションすることを示
している（データは示していない）。ミディバリアント
鋳型から複製した生成物は、さらにノーザンブロット法
により定性し、挿入された配列が側方に位置するミディ
バリアント配列と共に複製されたかどうかを確認した。
これらのブロットは、カンピロバクター配列の挿入物を
含む鋳型のためのカンピロバクター特異性プローブ、PM
238(プロメガ）、またはポリリンカー特異性プローブ、
PM905(プロメガ）により検査した（表Ｉ参照）。MDV-CA
29 およびMDV-CA 116からの複製生成物はPM238 とハイ
ブリダイゼーションしたのに対し、MDV-ポリからの複製
生成物はPM905とハイブリダイゼーションした（データ
は示していない）。これらの結果は、挿入された配列が
側方に位置するミディバリアント配列と共に複製するこ
とを立証している。
ＤＮＡ鋳型の反応生成物は、さらに変性ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により定性した。幾つかの32P 標識を
付けたミディバリアント複製生成物の電気泳動結果を図
５に示す。ミディバリアントＤＮＡ鋳型はＱＢレプリカ
ーゼで30℃で２時間処理した。各反応から得た試料は、
7M尿素を含む緩衝液中で70℃で５分間処理した。試料
は、トリスホウ酸塩EDTA緩衝液中に7M尿素を含む6%ポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。電気泳動の
後、これらのバンドをオートラジオグラフィーで目に見
える様にした。図５に関して、各レーン（左から右へ）
に付けた試料は、レーン１がサイズマーカーとして123
bpラダー(BRL) 、レーン２がゼロ鋳型比較、レーン３が
pMDV鋳型からの複製生成物、レーン４がMDV 鋳型からの
複製生成物、レーン５がMDV-CA 116鋳型からの複製生成
物、レーン６がMDV-CA 29 鋳型からの複製生成物、レー
ン７がMDV-ポリ鋳型からの複製生成物である。予想され
たサイズの全長複製生成物に加えて、各鋳型について、
全長生成物よりも速く移動した他の多くの生成物が観察
された。より速く移動したバンドは、ミディバリアント
プラスストランドおよびマイナスストランドの部分と相
補的なプローブとハイブリダイゼーションすることを示
している（データは示していない）。ミディバリアント
鋳型から複製した生成物は、さらにノーザンブロット法
により定性し、挿入された配列が側方に位置するミディ
バリアント配列と共に複製されたかどうかを確認した。
これらのブロットは、カンピロバクター配列の挿入物を
含む鋳型のためのカンピロバクター特異性プローブ、PM
238(プロメガ）、またはポリリンカー特異性プローブ、
PM905(プロメガ）により検査した（表Ｉ参照）。MDV-CA
29 およびMDV-CA 116からの複製生成物はPM238 とハイ
ブリダイゼーションしたのに対し、MDV-ポリからの複製
生成物はPM905とハイブリダイゼーションした（データ
は示していない）。これらの結果は、挿入された配列が
側方に位置するミディバリアント配列と共に複製するこ
とを立証している。
【００３４】
【実施例１】ミディバリアントＤＮＡ鋳 型の複製感度 ミディバリアント(pMDV)配列を含み、Xho I リンカーを
発生するために10塩基対挿入物を有するプラスミドをプ
ロメガ社、マディソン、WIから入手した。制限部位によ
り、望ましいターゲット特異性配列をMDV DNA のプラス
ストランドにおける塩基61に挿入できる。Xho I サイト
で各種の挿入物を含むMDV プラスミドからなるクローン
を調製した。MDV DNA 鋳型は精製プラスミドのPst I/Sm
a I 消化により調製し、調製用アガロースゲル電気泳動
法により精製した。鋳型の濃度はアガロースゲル電気泳
動により分析した精製鋳型の臭化エチジウムで着色した
バンドの蛍光強度により推定した。また、鋳型は、T7RN
Aポリメラーゼによりプラスストランド鋳型を転写でき
るT7プロモーター配列をも含んでいた。MDV DNA 鋳型は
1 N NaOHで80℃で15分間塩基処理し、次いで当量のHCl
で中和した。この処理によりＲＮＡ汚染物をすべて分解
し、鋳型を単ストランドＤＮＡに変性した。
発生するために10塩基対挿入物を有するプラスミドをプ
ロメガ社、マディソン、WIから入手した。制限部位によ
り、望ましいターゲット特異性配列をMDV DNA のプラス
ストランドにおける塩基61に挿入できる。Xho I サイト
で各種の挿入物を含むMDV プラスミドからなるクローン
を調製した。MDV DNA 鋳型は精製プラスミドのPst I/Sm
a I 消化により調製し、調製用アガロースゲル電気泳動
法により精製した。鋳型の濃度はアガロースゲル電気泳
動により分析した精製鋳型の臭化エチジウムで着色した
バンドの蛍光強度により推定した。また、鋳型は、T7RN
Aポリメラーゼによりプラスストランド鋳型を転写でき
るT7プロモーター配列をも含んでいた。MDV DNA 鋳型は
1 N NaOHで80℃で15分間塩基処理し、次いで当量のHCl
で中和した。この処理によりＲＮＡ汚染物をすべて分解
し、鋳型を単ストランドＤＮＡに変性した。
【００３５】複製反応は、変性した単ストランド並びに
自然の二重ストランドの両方の、様々な量のMDV DNA 鋳
型を、100 mMのトリス-HCl、pH7.5 、15 mM のMgCl2 、
各１mMのATP 、GTP 、UTP 、およびCTP に加えた20 ug/
mlのＱＢレプリカーゼ（ロットM202、プロメガ）で処理
することにより行った。アルファ32P-CTP(アメルシャ
ム）800 Ci/mmol を加えて105 cpm/nmol CTPのオーダー
の特異的活性を与えた。反応は30℃で２時間行った。32
P-CTP は、氷冷10% トリクロロ酢酸／1%ピロリン酸ナト
リウムの存在下で、ガラス繊維フィルター（ホワットマ
ン）上に反応溶液のアリコートを沈殿させることにより
複製生成物へ組み込んだ。組み込まれなかったCTP は、
フィルターを氷冷5%トリクロロ酢酸で洗浄して除去し
た。組み込まれたCTP は、液体シンチレーション計数に
より測定した。陰性比較試料（鋳型を加えていない）も
実験に含めた。結果を表III に示す。これらの実験か
ら、複製感度（複製により検出された鋳型の数）は、変
性した、単ストランドＤＮＡ鋳型に対して500 以上、自
然の二重ストランドＤＮＡ鋳型に対しては200 未満であ
った。
自然の二重ストランドの両方の、様々な量のMDV DNA 鋳
型を、100 mMのトリス-HCl、pH7.5 、15 mM のMgCl2 、
各１mMのATP 、GTP 、UTP 、およびCTP に加えた20 ug/
mlのＱＢレプリカーゼ（ロットM202、プロメガ）で処理
することにより行った。アルファ32P-CTP(アメルシャ
ム）800 Ci/mmol を加えて105 cpm/nmol CTPのオーダー
の特異的活性を与えた。反応は30℃で２時間行った。32
P-CTP は、氷冷10% トリクロロ酢酸／1%ピロリン酸ナト
リウムの存在下で、ガラス繊維フィルター（ホワットマ
ン）上に反応溶液のアリコートを沈殿させることにより
複製生成物へ組み込んだ。組み込まれなかったCTP は、
フィルターを氷冷5%トリクロロ酢酸で洗浄して除去し
た。組み込まれたCTP は、液体シンチレーション計数に
より測定した。陰性比較試料（鋳型を加えていない）も
実験に含めた。結果を表III に示す。これらの実験か
ら、複製感度（複製により検出された鋳型の数）は、変
性した、単ストランドＤＮＡ鋳型に対して500 以上、自
然の二重ストランドＤＮＡ鋳型に対しては200 未満であ
った。
【００３６】
【実施例２】ミディバリアントプローブ の複製 実施例１のMDV DNA の各種分節を、それらの、ＱＢレプ
リカーゼで複製するための鋳型として作用する能力につ
いて試験した。アプライド バイオシステム391 PCR-Ma
teＤＮＡ合成装置を使用してオリゴマーを合成した。オ
リゴマーはRP-HPLC で精製した。下記のオリゴマーを合
成した。
リカーゼで複製するための鋳型として作用する能力につ
いて試験した。アプライド バイオシステム391 PCR-Ma
teＤＮＡ合成装置を使用してオリゴマーを合成した。オ
リゴマーはRP-HPLC で精製した。下記のオリゴマーを合
成した。
【００３７】MB2 ： プラスストランドMDV DNA の塩基
120-221 MB1SA1: MDV(+)DNA の塩基62-119の5'末端に付加したサ
ルモネラ特異性配列の24塩基 MASA5: MDV(+)DNA の塩基1-64の5'末端に付加した非特
異性配列の10塩基、3'末端に付加したサルモネラ配列の
24塩基 MBSA: MB2 およびMB1SA1を一つに結合したもの（下記
参照） MDSA1: MDV(-)DNA の塩基161-220 の5'末端に付加した
サルモネラ特異性配列の24塩基 MC2SA5: MDV(-)DNA の塩基85-160の3'末端に付加したサ
ルモネラ特異性配列の24塩基 合成により調製したMDV 鋳型の分節は、ＱＢレプリカー
ゼのための鋳型として試験した。考えられる鋳型を100
mMのトリス-HCl、pH7.5 、15 mM のMgCl2 、および各１
mMのATP 、GTP 、UTP 、およびCTP 中で、20 ug/mlのＱ
Ｂレプリカーゼ（ロットM202、プロメガ）で、30℃で２
時間処理した。アルファ32P-CTP(アメルシャム）800 Ci
/mmol を加えて105 cpm/nmolCTPのオーダーの特異的活
性を与えた。CTP の取り込みは実施例１に記載する様に
して測定した。これらの実験の結果を表IVに示す。これ
らの結果から、試験した水準では、MDV(+)またはMDV(-)
の分節のどれもＱＢレプリカーゼのための鋳型として作
用しないことが分かる。
120-221 MB1SA1: MDV(+)DNA の塩基62-119の5'末端に付加したサ
ルモネラ特異性配列の24塩基 MASA5: MDV(+)DNA の塩基1-64の5'末端に付加した非特
異性配列の10塩基、3'末端に付加したサルモネラ配列の
24塩基 MBSA: MB2 およびMB1SA1を一つに結合したもの（下記
参照） MDSA1: MDV(-)DNA の塩基161-220 の5'末端に付加した
サルモネラ特異性配列の24塩基 MC2SA5: MDV(-)DNA の塩基85-160の3'末端に付加したサ
ルモネラ特異性配列の24塩基 合成により調製したMDV 鋳型の分節は、ＱＢレプリカー
ゼのための鋳型として試験した。考えられる鋳型を100
mMのトリス-HCl、pH7.5 、15 mM のMgCl2 、および各１
mMのATP 、GTP 、UTP 、およびCTP 中で、20 ug/mlのＱ
Ｂレプリカーゼ（ロットM202、プロメガ）で、30℃で２
時間処理した。アルファ32P-CTP(アメルシャム）800 Ci
/mmol を加えて105 cpm/nmolCTPのオーダーの特異的活
性を与えた。CTP の取り込みは実施例１に記載する様に
して測定した。これらの実験の結果を表IVに示す。これ
らの結果から、試験した水準では、MDV(+)またはMDV(-)
の分節のどれもＱＢレプリカーゼのための鋳型として作
用しないことが分かる。
【００３８】
【実施例３】ハイブリダイゼーション− リゲーション−複製の立証 PM2058（プロメガ）、プローブのサルモネラ部分と相補
的な配列を有する48塩基合成オリゴマーを、24 ug MASA
5-PMP(PMP 、チバ コーニング ディアグノスティック
ス コーポレーション）および500 fmol MBSA1(MB2およ
びMB1SA1を結合したもの）で、4X SSC、10mMトリス-HC
l、pH7.5 、0.1% BSA、0.02% Tween-20、および5%硫酸
デキストリンを含む100 ul中で、56℃で１時間処理し
た。MBSA1 は、5'リン酸化MB2(10 pmol)およびMB1SA1(1
7pmol)の、MB2 およびMB1SA1と配列で相補的な33ヌクレ
オチド合成オリゴマーとのハイブリダイゼーションによ
り調製した。このハイブリダイゼーションにより、MB1S
A1の3'末端におけるミディバリアント配列がMB2の5'末
端におけるミディバリアント配列に隣接して同列に配置
される。これら２つのオリゴマーをT4 DNAリガーゼ（プ
ロメガ）により結合した。結合したMBSA1 は、調製用6%
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
ゼロターゲット比較用として、PMP およびMBSA1 だけ
を、同じ条件下で、PM2058を加えずに処理した。PMP を
分離し、上澄み液を除去した。このPMP を2XSSC/0.1% T
ween-20で２回洗浄した。
的な配列を有する48塩基合成オリゴマーを、24 ug MASA
5-PMP(PMP 、チバ コーニング ディアグノスティック
ス コーポレーション）および500 fmol MBSA1(MB2およ
びMB1SA1を結合したもの）で、4X SSC、10mMトリス-HC
l、pH7.5 、0.1% BSA、0.02% Tween-20、および5%硫酸
デキストリンを含む100 ul中で、56℃で１時間処理し
た。MBSA1 は、5'リン酸化MB2(10 pmol)およびMB1SA1(1
7pmol)の、MB2 およびMB1SA1と配列で相補的な33ヌクレ
オチド合成オリゴマーとのハイブリダイゼーションによ
り調製した。このハイブリダイゼーションにより、MB1S
A1の3'末端におけるミディバリアント配列がMB2の5'末
端におけるミディバリアント配列に隣接して同列に配置
される。これら２つのオリゴマーをT4 DNAリガーゼ（プ
ロメガ）により結合した。結合したMBSA1 は、調製用6%
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
ゼロターゲット比較用として、PMP およびMBSA1 だけ
を、同じ条件下で、PM2058を加えずに処理した。PMP を
分離し、上澄み液を除去した。このPMP を2XSSC/0.1% T
ween-20で２回洗浄した。
【００３９】PMP を、20 U T4 DNA リガーゼ(BRL) を含
むリガーゼ緩衝液(BRL) の100 ul中に分散し、室温で１
時間処理した。結合の必要性を決定するための比較試料
として、ハイブリダイゼーションしたPMP の同等の試料
を、T4 DNAリガーゼを含まないリガーゼ緩衝液で処理し
た。PMP を分離し、上澄み液を除去し、次いでPMP を2X
SSC/0.1% Tween-20で洗浄し、100 ulの水中に再分散し
た。
むリガーゼ緩衝液(BRL) の100 ul中に分散し、室温で１
時間処理した。結合の必要性を決定するための比較試料
として、ハイブリダイゼーションしたPMP の同等の試料
を、T4 DNAリガーゼを含まないリガーゼ緩衝液で処理し
た。PMP を分離し、上澄み液を除去し、次いでPMP を2X
SSC/0.1% Tween-20で洗浄し、100 ulの水中に再分散し
た。
【００４０】各リゲーション試料から得た１ulのアリコ
ートを、100mMのトリス-HCl、pH7.5 、15 mM のMgC
l2 、および各１mMのATP 、GTP 、UTP 、およびCTP 中
で、20 ug/mlのＱＢレプリカーゼ（ロットM202)(プロメ
ガ）で処理した。アルファ32P-CTP(アメルシャム）800
Ci/mmol を加えて105 cpm/nmol CTPのオーダーの特異的
活性を与えた。CTP の取り込みは実施例１に記載する様
にして測定した。変性6%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、変性複製反応も分析した。
ートを、100mMのトリス-HCl、pH7.5 、15 mM のMgC
l2 、および各１mMのATP 、GTP 、UTP 、およびCTP 中
で、20 ug/mlのＱＢレプリカーゼ（ロットM202)(プロメ
ガ）で処理した。アルファ32P-CTP(アメルシャム）800
Ci/mmol を加えて105 cpm/nmol CTPのオーダーの特異的
活性を与えた。CTP の取り込みは実施例１に記載する様
にして測定した。変性6%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、変性複製反応も分析した。
【００４１】CTP の取り込み結果を表Ｖに示し、ゲル電
気泳動の結果を図６に示す。図６に関して、各レーン
（左から右へ）に付けた試料は、レーン１がサイズマー
カーとして123 bpラダー(BRL) 、レーン２が結合した鋳
型複製生成物、レーン３がマイナスPM2058比較、複製生
成物、レーン４がマイナスリガーゼ比較、複製生成物で
ある。陰性比較試料中に複製が無いことから、試験評価
分析の条件かではプローブは複製しないという実施例２
の結果が確認される。
気泳動の結果を図６に示す。図６に関して、各レーン
（左から右へ）に付けた試料は、レーン１がサイズマー
カーとして123 bpラダー(BRL) 、レーン２が結合した鋳
型複製生成物、レーン３がマイナスPM2058比較、複製生
成物、レーン４がマイナスリガーゼ比較、複製生成物で
ある。陰性比較試料中に複製が無いことから、試験評価
分析の条件かではプローブは複製しないという実施例２
の結果が確認される。
【００４２】
【実施例３】配列転写−複写の感度 例えばサルモネラ、シゲラ、およびカンピロバクターを
始めとする、ターゲット特異性挿入物を含むミディバリ
アントプラスミドのPst I/Sma I 分節を調製し、ゲル精
製した。これらのPst I/Sma I 分節は、ミディバリアン
ト鋳型のプラスストランドをT7 RNAポリメラーゼにより
複製することができるT7プロモーターを含む。Pst I/Sm
a I 分節の希釈物を、T7 RNAポリメラーゼ（プロメガ）
3 U/ulにより、１時間、37℃で、40mMのトリス-HCl、pH
8.0 、10mMの NaCl 、6mM のMgCl2 、2mM のスペルミジ
ン、10mMのジチオトレストールおよび各3mM のATP 、CT
P、GTP 、およびUTP 中で、総量25ulで処理した。転写
反応生成物の2 ulアリコートを、処理を１時間、37℃で
行った以外は上記実施例に記載する標準複製反応条件下
で、ＱＢレプリカーゼで処理した。CTP の取り込みは実
施例１に記載する様にして測定した。転写−複製反応の
結果を図７、８および９に、それぞれMDV-CA83、MDV-SH
およびMDV-SA2 について示す。これらのデータは、存在
する鋳型が最低量でも転写が起こり、ＤＮＡ鋳型あたり
10〜100 のＲＮＡコピーが造られることを示している。
ＲＮＡ転写は、ＱＢレプリカーゼにより効率的に複製さ
れる。転写−複製の組み合わせにより、鋳型を単分子水
準で検出することができる。
始めとする、ターゲット特異性挿入物を含むミディバリ
アントプラスミドのPst I/Sma I 分節を調製し、ゲル精
製した。これらのPst I/Sma I 分節は、ミディバリアン
ト鋳型のプラスストランドをT7 RNAポリメラーゼにより
複製することができるT7プロモーターを含む。Pst I/Sm
a I 分節の希釈物を、T7 RNAポリメラーゼ（プロメガ）
3 U/ulにより、１時間、37℃で、40mMのトリス-HCl、pH
8.0 、10mMの NaCl 、6mM のMgCl2 、2mM のスペルミジ
ン、10mMのジチオトレストールおよび各3mM のATP 、CT
P、GTP 、およびUTP 中で、総量25ulで処理した。転写
反応生成物の2 ulアリコートを、処理を１時間、37℃で
行った以外は上記実施例に記載する標準複製反応条件下
で、ＱＢレプリカーゼで処理した。CTP の取り込みは実
施例１に記載する様にして測定した。転写−複製反応の
結果を図７、８および９に、それぞれMDV-CA83、MDV-SH
およびMDV-SA2 について示す。これらのデータは、存在
する鋳型が最低量でも転写が起こり、ＤＮＡ鋳型あたり
10〜100 のＲＮＡコピーが造られることを示している。
ＲＮＡ転写は、ＱＢレプリカーゼにより効率的に複製さ
れる。転写−複製の組み合わせにより、鋳型を単分子水
準で検出することができる。
【００４３】無論、当業者には、本発明の範囲および構
成から逸脱することなく、ここに記載する内容の各種の
変形が明らかであり、容易にそれを実行することができ
る。しかし、請求項の範囲はここに記載する内容に限定
するものではなく、請求項は、本発明が関連する当業者
が同等のものと認めるすべての特徴を含めて、本発明中
にある特許権を受けられる新規性のすべての特徴を含む
ものである。また、ここに記載する実施例は、本発明を
説明するためであって、制限するものではない。
成から逸脱することなく、ここに記載する内容の各種の
変形が明らかであり、容易にそれを実行することができ
る。しかし、請求項の範囲はここに記載する内容に限定
するものではなく、請求項は、本発明が関連する当業者
が同等のものと認めるすべての特徴を含めて、本発明中
にある特許権を受けられる新規性のすべての特徴を含む
ものである。また、ここに記載する実施例は、本発明を
説明するためであって、制限するものではない。
【００４４】
【表Ｉ】ポリ： 26 bp ポリリンカー配列（プロメガ） SA1 ： 48 bp サルモネラ配列（プロメガ） SA2 ： 48 bp サルモネラ配列（プロメガ） SH ： 60 bp シゲラ配列（プロメガ） CA ： 60 bp カンピロバクター配列（プロメガ） CA29： 29 bp カンピロバクター16S rRNA配列 CA83： 83 bp カンピロバクター16S rRNA配列 CA116 ：116bp カンピロバクター16S rRNA配列
【００４５】
【表ＩＩ】 ミディバリアントプラスミド分節の複製 鋳 型 処 理 (pmol) pMDV 塩基 ７２０ pMDV 塩基／DNase １４ pMDV／Pst I 塩基 ４２０ pMDV／Pst I 塩基／DNase １０ pMDV／Sma I 塩基 ４６０ pMDV／Sma I 塩基／DNase ７ MDV 塩基 ５９０ MDV 塩基／DNase ２２ pMDV/Xho 1/Pvu I より大きな分節 塩基 ０ pMDV/Xho 1/Pvu I より小さな分節 塩基 ２８
【００４６】
【表ＩＩＩ】 ＤＮＡ鋳型の複製感度 鋳 型 挿入物 特異性 感度 サイズ、bp 分子 MDV1 、ss2 １０００ MDV1 -SA1、ss2 ４８ サルモネラ １５００ MDV1 -SA2、ds3 ４８ サルモネラ １６０ MDV1 -CA 、ss2 ６０ カンピロバクター ２０００ MDV1 -CA83 、ss2 ８３ カンピロバクター １５００ MDV1 -CA29 、ss2 ２９ カンピロバクター ２０００ MDV1 -SH 、ss2 ６０ シゲラ ５００1 鋳型は、対応するミディバリアントプラスミドのPs
t 1/Sma I 分節を精製することにより分離した。
t 1/Sma I 分節を精製することにより分離した。
【００４７】2 制限分節は塩基処理により変性した。
【００４８】3 この鋳型は塩基処理しなかった。
【００４９】
ミディバリアント分節の複製鋳 型 CTP 取り込み、pmols MB2 、１pmol ０ MB1SA1、8 fmol ０ MASA5 、10 fmol ０ MB1SA1-MB2、600 amol ０ MDSA1 、１pmol ０ MC2SA5、１pmol ０
【００５０】
【表Ｖ】 複製生成物へのCTP の取り込み 試 料1 取り込まれたCTP 2 、pmols 結合された鋳型 １８０ マイナスPM2058比較 ０ マイナスリガーゼ比較 ０1 結合された鋳型試料に対する鋳型(1 fmol)の量は、
ハイブリダイゼーションおよびリゲーション工程の効率
が100%であると仮定して、複製反応中の鋳型の総量であ
る。
ハイブリダイゼーションおよびリゲーション工程の効率
が100%であると仮定して、複製反応中の鋳型の総量であ
る。
【００５１】2 取り込まれたCTP の量は、総量50 UL
から得た複製反応の5 ulアリコートに対してである。
から得た複製反応の5 ulアリコートに対してである。
【図１】ＱＢレプリカーゼにより触媒作用させた複製を
示す模式図
示す模式図
【図２】本発明のハイブリダイゼーション−リゲーショ
ン−複製方法を示す模式図
ン−複製方法を示す模式図
【図３】本発明のハイブリダイゼーション−リゲーショ
ン−転写−複製方法を示す模式図
ン−転写−複製方法を示す模式図
【図４】ｐＭＤＶの部分制限地図
【図５】本発明の複製生成物のゲル電気泳動写真
【図６】実施例３のハイブリダイゼーション−リゲーシ
ョン−複製反応に対するゲル電気泳動写真
ョン−複製反応に対するゲル電気泳動写真
【図７】実施例４のＭＤＶ−ＣＡ８３による転写−複製
反応の結果を示すグラフ
反応の結果を示すグラフ
【図８】実施例４のＭＤＶ−ＳＨによる転写−複写反応
の結果を示すグラフ
の結果を示すグラフ
【図９】実施例４のＭＤＶ−ＳＡ２による転写−複写反
応の結果を示すグラフ
応の結果を示すグラフ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジエフリー ジエイ ドナヒユー アメリカ合衆国 マサチユーセツツ州 01778 ウエイランド コール ロード ５ (72)発明者 ジヨン テイー アンガー アメリカ合衆国 マサチユーセツツ州 02052 メツドフイールド フイツチタ ロード 29
Claims (38)
- 【請求項１】 試料中のターゲット核酸配列の存在を検
出するための方法であって、それぞれがミディバリアン
トＤＮＡの異なった複製できない部分およびその試料中
のターゲット核酸配列に対して相補的な異なったターゲ
ット特異性核酸配列を含む、少なくとも２つのミディバ
リアントＤＮＡ／プローブ配合体をターゲット核酸配列
に対してハイブリダイゼーションすること、それらの配
合体を結合させて複製可能なＤＮＡ鋳型を形成するこ
と、およびこの鋳型を複製すること、を特徴とする増幅
方法。 - 【請求項２】 前記方法がさらに複製生成物の検出を含
むことを特徴とする請求項１の増幅方法。 - 【請求項３】 少なくとも一つの配合体が、付加された
ポリメラーゼプロモーターを含むことを特徴とする請求
項１の増幅方法。 - 【請求項４】 前記方法が、複製の前に、さらにミディ
バリアントＤＮＡ鋳型のＲＮＡへの転写を含むことを特
徴とする請求項３の増幅方法。 - 【請求項５】 前記ターゲット核酸配列が試料中に存在
することを特徴とする請求項１の増幅方法。 - 【請求項６】 複製がＱＢレプリカーゼにより触媒作用
を受けることを特徴とする請求項１の増幅方法。 - 【請求項７】 複製がＱＢレプリカーゼにより触媒作用
を受けることを特徴とする請求項４の増幅方法。 - 【請求項８】 前記ミディバリアントＤＮＡ／プローブ
配合体のターゲット核酸配列に対するハイブリダイゼー
ションにより、プローブが隣接して同列に並ぶことを特
徴とする請求項１の増幅方法。 - 【請求項９】 プローブがT4 DNAリガーゼにより結合さ
れることを特徴とする請求項８の増幅方法。 - 【請求項１０】 少なくとも一つのミディバリアントＤ
ＮＡ／プローブ配合体が固体支持体上に固定されている
ことを特徴とする請求項１の増幅方法。 - 【請求項１１】 プローブのリゲーションの前または後
に、配合体が固体相から解放されることを特徴とする請
求項１０の増幅方法。 - 【請求項１２】 前記固体支持体が常磁性粒子を含むこ
とを特徴とする請求項１０の増幅方法。 - 【請求項１３】 前記検出方法が導波管の使用を含むこ
とを特徴とする請求項２の増幅方法。 - 【請求項１４】 ハイブリダイゼーションに続いて、ハ
イブリダイゼーションされたミディバリアントＤＮＡ／
プローブ配合体が、磁気分離により、ハイブリダイゼー
ションされていないミディバリアントＤＮＡ／プローブ
配合体および試料の他の成分から分離されることを特徴
とする請求項１２の増幅方法。 - 【請求項１５】 前記ポリメラーゼプロモーターがT7 R
NAポリメラーゼプロモーターであることを特徴とする請
求項３の増幅方法。 - 【請求項１６】 ミディバリアントＤＮＡの複製できな
い部分がミディバリアント(+) ＤＮＡの5'末端の最初の
61ヌクレオチドであり、ミディバリアントＤＮＡの他の
複製できない部分がミディバリアント(+) ＤＮＡの残り
の3'ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１の増
幅方法。 - 【請求項１７】 少なくとも一つの配合体がさらにその
5'末端で非特異性塩基配列を含み、その非特異性塩基配
列が少なくとも一つのヌクレオチドを含み、少なくとも
一つのヌクレオチドが反応性基を含むことを特徴とする
請求項１の増幅方法。 - 【請求項１８】 前記反応性基が第一級アミンを含むこ
とを特徴とする請求項１７の増幅方法。 - 【請求項１９】 試料中のターゲット核酸配列を検出す
るための方法であって、 ａ）ターゲット核酸配列を、ハイブリダイゼーション条
件下で、それぞれが前記ターゲット核酸配列に対して相
補的な異なった核酸配列およびミディバリアントＤＮＡ
の異なった複製できない部分を含む、２つのミディバリ
アントＤＮＡ／プローブ配合体と接触させ、配合体のハ
イブリダイゼーションにより、プローブを隣接して同列
に並べること、 ｂ）プローブを結合させ、鋳型を形成すること、 ｃ）ＤＮＡ鋳型をＲＮＡに転写すること、 ｄ）ＲＮＡ転写を複製すること、および ｅ）工程ｄの複製生成物を検出すること からなる方法。 - 【請求項２０】 ターゲット特異性核酸配列およびミデ
ィバリアントＤＮＡの複製できない部分からなり、増幅
方法の成分である配合体。 - 【請求項２１】 前記ターゲット特異性核酸配列がオリ
ゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２０の配
合体。 - 【請求項２２】 前記ターゲット特異性核酸配列が、ハ
イブリダイゼーション条件下で、試料中のターゲット核
酸配列に対して相補的であることを特徴とする請求項２
０の配合体。 - 【請求項２３】 前記配合体がさらにT7 RNAポリメラー
ゼプロモーターを含むことを特徴とする請求項２０の配
合体。 - 【請求項２４】 前記配合体がさらに、ミディバリアン
トＤＮＡの複製できない部分の末端に付加した、少なく
とも一つのヌクレオチドを有する非特異性塩基配列を含
み、その非特異性配列がヌクレオチドに付加した反応基
を含むことを特徴とする請求項２０の配合体。 - 【請求項２５】 前記配合体が固体支持体上に固定され
ていることを特徴とする請求項２０の配合体。 - 【請求項２６】 前記固体支持体が常磁性粒子を含むこ
とを特徴とする請求項２５の増幅方法。 - 【請求項２７】 前記検出方法が導波管の使用を含むこ
とを特徴とする請求項１９の増幅方法。 - 【請求項２８】 ミディバリアントＤＮＡの複製できな
い部分がミディバリアント(-) ＤＮＡの3"末端の最初の
61ヌクレオチドであること、およびミディバリアントＤ
ＮＡの他の複製できない部分がミディバリアント(-) Ｄ
ＮＡの残りの5'ヌクレオチドであることを特徴とする請
求項１の増幅方法。 - 【請求項２９】 試料中のターゲット核酸配列を検出す
るための一対の配合体であって、 ａ）第一の配合体がターゲット特異性核酸配列およびミ
ディバリアントＤＮＡの複製できない部分を含み、 ｂ）第二の配合体がターゲット特異性核酸配列およびミ
ディバリアントＤＮＡの複製できない部分を含み、第一
の配合体および第二の配合体のターゲット特異性核酸配
列が互いに異なっており、両配列が、ハイブリダイゼー
ション条件下で、同じターゲットに対して相補的であ
り、第一および第二の配合体のミディバリアントＤＮＡ
の複製できない部分が互いに異なっていることを特徴と
する一対の配合体。 - 【請求項３０】 試料中のターゲット核酸配列を検出す
るためのテストキットであって、 ａ）ターゲット核酸配列を解放するための溶液、 ｂ）それぞれがハイブリダイゼーション条件下でターゲ
ット核酸配列に対して相補的な異なったターゲット特異
性核酸配列、およびミディバリアントＤＮＡの異なった
複製できない部分を含む、少なくとも２つの配合体、 ｃ）ＤＮＡ鋳型を形成するための配合体のリゲーション
に触媒作用させるための酵素、および ｄ）複製生成物が検出可能である鋳型の複製に触媒作用
させるための酵素 からなることを特徴とするテストキット。 - 【請求項３１】 一つの配合体がさらに、ミディバリア
ントＤＮＡの複製できない部分の末端に付加したＲＮＡ
ポリメラーゼプロモーターを含むこと、および前記プロ
モーターにより、結合したＤＮＡ鋳型がＲＮＡに転写さ
れることを特徴とする請求項３０のテストキット。 - 【請求項３２】 前記リガーゼがT4 DNAリガーゼである
ことを特徴とする請求項３０のテストキット。 - 【請求項３３】 前記プロモーターがT7 RNAポリメラー
ゼであることを特徴とする請求項３１のテストキット。 - 【請求項３４】 一つの配合体のミディバリアントＤＮ
Ａの複製できない部分がミディバリアント(+) ＤＮＡの
5'末端の最初の61ヌクレオチドを含むことを特徴とする
請求項３０のテストキット。 - 【請求項３５】 前記配合体がさらに、ミディバリアン
トＤＮＡの複製できない部分に付加した、少なくとも一
つのヌクレオチドからなる非特異性配列を含み、その非
特異性配列がヌクレオチドに付加した反応基を含むこと
を特徴とする請求項３４のテストキット。 - 【請求項３６】 前記配合体が固体支持体上に固定され
ていることを特徴とする請求項３５のテストキット。 - 【請求項３７】 前記固体支持体が常磁性粒子を含むこ
とを特徴とする請求項３６の増幅方法。 - 【請求項３８】 他の配合体のミディバリアント(+) Ｄ
ＮＡの複製できない部分が、ミディバリアントＤＮＡの
残りの3'ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項３
４の増幅方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59826990A | 1990-10-16 | 1990-10-16 | |
| US598269 | 1990-10-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0568597A true JPH0568597A (ja) | 1993-03-23 |
Family
ID=24394897
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3209029A Pending JPH0568597A (ja) | 1990-10-16 | 1991-08-21 | ミデイバリアントｄｎａ鋳型の増幅 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5407798A (ja) |
| EP (2) | EP0481704B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0568597A (ja) |
| KR (1) | KR920008196A (ja) |
| AU (1) | AU635142B2 (ja) |
| CA (1) | CA2046713A1 (ja) |
| DE (1) | DE69122346T2 (ja) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO1994016105A1 (en) * | 1993-01-15 | 1994-07-21 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Rna assays using rna binary probes and ribozyme ligase |
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| US20070269799A9 (en) * | 1994-06-22 | 2007-11-22 | Zhang David Y | Nucleic acid amplification methods |
| USRE38442E1 (en) * | 1994-06-22 | 2004-02-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM) |
| WO1995035390A1 (en) * | 1994-06-22 | 1995-12-28 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Ligation-dependent amplification for the detection of infectious pathogens and abnormal genes |
| US5942391A (en) | 1994-06-22 | 1999-08-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM) |
| US6593086B2 (en) | 1996-05-20 | 2003-07-15 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Nucleic acid amplification methods |
| US5876924A (en) * | 1994-06-22 | 1999-03-02 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM) |
| USRE43097E1 (en) | 1994-10-13 | 2012-01-10 | Illumina, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
| US5783453A (en) * | 1995-06-29 | 1998-07-21 | Chiron Diagnostics Corporation | Non-separation specific binding chemiluminescent assay |
| US20020150921A1 (en) * | 1996-02-09 | 2002-10-17 | Francis Barany | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
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