DE69122346T2

DE69122346T2 - Amplifikation von Midivariant-DNS-Templaten

Info

Publication number: DE69122346T2
Application number: DE69122346T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey J Donahue; Richard M Martinelli; John T Unger
Original assignee: Ciba Corning Diagnosys Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1990-10-16
Filing date: 1991-10-14
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2011-10-15
Also published as: DE69122346D1; AU635142B2; US5407798A; US5959095A; KR920008196A; JPH0568597A; CA2046713A1; AU8045391A; EP0481704A1; EP0692541A1; EP0481704B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Amplifizierungsverfahren und insbesondere die Amplifizierung, die Midivariant-DNS/Sondenkonjugate beinhaltet.
Auf Nukleinsäuren basierende Testassays bieten gegenüber herkömmlichen Immunoassays hinsichtlich der Spezifität und der Sensitivität bestimmte Vorteile. Die wesentliche Eigenschaft von auf Nukleinsäuren basierenden Testassays ist die Hybridisierung von spezifischen Target-Nukleinsäuresequenzen (Sonden) an ihre komplementären Target-Nukleinsäuresequenzen innerhalb einer Testprobe. Die Spezifitat einer Sonde bezieht sich auf ihre Fähigkeit, zwischen Target- und Nichttarget-Nukleinsäuresequenzen zu unterscheiden. Die Spezifität der Sonde kann entweder absolut sein (d.h. die Sonde kann zwischen Target- Nukleinsäuresequenzen und Nichttarget-Nukleinsäuresequenzen unterscheiden) oder funktionell sein (d.h. die Sonde kann zwischen der Target-Nukleinsäuresequenz und irgendeiner anderen Nukleinsäuresequenz, die sich normalerweise in der Testprobe befindet, unterscheiden). Eine Target-Nukleinsäuresequenz einer Testprobe in einem Testassay betrifft ein einzelsträngiges Polynukleotid-Segment, dessen Nukleotidbasensequenz dem genetischen Element entspricht, dessen Anwesenheit in der Testprobe nachgewiesen werden soll. Die Testprobe bezieht sich auf irgendeine Testprobe mit einer oder mehreren Target-Nukleinsäuren, die in gereinigter oder ungereinigter Form vorliegen kann. Quellen für die Testprobe können physiologische oder nicht physiologische DNS oder RNS (synthetisiert oder natürlich vorkommend) und dergleichen beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt.
Man stellte fest, daß das gesamte Antigendeterminantenrepertoire zweier separater aber verwandter Organismen ihre Unterscheidung durch Immunoassays nicht erlaubte, wohingegen einmalige genomische Sequenzen durch Nukleinsäuretestassays identifiziert und differenziert werden können. Siehe U.S.- Patent 4851336. Auch wenn im Falle viraler Targets, d. h. HIV- Infektion, Antikörper gegen virale Antigene möglicherweise nicht nachweisbar sind, selbst wenn virale Sequenzen in das Wirtsgenom eingefügt worden sind, stellt diese Insertion dennoch einen potentiellen, diagnostischen Marker dar, wenn eine Detektions- (Amplifizierungs-) Methodik mit der erforderlichen Sensitivität entwickelt werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt eine Amplifizierungsverfahrensweise bzw. Amplifizierungsverfahrensweisen der erforderlichen Sensitivität bereit.
Man stellte fest, daß das höchste Maß an Sensitivität von auf Nukleinsäuren basierenden Testassays nur in Verbindung mit einem Verfahren erreicht werden kann, das ein nachweisbares Molekül amplifiziert, das die Anwesenheit von Target-Nukleinsäuresequenzen in der Testprobe anzeigt.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Art des Amplifizierungsverfahrens, bei der die Targetsequenz zuerst amplifiziert und dann isoliert wird. Da die PCR-Amplifizierung früh im Reaktionsverlauf auftritt, können auch andere Sequenzen als die Targetsequenz amplifiziert werden. Die Identifizierung der tatsächlichen Targetsequenz erfordert die Analyse der amplifizierten Sequenzen. Siehe U.S.-Patente 4683195 und 4683202. Die U.S.-Patente 478660 und 4957858 beschreiben die autokatalytische Replikation rekombinanter RNS durch Qβ-Replikase, eine andere Art des Amplifizierungsverfahrens, bei dem die Targetsequenz zuerst isoliert und dann amplifiziert wird. Der Nachteil dieses Qβ-Amplifizierungsverfahrens ist, daß Sonden, die nicht an die Target-Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, für ihre Zerstörung anfällig gemacht, d. h unreplizierbar gemacht werden müssen. Siehe "Amplifying Probe Assays with Q- Beta Replicase" Bio/Technology 1989:7(6), 609-610 (Eng.) und "Q Beta Amplification" J. Clin. Lab. Anal. 4:318 (1990) (Brief).
WO-A-9014439 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis einer Target-Nukleinsäuresequenz mit einem replizierbaren RNS-Reporter-System. Das Verfahren stellt zwei Sonden-Primer bereit, die an der targetspezifischen Hybridisierung und an der Initiation der DNS-Polymerisation in einer komplementären DNS- Synthesereaktion beteiligt sind, wobei jede Sonde in einer separaten Polymerase-vermittelten Reaktion benützt wird. Diese erzeugt ein targetspezifisches Gen mit einer DNS-Sequenz, die dann als Matrize für die Synthese von replizierbarer RNS dient. Genauer, wird ein erster Sonden-Primer an eine erste Region der Targetsequenz hybridisiert und an der Matrize der Targetsequenz bis mindestens über die zweite Region der Targetsequenz verlängert. Das entstandene Extensionsprodukt wird dann von der Targetsequenz abgetrennt. Der zweite Sonden-Primer wird dann an das Extensionsprodukt hybridisiert und an der Matrize des Exensionsproduktes bis über die Promotorsequenz verlängert. Die zweite Verlängerung ergibt eine doppelsträngigen DNS mit einem funktionellen doppelsträngigen Promotor, der die Transkription des Gens einleiten kann, wodurch eine replizierbare RNS erzeugt wird.
WO-A-9006376 beschreibt ein Target-Nukleinsäure-Amplifizierungs/Nachweis-System unter Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, von denen eine eine Sondensequenz enthält, die mit einer Sequenz verbunden ist, welche die Initiation der Replikation durch eine RNS-abhängige RNS-Polymerase ermöglicht, und eines weiteren Reportermoleküls, das an einen von dem Extensionsprodukt der ersten Nukleinsäuresequenz getrennten Strang nach Hybridisierung an eine spezifische Targetsequenz hybridisieren kann. Das Extensionsprodukt der zweiten hybridisierten, Nukleotid-gebundenen Sequenz dient dann als Matrize für die autokatalytische Replikation durch eine RNS-abhängige RNS-Polymerase.
Jede der vorstehenden Anmeldungen beinhaltet zwei Hybridisierungszyklen der Oligonukleotid-Sonde, gefolgt von Extension der Sonde. Zusätzlich sind die komplementären Targetstränge als eine Folge der ersten Extensionsreaktion komplementär zu verschiedenen Strängen der Targetsequenzen.
Es wird/werden (ein) Amplifizierungsverfahren beschrieben, das als einen ersten Schritt die Hybridisierung von zwei getrennten, nicht replizierbaren Midivariant- DNS/Sondenkonjugaten an eine Target-Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe beinhaltet. Die Testprobe wird, falls nötig, vorher behandelt, um die Target-Nukleinsäuresequenzen freizusetzen. Diese Konjugate enthalten mindestens zwei Anteile. Ein Anteil besteht aus einer targetspezifischen Nukleinsäuresequenz (Sonde) 1 die unter Hybridisierungsbedingungen komplementär zu der Target-Nukleinsäuresequenz ist. Der andere Anteil enthält einen nicht replizierbaren Teil der Midivariant-DNS. Ein Konjugat enthält einen Anteil des 5'-Endes von einem Strang der Midivariant-DNS. Das andere Konjugat enthält den verbleibenden, nicht replizierbaren Anteil der Midivariant-DNS bis zu ihrem 3'-Terminus. Die Sonden der Konjugate werden so gewählt, daß bei der Hybridisierung an das Targetmolekül die zwei Sonden hintereinander zu liegen kommen. In einem nächsten Schritt werden die Sonden durch T4-DNS-Ligase kovalent verknüpft, um ein Substrat für die Replikation zu erzeugen. Das Enzym Qβ-Replikase nützt die Midivariant-DNS als eine Matrize zur Herstellung von Kopien einer RNS-Midivariant-Sequenz, die die targetspezische Sequenz enthalten. Die Produkte der Replikation werden nachgewiesen und weisen auf die Anwesenheit der Targetmoleküle in der Testprobe hin.
In einem modifizierten Amplifizierungsverfahren ist an einen Teil der nicht replizierbaren Midivariant-DNS ein RNS-Polymerasepromotor gebunden. Der RNS-Polymerasepromotor arbeitet als ein Doppelstrangmolekül. Nach der Hybridisierung und Ligierung wird die DNS-Matrize in RNS transkribiert. Das RNS- Transkript wird dann durch Qβ-Replikase repliziert und das Replikationsprodukt nachgewiesen.
Ein Konjugat und ein Paar von Konjugaten werden erfindungsgemäß für den Gebrauch bei dem/den erfindungsgemäßen Amplifizierungverfahren beschrieben.
Die Midivariant-DNS/Sondenkonjugate und andere hier beschriebene Komponenten sind an die Verpackung in einem Testkit zur Durchführung des/der Amplifizierungsverfahren (5) angepaßt.
Es ist eine primäre Aufgabe der Erfindung, ein Amplifizierungsverfahren bereitzustellen, an dem Midivariant-DNS beteiligt ist.
Es ist eine andere Aufgabe der Erfindung, ein Konjugat bereitzustellen, das einen nicht replizierbaren Anteil von Midivariant-DNS und eine targetspezifische Nukleinsäuresequenz enthält.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, zwei getrennte Konjugate bereitzustellen, wobei jedes einen bestimmten, nicht replizierbaren Midivariant-DNS-Anteil und eine bestimmte, targetspezifische Nukleinsäuresequenz besitzt. Nach der Hybridisierung der beiden targetspezifischen Nukleinsäuresequenzen an eine Target-Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe werden die Sonden ligiert, und die Anteile der Midivariant-DNS dienen dann als Matrize für die Replikation, deren Produkte anschließend nachweisbar sind.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Amplifizierungsverfahren einschließlich Hybridisierungs-, Ligierungs- und Replikationsschritten bereitzustellen, das den Nachweis von weniger als 200 Targetmolekülen in einer Testprobe erlaubt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein modifiziertes Amplifizierungsverfahren einschließlich Hybridisierungs- Ligierungs-, Transkriptions- und Replikationsschritten bereitzustellen, das den Nachweis von einem Targetmolekül in einer Testprobe erlaubt.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, einen Testkit bereitzustellen, der der Durchführung eines Amplifizierungsverfahrens dient und zum Nachweis von Replikationsprodukten führt, die die Anwesenheit einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe anzeigen.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Amplifizierungsverfahren bereitzstellen, das im Vergleich zu Immunoassays deutliche Sensitivitätsvorteile bietet.
Bezugnehmend auf die begleitenden, erläuternden Zeichnungen:
ist Fig. 1 eine bespielhafte Erläuterung der Replikation, die durch Qβ-Replikase katalysiert wird;
ist Fig. 2 eine bespielhafte Erläuterung des erfindungsgemäßen Hybridisierungs-, Ligierungs- und Replikationsverfahrens;
ist Fig. 3 eine bespielhafte Erläuterung des erfindungsgemäßen Hybridisierungs-Ligierungs -Transkriptions-Replikationsverfahrens;
ist Fig. 4 eine partielle Restriktionskarte von pMDV;
erläutert Fig. 5 die Resultate der Gelelektrophorese von erfindungsgemäßen Replikationsprodukten;
erläutert Fig. 6 die Resultate der Gelelektrophorese der Hybridisierungs-Ligierungs-Replikationsreaktion des Beispiels 3;
erläutert Fig. 7 die Resultate der Transkriptions-Replikationsreaktion mit MDV-CA83 des Beispiels 4;
erläutert Fig. 8 die Resultate der Transkriptions-Replikationsreaktion mit MDV-SH des Beispiels 4;
erläutert Fig. 9 die Resultate der Transkriptions-Replikationsreaktion mit MDV-SA2 des Beispiels 4.
In den nachstehenden Beispielen wird das Produkt des Replikationsschrittes der Amplifizierungsverfahren durch Radioisotopentechniken nachgewiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch die Produkte des Replikationsschrittes der Amplifizierung durch eine Chemilumineszenzmethode nachgewiesen. Siehe U.S.-Patent 4745181. Ein Immunoassaytyp, der im Falle der Sondentechnologie beispielhaft für diese Verfahrenstechnik ist, setzt voraus, daß eine komplementäre "Reagens"- Sequenz gegen ein möglicherweise in einer Testprobe anwesendes Target-Molekül von Interesse auf einer festen Phase paramagnetischer Partikel (PMP) (Ciba Corning Diagnostics Corp.) immobilisiert wird und eine zweite komplementäre "Reagens"-Sequenz gegen das Targetmolekül mit einem Acridiniumester (Ciba Corning Diagnostics Corp.) markiert ist. Nach der Inkubation der Reagentien mit der Testprobe bildet sich ein Sandwich-Komplex mit dem Targetmolekül Ein magnetisches Feld wird angelegt, und die PMP werden aus der Lösung isoliert. Dies bewirkt eine Trennung von nicht gebundener, mit Acridiniumester markierter Reagens-Sequenz von derjenigen, die spezifisch an den Analyten auf der Oberfläche der PMP gebunden ist. Nach diesem Trennschritt wird die Targetsequenz durch eine Chemilumineszenzreaktion der komplementären, markierten Reagens-Sequenz, die an die PMP gebunden bleibt, nachgewiesen. In der vorliegenden Erfindung könnte diese Chemilumineszenzmethode zum Nachweis der Replikationsprodukte angewendet werden. Die Amplifizierungsmethode könnte auch auf Immunoassays angewendet werden.
Eine andere Nachweismethode beinhaltet den Gebrauch von optischen Geräten zur Weiterleitung von Strahlung durch "totale interne Reflektion", um eine evaneszente Welle an der Grenzfläche des Gerätes und eines Testmediums mit einem niedrigeren Brechungsindex zu erzeugen. Siehe Harrick, N. J., "Internal Reflection Spectroscopy", Harrick Scientific Corp., Ossining N. Y. (3. Ausgabe) (1987) und U.S.-Patent 4880752. Die evaneszente Welle ist eine elektromagnetische Wellenform, die sich gewöhnlich nur weniger als eine Wellenlange in das Testmedium ausbreitet. Dennoch ist dieses Eindringungsvermögen ausreichend für eine Wechselwirkung zwischen der evaneszenten Wellenkomponente und dem Target in dem Testmedium. Ersatzweise kann das Target mit einem Sensor verknüpft werden. Wird diese Methode auf die vorliegende Erfindung angewendet, kann die Analyse des Replikationsproduktes des Amplifizierungsverfahrens erreicht werden, indem ein Reaktantenüberzug auf einen Evaneszenzsensor aufgebracht wird, der das/die Produkt(e) in der Evaneszenzzone detektiert. Ein Reaktantenüberzüg ist so definiert, daß er die Bindung eines Moleküls, das ein komplementäres Molekül in einem Testmedium unter Bildung eines Bin- dungspaares aufnimmt, durch mittels eines Überzugs beinhaltet, wobei das Überzugsverf ahren sowohl nicht-kovalente als auch kovalente Bindungen enthalten soll.
Man hat über Nukleinsäuresequenzen berichtet, die einzigartig und kennzeichnend für bestimmte Pathogene in verschiedenen Testproben sind. Die nicht nur darauf beschränkten Quellen von Target-Nukleinsäuresequenzen sind definiert als Zellen, Viren und Viroide. Obwohl gezeigt worden ist, daß einige Testproben durch quantitative Kulturverfahren mehr als 10&sup7;-10&sup9; Zellen eines infektiösen Organismus enthielten, waren in einigen Salmonella-Testproben weniger als 1000 Organismen pro Gramm vorhanden.
Die gegenwärtige Sensitivitätsgrenze von auf Chemilumineszenz basierenden Nachweismethoden ist ungefähr 100 amol (60 Millionen Moleküle). Diese Sensitivitätsgrenze wurde in einem Assay beobachtet, in dem ein Chemilumineszenz-markiertes DNS- Oligomer an 16 S ribosomale RNS von Campylobacter hybridisiert wurde. Die erforderliche Sensitivität dieser Assays, zum Beispiel für infektiöse Krankheitsagentien&sub1; muß weniger als 1000 Moleküle nachweisen können, somit müssen die Targetmoleküle mindestens 10&sup4;-10&sup5;fach amplifiziert werden, um sie durch Chemilumineszenzmethoden nachweisen zu können.
Ein Mittel, um die notwendige Sensitivität für diese Testassays zu erhalten, beinhaltet ein Amplifizierungsverfahren, das den Gebrauch des Enzyms Qβ-Replikase einschließt. Siehe "Autocatalytic Replication of a Recombinant RNA" J. Mol. Bio. 171:281-295 (1983). Das Qβ-Virus ist ein RNS-Phage, dessen Genom aus einem Strang von annähernd 4400 Ribonukleotiden besteht. Siehe Blumenthal (1982) in: "The Enzyme" (Bd. XV, Teil B) (P. D. Boyer, Herausg.) S. 267, Academic Press, New York. Die Aufgabe der Qβ-Replikase ist es die Synthese des komplementären RNS-Stranges von dieser RNS-Matrize zu katalysieren. Das Enzym besteht aus vier Untereinheiten, von denen lediglich eine vom Virusgenom codiert wird. Die anderen Untereinheiten stammen aus dem Wirtsbakterium. Obwohl Qβ-Replikase eine eng begrenzte Spezifität aufweist, indem sie nur Qβ-RNS als Replikationsmatrize für die Synthese des komplementären Strangs akzeptiert (andere virale RNS-Sequenzen werden nicht repliziert), können kürzere, natürlich vorkommende Mutanten der Qβ- RNS ebenfalls als Matrizen für die Replikation dienen. Diese kürzeren Matrizen können "Nanovariant"-RNS mit einer Länge von 90 Ribonukleotiden und "Midivariant"-RNS mit einer Länge von 220 Nukleotiden sein.
In Fig. 1 wird die Wirkung der Qβ-Replikase folgendermaßen erläutert: Ausgehend von einer Einzelkopie der Midivariant (MDV) -RNS, die aufgrund ihrer vorhergesagten Sekundärstruktur durch das Stem-and-Loop-Modell symbolisiert ist, wird der Strang als Matrize für die Synthese des komplementären Minusstranges verwendet. Nach N Replikationsrunden sind 2 Stränge für jeden zu Beginn vorhandenen Matrizenstrang synthetisiert worden. Solange das Enzym in molarem Überschuß gegenüber den RNS-Strängen vorliegt, nimmt die Synthese von RNS-Produkt exponentiell zu.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Amplifizierungsverfahren wird die Midivariant-(+)-DNS-Matrize in zwei nicht replizierbare Anteile getrennt, beispielsweise an der 61. Base des 5'-Endes des Plusstranges. Zu jedem der beiden Anteile wird eine bestimmte, targetspezifische Nukleinsäuresequenz gegeben, die komplementär zur Target-Nukleinsäuresequenz ist, so daß sich ein Konjugat bildet. Die entsprechenden komplementären Sequenzen der Midivariant-(-)-DNS können in ähnlicher Weise verwendet werden. Die zwei Konjugate werden als Sonde A bzw. Sonde B bezeichnet, siehe Fig. 2. Probe A wird auf PMP immobilisiert. Die Immobilisierung des Konjugats auf einem festen Träger ist weder eine Bedingung noch eine Begrenzung der vorliegenden Erfindung. Die Testprobe wird lysiert, um die Target-Nukleinsäuresequenzen freizusetzen. Die freigesetzten Target-Nukleinsäuresequenzen werden an die Sonde A und die Sonde B unter Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Die targetspezifischen Sequenzen sind so gewählt, daß nach Hybri- disierung an das Target die zwei targetspezifischen Sequenzen hintereinanderliegen. Nach Hybridisierung werden die PMP von den Bestandteilen der Testprobe, unhybridisierter Sonde B und Nichttarget-Nukleinsäuresequenzen abgetrennt.
Die Sonden A und B, die an das Target hybridisiert sind, werden dann durch die Wirkung der DNS-Ligase kovalent verknüpft, die die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen den beiden Sonden katalysiert, siehe Fig. 2B. Die Konjugate können von der festen Phase vor oder nach dem Ligierungsschritt freigesetzt werden. Durch diesen Ligierungsschritt wird eine Midivariant-(+)-DNS-Matrize in einer Weise gebildet, die von der Anwesenheit des Targetmoleküls in der Testprobe abhängt. In diese Midivariant-(+)-DNS-Sequenz sind die targetspezischen, kombinierten Sequenzen der Sonden A und B eingefügt. Die Midivariant-Matrize mit den eingefügten targetspezifischen Sequenzen kann nun durch die Qβ-Replikase repliziert werden. Die Produkte der Replikation sind nachweisbar, und dadurch wird die Anwesenheit des Targets in der Testprobe angezeigt.
Damit dieses Ligierungs-Replikationsverfahren funktioniert, ist es wünschenswert, daß weder Sonde A noch Sonde B allein als replizierbare Matrize fungieren können. Zusätzlich sollte die Insertion der targetspezifischen Sequenzen an der gewählten Position in die Midivariant-Matrize die Eigenschaften, die zur Erkennung durch die Qβ-Replikase erforderlich sind, nicht übermäßig verändern, siehe Fig. 2C.
In einem modifizierten Amplifizierungsverfahren wird die Midivariant-DNS vor der Replikation durch Qβ-Replikase in RNS transkribiert. Ein Polymerasepromotor wird mit einem nicht replizierbaren Anteil der Midivariant-DNS vor dem Transkriptionsschritt verknüpft. Das Ligierungs-Transkriptions-Replikationsverfahren ermöglicht den Nachweis einer einzigen Matrize. Siehe Fig. 3.
Ein Plasmid, das die Midivariant-Sequenz enthält (pMDV) (Promega, Madison, WI), wurde zur Transformation von Baktenenzellen (JM107) benützt. Die transformierten Zellen wurden in Kultur angezogen, die kultivierten Zellen geerntet und lysiert und das Plasmid gereinigt. Alle diese Schritte wurden nach Standardverfahren durchgeführt. Siehe Beispiel 1. PMDV-Proben wurden mit den Restriktionsenzymen Pst I, Sma 1, Xho 1 oder Kombinationen dieser Enzyme gespalten, um Fragmente zu erhalten, die in der Restiktionskarte der Fig. 4 angegeben sind. PMDV enthielt an der Position 61 des Plusstranges einen 10 Basenpaare langen Xho I-Linker.
Andere Versionen der Midivariant-Sequenz wurden präpariert und auf ihre Fähigkeit als Replikationsmatrize getestet. Die Xho I-Restriktionsstelle wurde ausgenutzt, um fremde target- spezifische Sequenzen einzufügen. Insertionen in natürlich vorkommende Midivariant-Sequenzen können benützt werden, um an gewünschte Targetsequenzen zu hybridisieren, und erleichtern den Gebrauch von Midivariant-DNS bei Amplifizierungsverfahren, solange die eingefügte targetspezifische Sequenz es dem rekombinanten Molekül erlaubt, als Matrize für die RNS-Synthese zu fungieren. Tabelle I listet Beispiele für inserierte Sequenzen an der Xho I-Restriktionsstelle auf.
Alle Versionen der Midivariant-DNS wurden vor ihrer Aufnahme in Replikationsreaktionen mit Base behandelt, um RNS- Kontaminationen zu entfernen. Intaktes Plasmid und restriktionsgespaltene Plamide wurden vor dem Einbringen in Replikase-Reaktionen bei 80ºC in lN NaOH während 15 Min. inkubiert und dann durch Zusatz von einem Äquivalent HCl neutralisiert, um kontaminierende RNS-Matrizen zu entfernen. Eine Probe von jeder der vermeintlichen DNS-Matrizen wurde mit DNAse (Promega) gespalten, und anschließend wurde ihre verbliebene Fähigkeit getestet, als Substrat für die Qβ-Replikase zu dienen.
Midivariant-DNS-Proben wurden dann auf ihre Fähigkeit untersucht, als Matrize für die RNS-Synthese durch die Qβ- Replikase zu fungieren. Die Replikase-Reaktionsansätze enthielten 100 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 15 mM MgCl&sub2;, je 1 mM ATP, GTP, UTP und CTP. Alpha-³²P-CTP (New England Nuclear) wurde als Markierung zum Nachweis synthetisierter RNS-Produkte verwendet. Die Qβ-Replikase-Konzentration war 20 µg/ml, und die Reaktionen wurden 1 Std. lang bei 37ºC inkubiert. Die Replikationsreaktion wurde getestet, indem ein Aliquot des Reaktionsansatzes auf einen GFF-Filter (Whatman) aufgetragen und die synthetisierte RNS durch Schwenken des Filters in eiskalter 10% Trichloressigsäure/1% Natriumpyrophosphat gefällt wurde. Die Filter wurden viermal in eiskalter 5%iger Trichloressigsäure gewaschen und in einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Die Ergebnisse dieser Replikationsexperimente, die in Tabelle II zusammengefaßt sind, weisen die Fähigkeit von intakten Midivariant-DNS-Sequenzen nach, sowohl in linearer als auch in geschlossen-zirkulärer Form als Matrize für die durch die Qβ-Replikase katalysierte RNS-Synthese zu dienen. Es wurde außerdem beobachtet, daß das RNS-Produkt, das nach einer Midivariant-DNS-Matrize synthetisiert worden war, an pMDV, nicht aber an ein Plasmid, das eine Nanovariant-DNS-Sequenz enthielt hybridisierte (Daten nicht gezeigt).
Um die Sensitivität der Replikation von Midivariant-Matrizen, die inserierte Sequenzen enthalten, zu untersuchen, wur- den Sequenzen in die Xho-Restriktionsstelle des vorstehend beschriebenen, die Midivariant-Sequenz enthaltenden Plasmids kloniert. Die Sensitivität der Replikationsreaktionen dieser Midivariant-DNS-Matrizen sind in Tabelle III zusammengefaßt. Diese Daten wurden erhalten, indem die Aufnahme von ³²P-CTP in das RNS-Replikationsprodukt gemessen wurde. Diese Daten verdeutlichen, daß das Endprodukt des Ligierungs-Replikationsschemas, siehe Fig. 2, eine Matrize für die Qβ-Replikase ist und daß nur 160 Matrizenmoleküle (MDV-SA2) nachgewiesen werden konnten. Die Replikationsprodukte wurden weiter durch Northern Blotting untersucht, und es wurde beobachtet, daß die eingefügten targetspezifischen Sequenzen zusammen mit den flankierenden Midivariant-Sequenzen repliziert wurden (Daten nicht gezeigt).
Es wurde festgestellt, daß einige der verwendeten Enzympräparationen der Qβ-Replikase DNAse-Kontaminationen enthielten. Diese Kontaminationen können die Replikationssensitivität stören, indem sie die DNS-Matrizen abbauen. Im Falle vorhandener Kontaminationen können alternative Reinigungsschemata oder der Einsatz von DNAse-Inhibitoren erorderlich sein. Ein alternativer Weg, um bessere Replikationssensitivität zu erhalten, ist, ein Enzym zu verwenden, das DNS-Matrizen effizienter als Qβ-Replikase replizieren kann. Die Qβ-Replikase selbst kann durch ortsgerichtete Mutagenese modifiziert werden und so ein effizienteres Enzym bilden.
Die Produkte der Qβ-Replikase mit verschiedenen Midivariant-DNS-Matrizen wurden durch denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese weiter charakterisiert. Die Resultate der Gelelektrophorese von einigen der ³²P-markierten Midivariant-Replikationsprodukte sind in Fig. 5 gezeigt. Midivariant-DNS-Matrizen wurden bei 30ºC zwei Stunden lang. lang mit Qβ-Replikase inkubiert. Proben von jeder Reaktion wurden in Auftragspuffer, der 7 M Harnstoff enthielt, bei 70ºC vor der Elektrophorese 5 Min. lang inkubiert. Die Proben wurden in einem 6%igen Polyacrylamidgel, das 7 M Harnstoff enthielt, in Tris- Borat-EDTA-Puffer elektrophoretisch aufgetrennt. Die Banden wurden nach der Elektrophorese durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Bezugnehmend auf Fig. 5 ist die Reihenfolge der aufgetragenen Proben in den Bahnen (von links nach rechts) folgende: Bahn 1: 123-bp-Leiter (BRL) als Längenmarker; Bahn 2: Kontrolle ohne Matrize; Bahn 3: Replikationsprodukte der pMDV- Matrize; Bahn 4: Replikationsprodukte der MDV-Matrize, Bahn 5: Replikationsprodukte der MDV-CA 116-Matrize, Bahn 6: Replikationsprodukte der MDV-CA 29-Matrize und Bahn 7: Replikationsprodukte der MDV-poly-Matrize. Zusätzlich zu den erwarteten Vollängenreplikationsprodukten wurden für jede Matrize viele zusätzliche Produkte beobachtet, die schneller als die Vollängenprodukte in dem Polyacrylamidgel wanderten. Die schneller wandernden Banden hybridisierten mit Sonden, die komplementär zu Teilen des Midivariant-Plusstranges und -Minusstranges waren (Daten nicht gezeigt).
Die Replikationsprodukte der Midivariant-Matrizen wurden durch Northern Blotting weiter untersucht, um festzustellen, ob die eingefügten Sequenzen zusammen mit den flankierenden Midivariant-Sequenzen repliziert wurden. Diese Blots wurden mit der Campylobacter-spezifischen Sonde PM238 (Promega), siehe Tabelle I, die Matrizen erkennt, die Campylobacter-spezifische Sequenzen enthalten, oder mit der Polylinker-spezifischen Sonde PM905 (Promega), siehe Tabelle I, getestet. Das Replikationsprodukt von MDV-CA 29 und MDV-CA-116 hybridisierte mit PM238, während das Replikationsprodukt von MDV-poly mit PM905 hybridisierte (Daten nicht gezeigt) . Die Ergebnisse zeigen, daß die eingefügten Sequenzen zusammen mit den flankierenden Midivariant-Sequenzen repliziert wird.

BEISPIEL 1

Replikationssensitivität der Midivariant-DNS-Matrizen

Ein Plasmid, das eine Midivariant- (PMDV) -Sequenz und eine 10 bp-Insertion für die Bildung eines Xho I-Linkers enthält, wurde von Promega, Inc., Madison, WI, erhalten. Die Restriktionsstelle ermöglicht die Insertion der gewünschten target- spezifischen Sequenzen an der Base 61 in den Plusstrang der MDV-DNS. Es wurden Klone konstruiert, die das MDV-Plasmid mit verschiedenen Inserts an der Xho I-Stelle enthielten. MDV-DNS- Matrizen wurden durch Pst I/Sma I-Spaltung des gereinigten Plasmids hergestellt und mittels des präparativen Agarosegelelektrophoreseverfahrens gereinigt. Die Konzentration der Matrize wurde anhand der Fluoreszenzintensität der Ethidiumbromid-gefärbten Bande der gereinigten, durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennten Matrize geschätzt. Die Matrize enthielt außerdem eine T7-Promotorsequenz, die die Transkription der Plusstrang-Matrize durch T7-RNS-Polymerase ermöglichte, siehe Fig. 4. Die MDV-DNS-Matrizen wurden durch Inkubation mit 1 N NaOH bei 80ºC während 15 Min. mit Base behandelt und dann mit einem Äquivalent HCl neutralisiert. Diese Behandlung entfernt jegliche anwesende RNS-Kontamination und denaturiert die Matrize zu einzelsträngiger DNS.
Replikationsreaktionen wurden ausgeführt, indem verschiedene Mengen an MDV-DNS-Matrize, die sowohl denaturiert-einzelsträngig als auch natürlich-doppelsträngig vorlag, mit 20 µg/ml Qβ-Replikase (Lot M202, Promega) in 100 mM Tris-HCl, pH- Wert 7,5, 15 mM MgCl&sub2; mit je 1 mM ATP, GTP, UTP und CTP inkubiert wurden. Es wurde Alpha-³²P-CTP (Amersham), 800 Ci/mMol, zugegeben, um eine spezifische Aktivität in der Größenordnung von 10&sup5; cpm/nmol CTP zu erhalten. Die Reaktionen wurden bei 30ºC 2 Stunden lang inkubiert. Der Einbau von ³²P-CTP in das Replikationsprodukt wurde bestimmt, indem ein Aliquot der Reaktionslösung in Gegenwart einer eiskalten 10% Trichloressigsäure/1% Natriumpyrophosphat-Lösung auf einem Glasfaserfilter (Whatman) gefällt wurde. Nicht eingebautes CTP wurde durch Waschen der Filter in eiskalter 5%ige Trichloressigsäure entfernt. Eingebautes CTP wurde in einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Eine Negativkontrolle (keine zugesetzte Matrize) war in den Experimenten enthalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt. Die Experimente zeigen, daß die Replikationssensitivität (Zahl der Matrizen, die durch Replikation nachgewiesen werden konnten) größer oder gleich 500 Matrizenmoleküle bei denaturierter, einzelstrangiger DNS-Matrize und weniger als 200 Matrizenmoleküle bei natürlicher, doppel- strangiger DNS-Matrize beträgt.

BEISPIEL 2

Replikation von Midivariant - Sonden

Verschiedene Fragmente der MDV-DNS des Beispiels 1 wurden auf ihre Fähigkeit als Matrize für die Replikation mit Qβ-Replikase getestet. Für die Synthese der Oligomere wurde der 391-PCR-Mate-DNA-Synthesizer von Applied Biosystems verwendet. Die Oligomere wurden über RP-HPLC gereinigt. Folgende Oligomere wurden synthetisiert:
MB2: Basen 120-221 des Plusstranges der MDV-DNS.
MB1SA1: 24 Basen einer Salmonella-spezifischen Sequenz, verknüpft mit dem 5'-Terminus der Basen 62-119 von MDV-(+)- DNS.
MASA5: 10 Basen einer nicht spezifischen Sequenz, verknüpft mit dem 5'-Terminus der Basen 1-64 von MDV-(+)-DNS, 24 Basen einer Salmonella-Sequenz verknüpft mit dem 3'-Terminus.
MBSA: MB2 und MB1SA1 aneinander ligiert (siehe unten).
MDSA1: 24 Basen einer Salmonella-spezifischen Sequenz, verknüpft mit dem 5'-Terminus der Basen 161-220 von MDV-(-)-

DNS.

MC2SA5: 24 Basen einer Salmonella-spezifischen Sequenz, verknüpft mit dem 3'-Terminus der Basen 85-160 von MDV-(-)- DNS.
Die synthetisch hergestellten Fragmente der MDV-Matrizen wurden als Matrizen für die Qβ-Replikase getestet. Die vermeintlichen Matrizen wurden mit 20 µg/ml Qβ-Replikase (Promega) (Lot M202) in 100 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 15 mM MgCl&sub2; mit je 1 mM ATP, GTP, UTP und CTP bei 30ºC 2 Stunden lang inkubiert. Es wurde Alpha-³²P-CTP (Amersham), 800 Ci/mmol, zugegeben, um eine spezifische Aktivität von ungefähr 10&sup5; cpm/nmol CTP zu erhalten. Der Einbau von CTP wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle IV zusammengefaßt. Die Resultate zeigen, daß bei den untersuchten Mengen keines der Fragmente der MDV- (+)- oder MDV-(-)-DNS als Matrize für die Qβ-Replikase diente.

BEISPIEL 3

Demonstration der Hybridisierungs-Ligierungs-Replikation

PM2058 (Promega), ein synthetisches 48 Basen langes Oligomer mit einer Sequenz, die komplementär zu den Salmonella-Anteilen der Sonden ist, wurde mit 24 µg MASA5-PMP (PMP, Ciba Corning Diagnostics Corp.) und 500 fmol MBSA1 (MB2 und MB1SA1 aneinander ligiert) in 100 µl mit 4x SSC, 10 mM Tris-HCl, pH- Wert 7,5, 0,1 % BSA, 0,02% Tween-20 und 5% Dextransulfat 1 Stunde lang bei 56ºC inkubiert. MBSA1 wurde durch Hybridisierung von 5'-phosphoryliertem MB2 (10 pmol) und MB1SA1 (17 pmol) an ein synthetisches, 33 Nukleotide langes Oligomer hergestellt, das eine komplementäre Sequenz zu Teilen von MB2 und MB1SA1 besitzt. Diese Hybridisierung ordnet die Midivariant- Sequenz am 3'-Terminus von MB1SA1 neben der Midivariant-Sequenz am 5'-Terminus von MB2 an. Diese zwei Oligomere wurden durch T4-DNS-Ligase (Promega) verknüpft. Das ligierte Produkt (MBSA1) wurde aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt und durch präparative, denaturierende 6%ige Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Als Kontrolle ohne Target wurden PMP und MBSA1 alleine ohne PM2058 unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Die PMP wurden dann abgetrennt und der Überstand entfernt. Die PMP wurden zweimal mit 2x SSC/0,1% Tween-20 gewaschen.
Dann wurden die PMP in 100 µl Ligasepuffer (BRL), der 20 E T4-DNS-Ligase (BRL) enthielt, resuspendiert und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Als Kontrolle zur Bestimmung der Notwendigkeit der Ligation wurde eine äquivalente Probe mit hybridisierten PMP in dem Ligasepuffer ohne T4-DNS-Ligase inkubiert. Die PMP wurden abgetrennt und der Überstand entfernt. Die PMP wurden dann zweimal mit 2x SSC/0,1% Tween-20 gewaschen und in 100 µl Wasser resuspendiert.
Ein-µl-Aliquots jeder Ligierungsreaktion wurden mit 20 µg/ml Qβ-Replikase (Lot M202) (Promega) in 100 TNM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 15 mM MgCl&sub2; mit je 1 mM ATP, GTP, UTP und CTP inkubiert. Es wurde Alpha-³²P-CTP (Amersham), 800 Ci/mmol, zugegeben, um eine spezifische Aktivität von ungefähr 10&sup5; cpm/nmol CTP zu erhalten. Der Einbau von CTP wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Replikationsprodukte wurden ebenfalls durch denaturierende 6%ige Polyacrylamidgelelektropho- rese analysiert.
Die Ergebnisse des CTP-Einbaus sind in Tabelle V und die Ergebnisse der Gelelektrophorese sind in Fig. 6 gezeigt. Bezugnehmend auf Fig. 6 ist die Reihenfolge der aufgetragenen Proben in den Bahnen (von links nach rechts) folgende: Bahn 1: 123-bp-Leiter (BRL) als Längenmarker; Bahn 2:Replikationsprodukt der ligierten Matrize; Bahn 3: Replikationsprodukt der PM2058 Minus-Kontrolle; Bahn 4: Replikationsprodukt der Ligase-Minus-Kontrolle. Die Abwesenheit von Replikation in den Negativ-Kontrollen bestätigt die Ergebnisse von Beispiel 2, daß die Sonden unter den Bedingungen des Testassays nicht repliziert werden.

BEISPIEL 4

Sensitivität von aufeinanderfolgender Transkridtion-Replikation

Es wurden Pst I/Sma I-Fragmente der Midivariant-Plasmide, die beispielsweise targetspezifische Insertionen von Salmonella, Shigella und Campylobacter enthalten, hergestellt und Gel-gereinigt. Diese Pst I/Sma I-Fragmente enthalten einen T7- Promotor, mit dem der Plusstrang der Midivariant-Matrize durch die T7-RNS-Polymerse transkribiert werden kann. Verdünnungen der Pst I/Sma I -Fragmente wurden mit 3E/µl T7-RNS-Polymerase (Promega) in 40 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 10 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 2 mM Spermidin, 10 mM Dithiothreitol und je 3 mM ATP, CTP, GTP und UTP 1 Std. lang bei 37ºC in einem Gesamtansatz von 25 µl inkubiert. Ein 2-µl-Aliquot des Transkriptionsreaktionsproduktes wurde dann mit Qβ-Replikase unter Standardreplikationsreaktionsbedingungen wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, allerdings 1 Std. lang bei 37ºC, inkubiert. Der Einbau von CTP wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse der Transkriptions-Replikationsreaktionen sind in Fig. 7, 8 und 9 für MDV-CA83, MDV-SH bzw. MDV- SA2 gezeigt. Diese Daten zeigen, daß Transkription auch bei der geringsten Menge an anwesender Matrize auftritt und daß zwischen 10 und 100 RNS-Kopien pro DNS-Matrize gebildet werden. Die RNS-Transkripte wurden effizient durch Qβ-Replikase repliziert. Die kombinierte Transkription-Replikation erlaubt den Nachweis von nur einem einzigen Matrizenmolekül. TABELLE I TABELLE II REPLIKATION VON MIDIVARIANT-PLASMIDFRAGMENTEN TABELLE III REPLIKATIONSSENSITIVITÄT VON DNS-MATRIZEN
¹Die Matrize wurde durch Reinigung des Pst I/Sma I-Fragmentes des entsprechenden Midivariant-Plasmids isoliert.
²Das Restriktionsfragment wurde durch Basenhehandlung denaturiert.
³Diese Matrize wurde nicht basenhehandelt. TABELLE IV REPLIKATION VON MIDIVARIANT-FRAGMENTEN TABELLE V EINBAU VON CTP IN REPLIKATIONSPRODUKTE
¹Die Menge an Matrize (1fmol) flir die Probe der ligierten Matrize ist dieGesamtmenge der Matrize in der Repiikationsreaktion unter der Annahme, daß die Hybridisierungs- und Ligierungsschritte zu 100% effizient waren.
²Die Menge des eingebauten CTP ist für ein 5µl Aliquot der Replikationsreaktion aus einem totalen Volumen von 50 µl angegeben.

Claims

1. Amplifizierungsverfahren zum Nachweis des Vorliegens einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe, dadurch gekennzeichnet, daß es die nachfolgenden Schritte umfasst:

Hybridisierung wenigstens zweier Midivariant-DNS/Sonden- Konjungate an eine Target-Nukleinsäuresequenz, wobei jedes Konjugat einen distinkten nicht replizierbaren Anteil einer Midivariant-DNS und eine distinkte targetspezifische Nukleinsäuresequenz, die zu einer Target-Nukleinsäuresequenz in der Testprobe komplementär ist, enthält; Ligieren der Konjugate zur Bildung einer replizierbaren DNS-Matrize; und Replizieren dieser Matrize.

2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Nachweis des Replikationsprodukts, wobei die Nachweismethode bevorzugt die Verwendung einer Wellenleiter- oder Radioisotopentechnik oder einer Chemilumineszenzmethode umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei wenigstens ein Konjugat einen angehängten Polymerase-Promotor, bevorzugt einen T7 RNA-Polymerase-Promotor, enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, das weiterhin die Transkription der Midivariant-DNS-Matrize zu RNA vor der Replikation umfaßt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, wobei die Replikation durch Qβ-Replicase katalysiert wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5, wobei die Hybridisierung der Midivariant-DNS/Sonden-Konjugate an die Target-Nukleinsäuresequenz die aneinanderliegende Ausrichtung (Alignment) der Sonden bewirkt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 6, wobei die Sonden durch T4 DNS-Ligase ligiert werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, wobei wenigstens ein Midivariant-DNS/Sonden-Konjugat auf einem Festträger, der bevorzugt ein paramagnetisches Teilchen umfaßt, immobilisiert wird, wobei das Konjugat wahlweise vor oder nach der Ligierung der Sonden von der Festphase freigesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei nach der Hybridisierung die hybridisierten Midivariant-DNS/Sonden-Konjugate von den nicht hybridisierten Midivariant-DNS/Sonden-Konjugaten und anderen Bestandteilen der Testprobe durch magnetische Abtrennung abgetrennt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 9, wobei der nicht replizierbare Anteil der Midivariant-DNS die ersten 61 Nukleotide des 5'-Endes der Midivariant-(+)-DNS und der andere, nicht replizierbare Anteil der Midivariant-DNS die verbleibenden 3'-Nukleotide der Midivariant-(+)-DNS umfaßt; oder wobei der nicht replizierbare Anteil der Midivariant- DNS die ersten 61 Nukleotide des 3'-Endes der Midivariant(-)-DNS umfaßt und wobei der andere, nicht replizierbare Anteil der Midivariant-DNS die verbleibenden 5'-Nukleotide der Midivariant-(-)-DNS umfaßt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 10, wobei wenigstens ein Konjugat weiterhin eine nicht spezifische Basensequenz an seinem 5'-Terminus umfaßt, wobei die nicht spezifische Basensequenz wenigstens ein Nukleotid enthält und wobei wenigstens ein Nukleotid eine reaktive Gruppe, bevorzugt ein primäres Amin, enthält.

12. Verfahren zum Nachweis einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe, dadurch gekennzeichnet, daß es die nachfolgenden Schritte umfaßt:

(a) in Kontakt bringen der Target-Nukleinsäuresequenz mit zwei Midivariant-DNS/Sonden-Konjugaten unter Rybridisierungsbedingungen, wobei jedes Konjugat eine distinkte, zur Target-Nukleinsäuresequenz komplementäre Nukleinsäuresequenz und einen distinkten, nicht replizierbaren Anteil der Midivariant-DNS umfaßt, wobei bei Hybridisierung der Konjugate die Sonden aneinanderliegend ausgerichtet werden;

(b) Ligieren der Sonden unter Bildung einer Matrize;

(c) Transkribieren der DNS-Matrize in RNA;

(d) Replizieren des RNA-Transkripts; und

(e) Nachweis des Replikationsprodukts von (d).

13. Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß es eine targetspezifische Nukleinsäuresequenz, bevorzugt mit einem Oligonukleotid, wobei die targetspezifische Nukleinsäuresequenz bevorzugt zu einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe unter Hybridisierungsbedingungen komplementär ist, und einen nicht replizierbaren Anteil der Midivariant-DNS umfaßt, wobei das Konjugat ein Bestandteil eines Amplifizierungsverfahrens nach einem der Ansprüche 1 - 11 ist.

14. Konjugatpaar zum Nachweis einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

(a) ein erstes Konjugat mit einer targetspezifischen Nukleinsäuresequenz und einem nicht replizierbaren Anteil der Midivariant-DNS; und

(b) ein zweites Konjugat mit einer targetspezifischen Nukleinsäuresequenz und einem nicht replizierbaren Anteil der Midivariant-DNS, wobei die target- spezifischen Nuleinsäuresequenzen der ersten und zweiten Konjugate wechselseitig distinkt und beide Sequenzen zu dem gleichen, aneinanderliegend anzuordnenden Target unter Hybridisierungsbedingungen komplementär sind, so daß die Target-Nukleinsäuresequenzen ligierbar sind, und die nicht replizierbaren Anteile der Midivariant-DNS der ersten und zweiten Konjugate wechselseitig distinkt sind.

15. Testkit zum Nachweis einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:

(a) eine Lösung zur Freisetzung der Target-Nukleinsäuresequenz und

(b) zumindest zwei Konjugate, von denen zumindest eines wie in Anspruch 13 oder Anspruch 14 beansprucht ist, wobei beide Konjugate eine distinkte targetspezifische Nukleinsäuresequenz aufweisen, die unter Hybridisierungsbedingungen zur Target-Nukleinsäuresequenz komplementär sind; und einen distinkten, nicht replizierbaren Anteil der Midivariant-DNS.