CN116024308A - 肺癌相关基因高通量扩增子文库的制备方法、多重pcr引物对及应用 - Google Patents

肺癌相关基因高通量扩增子文库的制备方法、多重pcr引物对及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高通量测序技术领域，尤其是涉及肺癌相关基因高通量扩增子文库的制备方法、多重PCR引物对及应用。(1)本发明能够通过一步多重PCR和一步产物磁珠纯化步骤即可完成肺癌相关基因文库制备，大大缩短了高通量测序文库的操作步骤和实验时间。由于不需要使用更多的PCR和纯化试剂，可以更大地降低实验成本。在减少PCR和磁珠纯化步骤的同时，降低了实验过程中样本多次加样和多次纯化带来的气溶胶污染，可以提高检测结果的准确性。(2)本发明含有双端标签序列，可以比只有单端标签序列的文库进行更严格的数据拆分质控，从而能降低拆分样本的数据污染，提高数据质控的准确性。(3)本发明制备的文库含有5’端磷酸化修饰，可不通过文库接头转换试剂，就能兼容用于下游的Illumina和华大测序平台上机测序，具有更多的仪器型号拓展适配性。综上来看，本发明具有操作简便、成本更低、时间更快、适用平台更广泛和文库污染率更低等效果。

Description

肺癌相关基因高通量扩增子文库的制备方法、多重PCR引物对及应用
本发明为分案申请，母案申请号为2022115394195，主题名称为高通量扩增子文库的制备方法、多重PCR引物对及应用，申请日为2022年12月02日。
技术领域
本发明涉及高通量测序技术领域，尤其是涉及肺癌相关基因高通量扩增子文库的制备方法、多重PCR引物对及应用。
背景技术
高通量测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术由于可以对样本进行高通量、并行大规模测序，相比传统的一代测序、qPCR等技术，可以同时对更多基因组区域进行研究，且灵敏度更高、成本更低。扩增子测序(Amplicon Sequencing)方法是测序文库制备的一种，相比常规的杂交捕获文库则不需要经过基因组片段化、末端修复、3’加A尾、连接接头、探针杂交捕获、目标区域富集和产物纯化等繁琐的过程。研究者可以通过更短的时间、更低的成本，只对需要研究的基因区域进行扩增，即可获得目标区域文库产物，进行快速的高通量测序。
杂交捕获文库制备的原理是人工设计探针(DNA探针或者RNA探针)，探针可以和目标区段部分或者全部互补。将样本和探针混合，探针会将目标区段捕获，未设计探针的区段会被洗脱丢弃，之后通过变性(一般是调节pH值到碱性)将探针和捕获区段分开，被捕获的片段即可进行二代测序文库构建。优点：捕获区段大，可以达到几百MB，远超PCR方案和MIP方案，同时根据探针的原理其均一性很好，均一性是评价捕获技术很关键的参数，均一性好后续测序成本就会下降。缺点：容易捕获非目标片段，造成成本增加。因为杂交前样本会被随机打断一般认为500bp是比较合适的长度，探针捕获时可能和目标片段部分杂交，导致一些含有部分目标区段的片段被捕获。所以杂交捕获的特异性较差，容易捕获非目标区段。
扩增子靶向测序技术，又称多重PCR靶向测序技术，是一种将多重PCR技术与二代测序技术相结合的一种靶向捕获测序技术。该技术首先利用多重PCR反应，同时扩增多个目标区域序列，得到扩增子产物，然后通过PCR反应或者酶连接反应，将二代测序所需的接头序列引入到扩增子产物的两侧，得到扩增子文库，然后进行二代测序和生信流程分析，获取目标区域的序列信息，实现目标区域序列检测的目的。其特点是目的明确、应用灵活、价格低廉、分析简单，利用超高的测序深度，能检测全基因组、外显子组测序所不能涵盖的超低频突变，广泛应用于大健康筛查、医学诊断、分子育种、法医等领域。
常见的操作流程是：第一步以1～100ng DNA为模板，利用多重PCR扩增感兴趣的目标区域并构建扩增子，第二步，对产物进行纯化以及混合产物，为接头连接做好准备，第三步通过通用引物扩增，把完整的测序接头带上，再进行纯化。
目前的扩增子测序在文库制备时，通常先经过第一轮的多重PCR把目标区域扩增出来，经过产物的纯化后，再以纯化后的产物作为模板进行第二轮的PCR扩增，把测序的接头及标签序列加在文库序列的两端，然后再经过一次产物纯化后才能进行质检后上机测序。该流程存在实验步骤较多、操作时间较长、容易引入样本交叉污染等缺陷。
此外，也有直接用连接法加上测序接头的扩增子测序操作。简要步骤是先通过第一轮多重PCR把目标区域扩增出来，经过产物纯化后，利用连接反应将测序的接头序列连接到目标片段两侧，形成完成的文库结构，然后再经过一轮PCR进行文库扩增加上不同的标签序列，再对PCR产物进行纯化。该流程同样存在多次PCR和多次的产物纯化操作，操作时间较长等问题。该种连接法加测序接头的应用常出现在杂交捕获的靶向测序文库制备中。例如专利文献CN111748551B、CN202111152079采用了连接反应添加测序接头的方法，它们需要在接头连接后进行片段筛选和PCR扩增以及产物纯化操作，这种操作步骤多、时间长，容易带来更多的操作失误等问题。
以上两步法PCR和接头连接法虽然能够在第二步PCR或连接反应中加上接头序列，但是操作上需要更多的实验步骤和操作时间，引入污染的可能性也更大。
目前，也有一步法PCR制备扩增子测序文库的方法，虽然能够解决一步PCR快速制备文库的目的，但是仍存在一些问题。例如专利文献CN201410499918记载的方法，只能制备带有单端标签序列的文库，不利于样本混合的数量扩展；相比双端标签序列的文库，只能通过单端标签序列来拆分下机的测序数据，会导致更高的样本之间交叉污染的出现。又如专利文献CN201710218529所述方法，通过把两轮PCR的引物按比例混合一起实现了一步PCR操作，但是导致了PCR反应体系配制的操作更为复杂，需要添加更多的组分来控制PCR反应，成本也相对更高。
因此这些文库制备的方法在降低文库污染率、简化反应体系、拓展文库测序平台等方面，仍有需要改进的地方。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种快速制备肺癌相关基因扩增子文库的方法，期望该方法可以仅经过一步多重PCR扩增，制备出带有双端标签序列的文库。通过该方法，可以实现操作简便、成本更低、时间更快、适用平台更广泛、文库污染率更低等效果。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供肺癌相关基因扩增子文库的制备方法，使用多重PCR方法对样本中的肺癌相关基因进行扩增，而后仅经过一步纯化获得扩增子文库；
所述多重PCR使用的引物对包括如下上游引物和下游引物：
上游引物的核苷酸序列从5’端至3’端依次为：5’-正向接头序列-标签序列1-正向测序引物序列-肺癌相关基因扩增的特异性正向引物序列-3’；
下游引物的核苷酸序列从5’端至3’端依次为：5’-反向接头序列-标签序列2-反向测序引物序列-肺癌相关基因扩增的特异性反向引物序列-3’；
所述标签序列1和标签序列2为互相不同的6～10bp的核苷酸片段。
在可选的实施方式中，所述正向接头序列如SEQ ID No：1(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC)所示；所述反向接头序列如SEQ ID No：2(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT)所示。
在可选的实施方式中，所述正向测序引物序列如SEQ ID No：3(ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)所示；所述反向测序引物序列如SEQ ID No：4(GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)所示。
在可选的实施方式中，所述上游引物和/或下游引物的5’端具有磷酸化修饰。
在可选的实施方式中，所述同一样本的目标扩增区域的数量≥1。
在可选的实施方式中，所述同一样本中目标扩增区域的数量＞1，不同目标扩增区域所使用的上游引物和下游引物具有相同的标签序列组合。
在可选的实施方式中，不同样本所使用的上游引物和下游引物具有不同的标签序列组合。
在可选的实施方式中，所述样本包括来源于全血、血浆、唾液、组织、福尔马林固定样本、石蜡包埋样本或穿刺样本中的DNA样本或RNA样本。
在可选的实施方式中，所述多重PCR反应程序依次包括：
98℃下反应5min循环1次；
98℃下反应10s，60℃下反应15s，72℃下反应20s，并循环30次；
72℃下反应5min，循环1次；
4℃下保温，循环1次；
所述多重PCR反应的体系包括，PCR反应预混液、引物混合物、DNA模板和无酶水。
第二方面，本发明提供肺癌相关基因的多重PCR引物对，所述多重PCR引物对应用于前述实施方式任一项所述制备方法，用于制备肺癌相关基因扩增子文库；
所述多重PCR引物对靶向基因为第二十外显子HER2基因、第十八外显子EGFR基因、第十九外显子EGFR基因、第二十外显子EGFR基因或第二十一外显子EGFR基因中的至少一种。
优选地，靶向第二十外显子HER2基因的多重PCR引物对包括，核苷酸序列如SEQ IDNo：57或SEQ ID No：58所示正向引物中至少一条，和核苷酸序列如SEQ ID No：59或SEQ IDNo：60所示反向引物中至少一条。
优选地，靶向第十八外显子EGFR基因的多重PCR引物对包括，核苷酸序列如SEQ IDNo：61或SEQ ID No：62所示正向引物中至少一条，和核苷酸序列如SEQ ID No：63或SEQ IDNo：64所示反向引物中至少一条。
优选地，靶向第十九外显子EGFR基因的多重PCR引物对包括，核苷酸序列如SEQ IDNo：65或SEQ ID No：66所示正向引物中至少一条，和核苷酸序列如SEQ ID No：67或SEQ IDNo：68所示反向引物中至少一条。
优选地，靶向第二十外显子EGFR基因的多重PCR引物对包括，核苷酸序列如SEQ IDNo：69或SEQ ID No：70所示正向引物中至少一条，和核苷酸序列如SEQ ID No：71或SEQ IDNo：72所示反向引物中至少一条。
优选地，靶向第二十一外显子EGFR基因的多重PCR引物对包括，核苷酸序列如SEQID No：73或SEQ ID No：74所示正向引物中至少一条，和核苷酸序列如SEQ ID No：75或SEQID No：76所示反向引物中至少一条。
第三方面，本发明提供采用前述实施方式任一项所述的制备方法得到的肺癌相关基因扩增子文库或前述实施方式任一项所述的多重PCR引物对在肺癌相关基因的非诊断目的的扩增中的应用；
优选地，所述非诊断目的的扩增包括肺癌相关基因的富集或纯化。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明能够通过一步多重PCR和一步产物磁珠纯化步骤即可完成肺癌相关基因文库制备，大大缩短了高通量测序文库的操作步骤和实验时间。由于不需要使用更多的PCR和纯化试剂，可以更大地降低实验成本。在减少PCR和磁珠纯化步骤的同时，降低了实验过程中样本多次加样和多次纯化带来的气溶胶污染，可以提高检测结果的准确性。
(2)本发明含有双端标签序列，可以比只有单端标签序列的文库进行更严格的数据拆分质控，从而能降低拆分样本的数据污染，提高数据质控的准确性。
(3)本发明制备的文库含有5’端磷酸化修饰，可不通过文库接头转换试剂，就能兼容用于下游的Illumina和华大测序平台上机测序，具有更多的仪器型号拓展适配性。
综上来看，本发明具有操作简便、成本更低、时间更快、适用平台更广泛和文库污染率更低等效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一步法多重PCR文库制备原理；
图2为本发明实施例1中多重PCR扩增产物的凝胶电泳图；
图3为本发明实施例1中制备的扩增子文库产物片段分布图；
图4为本发明实施例3中BRAF c.1799T>A p.V600E位点测序的IGV结果；
图5为本发明实施例3中TERT c.1-124C>T(C228T)位点测序的IGV结果；
图6为本发明实施例3中TERT c.1-136C>T(C250T)位点测序的IGV结果；
图7为本发明实施例5中EGFR exon 20c.2369C>T p.T790M位点测序的IGV结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1：甲状腺癌相关基因检测的引物组及文库制备
提供一种快速、准确、一次性检测甲状腺癌相关基因的多个变异位点的引物组及文库制备方法。采用一步法多重PCR对4份甲状腺癌患者的FFPE样本制备测序文库，具体过程如下：
1、核酸提取：使用FFPE固定组织DNA提取试剂盒(康为世纪，CWY017)提取FFPE样本中的基因组DNA，具体步骤参照试剂盒操作说明，使用NanoDrop和Qubit3.0检测提取的DNA纯度和浓度，将DNA浓度稀释为10ng/ul。
2、设计并合成引物：以甲状腺癌相关基因BRAF和TERT的2个目标区域扩增为例，分别设计2条上游引物和2条下游引物。所包括的甲状腺癌相关基因检测位点、引物组合及序列见下表：
Figure BDA0004112590870000041
其中上游引物5’端带有磷酸化修饰，从5’端至3’端的顺序依次为接头序列、标签序列、测序引物序列、目标片段扩增的特异性正向引物序列，同一目标片段扩增的上游引物有2条，它们的正向特异性引物序列相同，区别在于标签序列不同。下游引物从5’端至3’端的顺序依次为接头序列、标签序列、测序引物序列、目标片段扩增的特异性反向引物序列，同一目标片段扩增的下游引物有2条，它们的反向特异性引物序列相同，区别在于标签序列不同。组成同一目标片段扩增的上游引物和下游引物中的4种标签序列各不相同。
不同目标片段扩增的正向引物中的标签序列有对应的相同序列，如第一个目标片段的第一条上游引物的正向标签序列与第二个目标片段的第一条上游引物的正向标签序列相同。不同目标片段扩增的反向引物中的标签序列也有对应的相同序列，如第一个目标片段的第一条下游引物的反向标签序列与第二个目标片段的第一条下游引物的反向标签序列相同；
根据目标片段扩增的2条上游引物和2条下游引物中标签序列的不同，可以构成2*2的4种标签序列组合，见下表：
标签组合 上游引物F 下游引物R
1 正向标签序列1 反向标签序列1
2 正向标签序列1 反向标签序列2
3 正向标签序列2 反向标签序列1
4 正向标签序列2 反向标签序列2
需要说明的是，可以根据上下游引物标签序列的不同设计更多的标签序列组合，包括但不限于本实施例中的4种组合。
3、配制多重PCR的引物混合液：将合成的引物稀释成100uM的保存液，根据上述4种不同的标签序列组合，将2种目标片段的各条引物按照标签序列的组合分为4组。
以第1种标签组合的配制为例，把2种目标片段的4条引物按照TERT 1F：TERT 1R：BRAF 1F：BRAF 1R摩尔比为2：2：1：1的比例进行混合。另外3种标签组合的配制依次类推，配比与此相同。由此得到用于制备多重PCR文库的4种引物组合。
4、进行一步法多重PCR扩增
取4例样本DNA分别用以上4种引物组合进行多重PCR扩增，制备扩增子文库。多重PCR反应程序按照下述进行：
Figure BDA0004112590870000051
多重PCR反应体系按照下述进行：
组分 用量
PCR反应预混液 10μL
引物混合物 4.8μL
DNA模板 2μL
无酶水 补足至20μL
所述PCR反应预混液为2X KAPA2G Fast Multiplex Mix，引物混合物为不同目标区域扩增所需要的多重引物组合物，其测序原理如图1所示。
5、文库纯化及质检：把PCR结束后的文库用Agencourt AMPure XP Kit(BeckmanCoulter，A63880/A63881/A63882)进行磁珠纯化，按照试剂盒说明书进行操作。将纯化后的文库用Qubit进行文库浓度测定。使用Agilent 2100Bioanalyzer或QSEP 100等同物进行文库片段质控，文库主要片段分布约220～350bp，如图2所示，无明显小片段和大片段杂峰，如图3所示，即为合格文库。
实施例2：用不同的测序平台进行测序验证
把实施例1得到的文库按照Illumina和BGI/MGI测序平台的配套试剂说明书分别进行上机测序操作。对下机数据进行生物信息分析之后，得到检测基因的变异情况。数据处理包括质控、序列比对(参考基因组为NCBI GRCh38/Hg38)、突变位点分析等过程，通过数据处理分析后得到检测样本的突变信息，质控结果见下表：
Figure BDA0004112590870000061
从上机测序得到的质控数据可以看出Illumina和BGI/MGI测序平台的测序结果Q20均大于95％、Q30均大于80％，mapped_rate均大于95％，说明采用本发明制备的文库能够兼容Illumina和BGI/MGI测序平台，比现有公开的一步法PCR文库具有更多的测序仪器平台拓展适配性。
实施例3：用一代测序进行验证
对实施例1中高通量测序发现的存在突变位点的样本进行Sanger测序验证，比较高通量测序的准确性，验证结果下表：
Figure BDA0004112590870000062
*SUB：置换；WT：野生型
BRAF c.1799T>Ap.V600E位点测序的IGV结果如图4所示，TERT c.1-124C>T(C228T)位点测序的IGV结果如图5所示，TERT c.1-136C>T(C250T)位点测序的IGV结果如图6所示。对比结果发现，使用该发明所述引物及检测方法进行高通量测序的结果与Sanger测序法一致性达到100％。
实施例4：与两轮PCR法建库的对比
对实施例1种的4例样本进行2轮PCR扩增制备文库，简要步骤如下：
(1)第一轮多重PCR反应程序按照下述进行：
Figure BDA0004112590870000063
多重PCR反应体系按照下述进行：
组分 用量/
PCR反应预混液 10μL
引物混合物 4.8μL
DNA模板 2μL
无酶水 补足至20μL
(2)PCR产物纯化：把PCR结束后的多重PCR产物用Agencourt AMPure XP Kit(Beckman Coulter，A63880/A63881/A63882)进行1X磁珠纯化，按照试剂盒说明书进行操作，最后用12μL无核酸酶水洗脱，把洗脱产物转移到新的0.2ml PCR管中，进行第二轮PCR扩增。
(3)第二轮PCR扩增：反应程序按照下述进行：
Figure BDA0004112590870000071
多重PCR反应体系按照下述进行：
组分 用量/
PCR反应预混液 25μL
接头P5-F* 1
接头P7-R* 1
第一轮PCR纯化产物 12μL
无酶水 补足至50μL
*注：不同的样本使用不同的标签编号P5和P7接头引物，引物混合物为不同目标区域扩增所需要的多重引物组合物，序列见下表：
Figure BDA0004112590870000072
其中，N表示标签序列的碱基(A，G，C或T)，不同的样本使用不同的标签序列引物。
(4)第二轮PCR产物的纯化：用Agencourt AMPure XP Kit(Beckman Coulter，A63880/A63881/A63882)进行0.9X磁珠纯化，按照试剂盒说明书进行操作，最后用30μL无核酸酶水洗脱。将纯化后的文库用Qubit进行文库浓度测定。使用Agilent 2100Bioanalyzer或QSEP 100等同物进行文库片段质控，文库主要片段分布约220～350bp，无明显小片段和大片段杂峰，即为合格文库。
(5)上机测序：将质检通过的文库，稀释到合适的浓度，参照测序操作说明书进行上机测序。
(6)生信分析：对测序结果利用生物信息软件进行分析和注释，通过数据处理分析后得到检测样本的突变信息。把两轮PCR的文库测序结果与实施例1中一步法PCR制备的文库测序质控结果进行对比，如下表：
Figure BDA0004112590870000081
从测序得到的质控数据可以看出，本发明的一步法PCR和两步法PCR的扩增子文库测序结果中Q20和Q30基本一致，但是本发明的mapped_rate则普遍高于两步法PCR的测序结果。说明采用本发明制备的文库能达到两步法PCR的测序结果，且在有效数据比对率上要优于两步法PCR的数据，具有更高的防污染控制能力。
实施例5：一种肺癌相关基因检测的引物组及文库制备方法
提供一种快速、准确、一次性检测肺癌相关基因的多个变异位点的引物组及文库制备方法。步骤如下：
1、本实施例所包括的肺癌相关基因的检测位点、引物组及序列见下表：
Figure BDA0004112590870000082
Figure BDA0004112590870000091
Figure BDA0004112590870000101
Figure BDA0004112590870000111
2、参考实施例1的步骤进行文库制备。利用本实施例所述引物组合对1例非小细胞肺癌阳性样本(LC)和1例阴性样本(NC)分别进行5次重复检测。检测方法按照实施例1的步骤进行。将得到的文库进行测序分析，质控结果如下：
Figure BDA0004112590870000112
对2例样本的EGFR exon 20c.2369C>T p.T790M突变位点的检出结果分别进行统计，结果如下：
Figure BDA0004112590870000113
从质控结果来看，Q20均大于95％、Q30均大于80％、mapped_rate均大于95％，1000X的测序深度覆盖率均能达到100％，说明采用本发明制备的肺癌相关基因文库具有较好的检测重复性。从样本的EGFR exon 20c.2369C>T p.T790M突变位点的检测符合率(如图7所示)都能达到100％来看，说明采用本发明制备的肺癌相关基因文库具有较好的分析性能准确性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.肺癌相关基因扩增子文库的制备方法，其特征在于，使用多重PCR方法对样本中的肺癌相关基因进行扩增，而后仅经过一步纯化获得扩增子文库；
所述多重PCR使用的引物对包括如下上游引物和下游引物：
上游引物的核苷酸序列从5’端至3’端依次为：5’-正向接头序列-标签序列1-正向测序引物序列-肺癌相关基因扩增的特异性正向引物序列-3’；
下游引物的核苷酸序列从5’端至3’端依次为：5’-反向接头序列-标签序列2-反向测序引物序列-肺癌相关基因扩增的特异性反向引物序列-3’；
所述标签序列1和标签序列2为互相不同的6～10bp的核苷酸片段。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正向接头序列如SEQ ID No：1所示；所述反向接头序列如SEQ ID No：2所示。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正向测序引物序列如SEQ ID No：3所示；所述反向测序引物序列如SEQ ID No：4所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述上游引物和/或下游引物的5’端具有磷酸化修饰。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，同一样本的肺癌相关基因的数量≥1；
优选地，同一样本中肺癌相关基因的数量＞1，不同肺癌相关基因所使用的上游引物和下游引物具有相同的标签序列组合。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，不同样本所使用的上游引物和下游引物具有不同的标签序列组合。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述样本包括来源于全血、血浆、唾液、组织、福尔马林固定样本、石蜡包埋样本或穿刺样本中的DNA样本或RNA样本。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多重PCR反应程序依次包括：
98℃下反应5min循环1次；
98℃下反应10s，60℃下反应15s，72℃下反应20s，并循环30次；
72℃下反应5min，循环1次；
4℃下保温，循环1次；
所述多重PCR反应的体系包括，PCR反应预混液、引物混合物、DNA模板和无酶水。
9.肺癌相关基因的多重PCR引物对，其特征在于，所述多重PCR引物对应用于权利要求1～8任一项所述制备方法，用于制备肺癌相关基因扩增子文库；
所述多重PCR引物对靶向基因为第二十外显子HER2基因、第十八外显子EGFR基因、第十九外显子EGFR基因、第二十外显子EGFR基因或第二十一外显子EGFR基因中的至少一种；
优选地，靶向第二十外显子HER2基因的多重PCR引物对包括，核苷酸序列如SEQ ID No：57或SEQ ID No：58所示正向引物中至少一条，和核苷酸序列如SEQ ID No：59或SEQ ID No：60所示反向引物中至少一条；
优选地，靶向第十八外显子EGFR基因的多重PCR引物对包括，核苷酸序列如SEQ ID No：61或SEQ ID No：62所示正向引物中至少一条，和核苷酸序列如SEQ ID No：63或SEQ ID No：64所示反向引物中至少一条；
优选地，靶向第十九外显子EGFR基因的多重PCR引物对包括，核苷酸序列如SEQ ID No：65或SEQ ID No：66所示正向引物中至少一条，和核苷酸序列如SEQ ID No：67或SEQ ID No：68所示反向引物中至少一条；
优选地，靶向第二十外显子EGFR基因的多重PCR引物对包括，核苷酸序列如SEQ ID No：69或SEQ ID No：70所示正向引物中至少一条，和核苷酸序列如SEQ ID No：71或SEQ ID No：72所示反向引物中至少一条；
优选地，靶向第二十一外显子EGFR基因的多重PCR引物对包括，核苷酸序列如SEQ IDNo：73或SEQ ID No：74所示正向引物中至少一条，和核苷酸序列如SEQ ID No：75或SEQ IDNo：76所示反向引物中至少一条。
10.采用权利要求1～8任一项所述的制备方法得到的扩增子文库或权利要求9所述的多重PCR引物对在肺癌相关基因的非诊断目的的扩增中的应用；
优选地，所述非诊断目的的扩增包括肺癌相关基因的富集或纯化。
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