CN108060261A

CN108060261A - 一种对玉米snp标记组合进行捕获测序的方法及其应用

Info

Publication number: CN108060261A
Application number: CN201810089343.8A
Authority: CN
Inventors: 邹继军; 卢东林; 阮详经; 谈存梅; 李晓鹏
Original assignee: YUAN LONGPING HIGH-TECH AGRICULTURE Co Ltd
Current assignee: YUAN LONGPING HIGH-TECH AGRICULTURE Co Ltd
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2038-01-30
Also published as: CN108060261B

Abstract

本发明涉及分子生物学与生物信息学领域，具体公开了一种对玉米SNP标记组合进行捕获测序的方法及其应用。本发明通过筛选可覆盖玉米10条染色体的904个SNP标记，并通过两步PCR完成捕获过程，所采用的建库方法可以兼容Illumina HiseqX二代测序平台，采用2*150测序模式，对捕获片段进行高通量测序，其成本是现有捕获测序技术四分之一。相对于其它SNP标记基因型分型技术，例如芯片检测和单个SNP位点检测的KASP技术，本发明的检测成本是其十分之一甚至更低，在实际育种过程中具有广泛的应用前景。

Description

一种对玉米SNP标记组合进行捕获测序的方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物信息学领域，具体地说，涉及一种对玉米SNP标记组合进行捕获测序的方法及其应用。

背景技术

分子标记技术的发展经历了第一代分子标记(以RFLP，RAPD，AFLP为代表)，第二代分子标记(以SSR为代表)和第三代分子标记(以SNP为代表)三个阶段。目前SNP标记是应用前景最为广泛的分子标记类型。SNP标记具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点。

目前在玉米中获得SNP位点基因型的方法有重测序、外显子捕获测序、GBS(Genotyping By Sequencing)、芯片检测、KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)检测等。通过以上方法可以获得不同数目和密度的SNP标记的基因型。通过测序和芯片的方法可以针对一个样品获得数以万计的SNP标记基因型，但是这些方法获得单个样品的SNP标记基因型的成本很高，难以在实际育种过程中得到大范围的应用。KASP等技术对于单一或若干个SNP标记进行检测具有很高的灵活性，但是对于大量SNP标记的检测其成本也随之大幅增加。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种对玉米SNP标记组合进行捕获测序的方法及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种对玉米SNP标记组合进行捕获测序的方法，包括如下步骤：

(1)针对表1～表3中904个SNP标记，设计904对引物用于分别扩增包含所述SNP标记在内的序列；

(2)以待测玉米基因组DNA为模板，利用所述904对引物进行多重PCR扩增；

(3)以步骤(2)得到的扩增产物为模板，利用上海茂槿生物技术公司设计的带有illumina测序接头的上游引物，与带有illumina测序接头和样品barcode的下游引物，进行第二轮扩增，得到连接有测序接头和样品barcode的扩增产物；

其中，所述带有illumina测序接头的上游引物如SEQ ID NO.1所示；所述带有illumina测序接头和样品barcode的下游引物如SEQ ID NO.2～13所示，择其一使用即可。

(4)利用illumina二代测序仪对步骤(3)所得扩增产物进行高通量测序，通过生物信息学方法对测序数据进行分析获取待测玉米SNP标记的基因型。

与现有技术相比，本发明所述方法可以兼容Illumina HiseqX二代测序平台，采用2*150测序模式，对捕获片段进行高通量测序，其成本是现有捕获测序技术四分之一。相对于其它SNP标记基因型分型技术，例如芯片检测和单个SNP位点检测的KASP技术，本发明的检测成本是其十分之一甚至更低，在实际育种过程中具有广泛的应用前景。

第二方面，本发明提供了所述方法在玉米种质资源遗传结构分析中的应用，利用Powermarker软件对获取的待测玉米SNP标记的基因型数据进行处理，剔除缺失率>20％，杂合率>20％，MAF>0.05的SNP位点；利用筛选出的SNP标记基因型数据计算不同玉米材料之间的遗传距离，根据neighbor-jointing聚类模型或者UPGMA(Unweighted Pair GroupMethod Arithmetic Average)聚类模型进行聚类分析，利用MEGA6.0软件对聚类结果进行编辑。利用Tassel软件对筛选出的基因型数据进行PCA计算。利用R软件进行PCA作图。

本发明还提供了所述方法在玉米分子标记辅助背景选择中的应用，通过获取待测玉米SNP标记的基因型，将回交群体中每个玉米单株的基因型分别与轮回亲本的基因型进行比较，计算每个玉米单株的背景回复率。挑选背景回复率最高的单株与轮回亲本进行下一次回交。

本发明还提供了所述方法在玉米品种鉴定中的应用，获取待鉴定玉米品种和对比玉米品种的样品DNA，利用panel对样品DNA进行基因型鉴定，将待鉴定玉米品种的基因型与对比品种的基因型进行比较，计算待鉴定玉米品种与对比品种的相似度。

本发明还提供了所述方法在玉米全基因组关联分析中的应用。

第三方面，由于本发明筛选的玉米SNP标记组合也属于本发明的保护范围。所述SNP标记组合包括904个SNP标记，如表1～表3所示。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明通过筛选可覆盖玉米10条染色体的904个SNP标记，并通过两步PCR完成捕获过程，所采用的建库方法可以兼容Illumina HiseqX二代测序平台，采用2*150测序模式，对捕获片段进行高通量测序，其成本是现有捕获测序技术四分之一。相对于其它SNP标记基因型分型技术，例如芯片检测和单个SNP位点检测的KASP技术，本发明的检测成本是其十分之一甚至更低，在实际育种过程中具有广泛的应用前景。

本发明首次将捕获测序panel应用于种质遗传资源结构分析和背景选择中，降低了成本，并获得了较高的检测准确率。

附图说明

图1为本发明所述SNP标记在染色体上的分布。

图2为利用本发明方法对217份玉米自交系的聚类分析结果。

图3为利用本发明方法对217份玉米自交系的PCA分析结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本发明所述SNP标记组合包括904个SNP标记，均匀分布于玉米10条染色体。其中：412个SNP标记来源于现有技术已公开的397份玉米自交系的测序数据(CN107090504A)，403个SNP标记来源于illumina GoldenGate 1536SNP芯片(Molecular characterization ofglobal maize breeding germplasm based on genome-wide single nucleotidepolymorphisms[J].Theoretical&Applied Genetics,2009,120(1):93-115.)，89个标记来源于LGC maize KASP library。

具体地说，412个SNP标记的筛选过程如下：

从276份玉米自交系的外显子组测序数据和206份玉米自交系的简化基因组测序数据中筛选出二者共有的64656个高质量SNP位点。

(1)根据SNP位点的PIC值，剔除PIC≤0.37的SNP；

(2)根据SNP位点基因型的杂合率，剔除杂合>20％的SNP；

(3)利用plink对SNP进行即一步筛选：设置参数--indep-pairwise 100 10 0.5，以每100个SNP为一个窗口，10个SNP为步长，计算每个窗口内的每对SNP间的连锁不平衡LD值，如果LD大于0.2，则其中一个SNP被剔除；

(4)重复以上操作，确保所留存的SNP不在同一个连锁不平衡区间内。

通过以上步骤筛选，最后得到412个SNP位点，标记的信息如表1所示。

表1. 412个SNP标记信息

403个SNP标记的筛选流程：

Yanli Lu等(Molecular characterization of global maize breedinggermplasm based on genome-wide single nucleotide polymorphisms[J].Theoretical&Applied Genetics,2009,120(1):93-115.)收集了分布于全球的770份玉米自交系材料，采用illumina GoldenGate 1536 SNP芯片对这770份材料进行了1536个玉米SNP标记的基因型分型，从基因型数据中按以下标准筛选SNP标记：

(1)根据SNP标记的PIC值，挑选PIC>0.25的SNP；

(2)根据SNP标记的MAF值，挑选MAF>0.2的SNP；

(3)根据SNP标记的染色体和物理位置信息，将这些信息比对到玉米参考基因组B73_V3上，剔除不能比对参考基因组上的SNP标记。

通过筛选得到403个高质量的SNP标记，信息如表2所示。

表2. 403个SNP标记信息

根据以上815个SNP标记在玉米10条染色体上的分布情况，从LGC的maize KASPlibrary中选取89个SNP标记，用于填补每条染色体上标记覆盖密度较小的区域。标记信息如表3所示。

表3. 89个SNP标记信息

图1显示了这904个SNP标记在基因组上的分布情况，总体上SNP标记在玉米10条染色体上分布均匀，在染色体两端分布的较多，在着丝粒或LD较长的区域入选的SNP较少，这与玉米基因在染色体上的分布趋势一致。

实施例2 904个SNP标记的引物列表

根据每个SNP标记在染色体上的物理位置信息，提取SNP位点两侧各250bp的参考基因组序列，结合玉米基因组的SNP标记Hapmap2的信息，在每个SNP位点两侧设计1条正向引物和1条反向引物，用于扩增包含SNP位点在内的基因组序列，共计904对引物，这904对引物组成捕获测序的panel。引物的设计合成由上海茂槿生物技术公司完成。引物信息见表4。

表4.基因捕获panel引物信息

实施例3利用捕获测序panel对66份玉米自交系进行SNP标记基因型分型

用CTAB法提取66份玉米自交系叶片的DNA，其中10份材料的DNA设置了两次重复。由上海茂槿生物技术公司完成PCR测序建库，测序以及SNP标记基因型获取。

比较10份材料的两个重复在904个SNP标记位点的基因型一致率

通过比较，这10份材料的重复间基因型一致率在98.16％以上，说明捕获测序panel鉴定的基因型重复性较好。如表5所示

表5. 10个样本两个重复间的基因型一致率

比较66份材料的panel基因型和已有测序基因型，

通过比较，这66份材料的panel基因型和已有测序基因型一致率在92.96％以上，说明捕获测序panel鉴定的SNP标记基因型准确率很高。如表6所示。

表6. 66份骨干自交系材料panel基因型与测序基因型对比

实施例4利用panel数据对217份玉米自交系进行聚类分析和PCA分析

用CTAB法提取217份玉米材料的叶片DNA，由上海茂槿生物技术公司完成PCR测序建库，测序以及SNP标记基因型获取。

聚类分析。利用Powermarker软件对217份材料的904个SNP标记基因型数据进行处理。剔除缺失率>20％，杂合率>20％，MAF>0.05的SNP位点，筛选出831个高质量的SNP位点。利用筛选出的SNP标记基因型数据计算不同玉米材料之间的遗传距离，根据neighbor-jointing聚类模型或者UPGMA(Unweighted Pair Group Method Arithmetic Average)聚类模型进行聚类分析。利用MEGA6.0对聚类图进行编辑。从聚类结果看，材料的分类和已有的系谱信息、杂种优势群信息一致。聚类结果如图2所示

PCA分析。利用Tassel软件对筛选出的基因型数据进行PCA计算。利用R软件进行PCA作图，如图3所示。从图中可以看出PCA分析结果可以将不同的杂种优势群清晰分开。

实施例5利用panel数据对回交后代进行高通量分子标记辅助选择

构建回交群体。第一季，将昌7-2背景的抗虫耐除草剂玉米自交系和待改良玉米自交系D109在转基因试验田进行种植，在开花授粉期进行杂交获得F1种子；第二季，将F1与D109在转基因试验田进行种植，在开花授粉期再次进行杂交获得BC1F1种子；第三季，将BC1F1与D109在转基因试验田进行种植，在苗期对群体单株喷洒除草剂，一周后对仍正常生长的单株进行取样，采用CTAB法进行DNA提取。前景选择。采用CaMV35S启动子的KASP引物，对样品DNA进行检测，确认其是否含有抗虫耐除草剂基因。采用LGC生产的高通量实时荧光检测系统Intelliqube进行高通量PCR反应体系的配制，利用LGC生产的高通量水浴PCR仪对配制好的PCR反应体系进行高通量PCR反应，PCR反应结束以后利用Intelliqube对反应体系进行高通量荧光扫描，根据荧光信号的扫描结果判定样品是否含有CaMV35S启动子，进而判定是否是抗虫耐除草剂单株。

背景选择。利用panel对经过前景选择筛选出的抗虫耐除草剂单株样品DNA以及轮回亲本样品DNA进行背景基因型鉴定。具体步骤如下：

1.利用panel中904个SNP标记的引物对每个样品DNA进行目标位点多重PCR扩增；

2.利用上海茂槿生物技术公司设计的带有illumina测序接头和样品barcode的下游引物对步骤1中的PCR产物进行第二轮扩增，得到连接有测序接头和样品barcode的扩增产物；

3.利用illumina二代测序仪HiSeq X对步骤2所得扩增产物进行高通量测序，通过生物信息学方法对测序数据进行分析获取每个样品以及轮回亲本的SNP标记基因型；

4.对基因型数据进行筛选。第一步删除缺失率大于10％，实施例4中杂合率大于20％的SNP标记。第二步删除在检测样品及轮回亲本中没有多态性的SNP标记，留下具有多态性的SNP标记；

5.根据每个样品的多态性标记基因型计算背景回复率：G(g)＝[L+X(g)]/2L×100％，其中G(g)是指在g代的遗传背景回复率，g是指用于回交的世代次数，L是指用于参与分析的多态性分子标记数量，X(g)是指回交g代中与轮回亲本基因型一致的标记的数量；

6.将背景回复率最高的单株继续与轮回亲本D109进行杂交。

根据上述步骤对135份BC1F1抗虫耐除草剂单株和轮回亲本的DNA进行了panelSNP标记基因型分型，并计算每一份样品的背景回复率，获得背景回复率最高的单株LPGK699，背景回复率为91.28％。背景回复率排在前10的单株如表7所示。

表7

在回交转育的过程中，在BC1F1和BC2F1世代，背景回复率理论上是75％和87.5％，从表7中可以看出，回复率排在前10的单株的背景回复率都大于理论值75％，超过BC2F1的理论背景回复率87.5％，说明利用panel进行背景选择具有很高的效率，可以有效地缩短育种年限。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司

<120> 一种对玉米SNP标记组合进行捕获测序的方法及其应用

<130> KHP171118123.5

<141> 2017-12-14

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caagcagaag acggcatacg agatagtcat cggtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagcagaag acggcatacg agatcagttg acgtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatgtcaga gtgtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caagcagaag acggcatacg agattcagcc tagtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agatcatgta cggtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caagcagaag acggcatacg agattgacag tcgtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caagcagaag acggcatacg agatgtgact gagtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caagcagaag acggcatacg agatacctgc atgtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caagcagaag acggcatacg agattgagtg tggtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caagcagaag acggcatacg agataccagt gcgtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caagcagaag acggcatacg agatgatcaa cagtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caagcagaag acggcatacg agatctgtcc atgtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

Claims

1.一种对玉米SNP标记组合进行捕获测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)以步骤(2)得到的扩增产物为模板，利用带有illumina测序接头的上游引物，与带有illumina测序接头和样品barcode的下游引物，进行第二轮扩增，得到连接有测序接头和样品barcode的扩增产物；

(4)利用illumina二代测序仪HiSeq X对步骤(3)所得扩增产物进行高通量测序，通过生物信息学方法对测序数据进行分析获取待测玉米SNP标记的基因型。

2.权利要求1所述的方法在玉米种质资源遗传结构分析中的应用，其特征在于，利用Powermarker软件对获取的待测玉米SNP标记的基因型数据进行处理，剔除缺失率>20％，杂合率>20％，MAF>0.05的SNP位点；利用筛选出的SNP标记基因型数据计算不同玉米材料之间的遗传距离，进行聚类分析。

3.权利要求1所述的方法在玉米分子标记辅助背景选择中的应用，其特征在于，通过获取待测玉米SNP标记的基因型，将回交群体中每个玉米单株的基因型分别与轮回亲本的基因型进行比较，计算每个玉米单株的背景回复率，挑选背景回复率最高的单株与轮回亲本进行下一次回交。

4.权利要求1所述的方法在玉米品种鉴定中的应用，其特征在于，获取待鉴定玉米品种和对比玉米品种的样品DNA，利用panel对样品DNA进行基因型鉴定，将待鉴定玉米品种的基因型与对比品种的基因型进行比较，计算待鉴定玉米品种与对比品种的相似度。

5.权利要求1所述的方法在玉米全基因组关联分析中的应用。

6.用于对玉米基因组进行基因型捕获测序的玉米SNP标记组合，其特征在于，所述SNP标记组合包括904个SNP标记，如表1～表3所示。