JP7421071B2 - 処理方法 - Google Patents
処理方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7421071B2 JP7421071B2 JP2019228494A JP2019228494A JP7421071B2 JP 7421071 B2 JP7421071 B2 JP 7421071B2 JP 2019228494 A JP2019228494 A JP 2019228494A JP 2019228494 A JP2019228494 A JP 2019228494A JP 7421071 B2 JP7421071 B2 JP 7421071B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- thiocyanate
- rna
- base sequence
- seq
- microorganisms
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000003672 processing method Methods 0.000 title claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 126
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 125
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 116
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 99
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 82
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 71
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 71
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 71
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 70
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 62
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical group N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 42
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 37
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 21
- 108010012464 thiocyanate hydrolase Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000571 coke Substances 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 97
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 87
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 36
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 35
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 34
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 32
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 27
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 22
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 22
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-N cyanic acid Chemical compound OC#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- -1 thiocyanate ions Chemical class 0.000 description 21
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 16
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 description 16
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 16
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 16
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 11
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 8
- RLDQYSHDFVSAPL-UHFFFAOYSA-L calcium;dithiocyanate Chemical compound [Ca+2].[S-]C#N.[S-]C#N RLDQYSHDFVSAPL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 8
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 8
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 8
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 7
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N sulfurothioic S-acid Chemical compound OS(O)(=O)=S DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 5
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 5
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 4
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 4
- 102000039634 Untranslated RNA Human genes 0.000 description 4
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- OMOVVBIIQSXZSZ-UHFFFAOYSA-N [6-(4-acetyloxy-5,9a-dimethyl-2,7-dioxo-4,5a,6,9-tetrahydro-3h-pyrano[3,4-b]oxepin-5-yl)-5-formyloxy-3-(furan-3-yl)-3a-methyl-7-methylidene-1a,2,3,4,5,6-hexahydroindeno[1,7a-b]oxiren-4-yl] 2-hydroxy-3-methylpentanoate Chemical compound CC12C(OC(=O)C(O)C(C)CC)C(OC=O)C(C3(C)C(CC(=O)OC4(C)COC(=O)CC43)OC(C)=O)C(=C)C32OC3CC1C=1C=COC=1 OMOVVBIIQSXZSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000008235 industrial water Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 2
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 2
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000012854 evaluation process Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 2
- 230000008558 metabolic pathway by substance Effects 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010061397 Ammonia monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000001353 Chip-sequencing Methods 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001453382 Nitrosomonadales Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000010806 PrimeScriptTM RT Reagent kit Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000605268 Thiobacillus thioparus Species 0.000 description 1
- 108010008698 Thiosulfate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000005431 greenhouse gas Substances 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ、検出試薬、検出方法、定量方法、及び処理方法に関する。
コークス炉排水（安水）は物理化学的処理の後、生物学的水処理方法である活性汚泥法によって、排水基準であるＣＯＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｏｘｙｇｅｎ Ｄｅｍａｎｄ）成分が処理され、放流される。安水中のチオシアン酸［チオシアン酸イオン（ＳＣＮ－）として存在］はＣＯＤ成分であるため、処理が求められるが、処理が不安定になりがちである。チオシアン酸イオンの生分解には、硫化カルボニル（ＣＯＳ）を経てチオシアン酸イオンが分解されるＣＯＳ経路が知られている。ＣＯＳ経路のチオシアン分解微生物は既に分離されており（特許文献１）、チオシアン分解酵素の遺伝子配列もデータベースに登録されている。
一方、生物学的排水処理では微生物の優占種等の変動などにより、特定物質の除去の不良が問題となっている。活性汚泥法などの生物学的排水処理プロセスを理解、最適化するため、従来、水処理微生物のＤＮＡを解析することで、汚濁成分の分解に関わる遺伝子を定量し、分解に関わる微生物種を定量することなどが行われている（例えば、特許文献２）。
しかしながら、ＤＮＡの解析ではどのような条件で代謝機能が活性化するか評価できず、また、ＤＮＡは微生物量を反映しているため、ＤＮＡによる解析は、微生物の増殖速度に依存し、明確な変化を得るには数日を要する。それに対し、ＲＮＡは数時間で顕著に増減するため、活性を含めた評価を実施するためにはＲＮＡを対象とした解析が望ましい。ＲＮＡの発現は微生物の代謝機能を反映していると考えられるため、ＲＮＡを対象とした解析により、微生物による代謝活性の状態を評価できる。しかしながら、ＲＮＡは一般に遺伝子配列データベースと比較しないと何の機能に関与するものであるか不明であることや、分解が早く扱いが非常に難しいこと等から、実用上の課題も多い。
しかしながら、ＤＮＡの解析ではどのような条件で代謝機能が活性化するか評価できず、また、ＤＮＡは微生物量を反映しているため、ＤＮＡによる解析は、微生物の増殖速度に依存し、明確な変化を得るには数日を要する。それに対し、ＲＮＡは数時間で顕著に増減するため、活性を含めた評価を実施するためにはＲＮＡを対象とした解析が望ましい。ＲＮＡの発現は微生物の代謝機能を反映していると考えられるため、ＲＮＡを対象とした解析により、微生物による代謝活性の状態を評価できる。しかしながら、ＲＮＡは一般に遺伝子配列データベースと比較しないと何の機能に関与するものであるか不明であることや、分解が早く扱いが非常に難しいこと等から、実用上の課題も多い。
ＲＮＡを対象にした解析は、定量ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ法）による対象ＲＮＡの定量評価、又はマイクロアレイによる解析が行われてきたが、近年開発された次世代シーケンサーにより、ＲＮＡ配列を大規模に解析することが可能になった。
次世代シーケンサーを用いたＲＮＡの解析はＲＮＡ－ｓｅｑ（またはメタトランスクリプトーム）と呼ばれ、医学分野で技術が発展している。しかし、該手法を水処理微生物の代謝活性解析に適用しようとすると、微生物のＤＮＡ配列のデータベースは乏しく、得られたＲＮＡ配列が関与する代謝等の同定が困難であることや、水処理微生物の試料は数千種類の微生物が混在した試料であるため解析が困難であることなどから、ＲＮＡの塩基配列解読による発現解析を、水処理微生物の代謝活性解析に適用することは困難である。
また、チオシアン酸イオンの生分解には２つの経路があり、一方はシアン酸イオン（ＯＣＮ－）を経るシアン酸経路にて、もう一方が硫化カルボニル（ＣＯＳ）を経る硫化カルボニル経路にて、チオシアン酸イオンが分解されることが知られていた（図１）。一方、シアン酸経路によりチオシアン分解微生物に関する知見はないため、シアン酸経路のチオシアン分解微生物を定量することが出来ない。
本発明者らは、微生物のＲＮＡの塩基配列の解読による解析手法において、微生物による特定物質の代謝活性の評価をより効果的に実現可能な評価方法を検討した結果、予め飢餓状態で培養した微生物を培養することで得られる微生物試料を用いることで、微生物のＲＮＡの塩基配列の解読による解析手法において、微生物による特定物質の代謝活性の評価をより効果的に実現可能であることを見出した。さらに、この解析方法を用いてＲＮＡの塩基配列を網羅的に解析した結果、微生物によるチオシアン分解活性を短時間で測定できる新規チオシアン酸デヒドロゲナーゼ及び該酵素を用いるチオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性の検出方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
また、チオシアン酸デヒドロゲナーゼを有する微生物を利用して、チオシアンを含有する被処理水を処理可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明は、上記課題を解決するための手段として、以下の構成を採用する。
また、チオシアン酸デヒドロゲナーゼを有する微生物を利用して、チオシアンを含有する被処理水を処理可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明は、上記課題を解決するための手段として、以下の構成を採用する。
［１］以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質であるチオシアン酸デヒドロゲナーゼ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９８％以上のアミノ酸配列を含み、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
［２］以下の（Ｉ）～（ＩＶ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドを有する検出試薬。
（Ｉ）［１］に記載のチオシアン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩ）［１］に記載のチオシアン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列と相補的な塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＶ）前記（ＩＩ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｖ）前記（Ｉ）の部分配列との配列同一性が９８％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＶＩ）前記（ＩＩ）の部分配列との配列同一性が９８％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
［３］前記チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（１）～（６）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（７）～（１２）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備える、［２］に記載の検出試薬。
（１）配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５）配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６）配列番号７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７）配列番号４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（８）配列番号４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（９）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１０）配列番号６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１１）配列番号８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１２）配列番号８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
［４］［２］又は［３］に記載の検出試薬を用いて、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を検出する方法。
［５］［２］又は［３］に記載の検出試薬を用いて、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を定量する方法。
［６］チオシアンと、［１］に記載のチオシアン酸デヒドロゲナーゼと、を含む混合相を形成させ、前記チオシアン酸デヒドロゲナーゼにより前記チオシアンを分解させる処理工程を有する処理方法。
［７］チオシアンを含有する被処理水と、チオシアン酸デヒドロゲナーゼを有する微生物とを含む混合相を形成させ、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解する処理工程と、
前記シアン酸を経由して前記チオシアンを分解するシアン酸経路に係る酵素活性を検出する検出工程と、を有する処理方法。
［８］前記シアン酸経路に係る酵素が、チオシアン酸デヒドロゲナーゼである［７］に記載の処理方法。
［９］更に、硫化カルボニルを経由して前記チオシアンを分解する硫化カルボニル経路に係る酵素活性を検出する第二検出工程を有する［７］又は［８］に記載の処理方法。
［１０］前記硫化カルボニル経路に係る酵素が、チオシアン酸ヒドロラーゼである［９］に記載の処理方法。
［１１］チオシアンを含有する被処理水と、［１］に記載のチオシアン酸デヒドロゲナーゼを有する微生物とを含む混合相を形成させ、前記チオシアンを分解する処理工程を有する処理方法と、
前記チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を検出する検出工程と、を有する処理方法。
［１２］［２］又は［３］に記載の検出試薬を用いて前記チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を検出する検出工程を有する、［１１］に記載の処理方法。
［１３］前記チオシアンを含有する被処理水が、コークス炉から排出された安水である［８］～［１２］のいずれか一つに記載の処理方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９８％以上のアミノ酸配列を含み、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
［２］以下の（Ｉ）～（ＩＶ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドを有する検出試薬。
（Ｉ）［１］に記載のチオシアン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩ）［１］に記載のチオシアン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列と相補的な塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＶ）前記（ＩＩ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｖ）前記（Ｉ）の部分配列との配列同一性が９８％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＶＩ）前記（ＩＩ）の部分配列との配列同一性が９８％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
［３］前記チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（１）～（６）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（７）～（１２）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備える、［２］に記載の検出試薬。
（１）配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５）配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６）配列番号７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７）配列番号４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（８）配列番号４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（９）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１０）配列番号６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１１）配列番号８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１２）配列番号８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
［４］［２］又は［３］に記載の検出試薬を用いて、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を検出する方法。
［５］［２］又は［３］に記載の検出試薬を用いて、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を定量する方法。
［６］チオシアンと、［１］に記載のチオシアン酸デヒドロゲナーゼと、を含む混合相を形成させ、前記チオシアン酸デヒドロゲナーゼにより前記チオシアンを分解させる処理工程を有する処理方法。
［７］チオシアンを含有する被処理水と、チオシアン酸デヒドロゲナーゼを有する微生物とを含む混合相を形成させ、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解する処理工程と、
前記シアン酸を経由して前記チオシアンを分解するシアン酸経路に係る酵素活性を検出する検出工程と、を有する処理方法。
［８］前記シアン酸経路に係る酵素が、チオシアン酸デヒドロゲナーゼである［７］に記載の処理方法。
［９］更に、硫化カルボニルを経由して前記チオシアンを分解する硫化カルボニル経路に係る酵素活性を検出する第二検出工程を有する［７］又は［８］に記載の処理方法。
［１０］前記硫化カルボニル経路に係る酵素が、チオシアン酸ヒドロラーゼである［９］に記載の処理方法。
［１１］チオシアンを含有する被処理水と、［１］に記載のチオシアン酸デヒドロゲナーゼを有する微生物とを含む混合相を形成させ、前記チオシアンを分解する処理工程を有する処理方法と、
前記チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を検出する検出工程と、を有する処理方法。
［１２］［２］又は［３］に記載の検出試薬を用いて前記チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を検出する検出工程を有する、［１１］に記載の処理方法。
［１３］前記チオシアンを含有する被処理水が、コークス炉から排出された安水である［８］～［１２］のいずれか一つに記載の処理方法。
本発明のチオシアン酸デヒドロゲナーゼによれば、チオシアンの分解が可能である。
本発明の検出試薬によれば、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性の検出が可能である。
本発明の検出方法によれば、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性の検出が可能である。
本発明の処理方法によれば、チオシアンの分解が可能である。
本発明の処理方法によれば、被処理水がチオシアンを含有する場合、チオシアン酸デヒドロゲナーゼを有する微生物を利用して、チオシアンを含有する被処理水を処理可能である。
本発明の検出試薬によれば、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性の検出が可能である。
本発明の検出方法によれば、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性の検出が可能である。
本発明の処理方法によれば、チオシアンの分解が可能である。
本発明の処理方法によれば、被処理水がチオシアンを含有する場合、チオシアン酸デヒドロゲナーゼを有する微生物を利用して、チオシアンを含有する被処理水を処理可能である。
本明細書においては、図１に示すようなチオシアン酸イオンの分解について、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ－）のことを、単に「チオシアン」ということがあり、シアン酸イオン（ＯＣＮ－）のことを、単に「シアン酸」ということがある。
本実施形態のチオシアン酸デヒドロゲナーゼは、下記の評価方法により、微生物試料についてチオシアンを分解する活性を定量評価し、該微生物試料より単離することができる。
≪微生物による特定物質の代謝活性を定量評価する評価方法≫
＜第一実施形態＞
本実施形態の評価方法は、培養工程、解読工程、及び評価工程を含む。また、上記各工程に加えて、さらに確認工程を含んでもよい。以下、実施形態に係る各工程について詳細に説明する。
＜第一実施形態＞
本実施形態の評価方法は、培養工程、解読工程、及び評価工程を含む。また、上記各工程に加えて、さらに確認工程を含んでもよい。以下、実施形態に係る各工程について詳細に説明する。
（培養工程）
培養工程は、１種類以上の微生物を特定物質の飢餓状態で飢餓培養し、その後前記微生物を、特定物質を代謝可能な条件で本培養することで得られる微生物試料を用意する工程である。
本実施形態では、前記１種類以上の微生物が、生物学的排水処理に使用される微生物である場合について説明する。
培養工程は、１種類以上の微生物を特定物質の飢餓状態で飢餓培養し、その後前記微生物を、特定物質を代謝可能な条件で本培養することで得られる微生物試料を用意する工程である。
本実施形態では、前記１種類以上の微生物が、生物学的排水処理に使用される微生物である場合について説明する。
生物学的排水処理で処理される被処理水には、当該微生物の処理対象の特定物質が含まれており、生物学的排水処理の目的は、その特定物質の処理にある。
被処理水としては、例えば、コークス工場から排出されたコークス排水が挙げられる。
被処理水は、アンモニア、フェノール、チオシアン、およびチオ硫酸からなる群から選ばれるいずれか一以上を含むものであってよい。
被処理水としては、例えば、コークス工場から排出されたコークス排水が挙げられる。
被処理水は、アンモニア、フェノール、チオシアン、およびチオ硫酸からなる群から選ばれるいずれか一以上を含むものであってよい。
前記１種類以上の微生物は、生物学的排水処理が行われる処理槽からサンプリングして得ることができる。処理槽では、生物学的排水処理に使用される微生物が生育している。後述の実施例の場合では、図２の処理槽中のスポンジ担体２１から得られた微生物が挙げられる。処理槽中の活性汚泥から得られた微生物を用いてもよい。さらに処理後に固液分離される沈殿汚泥や再び処理槽に返送される返送汚泥から得られた微生物を用いてもよい。
生物学的排水処理に使用される微生物は、２種類以上の複数の種類の微生物から構成されてよい。つまり、生物学的排水処理に使用される微生物は、２種類以上の微生物群が含まれてよい。本明細書において「微生物群」とはある形質又は遺伝子型に基づいて分類された微生物集団を指し、例えば属、種、亜種が挙げられ、これらに限定されない。当該遺伝子型としては単に微生物のゲノムの塩基配列も含むものとする。
処理槽中に含まれる微生物群の数は、一例として、１００種類以上１００万種類以下であってもよく、１０００種類以上１万種類以下であってもよい。
処理槽中に含まれる微生物群の数は、一例として、１００種類以上１００万種類以下であってもよく、１０００種類以上１万種類以下であってもよい。
微生物が「生物学的排水処理に使用される微生物」であるというのは、「生物学的排水処理に使用される微生物群と同じ種類の微生物群」であることの意味であってよい。
本実施形態における生物学的排水処理に使用される微生物としては、例えば、アンモニアを酸化し亜硝酸を生成する微生物、フェノールを分解する微生物、チオシアンを分解する微生物、及びチオ硫酸を分解する微生物等を挙げることができる。
アンモニアを酸化し亜硝酸を生成する微生物としては、アンモニア酸化細菌（ammonia-oxidizing bacteria）やアンモニア酸化古細菌（ammonia-oxidizing archaea）が挙げられる。チオ硫酸を分解する微生物としては、チオバシラス・チオパルス（Thiobacillus Thioparus）などが挙げられる。
アンモニアを酸化し亜硝酸を生成する微生物としては、アンモニア酸化細菌（ammonia-oxidizing bacteria）やアンモニア酸化古細菌（ammonia-oxidizing archaea）が挙げられる。チオ硫酸を分解する微生物としては、チオバシラス・チオパルス（Thiobacillus Thioparus）などが挙げられる。
・飢餓培養
本実施形態の評価方法では、まず、得られた微生物を特定物質の飢餓状態で飢餓培養する。なお、この特定物質の代謝活性が、後の評価工程における評価対象となる。この評価結果は、生物学的排水処理の処理における、微生物の特定物質の処理能力の評価につながる。
本実施形態の評価方法では、まず、得られた微生物を特定物質の飢餓状態で飢餓培養する。なお、この特定物質の代謝活性が、後の評価工程における評価対象となる。この評価結果は、生物学的排水処理の処理における、微生物の特定物質の処理能力の評価につながる。
特定物質としては、微生物が直接的又は間接的に処理することのできるものであれば特に限定されるものではない。例えば、特定物質としては、アンモニア、フェノール、チオシアン、及びチオ硫酸等を挙げることができる。
「微生物を特定物質の飢餓状態で飢餓培養する」とは、微生物において特定物質の代謝経路が停止又は活性低下する条件で微生物を培養することをいう。係る条件を満たす飢餓培養に用いられる培地としては、特定物質を含まない培地や、特定物質を少量含む培地等があげられる。少量とは、微生物において特定物質の代謝経路が停止又は活性低下する程度の量とする。代謝経路が停止又は活性低下したことは、例えば、培地及び微生物を含む培養系において、特定物質の代謝産物の増加が停止したこと、又は特定物質の代謝産物の増加率が低下したこと等により判断できる。
本明細書において、微生物の「培養」とは生体内以外の環境で微生物を生育させることをいい、それに用いられる「培地」とは、微生物を培養可能なものであれば特に制限されない。
特定物質を含まない培地は、微生物を培養可能であり且つ特定物質を含まないものであれば特に制限されず、公知の微生物培養用培地、バッファー等を用いることができる。培地形態は特に制限されず、液体状、固体状、ゲル状等の形態が挙げられる。
後述の本培養における代謝活性状態との比較を容易にするため、飢餓培養に用いられる培地と、本培養に用いられる培地とは、特定物質以外の成分の組成を共通の組成とすることが推奨される。
・本培養
次いで、飢餓培養された微生物を、特定物質を代謝可能な条件で本培養する。
次いで、飢餓培養された微生物を、特定物質を代謝可能な条件で本培養する。
「微生物を特定物質を代謝可能な条件で本培養する」とは、微生物において特定物質の代謝経路が活性化した条件で微生物を培養することをいう。係る条件を満たす本培養に用いられる培地としては、特定物質を十分量含む培地等があげられる。十分量とは、微生物において特定物質の代謝経路が活性化する程度の量とする。代謝経路が活性化したことは、例えば、培地及び微生物を含む培養系において、特定物質の代謝産物の増加又は分解による特定物質の減少が確認されたこと等により判断できる。
特定物質を含む培地は、微生物を培養可能であり且つ特定物質を含むものであれば特に制限されず、公知の微生物培養用培地、バッファー等を用いることができる。培地形態は特に制限されず、液体状、固体状、ゲル状等の形態が挙げられる。
既述の飢餓培養における代謝活性状態との比較を容易にするため、本培養に用いられる培地と、飢餓培養に用いられる培地とは、特定物質以外の成分の組成を共通の組成とすることが推奨される。
このようにして、飢餓培養及び本培養を行うことで、後の解読工程に供される微生物試料を得ることができる。
（解読工程）
解読工程は、前記培養工程で得られた微生物試料中のＲＮＡの塩基配列を解読する工程である。
解読工程は、前記培養工程で得られた微生物試料中のＲＮＡの塩基配列を解読する工程である。
解読工程は、例えば、以下の工程を含むことができる。以下の工程Ａ～Ｃはこの順に行うことができる。
工程Ａ：前記培養工程で得られた微生物試料中のＲＮＡを抽出しＲＮＡ試料を得る工程、
工程Ｂ：前記ＲＮＡ試料から逆転写によってｃＤＮＡを生成する工程、
工程Ｃ：前記生成されたｃＤＮＡの塩基配列を解読する工程。
工程Ａ：前記培養工程で得られた微生物試料中のＲＮＡを抽出しＲＮＡ試料を得る工程、
工程Ｂ：前記ＲＮＡ試料から逆転写によってｃＤＮＡを生成する工程、
工程Ｃ：前記生成されたｃＤＮＡの塩基配列を解読する工程。
ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの生成の方法は公知であり、当該技術分野で通常用いられている方法を適宜採用して、実施することが可能である。
なお、ここで例示するように、本実施形態ではＲＮＡからｃＤＮＡを生成しｃＤＮＡの塩基配列を解読することも、ＲＮＡの塩基配列を解読することに該当するものとする。つまり、ＲＮＡの塩基配列に対応する配列を有する核酸の塩基配列を解読することも、ＲＮＡの塩基配列を解読することに該当するものとする。
抽出されたＲＮＡには、微生物試料中の微生物のＲＮＡが含まれている。得られたＲＮＡの塩基配列は網羅的に解読してもよく、一部のみを解読してもよい。「網羅的」とは、解読対象の配列部分を予め特定しないことを意味する。
解読するＲＮＡの種類は、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びそれらの前駆体並びに誘導体が挙げられる。ｎｃＲＮＡとしては、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等が挙げられる。
塩基配列の解読は、公知の方法により行うことができる。塩基配列の解読にはシーケンサーを用いることができる。
本実施形態の評価方法は、非常に多くの微生物群を含む微生物試料に対して好適に用いられる。そのため、前記塩基配列の解読に、次世代シーケンサーを用いることが好ましい。次世代シーケンサーとしては、ＤＮＡポリメラーゼ等による逐次的ＤＮＡ合成反応を利用したものが代表的である。前記塩基配列の解読に用いるシーケンサープラットフォームとして、４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ、ＰａｃＢｉｏが挙げられる。
本実施形態の評価方法は、非常に多くの微生物群を含む微生物試料に対して好適に用いられる。そのため、前記塩基配列の解読に、次世代シーケンサーを用いることが好ましい。次世代シーケンサーとしては、ＤＮＡポリメラーゼ等による逐次的ＤＮＡ合成反応を利用したものが代表的である。前記塩基配列の解読に用いるシーケンサープラットフォームとして、４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ、ＰａｃＢｉｏが挙げられる。
（確認工程）
実施形態の評価方法は、第１の確認工程を更に含んでもよい。第１の確認工程は、微生物試料について、特定物質の代謝に関わる既知のＲＮＡの検出を指標にして、前記微生物試料の品質確認を行う工程である。
実施形態の評価方法は、第１の確認工程を更に含んでもよい。第１の確認工程は、微生物試料について、特定物質の代謝に関わる既知のＲＮＡの検出を指標にして、前記微生物試料の品質確認を行う工程である。
なお、第１の確認工程は、その前段階として、例えば上記の工程Ａ～Ｂを行うことができ、得られたｃＤＮＡの検出を指標にして、ＲＮＡ試料の品質確認を行ってもよい。この場合の第１の確認工程は、ＲＮＡ試料における、特定物質の代謝に関わる既知のＲＮＡの検出を指標にして、ＲＮＡ試料の品質確認を行う工程であってよい。
第１の確認工程は、解読工程の前に行われることが好ましい。第１の確認工程により、微生物試料又はＲＮＡ試料における特定物質の代謝活性の状態の一部の情報を、参考情報として予備的に把握することができる。例えば、微生物試料又はＲＮＡ試料から、特定物質の代謝に関わる既知のＲＮＡが検出されたかを確認する。また、既知のＲＮＡがどの程度検出されたかを確認してもよい。特定物質の代謝に関わる既知のＲＮＡが検出されたのであれば、当該試料の微生物では特定物質の代謝が活性化されていると判断でき、当該試料について解読工程及び評価工程を行えば、特定物質の代謝の評価結果が得られるはずである。
ＲＮＡの検出の方法は公知であり、当該技術分野で通常用いられている方法を適宜採用して、実施することが可能である。第１の確認工程では、ＲＮＡの配列を解読しなくともよい。第１の確認工程で用いられるＲＮＡの検出方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ドットブロット法などが挙げられ、なかでもＲＴ－ＰＣＲ法が好ましい。ＲＴ－ＰＣＲは、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法を用いてもよい。
検出するＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びそれらの前駆体並びに誘導体が挙げられる。ｎｃＲＮＡとしては、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等が挙げられる。これらのなかでは、ｍＲＮＡが好ましい。特定物質の代謝に関わる既知のＲＮＡとは、特定物質の代謝に関わることが知られている遺伝子産物のＲＮＡを例示できる。遺伝子は、特定物質の代謝に関わる既知の酵素をコードする遺伝子を例示できる。
実施形態の評価方法は、第２の確認工程を更に含んでもよい。第２の確認工程は、ＲＮＡ試料のＲＮＡの純度を指標にして、前記ＲＮＡ試料の品質確認を行う工程である。
第２の確認工程は、解読工程の前に行われることが好ましい。例えば、ＲＮＡ試料中に含まれる核酸量に対するＲＮＡ量を確認することでＲＮＡの純度を求めてもよく、残存するＤＮＡ量を確認してもよい。また、ＰＣＲ等を利用して特定の配列について確認することもできる。ＲＮＡ試料中に高純度でＲＮＡが含まれているか、残存するＤＮＡが少ないことを確認できれば、高純度でＲＮＡを含む高品質のＲＮＡ試料が得られたと判断できる。
ＲＮＡとＤＮＡとを区別して検出する方法は公知であり、当該技術分野で通常用いられている方法を適宜採用して、実施することが可能である。第２の確認工程でも、ＲＮＡの配列を解読しなくともよい。確認工程で用いられるＲＮＡの検出方法としては、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡの染色測定、吸光度測定、各種のＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅などの方法が例示できる。
上記第１の確認工程及び第２の確認工程（以下、まとめて確認工程と記す。）は、どちらか一方のみ行ってもよく、両方を行ってもよい。
確認工程を行うことにより、微生物試料又はＲＮＡ試料が、解読工程で解読されて特定物質の代謝活性を評価されるに値する品質かどうか確認できる。
確認工程においてＲＮＡの配列を解読せずにＲＮＡの発現解析を行い、解読工程においてＲＮＡの配列を解読してＲＮＡの発現解析を行うことで、効率よく微生物による特定物質の代謝活性の評価を行うことができる。
確認工程においてＲＮＡの配列を解読せずにＲＮＡの発現解析を行い、解読工程においてＲＮＡの配列を解読してＲＮＡの発現解析を行うことで、効率よく微生物による特定物質の代謝活性の評価を行うことができる。
（評価工程）
評価工程は、前記解読された塩基配列の検出頻度を指標にして、微生物による前記特定物質の代謝活性を評価する工程である。
解読工程によって解読されたＲＮＡの塩基配列には、本培養時に存在していたＲＮＡの塩基配列が解読されている。そこには、特定物質の代謝に関与するＲＮＡの塩基配列も含まれている。
評価工程は、前記解読された塩基配列の検出頻度を指標にして、微生物による前記特定物質の代謝活性を評価する工程である。
解読工程によって解読されたＲＮＡの塩基配列には、本培養時に存在していたＲＮＡの塩基配列が解読されている。そこには、特定物質の代謝に関与するＲＮＡの塩基配列も含まれている。
特定物質の代謝に関与するＲＮＡとしては、上記の確認工程で検出するＲＮＡとして例示したものが挙げられる。特定物質の代謝に関与するＲＮＡとは、特定物質の代謝に関わる遺伝子産物のＲＮＡを例示できる。遺伝子は、特定物質の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子を例示できる。
代謝活性を評価することは、解読されたＲＮＡが関与する代謝の反応の活性化状況を値化することで行われる。
塩基配列の検出頻度とは、解読された全塩基配列中に確認されたＲＮＡの塩基配列ごとのリード数の相対数又は絶対数である。特定物質の代謝に関与するＲＮＡの塩基配列の検出頻度が高いほど、特定物質の代謝経路に関与するＲＮＡの発現量が高く、微生物による特定物質の代謝活性が高いと評価できる。また逆に、特定物質の代謝に関与するＲＮＡの塩基配列の検出頻度が低いほど、特定物質の代謝経路に関与するＲＮＡの発現量が低く、微生物による特定物質の代謝活性が低いと評価できる。特定物質の代謝に関与するＲＮＡの塩基配列が検出されなければ、微生物による特定物質の代謝活性が無い又は著しく低いと評価できる。
塩基配列の検出頻度とは、解読された全塩基配列中に確認されたＲＮＡの塩基配列ごとのリード数の相対数又は絶対数である。特定物質の代謝に関与するＲＮＡの塩基配列の検出頻度が高いほど、特定物質の代謝経路に関与するＲＮＡの発現量が高く、微生物による特定物質の代謝活性が高いと評価できる。また逆に、特定物質の代謝に関与するＲＮＡの塩基配列の検出頻度が低いほど、特定物質の代謝経路に関与するＲＮＡの発現量が低く、微生物による特定物質の代謝活性が低いと評価できる。特定物質の代謝に関与するＲＮＡの塩基配列が検出されなければ、微生物による特定物質の代謝活性が無い又は著しく低いと評価できる。
例えば、解読されたＲＮＡの塩基配列に、物質Ａの代謝に関与する遺伝子ＡのＲＮＡの塩基配列が１００リード含まれ、物質Ｂの代謝に関与する遺伝子ＢのＲＮＡの塩基配列が１００００リード含まれているとする。この場合、微生物試料中では、物質Ａと物質Ｂの代謝活性があり、物質Ａよりも物質Ｂの代謝活性が向上されていると評価できる。
ここでいう微生物による特定物質の代謝活性とは、微生物試料に含まれる微生物全体の代謝活性の評価であってよい。ＲＮＡの塩基配列から微生物群が特定できるのであれば、微生物試料に含まれる特定の微生物群のみの代謝活性の評価であってよい。
前記特定物質の代謝は、アンモニアを酸化し亜硝酸を生成する反応、フェノールを分解する反応、チオシアンを分解する反応、およびチオ硫酸を分解する反応等が挙げられる。
データベースの登録されているＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列の機能に関する注釈情報を利用して、特定物質の代謝に関与するＲＮＡの塩基配列を分類して用いることができる。同様の手法で、上記の反応に関与する代謝に関与するＲＮＡの塩基配列も分類して用いることができる。
アンモニアを酸化し亜硝酸を生成する反応に関与する遺伝子としては、アンモニアモノオキシゲナーゼ（ａｍｍｏｎｉａ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子等が挙げられる。フェノールを分解する反応に関与する遺伝子としては、フェノールモノオキシゲナーゼ（ｐｈｅｎｏｌ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子等が挙げられる。チオシアンを分解する反応に関与する遺伝子としては、チオシアン酸ヒドロラーゼ（ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）をコードする遺伝子、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子等が挙げられる。チオ硫酸を分解する反応に関与する遺伝子としては、チオ硫酸デヒドロゲナーゼ（ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子等が挙げられる。
塩基配列の検出頻度を常法により補正することで、活性の定量的な評価をすることも可能である。例えば、補正後の補正値としては、ＴＰＭ値、ＦＰＫＭ値等が挙げられる。ＴＰＭ値、ＦＰＫＭ値は、解読された全リード数に対し、該当配列の発現量（検出量）に所定の補正をして算出された値とされる。
以上のように、実施形態の評価方法においては、微生物を前記特定物質の飢餓状態で飢餓培養し、その後、前記微生物を特定物質を代謝可能な条件で本培養することで得られる微生物試料中の、ＲＮＡ塩基配列を解読し、解読された塩基配列の検出頻度を指標にして、微生物による前記特定物質の代謝活性を評価する。
従来、生物学的排水処理に係る微生物の解析を行う場合、微生物の種類が多様で、得られる塩基配列の種類も膨大となる、そのため、解読された塩基配列を用いてＲＮＡの発現解析を試みても、十分な精度が得られなかった。
それに対して、本実施形態の評価方法では、微生物を飢餓培養して特定物質の代謝を一旦低下させ、その後の本培養にて代謝を再び活性化させることで、特定物質の代謝活性が明確な微生物試料を調製可能となる。そのため、塩基配列の検出頻度からＲＮＡの発現解析を行う場合であっても、特定物質の代謝活性の評価を精度よく実現可能である。
また、本実施形態の評価方法は、上記のとおり、特定物質の代謝活性が明確な微生物試料を調製可能であるため、ＲＮＡの塩基配列の解読が網羅的な解読である場合に好適である。網羅的に解読され、膨大な量解読された塩基配列を用いてＲＮＡの発現解析を行う場合あっても、特定物質の代謝活性の評価を精度よく実現可能である。
＜第二実施形態＞
本実施形態の評価方法は、上記の第一実施形態の評価方法において、前記培養工程が、１種類以上の微生物を前記特定物質の飢餓状態で飢餓培養し、その後前記微生物を、特定物質を代謝可能な第１の条件で本培養することで得られる第１の微生物試料と、特定物質を代謝可能な第２の条件で本培養することで得られる第２の微生物試料と、を用意する工程である方法である。
本実施形態の評価方法も、上記第一実施形態の評価方法と同じく、培養工程、解読工程、及び評価工程を含み、上記各工程に加えて、さらに確認工程を含んでもよい。培養工程、解読工程、評価工程、及び確認工程について、上記第一実施形態の評価方法と共通する内容について説明を省略する。
本実施形態の評価方法は、上記の第一実施形態の評価方法において、前記培養工程が、１種類以上の微生物を前記特定物質の飢餓状態で飢餓培養し、その後前記微生物を、特定物質を代謝可能な第１の条件で本培養することで得られる第１の微生物試料と、特定物質を代謝可能な第２の条件で本培養することで得られる第２の微生物試料と、を用意する工程である方法である。
本実施形態の評価方法も、上記第一実施形態の評価方法と同じく、培養工程、解読工程、及び評価工程を含み、上記各工程に加えて、さらに確認工程を含んでもよい。培養工程、解読工程、評価工程、及び確認工程について、上記第一実施形態の評価方法と共通する内容について説明を省略する。
本実施形態における培養工程では、飢餓培養に続く本培養において、互いに条件の異なる第１の条件および第２の条件でそれぞれについて培養を行う。例えば、第１の条件として、特定物質としてチオシアン酸ナトリウムおよび塩化アンモニウムを含み、フェノールを含まない培地での培養とし、第２の条件として、特定物質としてフェノール及び塩化アンモニウムを含み、チオシアン酸ナトリウムを含まない培地での培養とする培養工程が挙げられる。
異なる条件とは、上記のように培地における特定物質の含有量の違いのほか、温度条件や曝気条件などのその他の培養条件であってよい。
異なる条件とは、上記のように培地における特定物質の含有量の違いのほか、温度条件や曝気条件などのその他の培養条件であってよい。
解読工程及び評価工程では、第１の微生物試料と、第２の微生物試料のそれぞれに対して解読及び評価を行うことができる。更に、第１の微生物試料と、第２の微生物試料のそれぞれに対して得られた評価結果を比較できる。
以上のように、実施形態の評価方法においては、微生物を前記特定物質の飢餓状態で飢餓培養し、その後、前記微生物を特定物質を代謝可能な条件で本培養することで得られる微生物試料中の、ＲＮＡ塩基配列を解読し、解読された塩基配列の検出頻度を指標にして、微生物による前記特定物質の代謝活性を評価する。
従来の方法では、異なる複数の水処理リアクターを運転し、それぞれの微生物試料から抽出したＲＮＡを比較することを試みるような場合、以下のような問題により、十分な精度が得られなかった。１）リアクター間の条件のバイアスが大きくならないように、複数のリアクターを安定して運転することは困難。２）複数のリアクターで運転すると異なる微生物が優占するので比較が困難。
それに対して、本実施形態の評価方法では、微生物を飢餓培養して特定物質の代謝を一旦低下させ、その後の本培養にて代謝を再び活性化させることで、異なる条件間で特定物質の代謝活性の違いが明確な微生物試料を調製可能となる。加えて、飢餓培養ではリアクター間のバイアスも小さくできる。加えて、リアクターは通常数週～数か月間運転するが、本実施形態での培養は数時間で完了する。そのため、異なる培養条件のもと取得されたサンプル間の、塩基配列の検出頻度からＲＮＡの発現解析を行う場合であっても、条件間での特定物質の代謝活性の比較評価を精度よく実現可能である。
上記の≪微生物による特定物質の代謝活性を定量評価する評価方法≫により、微生物試料から、本実施形態のチオシアン酸デヒドロゲナーゼを単離することができる。以下、本実施形態のチオシアン酸デヒドロゲナーゼについて説明する。
≪チオシアン酸デヒドロゲナーゼ≫
本実施形態のチオシアン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、以下、ＴｃＤＨともいう）は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質である。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、ＴｃＤＨ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ＴｃＤＨ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９８％以上のアミノ酸配列を含み、ＴｃＤＨ活性を有するタンパク質
本実施形態のチオシアン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、以下、ＴｃＤＨともいう）は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質である。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、ＴｃＤＨ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ＴｃＤＨ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９８％以上のアミノ酸配列を含み、ＴｃＤＨ活性を有するタンパク質
前記（ａ）において、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、後述の実施例で取得されたＴｃＤＨのアミノ酸配列である。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸としては、配列番号２で表される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
本実施形態のＴｃＤＨは、ＴｃＤＨ活性を有するタンパク質である限りにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して変異を有するものであってよく、前記（ｂ）のタンパク質、及び（ｃ）のタンパク質であってもよい。
前記（ｂ）のタンパク質において、１又は数個とは、例えば、１～３０個であってもよく、１～２０個であってもよく、１～１０個であってもよく、１～５個であってもよく、１～４個であってもよく、１～３個であってもよく、１～２個であってもよい。
前記（ｃ）のタンパク質において、アミノ酸配列の配列同一性は９８％以上であってもよく、９９％以上であってもよい。アミノ酸配列の配列同一性は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース上で提供されるＢＬＡＳＴ検索により求めることができる。
（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質は、ＴｃＤＨ活性を有する。本発明のＴｃＤＨ活性とは、図１に示す通り、ＯＣＮ経路で、チオシアンをシアン酸と元素硫黄（Ｓ０）に分解する活性であってよい。ＴｃＤＨの候補タンパク質がＴｃＤＨ活性を有することは、当該候補タンパク質の機能を解析することにより判断でき、例えば、本来はチオシアン分解能を有していない微生物に、ＴｃＤＨの候補タンパク質の遺伝子を導入し、ＴｃＤＨの候補タンパク質を発現させる。そして、当該微生物がチオシアン分解能を獲得した場合、当該候補タンパク質はＴｃＤＨであると判断できる。
本実施形態のＴｃＤＨは、配列番号１で表されるアミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、また、当該ＴｃＤＨをコードする遺伝子を用いて、公知のタンパク質発現系によって製造することができる。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して変異を有するＴｃＤＨは、配列番号１で表されるアミノ酸配列基づき、公知のアミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて製造することもできる。
当該実施形態に係るＴｃＤＨは、チオシアンの分解に使用することができ、排水処理や物質製造など種々の反応に用いることができる。
当該実施形態に係るＴｃＤＨは、チオシアンの分解に使用することができ、排水処理や物質製造など種々の反応に用いることができる。
≪検出試薬≫
以下、実施形態の検出試薬について説明する。
実施形態の検出試薬は、（Ｉ）～（ＶＩ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
（Ｉ）本発明に係るＴｃＤＨの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩ）本発明に係るＴｃＤＨの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列と相補的な塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＶ）前記（ＩＩ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｖ）前記（Ｉ）の部分配列との配列同一性が９８％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＶＩ）前記（ＩＩ）の部分配列との配列同一性が９８％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
以下、実施形態の検出試薬について説明する。
実施形態の検出試薬は、（Ｉ）～（ＶＩ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
（Ｉ）本発明に係るＴｃＤＨの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩ）本発明に係るＴｃＤＨの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列と相補的な塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＶ）前記（ＩＩ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｖ）前記（Ｉ）の部分配列との配列同一性が９８％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＶＩ）前記（ＩＩ）の部分配列との配列同一性が９８％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
本明細書における「遺伝子」とは、ゲノム上のＴｃＤＨの転写産物に対応するタンパク質コード領域の他に、イントロン、非翻訳領域、及び隣接した転写調節領域を含んでもよい。隣接した転写調節領域としては、プロモーターが挙げられる。ここでのＴｃＤＨの「遺伝子産物」としては、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体が挙げられる。
実施形態の検出試薬におけるＴｃＤＨの遺伝子とは、上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である。
実施形態の検出試薬において、前記（Ｉ）の部分配列とは、本発明に係るＴｃＤＨの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の全部は含まない、前記塩基配列の任意の連続する一部の塩基配列であって、後述するプローブ又はプライマーとして使用可能な長さを有する。
実施形態の検出試薬において、前記（ＩＩ）の部分配列とは、本発明のＴｃＤＨ遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列と相補的な塩基配列の全部は含まない、前記塩基配列の任意の連続する一部の塩基配列であって、後述するプローブ又はプライマーとして使用可能な長さを有する。
実施形態の検出試薬において、前記（Ｉ）と（ＩＩ）のポリヌクレオチドは、ＴｃＤＨの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列、又は該部分配列と相補的な配列を含んでいるので、前記ＴｃＤＨの遺伝子若しくは該遺伝子産物とハイブリダイズすることで、これらの存在を検出できる。
ポリヌクレオチド同士のハイブリダイズは、完全に相補的な配列同士でなくとも生じることが知られている。そのため、前記（Ｉ）又は（ＩＩ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする限りにおいて、ポリヌクレオチドは変異を有するものであってよい。実施形態の検出試薬が含んでもよいポリヌクレオチドとしては、例えば、前記（ＩＩＩ）～（ＶＩ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
実施形態の検出試薬において、前記（Ｉ）の部分配列とは、本発明に係るＴｃＤＨの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の全部は含まない、前記塩基配列の任意の連続する一部の塩基配列であって、後述するプローブ又はプライマーとして使用可能な長さを有する。
実施形態の検出試薬において、前記（ＩＩ）の部分配列とは、本発明のＴｃＤＨ遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列と相補的な塩基配列の全部は含まない、前記塩基配列の任意の連続する一部の塩基配列であって、後述するプローブ又はプライマーとして使用可能な長さを有する。
実施形態の検出試薬において、前記（Ｉ）と（ＩＩ）のポリヌクレオチドは、ＴｃＤＨの遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列、又は該部分配列と相補的な配列を含んでいるので、前記ＴｃＤＨの遺伝子若しくは該遺伝子産物とハイブリダイズすることで、これらの存在を検出できる。
ポリヌクレオチド同士のハイブリダイズは、完全に相補的な配列同士でなくとも生じることが知られている。そのため、前記（Ｉ）又は（ＩＩ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする限りにおいて、ポリヌクレオチドは変異を有するものであってよい。実施形態の検出試薬が含んでもよいポリヌクレオチドとしては、例えば、前記（ＩＩＩ）～（ＶＩ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
上記において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃以上７０℃以下で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
前記（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の配列において、１又は複数個とは、例えば、１～３０個であってもよく、１～２０個であってもよく、１～１０個であってもよく、１～５個であってもよく、１～４個であってもよく、１～３個であってもよく、１～２個であってもよい。
前記（Ｖ）及び（ＶＩ）の配列において、塩基配列の配列同一性は９８％以上であってもよく、９９％以上であってもよい。塩基配列の配列同一性は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース上で提供されるＢＬＡＳＴ検索により求めることができる。
実施形態の検出試薬に含まれるポリヌクレオチドは、プライマー又はプローブとして使用することができる。実施形態の検出試薬に含まれるポリヌクレオチドの長さは、プライマー又はプローブとして使用可能な長さであればよく、用途により適切な長さを適宜選択できる。検出試薬がプローブである場合、プローブの長さは、例えば、１０～５００塩基であってよく、２０～２００塩基であってよく、５０～１００塩基であってよい。検出試薬がプライマーである場合、プライマーの長さは、例えば、１０～４０塩基であってよく、１８～３５塩基であってよく、２０～２５塩基であってよい。当該ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
実施形態の検出試薬がプライマーである場合、実施形態の検出試薬は、前記（Ｉ）、（ＩＩＩ）、及び（Ｖ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドと、前記（ＩＩ）、（ＩＶ）、及び（ＶＩ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含んでいてもよい。
実施形態の検出試薬に含まれるポリヌクレオチドは、ＤＮＡが好ましく、ＤＮＡと同様の機能を有するものであれば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）やＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。
＜プライマーセット＞
実施形態の検出試薬は、前記ＴｃＤＨ活性を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（１）～（６）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（７）～（１２）からなる群から選ばれるすくなくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備えていてもよい。
（１）配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５）配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６）配列番号７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７）配列番号４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（８）配列番号４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（９）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１０）配列番号６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１１）配列番号８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１２）配列番号８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１）配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５）配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６）配列番号７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７）配列番号４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（８）配列番号４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（９）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１０）配列番号６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１１）配列番号８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１２）配列番号８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
配列番号３～８で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の部分配列、又は当該部分配列と相補的な配列である。これら（１）～（１２）のポリヌクレオチドの組み合わせによれば、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＴｃＤＨのチオシアン分解活性を検出可能である。
検出試薬が備えるポリヌクレオチドの、好ましい組み合わせとしては、
（１）及び／又は（２）のポリヌクレオチドと、（７）及び／又は（８）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（３）及び／又は（４）のポリヌクレオチドと、（９）及び／又は（１０）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（５）及び／又は（６）のポリヌクレオチドと、（１１）及び／又は（１２）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
（１）及び／又は（２）のポリヌクレオチドと、（７）及び／又は（８）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（３）及び／又は（４）のポリヌクレオチドと、（９）及び／又は（１０）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（５）及び／又は（６）のポリヌクレオチドと、（１１）及び／又は（１２）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
前記（２）、（４）、（６）、（８）、（１０）及び（１２）のポリヌクレオチドにおいて、１又は複数個とは、例えば、１～５個であってもよく、１～４個であってもよく、１～３個であってもよく、１～２個であってもよい。また、これらポリヌクレオチドの３’末端から２塩基には塩基の欠失、置換及び付加が存在しないことが好ましい。
当該実施形態に係る検出試薬によれば、ＴｃＤＨ活性を精度よく検出することができる。
≪検出方法≫
実施形態の検出方法は、上記実施形態の検出試薬を用いて、ＴｃＤＨ活性を検出する方法である。
実施形態の検出方法は、上記実施形態の検出試薬を用いて、ＴｃＤＨ活性を検出する方法である。
実施形態の検出試薬に含まれるポリヌクレオチドは、プライマー又はプローブとして使用することができる。プライマー又はプローブを用いたＴｃＤＨ活性の検出方法は、特に制限されず、各種方法に適用可能である。例えば、ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、マイクロアレイ、シーケンス解析等の各種方法が挙げられる。
実施形態の検出方法は、分析対象物からＲＮＡを抽出する工程と、前記ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程と、上記実施形態のプライマーセットを用いて、前記ｃＤＮＡの増幅反応を行う工程と、前記増幅反応により増幅された増幅産物の検出によりＴｃＤＨ活性を検出する工程、とを有する。上記ｃＤＮＡの合成工程と、ｃＤＮＡの増幅工程と、ＴｃＤＨ活性の検出工程は、PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2等のキット等を用いて同時に実施することもできる。
増幅反応としては、ＰＣＲ法が挙げられる。増幅産物の検出は、例えば、アガロースゲル電気泳動等により、増幅産物を観察することにより行ってもよい。また、ＳＹＢＲグリーン等のインターカレーター色素の存在下でＰＣＲを行い、インターカレーター色素の蛍光を検出することにより行ってもよい。
本実施形態に係る検出方法により、前記ＴｃＤＨ活性が検出された場合には、前記分析対象物にＴｃＤＨが存在すると判定できる。また、前記分析対象物にＴｃＤＨ活性が存在するとの判定により、前記分析対象物にＴｃＤＨの遺伝子を有する微生物が存在すると判断することも可能となる。
≪定量方法≫
実施形態の定量方法は、上記実施形態の検出試薬を用いて、ＴｃＤＨ遺伝子の発現量を定量する方法である。
実施形態の定量方法は、上記実施形態の検出試薬を用いて、ＴｃＤＨ遺伝子の発現量を定量する方法である。
実施形態の定量方法は、分析対象物からＲＮＡを抽出する工程と、前記ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程と、上記実施形態のプライマーセットを用いて、前記ｃＤＮＡの増幅反応を行う工程と、前記増幅反応により増幅された増幅産物の定量により、ＴｃＤＨの発現量を定量する工程とを有する。上記ｃＤＮＡの合成工程と、ｃＤＮＡの増幅工程と、ＴｃＤＨの発現量を定量する工程は、One Step TB GreenTM PrimeScriptTM PLUS RT-PCR Kit （Perfect Real Time）等のキット等を用いて同時に実施することもできる。
ＴｃＤＨ遺伝子の発現量の定量は、例えば、増幅産物に対応する遺伝子のコピー数と、蛍光強度の相関関係を利用した検量線を予め用意することにより、蛍光強度からＴｃＤＨ遺伝子のコピー数を定量することにより実施できる。
ＴｃＤＨ遺伝子の発現量の定量は、例えば、増幅産物に対応する遺伝子のコピー数と、蛍光強度の相関関係を利用した検量線を予め用意することにより、蛍光強度からＴｃＤＨ遺伝子のコピー数を定量することにより実施できる。
当該実施形態に係る定量方法によれば、前記増幅産物を定量することで、前記分析対象物に含まれるＴｃＤＨ遺伝子のコピー数を定量できる。また、前記分析対象物におけるＴｃＤＨ遺伝子のコピー数から、前記分析対象物に存在するＴｃＤＨの量を定量することも可能となる。
≪処理方法≫
＜第１実施形態＞
本実施形態の処理方法は、チオシアンと、上記実施形態のＴｃＤＨと、を含む混合相を形成させ、前記ＴｃＤＨにより前記チオシアンを分解させる処理工程を有する。上記実施形態のＴｃＤＨは、チオシアン分解活性を有するので、チオシアンとＴｃＤＨが反応し、チオシアンがシアン酸と元素硫黄に分解される。
チオシアンとしては、チオシアン酸塩であってもよく、チオシアン酸イオンであってもよい。チオシアン酸塩としては、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム等が挙げられる。
＜第１実施形態＞
本実施形態の処理方法は、チオシアンと、上記実施形態のＴｃＤＨと、を含む混合相を形成させ、前記ＴｃＤＨにより前記チオシアンを分解させる処理工程を有する。上記実施形態のＴｃＤＨは、チオシアン分解活性を有するので、チオシアンとＴｃＤＨが反応し、チオシアンがシアン酸と元素硫黄に分解される。
チオシアンとしては、チオシアン酸塩であってもよく、チオシアン酸イオンであってもよい。チオシアン酸塩としては、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム等が挙げられる。
本実施形態の処理方法によれば、本発明に係るＴｃＤＨを用いることで、チオシアンの分解が可能である。
＜第２実施形態＞
（処理工程）
本実施形態の処理方法は、チオシアンを含有する被処理水と、ＴｃＤＨを有する微生物とを含む混合相を形成させ、前記チオシアンをシアン酸に分解する処理工程を有する。
（処理工程）
本実施形態の処理方法は、チオシアンを含有する被処理水と、ＴｃＤＨを有する微生物とを含む混合相を形成させ、前記チオシアンをシアン酸に分解する処理工程を有する。
チオシアンを含有する被処理水としては、各種工場排水が挙げられ、コークス炉から排出された安水が好ましい。
チオシアンを含有する被処理水と、ＴｃＤＨを有する微生物とを混合させ、これらを含む混合相を形成させる。例えば、ＴｃＤＨを有する微生物を含んだ活性汚泥が溜められた処理槽に、チオシアンを含有する被処理水を導入すると、前記混合相が形成される。
被処理水に含まれるチオシアンとしては、チオシアン酸塩であってもよく、チオシアン酸イオンであってもよい。チオシアン酸塩としては、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム等が挙げられる。
処理工程は、嫌気的条件下で行われてもよいが、好気的条件下で行われることが好ましい。
（検出工程）
本実施形態の処理方法は、前記チオシアンをシアン酸に分解するシアン酸経路に係る酵素活性を検出する検出工程を有する。
本実施形態の処理方法は、前記チオシアンをシアン酸に分解するシアン酸経路に係る酵素活性を検出する検出工程を有する。
チオシアンの分解には、図１に示すとおり、シアン酸を経由してチオシアンを分解するシアン酸経路と、硫化カルボニルを経由してチオシアンを分解する硫化カルボニル経路と、がある。
シアン酸経路は、図１に示すとおり、チオシアンが、シアン酸及び元素硫黄に分解される経路である。シアン酸経路に係る酵素としては、当該経路に係る反応に関与する酵素が挙げられ、未知の酵素であってもよく、ＴｃＤＨが好ましい。
本実施形態の処理方法におけるＴｃＤＨは、チオシアン分解酵素活性を有する。ＴｃＤＨ活性とは、チオシアンを分解する活性であり、図１に示す通り、チオシアンを、シアン酸と元素硫黄へと分解する活性であってよい。
ＴｃＤＨとしては、例えば上記≪チオシアン酸デヒドロゲナーゼ≫で例示したものが挙げられる。ＴｃＤＨ活性の検出には、上記実施形態の検出試薬を用いてもよく、例えば＜検出方法・定量方法＞で例示した方法により実施することができる。
なお、本実施形態の検出工程では、酵素活性として、タンパク質を検出してもよい。タンパク質の検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等の種々の方法が採用できる。
なお、本実施形態の検出工程では、酵素活性として、タンパク質を検出してもよい。タンパク質の検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等の種々の方法が採用できる。
本実施形態の処理方法は、検出工程として、更に、硫化カルボニルを経由して前記チオシアンを分解する硫化カルボニル経路に係る酵素活性を検出する第二検出工程を有してもよい。
硫化カルボニル経路は、図１に示すとおり、チオシアンが、硫化カルボニルを経由して二酸化炭素と硫化水素へと分解される経路である。硫化カルボニル経路に係る酵素としては、当該経路に係る反応に関与する酵素が挙げられ、未知の酵素であってもよく、硫化カルボニル分解酵素であってもよく、チオシアン酸ヒドロラーゼであってもよい。
実施形態の処理方法におけるチオシアン酸ヒドロラーゼは、チオシアン分解活性を有する。チオシアン酸ヒドロラーゼは「EC 3.5.5.8」が付与されている。チオシアン酸ヒドロラーゼ活性とは、チオシアン又はチオシアン酸イオンを加水分解する活性であり、図１に示す通り、チオシアン又はチオシアン酸イオンを、硫化カルボニルへと分解する活性であってよい。
チオシアン酸ヒドロラーゼの候補タンパク質がチオシアン分解活性を有することは、当該候補タンパク質の機能を解析することにより判断できる。例えば、本来はチオシアン分解能を有していない微生物に、チオシアン酸ヒドロラーゼの候補タンパク質の遺伝子を導入し、チオシアン酸ヒドロラーゼの候補タンパク質を発現させる。そして、当該微生物がチオシアン分解能を獲得した場合、当該候補タンパク質はチオシアン酸ヒドロラーゼであると判断できる。
酵素活性の検出対象は、前記混合相であってよく、前記混合相からサンプリングして得られたサンプルであってよい。サンプルからの核酸又はタンパク質の抽出方法は公知の方法により行うことができる。サンプリングは、処理工程の開始前や終了後に行ってもよいが、処理工程での処理状況を把握するとの観点から、処理工程の途中で行うことが好ましい。
検出工程は、処理工程と別々に行ってもよく、同時に行ってもよい。検出工程は、処理工程において経時的に行ってもよい。
検出工程は、処理工程と別々に行ってもよく、同時に行ってもよい。検出工程は、処理工程において経時的に行ってもよい。
当該実施形態に係る処理方法によれば、ＴｃＤＨ活性を検出する検出工程を有することで、処理水に含まれる微生物のＴｃＤＨの発現や活性化状況を把握することが可能となる。また、処理水におけるシアン酸経路でチオシアンを分解する微生物の存在や量を把握することが可能となる。
従来、チオシアンを含む排水の処理において、硫化カルボニル経路でチオシアンを分解する微生物が分離されていたため、当該微生物に関する情報を得ることで、チオシアンの処理状況を把握や制御が試みられてきた。
今回、発明者らは、チオシアンを含む排水の処理において、シアン酸経路によるチオシアンの分解が生じていることを見出した。さらにシアン酸経路が硫化カルボニル経路よりも、優勢となり得ることを見出した。
当該実施形態に係る処理方法によれば、処理水に含まれる微生物のシアン酸経路の存在や活性化状況、シアン酸経路でチオシアンを分解する微生物の存在や量をモニタリングすることができるので、シアン酸経路によるチオシアンの処理が向上するよう処理条件をコントロールでき、シアン酸経路によるチオシアンの処理効率を向上させることができる。
硫化カルボニルは温室効果ガスのため、硫化カルボニルの発生を抑えつつチオシアンを分解することが望ましい。
当該実施形態に係る処理方法によれば、シアン酸経路に係るモニタリングに加え、処理水に含まれる微生物の硫化カルボニル経路の存在や活性化状況、硫化カルボニル経路でチオシアンを分解する微生物の存在や量をモニタリングすることで、例えば、硫化カルボニル経路よりも、シアン酸経路によるチオシアンの処理が向上するよう処理条件をコントロールでき、硫化カルボニルの発生を制御しつつ、チオシアンの処理を行うことができる。
当該実施形態に係る処理方法によれば、シアン酸経路に係るモニタリングに加え、処理水に含まれる微生物の硫化カルボニル経路の存在や活性化状況、硫化カルボニル経路でチオシアンを分解する微生物の存在や量をモニタリングすることで、例えば、硫化カルボニル経路よりも、シアン酸経路によるチオシアンの処理が向上するよう処理条件をコントロールでき、硫化カルボニルの発生を制御しつつ、チオシアンの処理を行うことができる。
以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕
＜試料準備工程＞生物学的排水処理プロセスの運転、水質分析、分解速度算出および微生物試料の採取
先ず、本発明に用いる１種類以上の微生物を含む試験体を以下によって準備した。
特開２０１６－１１２５５６号公報に記載の方法に沿って微生物サンプルを得て、工業用水と自然海水とを体積比２：３で混合して得られた溶媒中に、表１に示す溶質を表１に示す濃度で溶解し、人工排水（被処理水）を調製した。
先ず、本発明に用いる１種類以上の微生物を含む試験体を以下によって準備した。
特開２０１６－１１２５５６号公報に記載の方法に沿って微生物サンプルを得て、工業用水と自然海水とを体積比２：３で混合して得られた溶媒中に、表１に示す溶質を表１に示す濃度で溶解し、人工排水（被処理水）を調製した。
また、図２に示すように、１つの槽内で生物処理領域２０ａと沈降領域２０ｂとが隔壁２３により互いに隔てられていると共にこの隔壁２３の下方で互いに連通する構造を有する一体型の生物処理装置２０（処理槽）を用意した。また、ポリ瓶に１０ｍｍ×１０ｍｍ×１０ｍｍの大きさのスポンジ担体〔流動担体（関東イノアック製ＡＱ－１）〕と微生物植種源として高濃度の活性汚泥を投入し、手でよく揉み、一晩蓋をして浸け置くことで、微生物をスポンジ担体に付着させた。
このようにして準備されたスポンジ担体２１と活性汚泥を生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内にスポンジ担体２１の体積比が２０体積％となるように投入し、生物処理装置２０を準備した。
このようにして準備されたスポンジ担体２１と活性汚泥を生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内にスポンジ担体２１の体積比が２０体積％となるように投入し、生物処理装置２０を準備した。
このようにして準備された生物処理装置２０内にそれぞれ上記の被処理水２４を流入させ、スポンジ担体２１に微生物を定着させる微生物馴致処理（第１段処理）時には、被処理水２４の水理学的滞留時間が２４時間となるように流入させた。また、各生物処理装置２０内の被処理水２４に空気曝気２２を行って好気性流動床を形成させ、微生物の馴致を行った。また、５質量％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．５付近に調整しながら処理を行った。
この生物学的処理の運転開始後、すぐにチオシアン酸イオンの除去が認められ、その後チオシアン酸イオンの除去率が９９％以上で安定したため、１８日目で微生物馴致処理（第１段処理）を終了した。この微生物馴致処理（第１段処理）の期間、被処理水中のアンモニアの２２％以上が亜硝酸イオンに酸化された。
この微生物馴致処理（第１段処理）の終了後、各生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内の処理水についてチオシアン酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度とを測定してチオシアン酸イオン及び亜硝酸イオンのモニタリングを行なった。且つ、各生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内の処理水のｐＨを測定してｐＨ値のモニタリング行いながら、運転開始後１９日目より領域内の水理学的滞留時間が１８時間となるように被処理水２４の流入量を増やし（第２段処理）、次に、運転開始後３９日目より領域内の水理学的滞留時間が１２時間となるように被処理水２４の流入量を更に増やし（第３段処理）、更に、運転開始後４６日目より領域内の水理学的滞留時間が８時間となるように被処理水２４の流入量を更に増やした（第４段処理）。その後、７４日目より領域内の水理学的滞留時間が１０時間となるように被処理水２４の流入量を減らし（第５段処理）、更に９６日目より領域内の水理学的滞留時間が２４時間となるように被処理水２４の流入量を減らし（第６段処理）、最終的に１６４日目まで運転を継続した。
この間、第２段処理において領域内の水理学的滞留時間を１８時間に短縮したことにより、チオシアン酸イオンの除去率を高い値に維持しつつ、亜硝酸イオンの生成の減少傾向が観察され始め、更に領域内の水理学的滞留時間を１２時間に短縮することにより、チオシアン酸イオンの除去率を高い値に維持しつつ、亜硝酸イオンの生成を更に抑制することができた。
しかしながら、更に、第４段処理において領域内の水理学的滞留時間を８時間に短縮した場合には、亜硝酸イオンの生成をほぼ完全に抑制しながらも、しばらく継続するとチオシアン酸イオンの除去率が低下した。
このように、チオシアン酸イオンの除去率が目標値を超えて上昇してしまったため、第５段処理においては、水理学的滞留時間を第４段処理の条件（水理学的滞留時間が１２時間）に近い１０時間に戻して生物学的処理を行った。その結果、チオシアン酸イオンの除去率を９４％以上に維持しつつ、亜硝酸イオンの生成をほぼ完全に抑制することができた。
そこで更に、第６段処理においては、水理学的滞留時間を２４時間に延長したところ、チオシアン酸イオンの除去率を高い値に維持しながらも、更に驚くべきことには、その後７６日間にも亘って、亜硝酸イオンの生成をほぼ完全に抑制することができた。
しかしながら、更に、第４段処理において領域内の水理学的滞留時間を８時間に短縮した場合には、亜硝酸イオンの生成をほぼ完全に抑制しながらも、しばらく継続するとチオシアン酸イオンの除去率が低下した。
このように、チオシアン酸イオンの除去率が目標値を超えて上昇してしまったため、第５段処理においては、水理学的滞留時間を第４段処理の条件（水理学的滞留時間が１２時間）に近い１０時間に戻して生物学的処理を行った。その結果、チオシアン酸イオンの除去率を９４％以上に維持しつつ、亜硝酸イオンの生成をほぼ完全に抑制することができた。
そこで更に、第６段処理においては、水理学的滞留時間を２４時間に延長したところ、チオシアン酸イオンの除去率を高い値に維持しながらも、更に驚くべきことには、その後７６日間にも亘って、亜硝酸イオンの生成をほぼ完全に抑制することができた。
〔実施例２〕
＜工程１＞
１）飢餓培養工程
前記試料準備工程で運転した、運転１２３日目の生物処理装置２０より、微生物が付着したスポンジ担体を採取した。採取したスポンジ担体を使って飢餓培養を実施した。
２本のプラスチックボトルに、対象とする代謝に関わる特定物質（チオシアン、フェノール）およびアンモニアが含まれない無機塩培地［炭酸水素ナトリウム６５０ ｍｇ／Ｌ、燐酸水素二ナトリウム２９．２ ｍｇ／Ｌを工業用水（工水）と自然海水を体積比２：３で混合した溶媒に溶解］を２００ｍＬずつ投入した。各プラスチックボトルに、採取したスポンジ担体６個を投入し、ボトルを７時間、１２５ｒｐｍで回転振盪培養した。
＜工程１＞
１）飢餓培養工程
前記試料準備工程で運転した、運転１２３日目の生物処理装置２０より、微生物が付着したスポンジ担体を採取した。採取したスポンジ担体を使って飢餓培養を実施した。
２本のプラスチックボトルに、対象とする代謝に関わる特定物質（チオシアン、フェノール）およびアンモニアが含まれない無機塩培地［炭酸水素ナトリウム６５０ ｍｇ／Ｌ、燐酸水素二ナトリウム２９．２ ｍｇ／Ｌを工業用水（工水）と自然海水を体積比２：３で混合した溶媒に溶解］を２００ｍＬずつ投入した。各プラスチックボトルに、採取したスポンジ担体６個を投入し、ボトルを７時間、１２５ｒｐｍで回転振盪培養した。
２）本培養工程
飢餓培養工程後、1本のプラスチックボトルには、９０ｍｇＳＣＮ／Ｌになるようチオシアン酸ナトリウムと、終濃度が４００ｍｇＮ／Ｌになるよう塩化アンモニウムと、をそれぞれ添加した（チオシアン＋アンモニア）。もう１本のプラスチックボトルには終濃度が５０ｍｇ／Ｌになるようフェノールと、終濃度が４００ｍｇＮ／Ｌになるよう塩化アンモニウムと、をそれぞれ添加した（フェノール＋アンモニア）。
添加後に培養前の水質分析用試料を採取し、その後１７時間振盪培養した。
培養前後のチオシアン酸イオン、フェノール、アンモニアイオン、亜硝酸イオンおよび硝酸イオン濃度を測定した結果、表２に示すように、チオシアンまたはフェノールが培養期間中に分解されていることが確認された。
飢餓培養工程後、1本のプラスチックボトルには、９０ｍｇＳＣＮ／Ｌになるようチオシアン酸ナトリウムと、終濃度が４００ｍｇＮ／Ｌになるよう塩化アンモニウムと、をそれぞれ添加した（チオシアン＋アンモニア）。もう１本のプラスチックボトルには終濃度が５０ｍｇ／Ｌになるようフェノールと、終濃度が４００ｍｇＮ／Ｌになるよう塩化アンモニウムと、をそれぞれ添加した（フェノール＋アンモニア）。
添加後に培養前の水質分析用試料を採取し、その後１７時間振盪培養した。
培養前後のチオシアン酸イオン、フェノール、アンモニアイオン、亜硝酸イオンおよび硝酸イオン濃度を測定した結果、表２に示すように、チオシアンまたはフェノールが培養期間中に分解されていることが確認された。
＜工程２＞RNAの抽出
工程１の本培養後に採取したスポンジ担体をハサミで4分割した。分割した破片2つずつをビーズ充填チューブ（Lysing MatrixE、MP-Biomedicals社)にそれぞれ投入し、ＲＮＡを抽出した。各条件６個のスポンジ担体を培養したため、チューブは各条件１２本ずつ用意した。
ビーズ充填チューブにRNeasy Mini kit（QIAGEN社）付属のBuffer RLTを1mLと1M DTT （dithiothreitol、 Sigma-Aldrich社）を４０μＬ投入し、bead beaterを用いて最大速度、６０秒間で振盪し、菌体をビーズ破砕した。チューブを１３，０００ｇで２分間遠心分離し、上澄み７００μＬを新しいチューブ移した。１３，０００ｇで３分間遠心分離し、上澄み３５０μＬをRNeasy Mini kit付属のカラムチューブに移し、当該キット説明書に従い、ＲＮＡを精製した。ＤＮａｓｅＩ処理も説明書に従い実施し、試料中のＤＮＡを除去した。
ＲＮＡ精製後、チューブ４本分のＲＮＡ試料をチューブ１本にまとめた。各チューブの試料量は約４００μＬとなるが、３００μＬは別のチューブに移した。
工程１の本培養後に採取したスポンジ担体をハサミで4分割した。分割した破片2つずつをビーズ充填チューブ（Lysing MatrixE、MP-Biomedicals社)にそれぞれ投入し、ＲＮＡを抽出した。各条件６個のスポンジ担体を培養したため、チューブは各条件１２本ずつ用意した。
ビーズ充填チューブにRNeasy Mini kit（QIAGEN社）付属のBuffer RLTを1mLと1M DTT （dithiothreitol、 Sigma-Aldrich社）を４０μＬ投入し、bead beaterを用いて最大速度、６０秒間で振盪し、菌体をビーズ破砕した。チューブを１３，０００ｇで２分間遠心分離し、上澄み７００μＬを新しいチューブ移した。１３，０００ｇで３分間遠心分離し、上澄み３５０μＬをRNeasy Mini kit付属のカラムチューブに移し、当該キット説明書に従い、ＲＮＡを精製した。ＤＮａｓｅＩ処理も説明書に従い実施し、試料中のＤＮＡを除去した。
ＲＮＡ精製後、チューブ４本分のＲＮＡ試料をチューブ１本にまとめた。各チューブの試料量は約４００μＬとなるが、３００μＬは別のチューブに移した。
＜工程３＞抽出ＲＮＡの品質確認（総ＲＮＡ量および既知遺伝子発現量の定量）
工程２で抽出した試料の一部をQubit（登録商標） RNA HS Assay KitおよびQubit dsDNA HS Assay Kit（ライフテクノロジー社）と反応させた後、蛍光光度計（Qubit 2.0 Fluorometer、ライフテクノロジー社）によりＤＮＡおよびＲＮＡ濃度をそれぞれ測定した。その結果、表３に示すように、ＲＮＡ量に対してＤＮＡ量が少なく、ＤＮＡ除去およびＲＮＡ抽出に成功したことが確認できた。
工程２で抽出した試料の一部をQubit（登録商標） RNA HS Assay KitおよびQubit dsDNA HS Assay Kit（ライフテクノロジー社）と反応させた後、蛍光光度計（Qubit 2.0 Fluorometer、ライフテクノロジー社）によりＤＮＡおよびＲＮＡ濃度をそれぞれ測定した。その結果、表３に示すように、ＲＮＡ量に対してＤＮＡ量が少なく、ＤＮＡ除去およびＲＮＡ抽出に成功したことが確認できた。
＜工程４＞
続いて、ＲＮＡ試料から逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はPrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)（タカラバイオ社）および同キットにあるrandom 6merを用いて、説明書に従い実施した。
合成したｃＤＮＡおよびＲＮＡ試料はリアルタイムＰＣＲを用いて、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を定量した。加えて、１０２から１０７コピーになるよう調製した細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検量線試料として定量した。リアルタイムＰＣＲ法反応試薬はSYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はThermal Cycler Dice(登録商標） Real Time System II MRQ（タカラバイオ）を用いた。表４に示すプライマーセット（Fierer et al., Applied and Environmental Microbiology. 2005. 71(7). 4117-4120）を用いて、ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、５３℃２０秒、７２℃２０秒の反応を４５サイクル繰り返した。検量線試料の結果から、合成したｃＤＮＡおよびＲＮＡ試料中の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数を算出した。ＲＮＡ試料中には除去しきれなかったＤＮＡが定量され、ｃＤＮＡ試料中にはＲＮＡが逆転写されたｃＤＮＡ及び除去しきれなかったＤＮＡが定量される。
ＲＮＡ試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数をｃＤＮＡ試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数で除すことで、ＲＮＡ抽出時に残存したＤＮＡ量を計算した結果、上記表３に示したように、残存したＤＮＡ量はＲＮＡより合成したｃＤＮＡの０．０８％未満であり、ここでもＤＮＡ除去およびＲＮＡ抽出に成功したことが確認できた。
続いて、ＲＮＡ試料から逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はPrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)（タカラバイオ社）および同キットにあるrandom 6merを用いて、説明書に従い実施した。
合成したｃＤＮＡおよびＲＮＡ試料はリアルタイムＰＣＲを用いて、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を定量した。加えて、１０２から１０７コピーになるよう調製した細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検量線試料として定量した。リアルタイムＰＣＲ法反応試薬はSYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はThermal Cycler Dice(登録商標） Real Time System II MRQ（タカラバイオ）を用いた。表４に示すプライマーセット（Fierer et al., Applied and Environmental Microbiology. 2005. 71(7). 4117-4120）を用いて、ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、５３℃２０秒、７２℃２０秒の反応を４５サイクル繰り返した。検量線試料の結果から、合成したｃＤＮＡおよびＲＮＡ試料中の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数を算出した。ＲＮＡ試料中には除去しきれなかったＤＮＡが定量され、ｃＤＮＡ試料中にはＲＮＡが逆転写されたｃＤＮＡ及び除去しきれなかったＤＮＡが定量される。
ＲＮＡ試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数をｃＤＮＡ試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数で除すことで、ＲＮＡ抽出時に残存したＤＮＡ量を計算した結果、上記表３に示したように、残存したＤＮＡ量はＲＮＡより合成したｃＤＮＡの０．０８％未満であり、ここでもＤＮＡ除去およびＲＮＡ抽出に成功したことが確認できた。
＜工程５＞
上記合成したｃＤＮＡを用いて、フェノール分解に関わるＰｈｅｎｏｌ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ遺伝子を定量した。表５に示すプライマーセット（Brett R et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69, 3350-3358.）を用いて、ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、４９℃２０秒、７２℃２０秒の反応を４５サイクル繰り返した。プライマーセットおよび反応条件を除いて上記細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量と同じ条件とした。
上記合成したｃＤＮＡを用いて、フェノール分解に関わるＰｈｅｎｏｌ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ遺伝子を定量した。表５に示すプライマーセット（Brett R et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69, 3350-3358.）を用いて、ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、４９℃２０秒、７２℃２０秒の反応を４５サイクル繰り返した。プライマーセットおよび反応条件を除いて上記細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量と同じ条件とした。
図３に示す通り、フェノールを添加して培養した試料のＰｈｅｎｏｌ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ遺伝子発現量は、チオシアンを添加して培養した試料よりも5.1倍高く、フェノールを添加した培養では当該遺伝子が活性化されていることが確認できた。これにより、培養によりフェノール分解またはチオシアン分解に関わる活性が高まっていることが想定され、抽出したＲＮＡ試料がメタトランスクリプトーム解析に必要な品質であることが確認できた。
＜工程６＞メタトランスクリプトーム解析
工程２で抽出し、工程３～５で品質確認したＲＮＡについて、メタトランスクリプトーム解析を実施した。メタトランスクリプトーム解析では、複数種の混合微生物において発現しているＲＮＡを網羅的に定量測定した。解析操作の概要は、次の通りである。
工程２で抽出し、工程３～５で品質確認したＲＮＡについて、メタトランスクリプトーム解析を実施した。メタトランスクリプトーム解析では、複数種の混合微生物において発現しているＲＮＡを網羅的に定量測定した。解析操作の概要は、次の通りである。
１）抽出したＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）からｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）を除去
ｒＲＮＡはｔｏｔａｌ ＲＮＡ中の大多数を占めるが、環境変化に応じた遺伝子発現変化の情報に乏しいため、あらかじめ除去することで有効なデータ量を増やす狙いがある。
Ribo-ZeroTM Magnetic Kit（イルミナ株式会社）を用い、ｒＲＮＡを除去した。除去前後のサンプルをキャピラリー電気泳動によって検討した結果、図４に示すように、ｒＲＮＡ除去後ではｒＲＮＡの主要なピークである１８Ｓ ｒＲＮＡ、２８Ｓ ｒＲＮＡのどちらも検出されず、ｒＲＮＡの除去が良好に行われたものと判断出来る結果が得られた。
ｒＲＮＡはｔｏｔａｌ ＲＮＡ中の大多数を占めるが、環境変化に応じた遺伝子発現変化の情報に乏しいため、あらかじめ除去することで有効なデータ量を増やす狙いがある。
Ribo-ZeroTM Magnetic Kit（イルミナ株式会社）を用い、ｒＲＮＡを除去した。除去前後のサンプルをキャピラリー電気泳動によって検討した結果、図４に示すように、ｒＲＮＡ除去後ではｒＲＮＡの主要なピークである１８Ｓ ｒＲＮＡ、２８Ｓ ｒＲＮＡのどちらも検出されず、ｒＲＮＡの除去が良好に行われたものと判断出来る結果が得られた。
２）ＲＮＡ－ｓｅｑ用のライブラリ調製
ｒＲＮＡ除去後のＲＮＡサンプルを、９４℃、３分間処理し所定の長さに断片化した後、SMARTer Universal Low Input RNA Kit for Sequencing（タカラバイオ）を用いて二本鎖ｃＤＮＡの合成及び増幅を行った。
ｒＲＮＡ除去後のＲＮＡサンプルを、９４℃、３分間処理し所定の長さに断片化した後、SMARTer Universal Low Input RNA Kit for Sequencing（タカラバイオ）を用いて二本鎖ｃＤＮＡの合成及び増幅を行った。
増幅反応によって得られたｃＤＮＡ １０ｎｇを用い、アダプター、及びインデックスの付加を行った。キットとして、DNA SMART ChIP-Seq Kit（タカラバイオ）を用いた。その結果、図５に示すように、アダプター、インデックス分塩基配列が長くなったライブラリを得た。
３）次世代シーケンサーによるシーケンスデータの取得
作製したライブラリを２サンプル混合（別々のインデックスを付加しているのでデータ解析時に区別可能）し、Miseq Reagent Kit v3 150 cycles（イルミナ）を用いて、Miseqによってシーケンスした。チオシアン＋アンモニア群は約１８６０万リード、フェノール＋アンモニア群は約２４３０万リード得られた。このデータを基本データとして、メタトランスクリプトームのデータ解析を行うこととした。
作製したライブラリを２サンプル混合（別々のインデックスを付加しているのでデータ解析時に区別可能）し、Miseq Reagent Kit v3 150 cycles（イルミナ）を用いて、Miseqによってシーケンスした。チオシアン＋アンモニア群は約１８６０万リード、フェノール＋アンモニア群は約２４３０万リード得られた。このデータを基本データとして、メタトランスクリプトームのデータ解析を行うこととした。
４）シーケンスデータの品質チェック
シーケンスデータはｆａｓｔｑ形式のファイルとしてシーケンサーから排出した。ＦａｓｔＱＣプログラムを用いてシーケンスデータの品質チェックを行い、ｃｕｔａｄａｐｔプログラムを用いてアダプター配列を除去し、ｑｕａｌｉｔｙ ｖａｌｕｅが２０未満のもの、リード長が３０塩基未満のものを除去した。
シーケンスデータはｆａｓｔｑ形式のファイルとしてシーケンサーから排出した。ＦａｓｔＱＣプログラムを用いてシーケンスデータの品質チェックを行い、ｃｕｔａｄａｐｔプログラムを用いてアダプター配列を除去し、ｑｕａｌｉｔｙ ｖａｌｕｅが２０未満のもの、リード長が３０塩基未満のものを除去した。
５）ｄｅ ｎｏｖｏアセンブル
次に、除去処理を経て得られたシーケンスデータを用い、ｔｒｉｎｉｔｙプログラムによってリード配列をｄｅ ｎｏｖｏ アセンブルし、Ｃｏｎｔｉｇ（シーケンスによって得られる短いＤＮＡ配列断片であるリード配列を重ね合わせ得られるコンセンサス配列）を作成した。１１６１２個のＣｏｎｔｉｇリストが得られた。
次に、除去処理を経て得られたシーケンスデータを用い、ｔｒｉｎｉｔｙプログラムによってリード配列をｄｅ ｎｏｖｏ アセンブルし、Ｃｏｎｔｉｇ（シーケンスによって得られる短いＤＮＡ配列断片であるリード配列を重ね合わせ得られるコンセンサス配列）を作成した。１１６１２個のＣｏｎｔｉｇリストが得られた。
６）発現解析
得られたＣｏｎｔｉｇリストをリファレンスＲＮＡリストとして用い、各Ｃｏｎｔｉｇの定量化を行うために、シーケンスデータをＣｏｎｔｉｇリストに対してマッピングした。マッピングにはＢｏｗｔｉｅプログラムを用いた。
チオシアン＋アンモニア群、及びフェノール＋アンモニア群について、ＴＰＭ値、ＦＰＫＭ値を算出した。
得られたＣｏｎｔｉｇリストをリファレンスＲＮＡリストとして用い、各Ｃｏｎｔｉｇの定量化を行うために、シーケンスデータをＣｏｎｔｉｇリストに対してマッピングした。マッピングにはＢｏｗｔｉｅプログラムを用いた。
チオシアン＋アンモニア群、及びフェノール＋アンモニア群について、ＴＰＭ値、ＦＰＫＭ値を算出した。
図６に示した通り、ＴＰＭ値を比較した結果、チオシアン＋アンモニアでより高い値を示したＣｏｎｔｉｇまたはその逆のＣｏｎｔｉｇが確認され、チオシアンまたはフェノール分解によって発現した遺伝子、すなわち活性化した代謝が検出された。
また、図７に示した通り、ＦＰＫＭ値を比較した結果、ＴＰＭ値同様に、チオシアン＋アンモニアでより高い値を示したＣｏｎｔｉｇまたはその逆のＣｏｎｔｉｇが確認され、チオシアンまたはフェノール分解によって発現した遺伝子、すなわち活性化した代謝が検出された。さらに、チオシアン分解に関わるｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ遺伝子はＣＯＧデータベースにないため、追加してＦＰＫＭ値を比較した結果（図中の×がｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ遺伝子）、チオシアン＋アンモニアでフェノール＋アンモニアよりも高い値を示し、やはりチオシアン分解に伴いｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ遺伝子が発現し、チオシアン分解代謝活性が高まっていることが知見された。
〔実施例３〕
（１）チオシアン分解に係る遺伝子候補配列が存在するＣｏｎｔｉｇの選択及び相同性探索
実施例２の６）でチオシアン＋アンモニア培養で高い値を示したＣｏｎｔｉｇの塩基配列をＢｌａｓｔＸを用いて、塩基配列をアミノ酸配列に変換し、Ｅｍｓｅｍｂｌ ｂａｃｔｅｒｉａのデータベースに対して相同性検索を実施し、相同性の高い遺伝子の対応付けを行った。その結果から、ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを遺伝子名称にするＣｏｎｔｉｇを抽出したところ、２つのＣｏｎｔｉｇが得られた。このうちの一つがｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅとの相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が９０％と高く、発現も高かった。ただし、相同性は１００％未満であり、新規な配列であると判断できた。このＣｏｎｔｉｇのｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＴｃＤＨ）の相同領域の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号２、配列番号１に示す。
（１）チオシアン分解に係る遺伝子候補配列が存在するＣｏｎｔｉｇの選択及び相同性探索
実施例２の６）でチオシアン＋アンモニア培養で高い値を示したＣｏｎｔｉｇの塩基配列をＢｌａｓｔＸを用いて、塩基配列をアミノ酸配列に変換し、Ｅｍｓｅｍｂｌ ｂａｃｔｅｒｉａのデータベースに対して相同性検索を実施し、相同性の高い遺伝子の対応付けを行った。その結果から、ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを遺伝子名称にするＣｏｎｔｉｇを抽出したところ、２つのＣｏｎｔｉｇが得られた。このうちの一つがｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅとの相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が９０％と高く、発現も高かった。ただし、相同性は１００％未満であり、新規な配列であると判断できた。このＣｏｎｔｉｇのｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＴｃＤＨ）の相同領域の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号２、配列番号１に示す。
（２）ＴｃＤＨの遺伝子を定量するためのプライマーの設計
定量ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法）により（１）で得られたＴｃＤＨ遺伝子のみを特異的に定量するため、該ＴｃＤＨの遺伝子配列に対して、プライマーを設計した。プライマーの設計にはＰｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴを使用し、塩基配列データベースＢＬＡＳＴで検索することで特異性を確認した。
この結果、表６に示す３組のプライマーセットが設計できた。
定量ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法）により（１）で得られたＴｃＤＨ遺伝子のみを特異的に定量するため、該ＴｃＤＨの遺伝子配列に対して、プライマーを設計した。プライマーの設計にはＰｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴを使用し、塩基配列データベースＢＬＡＳＴで検索することで特異性を確認した。
この結果、表６に示す３組のプライマーセットが設計できた。
（３）培養試験
前記実施例１の工程１と同様の操作により、微生物が付着したスポンジ担体を培養した。
前記実施例１の工程１と同様の操作により、微生物が付着したスポンジ担体を培養した。
（４）ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
前記実施例１の工程２～４と同様の操作により、ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成を実施した。
前記実施例１の工程２～４と同様の操作により、ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成を実施した。
（５）検量線ＤＮＡの調製
（４）で合成したｃＤＮＡからＴｃＤＨ遺伝子を定量するため、検量線ＤＮＡを調製した。チオシアン分解微生物が付着したスポンジ担体よりＤＮＡをＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ（ＭＰ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡ試料は上記（２）に示したプライマーを用いたＰＣＲ反応によりＴｃＤＨ部分のみを増幅した。ＰＣＲ反応はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社）を用いた。各試薬、プライマーの量は当該製品の説明書に従った。ＰＣＲ反応は９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒の反応を３０サイクル繰り返した。
（４）で合成したｃＤＮＡからＴｃＤＨ遺伝子を定量するため、検量線ＤＮＡを調製した。チオシアン分解微生物が付着したスポンジ担体よりＤＮＡをＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ（ＭＰ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡ試料は上記（２）に示したプライマーを用いたＰＣＲ反応によりＴｃＤＨ部分のみを増幅した。ＰＣＲ反応はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社）を用いた。各試薬、プライマーの量は当該製品の説明書に従った。ＰＣＲ反応は９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒の反応を３０サイクル繰り返した。
反応後のＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により酵素などを除去することで試料を精製した。精製後のＰＣＲ産物の一部をＱｕｂｉｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＢＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ライフテクノロジー社）と反応させた後、蛍光光度計（Ｑｕｂｉｔ ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、ライフテクノロジー社）によりＤＮＡ濃度を測定した。定量ＰＣＲ法ではＤＮＡ断片の断片数（コピー数）を基に定量評価するため、下記式１に従い、コピー数に変換した。式中６．０２×１０２３はアボガドロ定数で６６０は２本鎖ＤＮＡの塩基長１あたりの平均分子量である。測定後ＰＣＲ産物を超純水で適宜希釈して検量線用ＤＮＡとした。
（６）定量ＰＣＲ法による定量法確立
調製した検量線ＤＮＡおよびＲＮＡより合成したｃＤＮＡの定量は定量（リアルタイム）ＰＣＲ法を適用し、反応試薬はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ＭＲＱ（タカラバイオ）を用いた。ＤＮＡ試料の調製や、反応試薬、プライマーおよびＤＮＡ試料濃度等の条件詳細はタカラバイオ社の反応試薬にあるプロトコルに従った。ＰＣＲ反応条件は９５℃５秒、６０℃３０秒の反応を４５サイクル繰り返した。
調製した検量線ＤＮＡおよびＲＮＡより合成したｃＤＮＡの定量は定量（リアルタイム）ＰＣＲ法を適用し、反応試薬はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ＭＲＱ（タカラバイオ）を用いた。ＤＮＡ試料の調製や、反応試薬、プライマーおよびＤＮＡ試料濃度等の条件詳細はタカラバイオ社の反応試薬にあるプロトコルに従った。ＰＣＲ反応条件は９５℃５秒、６０℃３０秒の反応を４５サイクル繰り返した。
各プライマーセットを用いて検量線ＤＮＡおよび陰性対照（ＤＮＡを含まない純水）を定量し、その定量性を評価した。定量性は、１）検量線が良好な直線性であること ２）最低濃度の検量線ＤＮＡの定量値が陰性対照よりも１０倍以上高い値を示すこと ３）ＰＣＲ反応１サイクルでのＤＮＡの増幅量が理論的な増幅量である２倍に近いこと、の３つの判断基準から評価した。
上記（２）に示した各プライマーにより検量線サンプルおよび陰性対照を定量し、検量線を作成した。この結果、図８～１０に示した通りいずれのプライマーでも良好な直線性且つ、陰性対照よりも１０倍以上高いコピー数となり、いずれのプライマーでもＴｃＤＨを定量できることが確認できた。
上記（２）に示した各プライマーにより検量線サンプルおよび陰性対照を定量し、検量線を作成した。この結果、図８～１０に示した通りいずれのプライマーでも良好な直線性且つ、陰性対照よりも１０倍以上高いコピー数となり、いずれのプライマーでもＴｃＤＨを定量できることが確認できた。
（７）活性評価（ＴｃＤＨ遺伝子の発現量の変化）
合成したｃＤＮＡのＴｃＤＨ遺伝子の発現量を、プライマーセットとして、ＴｃＤＨ２ＦとＴｃＤＨ２Ｒの組み合わせを用いて定量した。合成したｃＤＮＡから定量したＴｃＤＨ遺伝子の発現量を図１１に示す。ＴｃＤＨ遺伝子の発現はチオシアンを添加して培養した試料（チオシアン）の方が高く、フェノールを添加した培養（フェノール）に比べ２５倍高かった。すなわち、チオシアンを分解するためにＴｃＤＨ遺伝子が多く発現、即ち、ＤＮＡからＲＮＡが多く転写されており、今回確立した定量方法によってチオシアン分解活性を評価できることが示された。なお、プライマーセットをＴｃＤＨ５ＦとＴｃＤＨ５Ｒの組み合わせ、及びＴｃＤＨ９ＦとＴｃＤＨ９Ｒの組み合わせを用いても上記と同様の結果が得られた。
合成したｃＤＮＡのＴｃＤＨ遺伝子の発現量を、プライマーセットとして、ＴｃＤＨ２ＦとＴｃＤＨ２Ｒの組み合わせを用いて定量した。合成したｃＤＮＡから定量したＴｃＤＨ遺伝子の発現量を図１１に示す。ＴｃＤＨ遺伝子の発現はチオシアンを添加して培養した試料（チオシアン）の方が高く、フェノールを添加した培養（フェノール）に比べ２５倍高かった。すなわち、チオシアンを分解するためにＴｃＤＨ遺伝子が多く発現、即ち、ＤＮＡからＲＮＡが多く転写されており、今回確立した定量方法によってチオシアン分解活性を評価できることが示された。なお、プライマーセットをＴｃＤＨ５ＦとＴｃＤＨ５Ｒの組み合わせ、及びＴｃＤＨ９ＦとＴｃＤＨ９Ｒの組み合わせを用いても上記と同様の結果が得られた。
２０…生物処理装置、２０ａ…生物処理領域、２０ｂ…沈降領域、２１…スポンジ担体、２２…空気曝気、２３…隔壁、２４…被処理水、２５…生物処理装置で処理された処理水
Claims (4)
- チオシアンを含有する被処理水と、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質であるチオシアン酸デヒドロゲナーゼを有する微生物とを含む混合相を形成させ、前記チオシアンを分解する処理工程を有し、
前記チオシアンを含有する被処理水が、コークス炉から排出された安水である、
ことを特徴とする処理方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９８％以上のアミノ酸配列を含み、チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質 - 前記チオシアン酸デヒドロゲナーゼ活性を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（１）～（３）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備える検出試薬を用いて前記チオシアン酸デヒドロゲナーゼを検出する検出工程を有する、請求項１に記載の処理方法。
（１）配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド - 更に、硫化カルボニルを経由して前記チオシアンを分解する硫化カルボニル経路に係る酵素活性を検出する第二検出工程を有する請求項２に記載の処理方法。
- 前記硫化カルボニル経路に係る酵素が、チオシアン酸ヒドロラーゼである請求項３に記載の処理方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019228494A JP7421071B2 (ja) | 2019-12-18 | 2019-12-18 | 処理方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019228494A JP7421071B2 (ja) | 2019-12-18 | 2019-12-18 | 処理方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021093975A JP2021093975A (ja) | 2021-06-24 |
| JP7421071B2 true JP7421071B2 (ja) | 2024-01-24 |
Family
ID=76429703
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019228494A Active JP7421071B2 (ja) | 2019-12-18 | 2019-12-18 | 処理方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7421071B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7083541B1 (ja) * | 2021-06-04 | 2022-06-13 | 株式会社大都技研 | 遊技台 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021093976A (ja) | 2019-12-18 | 2021-06-24 | 日本製鉄株式会社 | チオシアン酸デヒドロゲナーゼ、検出試薬、検出方法、定量方法、及び処理方法 |
-
2019
- 2019-12-18 JP JP2019228494A patent/JP7421071B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021093976A (ja) | 2019-12-18 | 2021-06-24 | 日本製鉄株式会社 | チオシアン酸デヒドロゲナーゼ、検出試薬、検出方法、定量方法、及び処理方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DATABASE GenBank, accession no.AP018052, [online]，2017年06月28日，[2023年6月9日検索]，https://www.ncbi.nim.nih.gov/nuccore/AP018052 |
| Microbes Environ.，2019年10月19日，Vol.34, No.4，p.402-412，DOI:10.1264/jsme2.ME19068 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2021093975A (ja) | 2021-06-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Daims et al. | Complete nitrification by Nitrospira bacteria | |
| Adamczyk et al. | The isotope array, a new tool that employs substrate-mediated labeling of rRNA for determination of microbial community structure and function | |
| JP2024097031A (ja) | 検出試薬、検出方法、定量方法、及び処理方法 | |
| EP3353320A1 (en) | Improved detection of short homopolymeric repeats | |
| Nair et al. | Anaerobic ammonia-oxidizing bacteria in tropical bioaugmented zero water exchange aquaculture ponds | |
| CN113278717A (zh) | 一种靶向测序法检测血流感染的引物池、试剂盒及方法 | |
| JP7421071B2 (ja) | 処理方法 | |
| Paungfoo et al. | Nitrifying bacterial communities in an aquaculture wastewater treatment system using fluorescence in situ hybridization (FISH), 16S rRNA gene cloning, and phylogenetic analysis | |
| Hong et al. | Shifts in the abundance and community composition of particle-associated and free-living Nitrospira across physicochemical gradients in the pearl river estuary | |
| Dezotti et al. | Molecular biology techniques applied to the study of microbial diversity of wastewater treatment systems | |
| EP1563101B1 (en) | Method for the identification of sulfo-reducing bacteria | |
| CHHETRI et al. | Bacterial diversity in biological filtration plant for the removal of iron and manganese from groundwater | |
| CN113564269B (zh) | 阻碍细菌保守区域逆转录的探针组合物及其应用 | |
| CN102936621A (zh) | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 | |
| CN114075596A (zh) | 一种基于高通量测序技术检测目的微生物基因组rna的方法 | |
| dos Santos et al. | New approaches to understanding microbial diversity in wastewater, landfills and leachate treatment | |
| Wang et al. | A simple and sensitive direct mRNA multiplexed detection strategy for amoA-targeted monitoring of ammonia-oxidizing activity in water environment | |
| CN112029836A (zh) | 检测braf基因突变的核酸组合物及试剂盒和braf基因突变的检测方法 | |
| US20190203272A1 (en) | Use of brca1 and/or jaml genes in predicting intramuscular fat content of pork and in selective breeding of pigs | |
| Awolusi | Evaluation of seasonal impacts on nitrifiers and nitrification performance of a full-scale activated sludge system | |
| Jo | Validating post-enrichment steps in environmental RNA analysis for improving its availability from water samples | |
| CN104032000A (zh) | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 | |
| JP7180266B2 (ja) | 処理方法 | |
| Şentürk et al. | Ammonia-Oxidizing Bacteria: Biochemical and Molecular Characteristics | |
| JP4511980B2 (ja) | Ｔ−ｒｆｌｐ法による硝化活性能力の測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220803 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230614 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230620 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230802 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230926 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231027 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231212 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231225 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 7421071 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |