CN113564262A - 鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的pcr引物、试剂或试剂盒和鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物(16s 200)，所述引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1。该PCR引物用于鱼类线粒体DNA序列的eDNA代谢编码。采用该PCR引物对水体中的eDNA进行PCR扩增，基于高通量测序方法，能够有效的解决水体中存在多种近缘物种条件下难以得到有效的物种特异性引物的问题，基于环境DNA监测技术，为鱼类分类学研究及其多样性保护提供有效的技术支撑。利用该PCR引物鉴定淡水鱼类物种的方法具有耗时短、操作简便、特异性强等优点。
Description
技术领域
本发明涉及鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物、试剂或试剂盒和鉴定方法，属于分子生态学领域。
背景技术
由于环境变化和人类活动，全球生物多样性正在迅速减少。淡水生态系统是地球上最脆弱的生态系统之一，淡水鱼类是淡水生态系统的重要组成部分，由于气候变化、生境退化、生物入侵和过度捕捞等因素影响，淡水鱼类多样性正在迅速减少。准确评估鱼类种群和水生群落对环境变化的反应并量化鱼类群落结构和功能变化对水生生态系统的影响能力对于保护淡水生态系统和鱼类多样性至关重要。传统的鱼类监测技术，主要利用网具、钓具、电渔具、通过潜水等方式在现场采集实体标本，这种破坏性采样的缺点显而易见：对于珍稀物种、低密度的物种特别是外来入侵种的早期以及分布于复杂危险生境的鱼类，采样较为困难、甚至不具可操作性，且这些方法往往耗时费力，可能会伤害到目标物种或者破坏调查点的生态系统。
鱼类监测的另一类常用技术是声学探测法，该方法利用回声探测仪对各个水体的鱼类资源状况进行评估。研究通过回声成像，并充分结合分层拖网的鱼类取样，进行积分分配，从而得到目标强度与鱼体长度的换算关系式，最后估算水域鱼类资源量及分布，其结果相对捕捞法能更好地了解鱼类的数量和分布。然而该技术既不能对不同鱼类进行分类，同时准确的定量，还需建立在有正确的捕捞模型的基础上，目前的渔探仪均以国外海洋鱼类为标准建模，其是否适合我国的淡水鱼类存在着较大的疑问，该技术还受到水域理化指标和天气状况的限制。近年来，环境DNA(EnvironmentalDNA，eDNA)监测技术因其分子生物学手段的鉴定准确、对目标生物不造成干扰和样品采集的便利等优势，引起了广大水生生物研究人员的关注。
环境DNA是指从有机体脱落释放进入到自然环境中(如空气、水、土壤等)的DNA，包括细胞中的DNA和细胞破碎后游离出细胞外的DNA分子。在近些年来，环境DNA监测技术因其高效性、对目标生物不造成干扰和样品采集的便利等优势，引起了广大水生生物研究人员的关注。环境DNA监测技术的优势主要包括：(1)调查灵敏度高；(2)采样便利； (3)环境友好、对调查对象无损伤；(4)省时省力，调查成本低；(5)采样时间受天气等自然因素的影响更小。环境DNA监测技术在大型水生生物上的运用源自2008年Ficetola对美国牛蛙的探测研究，自此，环境DNA监测技术对水生生物的定性探测研究便开展起来，并在外来鱼类入侵监测、稀有鱼类物种的检测和鱼类群落资源调查等方面取得了良好的效果验证。比如，利用水样eDNA分析法监测密歇根湖及其周边河流中链和鳙的扩散趋势，利用水样eDNA分析法分析追踪入侵物种蓝鳃太阳鱼在日本本土及周边岛屿的扩散趋势等等，均取得了优于传统观察法的监测效果。Miya等通过对多个海洋鱼类物种的线粒体序列进行分析，设计出适用于海洋鱼类的通用引物，并与高通量测序技术相结合，验证了其在环境DNA 监测方法上的可行性。然而，在随后的研究中发现，国外研究人员设计的淡水鱼类通用引物在国内环境使用时效果并不理想，其原因在于我国淡水常见鱼类以鲤科鱼类为主，鱼类物种间亲缘关系相对较近，而使用国外设计的鱼类通用引物进行扩增对比时，部分鱼类的扩增片段序列相同，无法达到鉴定的准确性。因此，目前国内在利用淡水鱼类通用引物进行实验时无法同时兼顾精度和广度。
发明内容
为了克服上述问题，基于中国淡水鱼类的DNA序列，本发明提供了一种新的鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物(16s 200)，用于鱼类线粒体DNA序列的eDNA代谢编码。采用该PCR引物对水体中的eDNA进行PCR扩增，基于高通量测序方法，能够有效的解决水体中存在多种近缘物种条件下难以得到有效的物种特异性引物的问题，基于环境DNA监测技术，为鱼类分类学研究及其多样性保护提供有效的技术支撑。利用该PCR引物鉴定淡水鱼类物种的方法具有耗时短、操作简便、特异性强等优点。
一种鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物：所述引物的核苷酸序列为序列表中的 SEQ ID NO.1。
进一步地，所述PCR引物用于鱼类线粒体DNA序列的eDNA代谢编码。
一种鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的试剂或试剂盒，含有上述所述的PCR引物。
使用上述所述的PCR引物或上述所述的试剂或试剂盒鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的方法，所述方法为使用上述所述的PCR引物对待测水体样品进行PCR扩增，扩增产物进行测序，对测序所得的序列进行校正或编辑后提交数据库进行比对，依据DNA序列相似率即可鉴定水体样品的鱼类物种。
进一步地，扩增体系以25μL计，包括以下组分：2.5μL 10×ExTaq Buffer(Mg2+Plus) (20mM)，2μL dNTP Mixture(各2.5mM)，上下游引物各1μL(10μmol/L)，0.2μL TaKaRaTaqHS，2μL DNA模板，16.3μL ddH2O。
进一步地，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60.3℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；71℃后延伸10min。
进一步地，所述扩增程序中，上述所述的PCR引物的最适退火温度为60.3℃。
鱼类线粒体DNA与核DNA相比具有分子小、结构简单、易于提取且是母系遗传等特点，因此选择线粒体DNA片段作为分析鱼类种群结构、物种分类鉴定的分子标记。在NCBI上下载了62种鱼类线粒体DNA序列(序列号及对应拉丁文名见表1)。将序列进行比对后基于线粒体16s区域进行通用引物设计。此外，将设计好的引物与NCBI上人类线粒体DNA进行比对，剔除掉可以扩增出人类线粒体DNA的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。所得引物和探针序列如下(表2)：
表1设计环境DNA通用引物所用鱼类线粒体基因登录号
表2鱼类通用引物序列表
鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的具体方法如下：
(1)样品DNA采集
根据水域的大小，设置需要调查的样点区域，在采集样点处采集柱状水层混合，冷藏带回实验室。24h内对水样进行抽滤处理，抽滤好的滤膜装入灭菌离心管后，立即放入-20℃冰箱中保存备用，滤膜孔径为1.2μm。所获得的样品使用QIAGEN公司生产的试剂盒QIAampDNA MicroKit(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)或者其他同类试剂盒(如1.试剂盒DNeasyBlood and Tissue Kit(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)；2.试剂盒Power Water SterivexDNA Isolation Kit(MoBio，CA)等)提取滤膜中的所有环境DNA。提取好的DNA在-20℃条件下保存备用。
(2)DNA扩增和高通量测序
使用已合成的引物16s 200对提取的环境DNA样品进行PCR扩增。样品反应体系为25 μL：2.5μL 10×ExTaq Buffer(Mg2+Plus)(20mM)，2μL dNTP Mixture(各2.5mM)，上下游引物各1μL(10μmol/L)，0.2μL TaKaRa TaqHS，2μL DNA模板，16.3μL ddH2O。反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60.3℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环； 71℃后延伸10min。PCR产物进行1％凝胶电泳检测，用NanoDropTM2000分光光度计(Thermo FisherScience，Waltham，MA，USA)进行浓度测定。检测完成后选取合格样品进行高通量测序。
(3)数据分析
测序完成后，首先进行数据的质控与优化，之后对所有样本的有效序列，以97％的一致性进行OTUs(OperationalTaxonomicUnits)聚类，然后根据Genebank和实验室自建库的数据库对OTUs的序列进行物种注释。
本发明的有益效果是：
(1)本发明与现有捕捞方法和水声学方法相比，因其分子生物学手段的鉴定准确、对目标生物不造成干扰和样品采集的便利等优势，在很大程度上提高了样品检测的可行性。与现有DNA条形码技术相比，所用技术平台完全一致，但更重要的是解决了现有DNA条形码难以鉴定国内部分亲缘关系较近的鱼类的问题。因此，本发明所建立的DNA条形码及其应用方法是现有DNA条形码技术的重要补充。
(2)本发明基于环境DNA监测技术，不依赖于鱼类物种的捕获，只需要采集水体样品即可对物种的有无和多少进行分析，采样方法简单，且可以最大限度的保护鱼类资源；同时，对于一些分布较少难以捕获的物种，该方法也较传统捕捞调查更为有效。
(3)基于中国淡水鱼类的DNA序列，本法明提供了一种新的PCR引物(16s 200)，用于线粒体DNA序列的eDNA代谢编码。采用鱼类线粒体通用引物对水体中eDNA进行PCR 扩增，基于高通量测序方法，能够有效的解决样品中存在多种近缘物种条件下难以得到有效的物种特异性引物的问题，可以避免近缘种DNA难以鉴定、检测误差大等问题，有效地对淡水鱼类进行准确检测。
附图说明
图1为16s200鱼类通用引物对鱼类样本的扩增结果；
1.宽鳍鱲；2.黄颡鱼；3.大鳍鱊；4.似鱎；5.翘嘴鲌；6.蛇鮈；7.细鳞鲴；8.银鮈；9.大眼华鳊；10.鳙；11.蒙古鲌；12.鲢；13.餐条；14.华鳈；15.飘鱼；16.棒花鱼；17.黑鳍鳈；18.似鳊；19.子陵栉虾虎；20.鳜鱼；21.鲫鱼；22.红鳍原鲌；23.鲤鱼；24.青梢红鲌；25.刀鲚；26. 鲂；27.银鲴；28.草鱼；29.青鱼；30.阴性对照；
图2为滆湖鱼类调查采样点分布；
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。
实施例1
鱼类通用引物的验证，通用引物16s 200成功扩增出29种常见鱼类DNA
搜集29种常见鱼类的肌肉样本，使用上海生工生物工程有限公司的动物基因组DNA快速抽提试剂盒进行DNA提取，将提取好的DNA溶于TE缓冲液中，保存在-20℃。使用已合成的引物16s 200对29种鱼类DNA进行PCR扩增。样品反应体系为25μL：2.5μL 10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)(20mM)，2μL dNTPMixture(各2.5mM)，上下游引物各1μL(10μmol/L)， 0.2μL TaKaRaTaqHS，2μL DNA模板，16.3μL ddH2O。反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火40s，72℃延伸1min，35个循环；71℃延伸10min。PCR产物进行1％凝胶电泳检测。
引物16s 200对鱼类样品的扩增结果显示，1-29泳道都在同一位置出现了明亮清晰的条带(见图1)，显示出引物16s 200对全部29种鱼类都有良好的扩增效果。
实施例2
利用16s 200引物，检测到分布在中国江苏省滆湖的27种鱼类
我们在中国江苏省南部仅次于太湖的第二大湖泊滆湖进行了实地调查和取样。滆湖 (119°44′15″-119°52′56″E，31°28′19″-31°43′04″N)位于江苏省常州市西南，北通长江，东濒太湖，西连长荡湖，南接宜兴市的东氿、西氿，主要入湖河流有扁担、夏溪、湟里、北干和中干河等，属于太湖水系。滆湖南北狭长，形如长茄状，长25km、宽6.6km，水面面积164km2，蓄水量1.74×108m3，平均水深1.27m，为典型的浅水湖泊，具有饮用、灌溉、游览、水产养殖等多种使用功能。滆湖主要为亚热带季风气候，常年气候温和，雨量充沛，年平均气温15℃，年平均降水量约为1100mm。目前，关于滆湖鱼类多样性和渔业资源的数据不足。因此，我们利用环境DNA监测技术调查了分布在滆湖的16个地点的鱼类组成(采样点如图 2)。
(1)水样采集和处理
在滆湖选定16个采样点，大规模采集水样。采集工作于2017年9月，2018年5月和2018 年11月进行。每次采样时用GPS定位仪记录具体经纬度，采样时使用干净的塑料容器在每个采样点收集2L水样(0.5m深)，采集的水样放入事先准备好的泡沫箱中，箱中放置冰袋，低温运回实验室，在24小时内将水样进行抽滤处理。抽滤时，使用真空抽滤机(AP-01真空泵；AUTOS(IENCE))将水样通过孔径为1.2μm的滤膜过滤，抽滤过程中注意防止水样污染。将过滤后的滤膜立即收集到2mL灭菌的离心管中，并存放在-80℃保存。
(2)DNA提取
待全部样品抽滤完毕后，使用QIAGEN公司生产的QIAamp DNA Micro Kit试剂盒进行环境DNA提取。具体步骤如下：
将滤膜用剪刀剪碎，加入180μL Buffer ATL，20μL蛋白激酶K，振荡混匀，56℃孵育至完全裂解，孵育过程中不断振荡；加入200Μl BufferAL，200μL乙醇，振荡混匀；将上述混合物用移液枪移至2mL离心管中的DNeasy Mini滤柱中，6000×g(8000rpm)离心1min，弃去滤出液及离心管；将滤柱放入新的2mL收集管中，加入500μL Buffer AW1，≥6000×g 离心1min，弃去滤出液及收集管；将滤柱放入新的2mL收集管中，加入500μL Buffer AW2， 20000×g(14000rpm)离心3min，弃去滤出液及收集管；将滤柱移至新的1.5mL离心管，将200μLBuffer AE加至滤柱膜中央以洗提DNA，室温(15℃-25℃)下孵育1min，≥6000×g 离心1min。
将提取好的DNA溶于TE缓冲液中，保存在-20℃冰箱中备用。
(3)DNA扩增
使用已合成的引物16s 200对提取的环境DNA样品进行PCR扩增。样品反应体系为25 μL：2.5μL 10×ExTaq Buffer(Mg2+Plus)(20mM)，2μL dNTP Mixture(各2.5mM)，上下游引物各1μL(10μmol/L)，0.2μL TaKaRa TaqHS，2μL DNA模板，16.3μL ddH2O。反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60.3℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环； 71℃后延伸10min。PCR产物进行1％凝胶电泳检测，用NanoDropTM2000分光光度计(Thermo FisherScience，Waltham，MA，USA)进行浓度测定。
(4)Illumina Hiseq测序
选取16s 200鱼类通用引物扩增后的PCR产物进行测序。对28个eDNA样本进行测序，共产生1,253,258个reads，测序片段的平均长度为200bp。在对原始的HiSeq数据进行优化后，保留了1,216,055个reads，以便随后进行分析。高质量的DNA序列共聚类到6,504个OTUs(Operational Taxonomic Units)，3,398个OTUS可被注释到已知的鱼类物种，为研究各样本的物种组成，对所有样本的EffectiveTags，以97％的一致性(Identity)进行OTUs聚类，其中，选择了256个具有100％序列一致性的OTUs进行进一步的物种注释。从28个eDNA样本中共鉴定出27种鱼类(表3)。
表3 eDNA样本中鉴定鱼类组成
以上所述仅为本发明的较佳实施例而己，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的均等修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的专利涵盖范围内。
序列表
<110> 上海海洋大学、信阳农林学院
<120> 鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物、试剂或试剂盒和鉴定方法
<130> 2021/5/17
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgagtatggg agacagaaaa ggttcctttt gccacagaga cgggt 45
Claims (7)
1.鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物用于鱼类线粒体DNA序列的eDNA代谢编码。
3.鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的试剂或试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的PCR引物。
4.使用权利要求1所述的PCR引物或权利要求3所述的试剂或试剂盒鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1所述的PCR引物对待测水体样品进行PCR扩增，扩增产物进行测序，对测序所得的序列进行校正或编辑后提交数据库进行比对，依据DNA序列相似率即可鉴定水体样品的鱼类物种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，扩增体系以25μL计，包括以下组分：2.5μL10×ExTaq Buffer(Mg2+Plus)(20mM)，2μL dNTP Mixture(各2.5mM)，上下游引物各1μL(10μmol/L)，0.2μL TaKaRa TaqHS，2μL DNA模板，16.3μL ddH2O。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60.3℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；71℃后延伸10min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增程序中，权利要求1所述的PCR引物的最适退火温度为60.3℃。
Priority Applications (2)
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| CN202110572002.8A CN113564262A (zh) | 2021-05-25 | 2021-05-25 | 鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的pcr引物、试剂或试剂盒和鉴定方法 |
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| CN202110572002.8A CN113564262A (zh) | 2021-05-25 | 2021-05-25 | 鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的pcr引物、试剂或试剂盒和鉴定方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN115627295A (zh) * | 2022-06-22 | 2023-01-20 | 深圳市华大海洋研究院 | 试剂盒及小布氏鲸物种鉴定方法 |
Citations (2)
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| CN104531879A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-04-22 | 上海海洋大学 | 用于鱼类群落结构研究的环境dna鉴定方法 |
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2021
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-
2022
- 2022-04-03 LU LU501782A patent/LU501782B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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| CN109943645A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-06-28 | 南京易基诺环保科技有限公司 | 一种淡水鱼类线粒体12s通用宏条形码扩增引物及其应用方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘军等: "鱼类环境DNA研究中通用引物的筛选验证", 淡水渔业, vol. 46, no. 1, pages 1 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115627295A (zh) * | 2022-06-22 | 2023-01-20 | 深圳市华大海洋研究院 | 试剂盒及小布氏鲸物种鉴定方法 |
| CN115627295B (zh) * | 2022-06-22 | 2023-10-27 | 深圳市华大海洋研究院 | 试剂盒及小布氏鲸物种鉴定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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