CN115627295A - 试剂盒及小布氏鲸物种鉴定方法 - Google Patents

试剂盒及小布氏鲸物种鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种小布氏鲸物种鉴定方法及试剂盒，其中，小布氏鲸物种鉴定方法包括如下步骤：采用33组引物对所述总环境DNA进行多重PCR扩增；针对上述多重PCR扩增产物进行高通量测序；去掉测序产生的接头序列、无引物非特异性扩增序列；去掉未比对上参考数据库的序列；将剩余序列进行组装，得到相对于单个序列更长的contig序列；将得到的contig序列与小布氏鲸及小布氏鲸的近源物种的DNA序列进行比对。本发明提出了一种全新的环境DNA样品检测技术，该技术采用eDNA、多重PCR和高通量测序等三种技术相结合的模式，综合了现有eDNA技术两种主流策略的优点，规避了两者的缺点，实现特定海域中小布氏鲸的物种鉴定，具有技术成本低、灵敏度高、精确度高的优点。

Description

试剂盒及小布氏鲸物种鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物鉴定技术领域，特别涉及一种试剂盒及小布氏鲸物种鉴定方法。
背景技术
生物的物种鉴定是研究一切生物的前提，也是生物多样性监测和保护的最基本、最核心的工作。最早的物种鉴定手段通常使用生物的生活习性、表型、声音等特征数据，但这些数据往往不易定量且不够稳定，很容易造成鉴定错误，只能作为辅助鉴定手段。随着分子生物学技术的发展，基于物种某个基因片段的物种鉴定方法——DNA条形码技术已成为目前最常用的物种鉴定手段，但该方法需要直接采集生物个体的组织样本以提取DNA，这必定会对生物体造成伤害。近年来，随着eDNA(环境DNA)技术的问世，我们可以通过采集水样的方式直接预测该片水域中的生物种类和丰度，减少了对目标研究物种的伤害，还极大的提高了检测效率。该方法往往采用传统PCR手段且只设计一对引物去捕获目标片段，所以随机性高且灵敏度低；另一种策略是直接对水体总DNA进行建库、高通量测序和数据分析，该技术极度依赖于比对分析所用的数据库，且测序深度往往不足以覆盖所有DNA片段，从而丢失丰度较低的序列和物种信息，从而造成假阴性。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种小布氏鲸物种鉴定方法，旨在解决现有技术鉴定灵敏度低及准确率差的问题。
为实现上述目的，本发明提出的一种小布氏鲸物种鉴定方法，包括如下步骤：
a、提取海水样本中的总环境DNA；
b、采用表2所示的33组引物对所述总环境DNA进行多重PCR扩增；
c、针对上述多重PCR扩增产物进行高通量测序；
d、去掉测序产生的接头序列、无引物非特异性扩增序列；
e、去掉未比对上参考数据库的序列；
f、将剩余序列进行组装，得到相对于单个序列更长的contig序列；
g、将得到的contig序列与小布氏鲸及小布氏鲸的近源物种的DNA序列进行比对。
在一实施例中，所述步骤a包括：
采用2～5℃条件下离心20～40分钟的方法过滤掉水样中的大颗粒杂质，并取上清液；
使用已灭菌的水样真空抽滤装置，对离心后的上清液进行过滤，水样依次通过孔径142mm、90mm的滤纸过滤掉水样中的颗粒较小的杂质；
通过真空抽滤方法将DNA富集在孔径为0.45μm的微孔滤膜上；
取出微孔滤膜，加入液氮碾碎，将碎屑收集于离心管中，然后采用eDNA 提取试剂盒提取富集在滤膜碎屑上的水体总DNA。
在一实施例中，所述步骤b中PCR扩增条件如下：
PCR循环为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，65℃退火50秒(每次循环后降低1℃)，循环10次；95℃变性30秒，58℃退火30秒，循环25 次；72℃延伸15秒；72℃再延伸60秒，最后12℃保温。
在一实施例中，在所述步骤b与所述步骤c之间还包括：将扩增产物在 1.5％琼脂糖凝胶中电泳鉴定，观察是否在200-300bp之间得到明显的目的条带。
在一实施例中，所述步骤a包括：
以小布氏鲸线粒体全基因组序列为模板，生成各位点的候选引物；
设置引物筛选参数如下：扩增目标片段长度200-300bp；引物长度17-34 bp；解链温度65℃以上。
在一实施例中，所述步骤a与所述步骤b之间还包括：
对所述候选引物进行过滤，去除末端5bp碱基序列一致的候选引物；
根据DNA序列特征，仅保留引物序列区相对保守、且所扩增目标序列属于高变区的候选引物，得到如表2所述的33对引物。
本发明还提供一种试剂盒，其特征在于，包括如表2所述的33对引物序列。
本发明采用eDNA、多重PCR、高通量测序三种技术相结合的方法，能很好的弥补常规eDNA技术两种策略的不足。首先，在高通量测序前增加多重PCR，能过滤干扰信号，大大降低测序深度的要求，将每个样的测序数据量从几十甚至上百Gb降低到数百Mb，节约测序和分析成本十倍以上。其次，多重PCR放大了目标信号，大大提高了检测的灵敏度。最后，在保证一次PCR 操作的情况下，通过增加引物数量，将有效基因片段一次性增加数十倍，大大提高了检测的精确度。综上，本发明综合了现有eDNA技术两种主流策略的优点，规避了两者的缺点，在检测的成本、灵敏度和精确度上均有明显优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为在深圳大鹏湾沙鱼涌海域的8个采样点共采集11份水样；其中，黑圈白字所示1-3号采样点采样日期为2021年7月5日，白圈黑字所示1-5号采样点采样日期为2021年7月10日；S1-S11为样本编号；
图2为33对引物扩增目标片段对应到参考序列的位置；黑色线条表示线粒体全基因组序列示意图；
图3a为高通量测序后得到的多个DNA片段序列示意图；
图3b为在图3a的基础上，过滤掉测序产生的接头序列、无引物的非特异性扩增序列后的DNA片段序列示意图；
图3c为在图3b的基础上去掉未比对上参考数据库的数据剩余的DNA序列示意图；
图3d为在图3c的基础上去掉无法拼接和拼接较短的序列后剩余的DNA 序列示意图；
图3e为在图3d的基础上组装成多条更长的Contig序列示意图；
图3f为在图3e的基础上，将多序列与近缘物种多序列比的对示意图；
图4为组装的contigs对应参考序列、目标片段的位置；Primers所示为引物所扩增出的目标片段区域，Contigs所示为最终组装到的13条contigs序列；
图5为基于33对引物扩增出的线粒体全基因组数据构建的最大似然树。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
目前，现有eDNA技术主要采用两种策略，但均存在一定的局限性。
第一种策略是基于PCR(qPCR，ddPCR)的方法，该策略往往只设计一对引物，扩增一段包含数百个核苷酸的目标序列。一方面，海水水域开阔，物种DNA碎片含量稀少，这些DNA碎片极易在复杂的海水环境中进一步降解，因而仅捕获一条DNA序列风险较大，随机性较高，从而造成假阴性。另一方面，包含数百个核苷酸的DNA序列能提供的有效信息十分有限，可能不足以鉴别DNA序列相似的近源物种，当样品中不存在目标物种却包含其近源物种时，又会造成检测的假阳性。
第二种策略是不依赖于PCR的高通量测序方法，该方法直接对水体总 DNA进行建库、高通量测序和数据分析，因而，中间缺少了一步类似于PCR 这样的可过滤干扰信号、放大有效信号的过程。这种策略往往要求极高的测序深度以确保能覆盖所有DNA片段，尤其是那些丰度较低的序列。然而，更高的测序深度势必会增加测序费用、消耗更多的计算资源、需要更长的分析时间，从而导致人力、物力、财力成本的增加。
综上，当前eDNA分析的两种策略虽能在一定程度上解决相关问题，但仍存在各自的局限性，尤其是遇到降解程度较高、目标DNA丰度较低的情况时，它们的不足尤为凸显。
一方面为了解决第一种策略灵敏度低及准确率差的问题，另一方面也为了解决第二种策略中成本高的问题，本申请提出一种采用eDNA、多重PCR、高通量测序等三种技术相结合的小布氏鲸物种鉴定方法。
本申请通过采用eDNA、多重PCR、高通量测序等三个先进技术相结合的方法，在不靠近、不触碰、不伤害海洋野生保护动物的前提下，对海水样品进行采集，并设计了一套包含33对序列的扩增引物，对目标物种线粒体基因组11个高变区DNA区域进行多重PCR，再用高通量测序方法对目标片段进行测序，并最终通过生物信息学分析手段判断基因序列的物种来源，从而实现对该片水域中大型哺乳动物小布氏鲸物种的准确鉴定。本申请解决了降解程度较高、目标DNA丰度较低的海水样品中小布氏鲸的物种鉴定问题。
具体的，本申请方法步骤如下：
a、提取海水样本中的总环境DNA；
b、采用表2所示的33组引物对所述总环境DNA进行多重PCR扩增；
c、针对上述多重PCR扩增产物进行高通量测序；
d、去掉测序产生的接头序列、无引物非特异性扩增序列；
e、去掉未比对上参考数据库的序列；
f、将剩余序列进行组装，得到相对于单个序列更长的contig序列；
g、将得到的contig序列与小布氏鲸及小布氏鲸的近源物种的DNA序列进行比对。
在实验前，要先筛选引物，引物的筛选直接影响最终结果的准确性。
引物设计过程如下：
①使用PrimerPlex软件，以小布氏鲸线粒体全基因组序列(NCBI登录号：AB201258.1)为模板，生成各位点的候选引物。参数设置如下：扩增目标片段长度200-300bp；引物长度17-34bp；解链温度65℃以上。
在此，考虑到海洋中复杂的环境，DNA降解是非常严重的，所以只设计小片段(200-300bp)的目的片段，如果设计太长了，海洋中很可能无对应的长片段模板，就会导致扩增不出来。
如果设计过短，海洋中也很可能存在多个近源物种的DAN序列可以降解出同一个片段的情形。基于此，本申请中，设计的目标小片段以200～300bp 为主。
另外，引物长度一般是15～30bp，一般都不会超过30bp，在本申请中，引物长度筛选条件为17～34bp，相对来说，也是增加了引物的特异性。
②对候选引物进行过滤，去除末端5bp碱基序列一致的候选引物，防止产生非特异性扩增。
这是因为，对于17-34bp的引物而言，如果其中一个引物与另一个引物的末端一样，就有可能导致其中一个引物把另一个引物对应的目标片段扩增出来，从而发生非特异性扩增的情形。
③引物筛选
根据DNA序列特征，进一步对候选引物进行人工筛选，仅保留引物序列区相对保守，而所扩增目标序列属于高变区的候选引物，这样，在确保目标片段能被扩增出来的同时，还能保证目标序列有足够多态性用于物种鉴定，尤其是区分近源物种。
通过上述引物设计，得到如下表1所示的33对引物(引物组1)，通过将这33对引物进行多重PCR实验。这33对引物所对应的参考序列位置如图2 所示。
在图2中，DNA区域从左到右(从A到K的方向)依次为：tRNA-Phe、 12S-tRNA、tRNA-Val、16S-rRNA、tRNA-Leu、ND1、tRNA-Ile、tRNA-Gln、tRNA-Met、ND2、tRNA-Trp、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、 COI、tRNA-Ser、tRNA-Asp、COⅡ、tRNA-Lys、ATPASE8、ATPASE6、CO Ⅲ、tRNA-Gly、ND3、tRNA-Arg、ND4L、ND4、tRNA-His、tRNA-Ser、tRNA-Leu、 ND5、ND6、tRNA-Glu、CYTB、tRNA-Thr、tRNA-Pro、D-loop。以12S-tRNA 为例，可以看出，引物扩增出的部分目标片段之间存在重叠，共覆盖线粒体 全基因组上的11个DNA区域，这11个区域主要集中在12S-rRNA、tRNA-Val、 16S-rRNA、COI、COIII、tRNA-Gly、ND3、ND4、tRNA-Glu、CYTB和D-loop 基因区(图2上所标注的A～K区域)。在高变区设计多对引物，即形成重叠 区域，能最大限度的捕获水体中游离的、断裂的、碎片化DNA序列，确保这 些重要的区域能被成功扩增和捕获。
表1.多重PCR所用33对引物(引物组1)
Figure RE-GDA0003942423740000071
Figure RE-GDA0003942423740000081
多重PCR扩增
多重PCR扩增反应以海水体总DNA为模板，分别以表1所列序列为引物，构建一个25μl的反应体系，PCR循环为：95℃预变性5分钟；95℃变性 30秒，65℃退火50秒(每次循环后降低1℃)，循环10次；95℃变性30秒， 58℃退火30秒，循环25次；72℃延伸15秒；72℃再延伸60秒，最后12℃保温。
扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳鉴定，实验发现，在200-300bp之间得到明显的目的条带，证明扩增有效。采用DNA试剂纯化回收后，置于4℃冷藏保存。
高通量测序
取出纯化后的多重PCR产物，构建DNA测序文库，并用DNBSEQ-T7 测序仪进行高通量测序，选择双末端短片段测序策略(表2)。
表2.高通量测序数据统计
Figure RE-GDA0003942423740000082
生物信息分析
生物信息分析流程示意图如图3a-图3f所示。
首先，高通量测序数据下机后得到多个序列，参阅图3a。
利用cutadapter软件对原始数据进行过滤，过滤掉图3a中测序的接头序列(adapter)和不含引物的非特异性扩增的污染序列，得到如图3b中的序列。
随后，用SOAP软件将过滤后的数据比对到NCBI数据库的须鲸属 (Balaenoptera)物种的线粒体全基因组数据库，去掉未比对上参考数据库的数据，得到如图3c中的序列。
基于比对结果，提取正、反向reads均比对上的序列，并用pear软件对有重叠区域的reads进行拼接，去掉无法拼接和拼接较短的序列，获得多重PCR 扩增后的目标片段DNA序列，得到如图3d中的序列。
其次，将获得的目标片段进一步利用SPAdes进行组装，如图3e所示。该步骤可以将上一步中pear拼接的序列组装成更长的Contigs序列，以提供更多的有效遗传信息，便于后续比对和进化分析。
通过上述表1中的33对引物扩增出来的片段进行组装，最终共组装成全长共5200bp的13条contigs序列，最后，组装的contigs序列对应到参考序列(近缘物种多个序列)目标片段的位置如图4所示，由图可以看出，绝大部分目标区域的片段都被成功组装了出来，其中contigs编号为4、5、8、11、 12、13的序列成功将完整的目标片段B、C、G、I、J、K捕获。说明所设计的多重PCR引物有效，多重PCR实验对水样中的碎片DNA进行了特异性的目标片段的扩增，且高通量测序读取到了这些有效DNA信息。
为进一步确认上述13条contigs序列的物种来源，我们利用以上13条 contigs序列，以及表3中所列8种须鲸属物种的全基因组序列，先用MUSCLE 软件进行多序列比对，获得样本间DNA序列的差异关系。然后用Gblocks软件提取出保守的比对区域，以保证较为准确和稳定的进化结果。最后用PhyML 软件的最大似然法构建系统进化树(图5)。
表3.构建进化树所用的物种列表
编号 物种 NCBI Accession
1 B.acutorostrata NC_005271.1
2 B.bonaerensis NC_006926.1
3 B.borealis NC_006929.1
4 B.brydei AP006469.1
5 B.edeni AB201258.1
6 B.musculus NC_001601.1
7 B.omurai NC_007937.1
8 B.physalus X61145.1
结果显示，请参阅图5，进化树各节点的Bootstrap支持率均大于98％，待检物种与在日本近海的小布氏鲸样本(NCBI编号：AB201258.1)聚为一支，节点支持率达100％，说明待检物种与小布氏鲸亲缘关系最为相近，而与其他几种须鲸物种的亲缘关系相对较远，说明待检物种为小布氏鲸(B.edeni)。
本发明提出了一种全新的环境DNA样品检测技术，该技术采用eDNA、多重PCR和高通量测序等三种技术相结合的模式，综合了现有eDNA技术两种主流策略的优点，规避了两者的缺点，实现特定海域中小布氏鲸的物种鉴定，具有技术成本低、灵敏度高、精确度高的优点。本发明包括了多重PCR 步骤中所用的33对引物，这些引物依据须鲸属多个物种的全基因序列比对结果进行设计，然后根据保守区和高变区进行筛选并人工矫正。所设计引物覆盖小布氏鲸线粒体全基因组序列(NCBI编号：AB201258.1)的11个连续的区域，总长度为5645bp，占线粒体全基因组全长的36.63％，主要代表的DNA 区域为：12S-rRNA、tRNA-Val、16S-rRNA、COI、COIII、ND4、tRNA-Glu、 CYTB和D-loop。
通过采用eDNA、多重PCR、高通量测序等三个先进技术相结合的方法，在不靠近、不触碰、不伤害海洋野生保护动物的前提下，对海水样品进行采集，并设计了一套包含33对序列的扩增引物，对目标物种线粒体基因组11 个高变区DNA区域进行多重PCR，再用高通量测序方法对目标片段进行测序，并最终通过数据的拼接、比对等分析手段判断基因序列的物种来源，从而实现对该片水域中大型哺乳动物小布氏鲸物种的准确鉴定。本发明解决了降解程度较高、目标DNA丰度较低的海水样品中小布氏鲸的物种鉴定问题。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Figure RE-GDA0003942423740000111
Figure RE-GDA0003942423740000121
Figure RE-GDA0003942423740000131
Figure RE-GDA0003942423740000141
Figure RE-GDA0003942423740000151
Figure RE-GDA0003942423740000161
Figure RE-GDA0003942423740000171
Figure RE-GDA0003942423740000181
Figure RE-GDA0003942423740000191
Figure RE-GDA0003942423740000201
Figure RE-GDA0003942423740000211
Figure RE-GDA0003942423740000221
Figure RE-GDA0003942423740000231
Figure RE-GDA0003942423740000241
Figure RE-GDA0003942423740000251
Figure RE-GDA0003942423740000261
Figure RE-GDA0003942423740000271
Figure RE-GDA0003942423740000281
Figure RE-GDA0003942423740000291
Figure RE-GDA0003942423740000301
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SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市华大海洋研究院
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<130> 2022-05-17
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgagaggag acaagtcgt 19
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcatctttcc cttacggtac tattt 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccacatagat gagttcgtcc taa 23
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcacaaatta atcaaataaa acattcacca ta 32
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgcataatga cttaactagt aataacttag caaag 35
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccatctctaa aaagctgtac ctttt 25
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttgaagctgc ttccttgaat ttgc 24
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gattagtgtg ccgggctg 18
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggggagtagt cagaagctta tattatttat a 31
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gacattggca ccctatattt attatttgg 29
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggttgtattt aggtttcggt cagtaagta 29
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ccctttagcc ggaaatctag ca 22
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ttcgtatgat ccgtcctagt taca 24
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccatgtagcc gaaaggttct ttt 23
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tgttgctaat caactgaaga ctttta 26
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
agtatatatt ctaattcttc ctgggttcgg 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atcaacaaac attctaacaa tgtatcaatg 30
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gccagaggct agtagtacgg 20
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gtagagccgt aaattccatc tga 23
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
actccagaac taggcggatg t 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
acgagtagta gggccagtat c 21
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ttgtctgctt cctacgtcaa gta 23
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gattaggagg gtttgtagtg taattaata 29
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
aaaaataacc taatctgaat taactccaca gc 32
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
agaggtgtaa tccgtagagg g 21
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ttgaagctac actaattccc actcttatta tta 33
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tgaggccatg ggcaattatt 20
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
aactcggagg ctacggcat 19
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tgacctaaaa tcgctcattg cgt 23
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
caattaggtt gatggttgga ggta 24
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
tgaaggaagg ggtaatattg ttgat 25
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ggcctacaag tctttctacc actaat 26
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ccataaatag gcgaaggctt tg 22
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
tcatcatgag gagatatttg atggg 25
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gcgtgtaggt atcggataac tc 22
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ctacaagaac accaatgacc aaca 24
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cacacatttg ccgagacgta aa 22
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tgtatgggat tgctgataag aggt 24
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ggaaggtata tacatgtaca aatcacatag t 31
<210> 46
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ataccagtaa ctagtcttat cgagaataa 29
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tcagttatgt tatgatcatg ggct 24
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gtcattatgc atcccctggt tagtta 26
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gggatgcata atgacatgtg ct 22
<210> 50
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
taactatttc ctgaaaagta tattgtataa taacc 35
<210> 51
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gtacatgtat atactttccc atagcttaac t 31
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gagggatccc tgccaagc 18
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
taatagtctt ctcttatg 18
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
cgggttgctg gtttcacgcg gcatggtg 28
<210> 55
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gtaaaattaa taaaatttaa tacggacttc aact 34
<210> 56
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
agtatattat acaataacca caaggccac 29
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
tgtatatacc ctcccataac tcaattaata 30
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
agagggatcc ctgccgag 18
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
tcagttatgt tatgatcatg ggct 24
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
atgcatcccc tggtcaattt tactc 25
<210> 61
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
tctggttctt acttcaggac catattaa 28
<210> 62
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
cctgtaacca ttaatttaat tgcacatg 28
<210> 63
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
cagatttagt attgatttat gaataaaatg gtttt 35
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
cctaaagggt ctcgtcgca 19
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
ccgggctcaa aaacctgtat ct 22
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
taacgtattg gatagggatg gc 22

Claims (7)

1.一种小布氏鲸物种鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、提取海水样本中的总环境DNA；
b、采用表2所示的33组引物对所述总环境DNA进行多重PCR扩增；
c、针对上述多重PCR扩增产物进行高通量测序；
d、去掉测序产生的接头序列、无引物非特异性扩增序列；
e、去掉未比对上参考数据库的序列；
f、将剩余序列进行组装，得到相对于单个序列更长的contig序列；
g、将得到的contig序列与小布氏鲸及小布氏鲸的近源物种的DNA序列进行比对。
2.如权利要求1所述的小布氏鲸物种鉴定方法，其特征在于，所述步骤a包括：
采用2～5℃条件下离心20～40分钟的方法过滤掉水样中的大颗粒杂质，并取上清液；
使用已灭菌的水样真空抽滤装置，对离心后的上清液进行过滤，水样依次通过孔径142mm、90mm的滤纸过滤掉水样中的颗粒较小的杂质；
通过真空抽滤方法将DNA富集在孔径为0.45μm的微孔滤膜上；
取出微孔滤膜，加入液氮碾碎，将碎屑收集于离心管中，然后采用eDNA提取试剂盒提取富集在滤膜碎屑上的水体总DNA。
3.如权利要求2所述的小布氏鲸物种鉴定方法，其特征在于，所述步骤b中PCR扩增条件如下：
PCR循环为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，65℃退火50秒(每次循环后降低1℃)，循环10次；95℃变性30秒，58℃退火30秒，循环25次；72℃延伸15秒；72℃再延伸60秒，最后12℃保温。
4.如权利要求3所述的小布氏鲸物种鉴定方法，其特征在于，在所述步骤b与所述步骤c之间还包括：将扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳鉴定，观察是否在200-300bp之间得到明显的目的条带。
5.如权利要求1所述的小布氏鲸物种鉴定方法，其特征在于，所述步骤a包括：
以小布氏鲸线粒体全基因组序列为模板，生成各位点的候选引物；
设置引物筛选参数如下：扩增目标片段长度200-300bp；引物长度17-34bp；解链温度65℃以上。
6.如权利要求5所述的小布氏鲸物种鉴定方法，其特征在于，所述步骤a与所述步骤b之间还包括：
对所述候选引物进行过滤，去除末端5bp碱基序列一致的候选引物；
根据DNA序列特征，仅保留引物序列区相对保守、且所扩增目标序列属于高变区的候选引物，得到如表2所述的33对引物。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括如表2所述的33对引物序列。
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