CN112458162B - 器官移植ddcfDNA检测试剂和方法 - Google Patents

器官移植ddcfDNA检测试剂和方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种利用ALU重复序列定量cfDNA的非诊断方法以及ddcfDNA相对含量检测方法，所得的数据可用于检测器官移植排异反应。

Description

器官移植ddcfDNA检测试剂和方法
技术领域
 本发明属于医学分子生物学领域，具体涉及一种器官移植后血浆或尿液中Donor-Derived Cell-Free DNA检测试剂和方法。
背景技术
 器官移植是晚期器官疾病有效的治疗手段，但是器官移植成功并实现较长的存活时间，需要过很多“关”，包括免疫耐受排斥关、感染关以及对新器官的适应关等。排斥和感染是影响移植患者术后生活质量和生命安全的常见并发症。诊断器官移植排斥的传统工具为有创活检、血清肌酐检测，血清肌酐可以评估肾小球滤过率,但是对于区分移植肾损伤和急慢性失功的敏感性特异性均不高。穿刺活检是移植排斥反应检测的金标准,属创伤性检查常伴有并发症。使用非侵入性生物标志物来降低侵入性活检监测实体器官移植所带来的风险是最近备受关注的理想方式。其中一个很有前景的标记物是在移植受者的尿液或血液中存在的供体来源游离细胞（donor-derived cell-free DNA，dd-cfDNA）。
1948年，cfDNA首次在人类血液中被发现，是在细胞凋亡或者损伤坏死的过程中释放到血液中的片段化DNA。cfDNA检测已经在产前诊断和肿瘤等领域得到发展和应用。现在也有许多研究者在探讨将供者cfDNA（donor-derived cell-free DNA，dd-cfDNA）作为一种可行的工具应用于移植损伤的早期检测。
游离DNA（cell free DNA, cfDNA）指来自细胞凋亡或坏死，游离于细胞外的DNA片段，肾移植患者血液和尿液中都包含供体组织细胞凋亡来源的cfDNA。最新研究表明，供体来源cfDNA（donor-derived cfDNA, ddcfDNA）带有供体组织的基因信息，通过检测ddcfDNA可获得供体组织的健康状况，具有无创、高灵敏和实时等检测优势。
检测ddfDNA的方法有以下方式：一是在接受了男性器官的女性受者中，检测Y染色体上的SRY或者TSRY区域是最简单直接的方法，但由于局限性明显，因此也限制了其广泛运用；二是通过qPCR、ddPCR、MPSS等方式对个体间多态性丰富的基因或区域（如，HLA）进行检测，从而区分受者与供者的cfDNA，需要事先对供体及受体进行基因分型，费事又昂贵。因此急需要开发一种无创、高灵敏和常规的性价比高的方法应用于应用于监测移植物的损伤和排斥反应。
发明内容
为了提供一种相对低价、能常规操作、非侵入性的检测方法应用于监测移植物的损伤和排斥反应，对移植物的损伤具有高敏感性和特异性。申请人尝试使用基于ALU重复序列qPCR定量血浆中cfDNA，并结合排异相关位点的二代测序得到的ddcfDNA相对含量共同计算得到的绝对值评分来监测器官移植排斥反应。
一方面，本申请中提供了一种利用ALU重复序列定量cfDNA的非诊断方法，其特征在于包括使用针对ALU重复序列设计的引物进行定量PCR的步骤。
另一方面，本申请提供了一种ddcfDNA相对含量的非诊断检测方法，其特征在于，包括上述定量cfDNA的非诊断方法，以及cfDNA文库制备，靶向富集，测序和ddcfDNA相对含量计算步骤。
进一步地，使用针对排异相关SNP位点设计的探针进行靶向富集。
进一步地，测序为二代测序。
进一步地，ddcfDNA相对含量计算步骤包括：
1）将突变频率突变频率在0-0.2、0.8-1的SNP位点为供体分析筛选的位点；2）假设筛选位点供体基因型为纯合aa或杂合Aa计算ddcfDNA浓度值的上限值和下限值，上限值和下限值计算方法如下：上限值计算：假设供体所有筛选位点基因型为Aa，cfDNA含量=2*a型Reads/(A型Reads+a型Reads)；下限值计算：假设供体所有筛选位点基因型为aa，cfDNA含量=a型Reads/(A型Reads+a型Reads)；3）取上限值和下限值的平均值作为供体cfDNA相对含量。
进一步地，ddcfDNA相对含量计算步骤包括：
提取突变频率小于0.2的低频突变；采用最大似然估计的方法，使用所有的突变频率≤0.2（≥0.8）进行gamma分布拟合，确定最优的gamma分布函数，其中最大似然估计定义为：
xi是突变频率值，f(.|θ)是待估计的密度分布函数—gamma密度分布函数，拟合gamma函数，求得gamma分布的期望值，期望值为ddcfDNA浓度值。
进一步地，上述方法还包括ddcfDNA绝对值评分计算步骤：ddcfDNA绝对值评分=ddcfDNA相对含量×cfDNA定量。
另一方面，本申请提供了利用ALU重复序列定量cfDNA的试剂和检测ddcfDNA的试剂在制备检测器官移植排异的试剂盒中的应用，其特征在于，利用ALU重复序列定量cfDNA的试剂包括针对ALU重复序列设计的引物，检测ddcfDNA的试剂包括检测排异相关SNP位点的试剂。
进一步地，上述针对ALU重复序列设计的引物为SEQ ID NO.1-4的引物，或者扩增片段与SEQ ID NO.1-4物扩增片段相似的引物。
进一步地，上述检测排异相关SNP位点的试剂包括cfDNA提取试剂，建库试剂，二代测序用试剂。
本申请中的二代测序，包括但不限于基于Illumina平台的测序方法/平台NovaSeq、x-ten、Miseq等，Roche平台的测序方法/平台FLX，454等。
本申请中的检测样本可以为已知存在cfDNA或ddfDNA的样本，包括但不限于血浆，血液，尿液，脑脊液等体液。优选血浆和尿液样本。
本申请中“扩增片段相似”是指理论扩增片段有80%以上的序列同一性，如85%，90%，95%，100%，靶序列的区别可能由靶序列位置的变化和样本区别造成。
本申请中的引物本领域技术人员可以基于已知的PCR反应原理（如参见各版本《分子克隆指南》，萨姆布鲁克）设计，或者使用已知的软件/算法/网站设计，如PrimerPremier，Oligo 6，Pirmer 3，NCBI，BLAST等。即使基于相同的靶序列，也完全可能设计出序列不同的引物，这些可以实现预期扩增效果的引物均在本申请的保护范围之内。
本申请中的基因组DNA提取，cfDNA提取，文库构建，测序等步骤可参考相关分子生物学资料/书籍进行，也可以利用现有的市售试剂盒完成，可用的试剂盒不限于实施例中使用的种类。
本发明的有益效果：
1. 本发明通过检测ALU重复序列来达到定量血浆中cfDNA含量的方法，结果更灵敏、准确且可以重现；
2. 本发明是通过qPCR定量及二代测序两种方法协同判断器官移植后是否发生排斥反应，检测结果更准确；
3. 本发明检测受体血浆或尿液中ddcfDNA含量来评判受体在器官移植后是否发生排斥反应,具有无创、高灵敏和实时等检测优势。
具体实施方式
实施例1 受体血浆中游离DNA浓度检测方法建立
一标准曲线的建立
1 引物设计选用：ALU序列是人类基因组中含量丰富的重复序列，约占基因组的5%-10%，以平均间隔4kb分散于整个基因组中，本发明利用ALU重复序列设计81bp，115bp的引物来定量血浆中cfDNA量，序列见表1
表1引物序列
引物名称 引物序列 Seq NO
ALU81-F 5'-CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG-3' 1
ALU81-R 5'-GCCCCGGCTAATTTTTGTAT-3' 2
ALU115-F 5'-CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG-3' 3
ALU115-R 5'-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3' 4
2将Coriell institute NA12878基因组标准品gDNA稀释至0.1pg/µL、1.0pg/µL、10pg/µL、100pg/µL；
3按照表2配制反应体及表3 的定量PCR 程序，将上述稀释好的gDNA进行检测，每个浓度三个生物学重复；
表2荧光定量PCR体系
组分 体积
KAPA SYBR FAST Mastermix 10µL
正向引物(10µM) 0.4µL
反向引物(10µM) 0.4µL
DMSO 1.2µL
gDNA 2µL
ROX Low 0.4µL
<![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> <![CDATA[补H<sub>2</sub>O至20µL]]>
表3荧光定量PCR程序
5 通过软件计算每个反应的ct值， 并根据ct值制作标准曲线。
二 待检受体血浆中游离DNA浓度检测方法建立
1、用EDTA抗凝血管采集待测器官移植受体样本外周血10mL，4℃、1600g离心15min，收集上清1（置于低吸附离心管）。
2、完成步骤1后，取所述上清1，12000rpm离心5min，收集上清2（置于低吸附离心管）。上清2即为血浆。
3、完成步骤2后，取1mL上清2，用大体积游离核酸提取试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司的产品，货号为DP710）提取血浆游离DNA（cfDNA），52ul洗脱液洗脱。
4.利用Qubit™ dsDNA HS Assay Kit试剂盒检测所得cfDNA的浓度，得到1mL血浆中cfDNA的含量。
5、按照表2反应体系及表3的PCR程序进行定量血浆cfDNA样本，每个样本三个生物学重复；
6、根据步骤一的标准曲线计算待检样本血浆的含量。
结果：
利用gDNA作为标准品，按照梯度稀释后利用ct值及样本浓度制作标准曲线，并得到一次标准方程：
Alu81线性方程为：y=-38126x+24.033， R2=0.9942
Alu115线性方程为：y=-3.7369x+20.826，R2=0.9932
检测7例已知临床信息得器官移植受体样本，得到ct值，根据标准方程得到得结果见表5。
表5
样本编号 1mL血浆cfDNA的量(ng/mL)-qubit结果 1mL血浆cfDNA的量(ng/mL)-qPCR结果
1 59.28 29.4
2 144.56 96.8
3 39.416 21.4
4 44.2 31.4
5 32.604 6.1
6 122.2 86.9
7 32.448 7.6
实施例2、受体血浆中ddcfDNA相对含量检测方法建立
一探针设计
从UCSC中获取文献报道及迈基诺数据库中441个多态性SNP位点附近的序列，去除重复序列后，从第一个碱基开始截取78bp的序列做探针，再一次往后移动 n 个碱基，截取78bp的序列做探针，直到最后一个78bp。
表4（部分snp）
rs 染色体 位置 rs 染色体 位置
rs1490413 chr1 4367323 rs3764570 chr19 8528277
rs3740199 chr10 128019025 rs528557 chr20 3651742
rs10488710 chr11 115207176 rs3205187 chr22 31491295
rs10831567 chr11 11292700 rs743616 chr22 51064039
rs1169289 chr12 121416622 rs13071423 chr3 2140378
rs12825673 chr12 569945 rs6835017 chr4 20182928
rs4530059 chr14 104769149 rs16870629 chr5 1015063
rs2306049 chr16 88767769 rs62490396 chr7 1.4E+08
rs213656 chr16 1113847 rs6954783 chr7 1036512
rs4605160 chr16 9187721 rs6950990 chr7 1536566
rs2293067 chr17 1550106 rs2519123 chr9 1.37E+08
rs3809972 chr18 56204945 rs10815156 chr9 518755
rs9303995 chr18 7230612 rs10738558 chr9 2023316
二 待测受体血浆游离DNA文库的制备
将实施例1中提取的cfDNA利用KAPA Hyper文库构建试剂盒（KAPA Biosystems公司的产品，货号为KK8504）制备待测受体血浆游离DNA文库。
三待测受体文库靶向富集
将待测受体血浆游离DNA文库按照专利201811600116.3实施例2的方法进行靶向捕获，得到靶向捕获文库甲，利用Illumina平台测序。
四 数据分析
1．碱基识别
使用Illumina官方软件bcf2fastq（version 2.15.0.4），根据样本index序列，将Illumina测序仪下机二进制BCF格式文件转化并拆分为单个样本可读文件fastq格式。
2．数据质控
使用cutadapt（version 1.16）去除测序接头，删除低质量碱基，生成cleanreads。其中 cutadapt（version 1.16）的参数为（-q10,10 --nextseq-trim=10 -aATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG -A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT），序列长度小于80
3.数据比对
使用序列比对软件BWA（version 0.7.12-r1044）mem功能将clean reads比对至人基因组hg19，其中BWA的软件参数为（mem -M -t）。
使用samtools sort（version 1.2-99）功能，根据序列比对位置对序列进行排序。其中参数为（samtoolsfixmate -O bam sample.sam - | samtools sort -\@ 5 -m 1G -sample.sort）
使用samtools对产生的sort.bam文件建立索引，其中参数为（samtools indexsample.sort.bam>sample.sort.bam.bai）
使用picard的AddOrReplaceReadGroups对sample.sort.bam添加read group，在后续分析中GATK要求bam文件的header必须包含@RG，参数为（javapicardAddOrReplaceReadGroups VALIDATION_STRINGENCY=SILENT INPUT=sample.sort.bam OUTPUT=sample.sort.header.bam RGLB=ref RGPL=ILLUMINA RGSM=GP1RGPU=GRP1 SORT_ORDER=coordinate CREATE_INDEX=true）
使用bamtools对sample.sort.header.bam文件进行过滤，将一些不合格的序列删除，参数为（bamtools filter -isMapped true -isPaired true -isProperPair true -in sample.sort.header.bam -out sample.sort.header.flt.bam）
使用samtools对产生的sample.sort.header.flt.bam文件建立索引，其中参数为（samtools index sample.sort.header.flt.bam>sample.sort.header.flt.bam.bai）
使用bammarkduplicates2对sample.sort.header.flt.bam中的重复序列进行删除，参数为（bammarkduplicates2 I=sample.sort.header.flt.bam O=sample.rmdup.sorted.bam M=sample.duplication-report2.txt markthreads=threadindex=1 rmdup=0）
3．变异识别及注释
利用已有的snp数据库，建立相关性模型，产生重校准表，输入已知的多态性位点数据库，用于屏蔽那些不需要重校准的部分。使用软件GATK（version 4.1.4.0）BaseRecalibrator功能建立校准表，参数为（java GATK BaseRecalibrator -R ref_fa -Isample.rmdup.sorted.bam -known-sites /local_disk/DB/dbsnp/dbsnp_150.hg19.vcf-O recal.table -OBI true -L bed）
根据这个模型对原始碱基进行调整，只会调整非已知SNP区域。使用软件GATK（version 4.1.4.0）ApplyBQSR模块对bam文件进行调整，参数为（java GATK ApplyBQSR -Rref_fa -I sample.rmdup.sorted.bam -bqsrrecal.table -OBI true -Osample.recal.bam）
使用软件GATK（version 4.1.4.0）Mutect2功能识别SNP和InDel，其参数为（javaGATK Mutect2 -R ref_fa –I sample.recal.bam -L bed -DF NotDuplicateReadFilter--af-of-alleles-not-in-resource 0.00003125 -O sample.Mutect2.raw.vcf）
使用软件GATK（version 4.1.4.0）FilterMutectCalls功能过滤sample.Mutect2.raw.vcf，其参数为（java GATK FilterMutectCalls -R ref_fa -Vsample.Mutect2.raw.vcf -O sample.Mutect2.raw.FilterMutectCalls.vcf）
4.计算ddcfDNA含量
算法1：
使用受体基因型为纯合AA，而供体者基因型为纯合aa或杂合Aa的SNP位点计算供体cfDNA含量。本方法无供体基因型信息，根据位点a碱基频率大于0小于0.2筛选该类位点。分别假设筛选位点供体的基因型全部为aa和Aa，计算cfDNA浓度值下限和上限，取上限值和下限值的平均值作为供体cfDNA含量近似值。上限值和下限值计算方法如下：
上限值计算：假设供体所有筛选位点基因型为Aa，cfDNA含量=2*a型Reads/(A型Reads+a型Reads);
下限值计算：假设供体所有筛选位点基因型为aa，cfDNA含量=a型Reads/(A型Reads+a型Reads);
算法2：
使用受体基因型为纯合AA，而供体者基因型为纯合aa或杂合Aa的SNP位点计算供体cfDNA含量。本方法无供体基因型信息，根据位点a碱基频率大于0小于0.2筛选该类位点。对位点a的碱基频率进行曲线拟合，选择第一个曲线峰值即为cfDNA的含量。
算法3:
提取sample.Mutect2.raw.FilterMutectCalls.vcf文件中突变频率小于0.2的低频突变。采用最大似然估计的方法，使用所有的突变频率≤0.2（≥0.8）进行gamma分布拟合，确定最优的gamma分布函数，其中最大似然估计定义为：
（1）
xi是突变频率值，f(.|θ)是待估计的密度分布函数—gamma密度分布函数，使用R语言来拟合gamma函数，求得gamma分布的期望值，期望值为ddcfDNA浓度值。
结果：
按照上述方法将实施例1中7例器官移植受体血浆样本按检测ddcfDNA相对含量，检测结果如下：
表6
样本编号 算法1相对含量 算法2相对含量 算法3相对含量
1 0.0038 0.0022 0.0058
2 0.0038 0.002 0.0056
3 0.0087 0.0028 0.0131
4 0.0036 0.0025 0.0054
5 0.0193 0.0179 0.029
6 0.0011 0.0007 0.0017
7 0.0233 0.0138 0.0349
实施例3受体血浆中ddcfDNA绝对值评分计算
受体血浆中ddcfDNA绝对值评分计算：将实施例1得到的绝对含量和实施例2中表6的相对含量综合计算：cfdna总量×相对含量，得到一个绝对值评分，通过大量临床样本验证，发现绝对值评分大于0.2指示该待检样本为排斥个体（器官移植排斥反应的临床确诊采用的是移植肾穿刺病理诊断（依据国际统一的Banff标准））。
表7
样本编号 算法1相对值评分 算法1检测结果 算法2相对值评分 算法2检测结果 算法3相对值评分 算法3检测结果 临床检测结果
1 0.113 否 0.065 否 0.170 否 否
2 0.364 是 0.194 否 0.542 是 是
3 0.187 否 0.060 否 0.281 是 是
4 0.113 否 0.078 否 0.170 否 否
5 0.118 否 0.109 否 0.176 否 否
6 0.097 否 0.061 否 0.148 否 否
7 0.177 否 0.105 否 0.266 是 是
序列表
<110> 北京迈基诺基因科技股份有限公司
<120> 器官移植ddcfDNA检测试剂和方法
<130> aaaaa
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctgaggtca ggagttcgag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccccggcta atttttgtat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgaggtca ggagttcgag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccgagtagc tgggattaca 20

Claims (4)

1.一种ddcfDNA相对含量的非诊断检测方法，其特征在于，包括定量cfDNA的非诊断方法，以及cfDNA文库制备，靶向富集，测序和ddcfDNA相对含量计算步骤；
其中ddcfDNA相对含量计算步骤包括：
1）将突变频率突变频率在0-0.2、0.8-1的SNP位点为供体分析筛选的位点；2）假设筛选位点供体基因型为纯合aa或杂合Aa计算ddcfDNA浓度值的上限值和下限值，上限值和下限值计算方法为：上限值计算：假设供体所有筛选位点基因型为Aa，cfDNA含量=2×a型Reads/(A型Reads+a型Reads)；下限值计算：假设供体所有筛选位点基因型为aa，cfDNA含量=a型Reads/(A型Reads+a型Reads)；3）取上限值和下限值的平均值作为供体cfDNA相对含量；
其中ddcfDNA相对含量计算步骤包括：
提取突变频率小于0.2的低频突变；采用最大似然估计的方法，使用所有的突变频率≤0.2（≥0.8）进行gamma分布拟合，确定最优的gamma分布函数，其中最大似然估计定义为：
xi是突变频率值，f(.|θ)是待估计的密度分布函数—gamma密度分布函数，拟合gamma函数，求得gamma分布的期望值，期望值为ddcfDNA浓度值；
所述定量cfDNA的非诊断方法包括使用针对ALU重复序列设计的引物进行定量PCR的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用针对排异相关SNP位点设计的探针进行靶向富集。
3.根据权利要求1或2的方法，其中测序为二代测序。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中还包括ddcfDNA绝对值评分计算步骤：ddcfDNA绝对值评分=ddcfDNA相对含量×cfDNA定量。
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