CN105102634A - 使用尿的无细胞dna评价肾状态的方法和组合物 - Google Patents

使用尿的无细胞dna评价肾状态的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用尿的无细胞DNA评价肾状态和肾健康的非侵害性工具和方法。

Description

使用尿的无细胞DNA评价肾状态的方法和组合物
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请顺序号US61/793,427的优先权利益，将该文献的全部内容引入本文作为参考。
背景
统称为肾系统的肾执行从血液中除去废物和调节水基液体水平的主要功能。它们是泌尿系统中必需的，而且可起自身稳定功能的作用，例如调节电解质、维持酸-碱平衡和调节血压。它们充当身体血液的天然过滤器并且除去废物，使废物转移至膀胱。在产生尿的过程中，肾排泄废物，例如尿和铵，且它们还负责水、葡萄糖和氨基酸的再吸收。肾还产生激素，包括骨化三醇、红细胞生成素和酶肾素。
肾状态受肾病或损伤(也称作肾损伤、肾病)影响且可以因急性和慢性病症而产生。改变的肾状态的另一种形式是移植的肾排斥。
传统上，通过使用针对肌酸酐的血液试验评价肾状态。较高水平的肌酸酐表示较低的肾小球滤过率，且作为结果，肾排泄废物的能力下降。为了完整地研究肾损害的主要原因，各种形式的医学成像、血液试验和肾活组织检查(取出肾组织小样)通常用于发现是否存在可逆的肾功能障碍的原因。
对于改善的肾损伤和肾移植损伤的非侵害性诊断和用于评价肾状态一般存在关键的未得到满足的需求。在肾移植损伤中，例如，已经证实供体来源的无细胞DNA(dd-cfDNA)是血液中移植物损伤的替代者，但需要以供体和受体DNA测序为代价。
更近来，在人尿中发现了来自濒临死亡的细胞的无细胞DNA(cfDNA)。近期的尝试集中于测试尿的cfDNA作为同种异体移植物排斥的标记，然而，该技术限于检测已经接受了男性肾的女性接受者的Y染色体-特异性序列或预先测定供体与受体之间的遗传组成/分子标记的差异并且探测那些差异。照此，这些测试类型限于某些类型的构造(例如，接受男性供体肾的女性移植物接受者)且不能广泛地适用于所有移植物构造。
因此，需要用于广泛地适用于所有肾移植情况的非侵害性测试的改进的组合物和方法来使用尿cfDNA评价肾状态、肾损伤或肾移植物排斥。需要快速地用于测定所有肾损伤和肾移植患者中的尿的无细胞DNA的方法，与性别无关且无需负担DNA测序。
本文提供了用于这样的操作的组合物和方法，例如高流通量方法。
将本说明书中引述的所有出版物和专利申请引入本文作为参考，如同将出版物或专利申请各自特别地和分别地显示以并入作为参考一样。
发明概述
尿的无细胞DNA(cfDNA)可以是用于评估和评价肾状态、肾健康、肾损伤、肾移植损伤和高度急性肾排斥的强有力工具。可以通过数字或标准qPCR对尿cfDNA负荷进行依次分析，无需供体和受体DNA测序。
本发明涉及使用在尿中发现的cfDNA评价个体的肾状态和肾健康。具体地，本发明涉及用于监测、诊断、预后和评价患有或疑似具有改变的肾状态的受试者的治疗方案的方法和组合物。
本发明尤其提供了用于评价肾状态、肾损伤或肾移植物排斥的组合物和方法，其基于测定尿中的常染色体的cfDNA。
在一个方面，本发明提供了用于评价个体的肾状态的方法，包括：测定尿样中的常染色体的拷贝数和比较所述染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中所述染色体的标准拷贝数，其中拷贝数的改变预示改变的肾状态。在一个实施方案中，常染色体是染色体1。在一个实施方案中，使用EIF2C1基因座测定染色体1的拷贝数。在一个实施方案中，使用包含正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT和反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC的引物组测定EIF2C1基因座。在一个实施方案中，所述引物组用于实时PCR且进一步包括探针。在一个实施方案中，所述探针包含如下序列和报道基因：5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
在本文的任意实施方案中，经测定高于标准拷贝数的拷贝数预示受损的肾状态。在本文的任意实施方案中，经测定等于或低于标准拷贝数的拷贝数预示良好的肾健康。在本文的任意实施方案中，使用实时PCR、定量PCR或数字PCR(dPCR)测定拷贝数。在本文的任意实施方案中，使用BioMark实时PCR系统测定拷贝数。在本文的任意实施方案中，受损的肾状态可以包含肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植物排斥或者对于肾损害、肾损伤、肾病、肾病症或肾移植物排斥的治疗无响应。在本文的任意实施方案中，肾状态的评价可以包括测定肾脏病,肾损伤、肾移植损伤或肾移植物排斥进程。在本文的任意实施方案中，肾状态的评价可以包括测定患有且目前正在进行或已经进行过治疗的肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植物排斥的个体中的治疗响应。
在本文的任意实施方案中，cfDNA可以提取自尿。在本文的任意实施方案中，测定提取自尿的cfDNA中的拷贝数。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括测定其它病理学和临床数据。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括测定肌酸酐的量。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括测定蛋白尿或cGFR。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括进行肾的活组织检查。
在本文的任意一个实施方案中，所述个体是处于肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植物损伤或肾移植物排斥的风险中的个体。在本文的任意一个实施方案中，所述个体是糖尿病患者。在本文的任意一个实施方案中，所述个体患有高血压。在本文实施方案的任意一个中，所述个体是同种异体移植物肾移植的接受者。在本文的任意一个实施方案中，所述个体处于肾移植物损伤或肾移植物排斥的治疗中。在本文的任意一个实施方案中，所述个体患有至少一种急性排斥反应发作。
在另一个方面，本发明提供用于评价个体的肾状态的方法，包括：测定尿样中ALU重复单元的数量和比较ALU重复单元的数量与来自正常群体的尿样中ALU重复单元的标准数量，其中ALU重复单元的数量改变预示改变的肾状态。在一个实施方案中，经测定高于重复单元的标准数量的ALU重复单元的数量预示受损的肾状态。在一个实施方案中，经测定等于或低于ALU重复单元的标准化数量的ALU重复单元的数量预示良好的肾健康。在另一个实施方案中，测定提取自尿的cfDNA中ALU重复单元的数量。在另一个实施方案中，使用实时PCR、定量PCR或数字PCR测定ALU重复单元的数量。在另一个实施方案中，使用BioMark实时PCR系统测定ALU重复单元的数量。在另一个实施方案中，使用实时PCR测定ALU重复单元的数量。在另一个实施方案中，使用ALU基因座的115个碱基扩增子测定ALU重复单元的数量。在本文的任意实施方案中，所述方法还可以包含测定同一样品中常染色体的拷贝数。在另一个实施方案中，测定染色体1的拷贝数。在一个实施方案中，使用EIF2C1基因座测定染色体1的拷贝数。在另一个实施方案中，使用包含正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT和反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC的引物组测定EIF2C1基因座。在另一个实施方案中，所述引物组用于实时PCR且进一步包括探针。在另一个实施方案中，所述探针包含如下序列和报道基因：5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
在本文的任意实施方案中，受损的肾状态可以包含肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植物排斥或者对肾损害、肾损伤、肾病、肾病症或肾移植物排斥的治疗无响应。在本文的任意实施方案中，肾状态的评价可以包含测定肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植物排斥的进程。在本文的任意实施方案中，肾状态的评价可以包含测定患有肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植物排斥且目前正在进行或已经进行过治疗的个体中的治疗响应。
在本文的任意实施方案中，cfDNA可以提取自尿。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括测定其它病理学和临床数据。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括测定肌酸酐的量。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括测定蛋白尿或cGFR。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括进行肾的活组织检查。
在本文的任意一个实施方案中，所述个体是处于肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植损伤或肾移植排斥的风险中的个体。在本文的任意一个实施方案中，所述个体是糖尿病患者。在本文的任意一个实施方案中，所述个体患有高血压。在本文的任意一个实施方案中，所述个体是同种异体移植物肾移植的接受者。在本文的任意一个实施方案中，所述个体处于肾移植物损伤或肾移植物排斥的治疗中。在本文的任意一个实施方案中，所述个体患有至少一种急性排斥反应发作。
在另一个方面，本发明提供了诊断测定试剂盒，该试剂盒包含：用于测定来自样品的至少一种常染色体的拷贝数的试剂；用于测定所述拷贝数的引物组；和用于测定的使用说明书。在一个实施方案中，常染色体是染色体1。在另一个实施方案中，所述引物组能够扩增基因座EIF2C1的扩增子。在另一个实施方案中，所述引物组包含正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT和反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC。在另一个实施方案中，引物添加包含用于dPCR的探针。在一个实施方案中，所述探针的序列包含如下序列和报道基因：5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
在本文的任意实施方案中，所述试剂盒还包含用于从样品中提取cfDNA的试剂。在本文的任意实施方案中，所述样品包含尿。在本文的任意实施方案中，所述引物组能够用于实时PCR、定量PCR或数字PCR。在本文的任意实施方案中，所述引物组还包含用于数字PCR的探针。
在另一个方面，本发明提供了诊断测定试剂盒，该试剂盒包含：用于测定样品中ALU重复单元的数量的试剂；用于测定所述ALU重复单元的数量的引物组；和用于测定的使用说明书。在一个实施方案中，所述引物组是能够扩增ALU基因座的扩增子的组。在另一个实施方案中，所述引物组包含正向引物5'-GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3'和反向引物5'-ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'。在另一个实施方案中，引物另外包含用于数字PCR的探针。在一个实施方案中，所述探针的序列包含如下序列和报道基因：5'-HEXTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3'。在另一个实施方案中，所述试剂盒还能够包含测定常染色体拷贝数的引物组。在一个实施方案中，常染色体是染色体1。在另一个实施方案中，所述引物组能够扩增基因座EIF2C1的扩增子。在另一个实施方案中，所述引物组包含正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT和反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC。在另一个实施方案中，引物另外包含用于数字PCR的探针。在一个实施方案中，所述探针的序列包含如下序列和报道基因：5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
在本文的任意实施方案中，所述试剂盒还包含用于从样品中提取cfDNA的试剂。在本文的任意实施方案中，所述样品包含尿。在本文的任意实施方案中，所述引物组能够用于实时PCR、定量PCR或数字PCR。在本文的任意实施方案中，所述引物组还包含用于数字PCR的探针。
附图简述
图1呈现来自个体的血浆样品中染色体1染色体Y拷贝数之间的相关性，所述个体进行了肾移植，具有或没有急性排斥(AR)发作。
图2呈现来自个体的血浆样品中染色体1染色体Y拷贝数之间的相关性，所述个体进行了肾移植，具有或没有急性排斥(AR)发作。
图3呈现质量控制测定。为了评价尿样中染色体1拷贝数的稳定性，以重复试验发问那个是测定来自3位患者的9份样品中染色体1的拷贝数。在一式两份试验之间观察到紧密的相关性。
图4显示与染色体1拷贝数相关的尿中的蛋白质的量。
图5显示尿样中ALU重复单元与染色体1拷贝数之间的相关性。
图6显示实施例4所用研究样品和方法的示意图。本研究评价肾移植患者尿和血浆中无细胞DNA测量值的意义。分3期进行本研究。在第1期中，评价尿和血浆中dd-cfDNA的意义。在第2期中，评价常染色体基因座(Chrl)的测量值。在第3期中，分析尿中总cfDNA负荷的定量以用于特异性移植物损伤检测。
图7显示在具有男性移植物的19位女性接受者的小组中，当与稳定(STA)移植物功能过程中测定的血浆dd-cfDNA值比较时，在急性排斥反应(AR)时观察到血浆dd-cfDNA的量增加。
图8显示正如根据Chr1基因座EIF2C1拷贝数测定的，尿cfDNA负荷显示甚至尿中检测到的常染色体DNA是供体来源的。ChrY基因座SRY的尿cfDNA负荷与Chr1基因座EIF2C的尿cfDNA负荷强烈相关。
图9显示作为肾移植损伤指示剂的尿中的无细胞Chrl拷贝数。(A)来自具有移植物损伤的肾移植患者的尿中Chrl的基因座EIF2C1的拷贝数在与来自无移植物损伤的肾移植患者的尿中的Chrl的基因座EIF2C1的拷贝数比较时具有显著性。(B)数据的ROC分析产生0.777的AUC，其中p值<0.0001。(C)移植物损伤表型中的蛋白质与肌酸酐之显著地高于来自无移植物损伤患者的尿的蛋白质与肌酸酐之比。(D)ROC分析产生0.66的AUC，其中p值为0.004。
图10显示用于移植物损伤适应征的无细胞DNA。(A)显示根据ALU测定数据计算基因组当量时来自有代表性的患者的数据，与低级AR或其它慢性损伤比较时严重AR的尿中的cfDNA负荷增加。(B)在一种有代表性的情况中尿中的总cfDNA增加显著地高于其它慢性损伤相比高级AR和返流性肾病的尿中的总cfDNA增加。(C)呈现了尿cfDNA的增加特别地高于AR前后样品时的样品数据。(D)cfDNA负荷增加高于BKVN中且在前-BKVN尿中可以观察到cfDNA负荷升高。
图11显示在与AR前后相比时尿cfDNA负荷升高在AR发作中增加。评价3位患者(患者#1、#2和#3)的AR前后尿中的总cfDNA，显示在AR过程中和发作时尿中的cfDNA负荷升高。
详细描述
本文所述的本发明特别地提供了用于管控肾健康(肾脏健康)、肾病和肾移植的组合物和方法。本发明提供了用于评价个体(例如患者)的肾健康、监测肾健康和鉴定用于治疗干预的个体和个体亚群的诊断、预后和/或治疗组合物和方法。一般地，本发明基于测定尿中的cfDNA。如下所述，测定尿cfDNA中的常染色体的拷贝数和/或测定来自那些已经进行过肾/肾脏移植的尿的cfDNA中的ALU重复单元的数量,可以用于精确地鉴定处于发生肾移植物损伤或肾移植物排斥症状风险的个体；监测肾移植损伤或肾移植排斥的进程；监测肾移植物损伤或肾移植物排斥的进程；监测对治疗肾移植物损伤或肾移植物排斥的个体的治疗响应；鉴定和/或预测肾移植物损伤或肾移植物排斥发作的风险；鉴定应开始或持续肾移植物损伤或肾移植物排斥治疗的患者亚群；评价肾移植物损伤或肾移植物排斥的治疗效能；和/或鉴定应监测发生肾移植损伤或肾移植排斥症状的患者亚群。另外进一步如下所述，测定尿cfDNA中的常染色体拷贝数和/或测定尿cfDNA中的ALU重复单元的数量可以用于精确地鉴定处于发生肾病或肾损伤风险中的个体；监测肾脏病或肾损伤的进程；监测肾病或肾损伤的进程；监测治疗肾病或肾损伤的个体的治疗响应；鉴定和/或预测肾病或肾损伤发作的风险；鉴定应开始或持续肾病或肾损伤治疗的患者亚群；评价肾病或肾损伤的治疗效能；和/或鉴定应监测发生肾病或肾损伤症状的患者亚群。
定义
为了解释本说明书的目的，下列定义适用，且只要适合，用于单数的术语也包括复数，反之亦然。
本文所用的术语“肾脏”和“肾”可互换使用,术语“肾健康”、“肾脏健康”、“肾状态”和“肾状态”可互换使用，术语“肾损害”、“肾脏损害”、“肾损伤”和“肾脏损伤”可互换使用，术语“肾病症”、“肾脏病症”、“肾病”和“肾脏疾病”可互换使用，术语“肾移植物”和“肾脏移植物”可互换使用。
术语“疾患”或“疾病”和“损伤”或“损害”在本文中可互换使用，是指身体或其器官和/或组织之一状态的任意改变，从而中断或破坏器官功能和/或组织功能性能(例如导致器官功能障碍)和/或导致患有疾病的受试者症状，例如不适、功能障碍、痛苦乃至死亡。
处于发生肾损伤、肾病或肾移植物排斥“风险”中的个体可以具有可检测到的疾病或症状，也可以不具有可检测到的疾病或症状，且在本文所述的治疗方法前可以展示出可检测到的疾病或疾病症状，也可以不展示出可检测到的疾病或症状。“处于风险中”表示个体具有一种或多种风险因素，它们是与本文所述的肾损伤、肾病或肾移植物排斥发生相关并且为本领域公知的可测定的参数。具有这些风险因素的一种或多种的受试者存在发生肾损伤、肾病或肾移植物排斥的可能性高于无这些风险因素的一种或多种的受试者。
“个体”可以是“患者”。“患者”是指处于治疗医师护理下的“个体”。在一个实施方案中，所述患者患有肾损害或肾损伤。在另一个实施方案中，所述患者患有肾病或肾疾患。在另一个实施方案中，所述患者具有肾移植并且处于移植物排斥中。在其它实施方案中，所述患者被诊断为肾损伤、肾病或肾移植物排斥，但尚未进行过任何治疗以寻求诊断。
本文所用的“患者亚群”及其语法变化形式是指患者亚组，其特征为具有一种或多种特征性的可测定的和/或可鉴定的特征，它们可以将该患者亚组与属于更广泛疾病类别的其他患者亚组区分开来。这样的特征包括具有如本文所述的升高量的尿cfDNA作为具有肾损伤、肾病或肾移植物排斥或处于发生其风险中的特征，任选地与本文所述和本领域技术人员包括治疗医师公知的任意症状组合。
本文所用的术语“生物样品”是指得自或来源于个体的组合物，所述个体包含细胞和/或其它分子实体，其例如基于物理、生化、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定。在一个实施方案中，所述样品是尿。在其它实施方案中，所述样品是流体(血液、血清、血浆、唾液、痰、胃液、精液、泪液、汗液等)、皮肤、毛发、细胞、活检组织或组织样本。
本文所用的“预测”和“预计”并非是指事件以100％的确定性发生。而是预以指事件比不发生更可能发生。对于采取“预测”或“做出预测”可以包括确定时间比不发生更可能发生的可能性。本文所述的多种因素评价可以用于做出这样的确定或预测。
所谓“与…相关”或“相关”是指按照任何方式比较第一种分析或方案的效能和/或结果与第二种分析或方案的性能和/或结果。例如，可以在执行第二种方案中使用第一种分析或方案的结果和/或可以使用第一种分析或方案的结果确定是否应执行第二种分析或方案。在对来自个体的尿样进行的常染色体拷贝数测定或ALU拷贝数评价的实施方案方面，可以使用所述结果确定是否应对该个体执行特定治疗方案。
本文所用的术语“诊断”是指鉴定或分类医学或病理学状态、疾病或病症。例如，“诊断”可以指鉴定肾损伤、肾病或肾移植物排斥。“诊断”还可以指对肾损伤、肾病或肾移植物排斥的严重性进行分类。肾损伤、肾病或肾移植物排斥的诊断可以根据本领域技术人员(例如，肾病学家)可以使用的任意方案进行。
本文所用的术语“辅助诊断”是指有助于在肾损伤、肾病或肾移植物排斥症状或病症的具体类型的存在、程度或其它性质方面做出临床确定的方法。例如，辅助诊断肾损伤、肾病或肾移植物排斥的方法可以包括测定来自个体的尿样中的任何常染色体、染色体1、染色体Y或ALU重复单元的量。
本文所用的术语“预后”是指预测肾损伤、肾病或肾移植物排斥发生和/或复发的可能性。本发明的预测方法可以用于通过选择针对任何具体患者最适合的治疗方式在临床上做出治疗决定。本发明的预测方法在预测是否和/或有助于诊断患者是否可能发生肾损伤、肾病或肾移植物排斥、存在肾损伤、肾病或肾移植物排斥复发和/或肾损伤、肾病或肾移植物排斥症状恶化方面是有价值的工具。
“治疗”是指改变所述个体天然过程并且可以在临床诊断之前、过程中或之后进行的尝试。治疗的期望的效果包括预防肾损伤、肾病或肾移植物排斥或其病症或症状发生或复发；缓解肾损伤、肾病或肾移植物排斥病症或症状；减少肾损伤、肾病或肾移植物排斥的任何直接或间接后果；降低肾损伤、肾病或肾移植物排斥进展或严重性和/或改善或缓和肾损伤、肾病或肾移植物排斥。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物对被鉴定为处于发生肾损伤、肾病或肾移植物排斥风险中的患者亚群使用。在一些情况中，本发明的方法和组合物用于尝试延缓肾损伤、肾病或肾移植物排斥发生。有益或期望的临床结果是本领域技术人员已知的或用于由本领域技术人员得到。例如，有益或期望的临床结果可以包括、但不限于如下的一种或多种：监测肾损伤、检测肾损伤、鉴定肾损伤类型、帮助肾移植临床医师决定是否将移植患者送至进行活组织检查并且决定临床处置和治疗干预的目的。
“预防”、“预防性治疗”、或“预防治疗”是指预防一种或多种症状和/或其潜在原因发生，例如，预防易感发生疾病或病症的患者(例如处于较高风险中，作为遗传因素、环境因素的结果，倾向于发生疾病或病症等)的疾病或病症。
本文所用的“延缓”肾损伤、肾病或肾移植物排斥的进程或发生是指延迟、阻止、减缓、推迟、稳定和/或延缓它们的发生。这种延迟可以具有不同的时间期限，这取决于待治疗的疾患和/或个体的病史。本文所述的组合物和方法可以有助于确定个体或患者可以具有肾损伤、肾病或肾移植物排斥的延迟。
术语“有效量”是指用于治疗肾损伤、肾病或肾移植物排斥的药物制剂的用量，该用量是足以赋予期望的治疗结果的用量。有效量可以包含在一种或多种剂量范围内，即可能需要单剂量或多剂量达到期望的治疗终点。本文所述的组合物和方法可以有助于确定个体或患者可以或应接受药物制剂的有效量。
“治疗有效量”是指用于治疗肾损伤、肾病或肾移植物排斥的药物制剂的用量，该用量是足以产生期望的治疗结果(例如减轻疾病或病症的严重性)的用量。“预防有效量”是指用于治疗肾损伤、肾病或肾移植物排斥的药物制剂的用量，该用量是在施用于易感和/或可能发生疾病或病症的个体时足以预防或减轻未来疾病或病症的严重性的用量。
本文所用的“预测”或“预计”是指个体对治疗方案可能地产生有利或不利地响应的可能性。
本文所用的“在开始治疗时”或“基线”是指在首次接触治疗时或之前的时间期限。
本文所用的“基于”包括评价、确定或测定如本文所述的个体的特征(且优选选择适合于接受治疗的个体)。当将常染色体的拷贝数或总ALU拷贝数用作用于如本文所述的治疗和/或预防的选择、评价、测量或测定方法的基础时，在治疗之前和/或治疗过程中测定标记，并且得到的值由临床医师在评价如下的任一种时使用：(a)个体对最初接受治疗的可能或有可能的适合性；(b)个体对最初接受治疗的可能或有可能的不适合性；(c)对治疗的反应性；(d)个体对持续接受治疗的可能或有可能的适合性；(e)个体对持续接受治疗的可能或有可能的不适合性；或(f)预测临床有益性的可能性。正如本领域技术人员可以充分理解的，临床环境中与个体健康相关的生活质量的评价是一种清楚的指征，即这种参数用作启动、持续和/或终止本文所述的治疗施用的基础。
应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括"组成"和/或"主要由方面和实施方案组成。
本文所用的术语“检测”是指不可检测到的、低、正常或高浓度的一种或多种生物标记的定量测定，所述生物标记例如核酸、DNA、RNA、基因组DNA、dd-cfDNA、cfDNA、尿DNA等。
本文所用的,术语“定量”和“量化”可以互换使用且是指测定样品中的物质(例如常染色体)的量或丰度的方法，无论其是相对于的还是绝对的。
本文涉及数值或参数的“约”包括(且描述)涉及该数值或参数自身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括描述“X”。术语“约”用于通过提供该指定值可以是“稍高”或“稍低”于端点提供数值范围端点的灵活性，不影响期望的结果。可以用范围方式表示或呈现本文的浓度、用量和其它数据。应理解，这样的范围方式仅为了便利性和简便性，且由此应灵活地解释为对所述范围的限定，而且包括该范围内包括的所有各数值或子范围，只要每个数值和子范围得到明确地描述。
正如本说明书和待批权利要求中使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文中另有清楚地指示。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或不能发生，且该描述包括所述事件或情况发生的情况和它不发生的情况。
正如本领域技术人员显而易见的，所评价、选择和/或接受治疗的个体可以是需要评价、选择和/或接受治疗的个体。
一般技术
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有于本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
除非另有指示，否则本发明的实施使用常规的分子生物学技术(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学，它们属于本领域技术人员的范围。这样的技术完整地解释在文献中，例如：MolecularCloning：ALaboratoryManual,secondedition(Sambrooketal,1989)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；AnimalCellCulture(R.I.Freshney,ed.,1987)；HandbookofExperimentalImmunology(D.M.Weir&C.C.Blackwell,eds.)；GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.Miller&M.P.Calos,eds.,1987)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人,eds.,1987)；PCR：ThePolymeraseChainReaction,(Mullis等人,eds.,1994)；CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coligan等人,eds.,1991)；TheImmunoassayHandbook(D.Wild,ed.,StocktonPressNY,1994)；BioconjugateTechniques(GregT.Hermanson,ed.,AcademicPress,1996)；和MethodsofImmunologicalAnalysis(R.Masseyeff,W.H.Albert和N.A.Staines,eds.,Weinheim：VCHVerlagsgesellschaftmbH,1993)。本发明的实施还可以使用如AgingCell(2013年2月25日,CharacterizationoftheroleofdistinctplasmacfDNA(cfDNA)speciesinage-associatedinflammationandfrailty；J,NevalainenT,MarttilaS,M,HervonenA,HurmeM.)和ClinicalBiochemistry(44(2011)1074-1079)中所述的ALU重复单元的多种测定方法。
肾状态
本发明提供了可以用于评价个体的肾状态的组合物和方法。当个体需要医学干预时，例如，需要指定的多种医学治疗以解决医学问题或减少的医学治疗(包括终止)(其中医学治疗不再必要)时，这样的评价有助于诊断。当个体具有改变的肾状态、受损的肾状态、肾病、肾损害、肾损伤、肾移植物排斥或对于这些病症的治疗无响应时，可以使用本发明的组合物和方法可。
本文所用的受损的肾状态包括、但不限于肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植物排斥或对肾损害、肾损伤、肾病、肾病症或肾移植物排斥的治疗无响应。例如，具有受损的肾状态的个体可以是处于发生肾脏病或损伤症状的风险中的个体、其肾病或损伤消退的个体、处于发生肾移植损伤或肾移植排斥症状风险中的个体或其肾移植损伤或肾移植排斥退化的个体。
本文所用的改变的肾状态包括、但不限于个体肾损害、肾损伤、肾病、肾病症、肾移植物排斥或对肾损害、肾损伤、肾病、肾病症或肾移植物排斥治疗的反应性的改变。
肾病或肾疾患是不同的，但具有肾病的个体通常展示出特征性临床特征。牵涉肾的常见的临床病症包括、但不限于肾综合征和肾病综合征、肾囊肿、急性肾损伤、慢性肾疾病、糖尿病诱发的肾病、尿道感染、肾结石和尿路梗阻、肾小球肾炎(局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、IgA肾病、肾小球系膜毛细血管性、狼疮和膜状(membranous)等)、高血压性肾病和药物诱发肾病。肾病还可以包括存在的各种肾癌。例如，这样的癌症包括、但不限于恶性肾肿瘤有肾细胞癌、肾盂的膀胱上皮细胞、鳞状细胞癌、球旁细胞瘤(肾素瘤)、血管肌脂瘤、肾嗜酸细胞瘤、肾直小管、肾透明细胞肉瘤、中胚叶肾瘤、肾母细胞瘤、混合型上皮间质瘤、透明细胞腺癌、过渡细胞癌、内翻乳头状瘤、肾淋巴瘤、畸胎瘤、癌肉瘤和肾盂的类癌瘤。肾病还可以是病毒诱发的且包括、但不限于BKV肾病和EBV和CMV诱发的肾病。肾病还可以是药物诱发的，因为一些药物是肾毒性的(它们对于损害肾具有升高的风险)。在最坏的情况中，药物导致肾衰竭，而在其它情况中，肾被损伤，但未衰竭。常见的肾毒性药物包括、但不限于非类固醇抗炎药(NSAIDs)、一些抗生素、一些止痛药和用于一些持续操作的放射性对照染料。
可以通过除去肾或肾切除术控制几种肾病症。当由肾小球滤过率测定的肾功能持久地虚弱时，透析和肾移植可以是治疗选择。
用于肾移植的适应征是终末期肾脏疾病(ESRD)，与原发性原因无关。肾移植损伤或肾移植排斥、肾异体移植物损伤或肾同种异体移植物排斥可以在已经进行肾移植的患者中发生。它可能因几种免疫和非免疫因素发生，作为实例，例如，缺血性再灌注损伤、尺寸不一致、供体相关因素、细胞介导的排斥和抗体介导的排斥。移植后的问题可以包括：移植物排斥(超急性、急性或慢性)；因降低排斥风险所需的免疫抑制剂药物导致的感染和脓毒症；移植后淋巴增生性障碍(因导致的免疫抑制剂导致的淋巴瘤形式)；电解质包括钙和磷酸盐不平衡，其可能导致骨问题等和其它药物副作用，包括胃肠道炎症和胃和食道溃疡、多毛症(慢性模式分布的过度毛发生长)、脱发、肥胖、痤疮、2型糖尿病、高胆固醇血症和骨质疏松症。
个体和/或患者群体
本发明的组合物和方法适用于任何个体。在一个实施方案中，所述个体是患者。在其它实施方案中，所述组合物和方法可以用于鉴定需要医学干预的个体亚群(例如患者)。
在一些实施方案中，检查其尿cfDNA以便测定常染色体拷贝数、染色体1拷贝数或ALU重复单元的数量的个体可以是处于发生肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥风险中的个体；患有肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥的个体；需要治疗肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥的个体，其肾病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥已经进展或其肾病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥已经消退。在其它实施方案中，检查其尿cfDNA以便测定常染色体拷贝数、染色体1拷贝数或ALU重复单元的数量的个体是已经接受肾移植、异体移植物肾移植或具有肾病家族史的个体。在一个实施方案中，检查其尿cfDNA以便测定常染色体拷贝数、染色体1拷贝数或ALU重复单元的数量的个体是患有肾移植后急性排斥(AR)发作的个体。在其它实施方案中，检查其尿cfDNA以便测定常染色体拷贝数、染色体1拷贝数或ALU重复单元的数量的个体是患有高血压(高血压)、患糖尿病、患有系统性红斑狼疮或患有心血管疾病的个体。在其它实施方案中，所述个体超过50岁年龄、超过55岁年龄、超过60岁年龄、超过65岁年龄、超过70岁年龄或超过75岁年龄。
使用方法
本文提供通过检查尿cfDNA评价肾状态和评价肾健康的方法。本文还提供评价肾移植患者中肾移植物排斥和肾移植物排斥的方法。
本文特别地提供了检查个体的cfDNA的方法，以便鉴定处于发生肾移植损伤或肾移植排斥症状风险中的个体；监测肾移植损伤或肾移植排斥进程；监测肾移植损伤或肾移植排斥消退；监测个体对需要肾移植损伤或肾移植排斥治疗的个体治疗的响应；鉴定和/或预测肾移植损伤或肾移植排斥的风险；鉴定应开始或持续肾移植损伤或肾移植排斥的患者亚群；评价肾移植损伤或肾移植排斥的治疗效能和/或鉴定应监测发生肾移植损伤或肾移植排斥症状的患者的亚群。本文还特别地提供检查个体的cfDNA的方法，以便鉴定处于发肾病或肾损伤生风险中的个体；监测肾脏病或肾损伤进程；监测肾病或肾损伤消退；监测个体对肾病或肾损伤治疗的响应；鉴定和/或预测肾病或肾损伤发生的风险；鉴定应开始或持续肾病或肾损伤治疗的患者亚群；评价肾病或肾损的治疗效能和/或鉴定应监测发生肾脏病或肾损伤症状的患者的亚群。
这种肾状态评价方法包括测定提取自来自个体的尿样中的cfDNA。
在一个实施方案中，评价个体肾状态的方法包括测定尿样中的ALU重复单元的数量和比较ALU重复单元的数量与来自正常群体的尿样中ALU重复单元的标准数量或与另外预定的标准水平，其中ALU重复单元的数量改变预示改变的肾状态。如果经测定染色体1的拷贝数高于标准拷贝数，则预示所述个体的受损的肾状态。如果经测定染色体1的拷贝数等于或低于标准拷贝数，则预示良好的肾健康。
在另一个实施方案中，评价个体肾状态的方法包括测定尿样中任意染色体的拷贝数和比较该染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中该染色体的拷贝数或与另外预定的标准水平，其中拷贝数改变预示改变的肾状态。如果经测定染色体的拷贝数高于标准拷贝数，则预示所述个体的受损的肾状态。如果经测定染色体的拷贝数等于或低于标准拷贝数，则预示良好的肾健康。
在另一个实施方案中，所述方法用于评价个体的肾状态，包含测定尿样中染色体1、染色体2、染色体3、染色体4、染色体5、染色体6、染色体7、染色体8、染色体9、染色体10、染色体11、染色体12、染色体13、染色体14、染色体15、染色体16、染色体17、染色体18、染色体19、染色体20、染色体21、染色体22、染色体X和/或染色体Y的拷贝数和将所述染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样的染色体的标准拷贝数或另外的预定标准水平比较，其中拷贝数的改变预示改变的肾状态。如果经测定的染色体的拷贝数高于标准拷贝数，则预示所述个体的受损的肾状态。如果经测定染色体的拷贝数等于或低于标准拷贝数，则预示良好的肾健康。
在另一个实施方案中，评价个体肾状态的方法包括测定尿样中任意常染色体的拷贝数和比较任意染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中该染色体的拷贝数或与另外预定的标准水平，其中拷贝数改变预示改变的肾状态。如果经测定常染色体的拷贝数高于标准拷贝数，则预示所述个体的受损的肾状态。如果经测定常染色体的拷贝数等于或低于标准拷贝数，则预示良好的肾健康。
在另一个实施方案中，评价个体肾状态的方法包括测定尿样中任意性染色体的拷贝数和比较任意染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中该染色体的拷贝数或与另外预定的标准水平，其中拷贝数改变预示改变的肾状态。
在另一个实施方案中，评价个体肾状态的方法包括测定尿样中染色体1的拷贝数和比较任意染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中染色体1的拷贝数或与另外预定的标准水平，其中染色体1的拷贝数改变预示改变的肾状态。如果经测定染色体1的拷贝数高于标准拷贝数，则预示所述个体的受损的肾状态。如果经测定染色体1的拷贝数等于或低于标准拷贝数，则预示良好的肾健康。
用于定量无细胞、测定染色体拷贝数和ALU重复单元数量的方法
在一个实施方案中，可以对来自个体的尿中定量cfDNA。可以通过任意标准方法由本领域技术人员采集尿。例如，可以使用清洁收集方法得到尿。清洁收集方法是一种采集尿的方法，其中患者用卫生擦拭纸擦拭生殖器，弃去第一部分尿并且随后在排尿过程中将中流尿采集在无菌杯中。使用这种方法，采集50-100mL尿，且然后以2000xg离心20分钟。从5mL上清液中纯化循环的cfDNA并且使用QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen)、按照制造商的说明浓缩。
在另一个实施方案中，可以从个体血浆中对循环cfDNA定量。可以通过由本领域技术人员实施的任意标准方法采集血浆。在这样的实施方案中，可以纯化cfDNA并且使用QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen)或类似产品浓缩。然后可以对得自尿或血浆的总cfDNA定量。一种定量总cfDNA的方法通过使用Quant-ItTMPicoGreendsDNA试剂和试剂盒(Invitrogen)、按照制造商的说明和ClinicaChimicaActa(327(2003)95-101，Chen等人,(2003))中提供的方案进行。在一个实施方案中，对来自尿样的总cfDNA定量。在另一个实施方案中，对来自血浆的总cfDNA定量。
在另一个实施方案中，测定染色体的拷贝数或ALU重复单元的数量。在一些实施方案中，为了测定这种拷贝数和ALU重复单元，使用实时PCR、定量PCR和/或数字PCR。在其它实施方案中，使用这样的方法，例如荧光原位杂交、比较基因组杂交和基于阵列比较基因组杂交(aCGH)和SNP阵列技术的基于高分辨率阵列的测定法。
在一个实施方案中，数字PCR可以用于测定任意染色体的拷贝数或任意常染色体的拷贝数或任意性染色体的拷贝数。更具体地，数字PCR可以用于测定染色体1、染色体2、染色体3、染色体4、染色体5、染色体6、染色体7、染色体8、染色体9、染色体10、染色体11、染色体12、染色体13、染色体14、染色体15、染色体16、染色体17、染色体18、染色体19、染色体20、染色体21和/或染色体22的拷贝数。类似地，数字PCR可以用于测定染色体Y或染色体X的拷贝数。在一个实施方案中，数字PCR可以用于测定染色体1的拷贝数。在另一个一般性的实施方案中，数字PCR可以用于测定样品中ALU重复单元的数量。
在一个实施方案中，能够进行字PCR、实时PCR或定量PCR的引物组扩增至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、190、200、210、220、230、250或300个碱基对的扩增子。在另一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或定量PCR的引物组扩增不超过20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、190,200、210、220、230、250或300个碱基对的扩增子。在本文的任意实施方案中，扩增子可以是选自本文上述下限和上限的任意值的范围。在一个具体的实施方案中，扩增子是81个碱基对长度。在另一个具体的实施方案中，扩增子是84个碱基对长度。在另一个具体的实施方案中，扩增子是115个碱基对长度。
在一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或定量PCR的正向引物、反向引物或探针是富含GC的。在一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或定量PCR的正向引物,反向引物或探针不富含GC。在另一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或定量PCR的引物组是至少富含10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％GC的。在另一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或定量PCR的引物组不超过10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％富含GC。
在一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或定量PCR的正向引物、反向引物或探针是至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55或60个碱基对长度。在一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或定量PCR的正向引物、反向引物或探针是不超过10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55或60个碱基对长度。
在一个具体的实施方案中，数字PCR可以用于测定ALU重复单元的数量。为了进行这样的实施方案，使用适合于扩增所关注的基因座的扩增子的引物和探针制备具有Rox(Roche)的FastStartTaqManProbeMasterMix。在一个实施方案中，为了扩增ALU基因座，可以使用如下引物组：正向引物5'-GGAGGCTGAGGCAGGAGAA-3'；反向引物5'-ATCTCGGCTCACTGCAACCT-3'和探针5'-(FAM)CGCCTCCCGGGTTCAAGCG-3'。在另一个实施方案中，为了扩增115个碱基对的ALU基因座，可以使用如下引物组：正向引物5'-GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3'；反向引物5'-ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'；和探针5'-HEXTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3'。
在另一个具体的实施方案中，数字PCR可以用于测定染色体1的拷贝数。为了进行这样的实施方案，使用适合于扩增所关注的基因座的扩增子的引物和探针制备具有Rox(Roche)的FastStartTaqManProbeMasterMix。在一个实施方案中，为了扩增染色体1上基因座EIF2C1的81个碱基对的扩增子，可以使用如下：正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT；反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC；探针HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
在另一个具体的实施方案中，数字PCR可以用于测定染色体Y的拷贝数。为了进行这样的实施方案，使用适合于扩增所关注的基因座的扩增子的引物和探针制备具有Rox(Roche)的FastStartTaqManProbeMasterMix。在一个实施方案中，为了扩增染色体Y上基因座DYS14(多拷贝基因座)的84个碱基对的扩增子，可以使用如下引物组：正向引物5'-ATCGTCCATTTCCAGAATCA；反向引物5'-GTTGACAGCCGTGGAATC；探针：5'-FAM-TGCCACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BHQ1。
在另一个具体的实施方案中，数字PCR可以用于测定染色体Y的拷贝数。为了进行这样的实施方案，使用适合于扩增所关注的基因座的扩增子的引物和探针制备具有Rox(Roche)的FastStartTaqManProbeMasterMix。在一个实施方案中，为了扩增所关注的染色体Y上基因座SRY(多拷贝基因座)的84个碱基对的扩增子，可以使用如下引物组：正向引物5'-CGCTTAACATAGCAGAAGCA；反向引物5'-AGTTTCGAACTCTGGCACCT；和探针5'-FAM-TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACA-BHQ1。
可以使用BioMark实时PCR系统(Fluidigm)将为数字PCR制备的样品负载在12.765数字阵列芯片上。可以使用数字PCR分析软件v3.0提取和评估数据。每种染色体的拷贝数可以使用如下等式计算：(382/组/4.59μl/组)X(8μl反应混合物/1μlDNA)＝原始样品中的拷贝数/μl。
可以定量并且表示一种染色体的拷贝数与另一种染色体的拷贝数之间、一种染色体上的一种基因座与同一染色体上的另一种基因座之间或一种染色体的拷贝数与ALU重复单元的数量之间的相关性。可以建立这种相关性以便测定特定引物组检测肾病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥的灵敏性和可预测性。还可以建立这种相关性以便优化用于特定体液或样品的引物组。
如上所述，可以使用尿和/或血浆样品对总cfDNA、至少一种染色体的拷贝数、至少一种常染色体的拷贝数、染色体1的拷贝数、至少一种性染色体的拷贝数进行定量和测定或对ALU重复单元的数量进行定量并且与尿蛋白的测定组合。在一个具体的实施方案中，尿蛋白是肌酸酐。此外，可以使用尿和/或血浆样品对总cfDNA、至少一种染色体的拷贝数、至少一种常染色体的拷贝数、染色体1的拷贝数、至少一种性染色体的拷贝数进行定量和测定或对ALU重复单元的数量进行定量并且与测定其它病理学和临床数据组合。这样的病理学和临床数据包括、但不限于医学成像、其它血液试验、肾活组织检查、肾小球滤过率(GFR)测定(每分钟过滤的血浆水量)、校正的GFR(cGFR)测量使用体表面积的校正因子的GFR)、蛋白尿测定等。
标准水平
如本文提供的方法用于评价个体的肾状态，部分地通过测定尿样中至少一种染色体的拷贝数、测定至少一种常染色体的拷贝数、测定至少性染色体的拷贝数、特别地测定染色体1的拷贝数、特别地测定染色体Y的拷贝数、测定ALU重复单元的数量和比较该数量与来自正常群体的尿样中的标准拷贝数或另外预定的标准水平来进行，其中所述数量的改变预示改变的肾状态。
在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的染色体的标准拷贝数通过测定正常群体中该特定染色体的平均拷贝数来测定。在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的染色体的标准拷贝数通过测定正常群体中该特定染色体的拷贝数中位值来测定。在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的染色体的标准拷贝数通过测定正常群体中该特定染色体的拷贝数范围来测定。
在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的染色体1的标准拷贝数通过测定正常群体中染色体1的平均拷贝数来测定。一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的染色体1的标准拷贝数通过测定正常群体中染色体1的拷贝数中位值来测定。在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的染色体1的标准拷贝数通过测定正常群体中染色体1的拷贝数范围来测定。
在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的ALU重复单元的标准数量通过测定正常群体中ALU基因座的重复单元的平均数量来测定。在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的染色体1的标准拷贝数通过测定正常群体中ALU基因座的重复单元的中位值来测定。在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的ALU重复单元的标准数量通过测定正常群体中ALU重复单元的数量范围来测定。
在一个实施方案中，正常群体是未患有或始终未患有肾损伤、肾病、肾移植物损伤或肾移植物排斥的个体人群。在另一个实施方案中，正常群体是个体人群，其拷贝数在患有肾损伤、肾病、肾移植物损伤或肾移植物排斥之前测定。在另一个实施方案中，正常群体是患有肾损伤、肾病、肾移植物损伤或肾移植物排斥、但尚未恢复的个体人群。在不同的实施方案中，正常群体是年龄匹配、性配对、病史匹配(例如糖尿病、心血管疾病、高血压、在先病毒感染、肾癌等)、血型匹配、种族来源匹配、种族性匹配、移植史匹配、可以导致用于正常群体的测量值不均匀性的任意群体变量匹配及其组合的个体人群。
在一个实施方案中，如来自样品测定的数量等于或基本上与来自正常群体的尿样中的拷贝数相同或另外预定的标准水平。在另一个实施方案中，如来自样品测定的数量低于来自正常群体的尿样中的拷贝数相同或另外预定的标准水平。在另一个实施方案中，如来自样品测定的数量高于来自正常群体的尿样中的拷贝数相同或另外预定的水平。在一个相关的实施方案中，如来自样品测定的数量高于来自正常群体的尿样中的拷贝数或另外预定标准水平的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少2500、至少5000、至少7500、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、至少1,000,000、至少10,000,000或甚至至少100,000,000倍。在另一个实施方案中，如来自样品测定的数量低于来自正常群体的尿样中的拷贝数相同或另外预定的标准水平。
试剂盒
本发明还提供了包含用于执行本发明诊断和预后方法的材料的试剂盒。可以通过临床实验室、实验室或医师执行本文所述的操作。本发明提供可以用于这些不同环境的试剂盒。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含至少一种用于定量如本文所述的至少一种染色体的拷贝数的引物组。在一些实施方案中，所述试剂盒包含至少一种引物组，其用于定量存在于得自个体的样品中的任意染色体的拷贝数或更具体地定量任意常染色体的拷贝数、染色体1的拷贝数、染色体Y的拷贝数或ALU重复单元的数量。在一个实施方案中，所述样品得自所述个体。优选提供引物组，其用量适合于检测尿样中的cfDNA。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于定量来自尿样的cfDNA中的任意常染色体的拷贝数的引物组。在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向通过该群体相对恒定的染色体基因座。在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向代表恒定区的染色体或染色体的部分的基因座。在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向染色体的非可变区或非高变区。在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向通过该群体非恒定的染色体的基因座。在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向代表可变区的染色体或染色体部分的基因座。在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向染色体的高变区。本领域技术人员使用目前可利用的基因组方法和数据库能够鉴定为恒定的、非恒定的、可变的、非可变的、高变的、非高变的等的那些染色体或基因的基因座区域。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含引物组，其用于对提取自得自如上所述个体的尿样的cfDNA中的ALU重复单元的数量进行定量。
在一个实施方案中，所述引物组能够扩增ALU基因座的115个碱基对扩增子。在该实施方案中，所述引物组可以包含正向引物5'-GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3'和反向引物5'-ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'。在一个具体的实施方案中，该引物组能够用于数字PCR，且该引物组还包含用于数字PCR的探针。这种探针的一个示例性序列是5'-HEXTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3'。
在另一个实施方案中，所述引物组能够扩增ALU基因座的另一种扩增子。在该实施方案中，所述引物组可以包含正向引物5'-GGAGGCTGAGGCAGGAGAA-3'和反向引物5'-ATCTCGGCTCACTGCAACCT-3'。在一个具体的实施方案中该引物组能够用于数字PCR，且该引物组还包含用于数字PCR的探针。这种探针的一个示例性序列是
5'(FAM)CGCCTCCCGGGTTCAAGCG-3'。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含用于定量染色体1、染色体2、染色体3、染色体4、染色体5、染色体6、染色体7、染色体8、染色体9、染色体10、染色体11、染色体12、染色体13、染色体14、染色体15、染色体16、染色体17、染色体18、染色体19、染色体20、染色体21和/或染色体22的拷贝数的引物组，所述染色体在提取自得自如本文所述的个体的尿样的cfDNA中。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含用于对提取自得自如上所述个体的尿样的cfDNA中的染色体1的拷贝数定量的引物组。在一个实施方案中，所述引物组能够扩增基因座EIF2C1的扩增子。在该实施方案中，所述引物组可以包含正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT和反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC。在一个实施方案中，所述引物组能够用于数字PCR，且该引物组还包含用于数字PCR的探针。用于这种探针的一个示例性序列是5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含用于对提取自得自如上所述个体的尿样的cfDNA中的染色体Y的拷贝数定量的引物组。在一个实施方案中，所述引物组能够扩增基因座DYS14的扩增子。在该实施方案中，所述引物组可以包含正向引物5'-ATCGTCCATTTCCAGAATCA和反向引物5'-gttgacagccgtggaatc。在一个实施方案中，所述引物组能够用于数字PCR，且该引物组还包含用于数字PCR的探针。用于这种探针的一个示例性序列是5'-FAM-TGCCACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BHQ1。在另一个实施方案中，所述引物组能够扩增因座SRY的扩增子。在该实施方案中，所述引物组可以包含正向引物5'-CGCTTAACATAGCAGAAGCA和反向引物5'-AGTTTCGAACTCTGGCACCT。在一个实施方案中，所述引物组能够用于数字PCR，且该引物组还包含用于数字PCR的探针。用于这种探针的一个示例性序列是5'-FAM-TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACA-BHQ1。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含用于对提取自得自如上所述个体的尿样的cfDNA中的染色体X的拷贝数定量的引物组。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含一种或多种引物，其可以倍固定在底物表面上(例如，珠、阵列等)。
正如可接受的，这些内容启示试剂盒成分可以由本领域技术人员以常用的方式包装。例如，这些内容启示可以将试剂盒成分以溶液形式提供或作为液体分散体提供等。包括在本发明试剂盒中的不同的试剂可以以固体(例如，冻干的)或液体形式提供。本发明的试剂盒还可以包含用于各种缓冲液和/或试剂的不同的容器(例如，小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶子)。每种成分一般适合于作为等分在其相应的容器中或以浓缩形式被提供。还可以提供适合于进行所公开的方法的一些步骤的其它容器。优选将试剂盒的各容器以密闭形式维持以便商业销售。
在一些实施方案中，试剂盒还包含用于根据本发明方法使用其成分诊断个体的肾状态、肾移植物状态、肾病、肾损伤或肾移植物排斥的说明书。根据本发明方法的试剂盒的使用说明书可以包含用于处理得自所述个体的生物样品的说明书和/或进行试验和/或解释结果的说明书。
试剂盒还可以包含由管理药物或生物产品制造、使用或销售的政府部门开据的表格形式的通告。
计算机程序
可以使用包含记录在计算机可读媒体上的计算机执行逻辑形式的计算机程序产品执行上述方法的任一种。例如，计算机程序可以执行如下功能的一些或全部：(i)控制核酸从样品中分离；(ii)预先由样品扩增核酸；(iii)扩增样品中的特定区；(iv)鉴定和定量样品中的总cfDNA、染色体拷贝数或ALU重复单元数量；(v)比较如从样品与参比标准品中检测的数据；(vi)测定肾状态或临床结果；(vi)说明正常或异常肾状态或临床结果。
计算机可执行逻辑形式可以在任何计算机中工作，所述计算机可以是任一种类型的通用计算机，例如个人计算机、网络服务器、工作站或其它目前或随后研发的计算机平台。在一些实施方案中，描述了计算机程序产品，其包含具有其中储存的计算机执行逻辑形式(计算机软件程序，包括程序代码的计算机可读媒体。可以由处理器执行计算机可执行逻辑形式，导致处理器执行本文所述的功能。在其它实施方案中，一些功能主要使用例如硬件状态机在硬件中执行。硬件状态机的执行以便执行本文所述的功能对于本领域技术人员而言显而易见。
所述程序可以提供评价处于发生肾病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥风险中或患有它们的个体的肾状态或临床结果的方法。
实施例
实施例1：通过测定染色体Y和染色体1拷贝数检测血浆中的无细 胞DNA
对来自10位具有或不具有急性排斥(AR)发作的肾移植患者的33份唯一的血浆样品进行染色体Y和染色体1拷贝数定量。3位患者是男性肾的女性接受者。另外7位患者具有其他性别的组合。10位患者中的9位经活组织检查证实损伤。对于每位患者，分析2-4份连续的血浆样品。
使用QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen)、按照制造商的说明纯化和浓缩来自3mL血浆的循环cfDNA。然后使用Quant-iTTMPicoGreendsDNA试剂和试剂盒(Invitrogen)、按照制造商的说明定量总DNA。
数字PCR用于测定染色体Y和染色体1的拷贝数。使用如下引物和探针制备具有Rox(Roche)的FastStartTaqManProbeMasterMix。为了扩增染色体Y上基因座DYS14(多拷贝基因座)的84个碱基对的扩增子，使用如下：正向引物5'-ATCGTCCATTTCCAGAATCA；反向引物5'-gttgacagccgtggaatc；和探针5'-FAM-TGCCACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BHQ1。
为了扩增染色体1上基因座EIF2C1的81个碱基对的扩增子，使用如下：正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT；反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC；探针HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
使用BioMark实时PCR系统(Fluidigm)将样品负载在12.765数字阵列芯片上。使用PicoGreen测定样品的总DNA含量以确保等量负荷。对照男性和女性基因组DNA(Promega)用于校准染色体1和染色体Y信号。
使用数字PCR分析软件v3.0提取和评估数据。使用如下等式计算每种染色体的拷贝数：
(382/组/4.59μl/组)X(8μl反应混合物/1μlDNA)＝原始样品中的拷贝数/μl。
为了评价血浆样品中染色体1的拷贝数是否染色体Y的与拷贝数相关，分析来自4位男性肾的女性接受者患者的13份血浆样品(其中3位患者经活组织检查证实移植物损伤)。
图1呈现来自进行肾移植、具有或不具有急性排斥(AR)发作的个体的血浆样品中染色体1染色体Y的拷贝数之间的相关性。在血浆中，使用定向于多基因座基因的DYS-14引物检测到染色体Y。当与测定来自尿的cfDNA比较时，作为通过测定来自血浆的cfDNA检测肾损伤的测量值的染色体1的无细胞拷贝数的灵敏度仅有33％的灵敏度。
这些数据显示血浆在测定cfDNA以监测肾损伤方面是低于最佳的体液。
实施例2：通过测定染色体Y和染色体1拷贝数检测尿中的无细胞 DNA
对来自40位具有或不具有急性排斥(AR)发作的肾移植患者的125份唯一的尿样进行染色体Y和染色体1拷贝数定量。在125份样品中，20份取自具有AR发作或处于AR发作边缘的个体且105份样品取自尚未AR发作的个体。125份尿样中的53份来自16位男性肾的女性接受者。其余的72份尿样来自24位具有其它性别组合的患者。对于每位患者，分析2-4份连续样品。通过清洁收集方法得到50-100mL尿。清洁收集方法是一种采集尿的方法，其中患者用卫生擦拭纸擦拭生殖器，弃去第一部分尿并且随后在排尿过程中将中流尿采集在无菌杯中。然后以2000xg将样品离心20分钟。从5mL上清液中纯化循环的cfDNA并且使用QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen)、按照制造商的说明浓缩。然后使用Quant-iTTMPicoGreendsDNA试剂和试剂盒(Invitrogen)、按照制造商的说明定量总DNA。
使用BioMark(Fluidigm)实时PCR系统测定染色体Y和染色体1的拷贝数。使用如下引物和探针制备具有Rox(Roche)的FastStartTaqManProbeMasterMix。为了扩增染色体Y上基因座SRY(单一拷贝基因座)的84个碱基对扩增子，使用如下：正向引物5'CGCTTAACATAGCAGAAGCA；反向引物5'-AGTTTCGAACTCTGGCACCT；探针5'FAM-TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACA-BHQ1。为了扩增染色体1上基因座EIF2C1的81个碱基对扩增子，使用如下：正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT；反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC；探针HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。然后将样品负载在12.765数字阵列芯片上(Fluidigm)。如上所述使用PicoGreen测定样品的总DNA含量并且用于确保等量负荷。对照男性和女性基因组DNA(Promega)用于校准染色体1和染色体Y信号。
使用数字PCR分析软件v3.0提取和评估数据。使用如下等式计算每种染色体的拷贝数：
(382/组/4.59μl/组)X(8μl反应混合物/1μlDNA)＝原始样品中的拷贝数/μl。
为了评价尿样中染色体1的拷贝数是否与染色体Y的拷贝数相关，图2中比较了其相应的数量。图2呈现来自12位进行肾移植并且接受男性肾的具有或不具有急性排斥(AR)发作的女性个体的27份尿样的染色体1染色体Y拷贝数之间的相关性。作为质量对照且为了评价尿样中染色体1拷贝数的稳定性，测定来自重复试验的3位患者的9份样品中染色体1的拷贝数。在一式两份试验之间观察到紧密的相关性，正如表1和图3中呈现的。表1显示在评估的靶标方面两次试验之间的强再现性。'评估的靶标'即一种得自FluidigmBiomark仪器的无单位数量。此外，在样品中未检测到染色体Y，其中女性患者接受来自女性供体的肾移植物。
表1：
接受移植物、但未显示损伤的个体(非移植物损伤表型)的染色体1的平均拷贝数/mL/尿为1681±3124(标准偏差)。接受移植物、但未显示损伤的个体的染色体1的拷贝数中位值/mL/尿为321。接受移植物、但未显示损伤的个体的染色体1的拷贝数范围/mL/尿为0-12963个拷贝。
接受移植物并且显示损伤的个体(损伤表型)的染色体1的平均拷贝数/mL/尿为10728±30283(标准偏差)。接受移植物、但未显示损伤的个体的染色体1的拷贝数中位值/mL/尿为2009。接受移植物、但未显示损伤的个体的染色体1的拷贝数范围/mL/尿为0-198496个拷贝。
目前用于评价肾状态的标准方法是测定尿蛋白(测定蛋白尿)。为了评价染色体1拷贝数与尿蛋白测量值的相关性，将尿蛋白与染色体1拷贝数比较。如图4中所示，尿蛋白的量与染色体1拷贝数充分相关，正如在上述试验中测定的。通过标准Bradford测定法(考马斯+(Bradford)蛋白测定法,ThermoScientific)测定尿蛋白并且使用QuantiChromTM肌酸酐测定试剂盒(BioAssaySystems)、按照制造商的说明测定尿肌酸酐。
尿的无细胞染色体1拷贝数与病理学和临床数据充分相关。这些数据如表2中所示。染色体1拷贝数与cGFR的相关性优于蛋白尿与cGFR的相关性。类似地，染色体1拷贝数与急性损伤的相关性优于蛋白尿与急性损伤的相关性。染色体1拷贝数/μg尿肌酸酐与急性损伤评分相关：(i)其中r＝0.32，优于常规蛋白尿与急性损伤评分的相关性，r＝0.22。染色体1拷贝数/μg尿肌酸酐与cGFR测量值相关，其中r＝-0.28，优于常规蛋白尿与cGFR的相关性，r＝-0.02。
表2：
染色体1/肌酸酐
(P)＝p-值，(r)＝相关系数，间质(i)、小管(t)和肾小球(g)；
CADI＝慢性异体移植物损伤指数(CADI)
实施例3：通过测定ALU重复单元数量和ALU重复单元与染色体1 拷贝数的相关性检测尿中的无细胞DNA
通过实施例2中所述的尿样中标准实时PCR测定ALU重复单元的数量。对来自40位具有或不具有急性排斥(AR)发作的肾移植患者的125份唯一的尿样进行ALU重复单元和染色体1拷贝数定量。在125份样品中，20份取自具有AR发作或处于AR发作边缘的个体且105份样品取自尚未AR发作的个体。对于每位患者，分析2-4份连续样品。如实施例2中所述分离和纯化cfDNA。使用Quant-iTTMPicoGreendsDNA试剂和试剂盒(Invitrogen)、按照制造商的说明定量总DNA。
使用BioMark(Fluidigm)实时PCR系统测定染色体Y拷贝数和ALU重复单元的数量。使用如下引物和探针制备具有Rox(Roche)的FastStartTaqManProbeMasterMix。为了扩增染色体1上基因座EIF2C1的81个碱基对扩增子，使用如下：正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT；反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC；探针HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。为了扩增ALU基因座的115个碱基对扩增子，使用如下：正向引物5'-GCCTGTAATCCCAGCTACTC；反向引物5'-ATCTCGGCTCACTGCAAC；探针5'-HEX-TCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3'。然后将样品负载在12.765数字阵列芯片上(Fluidigm)。如上所述使用PicoGreen测定样品的总DNA含量并且用于确保等量负荷。对照男性和女性基因组DNA(Promega)用于校准染色体1和ALR重复单元信号。
使用数字PCR分析软件v3.0提取和评估数据。使用如下等式计算每种染色体的拷贝数：
(382/组/4.59μl/组)X(8μl反应混合物/1μlDNA)＝原始样品中的拷贝数/μl。
本实施例证实了使用基因组常染色体DNA在评价肾状态和肾损伤中的应用。图5显示样品中ALU重复单元与染色体1拷贝数的相关性。将染色体1拷贝数/2ng总DNA与ALU重复单元的数量/0.02ng总DNA的关系绘图并且显示染色体1数量与ALU重复单元数量之间良好的相关性。
实施例4：大规模研究
患者和样品：本研究登记肾移植患者血浆和尿样，这些样品是同时使用所示的肾异体移植物或活组织检查方案采集的，所述的肾异体移植物或活组织检查方案来自2004至2010年在Stanford的LucilePackard儿童医院的儿科和年轻成年人的肾移植物接受者。本研究中包括这样的患者，其中对于每位选择的患者具有本研究期间的至少2份样品，具有匹配的移植物活组织检查，包括所有可利用的监测和适应征(异体移植物功能障碍)来源的尿样。本研究经EthicsCommitteeofStanfordUniversityMedicalSchool和CaliforniaPacificMedicalCenterResearchInstitute(CPMCRI)批准并且全部患者/监护人提供参与本研究的知情许可，完全符合赫尔辛基宣言(DeclarationofHelsinki)。292份唯一的尿样采集自在移植后3、6、12和24个月的移植后时间点处于监测下和指示的活组织检查时的75位肾移植患者。血浆样品(n＝40)采集自在移植后3、6和12个月的时间点处于监测和指示下的12位患者。对于所有参与患者采集未经鉴定的临床信息。由单一病理学家使用用于急性和慢性损伤的最近期Banff标准以双盲方式给所有匹配的活检组织评分。按照Banff方案，将急性排斥(AR)定义为最小值，小管炎(tubulitis)评分≥1，附带间质性炎症评分≥1。将慢性异体移植物损伤(CAI)定义为最小值，为肾小管萎缩评分≥1，附带间质纤维化评分≥1。根据尿和血浆中存在BK病毒和显示炎症和异体移植物中阳性SV40染色鉴定BK病毒性肾炎(BKVN)。还诊断了急性肾小管坏(ATN)。将肾盂肾炎定义为存在蛋白尿(pyurina)和细菌性尿道感染和细菌性脓毒症的阳性血液培养物。将稳定(STA)的异体移植物定义为具有稳定的血清肌酸酐值且不存在有关病理学方面的显著性损伤的异体移植物。
样品采集和处理：将中流尿样(50-100mL)采集在无菌容器中并且在室温在1h采集期限内以2000xg离心20min。从包含细胞和细胞碎片的尿沉淀中分离上清液。使用TrisHCl将上清液的pH调节至7.0并且储存在-80℃至进一步分析为止。使用QuantichromTM肌酸酐测定试剂盒(DICT-500)(BioAssaySystems,Hayward,CA)测定尿肌酸酐。对于每份尿样使用考马斯+Beadford测定试剂盒(ThermoScientific,Rockford,IL)测定每份尿样的总蛋白。
血样：为了避免用于评价dd-cfDNA的供体和受体DNA测序，使用首先评价20位女性接受者的模型，然后评价ChrYcfDNA，其必须通过外推为供体衍生的。在活组织检查证实为急性排斥时(AR,n＝4)和非AR时(n＝16)采集血样；将非-AR样品分入急性肾小管坏死(ATN,n＝4)、细菌性脓毒症和肾盂肾炎(pyelonephrotos)(n＝4)、慢性移植物损伤(CAI；n＝4)和稳定移植物功能(n＝4)组。将全血采集入肝素钠试管(BDBiosciences,SanJose,CA)。使用基于Ficoll(Ficoll-PaguePLUS,GEHealthcare,Waukesha,WI)的密度梯度离心分离法除去细胞(淋巴细胞)，吸移出血浆级分并且储存在-800C至使用为止。
无细胞DNA提取和定量：使用QIAmp循环核酸试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)从来自在室温完全融化后取出的5ml尿和3ml血浆的尿样和血浆样品中得到cfDNA。如制造商的方案中所述，首先用蛋白水解酶K(提供的)处理这些样品以便降解细胞碎片并且除去DNA酶和RNA酶。然后缓冲样品并且加入RNA载体以有助于沉淀cfDNA。使这种裂解物通过DNA结合柱，且然后用缓冲液(提供的)和100％乙醇洗涤多次，使用50μl缓冲液(提供的)洗脱结合的DNA。包含DNA的洗脱液用于DNA定量和数字PCR(dPCR)。1μl洗脱液用于使用Quant-iTPicoGreen试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)、用1xTE缓冲液(提供的)按照1/100的稀释液如制造商的方案所述定量双链cfDNA。将其与等体积的每个孔(黑色微量滴定板)中的Quant-iT试剂的1/200稀释液合并，使用荧光分光光度计(GeminiEM,MolecularDevices,Sunnyvale,CA)读取得到的荧光。通过比较10-倍标准曲线(λDNA,提供的)计算每种样品的浓度(ng/ml)。
无细胞DNA测定：使用来自尿的12.765数字阵列芯片上的5ng提取的dd-cfDNA、应用Biomark实时PCR系统(Fluidigm,SouthSanFrancisco,CA)进行数字PCR(dPCR)。如下衍生引物和标记的探针(IDT,Coralville,IA)：1)对于SRY的每个单一拷贝染色体的基因座(Chr)Y(正向引物：5'CGCTTAACATAGCAGAAGCA；反向引物：5'-AGTTTCGAACTCTCTGGCACCT；探针：5'TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACA)；2)对于多拷贝ChrYDYS14的每个基因座(正向引物：5'-ATCGTCCATTTCCAGAATCA；反向引物：5'-GTTGACAGCCGTGGAATC；探针：5'-FAM-TGCCACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BHQl)；3)对于Chr1基因座EIF2C1(正向引物：5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT；反向引物：5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC；探针：5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1)。通过dPCR分析软件v3.0将每种基因座的拷贝数计算为拷贝数/ml提取的样品并且对测定的尿肌酸酐校准。通过定量PCR(qPCR)、使用引物和标记的探针(IDT,Coralville,IA)(正向引物：5'-GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3'；反向引物：5'-ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'；探针：5'-5HEXTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGC3BHQ1-3')计算ALU重复单元。标准方案用于标准条件(10min，95℃；15s95℃的40个循环；30s，60℃)下的ABIViiA7(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)上的qPCR反应。人基因组DNA(Promega,WI)用作ALU重复单元的校准标准。
统计学分析：使用未配对双尾斯氏T-检验(参数)或曼-怀二氏检验非参数)分析标称的临床变量。使用Fisher确切检验与双尾p-值分析范畴临床和组织病理学数据(Banff评分≥1)。使用Spearman秩相关系数建立相关性，其中相关性≥0.3和p-值<0.05被视为具有显著性。小于0.05的概率被视为对于所有统计学分析具有显著性，其使用GraphPadPrism(GraphpadSoftwareInc.,LaJolla,CA)计算。除非指定，否则将所有值表示为平均值±标准偏差。
血浆供体衍生的无细胞DNA(dd-cfDNA)在急性肾移植物损伤中增加：在选择的19位男性移植物的女性接受者的组中，当与稳定(STA)移植物功能期间测定的血浆dd-cfDNA值比较时，在AR时存在更大量的血浆dd-cfDNA(AR所ChrY多拷贝基因座DYS14的平均拷贝数/mL血浆为3268±1917与STA的1385±378)(p＝0.13)(图7)。当评价单一基因座ChrlSRY时，血浆中几乎不存在dd-cfDNA的信号。当对于血浆中单一基因座SRY的3份单独的血浆样品拷贝数检测重复时，我们观察到信号仅来自3份样品之一，且计算的平均拷贝数为0.65±1.12/μl负荷的DNA样品，而对于多基因座DYS14，同一样品上的拷贝数为82.82±73.52。
尿中dd-cfDNA的分析：如上所述，血浆中单一基因座SRY的检测是不可能的。而来自ChrY的基因座SRY拷贝数分析的dd-cfDNA的信号对于活组织检查证实的AR显示最高尿负荷，尿dd-cfDNA的显著增加在具有急性肾移植物损伤其它病症例如ATN和BKVN中也可以观察到。
具有末期肾病的接受者的天然肾组织是无功能的。知晓了这些，在相同的20位女性接受者或男性供体肾中测定单一基因座EIF2C1Chr1cfDNA(来自常染色体的cfDNA负荷)并且使结果/样品与得自如基因座SRY拷贝数测定的相同样品中尿ChrYdd-cfDNA负荷的结果建立相关性。
如Chr1基因座EIF2C1分析的拷贝数测定的尿cfDNA负荷几乎完全来源于供体；因为ChrY基因座SRY和Chr1基因座EIF2C1的尿cfDNA负荷高度相关(r＝0.96，R20.88，p值<0.0001；图8)。
尿ChrlcfDNA拷贝数与非特异性急性肾移植物损伤相关：接下来在独立的不同性别组合的37个供体/受体对的小组中测定尿Chr1cfDNA负荷。存在Chrl基因座EIF2C1的更广泛的变化，其中在全部样品中，0-21.57拷贝数/μg尿肌酸酐，中位值为0.97拷贝数，与表型无关。来自AR患者的尿的Chrl基因座EIF2C1的拷贝数为4.87±1.22拷贝数/μg尿肌酸酐，其显著地高于来自无损伤表型的尿中Chrl基因座EIF2C1的拷贝数(STA)0.93±0.15(p<0.0001)。然而，当来自AR患者的尿的Chrl基因座EIF2C1的拷贝数(4.87±1.22拷贝数/μg尿肌酸酐)与来自包括CAN和BKVN(4.77±1.07拷贝数/μg尿肌酸酐)的其他损伤表型的尿中的Chrl基因座EIF2C1的拷贝数比较时，无显著性差异0.93±0.15，其中P值为0.94。来自急性损伤表型(例如AR和BKVN)的尿中的Chrl基因座EIF2C1的拷贝数为4.72±0.78拷贝数/μg尿肌酸酐，其显著地高于来自无损伤表型(STA)的尿中Chrl基因座EIF2C1的拷贝数，0.93±0.15，其中P值为<0.0001(图9A)。ROC分析显示损伤和无损伤表型的ROC曲线的AUC为0.77，其中p-值为<0.0001。在1.15拷贝数/μg尿肌酸酐的阈值时，真阳性率(灵敏度)为77％，且特异性为64％。
当对于血浆中的Chr1进行dPCR时，数据显示常染色体血浆cfDNA是供体和受体cfDNA的混合物。通过测定具有移植物损伤和无损伤的患者血浆中的Chrl基因座EIF2C1拷贝数评价作为移植物损伤的标记的血浆中的常染色体拷贝数的值。AR患者血浆中的Chrl基因座EIF2C1拷贝数12.34±0.97与不具有AR的患者血浆中的Chrl基因座EIF2C1拷贝数10.25±0.71相比无显著性差异(p＝0.13)。AR患者血浆中的Chrl基因座EIF2C1拷贝数与具有慢性损伤的患者血浆中Chrl基因座EIF2C1的拷贝数相比无显著性差异。相同的情况也存在于具有损伤的AR患者血浆中的Chrl拷贝数与无损伤的患者血浆中的Chrl拷贝数相比较的情况中。
尿cfDNA达到的尿蛋白与肌酸酐之比优于急性肾移植物损伤标记的尿蛋白与肌酸酐之比：蛋白尿是移植物功能障碍的良好标记。分析同组尿样的蛋白质与肌酸酐之比。当与无损伤组(0.50±0.06)比较时，来自移植物损伤的样品的尿蛋白与肌酸酐之比高于损伤组(1.08±0.22)，p-值为0.009。有关尿蛋白与肌酸酐之比的ROC分析产生了ROC，其中AUC为0.66且p-值为0.004。在0.45μg/μg尿肌酸酐阈值下，真阳性率(灵敏度)仅为63％，特异性为64％(图9)。当蛋白质与肌酸酐配比与Chrl基因座EIF2C1拷贝数数据合并时，存在改善的AUC，为0.82，其中p<0.0001和79％的灵敏度和68％的特异性。
尿cfDNA与肾移植物组织学损伤和肾功能相关：为了评价尿cfDNA负荷是否在功能伤与移植物内组织学损伤和功能障碍相关，而与损伤Banff分类无关，使来自AR的尿dd-cfDNA(通过ChrY和Chr1的dPCR测定的)与时间配对双盲活组织检查组织学的肾小球、肾小管和间质损伤的不同Banff等级的半-定量组织学参数和评估的肾小球滤过率(eGFR)建立相关性。尿dd-cfDNA拷贝数/mcg肌酸酐显著地与eGFR(p＝7.70E-03，r＝-0.28)和炎症的配对活组织检查组织学标记(i-评分；p＝1.2E-03，r＝0.32)、肾小管炎评分(t-评分；p＝1.3E-03，r＝0.32)和肾小球炎症评分(g-评分；2.30E-02，r＝0.23)相关。
用于尿dd-cfDNA的dPCR的负荷与qPCR测定的尿ALU重复单元相关：通过测定来自cfDNA的ALU重复单元测定尿中的总染色体DNA。使用ChrY和Chr1的Dd-cfDNA测量值与如通过ALU重复单元QPCR测定法评估的总尿cfDNA相关(r＝0.87；p<0.0001)。由于这种如通过ChrY和总cfDNA、使用ALU重复单元评估的dd-cfDNA之间的相关性，所以对于独立的尿样组进行ALU重复单元QPCR，并且使ALU重复单元负荷与如通过匹配的异种移植物活组织检查Banff评分评价的样品表型建立相关性。
如通过ALU重复单元QPCR评估的尿的总cfDNA是急性肾移植物损伤的指示剂：对于全部相同表型计算基于ALU元件的尿中的基因组DNA拷贝数。基于根据ALU测定数据计算的基因组当量(GE)，当与具有正常肾功能(0.11±0.18GE/mg尿肌酸)(p＝4.25x10-07)的健康正常对照组比较时，稳定移植物患者的尿中的cfDNA负荷增加(2.06±5.75GE/mg尿肌酸)。当与具有稳定移植物功能和方案组织活组织检查时的正常移植物组织学的患者(STA；(2.06±5.75GE/mg尿肌酸))(p＝0.002)比较时，在对活组织检查时证实为AR采集的尿样中，ALU重复单元的增加进一步显著地较高(10.55±25.43GE/mg尿肌酸)。对于其他急性损伤表型例如BKVN的尿cfDNA的增加(6.55±7.02GE/mg尿肌酸)也显著地高于STA患者中的值(p＝0.04)。然而，具有慢性和其他移植物损伤表型(5.85±23.24)的患者中cfDNA负荷的增加高于具有稳定移植物功能和方案活组织检查时的正常移植物组织学的患者(STA；(2.06±5.75GE/mg尿肌酸)，但没有统计学差异(p＝0.14)。
基于移植物损伤与无移植物损伤关系的ALU测定的cfDNA数据的ROC分析显示AUC为0.73，且p值为0.001。
尿cfDNA的依次分析是用于预测移植物损伤的敏感性监测工具：通过分析采集自不同患者的尿样中的纵向尿样评价尿cfDNA负荷的潜在用途。在所有情况中，在急性损伤例如AR和BKVN时观察到cfDNA负荷急剧升高(图10)。当与低级AR或其它慢性损伤比较时，严重AR的尿中存在cfDNA负荷增加(图10A)。在每次AR事件和其它急性损伤情况例如返流性肾病中观察到这种增加(图10B)并且与稳定的移植物功能和其它慢性损伤比较。与边缘线和低级AR例如ARI比较，在高级AR(II和III)中存在cfDNA负荷的显著性提高(图10C)。在BKVN中cfDNA负荷增加较高且可以在前-BKVN尿中观察到cfDNA负荷升高(图10D)。当与如下相同患者的前-和后-AR比较时，将尿中cfDNA负荷升高观察为AR发作中的增加。评价3位患者(患者#1、#2和#3)AR前后的尿中的总cfDNA，显示在AR发作期间尿中的cfDNA负荷升高(图11)。
尽管为清楚理解的目的已经通过示例和实施例在一定程度上详细描述了上述发明，但是本领域技术人员显而易见，可以实施某些轻微的改变和变型。因此，本说明书和实施例不应被视为限定本发明的范围。

Claims (77)

1.用于评价个体的肾状态的方法，包括：
a.测定尿样中的常染色体的拷贝数；和
b.比较所述染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中的所述染色体的标准拷贝数，
其中拷贝数的改变预示改变的肾状态。
2.权利要求1的方法，其中经测定高于标准拷贝数的拷贝数预示受损的肾状态。
3.权利要求2方法，其中受损的肾状态包括肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植物排斥或者对肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症或肾移植物排斥的治疗无响应。
4.权利要求1的方法，其中肾状态的评价包括测定肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植物排斥的进程。
5.权利要求1的方法，其中肾状态的评价包括测定患有肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植物排斥且目前正在进行或已经进行过治疗的个体中的治疗响应。
6.权利要求1的方法，其中经测定等于或低于标准拷贝数的拷贝数预示良好的肾健康。
7.权利要求1的方法，其中无细胞DNA提取自尿。
8.权利要求1的方法，其中测定提取自尿的无细胞DNA中的拷贝数。
9.权利要求1的方法，其中使用实时PCR、定量PCR或数字PCR测定拷贝数。
10.权利要求9的方法，其中使用BioMark实时PCR系统测定拷贝数。
11.权利要求1的方法，其中常染色体是染色体1。
12.权利要求11的方法，其中使用EIF2C1基因座测定染色体1的拷贝数。
13.权利要求8的方法，其中使用包含正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT和反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC的引物组测定EIF2C1基因座。
14.权利要求13的方法，其中所述引物组用于实时PCR且进一步包括探针。
15.权利要求14的方法，其中所述探针包含如下的序列和报道基因：5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
16.权利要求1的方法，还包括测定其它病理学和临床数据。
17.权利要求16的方法，其中该方法包括测定肌酸酐的量。
18.权利要求16的方法，其中该方法包括测定蛋白尿或cGFR。
19.权利要求16的方法，其中该方法包括进行肾活组织检查。
20.权利要求1的方法，其中所述个体是处于肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植损伤或肾移植排斥的风险中的个体。
21.权利要求1的方法，其中所述个体是糖尿病患者。
22.权利要求1的方法，其中所述个体患有高血压。
23.权利要求1的方法，其中所述个体是同种异体移植物肾移植的接受者。
24.权利要求1的方法，其中所述个体处于肾移植物损伤或肾移植排斥的治疗中。
25.权利要求1的方法，其中所述个体患有至少一种急性排斥反应发作。
26.用于评价个体的肾状态的方法，包括：
a.测定尿样中的ALU重复单元数量；和
b.比较ALU重复单元数量与来自正常群体的尿样中的标准ALU重复单元数量，
其中ALU重复单元数量的改变预示改变的肾状态。
27.权利要求26的方法，其中经测定高于标准重复单元数量的ALU重复单元数量预示受损的肾状态。
28.权利要求27的方法，其中受损的肾状态包括肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植物排斥或者对肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症或肾移植物排斥的治疗无响应。
29.权利要求26的方法，其中肾状态的评价包括测定肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植物排斥的进程。
30.权利要求26的方法，其中肾状态的评价包括测定患有肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植物排斥且目前正在进行或已经进行过治疗的个体中的治疗响应。
31.权利要求26的方法，其中经测定等于或低于标准ALU重复单元数量的ALU重复单元数量预示良好的肾健康。
32.权利要求26的方法，其中无细胞DNA提取自尿。
33.权利要求26的方法，其中测定提取自尿的无细胞DNA中的ALU重复单元数量。
34.权利要求26的方法，其中使用实时PCR、定量PCR或数字PCR测定ALU重复单元数量。
35.权利要求9的方法，其中使用BioMark实时PCR系统测定ALU重复单元数量。
36.权利要求26的方法，其中使用实时PCR测定ALU重复单元数量。
37.权利要求36的方法，其中使用ALU基因座的115碱基对扩增子测定ALU重复单元数量。
38.权利要求26的方法，其中该方法进一步包括测定同一样品中常染色体的拷贝数。
39.权利要求38的方法，其中测定染色体1的拷贝数。
40.权利要求39的方法，其中使用EIF2C1基因座测定染色体1的拷贝数。
41.权利要求40的方法，其中使用包含正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT和反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC的引物组测定EIF2C1基因座。
42.权利要求41的方法，其中所述引物组用于实时PCR且进一步包括探针。
43.权利要求42的方法，其中所述探针包含如下序列和报道基因：5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
44.权利要求26的方法，还包括测定其它病理学和临床数据。
45.权利要求44的方法，其中该方法包括测定肌酸酐的量。
46.权利要求44的方法，其中该方法包括测定蛋白尿或cGFR。
47.权利要求44的方法，其中该方法包括进行肾活组织检查。
48.权利要求26的方法，其中所述个体是处于肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植损伤或肾移植排斥的风险中的个体。
49.权利要求26的方法，其中所述个体是糖尿病患者。
50.权利要求26的方法，其中所述个体患有高血压。
51.权利要求26的方法，其中所述个体是同种异体移植物肾移植的接受者。
52.权利要求26的方法，其中所述个体处于肾移植损伤或肾移植排斥的治疗中。
53.权利要求26的方法，其中所述个体患有至少一种急性排斥反应发作。
54.诊断试剂盒，该试剂盒包含：
a.用于测定来自样品的至少一种常染色体的拷贝数的试剂；
b.用于测定所述拷贝数的引物组；和
c.用于测定的使用说明书。
55.权利要求54的试剂盒，还包含用于从样品中提取无细胞DNA的试剂。
56.权利要求54的试剂盒，其中所述样品包含尿。
57.权利要求54的试剂盒，其中常染色体是染色体1。
58.权利要求57的试剂盒，其中所述引物组是能够扩增基因座EIF2C1的扩增子的组。
59.权利要求58的试剂盒，其中所述引物组包含正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT和反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC。
60.权利要求54的试剂盒，其中所述引物组能够用于实时PCR、定量PCR或数字PCR。
61.权利要求59的试剂盒，其中所述引物组还包含可用于数字PCR的探针。
62.权利要求61的试剂盒，其中所述探针的序列包含如下序列和报道基因：5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
63.诊断测定试剂盒，该试剂盒包含：
a.用于测定样品中ALU重复单元数量的试剂；
b.用于测定所述ALU重复单元数量的引物组；和
c.用于测定的使用说明书。
64.权利要求63的试剂盒，其还包含用于从样品中提取无细胞DNA的试剂。
65.权利要求64的试剂盒，其中所述样品包含尿。
66.权利要求63的试剂盒，其中所述引物组是能够扩增ALU基因座的115碱基对扩增子的组。
67.权利要求66的试剂盒，其中所述引物组包含正向引物5'-GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3'和反向引物5'-ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'。
68.权利要求63的试剂盒，其中所述引物组能够用于实时PCR、定量PCR或数字PCR。
69.权利要求67的试剂盒，其中所述引物组还包含可用于数字PCR的探针。
70.权利要求69的试剂盒，其中所述探针的序列包含如下序列和报道基因：5'-HEXTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3'。
71.权利要求63的试剂盒，其中该试剂盒还包含能够测定常染色体拷贝数的引物组。
72.权利要求71的试剂盒，其中常染色体是染色体1。
73.权利要求72的试剂盒，其中所述引物组是能够扩增基因座EIF2C1的扩增子的组。
74.权利要求73的试剂盒，其中所述引物组包含正向引物5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT和反向引物5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC。
75.权利要求74的试剂盒，其中所述引物组能够用于实时PCR、定量PCR或数字PCR。
76.权利要求74的试剂盒，其中所述引物组还包含可用于数字PCR的探针。
77.权利要求76的试剂盒，其中所述探针的序列包含如下序列和报道基因：5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
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