CN117187398A - 一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法，采用回声探测与环境DNA技术进行调查和采样；根据环境综合设定船只的调查航线，设定水体采样点，对数据进行处理、分析与检测；通过探测数据和环境DNA样品检测结果综合计算生物多样性指标。与现有技术相比较，本发明一次航程即可同步完成对鱼类定性、定量的生物多样性数据采集，显著节省了调查工作时间与成本，具有快速、高效、不损害生物资源等显著优势，本发明还可以分别得到所监测区域每一种鱼类单独的数量和生物量数据，而这些数据是进一步计算出鱼类的各项生物多样性评价指数，最终实现对鱼类生物多样性的全面、准确、高效评价的所必需的核心数据。
Description
技术领域
本发明涉及生物多样性监测技术领域，尤其涉及一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法。
背景技术
保护生物多样性是人类生存环境保护、改善和持续利用的重要方面。
作为河流水生态系统的重要组成部分，鱼类最先作为指示生物来评价河流的健康状况，其生物等级高，在食物链中的地位和对水质的灵敏程度高，其物种多样性的变化能够直接反映流域水生态健康状况。鱼类物种多样性包含物种丰富度、各物种丰度和群落的异质性或均匀性。同时，各物种对环境的适应能力不尽一致，优势种对群落结构有着明显的控制作用，它的时空变化反映环境的空间异质性特征和环境条件的变化。因此，监测鱼类物种分布结构、优势种的种类、数量和生物量变化趋势，对于鱼类多样性保护以及水生态系统健康状况的评价具有重要意义。
传统鱼类生物多样性调查评估多采用网具捕捞、现场调查访问相关人员、调查历史资料等方式进行，如：用底拖网、中层网、流刺网、定制网及围网钓具等渔具捕获鱼类，根据鱼类的外观特征用形态学方法鉴别物种并统计鱼类个体数量和重量，进而估算水域鱼类的种类组成、数量组成和生物量组成。虽然传统鱼类生物多样性调查在个体生物学特征方面具有优势，但调查过程存在准确度较低、耗时耗力、部分密度较低的生物群体难以获得、需要专业物种鉴定人员、对调查对象易造成损伤、对生态系统存在干扰等问题，而且随着生态文明保护步伐加快，大部分内陆天然水域实行禁渔、休渔，传统网具捕捞监测方式受到限制甚至不被允许，仅靠收集历史资料和走访渔民、渔业部门等获取的数据严重不足。
随着分子生物学技术的发展，环境DNA技术逐渐被应用到生物多样性调查中。环境DNA技术是指直接从水、土壤、沉积物等环境中提取生物DNA片段后，利用高通量测序分析获得大量DNA序列，通过宏条形码技术的序列检索对比检测环境中的物种种类，从而确定监测区域环境中的物种组成及相对丰度。该技术从分子生物学角度，通过非侵入式收集、分离、分析环境样品中DNA来检测物种，突破传统生物多样性调查多以现场调查为主的模式，提高了检测效率，降低专业物种鉴定人员的专业要求，实现了高灵敏度的鉴定珍稀濒危物种，显著提高了生物多样性调查效率，弥补了传统捕捞调查效率低、周期长、对环境干扰大、依赖专业分类学人员的不足，在生物多样性调查方面拥有广阔前景。但是，目前的环境DNA技术仅能做到通过水样监测区域的鱼类物种组成和各物种的环境DNA序列数，而环境DNA序列数虽然与物种的生物量具有一定的正相关关系，但无法绝对定量生物量，且环境DNA序列数与生物个体数量的关系不明确，因此该技术无法准确获知鱼类各物种的生物量和总个体数量，导致该技术的生物多样性调查结果不够全面。
随着水声学技术和装备的不断发展，利用水声学—回声探测仪评估渔业资源量已经成为一个重要手段。回声探测仪换能器发射的声波在水中传播，当遇到目标物体时，由于物体的声阻抗率与水介质的不同，该物体会对入射声波产生散射作用,部分反向散射至换能器，被换能器接收，即所谓的回声信号。根据声波发射后收到目标回声的间隔时间，可测得目标所处的深度，对回声信号强弱和结构加以分析，可估算出目标强度、目标数量及分布状况等，该技术具有快速高效、调查区域广、不损害生物资源、提供连续数据、精确定位鱼类位置、准确估算鱼群总数量和资源量的优势。但是，目前回声探测技术要做到对鱼类种类的精确鉴定需要非常高的探测精度与复杂的软件分析流程，成本很高，且对体型相似的鱼类鉴定困难，因此该技术无法调查出鱼类的种类组成，而种类组成是生物多样性评价中最重要的基础数据。
中国发明专利，公开(公告)号：CN115044663A，公开(公告)日：2022-09-13，公开了一种快速准确评估大水面生态渔业资源多样性的方法，其通过采样点位布设、样品采集、环境DNA提取与扩增、高通量测序和宏条码检测测其渔业资源信息，并根据监测信息进行渔业资源多样性分析。其不足之处在于：1)该发明针对的是渔业养殖场的鱼类资源多样性调查，不适用于天然生态环境中的鱼类多样性调查；2)该发明仅能获得鱼类资源的种类组成，无法准确获得鱼类的总个体数量和各种群数量组成和生物量组成。
中国发明专利，公开(公告)号：CN115248436A，公开(公告)日：2022-10-28，公布了一种基于成像声呐的鱼类资源评估方法，采用过浮标所载的多波束声呐，采集水面下的声呐图像；通过图像预处理获取各声呐图像处理后的预处理图像；通过边缘检测提取预处理图像中目标鱼类的待划分区域；基于二值化划分阈值对待划分区域进行二值化处理，并提取出二值化处理后图像中的目标鱼类；根据各声呐图像中的目标鱼类数量，进行鱼类资源统计。其不足之处是：1)该发明主要是监测渔业养殖网箱中渔业资源数量，针对特定的养殖鱼类，不适用于天然生态环境中的鱼类多样性调查；2)该发明仅能获得鱼群的总数量，无法获得鱼类的种类组成、优势种类和各种群的数量组成和生物量组成。
中国发明专利，公开(公告)号：CN 115011678A，公开(公告)日：2022-09-06，公布了一种鱼类多样性和相对丰度的评估方法，该方法通过以下步骤评估鱼类多样性和相对丰度：获得本土鱼类的种属和样品；构建本土鱼类的线粒体基因组数据，获得本土数据；整合本土数据和公共数据库数据，获得参考数据库1；采集待测流域的水环境样本和表层沉积物样本，提取DNA；获得DNA中目的基因的扩增产物，采用参考数据库1进行注释，联用水体和表层沉积物DNA宏条形码数据得到鱼类多样性和相对丰度。该发明完善了待监测流域本土鱼类的线粒体数据库，辅以两个权威数据库对鱼类物种进行注释，综合考虑水样、表层沉积物2个介质的DNA监测结果，提高了鱼类物种监测数量，提高了鱼类物种相对丰度估算的准确度。其不足之处是：该发明只是对环境DNA技术评估鱼类多样性和相对丰度的方法的简单改进，监测结果仍然无法准确获得鱼类的总个体数量和各种群数量组成和生物量组成。
中国发明专利，公开(公告)号：CN 109593829B，公开(公告)日：2020-11-17，公布了一种基于eDNA的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置，该发明采用过滤法进行样品DNA提取，在多次抽滤的同时进行搅拌，缩短实验的周期，同时避免样品在实验阶段被交叉污染，过滤的样品在24h内进行DNA提取，减少DNA降解，采用人体组织和血液提取物作为提取剂，获得最大提取量，提取的DNA浓度和纯度都较高，采用DNA克隆测序，减少实验成本，采用绝对定量PCR的方法进行鱼类定量研究。其不足之处是：该发明主要内容为eDNA实验方法的简单改进，目的是获得最大DNA序列避免交叉感染，提升速率和准确度，并采用了绝对定量PCR技术弥补基于高通量测序技术的宏条形码技术只能实现半定量监测的不足，但绝对定量PCR技术的操作复杂性与检测成本远远高于常用的宏条形码技术，严重限制了该技术在常规监测工作中的应用。
发明内容
本发明的目的就在于解决现有技术无法全面、有效监测鱼类生物多样性各项指标的问题，基于回声探测技术与环境DNA技术相结合，提出了一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法，所述鱼类生物多样性调查方法基于回声探测与环境DNA技术，方法步骤如下，
步骤一、使用同时搭载回声探测仪与环境DNA采样设备的船只，进行对自然水体的调查与采样作业；设备搭载的注意事项：回声探测仪的数字换能器(探头)需固定在船头的一侧，并远离发动机，探头放于水面以下约0.5米，以避免船体波动致使探头露出水面，同时也减少水面反射的影响。将环境DNA采样桶、水样过滤仪等放置于船舱内，并防水保存，避免影响采用检测。
步骤二、根据环境综合设定船只的调查航线，根据调查航线和环境设定水体采样点；
步骤三、走航过程中进行回声探测调查，在水体采样点进行环境DNA水样采集；
步骤四、对回声探测数据进行处理与分析；
步骤五、对环境DNA样品进行处理与检测；
步骤六、通过探测数据和环境DNA样品检测结果综合计算生物多样性指标，得到该区域自然水生态环境的鱼类生物多样性数据。
通过上述回声探测和环境DNA采样方法可以实现仅用一艘船、一次航程即可同步完成鱼类定性、定量的生物多样性数据采集，完成所需的全部调查采样工作，与现有的捕捞监测、环境DNA监测、水声学监测等技术相比，显著节省了为获得全面评价数据所需要的调查工作时间与成本，同时最大程度保证了所采集数据的同位性、代表性，从而保证后续生物多样性指标综合计算的准确性。
作为优选，步骤二中，所述调查航线的走向设置以垂直于鱼类密度梯度线、同时兼顾水域断面左中右区域为设计原则，每条走航路线均可覆盖各种密度类型的鱼类分布区，能够采集到河流或湖泊区域断面左中右点位的全面性环境DN A水样，保证航线充分覆盖水域，同时方便环境DNA采样。走航路线采用平行式走航调查，走“Z”或“弓”字形路线。
作为优选，步骤二中，水体采样点的设定方式根据环境不同采样不同的方式，确保采样数据的准确性，对于水体采样点设定方式如下：对于缓慢流动的低地溪流和河流，每间隔1km左右采集水域断面左中右3个环境DNA水样，对于快速流动的高山溪流和河流，每间隔10km左右采集水域断面左中右3个环境DNA水样，对于湖泊、水库，根据其面积确定采样点位数，对于面积小于50km2的湖库，采集3-10个点位，点位分布兼顾湖心区与湖滨区，在每个点位采集其周边100米区域范围内的左中右3个环境DNA水样，对于深水型湖泊间隔5m深度分层采样。
作为优选，步骤三中，调查时间选择为晴朗无风天，利用导航定位仪确定调查船的坐标位置，并记录航行路线。调查时间一般为7∶00-17∶30，避免天气对调查产生影响。船只航速保持8-10km/h，回声探测仪波束角为6.8°×6.8°，换能器频率为200kHz，-3dB，探测时脉冲宽度设定为0.4ms，脉冲发射频率设定为5pings/s，以保证回声探测仪的换能器充分接收回波信号，同时避免发动机工作噪音太大对仪器产生干扰。
当船只航行至设定的采样点时，稳住船只收集待采水样。其采样方法为：用带绳子的塑料桶收集待采水样，先润洗采样工具及过滤仪管道，然后用采水器准确采集5L水样于塑料桶中，现场用0.45μm的无菌微孔滤膜抽滤。抽滤完成，滤膜放入5mL无菌管中添加保存液混合均匀后常温保存，待调查完成后带回实验室，通过上述过程确保DNA水体采样的数据准确性和同位性。
作为优选，步骤四中，进行探测数据的处理与分析的方法如下，
A.进行走航覆盖率校验
走航覆盖率
其中,L是每次走航的总长度(km)，是探测水域的面积(km2)，要求走航覆盖率原则上应大于6，以保证所采集数据具有代表性。
B.进行水声学数据处理分析及参数设置
进行声学数据相关参数设置，相关参数如下：脉冲宽度决定水平＝6dB；最小标准脉宽＝0.6；最大标准脉宽＝1.5；最大波束补偿(2ways)＝6dB；短轴角度最大标准偏差＝0.6°；长轴角度最大标准偏差＝0.6°。
采用声学处理软件Echoview对所采集的数据进行处理，包括自动识别水底、人工校对、排除表层线以上和底线以下的区域，同时剔除水体中明显的噪音信号，保留用于评估鱼类数量的鱼群和单体鱼映像数据，采用回波积分法进行资源密度计算及其空间分布特征分析；
C.进行信息提取
对处理分析的数据进行信息提取，人工对回声信号进行计数，回声信号数量即为探测区域鱼类总数量。
作为优选，步骤五中，对环境DNA样品进行处理与检测的方法如下：
A.进行环境DNA提取
采用DNAeasy PowerWater Kit试剂盒提取水体环境DNA，DNA在-20℃及以下保存，并避免反复冻融，
B.进行PCR扩增
采用覆盖鱼类物种多且鉴别精度高的引物—12S rDNA基因的上下游引物扩增环境DNA，用1％～2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的PCR产物，应呈现单一清晰明亮、无拖尾的条带，若样品出现多个条带，需纯化PCR产物，PCR扩增产物在-20℃及以下温度条件下保存，保存时间不超过1年；
引物的特异性影响PCR成功的概率，引物的偏好性影响扩增后DNA序列相对比例，因此良好的引物设计对PCR扩增的成功至关重要，本发明所采用的引物不仅能保证扩增的成功率，还能提高扩增的准确性。
具体的引物序列为
MetafishF1：TCGTGCCAGCCACCGCGGTTA；
MetafishR1：ATAGTGGGGTATCTAATCCCAG。
C.进行高通量测序与分析
利用Ion PGM测序仪(Life Technologies，USA)进行测序，消除测序结果误差后，将分子分类单元的序列与本地数据库或现有的条形码数据库(如SILVA、RDP等)进行检索对比分析，最终获得物种注释信息；
对于测序结果，每个样品保留相对丰度＞0.1％的分子分类单元，且测序结果中的有效分子分类单元在某一位点的生物重复样品中检出率应不低于2/3，以消除测序结果误差。
作为优选，步骤六中，对调查、检测数据进行分析计算，得到所调查区域鱼类种类组成、总数量、总生物量、空间分布、优势种等指标，特别地，分别计算出所监测区域每一种鱼类单独的数量和生物量数据，生物多样性指标及其计算方法如下，
a.鱼类密度
由鱼类计数结果除以调查水域体积，得到鱼类密度，计算公式为：
式中,ρ为调查水域平均鱼类密度，ρi为第i次航程鱼类密度，Ni为该航次鱼类数量，Si为该航次扫描覆盖水底面积，hi为航次平均水深，Li为该航次航线距离，α为垂直方向夹角；
b.鱼类总个体数量
N＝ρ*S
式中，N为调查水域鱼类总个体数量，ρ为调查水域平均鱼类密度，S为调查水域总面积；
c.鱼类平均体长
有实测数据可进行实测反演，若无实测数据，参考如下经验公式：
TS0＝20lg L0－67.4
式中，TS0为鱼类的平均目标强度(dB)，L0为目标鱼体的平均体长(cm)；
d.鱼类总资源量
根据调查水域历史渔获物资料，确定鱼类体长(L，cm)体重(W，g)的经验公式：
W0＝a*L0 b
W＝W0*N
式中，W0为调查水域鱼类的平均重量，L0为鱼体的平均体长，参数a、b分别为根据现场资料得出的经验参数，W为调查水域鱼类的总重量，N为调查水域鱼类的总个体数量；
e.各种群数量组成
根据鱼类总个体数量和各种类相对丰度比例，可得各种群的个体数量：
Ni＝N*Ci％
式中，Ni为调查水域第i种鱼类的个体数量，N为调查水域鱼类总个体数量，Ci％为检测出的第i种鱼类相对丰度占比；
f.各种群生物量组成
根据计算出的鱼类总资源量和各种类生物量相对比例，可得各种群的生物量：
Wi＝W*Ci％
式中，Wi为调查水域第i种鱼类的生物量，W为调查水域鱼类总生物量，Ci％为检测出的第i种鱼类生物量相对丰度占比；
g.优势种群生物量
Wi＝W*Ci％
式中，Wi为检测出的第i种优势种类的生物量，W为调查水域鱼类总生物量，Ci％为检测出的第i种优势鱼类生物量相对丰度占比；
h.大型珍稀鱼类保有指数
计算现状大型珍稀鱼类数量与历史参考点数量的差异状况，以评价现状保有情况：
F＝FO/FE*100
式中，F为指定种类的大型珍稀鱼类的保有指数(％)，FO为调查评价河湖所获得的大型珍稀鱼类的数量，FE为1980s以前评价河湖的大型珍稀鱼类的数量；
i.鱼类多样性指数
鱼类物种多样性采用Shannon-Weiner多样性指数H′、Pielou均匀度指数J′和Margalef丰富度指数D进行综合分析评价，其中Shannon-Weiner多样性指数和Pielou均匀度指数分别基于个体数量和生物量进行计算,计算公式分别为：
Margalef种类丰富度指数(D)
D＝(A-1)/ln N
Shannon-wiener多样性指数(H′)
H'＝-∑(piln pi)
Pielou均匀度指数(J′)
J'＝H'/ln A
式中，N为群落中所有鱼类总个体数量，A为群落中鱼类物种种类数量，pi为群落中第i种鱼类个体数量或生物量占鱼类总个体数量或生物量的比值。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明所使用的采样方法可以实现仅用一艘船、一次航程即可同步完成对鱼类定性、定量的生物多样性数据采集所需的全部调查采样工作，与现有的捕捞监测、环境DNA监测、水声学监测等技术相比，显著节省了为获得全面评价数据所需要的调查工作时间与成本，同时最大程度保证了所采集数据的同位性、代表性，从而保证后续生物多样性指标综合计算的准确性。
(2)通过对本发明调查、检测数据进行分析计算，可准确得到所调查区域鱼类种类组成、总数量、总生物量、空间分布、优势种等指标，特别地，与现有的环境DNA监测、回声探测等技术相比，现有技术存在无法获知所监测区域的每一种鱼类单独的数量、生物量的缺陷，本发明可以分别得到所监测区域每一种鱼类单独的数量和生物量数据，而这些数据是进一步计算出鱼类的各项生物多样性评价指数，最终实现对鱼类生物多样性的全面、准确、高效评价的所必需的核心数据。
(3)本发明相对于传统常用的捕捞鉴定鱼类多样性调查方法，不需要使用电鱼、网捕等对鱼类的破坏性手段，也不需要经验要求高的传统形态学鉴定人员，具有快速、高效、不损害生物资源等显著优势。
(4)本发明所提出的调查方法对于大型珍稀鱼类(如中华鲟、江豚、达氏鳇等)的监测特别有效。一般体型越大的鱼类，数量相对越少，监测到的难度就越大，但是体型大的鱼类在水环境中产出的DNA碎片也较多，其回声信号也较容易识别，本发明所提出的调查方法利用复合型手段进行大型珍稀鱼类的监测，与现有技术相比，检出能力显著提高，并可以更加全面、准确得到水域中大型珍稀鱼类的具体种类、数量和分布位置等，为对其后续的保护提供有力的信息支撑。
附图说明
图1为本发明方法流程图。
具体实施方式
本发明是一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法，采用回声探测仪配合环境DNA采样技术进行调查和采样，不采用网捕、电鱼等具有破坏性的传统调查方式的条件下，实现了对自然水体中的鱼类生物多样性进行高效的定性与定量调查，克服了环境DNA技术、回声探测技术的显著不足，对于鱼类多样性保护以及水生态系统的保护和修复具有重要意义。本发明可以分别得到所监测区域每一种鱼类单独的数量和生物量数据，而这些数据是进一步计算出鱼类的各项生物多样性评价指数，最终实现对鱼类生物多样性的全面、准确、高效评价的所必需的核心数据。
下面结合具体实例，来进一步阐述本发明的方法的具体应用。
以四川省自贡市的某一水库为例，该水库面积约40km2，平均水深约为6.9米，其具体实施方法(参见图1)，具体步骤如下：
1.调查与采样
使用快艇同时搭载回声探测仪与环境DNA采样设备对该水库进行调查与采样作业。调查时间为2022年夏季，天气晴朗无风，调查时间为8∶00-16∶30。
调查前将回声探测仪的数字换能器(探头)固定在船头的一侧(远离发动机)，探头放于水面以下0.5米，以避免船体波动致使探头露出水面，同时也减少水面反射的影响。将环境DNA采样桶、水样过滤仪等放置于船舱内，防水保存。
走航采用“弓”字形路线，保证航线充分覆盖水域，同时方便环境DNA采样，根据水库面积确定为3个环境DNA水样采样点(A、B、C)，利用导航定位仪确定调查船的坐标位置，并记录航行路线，船只航速保持为8-10km/h，以保证换能器充分接收回波信号，同时避免发动机工作噪音太大对仪器产生干扰。具体的回声探测仪波束角为6.8°×6.8°，换能器频率为200kHz，-3dB，探测时脉冲宽度设定为0.4ms，脉冲发射频率设定为5pings/s。
船只航行至设定的环境DNA采样点时，稳住船只，观察记录回声探测系统探测深度(A点水深3.52米，B点水深8.67米，C点水深6.32米)，A点采集表层水，B点C点分别采集水面及水下5米的混合水样。每个点采集水样之前用带绳子的塑料桶收集待采水样，润洗采样工具及过滤仪管道，然后用采水器准确采集5L水样于塑料桶中，现场用0.45μm的无菌微孔滤膜抽滤。抽滤完成，滤膜放入5mL无菌管中添加保存液混合均匀后常温保存，待调查完成后带回实验室。采集5米深水样时，采用采样器采集深度5米水样，用水样润洗采样工具及过滤仪管道，然后再采集5L水样于塑料桶中，现场用0.45μm的无菌微孔滤膜抽滤。抽滤完成，滤膜放入5mL无菌管中添加保存液混合均匀后常温保存，待调查完成后带回实验室。
2.数据及样品处理与分析
(1)探测数据处理与分析
A.走航覆盖率校验
走航覆盖率
本次走航的总长度为52.3km，探测水域的面积40km2。本次航行覆盖率为8.2，符合走航覆盖率大于6的原则。
B.水声学数据处理分析及参数设置
数据采集完成，在办公室采用声学处理软件Echoview对所采集的数据进行处理，包括自动识别水底、人工校对、排除表层线以上和底线以下的区域，同时剔除水体中明显的噪音信号，保留用于评估鱼类数量的鱼群和单体鱼映像数据。采用回波积分法进行资源密度计算及其空间分布特征分析。具体的声学数据处理相关参数如下：脉冲宽度决定水平＝6dB；最小标准脉宽＝0.6；最大标准脉宽＝1.5；最大波束补偿(2ways)＝6dB；短轴角度最大标准偏差＝0.6°；长轴角度最大标准偏差＝0.6°。
C.信息提取
数据处理好后，人工对回声信号进行计数，回声信号数量即为探测区域鱼类总数量。
(2)环境DNA样品处理与检测
A.环境DNA提取
在环境DNA实验室采用DNAeasy PowerWater Kit试剂盒提取环境DNA。提取的DNA在-20℃及以下保存，需注意避免反复冻融。
B.PCR扩增
采用覆盖鱼类物种多且鉴别精度高的引物—12S rDNA基因的上下游引物扩增环境DNA。引物的特异性影响PCR成功的概率，引物的偏好性影响扩增后DNA序列相对比例，因此良好的引物设计对PCR扩增的成功至关重要，本发明所采用的引物不仅能保证扩增的成功率，还能提高扩增的准确性。
具体的引物序列为
MetafishF1：TCGTGCCAGCCACCGCGGTTA；
MetafishR1：ATAGTGGGGTATCTAATCCCAG。
用1％～2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的PCR产物，应呈现单一清晰明亮、无拖尾的条带。若样品出现多个条带，需纯化PCR产物。PCR扩增产物在-20℃及以下温度条件下保存，保存时间不超过1年。
建立PCR反应体系如下表1：
表1
建立扩增条件如下表2：
表2
C.高通量测序与分析
本发明利用Ion PGM测序仪(Life Technologies，USA)进行测序。对于测序结果，每个样品保留相对丰度>0.1％的分子分类单元，且测序结果中的有效分子分类单元在某一位点的生物重复样品中检出率应不低于2/3，以消除测序结果误差。将分子分类单元的序列与本地数据库或现有的条形码数据库(如SILVA、RDP等)进行检索对比分析，最终获得物种注释信息。
3.生物多样性指标计算
通过对本发明调查、检测数据进行分析计算，可准确得到所调查区域鱼类种类组成、总数量、总生物量、空间分布、优势种等指标，特别地，与现有的环境DNA监测、水声学监测等技术相比，本发明可以得到各不同种鱼类的种群数量和生物量组成数据，在此基础上进一步计算出鱼类的各项生物多样性指数，最终实现对鱼类生物多样性的全面、准确、高效评价。
同时，本发明所提出的调查方法对于大型珍稀鱼类(如中华鲟、江豚、达氏鳇等)的监测特别有效。一般体型越大的鱼类，数量相对越少，监测到的难度就越大，但是体型大的鱼类在水环境中产出的DNA碎片也较多，其回声信号也较容易识别。本发明所提出的调查方法利用复合型手段进行大型珍稀鱼类的监测，与现有技术相比，检出能力显著提高，并可以更加全面、准确得到水域中大型珍稀鱼类的具体种类、数量和分布位置等，为对其后续的保护提供有力的信息支撑。
本发明所采用的生物多样性指标如下：
(1)鱼类密度
由鱼类计数结果除以调查水域体积，得到鱼类密度，计算公式为：
式中,ρ为调查水域平均鱼类密度，ρi为第i次航程鱼类密度，Ni为该航次鱼类数量，Si为该航次扫描覆盖水底面积，hi为航次平均水深，Li为该航次航线距离，α为垂直方向夹角；
(2)鱼类总个体数量
N＝ρ*S
式中，N为调查水域鱼类总个体数量，ρ为调查水域平均鱼类密度，S为调查水域总面积；
(3)鱼类平均体长
有实测数据可进行实测反演，若无实测数据，参考如下经验公式：
TS0＝20lg L0－67.4
式中，TS0为鱼类的平均目标强度(dB)，L0为目标鱼体的平均体长(cm)；
(4)鱼类总资源量
根据调查水域历史渔获物资料，确定鱼类体长(L，cm)体重(W，g)的经验公式：
W0＝a*L0 b
W＝W0*N
式中，W0为调查水域鱼类的平均重量，L0为鱼体的平均体长，参数a、b分别为根据现场资料得出的经验参数，W为调查水域鱼类的总重量，N为调查水域鱼类的总个体数量；
(5)各种群数量组成
根据鱼类总个体数量和各种类相对丰度比例，可得各种群的个体数量：
Ni＝N*Ci％
式中，Ni为调查水域第i种鱼类的个体数量，N为调查水域鱼类总个体数量，Ci％为检测出的第i种鱼类相对丰度占比；
(6)各种群生物量组成
根据计算出的鱼类总资源量和各种类生物量相对比例，可得各种群的生物量：
Wi＝W*Ci％
式中，Wi为调查水域第i种鱼类的生物量，W为调查水域鱼类总生物量，Ci％为检测出的第i种鱼类生物量相对丰度占比；
(7)优势种群生物量
Wi＝W*Ci％
式中，Wi为检测出的第i种优势种类的生物量，W为调查水域鱼类总生物量，Ci％为检测出的第i种优势鱼类生物量相对丰度占比；
(8)大型珍稀鱼类保有指数
计算现状大型珍稀鱼类数量与历史参考点数量的差异状况，以评价现状保有情况：
F＝FO/FE*100
式中，F为指定种类的大型珍稀鱼类的保有指数(％)，FO为调查评价河湖所获得的大型珍稀鱼类的数量，FE为1980s以前评价河湖的大型珍稀鱼类的数量；
(9)鱼类多样性指数
鱼类物种多样性采用Shannon-Weiner多样性指数H′、Pielou均匀度指数J′和Margalef丰富度指数D进行综合分析评价，其中Shannon-Weiner多样性指数和Pielou均匀度指数分别基于个体数量和生物量进行计算,计算公式分别为：
Margalef种类丰富度指数(D)
D＝(A-1)/ln N
Shannon-wiener多样性指数(H′)
H'＝-Σ(pi ln pi)
Pielou均匀度指数(J′)
J'＝H'/ln A
式中，N为群落中所有鱼类总个体数量，A为群落中鱼类物种种类数量，pi为群落中第i种鱼类个体数量或生物量占鱼类总个体数量或生物量的比值
根据本次调查数据综合分析，简要计算结果如下：该水库此次调查中共检测出29种鱼类，其中以贝氏高原鳅和宽鳍鱲为优势种类，相对丰度占比分别为31.47％及19.00％。本次调查中，未监测到大型珍稀鱼类。库区鱼类的平均密度为0.31尾/m2，鱼类个体总数量为1.24*107条，声呐平均强度为-50dB，鱼类平均体长L0约为12cm。根据体长体重公式(平均体重W0＝0.0052*L03.162)得到该水库鱼类平均体重为13.44g，鱼类总质量为166.656吨。
根据各种类生物量组成可得鱼类多样性指数如下：
本次调查中，Shannon-wiener多样性指数H′为2.33。
本次调查中，Pielou均匀度指数J′为0.69。
本次调查中，Margalef种类丰富度指数D为1.71。
鱼类物种组成明细、数量明细、生物量明细见下表3至表6。
表3-鱼类多样性指数计算表
表4-物种组成明细表
表5-各物种数量组成明细表
表6-各物种生物量组成明细表
以上对本发明所提供的一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法进行了详尽介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，对本发明的变更和改进将是可能的，而不会超出附加权利要求所规定的构思和范围，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (7)
1.一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法，其特征在于：所述鱼类生物多样性调查方法基于回声探测与环境DNA技术，方法步骤如下，
步骤一、使用同时搭载回声探测仪与环境DNA采样设备的船只，进行对自然水体的调查与采样作业；
步骤二、根据环境综合设定船只的调查航线，根据调查航线和环境设定水体采样点；
步骤三、走航过程中进行回声探测调查，在水体采样点进行环境DNA水样采集；
步骤四、对回声探测数据进行处理与分析；
步骤五、对环境DNA样品进行处理与检测；
步骤六、通过探测数据和环境DNA样品检测结果综合计算生物多样性指标，得到该区域自然水生态环境的鱼类生物多样性数据。
2.根据权利要求1所述的一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法，其特征在于：步骤二中，所述调查航线的走向设置以垂直于鱼类密度梯度线、同时兼顾水域断面左中右区域为设计原则，每条走航路线均可覆盖各种密度类型的鱼类分布区，能够采集到河流或湖泊区域断面左中右点位的全面性环境DNA水样，走航路线采用平行式走航调查，走“Z”或“弓”字形路线。
3.根据权利要求1所述的一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法，其特征在于：步骤二中，对于水体采样点设定方式如下，对于缓慢流动的低地溪流和河流，每间隔1km左右采集水域断面左中右3个环境DNA水样，对于快速流动的高山溪流和河流，每间隔10km左右采集水域断面左中右3个环境DNA水样，对于湖泊、水库，根据其面积确定采样点位数，对于面积小于50km2的湖库，采集3-10个点位，点位分布兼顾湖心区与湖滨区，在每个点位采集其周边100米区域范围内的左中右3个环境DNA水样，对于深水型湖泊间隔5m深度分层采样。
4.根据权利要求1所述的一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法，其特征在于：步骤三中，调查时间选择为晴朗无风天，利用导航定位仪确定调查船的坐标位置，并记录航行路线，当船只航行至设定的采样点时，稳住船只收集待采水样。
5.根据权利要求1所述的一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法，其特征在于：步骤四中，进行探测数据的处理与分析的方法如下，
A.进行走航覆盖率校验
走航覆盖率
其中,L是每次走航的总长度(km)，是探测水域的面积(km2)，走航覆盖率应大于6；
B.进行水声学数据处理分析及参数设置
进行声学数据相关参数设置，采用声学处理软件Echoview对所采集的数据进行处理，包括自动识别水底、人工校对、排除表层线以上和底线以下的区域，同时剔除水体中明显的噪音信号，保留用于评估鱼类数量的鱼群和单体鱼映像数据，采用回波积分法进行资源密度计算及其空间分布特征分析；
C.进行信息提取
对处理分析的数据进行信息提取，人工对回声信号进行计数，回声信号数量即为探测区域鱼类总数量。
6.根据权利要求1所述的一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法，其特征在于：步骤五中，进行环境DNA样品处理与检测的方法如下，
A.进行环境DNA提取
采用DNAeasy PowerWater Kit试剂盒提取水体环境DNA，DNA在-20℃及以下保存，并避免反复冻融；
B.进行PCR扩增
采用覆盖鱼类物种多且鉴别精度高的引物—12S rDNA基因的上下游引物扩增环境DNA，用1％～2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的PCR产物，将满足要求的PCR扩增产物在-20℃及以下温度条件下保存；
C.进行高通量测序与分析
利用Ion PGM测序仪进行测序，消除测序结果误差后，将分子分类单元的序列与本地数据库或现有的条形码数据库进行检索对比分析，最终获得物种注释信息。
7.根据权利要求1所述的一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法，其特征在于：步骤六中，生物多样性指标及其计算方法如下，
a.鱼类密度
由鱼类计数结果除以调查水域体积，得到鱼类密度，计算公式为：
式中,ρ为调查水域平均鱼类密度，ρi为第i次航程鱼类密度，Ni为该航次鱼类数量，Si为该航次扫描覆盖水底面积，hi为航次平均水深，Li为该航次航线距离，α为垂直方向夹角；
b.鱼类总个体数量
N＝ρ*S
式中，N为调查水域鱼类总个体数量，ρ为调查水域平均鱼类密度，S为调查水域总面积；
c.鱼类平均体长
有实测数据可进行实测反演，若无实测数据，参考如下经验公式：
TS0＝20lg L0－67.4
式中，TS0为鱼类的平均目标强度(dB)，L0为目标鱼体的平均体长(cm)；
d.鱼类总资源量
根据调查水域历史渔获物资料，确定鱼类体长(L，cm)体重(W，g)的经验公式：
W0＝a*L0/b
W＝W0/*N
式中，W0/为调查水域鱼类的平均重量，L0为鱼体的平均体长，参数a、b分别为根据现场资料得出的经验参数，W为调查水域鱼类的总重量，N为调查水域鱼类的总个体数量；
e.各种群数量组成
根据鱼类总个体数量和各种类相对丰度比例，可得各种群的个体数量：
Ni＝N*Ci％
式中，Ni为调查水域第i种鱼类的个体数量，N为调查水域鱼类总个体数量，Ci％为检测出的第i种鱼类相对丰度占比；
f.各种群生物量组成
根据计算出的鱼类总资源量和各种类生物量相对比例，可得各种群的生物量：
Wi＝W*Ci％
式中，Wi为调查水域第i种鱼类的生物量，W为调查水域鱼类总生物量，Ci％为检测出的第i种鱼类生物量相对丰度占比；
g.优势种群生物量
Wi＝W*Ci％
式中，Wi为检测出的第i种优势种类的生物量，W为调查水域鱼类总生物量，Ci％为检测出的第i种优势鱼类生物量相对丰度占比；
h.大型珍稀鱼类保有指数
计算现状大型珍稀鱼类数量与历史参考点数量的差异状况，以评价现状保有情况：
F＝FO/FE*100
式中，F为指定种类的大型珍稀鱼类的保有指数(％)，FO为调查评价河湖所获得的大型珍稀鱼类的数量，FE为1980s以前评价河湖的大型珍稀鱼类的数量；
i.鱼类多样性指数
鱼类物种多样性采用Shannon-Weiner多样性指数H′、Pielou均匀度指数J′和Margalef丰富度指数D进行综合分析评价，其中Shannon-Weiner多样性指数和Pielou均匀度指数分别基于个体数量和生物量进行计算,计算公式分别为：
Margalef种类丰富度指数(D)
D＝(A-1)/lnN
Shannon-wiener多样性指数(H′)
H'＝-Σ(pilnpi)
Pielou均匀度指数(J′)
J'＝H'/ln A
式中，N为群落中所有鱼类总个体数量，A为群落中鱼类物种种类数量，pi为群落中第i种鱼类个体数量或生物量占鱼类总个体数量或生物量的比值。
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|---|---|---|---|
| CN202310177811.8A CN117187398A (zh) | 2023-02-28 | 2023-02-28 | 一种对自然生态环境下鱼类生物多样性的调查方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN117187398A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117761670A (zh) * | 2023-12-21 | 2024-03-26 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种水声学和渔获物相结合鱼类资源量分级量化评估方法 |
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2023
- 2023-02-28 CN CN202310177811.8A patent/CN117187398A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117761670A (zh) * | 2023-12-21 | 2024-03-26 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种水声学和渔获物相结合鱼类资源量分级量化评估方法 |
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