CN112126682B - 基于环境dna的替代生境支流和目标鱼类确定方法 - Google Patents

基于环境dna的替代生境支流和目标鱼类确定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于环境DNA的替代生境支流和目标鱼类确定方法，该方法首先在目标干流和支流中，设置若干采样点，在每个采样点分别采集水体样本以及渔获物捕捞；然后分别采用eDNA技术和形态学方法识别鱼类物种，判断结果是否一致，若一致，则根据eDNA技术得到的数据计算各支流与目标干流的群落组成相似性以及共有鱼类物种比例，选择数值最高的支流作为替代生境支流；选择目标干流中特有珍稀、且最具代表性、对水环境最敏感的鱼类物种作为替代生境支流适宜性研究的目标鱼类。本发明可以更准确的、自动化的确定替代生境支流和目标鱼类。

Description

基于环境DNA的替代生境支流和目标鱼类确定方法
技术领域
本发明涉及水利技术领域，尤其涉及一种基于环境DNA的替代生境支流和目标鱼类确定方法。
背景技术
水库大坝可以在防洪、发电、灌溉以及水资源配置等诸多方面发挥巨大作用，但也在一定程度上改变了水文水环境条件，阻隔了鱼类的洄游通道，造成了鱼类生境的破碎化以及适宜栖息环境被压缩、破坏。为了解决该问题，近年来“干流开发、支流保护”的新思路被提出，即在干流不可避免进行水电开发的同时，选择适宜的支流河段作为干流的替代补偿生境来保护干流中受影响的鱼类，并根据支流的现实条件采取一定的人工措施对支流进行适当的修复和重建，以提高生境的适宜性，从而实现对受干流开发影响的鱼类物种种群、群落的保护。研究支流替代生境适宜性的前提是确定目标物种以及替代生境支流，因此目标鱼类以及替代生境支流的确定对支流替代生境适宜性的研究非常重要。现有的替代生境支流和目标鱼类确定方法都是基于专家经验，没有一种普适性的方法。
环境DNA(environmental DNA，eDNA)指环境中游离的DNA分子，其主要由生物通过脱落的皮肤，粪便，唾液，分泌物等方式向周围环境中释放。eDNA宏条形码技术通过检测样本中的遗传物质信息获得大量的测序序列，已经在不同的水生生物类群中表现出了精确的物种分辨能力，该技术与传统形态学监测以物种个体为监测单位存在较大差异，如何建立二者之间的可靠关系，实现宏条形码结果与实际生物量监测的一致性，使其在生物资源量监测和完整性评价中发挥重要的作用，是eDNA宏条形码研究面临的重要挑战之一。目前eDNA宏条形码在高含沙河流中的运用也鲜有报道，因为泥沙含量高的河流中，极有可能会导致水体中DNA回收率低，导致结果不准确。
发明内容
发明目的：本发明针对现有技术存在的问题，提供一种普适性的基于环境DNA的替代生境支流和目标鱼类确定方法。
技术方案：本发明所述的基于环境DNA的替代生境支流和目标鱼类确定方法包括：
(1)根据目标干流的各支流流量规模，从中筛选出若干支流作为备选支流；
(2)在目标干流和筛选出的每个支流中，设置若干采样点，在每个采样点分别进行多时段的水体样本采集以及渔获物捕捞；
(3)汇总计算捕捞的渔获物，得到每个采样点的鱼类物种及对应的鱼类数量；
(4)对所有水体样本进行DNA片段提取，并通过测序、分析和计算，得到每个采样点的鱼类物种及对应的DNA序列数量；
(5)分别计算步骤(3)和步骤(4)得到的鱼类物种的一致性、鱼类物种检出频率的相关性以及鱼类物种数量的相关性，并判断是否均位于预设条件内，若是，则执行步骤(6)，若否，返回步骤(2)重新采集；
(6)对所有采样点的DNA序列进行无度量多维排序，并经过相似性分析后得到每个支流与目标干流的群落组成相似性；
(7)计算每个支流与目标干流的共有鱼类物种比例；
(8)选择与目标干流的群落组成相似性以及共有鱼类物种比例最高的支流作为替代生境支流；
(9)从替代生境支流与目标干流中的共有鱼类物种中，选择目标干流中特有珍稀、且最具代表性、对水环境最敏感的鱼类物种作为替代生境支流适宜性研究的目标鱼类。
进一步的，步骤(4)具体包括：
(4.1)对每个水体样本依次进行过滤、DNA样品提取和PCR扩增，得到水体样本中含有的DNA片段；
(4.2)对水体样本中含有的DNA片段进行高通量测序，得到DNA序列；
(4.3)对于各采样点，将该采样点中所有DNA序列进行聚类分析，得到若干分类单元；
(4.4)对各分类单元进行序列注释，得到各分类单元的鱼类物种；
(4.5)统计得到各支流的鱼类物种，以及各鱼类物种的DNA序列数量。
进一步的，步骤(5)具体包括：
(5.1)按下式计算步骤(3)和步骤(4)得到的鱼类物种的一致性RA，并判断是否位于预设误差范围内；
式中，N是采样点数，M＝max(mx,me)，mx,me分别是步骤(3)、步骤(4)得到的鱼类物种的种数，aij表示步骤(3)和步骤(4)在采样点i采集到鱼类物种j的一致性指标，若步骤(3)、步骤(4)都在采样点i采集到鱼类物种j或者都没有采集到鱼类物种j，则aij＝1，否则aij＝0；
(5.2)计算步骤(3)得到的每个鱼类物种的检出频率，作为第一组数据，计算步骤(4)得到的每个鱼类物种的检出频率，作为第二组数据，采用线性回归模型对两组数据进行相关性分析，判断两组数据是否呈显著的正相关；
(5.3)计算步骤(3)得到的每个采样点检出的鱼类物种的种数，作为第一组数据，计算步骤(4)得到的每个采样点检出的鱼类物种的种数，作为第二组数据，采用线性回归模型对两组数据进行相关性分析，判断两组数据是否呈显著的正相关；
(5.4)若步骤(5.1)～(5.3)的判断结果均为是，则执行步骤(6)，否则返回步骤(2)重新采集。
进一步的，步骤(6)具体包括：
(6.1)将每个采样点的DNA序列对数转化后，构建以采样点为单位的Bray-Curtis相似性系数矩阵；
(6.2)采用NMDS无度量多维排序与ANOSIM相似性分析方法对Bray-Curtis相似性系数矩阵进行分析，得到各支流与目标干流的R统计值和显著性P值；
(6.3)根据R统计值和显著性P值对每个支流与目标干流的群落组成相似性分级，其中，R统计值和显著性P值越高，群落组成相似性越高。
进一步的，步骤(7)具体包括：
按照下式计算每个支流与目标干流的共有鱼类物种比例：
式中，Qk表示支流k与目标干流的共有鱼类物种比例，mk表示根据步骤(4)的数据统计得到的支流k与目标干流共同都检测出来的鱼类物种的种数，mg表示根据步骤(4)的数据统计得到的目标干流检测出来的鱼类物种的种数。
进一步的，步骤(8)中若与目标干流群落组成相似性最高的支流和共有鱼类物种比例最高的支流不是同一条支流，则选取与目标干流群落组成相似性最高的支流作为替代生境支流。
有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点是：本发明提供了一种基于环境DNA的替代生境支流和目标鱼类确定方法，普适性更强，检测效率高，且自动化程度高。
附图说明
图1是本发明的一个实施例的流程示意图；
图2是金沙江下游“乌东德～白鹤滩”库区段干支流采样点分布；
图3是eDNA宏条形码技术得到的金沙江下游“乌东德～白鹤滩”段干支流鱼类物种组成及其对应的序列数占比；
图4是eDNA宏条形码技术得到的物种在金沙江下游“乌东德～白鹤滩”段干支流检出频率和序列数；
图5是eDNA宏条形码与形态学检出的鱼类物种在金沙江下游流域尺度上的分布比较；
图6是eDNA宏条形码与形态学在物种检出率的对比，图中阴影表示95％的置信区间；
图7是eDNA宏条形码与形态学在每个采集点检出的物种数的对比，图中阴影表示95％的置信区间；
图8是金沙江下游“白鹤滩～乌东德”段干支流鱼类群落结构的无度量多维排序结果；
图9是金沙江下游“乌东德～白鹤滩”段主要支流与干流鱼类组成对比。
具体实施方式
本实施例提供了一种基于环境DNA的替代生境支流和目标鱼类确定方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)根据目标干流的各支流流量规模，从中筛选出若干支流作为备选支流。
本实施例选择金沙江下游“乌东德～白鹤滩”段作为目标干流，金沙江下游是淡水鱼类种质资源最为丰富的地区之一，蕴藏了独特而多样的鱼类物种，同时，金沙江下游也是水电能源开发的热点地区，规划建造包括乌东德、白鹤滩、溪洛渡、向家坝在内的4座大型水电站。金沙江下游梯级电站建成蓄水会使原本的自然流水江段形成河谷型水库，水流显著变缓，水深增加，导致适应于急流生境的土著鱼类丧失重要的栖息地，故而需要选择替代生境支流。“乌东德～白鹤滩”段水系丰富，支流众多，黑水河、小江和普渡河为支流流量规模最大的三条，选择这三条支流作为备选支流。
(2)在目标干流和筛选出的每个支流中，设置若干采样点，在每个采样点分别进行多时段的水体样本采集以及渔获物捕捞。
本实施例在5月～6月对乌东德至白鹤滩156km江段及其一级支流黑水河、普渡河、小江进行了水体eDNA样本采集。在金沙江干流以25km河道长度为基准间隔共设置了6个采样点位；黑水河支流自河口至松新坝上共设置4个采样点位，相邻点位间隔15～20km。在小江与普渡河支流分别设置3处与2处采样点位，各采样点位编号和所处河段如图2所示。其中，eDNA样本采集使用容量为2L的可密封广口瓶于各采样点沿岸采集表层水样(水面以下30cm内)，每个点位平行采集3瓶水样。
(3)汇总计算捕捞的渔获物，得到每个采样点的鱼类物种及对应的鱼类数量。
渔获物捕捞也就是传统形态学监测方法，对捕获到的鱼类样本进行形态学鉴定，测量体长，体重以及发育程度等生物学信息后放归至原水域。最终，在金沙江下游“白鹤滩～乌东德”段干流及主要支流共调查采集到鱼类1381尾，统计渔获物总重18.67kg，隶属于3目10科30属44种。其中，金沙江干流鱼类组成包括3目9科26属39种；黑水河包括3目9科26属39种；黑水河包括3目8科18属23种；小江包括3目6科8属11种；普渡河包括3目7科8属9种。调查到的渔获物以鲤形目为主要优势类群，共采集到36种，占鱼类总种类数的81.82％；鲇形目与鲇形目各4种。鲤形目中鲤科鱼类最多，共24种，占到鲤科类鱼类总数的66.67％。采集到的渔获物样本共包含12种长江上游珍稀特有鱼类，分别是钝吻棒花鱼、短须裂腹鱼、昆明裂腹鱼、齐口裂腹鱼、软刺裸裂尻鱼、四川华吸鳅、西昌华吸鳅、中华金沙鳅、短体副鳅、红尾副鳅、白缘鰑。
(4)对所有水体样本进行DNA片段提取，并通过测序、分析和计算，得到每个采样点的鱼类物种及对应的DNA序列数量。
DNA序列提取也就是eDNA宏条形码技术，该步骤具体包括：
(4.1)对每个水体样本依次进行过滤、DNA样品提取和PCR扩增，得到水体样本中含有的DNA片段。其中，过滤用孔径为0.25μm的纤维素滤膜进行，抽滤过程中每个采样点设置一组阴性对照。过滤后的滤膜浸没于2mL离心管中在-20℃环境中低温保存直至DNA提取。eDNA样品的室内分析工作在南京大学环境学院生态毒理实验室进行。首先，采用QIAampDNA Mint Kit试剂盒提取截留在滤膜中的DNA，具体操作为：首先将保存的滤膜取出干燥后剪碎，放进装有1mL裂解液的离心管内，充分震荡2min后取上清液并加入200μL SolutionDE2溶液，用涡流混合仪混匀之后静置5min；转移上清液并加入650μL Solution DE 3溶液洗脱；然后加入650μL 70％乙醇后过滤冲洗，充分甩干冲洗液并加入100μL Solution EB至滤膜中心位置，离心1min即可得到高质量的水样DNA。每瓶水样的滤膜独立提取DNA信息并保存。PCR扩增利用12S通用引物对DNA样本进行，PCR扩增的总体系包括37.8μL无菌水，5μL10×PCR High Fidelity PCR buffer溶液，2μL50 mM的MgSO4,1μL10 mM dNTP mix,0.2μL的Platinum Taq DNA polymerase(Invitrogen,USA)，2μL的模板DNA和10μM通用引物[142]。PCR反应在SureCycler 8800热循环仪(Agilent Technologies,USA)上进行，将来自同一采样点的3个平行样本分别作为该采样点的扩增DNA模板，每个模板做3次PCR重复。使用琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，琼脂糖凝胶浓度为2％，核酸染料采用GelRed，电泳电压110V，电泳时间30min，使用100bp DNA Ladder对产物DNA链长度大致进行划分，电泳完成后使用ImageLab生成电泳图片。电泳检测完成后用MinElute gel extraction kit纯化试剂盒(Qiagen,CA,USA)进行纯化，纯化后的产物用Qubit dsDNA HS assay kits(Invitrogen,USA)定量。
(4.2)对水体样本中含有的DNA片段进行高通量测序，得到DNA序列。使用NEBNextFast DNA Library Prep Set for Ion Torrent(E6270)试剂盒进行测序文库的构建。测序文库构建主要包含三大步骤，即平末端补齐、接头连接及文库纯化，以去除文库中杂质和短片段。文库构建完成后使用安捷伦2100(Agilent Bioanalyzer 2100)检测合格后方可用于测序。文库质检完成后通过Ion Torrent S5平台对扩增后的PCR产物进行二代测序，芯片选用Chip 530，二代测序技术以每个单链DNA片段经PCR扩增后形成的单克隆基因簇群为测序的目标模板，通过酶延伸反应以及寡核苷酸连接等不同的反应方式实现对目标模板的边合成边测序。测序完成后利用Fastx toolkits将FASTQ格式的文件转化为FASTA和相应的质量控制文件；在综合计算平台QIME(Quantitative Insights into Microbial Ecology)去除低质量和短序列，包括引物错配和长度小于50bp以及大于1500bp的序列。
(4.3)对于各采样点，将该采样点中所有DNA序列进行聚类分析，得到若干分类单元。通过二代高通量测序共获得高质量12S引物序列233,933条，长度集中在230bp附近，原始FASTQ文件100MB，DNA序列质量平均值在20以上。经聚类分析共得到OTU单元1195个。
(4.4)对各分类单元进行序列注释，得到各分类单元的鱼类物种。利用SAP(Statistical Assignment Package)进行OTU序列的注释，合并与同一物种相似性大于97％的OTU为对应物种的丰度，当OUT丰度大于5时认为该物种存在于一个样本中，用于注释序列的数据库为南京大学环境学院建立的“EcoView 2.0”数据库，以上测序数据的处理均在Linux系统中操作完成。最终有778个分类单元能够被“EcoView”数据库注释，被注释的分类单元共包含基因序列18,629条。
(4.5)统计得到各支流的鱼类物种，以及各鱼类物种的DNA序列数量。本实施例中被注释的778个分类单元隶属于3目12科36属，能够鉴定到种的鱼类共有50种，如图3所示，其中，鲤形目为主要的生物类群，共包含3科26属37种，物种数量占到了总种类数的74％，测序丰度占到了总序列数的84％，鲤形目中以鲤科鱼类为优势类群，共21属27种，占到了鲤形目鱼类总数的73％，鳅科类次之，共3属7种，占鲤形目总数的的19％，其余各科的种类数量以及测序丰度都相对较少；鲈形目共包含4科4属7种，其物种数量以及测序丰度分别占到总数的10％和7％，鲈形目中以虾虎鱼科为主要优势类群，其测序丰度占到鲈形目总数的71％；鲇形目共包含5科6属6种，以鮡科纹胸鮡属为主要优势类群，其序列丰度占鲇形目总序列数的36％。各鱼类的检出率和序列数如图4所示。
(5)分别计算步骤(3)和步骤(4)得到的鱼类物种的一致性、鱼类物种检出频率的相关性以及鱼类物种数量的相关性，并判断是否均位于预设条件内，若是，则执行步骤(6)，若否，返回步骤(2)重新采集。
该步骤具体包括：
(5.1)按下式计算步骤(3)和步骤(4)得到的鱼类物种的一致性RA，并判断是否位于预设误差范围内，本实施例误差范围设置为50％-100％；
式中，N是采样点数，M＝max(mx,me)，mx,me分别是步骤(3)、步骤(4)得到的鱼类物种的种数，aij表示步骤(3)和步骤(4)在采样点i采集到鱼类物种j的一致性指标，若步骤(3)、步骤(4)都在采样点i采集到鱼类物种j或者都没有采集到鱼类物种j，则aij＝1，否则aij＝0。
本实施例中基于渔获物调查的形态学检测共发现了44种鱼类，其中有40种能被eDNA宏条形码技术检出，对于两种手段均能检出的物种，在属分类水平上，形态学共检测发现30属，其中有28属能够被宏条形码检出，在科分类水平上，形态学检出的10个科均能被宏条形码检出。而宏条形码无法检出的4种物种为墨头鱼(Garra pingi pingi)、犁头鳅(Lepturichthys fimbriata)、四川华鳊(Sinibrama taeniatus)以及戴氏山鳅(Schisturadabryi)，这四种鱼类均属于金沙江流域的稀有物种，数据库中缺少相应的参考数据可能是导致未被检出的主要原因。比较检出的鱼类物种在金沙江下游流域的分布情况，如图5所示，浅灰代表被eDNA宏条形码检出的物种在流域尺度的分布；中灰代表被形态学检出的物种在流域尺度的分布；黑色代表两种方法检出结果的一致性，即同时被两种方法检测到，或者同时没有被两种方法检测到，统计得到RA，可以发现通过eDNA宏条形码与形态学鉴定得到的鱼类物种具有超过70％的一致性，位于预设范围内。
(5.2)计算步骤(3)得到的每个鱼类物种的检出频率，作为第一组数据，计算步骤(4)得到的每个鱼类物种的检出频率，作为第二组数据，采用线性回归模型对两组数据进行相关性分析，判断两组数据是否呈显著的正相关。
本实施例中，线性回归模型对每个鱼类物种的检出频率在两种方法的分析结果如图6所示，R-Square＝0.2713，P＝0.0001，可知两组数据呈现显著的线性正相关。
(5.3)计算步骤(3)得到的每个采样点检出的鱼类物种的种数，作为第一组数据，计算步骤(4)得到的每个采样点检出的鱼类物种的种数，作为第二组数据，采用线性回归模型对两组数据进行相关性分析，判断两组数据是否呈显著的正相关。
本实施例中，线性回归模型得到的相关性分析结果如图7所示，R-Square＝0.7844，P<0.0001，两种方法在每个点检出的物种数量呈显著的正相关。
(5.4)若步骤(5.1)～(5.3)的判断结果均为是，则执行步骤(6)，否则返回步骤(2)重新采集。
本实施例中，可以得到判断结果均为是，因此，可执行步骤(6)。
(6)对所有采样点的DNA序列进行无度量多维排序，并经过相似性分析后得到每个支流与目标干流的群落组成相似性。
该步骤具体包括：
(6.1)将每个采样点的DNA序列对数转化后，构建以采样点为单位的Bray-Curtis相似性系数矩阵；(6.2)采用无度量多维排序(NMDS，non-metric multidimensionalscaling)与相似性分析(ANOSIM，Analysis of Similarities)方法对Bray-Curtis相似性系数矩阵进行分析，得到各支流与目标干流的R统计值和显著性P值；(6.3)根据R统计值和显著性P值对每个支流与目标干流的群落组成相似性分级，其中，R统计值和显著性P值越高，群落组成相似性越高。
基于eDNA宏条形码的测序结果显示，金沙江干流段共分布有鱼类48种，隶属于3目10科34属，鲤形目为该区的主要类群，共包括3科27属38种；在黑水河共调查到鱼类29种，隶属于3目6科2属，其中鲤科和鳅科鱼类比例最高，共有19属24种，占该地区鱼类总数的82.76％；在小江调查到鱼类13种，隶属于3目6科10属，以鳅科类为优势种；在普渡河共调查到鱼类10种，分类结构较为简单，其中以偏冷水行动鲤科类裂腹鱼亚科以及高原鰍为主。对于干支流鱼类群落结构的无度量多维排序的结果如图8所示，可以看出，位于小江的三处采样点“X01～X03”聚在了排序轴坐标系的右下角；位于普渡河的两处采样点位“P01～P02”以及金沙江干流“J05”采样点位聚坐标系上侧；而金沙江其余采样点位与黑水河采样点位“H01～H04”交织在一起聚在排序轴坐标系的左下角，说明金沙江和黑水河群落组成结构较为相似。同时，相似性分析(ANOSIM)的结果如表1所示，金沙江与黑水河鱼类群落结构不存在显著性的组间差异性(P>0.05)，而与另外两条支流的群落结构存在显著性差异(P<0.05)。
表1金沙江下游“白鹤滩～乌东德”段干支流鱼类群落结构相似性分析
注：表中括号前数字为R统计值，括号中数值为显著性P，P<0.05表示存在显著差异。
(7)计算每个支流与目标干流的共有鱼类物种比例。
具体按照下式计算每个支流与目标干流的共有鱼类物种比例：
式中，Qk表示支流k与目标干流的共有鱼类物种比例，mk表示根据步骤(4)的数据统计得到的支流k与目标干流共同都检测出来的鱼类物种的种数，mg表示根据步骤(4)的数据统计得到的目标干流检测出来的鱼类物种的种数。
本实施例中，与金沙江干流相比，各主要支流无论在全部种类还是特有物种种类组成上均有一定的差异。如图9所示，黑水河与金沙江干流鱼类组成的共有比例最高，两条河流的共有鱼类种类数为，为61.70％，普渡河最低，为20.83％；长江上游特有鱼类的共有性也以黑水河最高，为61.54％，其他两条支流未达到40％，不同群落之间物种组成的差异性可以在一定程度上反映生境的差异性和变化。
(8)选择与目标干流的群落组成相似性以及共有鱼类物种比例最高的支流作为替代生境支流。
本实施例中，黑水河共有鱼类物种比例与群落组成相似性方面与金沙江干流最为相似。且黑水河属于典型的峡谷河流，河道呈“V”字型，曲折蜿蜒，并且常年水量充沛、深潭浅滩错落相间，形成了鱼类生境的多样性，能够为鱼类生存提供了适宜的可选择场所。从鱼类群落结构特征及生境异质性来看，黑水河最适合作为金沙江下游“白鹤滩～乌东德”段的替代生境支流，为面临生境丧失的干流敏感性鱼类提供补偿生境。
(9)从替代生境支流与目标干流中的共有鱼类物种中，选择目标干流中特有珍稀、且最具代表性、对水环境最敏感的鱼类物种作为替代生境支流适宜性研究的目标鱼类。
根据鱼类群落多样性调查分析结果，金沙江干流主要以适应高海拔和适应急流生境的大型裂腹鱼属与个体相对较小的副鳅属、金沙鳅属为主要优势类群。共包含长江上游珍稀特有鱼类12种，分别是钝吻棒花鱼(Abbottina obtusirostris)、昆明裂腹鱼(Schizothorax grahami)、短须裂腹鱼(Schizothorax waltoni)、齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)、软刺裸裂尻鱼(Schizopygopsis younghusbandi)、四川华吸鳅(Sinogastromyzon puliensis)、西昌华吸鳅(Sinogastromyzon sichangensis)、中华金沙鳅(Jinshaia sinensis)、短体副鳅(Paracobitis potanini)、红尾副鳅(Paracobitisvariegatus)、前鳍高原鳅(Triplophysa anterodorsalis)、白缘鰑(Liobagrus kingi)、黄石爬鮡(Euchiloglanis kishinouyei Kimura)。从对渔业资源的贡献和物种本身的生态价值方面考虑，优先选取长江上游特有种作为支流生境替代保护的目标鱼类。本次在黑水河共检测到长江上游特有鱼类9种，其中以短体副鳅(Paracobitis potanini)、红尾副鳅(Paracobitis variegatus)、中华金沙鳅(Jinshaia sinensis)为代表的产漂流性卵鱼类6种。中华金沙鳅是“长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区”的重点保护对象，中华金沙鳅在金沙江干流渔获物中也有一定的产量，是金沙江下游最主要的生物类群之一；除此之外，中华金沙鳅是典型的产漂流性卵鱼类，繁殖量较低，其繁殖过程中对水温变化和水流涨落比较敏感。综上所述，结合黑水河栖息地的实际情况以及鱼类自身的生态类型，选择中华金沙鳅作为黑水河支流生境替代的目标鱼类物种。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (5)

1.一种基于环境DNA的替代生境支流确定方法，其特征在于该方法包括：
(1)根据目标干流的各支流流量规模，从中筛选出若干支流作为备选支流；
(2)在目标干流和筛选出的每个支流中，设置若干采样点，在每个采样点分别进行多时段的水体样本采集以及渔获物捕捞；
(3)汇总计算捕捞的渔获物，得到每个采样点的鱼类物种及对应的鱼类数量；
(4)对所有水体样本进行DNA片段提取，并通过测序、分析和计算，得到每个采样点的鱼类物种及对应的DNA序列数量；
(5)分别计算步骤(3)和步骤(4)得到的鱼类物种的一致性、鱼类物种检出频率的相关性以及鱼类物种数量的相关性，并判断是否均位于预设条件内，若是，则执行步骤(6)，若否，返回步骤(2)重新采集；
(6)对所有采样点的DNA序列进行无度量多维排序，并经过相似性分析后得到每个支流与目标干流的群落组成相似性；
(7)计算每个支流与目标干流的共有鱼类物种比例；
(8)选择与目标干流的群落组成相似性以及共有鱼类物种比例最高的支流作为替代生境支流；
步骤(5)具体包括：
(5.1)按下式计算步骤(3)和步骤(4)得到的鱼类物种的一致性RA，并判断是否位于预设误差范围内；
式中，N是采样点数，M＝max(mx,me)，mx,me分别是步骤(3)、步骤(4)得到的鱼类物种的种数，aij表示步骤(3)和步骤(4)在采样点i采集到鱼类物种j的一致性指标，若步骤(3)、步骤(4)都在采样点i采集到鱼类物种j或者都没有采集到鱼类物种j，则aij＝1，否则aij＝0；
(5.2)计算步骤(3)得到的每个鱼类物种的检出频率，作为第一组数据，计算步骤(4)得到的每个鱼类物种的检出频率，作为第二组数据，采用线性回归模型对两组数据进行相关性分析，判断两组数据是否呈显著的正相关；
(5.3)计算步骤(3)得到的每个采样点检出的鱼类物种的种数，作为第一组数据，计算步骤(4)得到的每个采样点检出的鱼类物种的种数，作为第二组数据，采用线性回归模型对两组数据进行相关性分析，判断两组数据是否呈显著的正相关；
(5.4)若步骤(5.1)～(5.3)的判断结果均为是，则执行步骤(6)，否则返回步骤(2)重新采集。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)具体包括：
(4.1)对每个水体样本依次进行过滤、DNA样品提取和PCR扩增，得到水体样本中含有的DNA片段；
(4.2)对水体样本中含有的DNA片段进行高通量测序，得到DNA序列；
(4.3)对于各采样点，将该采样点中所有DNA序列进行聚类分析，得到若干分类单元；
(4.4)对各分类单元进行序列注释，得到各分类单元的鱼类物种；
(4.5)统计得到各支流的鱼类物种，以及各鱼类物种的DNA序列数量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)具体包括：
(6.1)将每个采样点的DNA序列对数转化后，构建以采样点为单位的Bray-Curtis相似性系数矩阵；
(6.2)采用NMDS无度量多维排序与ANOSIM相似性分析方法对Bray-Curtis相似性系数矩阵进行分析，得到各支流与目标干流的R统计值和显著性P值；
(6.3)根据R统计值和显著性P值对每个支流与目标干流的群落组成相似性分级，其中，R统计值和显著性P值越高，群落组成相似性越高。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(7)具体包括：
按照下式计算每个支流与目标干流的共有鱼类物种比例：
式中，Qk表示支流k与目标干流的共有鱼类物种比例，mk表示根据步骤(4)的数据统计得到的支流k与目标干流共同都检测出来的鱼类物种的种数，mg表示根据步骤(4)的数据统计得到的目标干流检测出来的鱼类物种的种数。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(8)中若与目标干流群落组成相似性最高的支流和共有鱼类物种比例最高的支流不是同一条支流，则选取与目标干流群落组成相似性最高的支流作为替代生境支流。
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