KR20160057536A - 서양종꿀벌 특이적 초위성체 분자 마커 및 이를 이용한 서양종꿀벌 품종 판별 방법 - Google Patents

서양종꿀벌 특이적 초위성체 분자 마커 및 이를 이용한 서양종꿀벌 품종 판별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서양종 꿀벌(Apis mellifera)에 특이적인 초위성체 마커 및 이를 이용한 서양종 꿀벌 품종 간 근연관계 판별 방법에 관한 것으로서, 서양종 꿀벌의 게놈 DNA로부터 NGS(next generation sequencing)를 이용한 유전자형 분석(genotyping)을 통한 품종별 다형성의 차이점을 확인하여 서양종 꿀벌 판별용 초위성체 분자 마커를 발굴함으로써, 이런 초위성체 분자 마커를 통해 보급 품종에 대한 분자수준의 품종 판별을 용이하게 할 수 있다.

Description

서양종꿀벌 특이적 초위성체 분자 마커 및 이를 이용한 서양종꿀벌 품종 판별 방법{APIS MELLIFERA SPECIFIC MICROSATELLITE MOLECULAR MAKERS AND METHOD FOR DETERMINING APIS MELLIFERA SPECIES USING THE SAME}
본 발명은 꿀벌 품종 판별을 위한 초위성체(microsatellite) 분자 마커 개발에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 서양종 꿀벌(Apis mellifera)에 특이적인 초위성체 마커 12개를 발굴하고, 이를 통한 서양종 꿀벌 품종 간 근연관계 판별 방법에 관한 것이다.
육종에 사용되는 기존의 분자마커로는 RFLP(restriction fragment length polymorphism), RAPD(random amplified polymorphic DNA), AFLP(amplified fragment length polymorphism) 등이 있다. 이들 마커들은 대부분 게놈상의 DNA 염기서열 간의 다형성(polymorphism)을 PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 통해 쉽게 확인할 수 있다는 기술적 공통성을 가지고 있으나 계통간 변이가 극이 미미한 꿀벌의 계통간 차이를 구별하기 위한 분자마커로는 부적절하다.
최근, 집단유전학(population genetics) 분야에서는 생물집단의 유전적 구조와 다양성 연구를 위해서 초위성체(microsatellite)를 가장 많이 이용하고 있다. 초위성체는 매우 특이적인 유전자좌 특이성(locus specificity)을 보이며 개체 간 형태적 변이가 다양하고 전체 게놈에 무작위적으로 풍부하게 산재해 있으면서도 유전자좌가 공동우성으로 후세대에 유전된다는 특성을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 차세대 염기서열분석(NGS, next-generation sequencing)을 이용하여 서양종꿀벌(Apis mellifera)의 초위성체 마커를 발굴하고, 품종 판별을 할 수 있는 유전자 특이적 분자 마커를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing, NGS)을 이용하여 서양종 꿀벌(Apis mellifera)의 유전적 다형성을 발굴함으로써 꿀벌 품종의 유전체 수준에서의 특이성을 비교하고 꿀벌 품종을 판별할 수 있는 유전자 특이적 초위성체 분자 마커를 발굴하고, 이런 초위성체 분자 마커를 이용하여 서양종 꿀벌 품종 간 근연관계 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및
서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;를 포함하는 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 품종 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 서양종 꿀벌 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 서양종 꿀벌 품종 판별용 시약을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 서양종 꿀벌의 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 보존 또는 육성중인 꿀벌 품종이 갖는 유전체 수준에서의 특이성을 확인할 수 있는 유전자 특이적 분자 마커를 개발한 것으로서, NGS(next generation sequencing)를 이용한 유전자형 분석(genotyping)을 통한 품종별 다형성의 차이점을 확인하여 서양종 꿀벌 판별용 초위성체 분자 마커를 발굴함으로써, 이런 초위성체 분자 마커를 통해 보급 품종에 대한 분자수준의 품종 판별을 용이하게 할 수 있다.
도 1은 Genomic DNA shotgun library 생성 및 Illumina MiSeq Sequencing의 개요도이다.
도 2는 Msatcommander 분석을 통한 서양종 꿀벌의 SSR(di ,tri, tetra, octa and hexa) 성분을 보여주는 그림이다.
도 3은 서양종 꿀벌 6계통에 대한 UPGMA 계통도를 보여주는 그림이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서양종 꿀벌 유래 게놈 DNA로부터 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing, NGS)을 통해 SSR(di, tri, tetra, octa and hexa) 반복서열을 포함하는 꿀벌 DNA 염기서열 발굴하고, DNA 염기서열 데이터베이스로부터 SSR 반복서열을 증폭할 수 있는 PCR 프라이머(primer)를 제작함으로써, 제작된 프라이머를 바탕으로 서양종 꿀벌 유전자를 주형으로 한 유전자 증폭을 통해 재현 가능성이 높은 마커를 선별함으로써, 선별된 마커를 통해 보존 또는 육성중인 서양종 꿀벌 품종에 대한 근연관계 판별이 가능한 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및
서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;를 포함하는 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 품종 판별용 키트, 마이크로어레이, 또는 시약 등의 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 i) 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 6계통 각각의 게놈 DNA를 분리하는 단계; ii) 상기 단계 i)의 각각의 게놈 DNA에 대해 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing, NGS)을 이용하여 유전적 다형성을 분석하는 단계; iii) 상기 단계 ii)의 유전적 다형성을 통해 계통에 대한 유전자 특이적 초위성체(microsatellite) 마커를 선별하는 단계; 및, iv) 상기 단계 iii)의 초위성체 마커를 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트를 제작하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 키트는 DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 더 포함할 수 있다.
상기 키트는 각각의 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 비교 분석에 의해 서양종 꿀벌 6계통의 품종 간을 판별할 수 있다.
또한, 본 발명은
i) 서양종 꿀벌(Apis mellifera)의 게놈 DNA를 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 게놈 DNA를 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭하는 단계,
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및
서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
iii) 상기 단계 ii)의 PCR 증폭 산물로부터 상기 서양종 꿀벌의 품종을 판별하는 단계를 포함하는, 서양종 꿀벌의 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 3)에서 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 수행될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 3)에서 증폭 산물로부터 서양종 꿀벌의 품종을 판별하는 단계는 상기 서양종 꿀벌 품종 식별용 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 비교 분석에 의해 품종을 판별할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 방법은 서양종 꿀벌 6계통의 품종 간을 판별할 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 꿀벌 시료의 준비 및 게놈( genomic ) DNA 분리
꿀벌 시료는 농촌진흥청과 예천 곤충연구소에서 공동으로 선발 육성 중인 6계통의 서양종 꿀벌(Apis mellifera) A, C, D, E, F, G 이며, 이들 계통 간의 구분을 위한 분자마커 개발을 위해 먼저 A 계통에 대한 NGS(next generation sequencing) 분석을 실시하였다. NGS 분석을 위해 DNeasy Blood and Tissue kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 방법을 통해 게놈(Genomic) DNA를 분리하여 -20℃에 보관하였다. 게놈 DNA의 품질(quality)은 1% 아가로즈 젤(agarose gels)과 분광광도계(spectrophotometer)(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 통해 확인하였다.
< 실시예 2> 차세대 염기서열분석( Next Generation Sequencing , NGS )
페어드 엔드 숏건 라이브러리(paired-end shotgun library)를 생성하기에 앞서 200 ng의 정제된 게놈 DNA를 Covaris S220(Covaris, Woburn, MA)를 이용해 약 550 bp의 길이로 절단하였다(DNA shearing). 절단된 게놈 DNA는 TruSeq nano DNA Library Kit(Illumina, San Diego, CA)를 이용해 페어드 엔드 라이브러리(paired-end library)를 제작하였으며 Agilent 2100 Bioanalyzer system(Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 및 quantitative PCR-based KAPA library quantification kit(KAPA Biosystems, Wilmington, MA)을 통해 제작된 라이브러리의 사이즈 및 농도를 확인하였다. 제작된 라이브러리는 Miseq(Illumina)를 통해 양 말단을(paired-end) 250 bp씩 시퀀싱(sequencing)하였다
그 결과, 총 45,476개 Contig(205,009,405 bp)가 생성되었으며, GC 함량은 32.37% 이며, SSR(di ,tri, tetra, octa and hexa)은 20,580개로 확인되었다(표 1 및 도 2).
꿀벌 6계통에 대한 NGS(next generation sequencing) 결과
콘틱 수(Number of Contigs)(>1000bp) 45,476
총 염기(Total base) 205,009,405
최대 길이(Maximum Length) 232,034
N50 길이(Length) 7,355
평균 콘틱 길이(Average Contig Length) 4,508
GC 함량(contents) 32.37%
Gap N의 갯수(Number of N) 0
리매핑 비율(Remapping Rate) 92.15%
디-뉴클레오티드(Di-nucleotide) 12,340
트리-뉴클레오티드(Tri-nucleotide) 6,203
테트라-뉴클레오티드(Tetra-nucleotide) 1,533
옥타-뉴클레오티드(Octa-nucleotide) 400
헥사-뉴클레오티드(Hexa-nucleotide) 104
< 실시예 3> 초위성체 ( Microsatellite ) 마커의 선별
염기서열 분석 결과는 Bruijn 그래프 알고리즘인 CLC Genomics Workbench software ver. 7 (CLC Bio, Aarhus, Denmark)을 통해 어셈블리(assembly)하였다. assembly mapping Illumina adapters 및 CLC trimmer function(default limit = 0.05)을 통해 낮은 quality sequences을 제거한 후 수행하였다. 어셈블리 과정은 CLC Genomics Workbench software를 이용하여 Length Fraction(LF) 0.50, Sequence Similarity (SIM) 0.80, 최소 콘틱 길이(contig length)는 70 bp이 되도록 설정하였다. 초위성체(Microsatellite)는 Msatcommander program(Faircloth, 2008)을 통해 분석하였으며 각각의 콘틱(contig)은 Pimer 3 program (Rozen S and Skaletsky H, 2000)을 이용해 최적의 프라이머(primer)를 제작하였다(Primer length: 20-24 mer, Primer TM: 48-52℃, Product size 150-300 bp). 서열을 포함한 초위성체(microsatellite)는 GeneBank accession numbers M103702 - KM103697를 부여받았다.
그 결과, 서양종 꿀벌 6계통의 계통판별을 위한 총 12개의 초위성체 마커를 선별하였다(표 2 및 표 3).
NGS에 의해 개발된 서양종 꿀벌 6계통의 계통판별을 위한 초위성체 마커
마커 반복 모티프
(Repeat motifs)a 		프라이머 서열 (5'-3')b 온도
(℃)		 크기
(bp)		 GenBank No.
2716 (AC)23 F CGATTATTGCTTTGATTAGG (서열번호: 1) 50 154 M103702
R TTTAATCTCTTCATGATGCA (서열번호: 2)
4461 (AAT)4 F TTTTTGGCTTGAGTTTTTAT (서열번호: 3) 48 196 M103716
R TGTATAACTTCATCCACAAA (서열번호: 4)
4953 (ATT)6 F TTAATTAATTTCGAGGCTGA (서열번호: 5) 48 187 M103720
R ACTGTTGAAAGTTTTGTTTT (서열번호: 6)
21438 (AT)15 F AAGTATGAGTGCATAAGTTT (서열번호: 7) 49 171 KM103695
R AAGAGTTTATGCCTTAATGT (서열번호: 8)
24351 (AT)6 F ATATCATTTTAATTGCGTGC (서열번호: 9) 49 225 KM103697
R AAGTATTAACATTCGTACGT (서열번호: 10)
17588 (CT)37 F ATACATAGTATACACATGCGTG (서열번호: 11) 52 219 KM278234
R ATTTACTGGTTCAATAGGTCTAA (서열번호: 12)
127 (AAG)24 F ATATTGTTACTTACGAGGTGTAG (서열번호: 13) 54 212 KM278235
R AATCTTACAAATGCAACATCCTC (서열번호: 14)
1525 (AAT)27 F CTGTATTTATGAATGACGGATAAA (서열번호: 15) 52 248 KM278231
R TCGTAAAATCAAATAAATGCTTCAT (서열번호: 16)
167 (GT)40 F TAATCTGCAATTTCCTACAAAATT (서열번호: 17) 52 253 KM278232
R ATCGAAACACCAATAAAATGACAT (서열번호: 18)
17394 (CT)38 F TGTATCCAACATCAAGAATTTATT (서열번호: 19) 52 243 KM278233
R CGCTTTACATTACATACATGATC (서열번호: 20)
5 (AT)43 F AATATTGCATAACTGGTACATATA (서열번호: 21) 52 244 KM278230
R GATGTCAACATATAAAGCACGAT (서열번호: 22)
6 (AAT)22 F TCTCTTTCTTCATTGTTCATTTG (서열번호: 23) 52 274 KM278237
R AAAAGAACAGGAGGTAAAATAAA (서열번호: 24)
12개의 초위성체 마커 통계정보
마커 Allele.
Frquency		 Genotype
No		 Size No. of obs. Allele No. Availability Gene Diversity PIC
2716 0.2698 7.0000 63.0000 63.0000 7.0000 1.0000 0.8284 0.8065
4461 0.6190 6.0000 63.0000 53.0000 3.0000 0.8413 0.3916 0.3472
4953 0.8095 3.0000 63.0000 63.0000 3.0000 1.0000 0.3265 0.3026
21438 0.4444 5.0000 63.0000 62.0000 4.0000 0.9841 0.6327 0.5619
24351 0.5079 3.0000 63.0000 35.0000 2.0000 0.5556 0.1567 0.1445
17588 0.2381 12.0000 63.0000 63.0000 12.0000 1.0000 0.8677 0.8548
127 0.4355 5.0000 63.0000 62.0000 5.0000 0.9841 0.6935 0.6446
1525 0.4000 6.0000 63.0000 50.0000 6.0000 0.7937 0.7440 0.7071
167 0.2222 10.0000 63.0000 63.0000 10.0000 1.0000 0.8536 0.8367
17394 0.1905 10.0000 63.0000 63.0000 10.0000 1.0000 0.8647 0.8500
5 0.2833 9.0000 63.0000 60.0000 9.0000 0.9524 0.8356 0.8165
6 0.4098 5.0000 63.0000 61.0000 5.0000 0.9683 0.7186 0.6743
Mean 0.4483 6.333 63.0000 58.1667 6.333 0.9233 0.6595 0.6289
< 실시예 4> PCR 증폭( Amplification ) 및 유전형질 분석( Genotyping )
각각의 프라이머(primer)쌍은 (Bionics, Korea) 6 FAM fluorescent dyes(Yue et al., 2000)를 통해 라벨링(labeling)하였다. PCR 증폭반응은 ABI 2720 Thermo cycler(Applied Biosystems, USA)을 사용하였으며, 전변성(Pre-denaturation) 95℃ 3분, 94℃ 30초 50℃ 30초 72℃ 1분으로 30 사이클(cycle)을 반복하고 72℃에서 5분간 최종 연장(final extension)을 수행하였다. 각각의 반응량은 다음과 같다. 30 ng의 DNA, 1 × PCR 완충용액(buffer) [50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 8.8), 150 nM KCl, 1.5 mM MgCl2], 2.5 mM dNTPs, 200 nM 프라이머(primer), 1U Pure Speed PFU DNA 중합효소(polymerase)(Smarteome, KOREA). PCR 반응을 수행한 후, PCR 산물(product) 0.2 ㎕와 9.8 ㎕ Hi-Di 포름아미드(Formamide)(Applied Biosystems, USA), 0.2 ㎕ Liz-500 표준체(standard size)(Applied Biosystems, USA)을 준비하였다. 각 샘플은 95℃에서 5분간 변성(denature)시킨 후 얼음(ice) 상에 정치시켜두었으며, sequencer ABI 3730xl(Applied Biosystems, USA)를 통해 분석하였으며, GeneMapper® Software v4.1(Applied Biosystems, USA)을 통해 유전형질 분석(genotyping)을 수행하였다.
초위성체 유전자좌(locus)에 대한 꿀벌 유전자형 분석
Strain No. Microsatellite locus (bp)
2716 4461 4953 21438 24351 17588 127 1525 167 17394 5 6
A-01 158/158 - 199/199 156/156 - 191/191 207/207 246/246 267/267 250/250 197/197 264/264
A-02 158/158 192/192 187/187 156/156 - 191/191 207/207 249/249 269/269 250/250 207/207 270/270
A-03 158/158 192/192 187/187 156/156 - 191/191 207/207 246/246 269/269 248/248 197/197 264/264
A-04 158/158 192/192 199/199 156/156 - 191/191 207/207 - 269/269 250/250 - 270/270
A-05 158/158 195/195 187/187 152/152 - 211/211 207/207 - 269/269 250/250 - 270/270
A-06 158/158 195/195 187/187 156/156 - 211/211 207/207 249/249 269/269 248/248 207/207 264/264
A-07 158/158 195/195 187/187 156/156 - 191/191 207/207 246/246 269/269 248/248 197/197 264/264
C-01 148/148 195/195 187/187 152/152 - 251/251 210/210 240/240 257/257 256/256 189/189 270/270
C-02 150/150 - 187/187 158/158 224/224 219/219 210/210 249/249 257/257 256/256 189/189 270/270
C-03 148/148 195/195 187/187 152/152 - 251/251 210/210 240/240 257/257 256/256 189/189 270/270
C-04 150/150 - 187/187 152/152 224/224 251/251 210/210 240/240 257/257 256/256 175/175 270/270
C-05 150/150 195/195 187/187 152/152 - 219/219 210/210 240/240 259/259 256/256 189/189 270/270
C-06 148/148 195/195 187/187 152/152 - 251/251 210/210 240/240 259/259 256/256 189/189 270/270
C-07 150/150 - 187/187 160/160 - 251/251 210/210 240/240 257/257 254/254 175/175 270/270
C-08 150/150 195/195 187/187 152/152 - 219/219 210/210 249/249 259/259 256/256 175/175 270/270
C-09 150/150 195/195 187/187 152/152 - 251/251 210/210 240/240 259/259 256/256 189/189 270/270
D-01 158/158 195/195 187/187 158/158 - 229/229 210/210 252/252 317/317 264/264 193/193 267/267
D-02 148/148 - 187/187 158/158 - 229/229 210/210 252/252 317/317 236/236 193/193 273/273
D-03 158/158 - 187/187 - - 229/229 210/210 252/252 317/317 236/236 193/193 273/273
D-04 158/158 195/195 187/187 158/158 - 229/229 210/210 258/258 333/333 264/264 193/193 273/273
D-05 158/158 195/195 187/187 152/152 - 229/229 210/210 258/258 333/333 264/264 193/193 273/273
D-06 158/158 195/195 187/187 158/158 - 229/229 210/210 258/258 333/333 236/236 193/193 267/267
D-07 148/148 195/195 187/187 158/158 - 201/201 210/210 258/258 309/309 210/210 175/175 273/273
D-08 158/158 195/195 187/187 158/158 - 229/229 210/210 252/252 317/317 236/236 193/193 267/267
D-09 158/158 195/195 187/187 158/158 - 229/229 210/210 252/252 317/317 236/236 193/193 273/273
D-10 148/148 195/195 187/187 158/158 - 229/229 - 258/258 317/317 236/236 193/193 267/267
D-11 148/148 195/195 187/187 158/158 - 229/229 210/210 - 317/317 264/264 193/193 267/267
D-12 158/158 195/195 187/187 152/152 - 229/229 207/207 - 309/309 236/236 193/193 270/270
D-13 148/148 195/195 187/187 158/158 - 229/229 210/210 - 317/317 236/236 193/193 267/267
D-14 158/158 195/195 187/187 158/158 - 229/229 210/210 252/252 333/333 236/236 195/195 273/273
D-15 158/158 195/195 187/187 152/152 224/224 229/229 207/207 - 313/313 236/236 193/193 270/270
D-16 148/148 195/195 187/187 158/158 284/284 229/229 210/210 - 317/317 236/236 193/193 273/273
E-01 150/150 195/195 187/187 160/160 284/284 183/183 207/207 - 265/265 228/228 187/187 270/270
E-02 154/154 195/195 187/187 158/158 284/284 183/183 207/207 - 265/265 242/242 193/193 273/273
E-03 150/150 195/195 187/187 158/158 284/284 183/183 207/207 - 265/265 228/228 187/187 273/273
E-04 154/154 195/195 187/187 152/152 284/284 183/183 207/207 - 265/265 228/228 193/193 270/270
E-05 154/154 - 187/187 152/152 284/284 183/183 207/207 237/237 265/265 228/228 187/187 273/273
E-06 150/150 195/195 187/187 152/152 284/284 205/205 207/207 240/240 265/265 242/242 191/191 273/273
E-07 154/154 195/195 187/187 152/152 284/284 183/183 207/207 240/240 265/265 242/242 191/191 273/273
E-08 150/150 195/195 187/187 152/152 284/284 205/205 207/207 252/252 265/265 242/242 187/187 273/273
E-09 150/150 195/195 187/187 152/152 284/284 183/183 207/207 252/252 265/265 242/242 193/193 273/273
E-10 154/154 - 187/187 152/152 284/284 183/183 207/207 240/240 265/265 242/242 187/187 270/270
F-01 168/168 198/198 151/151 152/152 284/284 197/197 213/213 258/258 333/333 250/250 179/179 270/270
F-02 168/168 198/198 199/199 152/152 284/284 197/197 204/204 - 333/333 250/250 179/179 270/270
F-03 168/168 198/198 151/151 152/152 284/284 191/191 204/204 249/249 333/333 250/250 179/179 270/270
F-04 168/168 198/198 199/199 158/158 284/284 191/191 213/213 249/249 333/333 250/250 179/179 270/270
F-05 168/168 198/198 151/151 158/158 284/284 191/191 213/213 249/249 333/333 250/250 179/179 270/270
F-06 168/168 198/198 199/199 152/152 284/284 191/191 204/204 252/252 333/333 250/250 179/179 270/270
F-07 168/168 198/198 151/151 152/152 284/284 197/197 204/204 249/249 333/333 250/250 179/179 270/270
F-08 168/168 198/198 151/151 158/158 284/284 197/197 204/204 240/240 333/333 254/254 179/179 -
F-09 168/168 198/198 151/151 158/158 284/284 191/191 204/204 - 333/333 254/254 179/179 270/270
F-10 168/168 198/198 199/199 152/152 284/284 191/191 213/213 252/252 333/333 250/250 179/179 -
G-01 170/170 195/195 187/187 158/158 284/284 203/203 198/198 240/240 279/279 200/200 175/175 258/258
G-02 170/170 195/195 187/187 158/158 284/284 245/245 210/210 240/240 279/279 200/200 191/191 258/258
G-03 170/170 - 187/187 158/158 284/284 203/203 210/210 249/249 279/279 200/200 191/191 258/258
G-04 170/170 195/195 187/187 160/160 284/284 243/243 198/198 240/240 279/279 200/200 175/175 258/258
G-05 156/156 195/195 187/187 160/160 284/284 203/203 198/198 240/240 279/279 200/200 191/191 258/258
G-06 156/156 195/195 187/187 158/158 284/284 245/245 198/198 258/258 279/279 200/200 191/191 258/258
G-07 156/156 195/195 187/187 158/158 284/284 245/245 210/210 240/240 279/279 200/200 191/191 258/258
G-08 170/170 195/195 187/187 158/158 284/284 203/203 198/198 240/240 279/279 200/200 175/175 258/258
G-09 170/170 195/195 187/187 158/158 284/284 243/243 198/198 240/240 279/279 200/200 191/191 258/258
G-10 170/170 195/195 187/187 158/158 284/284 245/245 210/210 240/240 279/279 200/200 - 273/273
G-11 156/156 - 187/187 158/158 284/284 245/245 210/210 240/240 279/279 200/200 175/175 273/273
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> APIS MELLIFERA SPECIFIC MICROSATELLITE MOLECULAR MAKERS AND METHOD FOR DETERMINING APIS MELLIFERA SPECIES USING THE SAME <130> P2014-0123 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 2716 <400> 1 cgattattgc tttgattagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 2716 <400> 2 tttaatctct tcatgatgca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 4461 <400> 3 tttttggctt gagtttttat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 4461 <400> 4 tgtataactt catccacaaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 4953 <400> 5 ttaattaatt tcgaggctga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 4953 <400> 6 actgttgaaa gttttgtttt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 21438 <400> 7 aagtatgagt gcataagttt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 21438 <400> 8 aagagtttat gccttaatgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 24351 <400> 9 atatcatttt aattgcgtgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 24351 <400> 10 aagtattaac attcgtacgt 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 17588 <400> 11 atacatagta tacacatgcg tg 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 17588 <400> 12 atttactggt tcaataggtc taa 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 127 <400> 13 atattgttac ttacgaggtg tag 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 127 <400> 14 aatcttacaa atgcaacatc ctc 23 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 1525 <400> 15 ctgtatttat gaatgacgga taaa 24 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 1525 <400> 16 tcgtaaaatc aaataaatgc ttcat 25 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 167 <400> 17 taatctgcaa tttcctacaa aatt 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 167 <400> 18 atcgaaacac caataaaatg acat 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 17394 <400> 19 tgtatccaac atcaagaatt tatt 24 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 17394 <400> 20 cgctttacat tacatacatg atc 23 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 5 <400> 21 aatattgcat aactggtaca tata 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 5 <400> 22 gatgtcaaca tataaagcac gat 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for marker 6 <400> 23 tctctttctt cattgttcat ttg 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for marker 6 <400> 24 aaaagaacag gaggtaaaat aaa 23

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및
    서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    를 포함하는 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 품종 판별용 키트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는
    1) 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 6계통 각각의 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 각각의 게놈 DNA에 대해 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing, NGS)을 이용하여 유전적 다형성을 분석하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 유전적 다형성을 통해 계통에 대한 유전자 특이적 초위성체(microsatellite) 마커를 선별하는 단계; 및
    4) 상기 단계 3)의 초위성체 마커를 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트를 제작하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 품종 판별용 키트.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 키트는 DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 품종 판별용 키트.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 키트는 서양종 꿀벌 6계통의 품종 간을 판별하는 것을 특징으로 하는 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 품종 판별용 키트.
  5. 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및
    서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    를 포함하는 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 품종 판별용 마이크로어레이.
  6. 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및
    서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    를 포함하는 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 품종 판별용 시약.
  7. 1) 서양종 꿀벌(Apis mellifera)의 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 게놈 DNA를 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭하는 단계,
    서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및
    서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트;
    3) 상기 단계 2)의 PCR 증폭 산물로부터 상기 서양종 꿀벌의 품종을 판별하는 단계를 포함하는,
    서양종 꿀벌(Apis mellifera)의 품종 판별 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 단계 3)에서 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 수행되는 것을 특징으로 하는 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 품종 판별 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 단계 3)에서 증폭 산물로부터 서양종 꿀벌의 품종을 판별하는 단계는 상기 서양종 꿀벌 품종 식별용 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 비교 분석에 의해 품종을 식별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 품종 판별 방법.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 방법은 서양종 꿀벌 6계통의 품종 간을 판별하는 것을 특징으로 하는 서양종 꿀벌(Apis mellifera) 품종 판별 방법.
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