CN102041313B

CN102041313B - 一种K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测方法及应用

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Publication number: CN102041313B
Application number: CN 201010512125
Authority: CN
Inventors: 李兆申; 顾俊骏; 高军; 黄浩杰; 王小玮; 任艳
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2010-10-19
Filing date: 2010-10-19
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2030-10-19
Also published as: CN102041313A

Abstract

本发明属于生物技术领域。K-ras基因突变在胰腺癌的发生发展中起重要作用，但目前普遍应用的K-ras基因突变检测方法为限制性片断长度多态性分析法和扩增受阻突变体系法，但两方法特异性不高，且不能同时定性和定量检测K-ras基因的突变。本发明的目的是提供一种操作简便、敏感性高、特异性高的K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测方法，该方法设计针对野生型K-ras基因12密码子的PNA及相应的突变检测探针K-ras-FAMTagman MGB探针和K-ras-VIC Tagman MGB探针；利用PNA及探针，对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测，得出标准曲线和荧光类型；提取、纯化样品DNA，测定浓度，进行实时定量PCR检测，根据标准曲线和荧光类型，借以判别K-ras基因突变量和突变类型。

Description

一种K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地讲，涉及一种K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测方法，及其应用。

背景技术

K-ras基因(GenBank:NC_000012)突变在胰腺癌的发生发展中起重要作用。已报道，在胰腺癌组织、胰液或粪便、血液中可检测出K-ras基因第12、13或61密码子点突变(参见文献Takahashi，et al.Spontaneous rupture of a biliarydiverticulum in the distal common bile duct，with formation of a retroperitonealbiloma，Gastrointestinal Endo 2005；61：76-9；Laghi L，et al.Common occurrenceof multiple K-RAS mutations in pancreatic cancers with associated precursorlesions and in biliary cancers，Oncogene 2002；21：4301-6；Tada M，et al.Detectionof ras gene mutations in pancreatic juice and peripheral blood of patients withpancreatic adenocarcinoma，Cancer Res 1993；53：2472-4；Lu XH，et al.Anapplication value of detecting K-ras and p53 gene mutation in the stool and purepancreatic juice for diagnosis of early pancreatic cancer，Natl Med J China 2001；81：1050-3；N van Heek，et al.Comparison of the novel quantitative ARMS assay andan enriched PCR-ASO assay for K-ras mutations with conventional cytology onendobiliary brush cytology from 312 consecutive extrahepatic biliary stenoses，J.Clin.Pathol.2005；58；1315-1320)。

研究表明，检测体细胞DNA中K-ras基因突变与否可作为胰腺癌早期诊断的一种方法。但在一些实验中发现慢性胰腺炎及胆道结石等良性疾病中也存在K-ras基因突变，单纯定性分析，特异性较差，定量分析能更好反映突变程度，以便于良恶性鉴别。目前普遍应用的K-ras基因突变检测方法为限制性片断长度多态性分析法(RFLP法)和扩增受阻突变体系法(ARMS法)。

RFLP法：原理是将PCR与限制性酶切相结合的方法。第一步PCR引物(K₁-上游：5′-CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT-3′与

K₂-下游：5′-TCAAAGAATGGTCCTGGACC-3′)通过单一碱基错配，在K-ras基因第12密码子上游引入BstNI酶切位点，第一步PCR反应中野生型与突变型基因同比扩增，之后内切酶BstNI破坏了野生型片断，在第二步PCR时主要就只能扩增突变型基因片断，使突变型基因片断“信号放大”，从而提高了检测基因突变的敏感性。该方法的缺点是：1.步骤烦琐，需要2天时间才能完成鉴定；2.这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在K-ras基因突变，若要求定量，则需用其他的方法进行进一步检测；3.存在第一轮酶切不完全导致的假阳性(参见文献Watanabe H，et al.Detection of K-ras point mutations atcodon 12 in pure pancreatic juice for the diagnosis of pancreatic cancer byPCR-RFLP analysis，Pancreas 1996；12：18-24)。

ARMS法：原理是根据3′端错配原则，在进行扩增反应时，若3′端碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′，5′二磷酸二酯键形成的障碍而受阻，因此，只有模板链是特定的等位基因时，才会检测出特异的扩增产物。在ARMS的反应体系中，引物上标记2个不同荧光素，或加入荧光探针等方法都是以实时荧光PCR为基础的基因分型方法。该方法的缺点是：1.每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定，而K-ras基因在第12、13密码子的突变类型可有十余种，需要逐一检测；2.可能出现由于单一碱基错配造成的假阳性(参见文献Fox JC，et al.The detection of K-ras mutations in colorectal cancerusing the amplification-refractory mutation system，Br J Cancer 1998；77：1267-74)。

肽核酸是一种DNA类似物，其骨架由2-氨乙基甘氨酸取代了DNA的磷酸二酯糖，其较之传统DNA探针具有不少优点：1.PNA十分稳定，正确配对的DNA/PNA的稳定性远远高于相应的DNA/DNA，同时在PCR反应过程中PNA不可作为Taq酶的底物，亦不会被其他酶所降解。2.对于错配的PNA/DNA，哪怕只有一个碱基的错配，也会造成其融解温度下降9-10℃左右。目前，肽核酸作为一种非常有用分子生物学工具已在疾病的诊断、治疗等领域得到应用(参见文献：张兵波等，PNA探针与DNA探针的系统比较A SystemicComparison between PNA Probe and DNA Probe，《高分子通报》2006；9：62-68；Egholm M，et al.PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying theWatson-Crick hydrogen-bonding rules，Nature，1993，365：566～568.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种既能定性并定量检测K-ras基因12密码子突变，又能分辨K-ras基因12密码子突变不同类型的双荧光标记探针实时定量检测方法，及其应用。

基于背景技术中肽核酸作为DNA探针的优点，本发明将其与实时定量PCR检测结合，针对于不同性质的K-ras基因12密码子突变分别设计由FAM和VIC两种荧光标记的Taqman MGB探针，应用于K-ras基因检测，并且可分辨K-ras基因12密码子突变的不同类型。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测方法，包括如下步骤：设计针对野生型K-ras基因特定密码子的PNA，设计针对于不同性质的K-ras基因突变分别设计FAM和VIC荧光标记的Taqman MGB探针；利用PNA及探针，对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测，得出标准曲线；提取、纯化样品DNA，测定浓度，进行实时定量PCR检测，根据标准曲线，以及FAM和VIC荧光的类别，借以判别K-ras基因突变量和突变类型。

其中所述PNA为NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-COOH(SEQ ID NO：1)；

其中所述的K-ras-FAM Tagman MGB探针和K-ras-VIC Tagman MGB探针为：FAM-CTACGCCADCAGCTCCAACT-MGB(FAM-SEQ ID NO：2-MGB)和VIC-CTACGCCACDAGCTCCAACT-MGB(VIC-SEQ ID NO：3-MGB)；

其中所述的PCR引物为

上游引物F：5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3′(SEQ ID NO：4)；

下游引物R：5′-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3′(SEQ ID NO：5)。

其中所述的样品DNA取自粪便、血液、组织液、细胞株或组织。

本发明还提供了上述K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测方法在制备胰腺癌诊断试剂盒中的应用。

该试剂盒包括：分别装有核酸扩增体系反应液、荧光监测体系反应液、阳性标准品等，并加盖密封的试剂管/瓶；其中核酸扩增体系反应液中的PNA为NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-COOH；PCR上游引物为5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3′；PCR下游引物为5′-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3′；荧光监测体系反应液中的K-ras-FAMTagman MGB探针和K-ras-VIC Tagman MGB探针分别为：FAM-CTACGCCADCAGCTCCAACT-MGB和VIC-CTACGCCACDAGCTCCAACT-MGB。

本发明采用联合肽核酸(PNA)的实时定量PCR法检测K-ras基因12密码子点突变量和突变类型。所述K-ras基因可以是从粪便、组织、组织液、细胞珠及血液中提取的DNA中的基因。因为PNA同时覆盖了K-ras基因第一外显子中第12、13密码子的6个碱基，任一突变均可导致PNA/DNA的错配，使得融解温度发生明显改变，故只需设计一种针对野生型的PNA，进行一次PCR反应，即可区分野生型与突变型。因此本发明是一种操作简便、敏感性高、特异性高的K-ras基因实时定量检测方法，可实时定量检测K-ras基因12密码子突变量和突变类型，并可用于胰腺癌等疾病的诊断。

附图说明

图1是K-ras-FAM Tagman MGB探针敏感性和特异性的结果。

图2是K-ras-VIC Tagman MGB探针敏感性和特异性的结果。

图3是K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量PCR检测的标准曲线，其中：横坐标为：拷贝数的对数值；纵坐标为：Ct值；Slope：-4.2；Intercept：54.00；R2：0.999。

图4是胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群K-ras基因突变率的比较。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述。以下实施例以在胰腺癌患者K-ras基因的实时定量检测为例，对本发明作详细描述。应理解，该实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

1.主要试剂来源：

1.1设计PNA

PNA是针对野生型K-ras基因第12、13密码子设计的PNA，由韩国panagene公司合成，其组成为：NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-COOH。

1.2设计Tagman MGB探针

K-ras-FAM Tagman MGB探针和K-ras-VIC Tagman MGB探针由美国AppliedBiosystems公司合成，其组成分别为：

K-ras-FAM Tagman MGB探针：

FAM-CTACGCCADCAGCTCCAACT-MGB；

K-ras-VIC Tagman MGB探针：

VIC-CTACGCCACDAGCTCCAACT-MGB。

1.3PCR引物

PCR引物由美国AppliedBiosystems公司合成。

上游引物F：5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3′；

下游引物R：5′-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3′。

1.4 TaqMan Gene Expression Master Mix

购买于美国AppliedBiosystems公司。

1.5 K-ras基因野生型和突变型标准品

K-ras基因野生型标准品GGT和K-ras基因突变型标准品GAT、GCT、GTT、AGT、CGT、TGT由上海Invitrogen公司合成，其基因序列组成分别为：

1.5.1GGT野生型：

ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATT

ATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT

TGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO：6)；

1.5.2GAT突变型：

ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATT

ATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT

TGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ IDNO：7)；

1.5.3GCT突变型：

ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATT

ATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT

TGGAGCTGCTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO：8)；

1.5.4GTT突变型：

ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATT

ATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT

TGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ IDNO：9)；

1.5.5AGT型突变：

ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATT

ATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT

TGGAGCTAGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO：10)；

1.5.6CGT型突变：

ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATT

ATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT

TGGAGCTCGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO：11)；

1.5.7TGT型突变：

ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATT

ATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT

TGGAGCTTGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ IDNO：12)。

将模板倍比稀释为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、0拷贝，作为标准品模板。

2.1TaqMan MGB探针实时定量实验

该方法选用针对K-ras基因靶序列的特异性Taqman MGB探针。K-ras-FAM Tagman MGB探针两端分别以报告基团FAM及淬灭基团MGB标记，其特异性和K-ras基因12密码子GAT、GCT、GTT等三种突变类型相结合；K-ras-VIC Tagman MGB探针两端分别以报告基团VIC及淬灭基团MGB标记，其特性性和K-ras基因12密码子AGT、CGT、TGT等三种突变类型相结合。同样地，实验中PNA能将野生型基因完全抑制，因此仪器所检测的荧光量可反应突变基因的拷贝量。该方法特异性高，由于不受引物二聚体影响，定量将更加准确。

2.1.1反应体系及反应条件

仪器选用ABI公司的7500型实时定量PCR仪。

反应体系包括：TaqMan Gene Expression Master Mix 12.5μl，引物F、R(序列如1.3)0.5μl(5pmol/μl)，PNA1μl(10pmol/μl)，MGB探针(序列如1.2)各0.3μl(10pmol/μl)，DNA标准品模板为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、0拷贝，用无菌双蒸水定容至25μl。

PCR反应条件：95℃预变性10m，之后95℃变性15s，76℃PNA结合15s，60℃退火60s，共50个循环。

2.1.2根据标准曲线判定探针的敏感性和特异性

根据PCR标准品的标准曲线检验K-ras-FAM Tagman MGB探针和K-ras-VIC Tagman MGB探针的敏感性(图1)和特异性(图2)。图1示K-ras-FAM Tagman MGB能够检测出GAT、GCT、GTT三种K-ras基因12密码子突变而无法检测出AGT、CGT、TGT其他三种K-ras基因12密码子突变。图2示K-ras-VIC Tagman MGB能够检测出AGT、CGT、TGT三种K-ras基因12密码子突变而无法检测出GAT、GCT、GTT其他三种K-ras基因12密码子突变。由此可见K-ras-FAM Tagman MGB探针和K-ras-VIC Tagman MGB有较高的特异性和敏感性。

2.1.3定量方法

选用同一系列倍比稀释的质粒标准品，分成两组，一组标准品反应体系中加入FAM型标准品，另一组加入VIC型标准品。同一待检模板同时设置FAM和VIC两个待测探针为两组。反应结束后，利用两组标准品分别制作标准曲线(图3)，分别进行待检样本的定量，可实时定量检测K-ras基因12密码子突变量。

2.1.4突变类型检测方法

根据实时定量PCR反应结束后，可得知待测样本发出荧光的不同来判断K-ras基因突变类型。检测不到荧光提示GGT野生型K-ras基因；检测到FAM荧光提示GAT、GCT、GTT突变型K-ras基因；检测到VIC荧光提示AGT、CGT、TGT突变型K-ras基因。根据实验中收集到的样本发出荧光类型，可分辨K-ras基因的突变类型。

3.收集临床胰腺癌、慢性胰腺炎患者及正常人血液，抽提DNA。

3.1标本收集：胰腺癌、慢性胰腺炎患者及正常人，采抗凝全血1ml。

3.2血液DNA抽提方法：①、抗凝全血0.5-12ml；②、加入500-700ul TT缓冲液，剧烈振荡后，低温离心机12000转/分离心5分钟；③、收集沉淀。重复2，3步骤，直至沉淀为无色；④、加入200ulPCR裂解液A；⑤、37℃水浴过夜；⑥、抽取PCR裂解物(约200ul)，加入200ul酚氯仿，充分混匀后，12000转/分离心20分钟；⑦、取上清，加入200ul氯仿充分混匀，12000转/分离心10分钟；⑧、取上清，加入100ul乙酸铵及2倍体积无水乙醇(约700ul)充分混匀，静置1分钟后，12000转/分离心10分钟；⑨、弃上清加入1ml70％乙醇洗涤，12000转/分离心5分钟；⑩、弃上清，自然风干，用100ulTE液溶解沉淀，分装于-80℃保存。

3.3 DNA浓度测定

应用NanoDrop ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计测出浓度。

3.4标本进行K-ras基因的PNA钳制定量PCR法检测

按照方法2.1.3和2.1.4，进行K-ras基因的PNA钳制PCR法定量和突变类型检测。

4.结果分析

根据步骤2.1.3所得标准曲线，得出待测样本K-ras基因突变量。根据步骤2.1.4，得出待测样本本K-ras基因突变类型。

经过检测及数据转换，得到胰腺癌、慢性胰腺炎以及正常人群血液中K-ras基因的突变量。运用SPSS18.0软件，采用卡方检验得到胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群各个两组之间均有显著差异(P＜0.05)，组间的比较如图4所示。证实胰腺癌血液中K-ras基因的突变率高于慢性胰腺炎和正常人群.更进一步证实对于K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测的方法在现实实际中有可操作性，同时具有科学性。

本实施例仅以胰腺癌、慢性胰腺炎、正常人群血液为检测样本，对本发明的技术方案进行了验证，但是根据本发明的公开，也可以采集患者的胰液、粪便、组织、胰腺穿刺物等为DNA样本，也同样运用本实施例公开的方法准确、简便地定量检测K-ras基因。

Claims

1.一种用于胰腺癌诊断的K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：分别装有核酸扩增体系反应液、荧光监测体系反应液、阳性标准品，并加盖密封的试剂管/瓶；其中核酸扩增体系反应液中的PNA为NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-COOH；PCR上游引物为5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3′；PCR下游引物为5′-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3′；荧光监测体系反应液中的K-ras-FAM Tagman MGB探针和K-ras-VIC Tagman MGB探针分别为：FAM-CTACGCCADCAGCTCCAACT-MGB和VIC-CTACGCCACDAGCTCCAACT-MGB。