CN117248068A - 检测VGIb型隐球菌的引物探针组合、方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种检测VGIb型隐球菌的引物探针组合、方法及试剂盒。其中，该引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，该探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。通过本申请提供的引物探针组合能够准确、快速地检测隐球菌并鉴定致病率更高的VGIb型隐球菌，帮助临床的快速、有针对性的诊断。
Description
技术领域
本发明属于真菌病原学检测技术领域，具体涉及一种检测VGIb型隐球菌的引物探针组合、方法及试剂盒。
背景技术
隐球菌是一类属内种类众多的致病性真菌，感染人体后能够侵犯人体中枢神经或随血液流动造成其他脏器的感染。从流行病学观察上看，不同种属的隐球菌在流行性、致病率、致死率上存在显著差距，适用的疗法也不同。因此，对隐球菌的早期诊断中，检测并鉴定隐球菌的类型对治疗方案的指定具有重要意义。
通过分子分型通常将隐球菌分为8个类型，即一级分型。已有研究发现，同一个一级分型下不同亚种的隐球菌在临床上的表现也具有显著差距，尤其是VGIb型隐球菌的致病率明显高于其他菌株。但目前对隐球菌的检测仅能确定隐球菌的一级分型，无法进一步进行隐球菌亚型的检测。因此，如何准确检测隐球菌的亚型成为一项亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明提供了一种检测VGIb型隐球菌的引物探针组合、方法、试剂盒以及该引物探针组合在检测VGIb型隐球菌中的应用，通过针对VGIb型隐球菌的特定基因片段设计特异性的引物探针组合，能够准确地检测VGIb型隐球菌，帮助隐球菌病的早期临床诊断。
第一方面，本申请提供一种检测VGIb型隐球菌的引物探针组合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；所述探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
在一些实施例中，所述引物用于识别VGIb型隐球菌中如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，所述探针的3’端连接有荧光淬灭基团。
第二方面，提供一种检测隐球菌亚型的方法，所述方法包括：获取待测样本的模板DNA；通过聚合酶链式反应PCR对所述模板DNA进行扩增以获取扩增结果，其中所述PCR的反应物包括如第一方面任一实施例中的引物探针组合；根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述VGIb型隐球菌的检测结果为阳性或阴性。
在一些实施例中，所述根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述VGIb型隐球菌的检测结果为阳性或阴性包括：在所述扩增结果中所述荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述VGIb型隐球菌的检测结果为阳性；在所述扩增结果中所述荧光报告基团没有荧光增长，或所述荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述VGIb型隐球菌的检测结果为阴性。
第三方面，提供一种检测VGIb型隐球菌的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面任一实施例中的引物探针组合。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷酸三磷酸dNTP。
第四方面，提供一种如第一方面任一实施例中的引物探针组合在检测VGIb型隐球菌中的应用。
附图说明
图1是本申请实施例一种VGIb型隐球菌的检测方法的示意性流程图。
图2是本申请实施例VGIb型隐球菌的特异性扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请的技术方案作进一步介绍。
本申请所公开的“范围”以下限和上限的形式来限定，给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的，选定的下限和上限限定了特别范围的边界。这种方式进行限定的范围可以是包括端值或不包括端值的，并且可以进行任意地组合，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，如果针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。在本申请中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。另外，当表述某个参数为≥2的整数，则相当于公开了该参数为例如整数2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12等。
在本申请的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
如果没有特别的说明，本申请的所有实施方式以及可选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
隐球菌是一类广泛存在于自然界的真菌，属于半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母科。隐球菌属包括17个种和8个变种，其中致病的主要是新型隐球菌，以下简称隐球菌。不同种类的隐球菌的致病率、感染人群具有显著差异。例如，新生隐球菌主要感染免疫抑制人群，而格特隐球菌主要感染免疫正常人群。
随着基因检测手段的提升，隐球菌在一级分型上被分为8个类型，其包括：VNI型隐球菌、VNII型隐球菌、VNIII型隐球菌、VNIV型隐球菌、VGI型隐球菌、VGII型隐球菌、VGIII型隐球菌以及VGIV型隐球菌。此外，发明人研究发现，在上述8个分型下，隐球菌还能够被进一步细分，例如，VGI型隐球菌还能够被分为VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌、VGIc型隐球菌等多个亚型。不同亚型的隐球菌在流行性、致病率以及致死率上同样存在显著差异。尤其是VGIb型隐球菌在临床上表现出更高的致病率与致死率。因此，VGIb型隐球菌的早期检测对临床诊断具有重要的意义。
有鉴于此，本申请提供了一种检测VGIb型隐球菌的引物探针组合，基于该引物探针组合的聚合酶链式反应PCR能够准确、快捷地进行检测并鉴定VGIb型隐球菌。
首先本申请实施例提供一种检测VGIb型隐球菌的引物探针组合。
其中，该引物包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如Seq IDNo.1所示，反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。该探针的核苷酸序列如Seq IDNo.3所示。
具体来说，发明人通过生物信息学方法，通过对各种亚型的隐球菌的全部基因组进行比较，不局限于单一的编码基因，而是在整个基因组层面寻找差异位点，从而设计出了核苷酸序列如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的引物以及核苷酸序列如Seq ID No.3所示的探针。利用该引物探针组合能够准确检测并鉴定VGIb型隐球菌，从而帮助对VGIb型隐球菌引发的疾病的早期诊断。
该正向引物的核苷酸序列具体为ATGTCACATTGTCCCCCTCAG。
该反向引物的核苷酸序列具体为GATTGATGCCGAGGATAAGTCG。
该引物用于识别VGIb型隐球菌中如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。换言之，针对VGIb型隐球菌设计的引物能够特异性识别Seq ID No.4所示的核苷酸序列，该核苷酸序列只存在于VGIb型隐球菌中。
可选地，该探针的5’端连接有荧光报告基团，该探针的3’端连接有荧光淬灭基团。
其中，荧光报告基团包括但不限于6-羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素（TET）、2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素（JOE）、六氯-6-甲基荧光素（HEX）、花青素荧光染料CY3、6-羧基-四甲基若丹明（TAMRA）。荧光淬灭基团包括但不限于6-羧基-四甲基若丹明（TAMRA）、4-(4-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸（DABCYL）或黑洞淬灭剂BHQ1、BHQ2、BHQ3。
例如，探针的5’端连接有FAM基团，探针的3’端连接有BHQ1基团。即该探针为：FAM-CCACGTCAGTTCCGAGTATCACCGTACGCA-BHQ1。
上述引物探针组合在检测和鉴定VGIb型隐球菌时具有敏感性高、特异性强的明显优势。
本申请实施例还提供一种检测VGIb型隐球菌的方法100。
图1为本申请实施例检测VGIb型隐球菌的方法100的示意性流程图。如图1所示，方法100包括：
S101，获取待测样本的模板DNA。
S102，通过聚合酶链式反应PCR对待测样本的模板DNA进行扩增以获取扩增结果。其中，PCR的反应物包括本申请任一实施例中的引物探针组合。
S103，根据扩增结果判断待测样本中VGIb型隐球菌的检测结果为阳性或阴性。
具体来说，本申请提供的上述引物探针组合通过荧光定量PCR能够有效检测待测样本中的VGIb型隐球菌。
可选地，待测样本包括血液、体液、和/或肺部组织。
可选地，在S103中，根据扩增结果判断待测样本中VGIb型隐球菌的检测结果为阳性或阴性包括：
在扩增结果中，荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断待测样本中的VGIb型隐球菌的检测结果为阳性。
在扩增结果中，荧光报告基团没有荧光对数增长或荧光报告基团有荧光对数增长但循环阈值Ct大于30.0的情况下，判断待测样本中的VGIb型隐球菌的检测结果为阴性。
本申请实施例还提供一种检测VGIb型隐球菌的试剂盒，该试剂盒包括本申请任一实施例中的引物探针组合。
可选地，该试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷酸三磷酸dNTP。
可选地，该试剂盒还包括MgCl2。
使用本申请实施例提供的试剂盒，能够准确、快速地检测VGIb型隐球菌。操作简单、检测时间短、适应性强的同时还能鉴别致病菌的亚型，从而进行快速准确的临床诊断，为疾病治疗赢得宝贵的时间。
另外，本申请实施例还提供一种如上述任一实施例中的引物探针组合在检测VGIb型隐球菌中的应用。
接下来，对本申请提供的检测方法100的具体步骤做进一步介绍。应理解，下述实施例仅为了说明本申请的鉴定方法的实施方式，其中具体试剂用量或仪器的使用可根据需要调整，不构成对本申请实施例的限定。
实施例1：模板DNA的提取
一、试验材料：待测样本
本申请所述的待测样本包括但不限于血液、体液或肺部组织。
二、主要试剂与仪器
DNA提取采用天根公司酵母基因提取试剂盒；引物和探针的合成由生物工程有限公司完成；DNA聚合酶购自Takara公司；荧光定量PCR仪购于Roche公司。
三、实验方法
按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，使用分光光度计，测定样品中DNA含量，测定OD260/OD280比值。本实施例中提供的待测样本中含有新生隐球菌、VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌。
实施例2：PCR扩增反应
2.1 VGIb型隐球菌的PCR检测
一、试验材料
模板DNA。具体的PCR反应体系详见表1。
二、主要试剂与仪器
表1：实时荧光PCR反应体系 (25 μL)
三、实验方法
本实施例采用TAKARA公司的Prime STAR 2X Mix的PCR扩增试剂盒进行PCR扩增反应，PCR扩增过程可参见该试剂盒的产品使用说明书。
本实施例中，反应体系中正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
本实施例中，PCR反应的扩增条件为：95oC预变性5min；95oC 10s，68oC 60s，45个循环，获得扩增结果。
四、分析判断扩增结果
图2为本申请实施例通过上述操作得到的VGIb型隐球菌的扩增曲线。图2的扩增曲线中，纵坐标为相对荧光单位(Relative fluorescence unit, RFU)，横坐标为扩增的循环数目(cycle)。
如图2所示，在对待测样本的检测结果中，只有VGIb型隐球菌被特异性扩增，具有相应的扩增曲线，FAM荧光有荧光对数增长，且Ct≤30.0。而平行实验的VGIa型隐球菌、新生隐球菌均无特异性扩增曲线。说明该引物探针组合对VGIb型隐球菌具有良好的特异性，能够准确识别待测样本中的VGIb型隐球菌。并且，VGIb型隐球菌的3条扩增曲线具有几乎一致的荧光对数增长，说明通过该引物探针组合检测VGIb型隐球菌的方法具有良好的重复性。另外，图2中的模板DNA浓度为0.1 ng/μL，经过荧光PCR仍能有良好的荧光对数响应，说明通过该引物探针组合检测VGIb型隐球菌的方法具有优异的敏感性。
由此，本申请提供的引物探针组合能够准确、高效地检测VGIb型隐球菌。
经过上述对VGIa型隐球菌、VGIb型隐球菌以及新生隐球菌的检测可以看出，本申请提供的引物探针组合能够对VGIa型隐球菌进行特异性鉴定，平行实验的其他菌株的结果均为阴性，没有特异性扩增曲线，由此，该引物探针组合具有良好的特异性。另外，通过本申请提供的引物探针组合进行VGIb型隐球菌检测时，不仅能够检测是否存在隐球菌，还能够直接确定隐球菌的亚型，有利于在临床上帮助对致病率或致死率更高的VGIb隐球菌亚种进行早期干预和治疗。通过本申请提供的检测试剂盒对隐球菌亚型进行检测，操作简单且结果可靠准确，能够帮助医师对隐球菌感染的疾病进行快速地诊断，有利于尽早制定合适的治疗方法，减少药物滥用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一种实现方式”、“一些实施例”、“示意性实施方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种检测VGIb型隐球菌的引物探针组合，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；所述探针的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物用于识别VGIb型隐球菌中如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，所述探针的3’端连接有荧光淬灭基团。
4.一种检测VGIb型隐球菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
获取待测样本的模板DNA；
通过聚合酶链式反应PCR对所述模板DNA进行扩增以获取扩增结果，其中所述PCR的反应物包括如权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合；
根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述VGIb型隐球菌的检测结果为阳性或阴性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述VGIb型隐球菌的检测结果为阳性或阴性包括：
在所述扩增结果中所述荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述VGIb型隐球菌的检测结果为阳性；
在所述扩增结果中所述荧光报告基团没有荧光增长，或所述荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值Ct小于或等于30.0的情况下，判断所述待测样本中所述VGIb型隐球菌的检测结果为阴性。
6.一种检测VGIb型隐球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：缓冲液、模板DNA、DNA聚合酶和/或脱氧核苷三磷酸dNTP。
8.一种如权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合在检测VGIb型隐球菌中的应用。
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