CN118109648A - 一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸检测技术领域，具体为一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，S1：构建多靶点探针库；S2：样本处理；S3：探针杂交；S4：信号扩增与检测；S5：结果分析。本发明能够针对目标核酸的多个靶点，设计由相同荧光基团标记的n组核酸探针（n≥2），将1:1的探针和目标物的结合，转换成1:n的信号报告出来，降低Ct值，提高核酸检测敏感性，进一步拓宽核酸检测试剂盒的应用范围，为临床感染诊断、药物治疗效果监测及转阴判断等提供准确数据，相较传统的单靶点PCR‑荧光探针法，本方法可提升检测灵敏度约1个数量级，最低检测阈值低于10 copies/μL，低拷贝数目标核酸的阳性检出率可提升4‑5倍，极大提高了核酸检测的灵敏度、敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，特别是涉及一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，属于核酸检测技术领域。
背景技术
核酸探针是一类由核酸或类核酸分子组成的分子探针，具有两个基础功能，分别是目标物识别和信号转导。目标物识别能力要求探针能够高度亲和及特异的结合待测组分中的目标物，信号转导则要求将探针和目标物的结合转换为易于检测的信号报告出来。经典的核酸探针设计原理一般是：核酸探针与目标物结合后，促使核酸探针结构的变化，进而触发信号开关。其中，传统的PCR-荧光探针法是在PCR体系中加入1对引物的同时，加入1条荧光标记、可结合靶序列的特异性寡核苷酸探针，其5'端和3'端分别标记为荧光报告（Reporter， R）基团和荧光淬灭（Quencher，Q）基团。反应前，探针完整，R发出的荧光被Q吸收，检测不到荧光信号；探针随机结合到单链DNA（single stranded DNA，ssDNA）上进行扩增时，水生栖热菌DNA聚合酶（Thermus aquaticus DNApolymerase，TaqDNA聚合酶或Taq酶）的5’端至3’端天然核酸外切酶活性将探针酶切降解，R与Q分离，发射荧光抑制效应解除，R发出的荧光能够被检测到。每生成1个荧光分子就代表1条双链DNA（double stranded，dsDNA）扩增出来，说明荧光信号的累积与PCR产物的积累完全同步。
这种设计响应快速、简单、易行，并且已经广泛的用于核酸、蛋白质、小分子等生物分子的检测，但是随着研究和应用的深入，这类核酸探针的不足也愈发明显：目标物的识别和信号的转导是1:1的形式，1个目标物只能触发1个信号的输出，使检测的灵敏度限制在了一定的范围内，基本在nM级别。核酸检测法高敏感性结果的获得往往需要在使用较为理想的样品的条件下获得，而事实上，许多生物分子在生物体内或宿主体内初期的丰度非常低。
理论上，假设初始模板核酸浓度为1 copies/μL，酶的扩增效率100%，到达最大阈值约需要35个循环，因此业内通常认为qPCR的有效线性范围Ct值为15-35；但通常酶的扩增效率无法达到100%，达到1个拷贝模板的Ct值可能会达到38或更高；而当酶的效率更低或者存在抑制剂时，检测到1拷贝模板的Ct值就会更高；当初始模板量小于1个拷贝时，这时的影响因素不仅为能否检测到，还取决于每次能取到模板的概率（概率遵循泊松分布）。
针对不含背景核酸的纯DNA样品，qPCR法可以达到理论上1拷贝的检测灵敏度，但需要极其严格的实验环境以及最优的实验条件（引物、试剂、参数等），实际操作中很难达到这一目标，进一步提升Ct值，增加循环数，也不能提高试剂本身的最低检测限和对低浓度样品的检出率，同时增加了假阳性风险；
目前，商品化的PCR-荧光探针法核酸检测试剂盒，多采用的是单对引物和单条探针的检测，在检测极低拷贝数目标核酸（或极微量目标核酸混杂于大量背景核酸中）的样品时，检测方法的敏感性或特异性可能降低，从而导致假阴性或假阳性的结果。
尤其对于部分虫媒病毒，包括流行性乙型脑炎、登革热、寨卡病毒感染、黄热病等蚊媒病的病毒，病毒血症期患者血液内的病毒载量较低，且患者的病毒血症持续时间很短，一般仅为发病后的3-5天内，而患者就诊时往往已经接近病毒血症末期。此外，在样本保存、运输及核酸提取等过程中，不可避免会造成部分核酸片段的降解与损失，这更降低了目标核酸的数量与完整性。这些因素导致以上的病毒感染患者在进行早期诊断时，难以通过核酸检测获得确诊，反而可能造成误诊。在未获得核酸检测确凿结果支持的情况下，医生往往只能依靠流行病学史、临床症状及血液生化指标来进行临床诊断，这种诊断需要昂贵、复杂的仪器设备，且与临床医生的实践经验密切相关，存在较大的主观性。这种情况不仅不利于患者的早期诊断与合理治疗，甚至导致临床高度疑似感染患者或低病毒潜伏的“假痊愈患者”检测“假阴性”现象频发。
因此，亟需对基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法进行改进，以解决上述存在的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，能够针对目标核酸的多个靶点，设计由相同荧光基团标记的n组核酸探针（n≥2），将1:1的探针和目标物的结合，转换成1:n的信号报告出来，降低Ct值，提高核酸检测敏感性，进一步拓宽核酸检测试剂盒的应用范围，为临床感染诊断、药物治疗效果监测及转阴判断等提供准确数据。
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，包括如下步骤：
S1：构建多靶点探针库：设计多个针对目标病毒或病原体的特异性探针，每个探针分别针对病毒或病原体的不同基因区域或位点；
S2：样本处理：将待检测样本进行处理，以获得可用于后续检测的核酸模板；
S3：探针杂交：将处理后的核酸模板与构建的多靶点探针库进行杂交反应，使探针与目标核酸序列结合；
S4：信号扩增与检测：利用适用的信号扩增技术，对结合了目标核酸序列的探针进行信号放大，然后对信号进行检测和定量；
S5：结果分析：根据检测到的信号强度和特异性，判断样本中是否存在目标病毒或病原体，并可进一步定量分析其浓度。
优选的，所述S1中的特异性探针组由多组相同荧光基团标记的探针组成。
优选的，所述S1中的探针为核酸、肽核酸或其他适用生物分子。
优选的，所述S2中的样本处理包括核酸提取、逆转录、PCR扩增等步骤。
优选的，所述S4中的信号扩增技术包括有链式反应、滚环复制或其他等，所述信号扩增技术采用链式反应、滚环复制或其他中的一种或多种。
优选的，所述S4中对探针的检测采用荧光检测或者电化学检测中的其中一种或多种。
优选的，所述S4中的检测方法为：以人工合成的含有目标核酸序列的质粒为标准物质，将其稀释为多个梯度，作为测试标准品，每个稀释度设置若干个重复。
优选的，多个梯度分为0.1、1、10、100copies/μL4个梯度，每个稀释度具体设置10个重复。
优选的，所述S4中的检测设备选取ABI Prism 7500仪器上进行。
优选的，所述ABI Prism 7500仪器的循环运行时间依次为：20分、10分、十秒以及四十秒，所述ABI Prism 7500仪器循环运行的温度依次为：50℃、95℃、95℃以及55℃。
本发明至少具备以下有益效果：
1、相较传统的单靶点PCR-荧光探针法，本方法可提升检测灵敏度约1个数量级，最低检测阈值低于10 copies/μL，低拷贝数目标核酸的阳性检出率可提升4-5倍，极大提高了核酸检测的灵敏度、敏感性，并且本方法不仅可用于流行性乙型脑炎、登革热、寨卡病毒感染、黄热病等多种蚊媒病及其他传染病的早期核酸检测，也可用于多种传染病恢复期患者的病原学评价，以及媒介动物的病原学调查、痕量核酸的高灵敏度检测等，在医学、微生物学、流行病学等诸多研究领域具有广阔应用前景，并将创造可观经济效益。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本发明的检测方法流程图；
图2为本发明的仪器循环运行实例图；
图3为本发明的工作原理图。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，借此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
如图1-图3所示，本实施例提供的基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，包括如下步骤：
S1：构建多靶点探针库：设计多个针对目标病毒或病原体的特异性探针，每个探针分别针对病毒或病原体的不同基因区域或位点；
其中，特异性探针组由多组相同荧光基团标记的探针组成，探针为核酸、肽核酸或其他适用生物分子；
S2：样本处理：将待检测样本进行处理，以获得可用于后续检测的核酸模板，其中，样本处理包括核酸提取、逆转录、PCR扩增等步骤；
S3：探针杂交：将处理后的核酸模板与构建的多靶点探针库进行杂交反应，使探针与目标核酸序列结合；
S4：信号扩增与检测：利用适用的信号扩增技术，对结合了目标核酸序列的探针进行信号放大，然后对信号进行检测和定量；
其中，信号扩增技术包括有链式反应、滚环复制或其他等，信号扩增技术采用链式反应以及滚环复制反应；
进一步的，探针的检测采用荧光检测以及电化学检测；
更进一步的，检测方法为：以人工合成的含有目标核酸序列的质粒为标准物质，将其稀释为多个梯度，作为测试标准品，每个稀释度设置若干个重复；多个梯度分为0.1、1、10、100copies/μL4个梯度，每个稀释度具体设置10个重复；
检测设备选取ABI Prism 7500仪器上进行，其中如图1所示，ABI Prism7500仪器的循环运行时间依次为：20分、10分、十秒以及四十秒，ABI Prism 7500仪器循环运行的温度依次为：50℃、95℃、95℃以及55
S5：结果分析：根据检测到的信号强度和特异性，判断样本中是否存在目标病毒或病原体，并可进一步定量分析其浓度。
其中，具体实施例1，以乙型脑炎病毒PCR-荧光探针法检测为例：
1.引物及探针设计
atggctgctggtacggaatggaaatcagacctgttatgcatgatgaaacaacactcgtcagatcacaggttgatgctttcaaaggtgaaatggttgacccttttcagctgggccttctggtgatgtttctggccacccaggaagtccttcgcaagaggtggacggccagattgaccattcctgcggttttgggggtcctacttgtgctgatgcttgggggtatcacttacactgatttggcgaggtatgtggtgctagtcgctgctgctttcgcagaggccaacagtggaggagacgtcctgcaccttgctttgattgccgtttttaagatccaaccagcatttctagtgatgaacatgcttagcacgagatggacgaaccaagaaaacgtgattctggtcctaggggctgcctttttccaattggcctcagtagatctgcaaataggag
以上为乙型脑炎病毒特异性基因片段，传统PCR-荧光探针法设计1对引物及1条荧光标记探针：
上游引物：5’agctgggccttctggt 3’
下游引物：5’cccaagcatcagcacaag 3’
探针：5’FAM-cttcgcaagaggtggacggcca-BHQ1 3’（如上核酸序列中第一个划线处）；
本发明在该对引物及探针附近，另设1对引物及1条探针，且探针的发光基团同为FAM，淬灭基团同为BHQ1。
上游引物：5’tgatttggcgaggtatgtggt 3’
下游引物：5’aacggcaatcaaagcaaggt 3’
探针：5’FAM-agtcgctgctgctttcgcagaggcca-BHQ1 3’（如上核酸序列中第二个划线处）；
2.反应条件设置
以人工合成的含有目标核酸序列的质粒为标准物质，将其稀释为0.1、1、10、100copies/μL4个梯度，作为测试标准品，每个稀释度设置10个重复。分别以传统的单靶点PCR-荧光探针法和本发明设计的双靶点PCR-荧光探针法对各稀释度的测试标准品进行检测；
操作在ABIPrism7500仪器上进行，循环条件设置如图1所示；
3.结论
结果显示：当初始目标核酸含量≥10 copies/μL时，两种方法的目标核酸阳性检出率均为100%，双靶点法Ct值比单靶点法低4个数值；当初始目标核酸含量为1 copies/μL时，单靶点法阳性检出率为20%，双靶点法阳性检出率为90%；当初始目标核酸含量为0.1copies/μL时，单靶点法阳性检出率为0，双靶点法阳性检出率为20%。由此可见，双靶点PCR-荧光探针法比传统的单靶点PCR-荧光探针法具有更高的敏感性、灵敏度；
如图1-图2所示，当初始目标核酸含量低于10 copies/μL时，双靶点法的目标核酸阳性检出率约为单靶点法的4-5倍，显著提高目标核酸检测的敏感性。
如图2所示，一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，其工作原理如下：在目标核酸上同时设立检测靶点B，2条由相同荧光基团标记的TaqMan探针分别与各靶点特异性结合，在Taq酶的作用下，R与Q分离，每扩增1条dsDNA，就有2个荧光分子被检测到，荧光信号的累积与PCR产物的积累为2:1形式，使本发明相比较传统的单靶点PCR-荧光探针法提升约1个数量级，显著提高目标核酸检测的灵敏度。
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决技术问题，基本达到技术效果。
需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：构建多靶点探针库：设计多个针对目标病毒或病原体的特异性探针，每个探针分别针对病毒或病原体的不同基因区域或位点；
S2：样本处理：将待检测样本进行处理，以获得可用于后续检测的核酸模板；
S3：探针杂交：将处理后的核酸模板与构建的多靶点探针库进行杂交反应，使探针与目标核酸序列结合；
S4：信号扩增与检测：利用适用的信号扩增技术，对结合了目标核酸序列的探针进行信号放大，然后对信号进行检测和定量；
S5：结果分析：根据检测到的信号强度和特异性，判断样本中是否存在目标病毒或病原体，并可进一步定量分析其浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，其特征在于：所述S1中的特异性探针组由多组相同荧光基团标记的探针组成。
3.根据权利要求1所述的一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，其特征在于：所述S1中的探针为核酸、肽核酸或其他适用生物分子。
4.根据权利要求1所述的一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，其特征在于：所述S2中的样本处理包括核酸提取、逆转录、PCR扩增等步骤。
5.根据权利要求1所述的一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，其特征在于：所述S4中的信号扩增技术包括有链式反应、滚环复制或其他等，所述信号扩增技术采用链式反应、滚环复制或其他中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，其特征在于：所述S4中对探针的检测采用荧光检测或者电化学检测中的其中一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，其特征在于：所述S4中的检测方法为：以人工合成的含有目标核酸序列的质粒为标准物质，将其稀释为多个梯度，作为测试标准品，每个稀释度设置若干个重复。
8.根据权利要求7所述的一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，其特征在于：多个梯度分为0.1、1、10、100copies/μL4个梯度，每个稀释度具体设置10个重复。
9.根据权利要求7所述的一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，其特征在于：所述S4中的检测设备选取ABI Prism 7500仪器上进行。
10.根据权利要求9所述的一种基于多靶点扩增提高核酸检测敏感性的方法，其特征在于：所述ABI Prism 7500仪器的循环运行时间依次为：20分、10分、十秒以及四十秒，所述ABI Prism 7500仪器循环运行的温度依次为：50℃、95℃、95℃以及55℃。
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