CN117587167A - 一种用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合及其应用 - Google Patents

一种用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合及其应用。所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核酸序列包括SEQ ID NO:1所示的序列，所示下游引物的核酸序列包括SEQ ID NO:2所示的序列；所述探针的核酸序列包括SEQ ID NO:3所示的序列。本发明设计具有高特异性和灵敏性的引物和探针组合，进行基因扩增，扩增曲线呈现明显的指数期、平台期；利用所述引物和探针组合进行qPCR定量检测EMCV病毒，相较于经典的病毒噬斑实验，相对标准偏差小，在线性标准曲线、线性相关系数、范围、准确度、精密度、灵敏度和检测限等方面符合ICH法规要求。

Description

一种用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合及其应用
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合及其应用。
背景技术
随着动物源性组织、细胞、体液等来源的生物制品逐渐增多，使用的人群不断扩大，潜在医源性感染问题变得日益突出。目前已知经血液制品传染的病毒主要有乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)和人细小病毒(B19)。脑心肌炎病毒(EMCV)，属于非包膜RNA病毒，是一种人畜共患病病原，会引起猪和某些哺乳动物、啮齿动物乃至灵长类动物的脑炎、心肌炎或心肌周围炎。若产品受到污染，会带来巨大的影响。
在病毒清除实验中，为了检测下游纯化步骤对模型病毒的去除效果，通常使用噬斑法或TCID50法对病毒滴度进行检测。这种基于指示细胞的检测方法，培养周期长，且实验结果会受指示细胞状态和培养时间的影响。含有病毒颗粒的样品接种至指示细胞后，通常需要5-12天的时间才可获取数据，实验结果获取周期过长。
聚合酶链式反应(PCR)是检测目标核酸片段的有效方法，PCR通过热循环驱动扩增。实时荧光定量PCR(qPCR)方法已被开发应用于病毒检测以及病毒清除研究，该方法是通过实时监测荧光强度来检测并定量PCR产物的含量。qPCR中使用的DNA聚合酶具有5’至3’的核酸内切酶活性，通过水解标记有荧光素和淬灭染料的寡核苷酸探针，产生荧光信号。将qPCR和荧光素标记探针相结合，在理论上qPCR可以检测到样品中个位数拷贝的病毒核酸。目前，在病毒清除验证中，qPCR主要被应用在ProteinA亲和层析工艺步骤中病毒核酸的检测。将qPCR技术应用于病毒定量的主要技术难点包括：1)易产生假阳性信号，而不是假阴性信号；2)难以确定测定病毒基因组拷贝数的合适的标准曲线；3)核酸检测拷贝数与病毒滴度的换算方法复杂。如CN106811552A公开了一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的引物对、探针、试剂盒及方法。
综上所述，开发适用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针，实现快速、高效、高灵敏度、特异性的检测，具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合及其应用，设计并优化检测EMCV引物和探针，具有高特异性和灵敏性，进行基因扩增，扩增曲线呈现明显的指数期、平台期；基于特定引物和探针进行qPCR定量检测EMCV病毒，相较于经典的病毒使用指示细胞进行的噬斑实验，相对标准偏差小，在线性标准曲线、线性相关系数、范围(包括检测病毒拷贝数下限和上限)、准确度、精密度、灵敏度、检测限等方面符合ICH法规要求。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合及其应用，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核酸序列包括SEQ ID NO:1所示的序列，所示下游引物的核酸序列包括SEQ ID NO:2所示的序列；
所述探针的核酸序列包括SEQ ID NO:3所示的序列。
本发明通过病毒RNA序列进行Blast比对，设计了脑心肌炎病毒的特异性引物和探针，通过比对序列GC含量，Tm值和二级结构等，选择性合成引物探针，并通过PCR实验进一步调整引物探针浓度、退火温度和延伸温度等，确定优化后的反应参数，确定上游引物(FP)、下游引物(RP)和探针(Probe)，整体协同配合，实现高特异性、灵敏度检测。
SEQ ID NO:1：5‘-CATGCGTTTGAGGAGAAGCG-3’。
SEQ ID NO:2：5‘-GTGAGATACAAACCCGCCCT-3’。
SEQ ID NO:3：5‘-CCGGTGGTCTCCCATCAGGTTGTGCAGCG-3’。
本发明中，引物的特异性好，通过使用上述引物对常用病毒进行特异性扩增，结果显示所述引物对其它病毒的基因组无扩增，特异性好。
优选地，所述探针的5’端修饰荧光基团，所述探针的3’端修饰淬灭基团。
优选地，所述荧光基团包括FAM、TET、VIC、CY5、HEX或ROX中任意一种；
优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、MGB或TAMRA中任意一种。
第二方面，本发明提供一种检测脑心肌炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合。
优选地，所述试剂盒还包括病毒核酸标准品和荧光定量PCR反应试剂。
优选地，所述病毒核酸标准品采用包括如下步骤的方法制备得到：通过稀释脑心肌炎病毒原液和经典的病毒指示细胞噬斑实验，将103～104PFU的病毒稀释液调整为103～104拷贝的标准化Ct值；根据调整后的稀释液和稀释因子，从高滴度病毒库纯化制备106拷贝的病毒核酸标准品；将106拷贝病毒核酸标准品按10倍梯度稀释产生1～105拷贝的目标病毒基因标准品。
本发明中病毒核酸标准品的制备方法：
(1)使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit提取病毒核酸；
(2)将病毒核酸10倍梯度稀释，通过PCR得到各稀释度Ct值；
(3)比较检测Ct值和标准化Ct值，计算得到稀释倍数；
(4)将步骤(1)中核酸进行相应稀释，制备成病毒基因组标准品。
本发明中病毒核酸标准品病毒基因组标准品相比于RNA片段标准品不需要通过DNA片段进行反转录；不易降解，稳定性好。相比于DNA或质粒标准品，反转录效率一致，不影响扩增效率的评估。该方法制备的标准品主要用于病毒清除研究中病毒清除效果的计算。
优选地，所述荧光定量PCR反应试剂包括One Step PrimeScript III RT-qPCRMix。
本发明中所述荧光定量PCR反应可采用的常规的反转录酶和DNA聚合酶进行扩增检测，根据不同酶调整合适的扩增程序。
第三方面，本发明提供第一方面所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合在以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测脑心肌炎病毒中的应用。
本发明设计特定的引物和探针组合，开发检高灵敏度、特异性检测脑心肌炎病毒，可有效应用于以非疾病诊断和/或治疗为目的的领域，与检测生物制品中病毒含量等等。
第四方面，本发明提供一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测脑心肌炎病毒的方法，所述方法包括：
以待测样本中核酸为模板，利用第一方面所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合进行荧光定量PCR，得到Ct值及扩增曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量分析。
优选地，所述荧光定量标准曲线的构建方法包括：
对已知浓度的脑心肌炎病毒核酸标准品进行荧光定量PCR，得到Ct值及扩增曲线，根据所述标准品的浓度和Ct值，以Ct值为纵坐标，以Log(浓度)值为横坐标，绘制荧光定量标准曲线。
优选地，所述检测方法具体包括：
(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系，所述PCR体系包括第一方面所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合；
(2)对待测样品和脑心肌炎病毒核酸标准品进行荧光定量PCR，得到待测样品和标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线；
(3)根据标准品的浓度和Ct值，以Ct值为纵坐标，以Log(浓度)值为横坐标，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量分析。
优选地，所述荧光定量PCR反应的反应体系以终浓度计包括：One StepPrimeScript III RT-qPCRMix 1×、上游引物800～1000nM、下游引物800～1000nM、探针100～300nM。
优选地，所述荧光定量PCR的程序为：步骤1：47～49℃，8～12min；步骤2：94～96℃，4～6min；步骤3：94～96℃，12～18sec；步骤4：58～62℃，0.8～1.2min；步骤3和步骤4，40～42个循环。
第五方面，本发明提供一种第二方面所述的检测脑心肌炎病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系；
(2)对待测样品和脑心肌炎病毒核酸标准品进行荧光定量PCR，得到待测样品和标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线；
(3)根据标准品的浓度和Ct值，以Ct值为纵坐标，以Log(浓度)值为横坐标，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。
优选地，所述荧光定量PCR的反应体系以终浓度计包括：One Step PrimeScriptIII RT-qPCRMix 1×、上游引物800～1000nM、下游引物800～1000nM、探针100～300nM，所述上游引物、下游引物的终浓度优选为900nM，探针的终浓度优选为200nM。
本发明中，所述荧光定量PCR的反应体系中上游引物的终浓度为800～1000nM，例如可以是800nM、900nM或1000nM等；下游引物的终浓度为800～1000nM，例如可以是800nM、900nM或1000nM等；探针的终浓度为100～300nM，例如可以是100nM、200nM或300nM等。
优选地，所述荧光定量PCR反应的程序为：
步骤1：47～49℃(例如可以是47℃、48℃或49℃等)，8～12min(例如可以是8min、9min、10min、11min或12min等)；
步骤2：94～96℃(例如可以是94℃、95℃或96℃等)，4～6min(例如可以是4min、5min或6min等)；
步骤3：94～96℃(例如可以是94℃、95℃或96℃等)，12-18sec(例如可以是12sec、14sec、16sec或18sec等)；
步骤4：58～62℃(例如可以是58℃、59℃、60℃、61℃或62℃等)，0.8-1.2min(例如可以是0.8min、0.9min、1.0min、1.1min或1.2min等)；
步骤3和步骤4，40～42个循环(例如可以是40、41或42)。
作为本发明的优选技术方案，所述使用方法包括以下步骤：
(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系；所述荧光定量PCR反应的反应体系以终浓度计包括：One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix 1×、上游引物FP 800-1000nM、下游引物RP 800-1000nM、探针100-300nM、模板5μL、用ddH2O补足25μL体系。
(2)对待测样品和脑心肌炎病毒核酸标准品进行荧光定量PCR反应，所述荧光定量PCR反应的程序为：步骤1：47-49℃，8-12min；步骤2：94-96℃，4-6min；步骤3：94-96℃，12-18sec；步骤4：58-62℃，0.8-1.2min；步骤3和步骤4，40-42个循环；得到待测样品和所述标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线。
(3)根据所述标准品的浓度和Ct值，以Ct值为纵坐标，以Log(浓度)值为横坐标，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。
第六方面，本发明提供一种检测脑心肌炎病毒的系统，所述系统包括：
样品制备模块：用于采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系，所述荧光定量PCR体系包括第一方面所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合；
检测模块：用于对荧光定量PCR体系进行荧光定量PCR；
分析模块：用于根据荧光定量标准曲线，对待测样品进行定性和定量分析。
优选地，所述荧光定量PCR反应的反应体系以终浓度计包括：One StepPrimeScript III RT-qPCRMix 1×、上游引物800～1000nM、下游引物800～1000nM、探针100～300nM。
优选地，所述荧光定量PCR反应的程序为：步骤1：47～49℃，8～12min；步骤2：94～96℃，4～6min；步骤3：94～96℃，12～18sec；步骤4：58～62℃，0.8-1.2min；步骤3和步骤4，40～42个循环。
第七方面，本发明提供第一方面所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合、第二方面所述的检测脑心肌炎病毒的试剂盒或第六方面所述的检测脑心肌炎病毒的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测脑心肌炎病毒的产品中的应用。
本发明中第一方面所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合、第二方面所述的检测脑心肌炎病毒的试剂盒或第六方面所述的检测脑心肌炎病毒的系统在生物安全、病毒检测、生物制品和病毒清除验证中具有重要的应用价值。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明设计并优化检测EMCV病毒的引物和探针，具有高特异性和灵敏性，进行基因扩增后，扩增曲线呈现明显的指数期、平台期；
(2)本发明利用EMCV病毒原液的滴度和经典的病毒指示细胞噬斑实验，将病毒原液稀释并制备成106核酸标准品，使用标准品进行梯度稀释，制成1到105拷贝数的目标病毒基因标准品，进而生成标准曲线，使用该标准品生成的标准曲线，线性关系和相关系数好，孔间差异小，重复性高。
(3)利用qPCR定量检测EMCV病毒，相较于经典的病毒指示细胞噬斑实验，相对标准偏差小，所述方法在线性标准曲线、线性相关系数、范围(包括检测病毒拷贝数下限和上限)、准确度、精密度、灵敏度、检测限等方面符合ICH法规要求。
附图说明
图1为特异性检测的结果图；
图2为标准曲线线性图；
图3为标准曲线扩增图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种检测EMCV病毒的引物和探针。本发明通过病毒RNA序列进行Blast比对，设计多对EMCV病毒的特异性引物探针。通过比对序列GC含量，Tm值和二级结构等，选择性合成引物探针。引物探针如下所示：
上游引物FP(SEQ ID NO:1):5‘-CATGCGTTTGAGGAGAAGCG-3’；
下游引物RP(SEQ ID NO:2):5‘-GTGAGATACAAACCCGCCCT-3’；
探针Probe(SEQ ID NO:3):
5‘-CCGGTGGTCTCCCATCAGGTTGTGCAGCG-3’；
所述引物为针对EMCV病毒Polyprotein序列；
所述探针的5’端修饰荧光素FAM，所述探针的3’端修饰淬灭剂MGB。
对比例1
本对比例提供一种检测EMCV病毒的引物和探针，所述引物和探针如下所示：
上游引物(SEQ ID NO:4):5’-CCTGACTAGAGAATATCTTGAGTC-3’；
上游引物(SEQ ID NO:5):5’-GGTGTTGTCGTACGGAGATGA-3’；
下游引物(SEQ ID NO:6):5’-AACGTCTTCAAGCGTCGAAT-3’；
上游引物(SEQ ID NO:7):5’-TGAGAGCAAGCCTCGCAAAG-3’；
下游引物(SEQ ID NO:8):5’-TTCATGACAGGCCGATACAGAG-3’；
下游引物(SEQ ID NO:9):5’-GTTTTGTTAGCGGGAGTTATC-3’；
探针Probe(SEQ ID NO:10):5‘-CGCAAAGACAGGATATAAGATAACTC-3’。
引物探针对2：
上游引物序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示。
引物探针对3：
上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如SEQ ID NO:6所示，探针序列如SEQ ID NO:10所示。
引物探针对4：
上游引物序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物序列如SEQ ID NO:8所示，探针序列如SEQ ID NO:10所示。
引物探针对5：
上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:9所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示。
引物探针对6：
上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:6所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例2
本实施例提供一种检测检测EMCV病毒的试剂盒，所述试剂盒包括实施例1所述的检测EMCV病毒的引物和探针、病毒核酸标准品和荧光定量PCR反应试剂。
所述病毒核酸标准品采用如下步骤制备得到：
(1)使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit提取EMCV病毒核酸；
(2)将病毒核酸10倍梯度稀释，通过PCR得到各稀释度Ct值；
(3)比较检测Ct值和标准化Ct值，计算得到稀释倍数；
(4)将步骤(1)中核酸进行相应稀释，制备成病毒基因组标准品。
所述荧光定量PCR反应试剂包括：One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix(Takara Code RR600)。
实施例3
本实施例使用实施例2所述的检测EMCV病毒的试剂盒对EMCV病毒进行检测。检测的具体步骤如下所示：
(1)采集并处理待测样品(为已知滴度的EMCV病毒液)，配制荧光定量PCR体系，荧光定量PCR体系如下所示：
待测样品的荧光定量PCR体系中模板为1拷贝病毒基因组/5μL。
阳性标准品：对EMCV病毒基因组核酸标准品进行10倍梯度稀释，从106拷贝/5μL稀释至1拷贝/5μL。
(2)对待测样品和阳性标准品进行荧光定量PCR反应，得到待测样品和阳性标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线。
荧光定量PCR反应的扩增程序如下所示：
步骤1：48℃，30min；步骤2：95℃，10min；步骤3：95℃，15sec；步骤4：60℃，1min；步骤3和步骤4，40个循环。
(3)根据阳性标准品的浓度和Ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。实验结果如表1所示。
表1
表1的结果表明，所述引物和探针能够特异性的检测到1拷贝/5μL的EMCV病毒，检测灵敏度高。
实施例4
本实施例使用实施例2所述的检测EMCV病毒的试剂盒对EMCV病毒进行检测。本实施例参照实施例3的步骤对1拷贝/5μL和10拷贝/5μL的标准品进行检测，所述荧光定量PCR体系中上游引物FP、下游引物RP的终浓度为900nM，探针的终浓度为200nM。实验结果如表2所示。
表2
拷贝/5μL Ct值 标准偏差
1 33.31 0.309
10 29.48 0.135
实施例5
本实施例使用实施例2所述的检测EMCV病毒的试剂盒对EMCV病毒进行检测。本实施例与实施例4的区别仅在于，所述荧光定量PCR体系中上游引物FP、下游引物RP的终浓度为800nM，其余步骤参照实施例4。实验结果如表3所示。
表3
拷贝/5μL Ct值 标准偏差
1 33.41 0.525
10 29.46 0.0755
从表3的结果可知，实施例4中的引物探针浓度(900nM)，相比800nM的引物探针浓度检测的结果，对1拷贝/5μL的检测灵敏度更高，标准偏差更小，检测效果更好。
实施例6
本实施例使用实施例2所述的检测EMCV病毒的试剂盒对EMCV病毒进行检测。本实施例与实施例4的区别仅在于，所述荧光定量PCR体系中上游引物FP、下游引物RP的终浓度为1000nM，其余步骤参照实施例4。实验结果如表4所示。
表4
拷贝/5μL Ct值 标准偏差
1 33.68 0.674
10 29.45 0.084
从表4的结果可知，实施例4中的引物探针浓度(900nM)，相比1000nM的引物探针浓度检测的结果，对1拷贝/5μL的检测灵敏度更高，标准偏差更小，检测效果更好。
实施例7
本实施例使用实施例2所述的检测EMCV病毒的试剂盒对EMCV病毒进行检测。本实施例与实施例4的区别仅在于，所述荧光定量PCR体系中探针的终浓度为100nM，其余步骤参照实施例4。实验结果如表5所示。
表5
拷贝/5μL Ct值 标准偏差
1 33.71 0.254
10 29.78 0.142
从表5的结果可知，实施例4中的引物探针浓度(200nM)，相比100nM的探针浓度检测的结果，对1拷贝/5μL和10拷贝/5μL的检测灵敏度更高，检测效果更好。
实施例8
本实施例使用实施例2所述的检测EMCV病毒的试剂盒对EMCV病毒进行检测。本实施例与实施例4的区别仅在于，所述荧光定量PCR体系中探针的终浓度为300nM，其余步骤参照实施例4。实验结果如表6所示。
表6
拷贝/5μL Ct值 标准偏差
1 33.45 0.409
10 29.49 0.118
从表6的结果可知，实施例4中的引物探针浓度(200nM)，相比300nM的探针浓度检测的结果，对1拷贝/5μL的检测灵敏度更高，标准偏差更小，检测效果更好。
实施例9
本实施例使用实施例2所述的检测病毒的试剂盒对EMCV病毒进行检测。本实施例与实施例4的区别仅在于所述荧光定量PCR体系中扩增程序如下：
步骤1：48℃，15min；步骤2：95℃，10min；步骤3：95℃，15sec；步骤4：60℃，1min；步骤3和步骤4，40个循环，试验结果如表7所示。
表7
拷贝/5μL Ct值 标准偏差
1 34.67 0.319
10 30.92 0.137
从表7结果可知，相同的引物探针浓度，不同的扩增程序，相较于实施例4的结果，本实施案例对1拷贝/5μL和10拷贝/5μL的检测灵敏度低，标准偏差大，检测效果差。
实施例10
本实施例使用实施例2所述的检测EMCV病毒的试剂盒对EMCV病毒进行检测。本实施例与实施例4的区别仅在于所述荧光定量PCR体系中扩增程序如下：
步骤1：48℃，30min；步骤2：95℃，5min；步骤3：95℃，15sec；步骤4：60℃，1min；步骤3和步骤4，40个循环，试验结果如表8所示。
表8
拷贝/5μL Ct值 标准偏差
1 34.2 0.758
10 29.94 0.0801
从表8结果可知，相同的引物探针浓度，不同的扩增程序，相较于实施例4的结果，本实施案例对1拷贝/5μL的检测灵敏度低，标准偏差大，检测效果差。
实施例11
本实施例使用实施例2所述的检测EMCV病毒的试剂盒对EMCV病毒进行检测。本实施例与实施例4的区别仅在于所述荧光定量PCR体系中扩增程序如下：
步骤1：48℃，30min；步骤2：95℃，10min；步骤3：95℃，15sec；步骤4：60℃，40sec；步骤3和步骤4，40个循环，试验结果如表9所示。
表9
拷贝/5μL Ct值 标准偏差
1 34.64 0.391
10 30.67 0.0707
从表9结果可知，相同的引物探针浓度，不同的扩增程序，相较于实施例4的结果，本实施案例对1拷贝/5μL的检测灵敏度低，标准偏差大，检测效果差。
实施例12
本实施例使用实施例1(引物探针对1)和对比例1(引物探针对2、引物探针对3、引物探针对4、引物探针对5和引物探针对6)中的引物探针进行检测，对比不同引物探针的检测效果。
荧光定量PCR体系如下所示：
荧光定量PCR体系中模板为1拷贝病毒基因组/5μL。
荧光定量PCR反应的扩增程序如下所示：
步骤1：48℃，30min；步骤2：95℃，10min；步骤3：95℃，15sec；步骤4：60℃，1min；步骤3和步骤4，40个循环。
试验结果如表10所示：
表10
通过表10的结果可知，当使用相同引物探针浓度和检测程序，不同引物序列时，引物对1对1拷贝/5μL，2拷贝/5μL和5拷贝/5μL的检测灵敏度高，检测效果最好，表明本发明设计特定序列的引物和探针组合，协同增效，进一步提高检测效果。
实施例13
本实施例使用实施例2所述的检测EMCV病毒的试剂盒进行特异性检测。检测样品包括EMCV病毒、其它RNA病毒基因组(X-MuLV，Reo-3,VSV)。检测步骤如下所示：
(1)采集并处理待测样品，待测样品包括EMCV病毒、其它RNA病毒基因组，分别配制荧光定量PCR体系。荧光定量PCR体系如下所示：
荧光定量PCR体系中模板为10000拷贝病毒基因组/5μL。
(2)对待测样品进行荧光定量PCR反应，得到荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线。
荧光定量PCR反应的扩增程序如下所示：
步骤1：48℃，30min；步骤2：95℃，10min；步骤3：95℃，15sec；步骤4：60℃，1min；步骤3和步骤4，40个循环。
试验结果：其中其它RNA病毒的检测结果如图1所示，结果显示为无意义扩增，说明所设计的引物探针无法扩增其它RNA病毒的基因组，表明所述引物探针的特异性好。
实施例14
本实施例使用实施例2所述的检测EMCV病毒的试剂盒进行检测能力测试。
(1)参照实施例3中的检测步骤，配制荧光定量PCR反应体系，并分装于96孔PCR板。
(2)对EMCV病毒基因组核酸标准品进行10倍梯度稀释，从106拷贝/5μL稀释至1拷贝/5μL，并同时检测1拷贝/5μL、2拷贝/5μL和5拷贝/5μL，每个浓度20个复孔。
(3)参照实施例3中的扩增参数进行qPCR扩增。
检测结果如表11所示，表11为各浓度基因组核酸的检测概率、回收率和CV。
表11
拷贝/5μL 平均值 标准偏差 检出概率 CV 回收率
1 0.89 0.172 100％ 0.19 89％
2 1.89 0.259 100％ 0.14 101％
5 5.08 0.523 100％ 0.10 109％
从表11可知，加标1拷贝/5μL所有复孔都有检出，1拷贝/5μL定为检测限。加标1拷贝/5μL所有复孔检出值CV为0.19，回收率为89％，将1拷贝/5μL定为定量限。本发明设计的引物探针敏感性和重复性好，可快速准确的定量检测EMCV病毒。
标准曲线和扩增图谱分别参考图2和图3，图2为标准曲线线性图，图3为标准曲线扩增图。
图2中EMCV的标准曲线的斜率和R2分别为-3.546174和0.997373，通过本发明方案制备的标准品进行qPCR检测的扩增效率在90％-110％，结果可信度高。
图3中EMCV的扩增图谱可以看出，扩增曲线光滑，有明显的指数扩增期、平台期。
综上所述，本发明设计并优化检测EMCV病毒的引物和探针，使得引物探针协同配合，具有高特异性和灵敏性，扩增效果好，所得扩增曲线呈现明显的指数期、平台期；利用qPCR定量检测EMCV病毒，相较于经典的病毒噬斑实验，相对标准偏差小，在线性标准曲线、线性相关系数、范围(包括检测病毒拷贝数下限和上限)、准确度、精密度、灵敏度、检测限等方面符合ICH法规要求，在药物开发制备中具有重要的应用价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合及其应用，其特征在于，
所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核酸序列包括SEQ ID NO:1所示的序列，所示下游引物的核酸序列包括SEQ ID NO:2所示的序列；
所述探针的核酸序列包括SEQ ID NO:3所示的序列。
2.根据权利1所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合及其应用，其特征在于，所述探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合及其应用，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、TET、VIC、CY5、HEX或ROX中任意一种；
所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、MGB或TAMRA中任意一种。
4.一种检测脑心肌炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合。
5.根据权利要求4所述的检测脑心肌炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括脑心肌炎病毒核酸标准品和荧光定量PCR反应试剂。
6.权利要求1-3任一项所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合在以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测脑心肌炎病毒中的应用。
7.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测脑心肌炎病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
以待测样本中核酸为模板，利用权利要求1-3任一项所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合进行荧光定量PCR，得到Ct值及扩增曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量分析。
8.根据权利要求7所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测脑心肌炎病毒的方法，其特征在于，所述荧光定量标准曲线的构建方法包括：
对已知浓度的脑心肌炎病毒核酸标准品进行荧光定量PCR，得到Ct值及扩增曲线，根据所述标准品的浓度和Ct值，以Ct值为纵坐标，以Log(浓度)值为横坐标，绘制荧光定量标准曲线；
所述引物的工作浓度为800～1000nM；
所述探针的工作浓度为100～300nM。
9.一种检测脑心肌炎病毒的系统，其特征在于，所述系统包括：
样品制备模块：用于采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系，所述荧光定量PCR体系包括权利要求1-3任一项所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合；
检测模块：用于对荧光定量PCR体系进行荧光定量PCR；
分析模块：用于根据荧光定量标准曲线，对待测样品进行定性和定量分析。
10.权利要求1-3任一项所述的用于检测脑心肌炎病毒的引物和探针组合、权利要求4或5所述的检测脑心肌炎病毒的试剂盒或权利要求9所述的检测脑心肌炎病毒的系统在制备检测脑心肌炎病毒的产品中的应用。
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