CN116334308A - 一种检测牛腹泻病毒的引物和探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测牛腹泻病毒的引物和探针及其应用，所述引物包括上游引物FP和下游引物RP；所述上游引物FP的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示，所述下游引物RP的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示；所述探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示。本发明设计并优化后的BVDV引物和探针，具有高特异性和灵敏性，进行基因扩增，扩增曲线呈现明显的指数期、平台期；本发明利用qPCR定量检测BVDV病毒，相较于经典的病毒噬斑实验，相对标准偏差小。所述方法在线性标准曲线、线性相关系数、范围、准确度、精密度、灵敏度和检测限等方面符合ICH法规要求。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测牛腹泻病毒的引物和探针及其应用。
背景技术
血液制品又称血浆衍生物，是指从血浆中8％的血浆蛋白中分离提纯得到的物质。20世纪90年代以来，血液制品提取技术逐渐成熟，产品种类日益完善，并开始广泛应用于临床。
临床上广泛应用的血液制品，因其原料血浆来源于人体，具有潜在的病毒污染的风险。在血液制品的应用史上，亦曾发生过病毒疾病传播的案例。严格控制血液制品的病毒安全性是血液制品应用领域一直关注的主题。对血液制品的病毒安全性技术，特别是病毒灭活和去除都有严格的要求和规定。
目前已知经血液制品传染的病毒主要有乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)和人细小病毒(B19)。其中HCV的模型病毒牛腹泻病毒(BVDV)是一种包膜RNA病毒，会引起牛的以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为特征的疾病。同时牛血清广泛地应用于实验室细胞的培养，若细胞及其生产的生物制品受到BVDV的污染，也会产生重大的风险。
在病毒清除实验中，为了检测纯化步骤对模型病毒的去除效果，通常使用基于指示细胞的病毒噬斑法或TCID50法对病毒进行病毒滴度检测。基于指示细胞的病毒滴度检测，在正式实验前，需要首先进行预实验，包括毒性实验和干扰实验。根据预实验结果，完成病毒滴度检测实验。基于指示细胞的病毒滴度检测方法受到指示细胞状态和培养时间的影响，导致实验结果的差异。在接种含有病毒的测试样品后，通常需要花费5-10天的时间才能获得数据，而包括预实验在内的最终实验数据的获得则需要2-3个月的时间。
聚合酶链式反应(PCR)是检测目标核酸片段的有力工具，PCR通过热循环驱动扩增。定量PCR(qPCR，Q-PCR)被广泛用于细胞中mRNA的定量以及检测目标蛋白的表达水平。该技术已被开发应用于病毒检测以及病毒清除研究。qPCR主要的方法学是通过实时监测荧光强度来检测PCR产物的含量。而在常规PCR中，扩增产物通过电泳进行分离和可视化。qPCR中使用的DNA聚合酶具有5’至3’的核酸内切酶活性，通过水解标记有荧光素和淬灭染料的寡核苷酸探针，产生荧光信号。将qPCR和荧光素标记探针相结合，理论上可以检测单个病毒DNA/RNA，在实际应用中，无论病毒的活性如何，qPCR都可以检测到样品中个位数的病毒DNA/RNA。
目前，将qPCR用于病毒清除验证的例子是检测Protein A亲和柱工艺流程中单一种类的包膜病毒，因为目标产物的洗脱液是低pH缓冲液，可以灭活包膜病毒，所以基于指示细胞的测试无法检测到任何病毒感染性。BVDV是包膜RNA病毒，目前并没有一种针对BVDV病毒的清除验证的qPCR方法，因此，开发一种利用实时荧光定量PCR技术快速检测BVDV病毒的方法在病毒清除验证中具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种检测牛腹泻病毒的引物和探针及其应用。本发明设计并优化后的BVDV引物和探针，具有高特异性和灵敏性，进行基因扩增，扩增曲线呈现明显的指数期、平台期；本发明利用qPCR定量检测BVDV病毒，相较于经典的病毒噬斑实验，相对标准偏差小。所述方法在线性标准曲线、线性相关系数、范围(包括检测病毒拷贝数下限和上限)、准确度、精密度、灵敏度、检测限等方面符合ICH法规要求。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种检测牛腹泻病毒的引物和探针，所述引物包括上游引物FP和下游引物RP；
所述上游引物FP的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示，所述下游引物RP的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示；
所述探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示。
本发明通过病毒RNA序列进行Blast比对，设计了牛腹泻病毒的特异性引物探针。通过比对序列GC含量，Tm值和二级结构等，选择性合成引物探针，并通过PCR实验进一步调整引物探针浓度、退火温度和延伸温度等，确定优化后的反应参数。确定正向引物(FP)、逆向引物(RP)和探针(Probe)如下所示：
SEQ ID NO:1：5’-GCCCAGGTAAAAGCAGTTCTAA-3’。
SEQ ID NO:2：5’-AACTCCATGTGCCATGTACAG-3’。
SEQ ID NO:3：5’-CCTGATAGGGTGCTGCAGAGGC-3’。
本发明中所述引物的特异性好，通过使用上述引物对常用病毒进行特异性扩增，结果显示所述引物对X-MuLV病毒、PrV病毒和MVM病毒的基因组无扩增，特异性好。
优选地，所述探针的5’端修饰荧光素，所述探针的3’端修饰淬灭剂。
优选地，所述荧光素选自FAM、TET、VIC或HEX任意一种。
优选地，所述淬灭剂选自TAMRA或BHQ任意一种。
第二方面，本发明提供一种检测牛腹泻病毒的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测牛腹泻病毒的引物和探针。
优选地，所述试剂盒还包括病毒核酸标准品和荧光定量PCR反应试剂。
优选地，所述病毒核酸标准品采用包括如下步骤的方法制备得到：通过稀释病毒原液和经典的病毒噬斑实验，将103-104PFU的病毒稀释液调整为103-104拷贝的标准化Ct值；根据调整后的稀释液和稀释因子，从高滴度病毒库纯化制备106拷贝的病毒核酸标准品；将106拷贝病毒核酸标准品按10倍梯度稀释产生1-105拷贝的目标病毒基因标准品。
本发明中病毒核酸标准品的制备方法：
(1)使用UltraSens Virus Kit提取病毒核酸；
(2)将病毒核酸10倍梯度稀释，通过PCR得到各稀释度Ct值；
(3)比较检测Ct值和标准化Ct值，计算得到稀释倍数；
(4)将步骤(1)中核酸进行相应稀释，制备成病毒基因组标准品。
本发明中病毒核酸标准品病毒基因组标准品相比于RNA片段标准品不需要通过DNA片段进行反转录；不易降解，稳定性好。相比于DNA或质粒标准品，反转录效率一致，不影响扩增效率的评估。该方法制备的标准品主要用于病毒清除研究中病毒清除效果的计算。
优选地，所述荧光定量PCR反应试剂包括One Step PrimeScript III RT-qPCRMix。
本发明中所述荧光定量PCR反应可采用的常规的反转录酶和DNA聚合酶进行扩增检测，根据不同酶调整合适的扩增程序。
第三方面，本发明提供一种第二方面所述的检测牛腹泻病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系；
(2)对待测样品和阳性标准品进行荧光定量PCR反应，得到待测样品和阳性标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线；
(3)根据阳性标准品的浓度和Ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。
优选地，所述荧光定量PCR反应的反应体系以终浓度计包括：One StepPrimeScript III RT-qPCR Mix 1×、上游引物FP 180-200nM、下游引物RP 180-200nM、探针180-200nM，所述上游引物FP、下游引物RP和探针的终浓度优选为200nM。
本发明中，所述荧光定量PCR反应的反应体系中上游引物FP的终浓度为180-200nM，例如可以是180nM、190nM或200nM等；下游引物RP的终浓度为180-200nM，例如可以是180nM、190nM或200nM等；探针的终浓度为180-200nM，例如可以是180nM、190nM或200nM等。
优选地，所述荧光定量PCR反应的程序为：
步骤1：47-49℃(例如可以是47℃、48℃或49℃等)，8-12min(例如可以是8min、9min、10min、11min或12min等)；
步骤2：94-96℃(例如可以是94℃、95℃或96℃等)，4-6min(例如可以是4min、5min或6min等)；
步骤3：94-96℃(例如可以是94℃、95℃或96℃等)，12-18sec(例如可以是12sec、14sec、16sec或18sec等)；
步骤4：58-62℃(例如可以是58℃、59℃、60℃、61℃或62℃等)，0.8-1.2min(例如可以是0.8min、0.9min、1.0min、1.1min或1.2min等)；
步骤3和步骤4，40-42个循环(例如可以是40、41或42)。
作为本发明的优选技术方案，所述使用方法包括以下步骤：
(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系；所述荧光定量PCR反应的反应体系以终浓度计包括：One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix 1×、上游引物FP 180-200nM、下游引物RP 180-200nM、探针180-200nM、模板5μL、用ddH2O补足25μL体系。
(2)对待测样品和阳性标准品进行荧光定量PCR反应，所述荧光定量PCR反应的程序为：步骤1：47-49℃，8-12min；步骤2：94-96℃，4-6min；步骤3：94-96℃，12-18sec；步骤4：58-62℃，0.8-1.2min；步骤3和步骤4，40-42个循环；得到待测样品和阳性标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线。
(3)根据阳性标准品的浓度和Ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。
第四方面，本发明提供一种检测牛腹泻病毒的方法，所述方法包括：
(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系，所述PCR体系包括第一方面所述的检测牛腹泻病毒的引物和探针；
(2)对待测样品和阳性标准品进行荧光定量PCR反应，得到待测样品和阳性标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线；
(3)根据阳性标准品的浓度和Ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。
优选地，所述荧光定量PCR反应的反应体系以终浓度计包括：One StepPrimeScript III RT-qPCR Mix 1×、上游引物FP 180-200nM、下游引物RP 180-200nM、探针180-200nM。
优选地，所述荧光定量PCR反应的程序为：步骤1：47-49℃，8-12min；步骤2：94-96℃，4-6min；步骤3：94-96℃，12-18sec；步骤4：58-62℃，0.8-1.2min；步骤3和步骤4，40-42个循环。
第五方面，本发明提供一种检测牛腹泻病毒的系统，所述系统包括：
(1)样品制备模块：采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系，所述PCR体系包括第一方面所述的检测牛腹泻病毒的引物和探针；
(2)检测模块：对荧光定量PCR体系进行荧光定量PCR反应；
(3)分析模块：根据荧光定量标准曲线，对待测样品进行定性和定量检测。
优选地，所述荧光定量PCR反应的反应体系以终浓度计包括：One StepPrimeScript III RT-qPCR Mix 1×、上游引物FP 180-200nM、下游引物RP 180-200nM、探针180-200nM。
优选地，所述荧光定量PCR反应的程序为：步骤1：47-49℃，8-12min；步骤2：94-96℃，4-6min；步骤3：94-96℃，12-18sec；步骤4：58-62℃，0.8-1.2min；步骤3和步骤4，40-42个循环。
第六方面，本发明提供第一方面所述的检测牛腹泻病毒的引物和探针、第二方面所述的检测牛腹泻病毒的试剂盒或第五方面所述的检测牛腹泻病毒的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测牛腹泻病毒的产品中的应用。
本发明中第一方面所述的检测牛腹泻病毒的引物和探针、第二方面所述的检测牛腹泻病毒的试剂盒或第五方面所述的检测牛腹泻病毒的系统在生物安全、病毒检测、血液制品和病毒清除验证中具有重要的应用价值。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明设计并优化后的BVDV病毒的引物和探针，具有高特异性和灵敏性，进行基因扩增后，扩增曲线呈现明显的指数期、平台期。
(2)本发明利用BVDV病毒原液的滴度和经典的病毒噬斑实验，将病毒原液稀释并制备成106核酸标准品。使用标准品进行梯度稀释，制成1到105拷贝数的目标病毒基因标准品，进而生成标准曲线。使用该标准品生成的标准曲线，线性关系和相关系数好，孔间差异小，重复性高。
(3)利用qPCR定量检测BVDV病毒，相较于经典的病毒噬斑实验，相对标准偏差小。所述方法在线性标准曲线、线性相关系数、范围(包括检测病毒拷贝数下限和上限)、准确度、精密度、灵敏度、检测限等方面符合ICH法规要求。
附图说明
图1是特异性检测的结果图；
图2是标准曲线线性图；
图3是标准曲线扩增图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种检测BVDV病毒的引物和探针。本发明通过病毒RNA序列进行Blast比对，设计多对BVDV病毒的特异性引物探针。通过比对序列GC含量，Tm值和二级结构等，选择性合成引物探针。引物探针如下所示：
上游引物FP(SEQ ID NO:1)：5’-GCCCAGGTAAAAGCAGTTCTAA-3’
下游引物RP(SEQ ID NO:2)：5’-AACTCCATGTGCCATGTACAG-3’
探针Probe(SEQ ID NO:3)：5’-CCTGATAGGGTGCTGCAGAGGC-3’
所述引物为针对BVDV病毒NADL序列；
所述探针的5’端修饰荧光素FAM，所述探针的3’端修饰淬灭剂BHQ1。
对比例1
本对比例提供一种检测BVDV病毒的引物和探针。所述引物和探针如下所示：
上游引物-2(SEQ ID NO:4)：5’-CCAAAGCACATCTTAACCTGAG-3’
下游引物-2(SEQ ID NO:5)：5’-CTGACGGGTTTTTGTTTGTAAG-3’
上游引物-3(SEQ ID NO:6)：5’-GGAATAAAGGTCTCGAGATGC-3’
下游引物-3(SEQ ID NO:7)：5’-GAGATTTTTAGTAGCAGAACAGTGG-3’
所述引物-2和引物-3的探针为SEQ ID NO:3。
实施例2
本实施例提供一种检测检测BVDV病毒的试剂盒，所述试剂盒包括实施例1所述的检测BVDV病毒的引物和探针、病毒核酸标准品和荧光定量PCR反应试剂。
所述病毒核酸标准品采用如下步骤制备得到：
(1)使用UltraSens Virus Kit提取病毒核酸；
(2)将病毒核酸10倍梯度稀释，通过PCR得到各稀释度Ct值；
(3)比较检测Ct值和标准化Ct值，计算得到稀释倍数；
(4)将步骤(1)中核酸进行相应稀释，制备成病毒基因组标准品。
所述荧光定量PCR反应试剂包括：One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix(Takara Code RR600)。
实施例3
本实施例使用实施例2所述的检测BVDV病毒的试剂盒对BVDV病毒进行检测。检测的具体步骤如下所示：
(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系。荧光定量PCR体系如下所示：
待测样品的荧光定量PCR体系中模板为1拷贝病毒基因组/5μL。
阳性标准品：对BVDV病毒基因组核酸标准品进行10倍梯度稀释，从106拷贝/5μL稀释至1拷贝/5μL。
(2)对待测样品和阳性标准品进行荧光定量PCR反应，得到待测样品和阳性标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线。
荧光定量PCR反应的扩增程序如下所示：
步骤1：48℃，10min；步骤2：95℃，5min；步骤3：95℃，15sec；步骤4：60℃，1min；步骤3和步骤4，40个循环。
(3)根据阳性标准品的浓度和Ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。实验结果如表1所示。
表1
| 拷贝/5μL | 检测结果平均值(拷贝/5μL) | 标准偏差 |
| 1 | 0.95 | 0.41 |
表1的结果表明，所述引物和探针能够特异性的检测到1拷贝/5μL的牛腹泻病毒，检测灵敏度高。
实施例4
本实施例使用实施例2所述的检测BVDV病毒的试剂盒对BVDV病毒进行检测。本实施例参照实施例3的步骤对1拷贝/5μL和100拷贝/5μL的标准品，所述荧光定量PCR体系中上游引物FP、下游引物RP和探针的终浓度为200nM。实验结果如表2所示。
表2
| 拷贝/5μL | Ct值 | 标准偏差 |
| 1 | 34.86 | 0.34 |
| 100 | 29.07 | 0.13 |
实施例5
本实施例使用实施例2所述的检测BVDV病毒的试剂盒对BVDV病毒进行检测。本实施例与实施例3的区别仅在于，所述荧光定量PCR体系中上游引物FP、下游引物RP和探针的终浓度为180nM，其余步骤参照实施例3。实验结果如表3所示。
表3
| 拷贝/5μL | Ct值 | 标准偏差 |
| 1 | 35.07 | 0.55 |
| 100 | 28.69 | 0.30 |
从表3的结果可知，实施案例4中的引物探针浓度，相比180nM的引物探针浓度检测的结果，对1拷贝/5μL的检测灵敏度更高，标准偏差更小，检测效果更好。
实施例6
本实施例使用实施例2所述的检测BVDV病毒的试剂盒对BVDV病毒进行检测。本实施例与实施例3的区别仅在于，所述荧光定量PCR体系中上游引物FP、下游引物RP和探针的终浓度为150nM，其余步骤参照实施例3。实验结果如表4所示。
表4
| 拷贝/5μL | Ct值 | 标准偏差 |
| 1 | 35.07 | 0.81 |
| 100 | 29.02 | 0.21 |
从表4的结果可知，实施案例4中的引物探针浓度，相比150nM的引物探针浓度检测的结果，对1拷贝/5μL的检测灵敏度更高，标准偏差更小，检测效果更好。
实施例7
本实施例使用实施例2所述的检测BVDV病毒的试剂盒对BVDV病毒进行检测。本实施例与实施例3的区别仅在于所述荧光定量PCR体系中扩增程序如下：
步骤1：48℃，30min；步骤2：95℃，5min；步骤3：95℃，15sec；步骤4：60℃，40sec；步骤3和步骤4，40个循环，试验结果如表5所示。
表5
| 拷贝/5μL | Run2 | 标准偏差 |
| 1 | 35.84 | 0.78 |
| 100 | 29.38 | 0.49 |
从表5结果可知，相同的引物探针浓度，不同的扩增程序，相较于实施案例4的结果，本实施案例对1拷贝/5μL和100拷贝/5μL的检测灵敏度相对低，标准偏差大，检测效果相对差。
实施例8
本实施例使用实施例1(引物对1)和对比例1(引物对2和3)中的引物探针进行检测，对比不同引物探针的检测效果。
荧光定量PCR体系如下所示：
荧光定量PCR体系中模板为1拷贝病毒基因组/5μL。
荧光定量PCR反应的扩增程序如下所示：
步骤1：48℃，30min；步骤2：95℃，5min；步骤3：95℃，15sec；步骤4：60℃，1min；步骤3和步骤4，40个循环。
试验结果如表6所示：
表6
通过表6的结果可知，当使用相同引物探针浓度和检测程序，不同引物序列时，引物对1对1拷贝/5μL和100拷贝/5μL的检测灵敏度高，检测效果最好。
实施例9
本实施例使用实施例2所述的检测BVDV病毒的试剂盒进行特异性检测。检测样品包括BVDV病毒、X-MuLV病毒、PrV病毒和MVM病毒基因组。检测步骤如下所示：
(1)采集并处理待测样品，待测样品包括BVDV病毒、X-MuLV病毒、PrV病毒和MVM病毒基因组，分别配制荧光定量PCR体系。荧光定量PCR体系如下所示：
荧光定量PCR体系中模板为1000拷贝病毒基因组/5μL。
(2)对待测样品进行荧光定量PCR反应，得到荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线。
荧光定量PCR反应的扩增程序如下所示：
步骤1：48℃，10min；步骤2：95℃，5min；步骤3：95℃，15sec；步骤4：60℃，1min；步骤3和步骤4，40个循环。
试验结果：其中X-MuLV病毒、PrV病毒和MVM病毒基因组的检测结果如图1所示，结果显示为无意义扩增，说明所设计的引物探针无法扩增X-MuLV、PrV和MVM病毒基因组，表明所述引物探针的特异性好。
实施例10
本实施例使用实施例2所述的检测BVDV病毒的试剂盒进行检测能力测试。
(1)参照实施例3中的检测步骤，配制荧光定量PCR反应体系，并分装于96孔PCR板。
(2)对BVDV病毒基因组核酸标准品进行10倍梯度稀释，从106拷贝/5μL稀释至1拷贝/5μL，并同时检测1拷贝/5μL、5拷贝/5μL和10拷贝/5μL，每个浓度12个复孔。
(3)参照实施例3中的扩增参数进行qPCR扩增。
检测结果如表7所示，表7为各浓度基因组核酸的检测概率、回收率和CV。
表7
| 拷贝/5μL | 平均值 | 标准偏差 | 检出概率 | CV | 回收率 |
| 1 | 0.95 | 0.41 | 100％ | 0.44 | 95％ |
| 5 | 5.19 | 1.98 | 100％ | 0.38 | 104％ |
| 10 | 12.55 | 2.47 | 100％ | 0.20 | 125％ |
从表7可知，加标1拷贝/5μL所有复孔都有检出，1拷贝/5μL定为检测限。加标10拷贝/5μL所有复孔检出值CV为0.20，回收率为125％，将10拷贝/5μL定为定量限。本技术方案设计的引物探针敏感性和重复性好，该方法可快速准确定量检测BVDV病毒。
标准曲线和扩增图谱分别参考图2和图3。图2为标准曲线线性图，图3为标准曲线扩增图。
图2中BVDV的标准曲线的斜率和R2分别为-3.549113和0.997985，通过本技术方案制备的标准品进行qPCR检测的扩增效率在90％-110％，结果可信度高。
图3中BVDV的扩增图谱可以看出，扩增曲线光滑，有明显的指数扩增期、平台期。
综上，本发明设计并优化后的BVDV病毒的引物和探针具有高特异性和灵敏性，扩增效果好，所得扩增曲线呈现明显的指数期、平台期；本发明利用qPCR定量检测BVDV病毒，相较于经典的病毒噬斑实验，相对标准偏差小。所述方法在线性标准曲线、线性相关系数、范围(包括检测病毒拷贝数下限和上限)、准确度、精密度、灵敏度、检测限等方面符合ICH法规要求，在药物开发制备中具有重要的应用价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种检测牛腹泻病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物FP和下游引物RP；
所述上游引物FP的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示，所述下游引物RP的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示；
所述探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的检测牛腹泻病毒的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端修饰荧光素，所述探针的3’端修饰淬灭剂；
优选地，所述荧光素选自FAM、TET、VIC或HEX任意一种；
优选地，所述淬灭剂选自TAMRA或BHQ任意一种。
3.一种检测牛腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的检测牛腹泻病毒的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的检测牛腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括病毒核酸标准品和荧光定量PCR反应试剂；
优选地，所述病毒核酸标准品采用包括如下步骤的方法制备得到：通过稀释病毒原液和经典的病毒噬斑实验，将103-104PFU的病毒稀释液调整为103-104拷贝的标准化Ct值；根据调整后的稀释液和稀释因子，从高滴度病毒库纯化制备106拷贝的病毒核酸标准品；将106拷贝病毒核酸标准品按10倍梯度稀释产生1-105拷贝的目标病毒基因标准品；
优选地，所述荧光定量PCR反应试剂包括One Step PrimeScriptIIIRT-qPCR Mix。
5.一种权利要求3或4所述的检测牛腹泻病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系；
(2)对待测样品和阳性标准品进行荧光定量PCR反应，得到待测样品和阳性标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线；
(3)根据阳性标准品的浓度和Ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。
6.根据权利要求5所述的检测牛腹泻病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的反应体系以终浓度计包括：One StepPrimeScriptIIIRT-qPCR Mix 1×、上游引物FP 180-200nM、下游引物RP 180-200nM、探针180-200nM。
7.根据权利要求5或6所述的检测牛腹泻病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的程序为：步骤1：47-49℃，8-12min；步骤2：94-96℃，4-6min；步骤3：94-96℃，12-18sec；步骤4：58-62℃，0.8-1.2min；步骤3和步骤4，40-42个循环。
8.一种检测牛腹泻病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系，所述PCR体系包括权利要求1或2所述的检测牛腹泻病毒的引物和探针；
(2)对待测样品和阳性标准品进行荧光定量PCR反应，得到待测样品和阳性标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线；
(3)根据阳性标准品的浓度和Ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测；
优选地，所述荧光定量PCR反应的反应体系以终浓度计包括：One StepPrimeScriptIIIRT-qPCR Mix 1×、上游引物FP 180-200nM、下游引物RP 180-200nM、探针180-200nM；
优选地，所述荧光定量PCR反应的程序为：步骤1：47-49℃，8-12min；步骤2：94-96℃，4-6min；步骤3：94-96℃，12-18sec；步骤4：58-62℃，0.8-1.2min；步骤3和步骤4，40-42个循环。
9.一种检测牛腹泻病毒的系统，其特征在于，所述系统包括：
(1)样品制备模块：采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系，所述PCR体系包括权利要求1或2所述的检测牛腹泻病毒的引物和探针；
(2)检测模块：对荧光定量PCR体系进行荧光定量PCR反应；
(3)分析模块：根据荧光定量标准曲线，对待测样品进行定性和定量检测。
10.权利要求1或2所述的检测牛腹泻病毒的引物和探针、权利要求3或4所述的检测牛腹泻病毒的试剂盒或权利要求9所述的检测牛腹泻病毒的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测牛腹泻病毒的产品中的应用。
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| CN202211659069.6A CN116334308A (zh) | 2022-12-22 | 2022-12-22 | 一种检测牛腹泻病毒的引物和探针及其应用 |
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