CZ296806B6 - Rozpustný fúzní protein a zpusob výroby rozpustného rekombinantního botulinového toxinu - Google Patents

Abstract

Rozpustný fúzní protein, zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a cást toxinu typu A Clostridium botulinum, pricemz tato cást toxinu typu A Clostridium botulinum zahrnuje cást sekvence SEQ ID NO:28 o alespon ctyrech aminokyselinách.

Description

Rozpustný fúzní protein a způsob výroby rozpustného rekombinantního botulinového toxinu

Oblast techniky

Vynález se týká terapie pomocí klostridiálního antitoxinu a vakcíny pro lidi a jiné živočichy. Týká se rovněž antitoxinů, které neutralizují patologické účinky klostridiálních toxinů, a vakcín, které zamezují morbiditě a mortalitě spojené s klostridiálními onemocněními.

Dosavadní stav techniky

Rod Clostridium zahrnuje gram-pozitivní anaerobní sporogenní bacily. Přirozeným habitatem těchto organizmů je prostředí a intestinální trakt člověka a jiných živočichů. Klostridia jsou opravdu ubikvitní; nacházejí se běžně v půdě, prachu, odpadu, mořských sedimentech, hynoucí vegetaci a blátě [viz například P.H.A. Sneath a d., „Clostridium“, Bergey's Manual® of Systematic Bacteriology, sv. 2, str. 1141-2000, Williams & Wilkins (1986)]. Navzdory identifikaci přibližně 100 druhů Clostridium byl pouze malý počet označen za etiologického činitele medicinálního a veterinárního významu. Tyto druhy jsou však spojeny s velmi vážnými onemocněními, mezi něž patří botulismus, tetanus, anaerobní celulitis, plynová sněť, bakteremie, pseudomembránová kolitis a klostridiální gastroenteritis. Některé lékařsky a veterinárně významné druhy a choroby, s nímž jsou spojeny, jsou uvedeny v tabulce 1. Protože v podstatě všechny tyto druhy byly izolovány z fekálních vzorků zdánlivě zdravých osob, mohou být některé tyto izoláty pouze přechodnými, nikoli trvalými obyvateli střevní flóry.

-1 CZ 296806 B6

Tabulka 1. Druhy Clostridium mající význam pro humánní nebo veterinární medicínu*

druh	onemocnění
C. aminovalerícum	bakteriurie (těhotné ženy)
C. argentinense	infekce ran, bakteremie, botulismus, infekce plodové vody
C. baratii	infekce válečných ran, peritonitis, infekční procesy oka, ucha a prostaty
C. beijerinckikii	infekce ran
C. bifermenians	infekce ran, abscesy, plynová sněť, bakteremie
C. botulinum	otravy jídlem, botulismus (ran, jídla, dětský)
C. butyrícum	infekce močového traktu, dolních cest dýchacích, pohrudniční a břišní dutiny, infekce ran, abscesy, bakteremie
C. cadaveris	abscesy, infekce ran
C. ca mis	infekce měkkých tkání, bakteremie
C. chauvoei	toxemie
C. clostrídioforme	infekce břicha, čípku, šourku, pohrudnice a jiné, septicemie, peritonitis, apendicitis
C. cochtearum	izolováno z lidských chorobných procesů, ale role v onemocnění neznáma
C. difficile	průjem související s bakteriostatiky, pseudomembránová enterokolitis, bakteremie, hnisavé infekce
C. fallax	infekce měkkých tkání
C. ghnoii	infekce měkkých tkání
C. glycolicum	infekce ran, abscesy, peritonitis
C. hastiforme	infekce válečných ran, bakteremie, abscesy
C. histolyticum	infekce válečných ran, plynová sněť, izolát z gingiválního plaku
C. indolis	infekce gastrointestinálního traktu
C. innocuum	infekce gastrointestinálního traktu, empyem

-2CZ 296806 B6

Tabulka 1 - pokračování

C. irregulare	pěnil ní léze
C. leptům	izolováno z lidských chorobných procesů, ale role v onemocnění neznáma
C. limosum	bakteremie, peritonitis, pulmonálni infekce
C. ma/enom/natum	různé infekční procesy
C. novy i	infekce ran, plynová sněť, toxemie, zánět hlavové tkáně (u ovcí), krvavá moč (u hovězího dobytka)
C. oroticum	infekce močových cest, rektální abscesy
C. paraputrifícum	bakteremie, peritonitis, infekce ran, apendicitis
C. perfringens	plynová sněť, anaerobní celulitis, intraabdominální abscesy, infekce měkkých tkání, otravy jídlem, nekrotizujicí pneumonie, empyem, meningitis, bakteremie, infekce dělohy, enteritis necrotans, jehněčí červenka, ovčí enterotoxemie
C. putrefaciens	bakteriurie (těhotné ženy s bakteremií)
C. putríficum	abscesy, infekce ran, bakteremie
C. ramosum	infekce břišní dutiny, genitálního traktu, plic a žlučových cest, bakteremie
C. sartagoforme	izolováno z lidských chorobných procesů, ale role v onemocnění neznáma
C. septicum	plynová sněť, bakteremie, hnisavé infekce, nekrotizujicí enterokolitis, motolice
C. sordellii	plynová sněť, infekce ran, penilní léze, bakteremie. abscesy, abdominální a vaginální infekce
C. sphenoides	apendicitis, bakteremie, infekce kostí a měkkých tkání, intraperitoneální infekce, infekce válečných ran, viscerální plynová sněť, renální abscesy
C, sporogenes	plynová sněť, bakteremie, endokarditis, infekce centrálního nervového systému a pleuropulmonální infekce, penilní léze, infekce válečných ran, jiné hnisavé infekce

-3CZ 296806 B6

Tabulka 1 - pokračování

C. subterminale	bakteremie, empyem, infekce žlučových cest, měkkých tkání a kostí
C. symbiosum	jaterní abscesy, bakteremie, infekce v důsledku střevní flóry
C. tertium	plynová sněť, apendicitis, mozkové abscesy, infekce intestinálního traktu a měkkých tkání, infekce válečných ran, periodontitis, bakteremie
C. tetani	tetanus, infekce dásní a zubů, korneální ulcerace, infekce bradavky a středního ucha, intraperitoneální infekce, novorozenecký tetanus, poporodní infekce dělohy, infekce měkkých tkání, zvláště související s traumatem (včetně odřenin a tržných ran, infekce související s použitím kontaminovaných jehel
C. thermosaccharolyticum	izolováno z lidských chorobných procesů, ale role v onemocnění neznáma

* Kompilováno z P. G. Engelkirk a d., „Classification“. Principles and Practice of Clinical Anaerobic Bacteriology, str. 22 až 23, Star Publishing Co., Belmont, CA (1992); J. Stephen a R. A. Petrowski, „Toxins Which Traverse Membranes and Deregulate Cells“, in: Bacterial Toxins, 2. vyd., str. 66 až 67, Američan Society for Microbiology (1986); R. Berkow a A. J. Fletcher (ed.), „Bacterial Diseases“, Měrek Manual of Diagnosis and Therapy, 16. vyd., str. 116-126, Měrek Research Laboratories, Rahway, N. J. (1992); a O. H. Sigmund a C. M. Fraser (ed.), „Clostridial Infections“, Měrek Veterinary Manual, 5. vyd., str. 396 až 409, Měrek & Co., Rahway, N. J. (1979).

Ve většině případů souvisí patogenita těchto organizmů s uvolňováním silných exotoxinů nebo vysoce destruktivních enzymů. Některé druhy rodu Clostridium skutečně produkují toxiny a jiné enzymy velkého lékařského a veterinárního významu [C. L. Hatheway, Clin. Microbiol. Rev. 3:66-98(1990)].

Patrně pro jejich význam pro humánní a veterinární medicínu byl prováděn rozsáhlý výzkum těchto toxinů, zejména toxinů C. botulinum a C. difficile.

C. botulinum

Několik kmenů Clostridium botulinum produkuje toxiny, mající význam pro humánní a veterinární zdravotnictví [C. L. Hatheway, Clin. Microbiol. Rev. 3:66-98 (1990)]. Účinky těchto toxinů sahají od diaroických onemocnění, která mohou způsobit destrukci tlustého střeva, k paralytickým účinkům, které mohou vyvolat smrt. Nebezpečí vývinu klostridiálních onemocnění hrozí zejména novorozencům a lidem a živočichům ve špatném zdravotním stavu (například trpícím chorobami souvisejícími s vysokým věkem nebo imunodefíciencí).

-4CZ 296806 B6

Clostridium botulinum produkuje nejjedovatější známý biologický toxin. Letální lidská dávka činí pouze 10“⁹ mg/kg tělesné hmotnosti toxinu v krevním řečišti. Botulinový toxin blokuje nervový přenos do svalů a vede k ochablosti a paralýze. Dostane-li se toxin do dýchacích cest a dýchacích svalů, vede k selhání dýchání, které může vyvolat smrt [S. Arnon, J. Infect.

Dis. 154:201-206(1986)].

Spory C. botulinum jsou přenášeny prachem a nalézají se na rostlinách sklízených z půdy, na čerstvém ovoci a na zemědělských produktech jako je med. Za podmínek organizmu příznivých spory klíčí na vegetativní buňky, které produkují toxin [S. Arnon, Ann. Rev. Med. 31-541 (1980)].

Onemocnění botulismem je možno rozdělit na čtyři typy podle způsobu vniknutí toxinu do krevního řečiště. Botulismus přenášený potravou vzniká po požití nesprávně uchovávaného a nepřiměřeně tepelně upravovaného jídla, které obsahuje botulinový toxin. V letech 1976 a 1984 bylo ve Spojených státech 355 případů botulismu přenášeného potravou [K. L. MacDonald a d., Am. J. Epidemiol. 124:794 (1986)]. Úmrtnost v důsledku botulinového toxinu je 12 % a ve zvláště rizikových skupinách může být vyšší [C. O. Tacket a d., Am. J. Med. 76:794 (1984)]. Botulismus v důsledku rány vzniká tak, že C. botulinum pronikne do poraněné tkáně a produkuje toxin, který je absorbován do krevního řečiště. Od r. 1950 bylo zaznamenáno 30 případů botulismu v důsledku rány [Μ. N. Swatz, „Anaerobic Spore-Forming Bacilli: The Clostridia“, str. 633 až 646, in: B. D. Davis a d. (ed.) Microbiology, 4. vyd., J. B. Lippincott Co. (1990)]. Inhalační botulismus vznikne, je-li toxin vdechnut. Inhalační botulismus byl zaznamenán jako důsledek náhodné expozice v laboratoři [E. Holzer, Med. Kliň. 41:1735 (1962)] a mohl by být vyvolán při použití toxinu jako činidla v biologických zbraních [D. R. Franz a d., in: Botulinum and Tetanus Neurotoxins, ed. B. R. DasGupta, Plenům Press, New York (1993), str. 473-476]. Infekční dětský botulismus při kolonizaci intestinálního traktu dítěte C. botulinum s produkcí toxinu a jeho absorpcí do krevního řečiště. Je pravděpodobné, že k vniknutí bakterie dojde, jsou-li vdechnuty spory, které následně klíčí [S. Arnon, J. Infect. Dis. 154:201 (1986)]. Od prvního rozpoznání v r. 1976 bylo zaznamenáno 500 případů [Μ. N. Swartz, viz výše].

Dětský botulismus napadá děti ve věku tří týdnů až jedenácti měsíců (více než 90 % případů představují děti mladší šesti měsíců) [S. Arnon, J. Infect. Dis. 154:201 (1986)]. Má se za to, že děti jsou náchylné z velké části v důsledku absence plného komplementu střevní mikroflóry dospělých. Benigní mikroflóra, přítomná ve střevech dospělého, poskytuje kyselé prostředí, které není příznivé pro kolonizaci C. botulinum. Děti začínají život se sterilními střevy, která jsou postupně kolonizována mikroflórou. V důsledku přítomnosti omezené mikroflóry v raném dětství není střevní prostředí kyselé a umožňuje tak klíčení a růst spor a produkci toxinů. V tomto ohledu se stávají náchylnější k botulismu také někteří dospělí, kteří prodělali léčbu antibiotiky, která mění střevní mikroflóru.

Dalším faktorem, přispívajícím k náchylnosti dětí k infekčnímu botulismu, je nezralost imunitního systému dítěte. Zralý imunitní systém je senzibilizován na bakteriální antigeny a produkuje ochranné protilátky. Vylučovaný IgA, produkovaný ve střevech dospělých, má schopnost aglutinovat vegetativní buňky C. botulinum [S.Amon, J. Infect. Dis. 154:201 (1986)]. Sekreční IgA může působit také tak, že brání střevním bakteriím a jejich produktům, aby křížily buňky střeva [S. Arnon, Epidemiol. Rev. 3:45 (1981)]. Dětský imunitní systém k tomu není primárně imunizován.

Klinické příznaky dětského botulismu sahají od lehké paralýzy přes mírnou a silnou paralýzu vyžadující hospitalizaci k prudké paralýze, vedoucí k náhlé smrti [S. Arnon, Epidemiol. Rev. 3:45 (1981)].

Hlavní terapie silného dětského botulismu spočívá v pomocné ventilaci s použitím mechanického respirátoru a v současné eliminaci toxinů a bakterií s použitím projímadel, klyzmat a výplachu žaludku. V Kalifornii došlo za jediný rok k 68 hospitalizacím případů dětského botulismu

-5 CZ 296806 B6 s celkovými náklady na léčbu přes 4 miliony dolarů [T. L. Frankovich a S. Arnon, West. J. Med.

154:103 (1991)].

Každý z různých kmenů Clostridium botulinum produkuje antigenně odlišný toxin, označený písmenem A až G. Toxin sérotypu A se účastnil v 26 % případů botulismu přenášeného potravou; typy Β, E a F se rovněž účastnily menšího procenta případů botulismu přenášeného potravou [H. Sugiyama, Microbiol. Rev. 44:419 (1980)]. Botulismus v důsledku rány byl zaznamenán pouze u toxinů A nebo Β [H. Sugiyama, viz výše]. Téměř všechny případy dětského botulismu byly způsobeny bakteriemi produkujícími buď toxin typu A, nebo B. (Výjimkou byl v Novém Mexiku jeden případ, způsobený Clostridium botulinum produkujícím toxin typu F, a jiný případ, způsobený Clostridium botulinum, produkujícím hybrid typu B a typu F.) [S. Arnon, Epidemiol. Rev. 3:45)]. Toxin typu C napadá vodní drůbež, dobytek, koně a norky. Toxin typu D napadá dobytek a toxin typu E napadá lidi a ptáky.

Komerčně dostupný od Connaught Industries Ltd. je trivalentní antitoxin odvozený z koňské plazmy, jako terapie pro toxiny typu A, B a E. Tento antitoxin má však několik nevýhod. Za prvé je nutno intravenózně a/nebo intramuskulámě injekčně aplikovat velmi vysoké dávky. Za druhé má tento antitoxin vážné vedlejší účinky, jako je akutní anafylaxe, která může vyvolat smrt, a sérová nemoc. Konečně je účinnost antitoxinu nejistá a léčba nákladná [C. O. Tacket a d., Am. J. Med., 76:794 (1984)].

Heptavalentní koňský botulinový antitoxin, který používá pouze část F(ab')2 molekuly protilátky, byl testován Armádou Spojených států [M. Balady, USAMRDC Newsletter, str. 6 (1991)]. Jeho tvorba byla vyvolána proti nečistým toxoidům v těchto velkých zvířatech a nejedná se o preparát s vysokým titrem.

Z imunizovaných lidských subjektů byl získán pentavalentní lidský antitoxin pro použití k léčbě dětského botulismu. Zásoba tohoto antitoxinu je omezená a nelze očekávat, že bude splňovat požadavky všech jedinců napadených botulismem. Při odběru lidského séra je navíc nutno vyřadit HIV a další potenciálně vážné lidské patogeny [P. J. Schwatz a S. S. Arnon, Western J. Med. 156:197(1992)].

Dětský botulismus byl označen za příčinu úmrtí v některých případech syndromu náhlé smrti dítěte (SIDS). Jako SIDS se oficiálně označuje smrt dítěte, která je náhlá a nečekaná a která zůstává nevysvětlena navzdory kompletnímu posmrtnému vyšetření. Na vazbu SIDS k dětskému botulismu se přišlo, když bylo zjištěno, že vzorky stolice nebo krve, odebrané z takto zemřelých dětí při autopsii, ve 3 až 4% analyzovaných případů obsahují organizmy a/nebo toxin C. botulinum [D. R. Peterson a d., Rev. Infect. Dis. 1:630 (1979)]. Naproti tomu ze 160 zdravých dětí mělo pouze 1 (0,6 %) ve stolici organizmy C. botulinum a žádný botulinový toxin (S. Arnon ad., Lancet, str. 1273 až 1276, 17. 6. 1978).

V rozvinutých zemích je SIDS příčinou číslo jedna úmrtí dětí ve věku mezi 1 měsícem a 1 rokem (S. Arnon a d., Lancet, str. 1273 až 1277, 17. 6. 1978). Během prvního roku umírá na SIDS více dětí než na jakoukoli jinou jednotlivou příčinu smrti v prvních 14 letech života. Ve Spojených státech je ročně 8000 až 10 000 obětí SIDS (Id).

Je tedy potřebná účinná terapie proti dětskému botulismu bez nebezpečných vedlejších účinků, dostupná ve velké zásobě za přiměřenou cenu, která může být aplikována bezpečně a bezbolestně, aby bylo možno provádět profylaktickou aplikaci dětem.

Byla prováděna imunizace subjektů za účelem, vyvolání imunity proti botulinovým toxinům, pro humánní použití je komerčně dostupná vakcína C. botulinum, obsahující chemicky inaktivovaný (tj. ošetřený formaldehydem) toxin typu A, B, C, D a E. Tento vakcínový preparát však má několik nevýhod. Za prvé je účinnost této vakcíny proměnlivá (konkrétně se po podání primární série vyvine ochranné množství protilátek proti typu B pouze u 78 % příjemců). Za druhé je imu-6CZ 296806 B6 nizace bolestivá (aplikace vyžaduje hluboké subkutánní očkování) s častými nepříznivými reakcemi (mírné až silné místní reakce se vyskytují po první injekci u přibližně 6 % příjemců; toto číslo vzrůstá na přibližně 11 % jedinců, kteří dostávají posilovači injekci) [informační brožura o pentavalentním (ABCDE) botulinovém toxoidu, Centers for Disease Control]. Za třetí je příprava vakcíny nebezpečná, protože laboratorní pracovníci musejí pracovat s aktivním toxinem.

Jsou tedy potřebné bezpečné a účinné vakcínové preparáty pro podávání jedincům v nebezpečí expozice toxiny C. botulinum.

C. difficile

V nedávné době bylo prokázáno, že C. difficile, což je organizmus, který svůj název získal díky potížím, s nimiž se setkává jeho izolace, je etiologickým činitelem při průjmových onemocněních (Sneath a d., str. 1165). C. difficile je přítomno bez nepříznivých účinků v gastrointestmálním traktu přibližně 3 % zdravých dospělých a 10 až 30 % novorozenců (Swartz, str. 644); podle jiných odhadů je C. difficile součástí normální gastrointestinální flóry 2 až 10 % lidí [G. F.Brooks a d. (ed.), „Infections Caused by Anaerobic Bacteria“, Jawetz, Melnick & Adelberg's Medical Microbiology, 19. vyd., str. 257 až 262, Appleton & Lange, San Mateo, CA (1991)]. Protože jsou tyto organizmy relativně rezistentní vůči nejběžněji používaným bakteriostatikům, je-li pacient léčen antibiotiky, dojde k potlačení ostatních členů normální gastrointestinální flóry a C. difficile bují a produkuje cytopatické toxiny a enterotoxiny. Bylo nalezeno ve 25 % případů mírných průjmů v důsledku léčby antibiotiky, zejména cefalosporiny, klindamycinem a ampicilinem [Μ. N. Swartz, str. 644],

Významné je, že C. difficile je obvykle spojeno s nemocničními infekcemi. Tento organizmus je často přítomen v prostředí nemocnic a ošetřovatelských zařízení a může být přítomen na rukou a oděvech nemocničního personálu, který pečuje o vysílené pacienty s oslabeným imunitním systémem. Protože mnozí z těchto pacientů jsou léčeni bakteriostatiky nebo jinými chemoterapeutiky, představuje takovýto přenos C. difficile významný rizikový faktor onemocnění (Engelkirk a d., str. 64 až 67).

C. difficile je spojeno s různými průjmovými onemocněními od samotného průjmu po výrazný průjem a nekrózu gastrointestinální sliznice s nahromaděním zánětlivých buněk a fibrinu, které tvoří v napadené oblasti pseudomembránu (Brooks a d.). Bylo zjištěno ve více než 95 % případů pseudomembránové enterokolitidy (Swartz a d., str. 644). Toto příležitostně smrtelné onemocnění je charakterizováno průjmem, vícečetnými plaky v tlustém střevě a toxickým megakolonem (Swartz, str. 644). I když se pro diagnózu někdy používá kultivace stolice, je optimální provádět diagnózu detekcí tepelně labilních toxinů, přítomných ve fekálních filtrátech pacientů s enterokolitidou způsobenou C. difficile (Swartz, str. 644 až 645, a Brooks, str. 260). Toxiny C. difficile jsou cytotoxické pro tkáňové a buněčné kultury a při intracekální injekci křečkům vyvolávají enterokolitidu (Swartz, str. 644).

Enterotoxicita C. difficile je primárně výsledkem působení dvou toxinů, označených A a B, které mají oba molekulovou hmotnost přibližně 300 000. Oba jsou silnými cytotoxiny, přičemž toxin A má přímou enterocytotoxickou účinnost [Lyerly a d., Infect. Immun. 60:4633 (1992)]. Na rozdíl od toxinů A C. perfringens, což je organizmus vzácně související s bakteriostatiky vyvolaným průjmem, není toxin C. difficile složkou sporového pláště a není produkován během sporulace (Swartz, str. 644). Toxin A C. difficile způsobuje krvácení, hromadění tekutina poškození sliznic v králičích střevních kličkách a zdá se, že zvyšuje příjem toxinů B střevní sliznicí. Toxin B nezpůsobuje hromadění tekutin ve střevech, ale je pro buňky tkáňové kultury tisíckrát toxičtější než toxin A a způsobuje poškození membrán. Přestože oba toxiny vyvolávají podobné buněčné efekty, jako je desagregace aktinu, existují rozdíly v buněčné specifitě.

Při onemocnění jsou významné oba toxiny [Boriello a d., Rev. Infect. Dis. 12 (dodatek 2):S185;

Lyerly a d., Infect. Immun. 47:349 (1985); a Rolfe, Infect. Immun. 59:1223 (1990)]. Má se za to,

-7CZ 296806 B6 že nejprve působí toxin A vazbou na štětičkové hraniční receptory, čímž zničí vnější vrstvu sliznice, a pak umožní přístup toxinu B k takto odkryté tkáni. Tyto stupně patogeneze by naznačovaly, že k profylaktické terapii CDAD by postačovala produkce neutralizujících protilátek proti toxinu A. Pro účinné terapeutikum proti pozdnímu stadiu onemocnění tlustého střeva však mohou být nezbytnou další složkou protilátky proti toxinu B. Bylo skutečně zaznamenáno, že živočichové vyžadují pro úplnou ochranu proti onemocnění protilátky proti toxinu A i B [Kim a Rolfe, Abstr. Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol., 69:62 (1987)].

Bylo zaznamenáno, že C. difficile produkuje také jiné toxiny, jako je enterotoxin jiný než toxiny A a B [Banno a d., Rev. Infect. Dis. 6(Suppl. 1:S11-S2O (1984)], nízkomolekulámí toxin [Rihn ad., Biochem. Biophys. Res. Comm. 124:690-695 (1984)], faktor měnící motilitu [Justus a d., Gastroenterol., 83:836-843 (1982)] a snad další toxiny. Bez ohledu na to je primárním problémem gastrointestinální onemocnění C. difficile.

Je význačné, že v důsledku rezistence vůči nejběžněji používaným bakteriostatikůmje C. difficile spojeno s antimikrobiální terapií s použitím prakticky všech bakteriostatik (avšak nej častěji ampicilinu, klindamycinu a cefalosporinů). Je spojeno rovněž s onemocněním pacientů podstupujících chemoterapii sloučeninami, jako je methotrexát, 5-fluorouracil, cyklofosfamid a doxorubicin [S. M. Finegold a d., Clinical Guide to Anaerobic Infections, str. 88 až 89, Star Publishing Co., Belmont, CA (1992)].

Léčba onemocnění C. difficile je vzhledem k vysoké rezistenci organizmu problematická. Jako účinné byly zaznamenány orální metronidazol, bacitracin a vankomycin (Finegold a d., str. 89). Existují však problémy, související s léčbou pomocí těchto sloučenin. Vankomycin je velmi drahý, někteří pacienti nejsou schopni přijímat orální léčbu a poměr relapsů je vysoký (20 až 25 %), i když se nemusejí vyskytovat po několik týdnů (Id).

K prevenci nebo léčbě onemocnění C. difficile by vedla neutralizace účinků těchto toxinů v gastrointestinálním traktu. Je tedy potřebná účinná terapie proti toxinu C. difficile bez nebezpečných vedlejších účinků, dostupná ve velkém množství za přiměřenou cenu, a bezpečně aplikovatelná, aby mohla být účinně prováděna profylaktická aplikace pacientům s nebezpečím vývinu pseudomembránové enterokolitidy.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje reaktivitu anti-C. botulinum IgY pomocí Western blotu.

Obr. 2 znázorňuje titr protilátky IgY proti toxoidu typu A C. botulinum ve vejcích, měřeno pomocí ELISA.

Obr. 3 znázorňuje výsledky testů neutralizace toxinu A C. difficile.

Obr. 4 znázorňuje výsledky testů neutralizace toxinu B C. difficile.

Obr. 5 znázorňuje výsledky testů neutralizace toxinu B C. difficile.

Obr. 6 představuje restrikční mapu genu toxinu A C. difficile se znázorněním sekvencí primerů 1 až 4 (SEQ ID NO: 1-4).

Obr. 7 představuje Western blot reaktivního proteinu toxinu A C. difficile.

Obr. 8 znázorňuje expresní konstrukty toxinu A C. difficile.

Obr. 9 znázorňuje expresní konstrukty toxinu A C. difficile.

-8CZ 296806 B6

Obr. 10 znázorňuje čištění rekombinantního toxinu A C. difficile.

Obr. 11 znázorňuje výsledky testů neutralizace toxinu A C. difficile s protilátkami reagujícími na rekombinantní toxin A.

Obr. 12 znázorňuje výsledky pro neutralizační destičku toxinu A C. difficile.

Obr. 13 znázorňuje výsledky pro neutralizační destičku toxinu A C. difficile.

Obr. 14 znázorňuje výsledky testů neutralizace rekombinantního toxinu A C. difficile.

Obr. 15 znázorňuje expresní konstrukty toxinu A C. difficile.

Obr. 16 znázorňuje chromatogram s vynesenou absorbancí při 280 nm proti retenčnímu času pro preparát pMA 1870-680 IgY PEG.

Obr. 17 znázorňuje dva expresní konstrukty rekombinantního toxinu B C. difficile.

Obr. 18 znázorňuje expresní konstrukty toxinu B C. difficile.

Obr. 19 znázorňuje expresní konstrukty toxinu B C. difficile.

Obr. 20 znázorňuje expresní konstrukty toxinu B C. difficile.

Obr. 21 představuje gel SDS-PAGE znázorňující čištění fúzního proteinu rekombinantního toxinu B C. difficile.

Obr. 22 představuje gel SDS-PAGE znázorňující čištění dvou proteinů rekombinantního toxinu B C. difficile, značeným histidinem.

Obr. 23 znázorňuje expresní konstrukty toxinu B C. difficile.

Obr. 24 představuje Western blot reaktivního proteinu toxinu B C. difficile.

Obr. 25 znázorňuje expresní konstrukty toxinu typu A C. botulinum', jsou znázorněny i konstrukty použité k získání sekvencí C. botulinum a C. difficile.

Obr. 26 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňují čištění fuzních proteinů rekombinačního toxinu typu A C. botulinum.

Obr. 27 znázorňuje expresní konstrukty toxinu typu A C. botulinum; jsou znázorněny i konstrukty použité k získání sekvenci C. botulinum.

Obr. 28 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňující čištění proteinu pHisBot s použitím pryskyřice Ni-NTA.

Obr. 29 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňující expresi proteinu pHisBot v hostitelských buňkách BL21 (DE3) a BL21(DE3)pLysS.

Obr. 30 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňující čištění proteinu pHisBot s použitím šaržovitého absorpčního postupu.

Obr. 31 znázorňuje expresní konstrukty toxinu A C. difficile.

-9CZ 296806 B6

Obr. 32 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, a Western blot, znázorňující expresi pUC 1960-2680 v hostitelských buňkách E. coli.

Obr. 33 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, a Western blot, znázorňující expresi několika fúzních proteinů rekombinantního toxinu A C. difficile v hostitelských buňkách E. coli.

Obr. 34 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňující čištění fúzních proteinů rekombinantních toxinů A a B C. difficile.

Obr. 35 znázorňuje výsledky studie profylaktického ošetření u křečků.

Obr. 36 znázorňuje výsledky studie profylaktického ošetření u křečků.

Obr. 37 znázorňuje výsledky studie profylaktického ošetření u křečků.

Obr. 38 znázorňuje výsledky studie profylaktického ošetření u křečků.

Obr. 39 znázorňuje výsledky podávání vankomycinu křečkům se stanovenou infekcí C. difficile.

Obr. 40 znázorňuje výsledky analýzy ELISA IgY izolovaného ze slepic, imunizovaných proteinem pMAl 870-2680 rekombinantního toxinu A C. difficile a čtyřmi různými vehikuly.

Obr. 41 znázorňuje výsledky analýzy ELISA IgY izolovaného ze slepic, imunizovaných proteinem pPA1870-2680(N/C) rekombinantního toxinu A C. difficile a čtyřmi různými vehikuly.

Obr. 42 znázorňuje rozpouštěcí profily pro IgY, povlečený pomocí Aquateric.

Obr. 43 znázorňuje rozpouštěcí profily pro IgY, povlečený pomocí Eudragit®.

Obr. 44 znázorňuje výsledky analýzy ELISA IgY izolovaného z křečků, vakcínovaných proteiny rekombinantního oxinu A C. difficile.

Obr. 45 znázorňuje výsledky analýzy ELISA IgY izolovaného z křečků, vakcínovaných proteiny rekombinantních toxinů A a B C. difficile', je znázorněna reaktivita na rekombinantní toxin A C. difficile.

Obr. 46 znázorňuje výsledky analýzy ELISA IgY izolovaného z křečků, vakcínovaných proteiny rekombinantních toxinů A a B C. difficile', je znázorněna reaktivita na rekombinantní toxin B C. difficile.

Obr. 47 znázorňuje výsledky studie terapeutického ošetření u křečků.

Obr. 48 znázorňuje výsledky studie terapeutického ošetření u diaroických křečků.

Obr. 49 znázorňuje výsledky studie terapeutického ošetření u křečků.

Obr. 50 představuje Western blot, znázorňující hladiny toxinu A C. difficile v supematantu kultury, průtoku kolonou a eluátu z afinitní čistící kolony.

Obr. 51 představuje Western blot, znázorňující hladiny toxinu A C. difficile n supematantu kultury, průtoku kolonou a eluátu z afinitní čisticí kolony.

Obr. 52 představuje nativní gel PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňující hladiny toxinu B

C. difficile v supematantu kapalné kultury.

-10CZ 296806 B6

Obr. 53 představuje nativní gel PAGE, barvený Coomassie blue, a Western blot, znázorňující hladiny toxinu B C. difficile v kulturách z dialýzních sáčků.

Obr. 54 představuje nativní gel PAGE, barvený Coomassie blue, a Western blot, znázorňující hladiny toxinu B C. difficile v komerčním preparátu toxinu B, průtoku kolonou a eluátu z afínitní čisticí kolony.

Obr. 55 znázorňuje rozpouštěcí profily tablet IgY, povlečených enterosolventním filmem citlivým vůči pH.

Obr. 56 znázorňuje stabilitu reaktivity toxinu A C. difficile na IgY po procesu tabletování a povlékání enterosolventním povlakem.

Obr. 57 znázorňuje mortalitu křečků, profylakticky ošetřených IgY a infikovaných toxinem A C. difficile.

Obr. 58 znázorňuje mortalitu křečků, terapeuticky ošetřených IgY po infekci toxinem A C. difficile.

Definice

Pro snadnější porozumění vynálezu jsou dále definovány některé termíny.

Výraz „neutralizace“ se používá ve vztahu k antitoxinům, zejména antitoxinům obsahujícím protilátky, které mají schopnost bránit patologickému působení toxinu, proti němuž je antitoxin zaměřen.

Výraz „nadprodukce“ se používá ve vztahu k produkci klostridiálních toxinových polypeptidů v hostitelské buňce a naznačuje, že hostitelská buňka produkuje více klostridiálního toxinu v důsledku zavedení sekvencí nukleových kyselin, kódujících tento klostridiální toxinový polypeptid než by se od této hostitelské buňky očekávalo bez zavedení uvedených sekvencí nukleových kyselin. Pro snadné čištění toxinových polypeptidů, produkovaných v hostitelské buňce, je výhodné, aby hostitelská buňka uvedený toxinový polypeptid exprimovala nebo nadprodukovala v množství větším než 1 mg/1 kultury hostitelských buněk.

Výraz „fúzní protein“ se zde vztahuje na chimémí protein, obsahující daný protein (například toxin A nebo B C. difficile nebo jejich fragmenty) napojený na exogenní proteinový fragment (fúzní partner, který je tvořen netoxinovým proteinem). Fúzní partner může zvyšovat rozpustnost proteinu C. difficile, exprimovaného v hostitelské buňce a/nebo může dodávat afínitní značku k umožnění čištění rekombinantního fúzního proteinu ze supematantu hostitelských buněk nebo kultury. Je-li to žádoucí, může být fůzní protein z daného proteinu (tj. toxinového proteinu nebo jeho fragmentů) před imunizací odstraněn různými známými enzymatickými nebo chemickými metodami.

Výraz „netoxinový protein“ nebo „netoxinová proteinová sekvence“ se vztahuje na část fúzního proteinu nebo proteinové sekvence, která není odvozena od bakteriálního toxinového proteinu.

Výraz „daný protein“ se vztahuje na protein, jehož exprese ve fúzním proteinu je žádoucí, ve fúzním proteinu je daný protein napojen nebo fúzován s jiným proteinem nebo doménou proteinu, tj. fúzním partnerem, za účelem zvýšení stability daného proteinu a/nebo snadnosti čištění fúzního proteinu.

Výraz „maltózu vázající protein“ se vztahuje na maltózu vázající protein E. coli. K danému proteinu může být přidána část maltózu vázajícího proteinu za účelem vytvoření fúzního proteinu;

-11CZ 296806 B6 část maltózu vázajícího proteinu může pouze zvyšovat rozpustnost vzniklého fúzního proteinu, je-li exprimován v bakteriálním hostiteli. Naproti tomu může část maltózu vázajícího proteinu umožňovat afínitní čištění fúzního proteinu na amylózové pryskyřici.

Výraz „polyhistidinový úsek“, používaný ve vztahu k fúznímu proteinu, se vztahuje na přítomnost dvou až deseti histidinových zbytků buď na aminoterminálním konci, nebo na karboxyterminálním konci nebo na obou koncích daného proteinu nebo fúzního partnera. Výhodný je polyhistidinový úsek ze šesti až deseti zbytků. Polyhistidinový úsek je definován také funkčně jako počet za sebou následujících histidinových zbytků, přidaných k danému proteinu, který umožňuje afínitní čištění vzniklého fúzního proteinu na nikl-chelátové koloně.

Výraz „thioredoxinový protein“, používaný ve vztahu k fúznímu proteinu, se vztahuje na thioredoxinový protein E. coli. Je nutno upozornit, že se však vynálezu neomezuje zdrojem thioredoxinového proteinu; i když je thioredoxinový protein E. coli zvlášť výhodný, je možno thioredoxinový protein získat z různých zdrojů. K danému proteinu může být přidána část thioredoxinového proteinu za účelem vytvoření fúzního proteinu; část thioredoxinového proteinu může zvyšovat rozpustnost vzniklého fúzního proteinu, je-li exprimován v bakteriální buňce.

Výraz „čištěný“ nebo „čistit“ se vztahuje na odstraňování nečistot ze vzorku. Například antitoxiny se čistí odstraněním kontaminujících neimunoglobulinových proteinů; čistí se rovněž odstraněním imunoglobulinu, který neváže toxin. Odstranění neimunoglobulinových proteinů a/nebo odstranění imunoglobulinů, které neváží toxin, vede ke zvýšení procenta imunoglobulinů reaktivních s toxinem ve vzorku. Čištění antitoxinu může být prováděno různými metodami, zahrnujícími extrakci a srážením ptačího antitoxinu z vajec pomocí polyethylenglykolu. Čištění antiklostridiálního antitoxinu může být rovněž prováděno afínitní chromatografíí na pryskyřici, zahrnující část klostridiálního toxinového proteinu. V jiném příkladu jsou exprimovány polypeptidy rekombinantního toxinu v buňkách bakteriálního hostitele a toxinové polypeptidy jsou čištěny odstraněním proteinů hostitelských buněk; procento polypeptidů rekombinantního oxinu ve vzorku se tak zvýší. Dále se polypeptidy rekombinantního toxinu čistí odstraněním složek hostitelské buňky, jako je lipopolysacharid (například endotoxin).

Výraz „rekombinantní molekula DNA“ se vztahuje na molekulu DNA, která je tvořena segmenty DNA, spojenými navzájem metodami molekulární biologie.

Výraz „rekombinantní protein“ nebo „rekombinantní polypeptid“ se vztahuje na molekulu proteinu, která je exprimována z rekombinantní molekuly DNA.

Výraz „nativní protein“ se vztahuje na protein, který je izolován z přírodního zdroje oproti produkci proteinu rekombinantními metodami.

Výraz „část“ ve vztahu k proteinu (například „část daného proteinu“) se vztahuje na fragmenty tohoto proteinu. Fragmenty mohou mít velikost v rozmezí od čtyř aminokyselinových zbytků do celkové sekvence aminokyselin minus jedna aminokyselina.

Výraz „rozpustný“ ve vztahu k proteinu, produkovanému rekombinantní technologií DNA v hostitelské buňce označuje protein, který existuje v roztoku v cytoplazmě hostitelské buňky; jestliže protein obsahuje signální sekvenci, je rozpustný protein exportován do periplazmatického prostoru v bakteriálních hostitelích a vylučován do kultivačního média v eukaryotických buňkách schopných sekrece nebo bakteriálním hostitelem majícím příslušné geny (tj. gen kil). Naproti tomu nerozpustný protein je takový, který existuje v denaturované formě uvnitř cytoplazmatických granul (nazývaných inkluzní tělíska) v hostitelské buňce. Vysoká úroveň exprese (tj. větší než 10 až 20 mg rekombinantního proteinu/titr bakteriální kultury) rekombinantních proteinů často vede k tomu, že se exprimovaný protein nachází v inkluzních tělískách v buňkách bakteriálního hostitele. Rozpustný protein je protein, který se nenachází v inkluzním tělísku uvnitř

-12CZ 296806 B6 hostitelské buňky nebo se nachází jak v cytoplazmě, tak v inkluzních tělískách a v tomto případě může protein přítomen v cytoplazmě ve vysokém nebo nízkém množství.

Existuje rozdíl mezi rozpustným proteinem (tj. proteinem, který je při expresi v hostitelské buňce produkován v rozpustné formě) a „solubilizovaným“ proteinem. Nerozpustný rekombinantní protein, nacházející se uvnitř inkluzního tělíska, může být solubilizován (tj. převeden do rozpustné formy) tak, že se na čištěná inkluzní tělíska působí denaturanty, jako je guanidinhydrochlorid, močovina nebo dodecylsulfát sodný (SDS). Tyto denaturanty je pak nutno ze solubilizovaného proteinového preparátu odstranit, aby byla umožněna renaturace získaného proteinu. Ne všechny proteiny po solubilizaci vdenaturantu a odstranění denaturantu renaturují do aktivní konformace. Mnohé proteiny se po odstranění denaturantu vysrážejí. K solubilizaci inkluzních tělísek může být použit SDS, který udržuje proteiny v roztoku v nízké koncentraci. Dialýzou se však ne vždy odstraní veškerý SDS (SDS může tvořit micely, které nevydialyzují); protein v inkluzních tělískách, solubilizovaný pomocí SDS, je tedy rozpustný, ale ne renaturovaný.

Existuje rozdíl mezi proteiny, které jsou rozpustné (tj. rozpuštěné) v roztoku neobsahujícím významná množství iontových detergentů (například SDS) nebo denaturantů (například močoviny, guanidinhydrochloridu), a proteiny, které existují jako suspenze molekul nerozpustného proteinu dispergovaných v roztoku. Rozpustný protein se z roztoku jej obsahujícího neodstraní odstředěním s použitím podmínek dostatečných k odstranění bakterií přítomných v kapalném prostředí (tj. odstřeďováním při 5000 g po dobu 4 až 5 min). Za účelem zjištění, zda jsou dva proteiny, protein A a protein B, jsou rozpustné v roztoku, se například tyto dva proteiny umístí do roztoku vybraného ze skupiny zahrnující PBS-NaCl (PBS s obsahem 0,5 M NaCl), PBS-NaCl s obsahem 0,2 % Tweenu 20, PBS, PBS s obsahem 0,2 % Tweenu 20, PBS-C (PBS s obsahem 2 mM CaCl₂), PBS-C s obsahem buď 0,1, nebo 0,5 % Tweenu 20, PBS-C s obsahem buď 0,1, nebo 0,5 % NP-40, PBS-C s obsahem buď 0,1, nebo 0,5 % Tritonu X-100, PBS-C s obsahem 0,1 % deoxycholátu sodného. Směs obsahující proteiny A a B se pak odstřeďuje 5 min při 5000 g. Supematant a peleta vzniklá odstřeďováním se pak testují na přítomnost proteinu A a B. Jestliže se protein A nachází v supematantu a ne v peletě [kromě malých množství (tj. méně než 10 %) v důsledku zachycení], považuje se protein za rozpustný v testovaném roztoku. Jestliže se větší část proteinu B nachází v peletě (tj. více než 90 %), pak se protein B považuje za existující v suspenzi v testovaném roztoku.

Výraz „terapeutické množství“ se vztahuje na množství antitoxinu, nutné k neutralizaci patologických účinků jednoho nebo více klostridiálních toxinů v subjektu.

Výraz „terapeutická směs“, používaný ve vztahu ke směsi antitoxinů, se vztahuje na množství antitoxinu, nutné k neutralizaci patologických účinků jednoho nebo více klostridiálních toxinů v subjektu.

Výraz „terapeutická vakcína“, používaný ve vztahu k vakcíně zahrnující jeden nebo více rekombinantních fúzních proteinů klostridiálního toxinů, znamená, že vakcína obsahuje imunologicky účinné množství fúzních promotorů (tj. imunogenů).

Výraz „imunogenně účinné množství“ se vztahuje k množství imunogenu, nutnému k vyvolání produkce ochranného množství protilátek v hostiteli (tj. subjektu) po vakcinaci.

Výraz „pyrogen“ se vztahuje na látku vyvolávající horečku. Pyrogeny mohou být vůči hostiteli endogenní (například prostaglandiny) nebo to mohou být exogenní sloučeniny (například bakteriální endo- a exotoxiny, nebakteriální sloučeniny, jako jsou antigeny a určité steroidní sloučeniny atd.). přítomnost pyrogenu ve farmaceutickém roztoku může být detekována pomocí testu králičí horečky podle lékopisu USA (United States Pharmacopeia, sv. XXII (1990), United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD, str. 151).

-13CZ 296806 B6

Výraz „endotoxin“ se vztahuje na vysokomolekulámí komplexy, asociované s vnější membránou gram-negativní bakterie. Nečištěný endotoxin obsahuje lipidy, proteiny a uhlohydráty. Vysoce čištěný endotoxin neobsahuje protein a označuje se jako lipopolysacharid (LPS). Protože při výrobě farmaceutických sloučenin (například proteinů produkovaných v E. coli pomocí technologie rekombinace DNA) má význam nečištěný endotoxin, vztahuje se zde výraz endotoxin na nečištěný endotoxin. Bakteriální endotoxin je známý pyrogen.

Výraz „prostý endotoxinu“, používaný ve vztahu k přípravku podávanému hostiteli parenterálně (s výjimkou intrathekální aplikace), znamená, že podávaná dávka obsahuje méně než 5 EU/kg tělesné hmotnosti [FDA Guidelines for Parenteral Drugs (prosinec 1987)]. Za předpokladu hmotnosti dospělého člověka 70 kg musí dávka obsahovat méně než 350 EU, aby vyhověla citovanému předpisu FDA. Hladiny endotoxinu se zde měří pomocí testu LAL (Limulus Amebocyte Lysáte Pyrochrome™, Associates of Cápe Cod, lne. Woods Hole, MA). Pro měření hladiny endotoxinu v přípravcích rekombinantních proteinů se v testu LAL podle pokynů výrobce pro chromogenní konečný bod bez diazokopulace použije 0,5 ml roztoku zahrnujícího 0,5 mg čištěného rekombinantního proteinu v 50 mM NaPO₄, pH 7,0, 0,3 M NaCl a 10 % glycerolu. Přípravky obsahující méně nebo rovno 450 endotoxinových jednotek (EU)/mg čištěného rekombinantního proteinu se zde označují jako „v podstatě prosté endotoxinu“. Podávání bakteriálních toxinů nebo toxoidů dospělým lidem za účelem vakcinace zahrnuje dávky asi 10 až 500 pg proteinu/dávku. Podávání 10 až 500 pg čištěného rekombinantního proteinu 70kg člověku, kdy tento čištěný rekombinantní protein obsahuje 450 EU/mg proteinu, proto vede k zavedení pouze 4,5 až 225 EU (tj. 1,3 až 64,5 % maximálního přípustného zatížení endotoxinem na parenterální dávku).

Test LAL je uznáván úřadem U.S. FDA jako způsob detekce bakteriálních endotoxinů (21 C.F.R. §§ 660.100-105). Studie ukázaly, že test LAL je pro detekci endotoxinu ekvivalentní nebo lepší než test králičího pyrogenu podle USP, a proto může být test LAL použit jako náhrada studií pyrogenity u živočichů [F. C. Perason, Pyrogens: endotoxins. LAL testing and depyrogenation. Marcel Dekker, New York (1985), str. 150 až 155]. Biologický úřad FDA akceptuje test LAL místo testu králičího pyrogenu podle USP, pokud se použitý test LAL ukáže jako stejně nebo více citlivý než králičí test [Fed. Reg., 38, 26130 (1980)].

Výraz „monovalentní“, používaný ve vztahu ke klostridiální vakcíně, se vztahuje na vakcínu, která je schopna v hostiteli provokovat v hostitelském živočichovi (tj. subjektu) imunitní odpověď, zaměřenou proti jedinému typu klostridiálního toxinu. Například jestliže imunizace hostitele vakcínou toxinu typu A C. difficile indukuje v imunizovaném hostiteli protilátky, které chrání proti expozici toxinu typu A, ale ne proti expozici toxinu typu B, pak se vakcína typu A označuje jako monovalentní. Naproti tomu „multivalentní“ vakcína provokuje v hostitelském živočichovi imunitní odpověď zaměřenou proti několika (tj. více než jednomu) klostridiálním toxinům. Například jestliže imunizace hostitele vakcínou zahrnující toxiny typu A a B C. difficile indukuje produkci protilátek, které hostitele chrání před expozicí oběma typům toxinu A a B, označuje se vakcína jako multivalentní (konkrétně tato hypotetická vakcína je bivalentní).

Výrazy „agregát“ a „agregace“ se zde vztahují na tvoření shluků, nakupení nebo hmot materiálů. Není úmyslem omezovat tento výraz na určitý konkrétní typ shlukování. Naopak je úmyslem používat tento výraz v co nej širším smyslu, zahrnujícím všechny situace, v nichž se mnohonásobné prvky dostanou do těsného kontaktu. Tyto výrazy tedy zahrnují aglutinaci všech typů (neomezujícími příklady jsou aglutinace latexu, hemaglutinace nebo jakýkoli jiný pochod, při němž je ke vzniku aglutinace použita imunologická reakce). Tento výraz se vztahuje rovněž na neimunologické pochody a zahrnuje rovněž nespecifické vztahy mezi mnohočetnými komponentami; nutné je pouze, aby jednotlivé komponenty byly k sobě shluknuty.

Výraz „subjekt“, používaný ve vztahu k podávání přípravků zahrnujících antitoxiny nebo vakcín, se vztahuje na živočišného příjemce, jemuž jsou uvedené antitoxiny nebo vakcíny podávány.

Subjektem může být kterýkoli živočich, včetně savců a konkrétně lidí, u něhož je žádoucí tyto přípravky podávat. Subjekt může být před podáváním těchto přípravků vystaven jednomu nebo

-14CZ 296806 B6 více toxinům C. difficile (v tom případě se jedná o terapeutické podávání subjektu). Alternativně subjekt nemusí být před podáváním těchto přípravků předem vystaven toxinůmC. difficile (vtom případě se jedná o profylaktické podávání subjektu).

Výraz „vzorek“ je v popisu a v nárocích používán v nejširším smyslu. Jednak zahrnuje specimen nebo kulturu (například mikrobiologické kultury). Na druhé straně zahrnuje jak biologické, tak ekologické vzorky.

Biologické vzorky mohou být živočišné, včetně lidských, tekuté, pevné (například stolice) nebo tkáňové, stejně jako kapalné a pevné potravinářské a krmivářské produkty a složky, jako jsou mlékárenské výrobky, zelenina, maso a masně vedlejší výrobky a odpad. Biologické vzorky mohou být získány od všech druhů domácích stejně jako divokých zvířat, jejichž neomezujícími příklady mohou být takoví živočichové, jako jsou kopytnatci, medvědi, ryby, lagamorfa, hlodavci atd.

Ekologické vzorky zahrnují materiál životního prostředí, jako je povrchová hmota, půda, voda a průmyslové vzorky, stejně jako vzorky získané z přístrojů, zařízení, instalací, nástrojů, jednorázových a vícerázových pomůcek při zpracování potravin a mléka. Tyto příklady nejsou zamýšleny jako omezující typ vzorku použitelný podle vynálezu.

Výraz „kultura“ se zde používá ve vztahu k růstu organizmů, zahrnujících například bakterie, in vivo nebo in vitro. Tento výraz je zamýšlen jako zahrnující všechny formy mikrobiálních kultur. Je zamýšlen jako zahrnující propagaci mikroorganizmů nebo jiných živých buněk v médiu a v prostředí, které vede k jejich růstu. Tyto kultury mohou být pěstovány v jakémkoli formátu, zahrnujícím například agarové destičky, fermentační prostředí a polopevná prostředí, a v jakémkoli prostředí vhodném pro pěstovaný organizmus (tj. aerobním, anaerobním, mikroaerofílním atd.).

Výraz „supernatantů“ se zde používá ve vztahu k jakémukoli kapalnému nebo tekutému roztoku. Tato kapalina nebo tekutina může nebo nemusí obsahovat pevné částice, jako jsou proteiny (například protilátky nebo molekuly toxinů). Tento výraz zahrnuje jakoukoli kapalinu ležící nad vysráženým nerozpustným materiálem, stejně jako kapaliny, jako jsou kapalná kultivační média, odebraná z mikrobiální nebo buněčné kultury. Zahrnuje rovněž kapalnou část vzorku, který byl odstřeďován za účelem odstranění nerozpustných částic, které nejsou schopny během odstřeďování zůstat v roztoku, od částic, které jsou schopny během odstřeďování zůstat v roztoku. Není však úmyslem omezovat význam tohoto výrazu na situaci, v níž je používáno odstřeďování.

Výraz „ochranné množství“, používané ve vztahu k hladině protilátek, indukovaných imunizací hostitele imunogenem, který zahrnuje bakteriální toxin, znamená hladinu oběhu protilátek, dostatečnou k ochraně hostitele před expozicí letální dávkou toxinu.

Výrazy „protein“ a „polypeptid“ se zde vztahují na sloučeniny zahrnující aminokyseliny, spojené peptidickými vazbami, a jsou vzájemně zaměnitelné.

Výraz „toxin“, používaný ve vztahu k toxinům produkovaným členy (tj. druhy a kmeny) rodu Clostridium, se vztahuje na proteiny, které jsou toxické pro tkáň (tkáně). Například toxiny produkované C. difficile jsou toxické pro intestinální tkáně; toxiny produkované C. botulinum jsou toxické pro nervovou tkáň.

Výrazy „enkapsulace“ nebo „zapouzdřování“ se vztahují na povlékání pevné (například lyofilizované) formy antitoxinu. Povlak může zahrnovat jakýkoli enterosolventní povlak nebo kapsli.

Výrazy „enterosolventní povlak“ nebo „enterosolventní film“ se používají vzájemně zaměnitelně a označují látku nebo sloučeninu, která je odolná vůči kyselému pH (tj. kyselinovzdorná sloučenina), jaké se nachází v žaludku. Enterosolventní povlak, nanesený na pevnou látku, inhibuje rozpouštění této pevné látky v žaludku.

-15CZ 296806 B6

Pro enkapsulaci pevných přípravků existují standardní metody. Tyto metody zahrnují mikroenkapsulaci pevného přípravku, při níž se na pevný přípravek nanáší enterosolventní povlak.

Povlečený materiál může být subjektu podáván orálně tak, že se mikroenkapsulované částice suspendují ve známých farmaceutických suspenzních roztocích.

Má-li být pomocí enterosolventního povlaku enkapsulován pevný antitoxin, může být enterosolventní povlak aplikován s použitím jednostupňového procesu povlékání, pří němž se na pevný antitoxin přímo nanáší enterosolventní film; povlečený antitoxin se označuje jako překrytý enterosolventním filmem. Alternativně je možno použít dvoustupňového procesu nanášení, při němž se nejprve pevným antitoxinem povleče nonpareil (například částice cukru o velikosti asi 40 až 60 mesh) a pak se tento nonpareil povlečený antitoxinem povleče enterosolventním filmem. Žádoucí enterosolventní povlaky pro aplikaci antitoxinů zahrnují polymethakryláty, jako je Eudragit® L30D (RohmTech, lne.).

Pevný antitoxin může být pro orální podávání formulován vložením požadovaného množství antitoxinů do kapsle; přednostně má kapsle takové charakteristiky, zeje odolná proti rozpouštění v žaludku a schopná rozpuštění ve střevech. Jsou dostupné četné vhodné známé formulace kapslí; navíc jsou k dispozici standardní metody plnění kapslí zahrnující použití inertních plnících materiálů k získání dostatečného objemu náplně kapsle s terapeutickou kompozicí v pevné formě. Kromě použití mikroenkapsulovaného antitoxinů a antitoxinů obsaženého v kapsli může být pevný antitoxin podáván orálně ve formě tablet nebo pilulek. Pro dosažení dostatečného objemu pro lisování tablety nebo pilulky může být pevný antitoxin kombinován s inertními materiály. Po vytvoření může být tableta nebo pilulka povlékána enterosolventním filmem, bránícím rozpouštění v žaludku a podporujícím rozpouštění ve střevech.

Výraz „orální podávání“ nebo „orální aplikace“ se vztahuje na dodávání přípravku, jako je přípravek zahrnující antitoxin, ústy.

Výraz „parenterální podávání“ nebo „parenterální aplikace“ se vztahuje na dodávání přípravku, jako je přípravek zahrnující antitoxin nebo vakcínu, jinou cestou než přes gastrointestinální trakt (například orálně) nebo plíce. Parenterální aplikace může probíhat zejména intravenózní, subkutánní, intramuskulámí nebo intramedulámí (tj. intrathekální) injekcí.

Výraz „příznaky“ a „příznaky intoxikace“, používaný ve vztahu k subjektu vystavenému nebo v nebezpečí vystavení toxinům C. difficile, se vztahuje na přítomnost kteréhokoli z těchto jevů: průjem, enterokolitis, pseudomembránová kolitis, krvácení, ulcerace a/nebo zánět střevní sliznice, cecitis (tj. zánět slepého střeva).

Výraz „přestává vykazovat příznaky“ se vztahuje na situaci, v níž subjekt přestal vykazovat znaky a/nebo příznaky spojené s onemocněním a/nebo infekcí C. difficile.

Výraz „podstatná eliminace“ příznaků intoxikace onemocněním C. difficile znamená, že u subjektu, vystaveného intoxikaci a trpícího příznaky intoxikace jsou příznaky zmírněny, oslabeny nebo eliminovány. Například jestliže intoxikovaný subjekt vykazuje silný průjem (tj. objemný, vodnatý průjem), tvoří podstatnou eliminaci tohoto příznaku návrat k alespoň volně formované stolici.

Výraz „po uplynutí doby léčby“, používaný v souvislosti ze způsobem ošetřování subjektu vystaveného toxinu C. difficile, znamená období po přerušení podávání terapeutické sloučeniny (například antitoxinů) subjektu po dobu alespoň 7 dní, výhodně alespoň 14 dní. Terapeutická sloučenina, která vede k podstatné eliminaci příznaků intoxikace po uplynutí doby léčby, brání opětnému objevení (jsou-li příznaky eliminovány) nebo zvětšení intenzity (jsou-li příznaky zmírněny) těchto příznaků po dobu alespoň 7 dní po vysazení aplikace terapeutické sloučeniny. Jinými slovy není u většiny [tj. u statisticky významného počtu (například 75 %)] subjektů po

-16CZ 296806 B6 dobu alespoň 7 dní po přerušení terapie pozorován relaps (tj. znovuobjevení nebo zvýšení intenzity).

Na rozdíl od antitoxinů podle vynálezu současné terapeutické sloučeniny pro nepopiratelné infekce C. difficile [tj. antibiotika, jako je vankomycin nebo metronidazol nebo koncentrát bovinního IgG z krav imunizovaných toxoidy A a B C. difficile [Lyerly a d. (1991) Infect. Immun. 59:2215] ve významném počtu ošetřených subjektů nebrání relapsu. Relapsuje (tj. znovu se objevují příznaky intoxikace) například asi 25 % lidí a až 100 % křečků trpících onemocněním spojeným s C. difficile, ošetřovaným vankomycinem nebo metronidazolem.

Křečci, jimž byl podáván koncentrát bovinního IgG (BIC) z krav imunizovaných toxoidy A a B před infekcí C. difficile (tj. profylaktické ošetření) vždy relapsují (tj. průjmy se vracejí) a hynou, jakmile je BIC stažen [Lyerly a d. (1991), viz výše]. Jsou-li pomocí BIC ošetřováni křečci se zjištěnou infekcí C. difficile, není pozorován žádný terapeutický efekt (tj. podávání BIC neeliminuje průjem nebo nebrání úhynu) [Lyerly a d. (1991), viz výše].

Naproti tomu antitoxiny podle vynálezu, jsou-li používány k ošetřování zjištěné infekce C. difficile (terapeutický režim), podstatně eliminují příznaky intoxikace včetně průjmu a brání úmrtí. Většina živočichů ošetřovaných proteiny anti-toxinu C. difficile nerelapsuje a zůstává zdravých po přerušení antitoxinové terapie po dobu alespoň 14 dnů [zvířata zůstávají zdravá po dlouhou dobu (například asi 5 měsíců)].

Podstata vynálezu

Vynález se týká výroby polypeptidů odvozených od toxinů. V jednom provedení spadá do vynálezu fúzní protein zahrnující polyhistidinový úsek a část toxinu. Vynález není omezen na typ nebo charakter toxinu. Jako fúzní proteiny zahrnující polyhistidinový úsek jsou exprimovány části toxinů produkovaných členy rodu Clostridium.

Předmětem vynálezu je rozpustný fúzní protein zahrnující část toxinu typu A Clostridium botulinum, přičemž sekvence toxinu typu A C. botulinum zahrnují část sekvence SEQ IDNO:28 o alespoň čtyřech aminokyselinách. V dalším výhodném provedení zahrnují sekvence toxinu typu A C. botulinum část sekvence SEQ ID NO:23. Vynález není omezen na charakter fúzního proteinu. Fúzní protein může například zahrnovat sekvenci toxinu typu A Clostridium botulinum, uvedenou jako SEQ ID NO:23, spolu s polyhistidinovým úsekem.

Do vynálezu spadá rovněž hostitelská buňka obsahující rekombinantní expresní vektor, kde vektor kóduje výše uvedený fúzní protein. V tomto provedení je hostitelská buňka schopna exprimovat kódovaný protein toxinu typu A Clostridium botulinum jako rozpustný protein v úrovni větší nebo rovné 0,25 až 10 % celkového buněčného proteinu a výhodně v úrovni větší nebo rovné 0,75 % celkového buněčného proteinu.

Do vynálezu rovněž spadá hostitelská buňka obsahující rekombinantní expresní vektor, kde vektor kóduje výše uvedený fúzní protein. V tomto provedení je hostitelská buňka schopna exprimovat kódovaný protein toxinu typu A Clostridium botulinum v úrovni větší nebo rovné 10 až 40 % celkového buněčného proteinu a výhodně v úrovni větší nebo rovné 20 % celkového buněčného proteinu.

Vynález umožňuje vytváření neutralizujících toxinů, zaměřených proti toxinu typu A Clostridium botulinum, zahrnující (v jakémkoli pořadí) čištěný rozpustný fúzní protein, zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu typu A Clostridium botulinum SEQ ID NO:28, stejně jako imunizaci hostitele čištěným fúzním proteinem za účelem vytvoření protilátek schopných neutralizovat nativní toxin typu A Clostridium botulinum. Fúzní protein může například zahrnovat část sekvence toxinu typu A Clostridium botulinum, uvedené jako SEQ ID NO:23, a

-17CZ 296806 B6 polyhistidinový úsek. Způsob může dále zahrnovat další stupeň odebírání protilátek z hostitele.

Odebrané protilátky dále mohou být čištěny. Vynález zahrnuje protilátku jako takovou, vytvořenou výše uvedenými metodami.

Vynález dále umožňuje čištění rekombinantního fúzního proteinu, odvozeného z toxinu typu A Clostridium botulinum. V tomto provedení rekombinantní fúzní protein zahrnuje polyhistidinový úsek, zahrnující (v jakémkoli pořadí) roztok zahrnující fúzní protein zahrnující polyhistidinový úsek a část sekvence toxinu typu A Clostridium botulinum SEQ ID NO:28, a chromatografickou pryskyřici zahrnující dvojmocný kation kovalentně navázaný na pevný nosič. V tomto provedení se tento roztok přidává k chromatografické pryskyřici za účelem navázání fúzního proteinu k chromatografícké pryskyřici. Toto provedení může dále zahrnovat stupeň promývání chromatografícké pryskyřice obsahující uvedený navázaný fúzní protein za účelem odstranění nefúzního proteinu z chromatografícké pryskyřice a vymývání navázaného fúzního proteinu zpromyté chromatografícké pryskyřice.

Ve výhodném provedení chromatografícká pryskyřice zahrnuje niklové ionty, mobilizované na pevném nosiči. Příklady komerčně dostupných kolon s niklovými ionty zahrnují pryskyřici His*Bind® (Novagen) a agarózovou pryskyřici Ni-NTA (Qiagen). Protože agarózová pryskyřice Ni-NTA má velmi vysokou afinitu pro vazbu proteinů obsahujících polyhistidinový úsek, je velmi výhodná jako chromatografícká pryskyřice.

Vynález není omezen charakterem roztoku zahrnujícího fúzní protein zahrnující polyhistidinový úsek a část sekvence toxinu typu A Clostridium botulinum SEQ ID NO:28. V jednom provedení zahrnuje tento roztok rozpustný extrakt, odvozený z buněčné pelety zahrnující hostitelské buňky obsahující rekombinantní fúzní protein. V dalším provedení je rozpustný extrakt vytvořen z buněčné pelety suspendováním ve vazebném pufru a rozrušením suspenze za účelem rozrušení membrán hostitelské buňky za vzniku směsi zahrnující rozpustné proteiny a nerozpustné buněčné zbytky. V dalším provedení způsob čištění rekombinantního fúzního proteinu odvozeného od toxinu typu A Clostridium botulinum, kde rekombinantní fúzní protein zahrnuje polyhistidinový úsek, dále zahrnuje stupeň odstraňování nerozpustných buněčných zbytků z porušené suspenze buněk za vzniku čirého rozpustného lyzátu. V ještě dalším provedení způsob čištění rekombinantního fúzního proteinu používá přídavek neiontového detergentu k získanému čirému lyzátu. Výhodným neiontovým detergentem je Nonidet P-40. V ještě dalším výhodném provedení způsob čištění rekombinantního fúzního proteinu zahrnuje další stupeň inkubace čirého rozpustného lyzátu, obsahujícího uvedený neiontový detergent, chromatografickou pryskyřicí po dobu více než 1 h při 4 °C za účelem navázání fúzního proteinu na chromatografickou pryskyřici. Zvlášť výhodné jsou inkubační stupně v délce asi 3 h.

Vynález se týká klostridiální antitoxinové terapie pro lidi a jiné živočichy. Antitoxiny, které neutralizují patologické účinky klostridiálních toxinů, se vytvářejí imunizací ptačích hostitelů rekombinantními fragmenty toxinu. Může být vytvořen fúzní protein zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu B Clostridium difficile SEQ ID NO: 10. Fúzní protein může například zahrnovat část sekvence toxinu B Clostridium difficile, uvedené jako SEQ ID NO:20, a maltózu vázající protein (nebo jeho část). Na druhé straně může fúzní protein zahrnovat sekvenci toxinu B Clostridium difficile, uvedenou jako SEQ ID NO:21, spolu s polyhistidinovým úsekem.

Je tak umožněna tvorba neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti toxinu B Clostridium difficile, zahrnující a) vjakémkoli pořadí získání i) čištěného fúzního proteinu, zahrnujícího netoxinovou proteinovou sekvenci a část toxinu B Clostridium difficile SEQ ID NO: 10, a ii) ptačího hostitele a b) imunizaci tohoto hostitele uvedeným čištěným fúzním proteinem za účelem vytvoření antitoxinu schopného neutralizovat nativní toxin B Clostridium difficile. Opět pouze jako příklad je možno uvést, že fúzní protein může zahrnovat část sekvence toxinu B Clostridium difficile, uvedené jako SEQ ID NO:20, a maltózu vázající protein /nebo jeho část). Na druhé straně může fúzní protein zahrnovat sekvenci toxinu B Clostridium difficile, uvedenou jako

-18CZ 296806 B6

SEQ ID NO:21, spolu s polyhistidinovým úsekem. Způsob může dále zahrnovat stupeň c) získání uvedeného antitoxinu z uvedeného hostitele a dále d) čištění tohoto antitoxinu. Do vynálezu spadá protilátka, získaná výše uvedenými způsoby, jako taková.

Vynález dále umožňuje léčbu zahrnující a) získání i) subjektu a ii) alespoň jednoho neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti fúznímu proteinu, zahrnujícímu netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu B Clostridium difficile SEQ ID NO: 10, a b) podávání uvedeného antitoxinu uvedenému subjektu. V jednom provedení je možné podávání orální cestou. Ošetřovaný subjekt může nebo nemusí být vystaven Clostridium difficile a jeho toxinům. To znamená, že v jednom případě může expozice toxinu B Clostridium difficile proběhnout před podáním antitoxinu. V jiném případě subjekt nebyl před podáním antitoxinu vystaven toxinu typu B Clostridium difficile.

Podle vynálezu mohou být vytvářeny fúzní proteiny obsahující fragmenty toxinu A. V jednom provedení to může být fúzní protein zahrnuj ící netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu typu A Clostridium difficile, sestávající z SEQ ID NO:7. V dalším provedení připadá v úvahu fúzní protein zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu A Clostridium difficile, zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:8. Ve výše popsaných provedeních může být netoxinová část fúzního proteinu vybrána z různých typů sekvencí netoxinových proteinů. Ve výhodném provedení je netoxinovou sekvencí sekvence maltózu vázajícího proteinu (nebo její část).

Vynález umožňuje generování neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti toxinu A Clostridium difficile, zahrnující a) získání v jakémkoli pořadí: i) čištěného fúzního proteinu zahrnujícího netoxinovou proteinovou sekvenci (například sekvenci maltózu vázajícího proteinu nebo její část) a část sekvence toxinu A Clostridium difficile (například sekvenci toxinu A, jak je uvedena v SEQ ID NO:7), a ii) ptačího hostitele, a b) imunizaci uvedeného hostitele uvedeným čištěným fúzním proteinem za účelem vytvoření antitoxinu schopného neutralizovat toxin A Clostridium difficile. Způsob může dále zahrnovat stupeň c) získání uvedeného antitoxinu z uvedeného hostitele a d) čištění uvedeného antitoxinu.

Vynález umožňuje použití fragmentů toxinů ve vakcinacích a diagnostických testech. Fragmenty mohou být používány odděleně jako čištěné rozpustné antigeny nebo alternativně ve směsích nebo „koktejlech“.

Vynález poskytuje přípravky zahrnující ptačí neutralizující antitoxin zaměřený proti části toxinu A C. difficile a části toxinu B C. difficile. Tyto antitoxiny nalézají použití u lidí a jiných živočichů, vystavených nebo v nebezpečí expozice C. difficile. V jednom provedení je složka ptačího neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti části toxinu A C. difficile zaměřena proti prvnímu fúznímu proteinu, zahrnujícímu část toxinu A C. difficile, a druhému fúznímu proteinu, zahrnujícímu část toxinu B C. difficile. N dalším provedení zahrnuje první i druhý fúzní protein alespoň jednu netoxinovou proteinovou sekvenci. V ještě dalším provedení je antitoxin zaměřen proti části toxinu A C. difficile, zahrnující část SEQ ID NO:6. V jiném provedení je antitoxin zaměřen proti části toxinu A C. difficile, kde část SEQ ID NO:6 zahrnuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:7, 8 a 29. V ještě dalším provedení zahrnuje první i druhý fúzní protein alespoň jednu netoxinovou proteinovou sekvenci. Vynález není omezen charakterem netoxinové proteinové sekvence. V jednom provedení netoxinová proteinová sekvence zahrnuje maltózu vázající protein. V jiném provedení zahrnuje netoxinová proteinová sekvence thioredoxinový protein. V ještě dalším provedení je antitoxin zaměřen proti části toxinu B C. difficile, zahrnující část SEQ ID NO: 10. V jiném provedení je antitoxin zaměřen proti části toxinu B C. difficile, kde část SEQ ID NO: 10 zahrnuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 11, 12, 20, 21 a 30. V ještě dalším provedení přípravky zahrnující ptačí antitoxiny dále zahrnují enterosolventní povlak.

-19CZ 296806 B6

Vynálezu rovněž umožňuje léčbu zahrnující a) získání: i) subjektu, ii) prvního ptačího neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti části sekvence toxinu A Clostridium difficile SEQ ID NO:6 a iii) druhého ptačího neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti části sekvence toxinu B Clostridium difficile SEQ ID NO: 10, b) smísení prvního a druhého antitoxinu za vytvoření terapeutické směsi a c) podávání této terapeutické směsi subjektu po dobu léčby. Do vynálezu dále spadá způsob léčby, který dále zahrnuje před stupněm c) stupeň zpracování terapeutické směsi za účelem zlepšení její enterické stability. Ve výhodném provedení tato léčba zahrnuje enkapsulaci antitoxinů v terapeutické směsi. Ve zvláště výhodném provedení stupeň enkapsulace zahrnuje povlékání antitoxinů enterosolventním filmem.

Vynález dále umožňuje léčbu, kde subjekt byl před podáváním antitoxinu exponován alespoň jednomu toxinu Clostridium difficile. V jednom provedení trpí exponovaný subjekt příznaky intoxikace a podávání antitoxinu vede k podstatné eliminaci příznaků po přerušení léčby. V jiném provedení zahrnují příznaky intoxikace průjem.

V úvahu rovněž připadá způsob léčby, kdy subjekt nebyl před podáváním antitoxinu vystaven toxinu Clostridium difficile.

V jednom provedení se při způsobu léčby nejprve získá první ptačí antitoxin zaměřený proti části toxinu A Clostridium difficile, zahrnující proteinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:7, 8 a 29. V jiném provedení se získá druhý ptačí antitoxin, zaměřený proti části toxinu B Clostridium difficile, zahrnující proteinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 11,12,20,21 a 30.

Způsob léčby není omezen způsobem podávání antitoxinu. V jednom provedení způsob léčby zahrnuje podávání antitoxinů orální cestou. V jiném provedení způsob léčby zahrnuje podávání antitoxinů parenterální cestou.

Vynález dále umožňuje způsob vakcinace subjektu za účelem vytvoření neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti toxinu C. difficile, zahrnující a) získání v jakémkoli pořadí: i) subjektu, ii) prvního čištěného rozpustného a v podstatě endotoxinů prostého proteinu zahrnujícího sekvenci toxinu A Clostridium difficile SEQ ID NO:6 a iii) druhého čištěného rozpustného a v podstatě endotoxinů prostého proteinu zahrnujícího část sekvence toxinu B Clostridium difficile SEQ ID NO: 10, b) smísení prvního a druhého proteinu za vytvoření terapeutické vakcíny a d) vakcinaci subjektu terapeutickou vakcínou za účelem vytvoření neutralizujícího antitoxinu.

V jednom provedení je tímto subjektem pták. V jiném provedení je subjektem savec. V ještě dalším provedení je subjektem člověk. V dalším provedení první i druhý protein dále zahrnuje alespoň jednu netoxinovou proteinovou sekvenci. Vynález není omezen charakterem netoxinové proteinové sekvence. V jednom provedení netoxinová proteinová sekvence zahrnuje polyhistidinový úsek. V jiném provedení zahrnuje netoxinová proteinová sekvence maltózu vázající protein.

V ještě dalším provedení zahrnuje netoxinová proteinová sekvence thioredoxinový protein.

V jednom provedení se při způsobu vakcinace používá první čištěný a v podstatě endotoxinů prostý protein zahrnující SEQ ID NO:29. V jiném provedení se při způsobu vakcinace používá druhý čištěný a v podstatě endotoxinů prostý protein zahrnující SEQ ID NO:30.

Vynález dále poskytuje fuzní protein, zahrnující alespoň jednu netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu A Clostridium difficile, tvořenou SEQ ID NO:29. V jednom provedení netoxinová proteinová sekvence zahrnuje thioredoxinový protein. V jiném provedení netoxinová proteinová sekvence dále zahrnuje polyhistidinový úsek.

Vynález poskytuje způsob detekce antigenů Clostridium difficile ve vzorku, při němž se v jakémkoli pořadí získá vzorek s podezřením na obsah antigenů Clostridium difficile, pevné nosné konjugáty, zahrnující protilátky reaktivní s antigeny Clostridium difficile, navázanými na pevný nosič, vzorek a pevné nosné konjugáty se smísí za podmínek, za nichž jsou konjugáty

-20CZ 296806 B6 schopny vázat antigeny Clostridium difficile, a detekuje se vazba. V jednom provedení reagují ptačí protilátky s toxinem A Clostridium difficile. Ve zvláště výhodném provedení ptačí protilátky reagují s toxinem B Clostridium difficile. V jiném výhodném provedení reagují ptačí protilátky s intervalem B-3 toxinu Β. V dalším výhodném provedení ptačí protilátky reagují s toxinem A i toxinem B. Do vynálezu rovněž spadá, jestliže použitý pevný nosič zahrnuje polystyrénové částice. V jednom výhodném provedení vede stupeň míšení ke vzniku viditelných agregátů. Ve výhodném provedení je vzorkem lidská stolice.

V alternativním provedení umožňuje vynález způsob léčby zahrnující získání subjektu vystaveného Clostridium difficile, vykazujícího příznaky zahrnující průjem, a protilátky reagující s Clostridium difficile, kde protilátka je přítomna v terapeutickém množství, které je aplikovatelné, a podávání protilátky subjektu za takových podmínek, že subjekt přestane vykazovat příznaky a je možno ukončit léčbu. Ve zvlášť výhodném provedení vykazuje subjekt dlouhodobé přežití po skončení léčby. V jednom výhodném provedení jsou protilátkami reagujícími s antigeny Clostridium difficile ptačí protilátky. Předpokládá se, že protilátky budou reaktivní vůči různým jednotkám nebo antigenům, zahrnujícím, avšak neomezujícím se na toxin A Clostridium difficile, interval A-6 toxinu A, toxin B Clostridium difficile, interval B-3 toxinu B a kombinaci toxinu A a toxinu B.

Vynález dále poskytuje způsob čištění toxinů Clostridium difficile z kultury, zahrnující v jakémkoli pořadí získání kultury zahrnující organizmy Clostridium difficile a supernatantu zahrnujícího toxiny v roztoku, protilátek reaktivních s toxiny Clostridium difficile imobilizovaných na pevném nosiči, odebrání supernatantu z kultury zahrnující toxiny, přidání supernatantu k imobilizované protilátce za takových podmínek, že protilátky jsou schopny vazby na toxiny, eluování toxinů z imobilizovaných protilátek a detekci veškerých eluovaných toxinů. V jednom výhodném provedení jsou protilátkami reaktivními s antigeny Clostridium difficile ptačí protilátky. Předpokládá se, že při tomto způsobu budou používány různé protilátky včetně protilátek reaktivních vůči různým antigenům nebo jednotkám, zahrnující, avšak neomezující se na toxin A Clostridium difficile, interval A-6 toxinu A, toxin B Clostridium difficile, interval B-3 toxinu B a kombinaci toxinu A a toxinu B.

Vynález poskytuje přípravky zahrnující ptačí antitoxin zaměřený proti proteinu klostridiálního toxinu. Ve výhodném provedení jsou tyto přípravky v pevné dávkové formě. Výraz „pevná dávková forma“ zahrnuje dávkové formy zahrnující tablety, pilulky, kapsle (zahrnující například tzv. gel-cap ve významu, v jakém je používán ve farmaceutickém průmyslu) a všechny jejich variace s prodlouženým uvolňováním (například regulované uvolňování, trvalé uvolňování, časované uvolňování, prodloužený účinek apod.). Výraz „pevná dávková forma“ může navíc dále zahrnovat suspenze (tj. pevné částice zahrnující ptačí antitoxin suspendovaný v kapalném vehikulu; pevné částice mohou dále zahrnovat enterosolventní povlak), které mohou být aplikovány orálně.

V jednom provedení zahrnuje pevná dávková forma ptačího antitoxinu enterosolventní povlak. Ve zvlášť výhodném provedení se enterosolventní povlak rozpouští při pH asi 7,0. Výrazy „při pH asi 7,0“ a „pH asi 7,0“ se používají vzájemně zaměnitelně a vztahují se na rozmezí pH 6,5 až 7,5. Zvlášť výhodné enterosolventní povlaky jsou takové, které zůstávají v podstatě netknuté během průchodu enterosolventní tablety (pilulky, kapsle atd.) žaludkem (pH asi 0 až 2,0) a tenkým střevem (pH asi 5,0 až 6,5), ale rozpouštějí se, dosáhnou-li tlustého střeva (pH asi 7,0). Příklady vhodných enterosolventních povlaků jsou kopolymery kyseliny methakrylové [například Eudragit L nebo S (Rohm Těch, lne., Malden, MÁ)] acetátftalát celulózy (CAP) [například Aquateric (FMC Corp., Philadelphia, PA), který se rozpouští při pH 6,5], acetátsukcinát hydroxypropylmethylcelulózy (HPMCAS) [například Aquoat Grade 3 (Shin-Etsu Chemical Corp., Japonsko), který se rozpouští při pH 7,0] a polyvinylacetátfitalát (PVAP) [například Suretic (Colorcaon, lne., West Point, PA)]. Výraz „ v podstatě netknutý“ v souvislosti s enterosolventně povlečenou tabletou (pilulkou, kapslí atd.) znamená, že při pH pod asi 7,0 je uvolňováno méně než 10 % proteinu (tj. ptačího antitoxinu).

-21 CZ 296806 B6

V jednom provedení zahrnuje ptačí antitoxin, přítomný v pevné dávkové formě, tabletu. Výraz „tableta“ se vztahuje na pevnou dávkovou formu obsahující léčebné látky (například ptačí antitoxin) s vhodnými ředidly, vehikuly, plnivy atd. nebo bez nich. Tableta můžemít různý tvar, velikost a hmotnost a může být tříděna podle způsobu výroby (například tvarovaná tableta, lisovaná tableta atd.). Výraz tableta zahrnuje pilulky.

V dalším provedení obsahují přípravky zahrnující ptačí antitoxiny v pevné dávkové formě polyethylenglykol (PEG). Pevné dávkové formy (například tablety) zahrnující přípravky s lyofilizovanou ptačí protilátkou (tj. antitoxinem) obsahující PEG mohou obsahovat 0 až 60 % (z celkové hmotnosti tablet), přednostně 20 až 40 % PEG. Tablety mohou obsahovat rovněž vodu (stejně jako plniva, pojivá, nastavovadla, barviva atd.). Obsah vody se může měnit; přítomnost vody v tabletě je důsledkem absorpce vody z atmosféry během manipulace s lyofílizovanými přípravky ptačích protilátek před tvorbou tablet nebo během ní. Je-li žádoucí, je možno při tvorbě tablet vodu k pevným přípravkům protilátek úmyslně přidávat.

Vynález dále poskytuje způsob vytváření pevné dávkové formy ptačího antitoxinu zaměřeného proti klostridiálního toxinovému proteinu, zahrnující: a) získání přípravku zahrnujícího ptačí antitoxin zaměřený proti klostridiálnímu toxinovému proteinu v suché formě a b) tvarování tohoto suchého ptačího antitoxinu do tablety. Způsob tvarování suchého antitoxinu do tablety zahrnuje jakýkoli postup schopný uvést pevný antitoxinový přípravek do formy tablety, včetně lisování nebo tvarování antitoxinu. Metody vytváření tablet ze suchého materiálu jsou známy. Ve výhodném provedení se tvarování suchého antitoxinu do tablet provádí lisováním suchého antitoxinu pomocí tabletovacího lisu.

V dalším provedení způsob vytváření pevné dávkové formy zahrnující ptačí antitoxin dále zahrnuje stupeň nanášení enterosolventního povlaku na tabletu. V dalším výhodném provedení způsob vytváření pevné dávkové formy zahrnující ptačí antitoxin používá kompozici, obsahující suchý antitoxin, která obsahuje polyethylenglykol.

Vynález předpokládá vakcinaci lidí a jiných živočichů polypeptidy odvozenými od neurotoxinu C. botulinem, které jsou v podstatě prosté endotoxinu. Tyto botulinové peptidy jsou použitelné rovněž pro produkci antitoxinu. Anti-botulinální antitoxin je vhodný pro ošetřování pacientů, u nichž se projevují nebo hrozí příznaky v důsledku působení toxinů C. botulinum. Organizmy, toxiny a jednotlivé stupně podle vynálezu jsou podrobně popsány dále.

I Druhy Clostridium, klostridiální onemocnění a související toxiny

Výhodné provedení způsobu podle vynálezu je zaměřeno na získání protilátek proti druhům Clostridium, jejich toxinům, enzymům nebo jiným metabolickým produktům, komponentám buněčných stěn nebo syntetickým nebo rekombinačním verzím všech těchto sloučenin. Předpokládá se, že tyto protilátky budou vznikat imunizací lidí nebo jiných živočichů. Vynález není zamýšlen jako omezený na kterýkoli konkrétní toxin nebo kterýkoli druh organizmu. V jednom provedení se jako imunogeny předpokládají toxiny všech druhů Clostridium. Příklady těchto toxinů jsou neuraminidasový toxin C. butyricum, toxiny HT a LT C. sordellii, toxiny A, B, C, D, E, F a G C. botulinum a četné toxiny C. perfringens. V jednom výhodném provedení se jako imunogeny předpokládají toxiny A a B C. difficile. V tabulce 2 jsou uvedeny druhy Clostridium, jejich toxiny a některé antigeny související s onemocněním.

-22CZ 296806 B6

Tabulka 2. Klostridiální toxiny

organismus	toxiny a antigeny související s chorobou
C. botulinum	A, B, Cb C2, D, E, F, G
C. butyricum	neuraminidasa
C. difficile	A, B, enterotoxin (ani A ani B), faktor měnící motilitu, nízkomolekulámí toxin, jiné
C. perfringens	a, β, ε, ι, γ, δ, ν, θ, κ, λ, μ, υ
C. sordelli/ C. bifermentans	HT, LT, α, β,γ
C. novyi	α, β, γ, δ, ε, ζ, ν, θ
C. septicum	α, β, γ, δ
C. histolyticum	α, β, γ, δ, ε plus další enzymy
C. chauvoei	α, β, γ, δ

Nepředpokládá se, že by protilátky, produkované proti jednomu toxinů, byly používány pouze proti tomuto toxinů. Předpokládá se, že protilátky zaměřené proti jednomu toxinů (například enterotoxinu typu A C. perfringens) mohou být používány jako účinný terapeutický prostředek proti jednomu nebo více toxinům produkovaným jinými členy rodu Clostridium nebo jinými organizmy produkujícími toxiny (například Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas aeruginosa, další druhy Pseudomonas atd.) Dále se předpokládá, že protilátky zaměřené proti části toxinů, která se váže na savčí membrány (například enterotoxin A C. pefringens), mohou být použity i proti jiným organizmům. Předpokládá se, že tyto oblasti vážící se na membrány, se budou vyrábět synteticky a používat jako imunogeny.

II. Získávání protilátek u ne-savců

Výhodné provedení způsobu podle vynálezu pro získávání protilátek zahrnuje imunizaci. Předpokládá se však rovněž, že je možno získávat protilátky od ne-savců bez imunizace. V případě, kdy se nepředpokládá imunizace, je možno podle vynálezu používat ne-savce s předem existujícími protilátkami proti toxinům a rovněž ne-savce, kteří mají protilátky proti celým organizmům, na základě reakcí s podávaným antigenem. Jako příklad posledně uvedené možnosti je možno provádět imunizaci syntetickými peptidy nebo rekombinačními proteiny sdílejícími se složkami celého organizmu epitopy.

Ve výhodném provedení předpokládá způsob podle vynálezu imunizaci ne-savců bakteriálním toxinem nebo toxiny. Vynález není zamýšlen jako omezený na kterýkoli konkrétní toxin. V jednom provedení se jako imunogeny předpokládají toxiny ze všech klostridiálních bakteriálních zdrojů (viz tabulka 2). Příklady těchto toxinů jsou neuraminidasový toxin C. butyricum, toxiny A, B, C, D, E, F a G C. botulinum, toxiny α, β. ε a i C. perfringens a toxiny HT a LT C. sordellii. Ve výhodném provedení se jako imunogeny předpokládají toxiny A a B C. difficile.

Zvlášť výhodné provedení zahrnuje použití bakteriálního toxinového proteinu nebo fragmentů toxinových proteinů produkovaných molekulárně biologickými prostředky (tj. rekombinační toxinové proteiny). Ve výhodném provedení imunogen zahrnuje interval 6 toxinů A C. difficile produkovaný technologií rekombinace DNA. V dalším výhodném provedení imunogen zahrnuje interval 3 toxinů B C. difficile produkovaný technologií rekombinace DNA. Rekombinační proteiny toxinů C. difficile mohou být používány jako imunogeny odděleně nebo v kombinaci za účelem produkce protilátek specifických buď pro toxin A C. difficile, toxin B C. difficile, nebo toxiny A i B C. difficile. Konkrétně mohou být proteiny toxinů A a B C. difficile navzájem smíšeny a používány jako jediný imunogen. Alternativně mohou být proteiny toxinů A C. difficile používány odděleně jako imunogen u prvního subjektu. Podobně mohou být proteiny toxinů B C. difficile používány odděleně jako imunogen u druhého subjektu. Antitoxiny, produkované oddě

-23CZ 296806 B6 lenou imunizací dvou oddělených subjektů proteiny toxinu A C. difficile nebo proteiny toxinu B

C. difficile, mohou být spojeny a vytvořit antitoxin zaměřený proti toxinu A i B C. difficile.

Rekombinační proteiny toxinů C. difficile podle vynálezu umožňují produkci protilátek, které jsou specifické pro jediný toxin C. difficile (tj. monospecifické protilátky). To je v kontrastu s biochemickým čištěním toxinu A C. difficile z přírodních zdrojů, které vždy vede k izolaci preparátu toxinu A, kontaminovaného imunologicky významným množstvím toxinu B; podobně biochemickým čištěním toxinu B C. difficile z přírodních zdrojů se izoluje preparát toxinu B, kontaminovaný imunologicky významným množstvím toxinu A. Protože jsou tyto preparáty nerekombinačního toxinu A a/nebo B křížově kontaminovány buď toxinem B, nebo A, dojde při imunizaci živočicha k produkci polyklonálních protilátek, reaktivních vůči toxinu A i B.

Jak je uvedeno dále v oddílu VI, přesná detekce přítomnosti toxinu A a/nebo B ve vzorku vyžaduje dostupnost čistých preparátů toxinů A a B a dostupnost monospecifických protilátek. Použití rekombinačních toxinových proteinů C. difficile tak umožňuje produkci preparátu polyklonálních protilátek, který může být použit pro přesnou detekci jednotlivých toxinů C. difficile i organizmů C. difficile.

Používá-li se imunizace, je přednostní ne-savec z třídy Aves. Předpokládají se všichni ptáci (například kachny, pštrosi, emu, krůty atd.). Výhodným ptákem je kuře. Důležité je, že kuřecí protilátka nefixuje savčí komplement. [Viz Η. N. Benson a d., J. Immunol. 87:616(1961).] Kuřecí protilátka tedy normálně nevyvolává reakci závislou na komplementu. [A. A. Benedict a K. Yamaga, „Immunoglobulins and Antibody Production in Avian Species“, v Comparative Immunology (J. J. Marchaloni, ed.), str. 335-375, Blackwell, Oxford (1966).]. Výhodné antitoxiny podle vynálezu tedy nevykazují vedlejší účinky spojené s komplementem, pozorované u dosud známých antitoxinů.

Používají-li se ptáci, předpokládá se, že protilátka se bude získávat buď z ptačího séra, nebo z vejce. Výhodné provedení zahrnuje získávání protilátky z vejce. Nosné slepice transportují imunoglobulin žloutku („IgY“) v koncentracích rovných nebo převyšujících jeho koncentrace v séru. [Viz R. Patterson a d., J. Immunol. 89:272 (1962) a S. B. Caroll a B. D. Stollar, J. Biol. Chem. 258:24 (1983).]. Kromě toho velký objem produkovaného žloutku značně převyšuje objem séra, které je možno v kterémkoli daném časovém úseku z ptáka získat. Konečně je protilátka z vajec čistší a homogennější; obsahuje mnohem méně neimunoglobulinových proteinů (v porovnání se sérem) a do žloutku je transportována pouze jedna třída imunoglobulinu.

Vezme-li se v úvahu imunizace toxiny, je možno uvažovat modifikaci za účelem snížení toxicity. V tomto ohledu nelze vynález pokládat za omezený imunizací modifikovaným toxinem. Jako imunogen se předpokládá rovněž nemodifikovaný („nativní“) toxin.

Rovněž se nepředpokládá, že by vynález byl omezen typem modifikace - je-li modifikace použita. Vynález zahrnuje všechny typy modifikace toxinu včetně chemického a tepelného zpracování toxinu. Přednostní modifikací je však zpracování formaldehydem.

Nepředpokládá se, že by vynález byl omezen na konkrétní způsob imunizace; vynález zahrnuje všechny způsoby imunizace, zahrnující subkutánní, intramuskulámí, intraperitoneální a intravenózní nebo intravaskulární injekce, stejně jako perorální aplikaci imunogenu.

Vynález dále zahrnuje imunizaci s adjuvans nebo bez něj. (Adjuvans je definováno jako látka, o níž je známo, že zvyšuje imunitní odpověď na jiné antigeny, je-li podávána s jinými antigeny). Je-li použito adjuvans, nepředpokládá se, že by vynález byl omezen na jakýkoli konkrétní typ adjuvans - nebo může být totéž adjuvans, jakmile již bylo použito, používáno po celou dobu. Přestože vynález zahrnuje všechny typy adjuvans, ať používané odděleně nebo v kombinacích, přednost se dává použití kompletního Freundova adjuvans následovaného poněkud později

-24CZ 296806 B6 nekompletním Freundovým adjuvans. Výhodné je dále použití adjuvans Gerbu. Vynález dále zahrnuje použití drůbežího adjuvans RIBI a adjuvans Quil A.

Používá-li se imunizace, zahrnuje vynález různá schémata imunizace. V jednom provedení se kuřeti podává v den 0 a následně v určitých intervalech toxin nebo toxiny. Nepředpokládá se, že by vynález byl omezen na konkrétní intervaly nebo dávky. Podobně se nepředpokládá, že by vynález byl omezen na konkrétní schéma získávání protilátky. Výhodná doba získávání je někdy po dni 100.

Jestliže se používají ptáci a protilátka se získává z vajec, mohou být vejce před zpracováním na protilátku skladována. Je výhodné, skladují-li se vejce po dobu méně než 1 rok při 4 °C.

Předpokládá se, že kuřecí protilátka, produkovaná tímto způsobem, může být extrahována pomocí pufru a použita analyticky. I když je nečištěný, může tento preparát sloužit jako reference účinnosti protilátky před další manipulací (například imunologickým čištěním).

Π. Zvyšování účinnosti protilátek

Používá-li se čištění, předpokládá vynález čištění za účelem zvýšení účinnosti ne-savčích i savčích antitoxinů. Konkrétně vynález předpokládá zvýšení procenta imunoglobulinu reaktivního stoxinem. Přednostně se čištění ptačí protilátky provádí dělením s polyethylenglykolem (PEG).

Vynález předpokládá, že ptačí protilátka se bude nejprve čistit pomocí jednoduchých nenáročných postupů. V jednom provedení se kuřecí protilátka z vajec čistí extrakcí a srážením s PEG. Čištění pomocí PEG využívá rozdílnou rozpustnost lipidů (kterých je ve vaječném žloutkuhojně) a proteinů ve vysokých koncentracích PEG 8000. [Polson a d., Immunol. Comm. 9:495 (1980)]. Tato metoda je rychlá, jednoduchá a relativně levná a poskytuje imunoglobulinovou frakci, která je významně čistší, pokud jde o kontaminaci neimunoglobulinových proteinů, než srovnatelné amoniumsulfátové frakce savčího séra a koňských protilátek. Většina PEG se zvysráženého kuřecího imunoglobulinu odstraní působením ethanolu. Protilátka čištěná pomocí PEG je skutečně dostatečně čistá, takže vynález předpokládá použití PEG-čištěných antitoxinů při pasivní imunizaci intoxikovaných lidí a zvířat.

Vynález dále předpokládá zvyšování účinnosti kompozic obsahujících antitoxin enterosolventním povlečením pevné formy antitoxinů za účelem zlepšení přežití antitoxinů v gastrointestinálním traktu (tj. enterické stability), jak je dále diskutováno v oddílu IV(C).

IV. Ošetření

Vynález předpokládá antitoxinovou terapii pro lidi a další živočichy intoxikované bakteriálními toxiny. Další výhodnou metodou ošetření je parenterální aplikace antitoxinů.

A. Terapeutické přípravky a kombinace

Vynález předpokládá použití terapeutických kompozic antitoxinů. Antitoxinové kompozice mohou zahrnovat antitoxin v pevné nebo kapalné formě.

Nepředpokládá se, že by vynález byl omezen na konkrétní charakter terapeutického přípravku. Tyto přípravky mohou být k dispozici například spolu s fyziologicky tolerovatelnými kapalnými, gelovými nebo pevnými nosiči, ředidly, adjuvans a vehikuly. Dále mohou být antitoxiny používány společně s jinými terapeutickými prostředky včetně antibiotik.

Jak výše uvedeno, mohou být tyto terapeutické přípravky podávány savcům pro veterinární použití, například domácím zvířatům, a pro klinické použití u lidí způsobem podobným jako u jiných

-25CZ 296806 B6 terapeutických prostředků. Obecně se dávka nutná pro terapeutickou účinnost liší podle typu použití a způsobu podávání, stejně jako podle konkrétních požadavků jednotlivých hostitelů.

Z hlediska způsobu podávání mohou být antitoxiny používány pro orální, intravenózní, intraperitoneální, intramuskulámí nebo intrathekální aplikaci. Formulace pro tyto aplikace mohou zahrnovat účinné množství antitoxinu ve sterilní vodě nebo fyziologickém salinickém roztoku.

Na druhé straně mohou tyto formulace obsahovat běžně používané přísady, jako jsou pojivá, plniva, nosiče, konzervační prostředky, stabilizační prostředky, emulgátory, pufry a vehikula, jako jsou například ve farmaceutické čistotě mannitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, natriumsacharin, celulóza, uhličitan hořečnatý apod. Tyto kompozice typicky obsahují 1 až 95 %, přednostně 2 až 70 % účinné složky.

Kompozice se přednostně připravují pro orální aplikaci, buď jako kapalné roztoky, nebo suspenze; mohou být také připravovány pevné formy, zahrnující pevné formy vhodné pro rozpouštění nebo suspendování v kapalině před podáváním. Pevné formy antitoxinů mohou dále zahrnovat enterosolventní povlak. Kompozice se přednostně připravují jako injekční, buď jako kapalné roztoky, nebo suspenze; mohou být rovněž připravovány pevné formy vhodné pro rozpouštění nebo suspendování v kapalině před podáváním.

Antitoxiny podle vynálezu se často mísí s ředidly nebo vehikuly, které jsou fyziologicky tolerovatelné a kompatibilní. Vhodná ředidla a vehikula jsou například voda, salinický roztok, živné formulace (například Ensure®, Enfamil® atd.), dextróza, glycerol apod. a jejich kombinace, kromě toho, je-li to žádoucí, mohou kompozice obsahovat menší množství pomocných látek, jako jsou smáčecí a emulgační prostředky, stabilizační nebo pufrující prostředky.

B. Dávkování antitoxinu

Je známo, že je nutno nalézt kompromis při podávání běžně dostupného antitoxinu, který je obvykle produkován ve velkém množství velkými zvířaty, jako jsou koně; je nutno podávat dostatečné množství antitoxinu, aby byl neutralizován toxin, ale ne tolik, aby se zvýšilo riziko nežádoucích vedlejších účinků. Tyto vedlejší účinky jsou vyvolávány: i) citlivostí pacienta na cizí (například koňské) bílkoviny, ii) anafylaktickými nebo imunogenními vlastnostmi neimunoglobulinových proteinů, iii) fixací komplementu u savčích protilátek a/nebo iv) celkovou zátěží podané cizí bílkoviny. Tuto rovnováhu je velmi obtížné dodržet, jestliže je možno stupeň intoxikace (a tudíž potřebnou úroveň antitoxinové terapie), jak výše uvedeno, odhadnout pouze přibližně.

Vynález předpokládá podstatné snížení vedlejších účinků, takže se této rovnováhy dosahuje snadněji. Ošetření podle vynálezu předpokládá snížení vedlejších účinků použitím PEG-čištěného antitoxinu z ptáků.

V jednom provedení ošetření podle vynálezu předpokládá použití PEG-čištěného antitoxinu z ptáků. Použití protilátky odvozené ze žloutku a čištěné PEG jako antitoxinu umožňuje podávání 1) ptačí protilátky nefixující (savčí) komplement, 2) méně heterogenní směsi neimunoglobulinových proteinů a 3) méně celkového proteinu k dosažení ekvivalentní hmotnosti aktivní protilátky přítomné v běžně dostupných antitoxinech. Ne-savčí zdroj antitoxinu umožňuje použití pro pacienty, kteří jsou citliví na koňské nebo jiné savčí sérum.

Jak platí v případech botulismu, stupeň expozice jedince toxinu C. difficile a prognóza se často obtížně odhadují a závisí na velkém počtu faktorů (například množství inokula, toxigenitě a sérotypu daného kmene C. difficile atd.). Pro stanovení dávek při podávání antitoxinu je tedy obvykle důležitější klinická manifestace pacienta než kvantitativní diagnostický test. Pro mnoho onemocnění spojených s toxinem (například botulismus, tetanus, záškrt atd.) totiž neexistuje rychlý kvantitativní test pro detekci přítomnosti toxinu v organizmu. Tato onemocnění spojená

-26CZ 296806 B6 s toxiny představují spíše naléhavé lékařské případy, které ospravedlňují okamžité ošetření.

Potvrzení etiologického činitele nesmí zpozdit zahájení terapie, protože stav zasaženého pacienta se může rychle zhoršovat. Navíc k počátečnému ošetření antitoxinem mohou být indikovány následné dávky, jak onemocnění postupuje. Dávkování a časování těchto následných dávek je závislé na znacích a příznacích nemoci u každého jednotlivého pacienta.

Předpokládá se, že má-li být antitoxin podáván parenterálně, zahrnuje podávání antitoxinu zasaženému jedinci počáteční injekci přibližně 10 ml dávky imunoglobulinu (s méně než přibližně 1 g celkových proteinů). V jednom výhodném provedení se předpokládá, že alespoň 50 % počáteční injekce tvoří imunoglobulin. Předpokládá se rovněž, že se pro léčbu používá čistší imunoglobulin, kdy přibližně 90 % počáteční injekce tvoří imunoglobulin. Používá-li se čistší imunoglobulin (například čištěný IgY), předpokládá se, že celkové proteiny tvoří méně než přibližně 100 mg. Předpokládají se rovněž dodatečné dávky v závislosti na znacích a příznacích souvisejících s postupem choroby spojené s C. difficile.

Předpokládá se, že jestliže má být antitoxin podáván orálně, zahrnuje podávání antitoxinu zasaženému jedinci léčebný běh (tj. počáteční a následné dávky) zahrnující podávání terapeutického přípravku zahrnujícího asi 50 g, přednostně asi 4 až 5 g antitoxinu.

C. Podávání antitoxinu

I když není úmyslem omezovat cestu podávání, předpokládá vynález způsob antitoxinové léčby bakteriální intoxikace, při němž je podávání antitoxinu parenterální nebo orální.

V jednom provedení se antitoxin parenterálně podává subjektu ve vodném roztoku. Nepředpokládá se, že by parenterální podávání bylo omezeno na konkrétní cestu. Naopak se uvažuje spoužitím všech cest parenterálního podávání. V jednom provedení se parenterální podávání provádí intravenózní injekcí.

V jednom provedení se antitoxin podává v pevné formě (například tablety, kapsle). V alternativním provedení se antitoxin podává ve vodném roztoku. Používá-li se vodný roztok, má tento roztok dostatečnou iontovou sílu pro solubilizaci bílkovinné protilátky a současně je schopný požití při orální aplikaci. Aplikační roztok může být rovněž pufrován (například karbonátový pufr o pH 9,5), což může neutralizovat žaludeční kyseliny a stabilizovat protilátky, jsou-li protilátky podávány orálně. V jednom provedení je aplikačním roztokem vodný roztok. V jiném provedení je aplikačním roztokem umělý výživa. Přednostně je aplikačním roztokem kojenecká výživa. Další provedení předpokládá podávání lyofílizované protilátky enkapsulované nebo mikroenkapsulované ve sloučeninách odolných vůči kyselinám.

Způsoby nanášení enterosolventních povlaků na farmaceutické sloučeniny jsou v oboru známy [jsou známy společnosti specializují se na povlékání farmaceutických sloučenin, například The Coating Plače (Verona, WI) a AAI (Wilmington, NC)]. Enterosolventní povlaky, které jsou odolné vůči žaludečním kyselinám a jejichž uvolňování (tj. rozpouštění povlaku k uvolnění farmaceutické sloučeniny) je závislé na pH, jsou komerčně dostupné [například polymethakryláty Eudragit® L a Eudragit® S (Róhm GmbH)]. Eudragit® Sje rozpustný ve střevní tekutině od pH 7,0; tento povlak může být používán k mikroenkapsulaci lyofilizovaných antitoxinových protilátek a částice se pro orální aplikaci suspendují v roztoku o hodnotě pH nad nebo pod 7,0. Mikročástice zůstávají intaktní a nerozpuštěné, dokud nedosáhnou střev, kde pH vyvolá jejich rozpuštění a uvolnění antitoxinu.

Vynález je zaměřen na zlepšení enterické stability terapeutického antitoxinu [Enterická stabilita je definována jako stabilita antitoxinu během průchodu gastrointestinálním traktem; enterická stabilita se zlepší zvýšením množství orálně aplikovaného antitoxinu, který je dodán na požadované místo (tj. střeva) ve funkční nebo aktivní formě], O protilátkách, a zejména ptačích, je známo, že jsou významně denaturovány, jsou-li vystaveny kyselým roztokům (například žalu-27CZ 296806 B6 deční tekutině). Denaturace protilátky vede ke ztrátě funkčnosti (tj. ztrátě schopnosti vázat se na specifický cíl). Kromě denaturace protilátek v důsledku nízkého pH, které se vyskytuje v částech gastrointestinálního traktu, může docházet k proteolytické degradaci antitoxinu v důsledku štěpení enzymy. Vynález zlepšuje enterickou stabilitu terapeutických antitoxinů jejich povlékáním enterosolventním povlakem. Enterosolventní povlak zabraňuje kysele vyvolané denaturaci antitoxinu a brání expozici antitoxinu enzymům přítomným v horních částech gastrointestinálního traktu.

Podle vynálezu se ukazuje, že použití enterosolventních povlaků, odolných vůči kyselinám, brání uvolnění mikroenkapsulovaného antitoxinu (například enterosolventně povlečeného antitoxinu) do simulované žaludeční tekutiny a současně umožňuje uvolňování antitoxinu v simulované střevní tekutině. Enterické přežití terapeutických antitoxinů může být zlepšeno také použitím vehikul (více nebo méně inertních látek přidávaných k terapeutické sloučenině jako ředidlo nebo pro dodání tvaru nebo konzistence, je-li sloučenina ve formě tablet). Vehikula, jako jsou karbonátové pufry o pH asi 9,5 nebo výživné formulace (například Ensure®, Enfamil® atd.) mohou nepřímo snižovat denaturaci antitoxinu v žaludku zvyšováním pH žaludku nebo poskytováním dalšího proteinu konkurujícího při degradaci žaludečními enzymy. Naproti tomu použití enterosolventních povlaků na antitoxinové kompozici přímo brání denaturaci nebo štěpení antitoxinu v žaludku tím, že brání uvolňování antitoxinu z enterosolventně povlečené částice, dokud částice nedosáhne střevní tekutiny, která má zásadité pH. Použití enterosolventních povlaků je zvlášť výhodným prostředkem zlepšení stability terapeutických antitoxinů podle vynálezu v kyselém prostředí.

Vynález zahrnuje způsob léčení, který může být aplikován při léčbě akutní intoxikace. V jednom provedení se podává antitoxin orálně buď v aplikačním roztoku nebo ve formě tablet v terapeutické dávce subjektu intoxikovanému bakteriálním toxinem, který sloužil jako imunogen pro antitoxin.

Vynález rovněž zahrnuje způsob léčení, který může být aplikován profylakticky. V jednom provedení se antitoxin podává orálně v aplikačním roztoku v terapeutické dávce subjektu za účelem zabránění intoxikace subjektu bakteriálním toxinem, který sloužil jako imunogen pro produkci antitoxinu. V jiném provedení se antitoxin podává orálně v pevné formě, jako jsou tablety, nebo jako mikroenkapsulované částice. Mikroenkapsulace lyofilizované protilátky pomocí sloučenin, jako je Eudragit® (Rohm Těch, lne.) nebo polyethylenglykol, které se rozpouštějí v širokém rozmezí jednotek pH, umožňuje orální aplikaci pevného antitoxinu v kapalné formě (tj. v suspenzi) příjemcům neschopným tolerovat podávání tablet (například dětem nebo pacientům na umělé výživě). Ve výhodném provedení je lyofilizovaná protilátka povlečena Eudragitem® L30D (Rohm Těch, lne.). V jednom výhodném provedení je subjektem dítě. V jiném provedení se protilátka, produkovaná proti celému bakteriálnímu organizmu, podává orálně subjektu v aplikačním roztoku v terapeutické dávce.

V. Vakcíny proti druhům klostridií

Vynález zahrnuje vytvoření mono- a multivalentních vakcín pro ochranu živočicha (zejména lidí) proti několika druhům klostridií. Zvlášť zajímavé jsou vakcíny, které stimulují produkci humorální imunitní odpovědi na C. difftcile, C. tetani a C.botulinum u člověka. Antigeny tvořící vakcínový preparát mohou být nativní nebo rekombinačně získané toxinové proteiny z výše uvedených druhů klostridií. Jestliže se jako imunogeny používají toxinové proteiny, jsou obvykle modifikovány za účelem snížení toxicity. Tato modifikace může být chemická nebo genetická (tj. technologie rekombinace DNA). Obecně je preferována genetická detoxifikace (tj. exprese netoxických fragmentů v hostitelské buňce), protože exprese netoxických fragmentů v hostitelské buňce vylučuje přítomnost intaktního aktivního toxinu ve finálním preparátu. Požaduje-li se však chemická modifikace, představuje výhodnou modifikaci toxinu ošetření formaldehydem.

-28CZ 296806 B6

Podle vynálezu se jako antigeny v mono- a multivalentních vakcínových preparátech používají rekombinační toxinové proteiny C. difficile. Pro přípravu těchto mono- a multivalentních vakcín mohou být jako antigeny používány rozpustné rekombinační proteiny toxinu A a B C. difficile, v podstatě prosté endotoxinu, mohou být používány samotné nebo ve spojení buď s rekombinačními, nebo nativními toxiny nebo toxoidy z C. botulinum, C. difficile a C. tetani. Předpokládá se, že v důsledku strukturní podrobnosti proteinů toxinů C. botulinum a C. tetani je možno použít vakcínu zahrnující toxinové proteiny C. difficile a botulinum (nativní nebo rekombinační nebo jejich směs) ke stimulaci imunitní odpovědi vůči C. botulinum, C. tetani a C. difficile.

Nepříznivým důsledkům vystavení toxinům C. difficile je možno zamezit imunizací ohrožených subjektů přípravky, které dodávají imunitu jako je chemicky nebo geneticky detoxifikovaný toxin.

Vakcíny, které dodávají imunitu vůči jednomu nebo více typům toxinů A a B, by byly použitelné jako prostředky ochrany živočichů včetně lidí před škodlivými účinky toxinů C. difficile. Subjekt může být imunizován kompozice, zahrnujícími jeden nebo více toxinových proteinů C. difficile, za účelem vyvolání neutralizujících protilátek u subjektu. Subjekt může být imunizován prvním imunogenem zahrnujícím proteiny toxinu B C. difficile za účelem produkce neutralizujících protilátek zaměřených proti toxinům A a B C. difficile. Alternativně může být subjekt imunizován jediným imunogenem zahrnujících proteiny toxinu A a B C. difficile.

Obecně není chemická detoxifíkace bakteriálních toxinů pomocí prostředků, jako je formaldehyd, glutaraldehyd nebo peroxid vodíku, optimální pro vytváření vakcín nebo antitoxinů. Je nutno dosáhnout jemné rovnováhy mezi přílišnou a příliš malou chemickou modifikací. Je-li ošetření nedostatečné, může vakcína ztratit účinnost díky destrukci nativních imunogenních determinant. Dalším velkým omezením použití botulinálních toxoidů pro tvorbu antitoxinů nebo vakcín jsou vysoké výrobní náklady. Z výše uvedených důvodů je žádoucí vývoj způsobů výroby netoxických, avšak imunogenních toxinových proteinů C. difficile.

Rekombinační toxinové proteiny C. difficile se produkují v hostitelských buňkách, jako je E. coli, buď v rozpustné nebo nerozpustné formě. Nerozpustné rekombinační proteiny se nacházejí v inkluzních tělískách. Protein inkluzního tělíska musí být před čištěním a/nebo podáním hostiteli solubilizován. Drsné zacházení s proteinem inkluzního tělíska, nutné k této solubilizaci, může snížit imunogenitu čištěného proteinu. V ideálním případě jsou rekombinační proteiny, použitelné jako vakcíny, exprimovány jako rozpustné proteiny ve vysoké hladině (tj. vyšší nebo rovné asi 0,75 % celkových buněčných proteinů) n E. coli nebo jiných hostitelských buňkách. To usnadňuje produkci a izolaci dostatečných množství imunogenu ve vysoce čištěné formě (tj. v podstatě prosté kontaminace endotoxinem nebo jiným pyrogenem). Schopnost exprimovat rekombinační proteiny jako rozpustné proteiny v E. coli je výhodná díky nízkým nákladům na růst v porovnání s hmyzími nebo savčími tkáňovými kulturami.

Tento vynález poskytuje rozpustné toxinové proteiny C. difficile, produkované v ekonomických hostitelských buňkách (například E. coli). Dále poskytuje způsoby izolace čištěných rozpustných toxinových proteinů C. difficile, které jsou vhodné pro imunizaci lidí a jiných živočichů. Tyto rozpustné čištěné preparáty toxinových proteinů C. difficile poskytují základ pro zlepšené vakcínové přípravky a usnadňují produkci antitoxinů.

Jestliže se jako vakcíny používají rekombinační klostridiální toxinové proteiny, produkované v gram-negativních bakteriích (například E. coli), pak se před podáním hostitelskému živočichovi čistí pro odstranění endotoxinu. Za účelem vakcinace hostitele se podává imunogenně účinné množství čištěného rekombinačního klostridiálního toxinového proteinu, v podstatě prosté endotoxinu v kterémkoli z různých fyziologicky přijatelných známých nosičů. Jestliže se podává pro účely vakcinace, může být čištěný rekombinační klostridiální toxinový protein, v podstatě prostý endotoxinu, používán samostatně nebo ve spojení se známými adjuvans, zahrnujícími kamenec draselný, fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý, Gerbuco adjuvans (GMDP; C. C.

-29CZ 296806 B6

Biotech Corp.), adjuvans RIBI (MPL; RIBI Immunochemical Research, lne.), QS21 (Cambridge

Biotech). Adjuvans na bázi kamence a hliníku jsou zvlášť preferována, mají-li být vakcíny podávány lidem. Imunizace může probíhat nasální, orální, intramuskulární, intraperitoneální nebo subkutánní cestou.

Vynález zahrnuje použití rozpustných preparátů fúzních proteinů, v podstatě prostých endotoxinu, zahrnujících části toxinů A a B C. difficile, jako vakcíny. V jednom provedení vakcína zahrnuje část toxinu C. difficile a polyhistidinový úsek (nazývaný také jako histidinová značka). Ve zvlášť výhodném provedení je fúzní protein, zahrnující část toxinového proteinu C. difficile a polyhistidinový úsek, exprimován s použitím série pET expresních vektorů (Novagen). Expresní systém pET používá vektor obsahující promotor T7, který kóduje fúzní protein, a hostitelskou buňku, která může být indukována k expresi T7 DNA polymerázy (tj. hostitelský kmen DE3). produkce fúzních toxinových proteinů C. difficile, obsahujících histidinový úsek, není omezena na použití konkrétního expresního vektoru a hostitelského kmene. Pro expresi proteinových sekvencí C. difficile jako fúzního proteinu obsahujícího histidinový úsek může být použito několik komerčně dostupných expresních vektorů a hostitelských kmenů (například série pQE (pQE-8, 12, 16, 17, 18, 30, 31, 32, 40, 41, 42, 50, 51, 52, 60 a 70) expresních vektorů (Qiagen), které se používají s hostitelskými kmeny M15[pRE/4] (Qiagen) a SG13009[pREP4] (Qiagen), může být použita k expresi fúzních proteinů obsahujících šest histidinových zbytků na aminoterminálním konci fúzního proteinu.

VI. Detekce toxinu

Vynález zahrnuje detekci bakteriálního toxinu ve vzorku. Výraz „vzorek“ je v popisu a v nárocích používán v nejširším smyslu. Na jedné straně zahrnuje specimen nebo kulturu. Na druhé straně zahrnuje jak biologické, tak environmentální vzorky.

Biologické vzorky mohou tvořit živočišné, včetně lidských, tekutiny, pevné látky (například stolice) nebo tkáň; kapalné a pevné potravinářské produkty a složky, jako jsou mlékárenské produkty, zelenina, maso a masné produkty a odpad. Environmentální vzorky zahrnují environmentální materiály, jako je povrchová voda, půda, voda a průmyslové vzorky, stejně jako vzorky získané z pomůcek, nástrojů a zařízení pro zpracování potravin a mléka pro jednorázové i opakované použití. Tyto příklady však v žádném případě neomezují typy vzorků, použitelné podle vynálezu.

Jak je uvedeno výše v oddíle IV, onemocnění spojená s toxiny představují naléhavé lékařské případy, které odůvodňují okamžité ošetření, protože existující metodologie neposkytují rychlé kvantitativní testy na přítomnost toxinů nebo organizmů C. difficile, zahajuje se léčba subjektů, u nichž je podezření na onemocnění spojené s C. difficile, před stanovením množství nebo povahy přítomného toxinu nebo organizmu. Pokud by byl k dispozici rychlý test na toxiny a organizmy C. difficile, bylo by možno stanovit dávkování terapeutických sloučenin tak, aby poskytovaly intoxikovanému subjektu maximální přínos. Specifické protilátky proti toxinu A a B C. difficile podle vynálezu umožňují rychlé a kvantitativní testy na toxiny nebo organizmy C. difficile.

NyaáXez. zahrnuje detekci bakteriálního toxinu metodou kompetitivní imunoanalýzy, která používá rekombinační proteiny toxinu A a B, protilátky vytvořené proti rekombinačním proteinům bakteriálních toxinů. Fixní množství rekombinačních toxinových proteinů je imobilizováno na pevném nosiči (například mikrotitrační destičce), načež se přidá biologický vzorek s podezřením na obsah bakteriálního toxinu. Biologický vzorek se nejprve smísí s afinitně čištěnými nebo PEG frakcionovanými protilátkami zaměřenými proti rekombinačnímu toxinovému proteinu. Pak se přidá reporterová látka, která je schopna detekovat přítomnost protilátky navázané na mobilizovaný toxinový protein. Reporterová látka může zahrnovat protilátkou s vazebnou specifitou pro antitoxin napojený na molekulu, která se používá k identifikaci přítomnosti reportérové látky. Jeli ve vzorku přítomen toxin, bude tento toxin soutěžit s imobilizovaným toxinovým proteinem o

-30CZ 296806 B6 vazbu na anti-rekombinační protilátku, a tím snižovat signál získaný po přídavku reportérové látky. Jako kontrola se používá roztok, ke kterému není přimíšena protilátka. Ten poskytuje nejvyšší (tj. referenční) signál.

Vynález rovněž zahrnuje detekci bakteriálního toxinů metodou „sendvičové“ imunoanalýzy, která používá protilátky zaměřené proti rekombinačním bakteriálním toxinovým proteinům. Afínitně čištěné protilátky zaměřené proti rekombinačním bakteriálním toxinovým proteinům jsou imobilizovány k pevnému nosiči (například mikrotitračním destičkám). Pak se přidávají biologické vzorky s podezřením na obsah bakteriálních toxinů s následným promytím k odstranění v podstatě veškerého nenavázaného antitoxinu. Biologický vzorek se pak vystaví působení reportérové látky, která se váže na antitoxin, a pak se promyje od v podstatě veškeré nenavázané reportérové látky. Reporterová látka může zahrnovat protilátku s vazebnou specifitou pro antitoxin napojený na molekulu, která se používá k identifikaci přítomnosti reportérové látky. Identifikace reportérové látky v biologické tkáni indikuje přítomnost bakteriálního toxinů.

Předpokládá se rovněž detekce bakteriálního toxinů přeléváním kapalin (například polévek a jiné tekuté stravy a krmiv včetně výživných doplňků pro lidi a jiné živočichy) přes imobilizovanou protilátku, která je zaměřena proti bakteriálnímu toxinů. Předpokládá se, že imobilizovaná protilátka bude přítomna v tomto nosiči nebo na něm, přičemž jde o patrony, kolony, kuličky nebo jiné pevné nosné médium. V jednom provedení se po expozici kapaliny imobilizovanou protilátkou promytím v podstatě odstraní nenavázaný toxin. Expozice kapaliny se pak vystaví reportérové látce, která detekuje přítomnost navázaného toxinů. Ve výhodném provedení je reportérovou látkou enzym, fluorescenční barvivo nebo radioaktivní sloučenina napojená na protilátku, která je zaměřena proti toxinů (tj. „sendvičová“ imunoanalýza). Předpokládá se rovněž, že detekční systém bude podle potřeby vyvíjen (například přídavkem enzymového substrátu do enzymových systémů, pozorování pomocí fluorescenčního záření u fluorescenčních barvivových systémů a kvantifikace radioaktivity v radioaktivních systémech).

Příklady provedení vynálezu

K osvětlení některých výhodných provedení a aspektů vynálezu slouží následující příklady, které jej však žádným způsobem neomezují.

V následujícím popisu se používají tyto zkratky: °C (stupeň Celsia), min^-1 (otáčky za minutu), BBS-Tween (borátem pufrovaný salinický roztok obsahující Tween), BSA (hovězí sérový albumin), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), CFA (kompletní Freundovo adjuvans), IFA (nekompletní Freundovo adjuvans), IgG (imunoglobulin G), IgY (imunoglobulin Y), IM (intramuskulámí), IP (intraperitoneální), IV (intravenózní nebo intravaskulámí), SC (subkutánní), H₂O (voda), HC1 (kyselina chlorovodíková), LD₁₀₀ (letální dávka po 100 % pokusných zvířat), aa (aminokyselina), HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie, kD (kilodalton), g (gram), pg (mikrogram), mg (miligram), ng (nanogram), pl (mikrolitr), ml (mililitr), mm (milimetr), nm (nanometr), pm (mikrometr), M (molámí), mM (milimolámí), MW (molekulová hmotnost) s (sekunda), min (minuta), h (hodina), MgCl₂ (chlorid hořečnatý), NaCl (chlorid sodný), Na₂CO₃ (uhličitan sodný), OD₂₈₀ (optická hustota při 280 nm), OD₆oo (optická hustota při 600 nm), PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu), PBS [fosfátem pufrovaný salinický roztok (150 mM NaCl, 10 mM natriumfosfátového pufru, pH 7,2)], PEG (polyethylenglykol), PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid), SDS (dodecylsulfát sodný), Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethan), Ensure® (Ensure®, Ross Laboratories, Columbus OH), Enfamil® (Enfamil®, Mead Johnson), w/v (hmotnost na objem), v/v (objem na objem), Accurate Chemical (Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY), Amicon (Amicon, lne., Beverly, MA), Amresco (Amresco, lne., Solon, OH), ATCC (Američan Type Culture Collection, Rockville, MD), BBL (Baltimore Biologics Laboratory (divize Becton Dickinson), Cockeysville, MD), Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ), BioRad (BioRad, Richmond, CA), Biotech (C-C Biotech Corp. Poway, CA), Charles River (Charles River Laboratories,

-31 CZ 296806 B6

Wilmington, MA), Cocalico (Cocalico Biologicals lne., Reamstown, PA), CytRx (CytRx Corp., Norcross, GA), Falcon (například Baxter Healthcare Corp., MacGraw Park, IL, a Becton Dickinson), FDA (Federal Food and Drug Administration), Fisher Biotech (Fisher Biotech, Springfield, NJ), GIBCO (Grand Island Biologie Company/BRL, Grand Island, NY), GibcoBRL (Life Technologies, lne., Gaithersburg, MD), Harlan Sprague Dawley (Harlan Sprague Dawley, lne., Madison, WI), Mallinckrodt (divize Baxter Healthcare Corp., McGraw Park, IL), Millipore (Millipore Corp., Marlborough, MA), New England Biolabs (New England Biolabs, lne. Beverly, MA), Novagen (N Novagen, lne., Madison, WI), Pharmacia (Pharmacia, lne., Piscataway, NJ), Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA), RIBI (RIBI Immunochemical Research, lne., Hamilton, MT), Sasco (Sasco, Omaha, NE), Showdex (Showa Denko America, lne., New York, NY), Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), Sterogene (Sterogene, lne., Arcadia, CA), Těch Lab (Těch Lab, lne., Blacksburg, VA) a Vaxcell (Vaxcell, lne., přidružená společnost CytRx Corp., Norcross, GA).

Je-li v popisu uváděn rekombinační protein, je na něj stručně poukazováno pomocí aminokyselin v sekvenci toxinu přítomných v rekombinačním proteinu, zaokrouhlených na nejbližší desítku. Například rekombinační protein pMB 1850-2360 obsahuje aminokyseliny 1852 až 2362 proteinu toxinu B C. difficile. V popisu jsou uvedeny konstrukční detaily pro všechny rekombinační proteiny, aby odborník přesně věděl, které aminokyseliny jsou v daném rekombinačním proteinu přítomny.

Příklad 1

Produkce vysokého titru protilátek ke Clostridium difficile u slepice

Ukázalo se, že protilátky proti určitým patogenním organizmům jsou účinné při léčbě onemocnění, vyvolaných těmito organizmy. Nebylo zjištěno, zda je možno produkovat protilátky proti Clostridium difficile, které by byly účinné při léčbě infekce vyvolané tímto organizmem. C. difficile tedy bylo testováno jako imunogen pro produkci slepicích protilátek.

Pro stanovení optimální průběhu produkce vysokého titru vaječných protilátek proti celým organizmům C. difficile byly vyzkoušeny různé imunizační kmeny a různé imunizační koncentrace. Příklad zahrnoval (a) přípravu bakteriálního imunogenu, (b) imunizaci, (c) čištění antibakteriálních kuřecích protilátek a (d) detekci antibakteriálních protilátek v čištěných preparátech IgY.

a) Příprava bakteriálního imunogenu

Kmeny C. difficile 43594 (sérotyp A) a 43596 (sérotyp C) byly původně získány z ATCC. Tyto dva kmeny byly vybrány proto, že představují dva z nejběžněji se vyskytujících sérotypů izolovaných z pacientů s pseudomembránovou kolitidou, související s antibiotiky. [Delmee a d., J. Clin. Microbiol., 28(10):221 (1990).] Tyto kmeny byly navíc dříve charakterizovány s ohledem na virulenci na modelu infekce C. difficile na syrském křečkovi. [Delmee a d., J. Med. Microbiol., 33:85 (1990).]

Bakteriální kmeny byly odděleně kultivovány po dobu 48 h na agaru se srdcovým a mozkovým nálevem při 37 °C v zařízení Gas Pack Jar (BBL, Cockeysville, MD), vybaveném anaerobním obalem Gas Pack Plus (BL). byla použita 48h kultivace, protože produkuje lepší růst a organizmy jsou více křížově reaktivní s ohledem na výskyt povrchových antigenů. Čím vyšší je stupeň křížové reaktivity našich preparátů IgY, tím lepší je pravděpodobnost širokého rozmezí účinnosti proti různým kmenům a sérotypům. [Torna a d., J. Clin. Microbiol., 26(3):426 (1988).]

Vzniklé organizmy byly setřeny z povrchu agaru pomocí sterilního tamponu s dacronovým koncem a suspendovány v roztoku obsahujícím 0,4 % formaldehydu v PBS, pH 7,2. Tato koncentrace formaldehydu byla popsána jako produkující dobré výsledky pro účely přípravy suspenzí

-32CZ 296806 B6 imunogenů celého organizmu pro tvorbu polyklonálního anti-C. difflcile séra u králíků. [Delmee a d., J. Clin. Microbiol., 21:323 (1985), Davies a d., Microbial Path., 9:141 (1990).] Tímto způsobem byly připraveny dvě oddělné bakteriální suspenze, pro každý kmen jedna. Obě suspenze pak byly inkubovány 1 h při 42 °C. Po této době zpracování formaldehydem byly suspenze odstřeďovány 20 min při 4200 x g a vzniklé pelety byly dvakrát promyty normálním salinickým roztokem. Promyté pelety, které obsahovaly celé organizmy ošetřené formalinem, byly resuspendovány v čerstvém normálním salinickém roztoku tak, aby visuální turbidita každé suspenze odpovídala McFarlandovu standardu č. 7. [M.A.C. Edelstein, „Processing Clinical Specimens for Anaerobic Bacteria: Isolation and Identifícation Procedures“, in: S. M. Finegold a d. (ed.), Bailey and Scotťs Diagnostic Microbiology, str. 477-507, C. V. Mosby Co. (1990). Příprava McFarlandových nefelometrických standardů a odpovídající přibližný počet organizmů pro každou zkumavku je detailně popsán na str. 172-173 tohoto svazku. Každá z obou suspenzí s hodnotou 7 pak byla rozdělena na dva objemy. Jeden objem každé suspenze byl volumetricky adjustován přídavkem salinického roztoku, aby odpovídal visuální turbiditě McFarlandova standardu č. 1 [Tamtéž], Suspenze s hodnotou 1 obsahovaly přibližně 3.10⁸ organizmů/ml a suspenze s hodnotou 7 přibližně 2.10⁹ organizmů/ml. [Tamtéž], Čtyři vzniklé suspenze s upravenou koncentrací organizmů C. difficile, ošetřených formalinem, byly považovány za „suspenze bakteriálních imunogenů“. Tyto suspenze byly použity bezprostředně po přípravě pro počáteční imunizaci. [Viz oddíl (b).]

Postup ošetření formalinem nevedl k získání 100 % neživotných bakterií v suspenzích imunogenů. Za účelem zvýšení úrovně usmrcení byla zvýšena jak koncentrace formalinu, tak délka působení, jak je uvedeno dále v tabulce 3. (Přestože životnost se silnějším působením formalinu poklesla, nebylo dosaženo 100% neživotnosti suspenzí bakteriálních imunogenů.) V následných imunogenových preparátech byly proto formalinové roztoky připravovány v normálním salinickém roztoku místo v PBS. V den 49, tj. páté imunizace, byly přebytečné objemy čtyř dříve uvedených suspenzí bakteriálních imunogenů zmrazený na -70 °C a uchovány pro použití při všech následujících imunizacích.

b) Imunizace

Pro počáteční imunizaci byl objem 1,0ml každé zvýše uvedených suspenzí bakteriálního imunogenu zvlášť emulgován v 1,2 objemu CFA (GIBCO). Každou ze čtyř emulgovaných suspenzí imunogenu byly imunizovány dvě slepice (ještě nenesoucí) bílého leghomského plemene o stáří čtyř měsíců, (není nutno používat ještě nenesoucí slepice; je možno použití i aktivní nosnice). Každá slepice obdržela celkový objem přibližně 1,0 ml jedné emulgované suspenze imunogenu ve čtyřech injekcích (dvou subkutánních a dvou intramuskulámích) o objemu přibližně 250 μΐ. Tímto způsobem byly zahájeny celkem čtyři různé imunizační kombinace s použitím dvou slepic na kombinaci za účelem zhodnocení jak účinku imunizační koncentrace na produkci protilátek vaječného žloutku (IgY), tak mezikmenovou křížovou reaktivitu IgY produkovaného proti heterologním kmenům. Tyto čtyři imunizace jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3. Imunizační skupiny

označení skupiny	imunizační kmen	přibližná imunizační dávka
CD 43594, #1	kmen C. difficile 43594	1,5.108 organismú/slepici
CD 43594, #7	» n	1,0.10® organismú/slepici
CD 43594, #1	kmen C. difficile 43596	1,5.109 organismú/slepici
CD 43594, #7	»> Jí	1,0.109 organismú/slepici

-33CZ 296806 B6

Časový okamžik první série imunizací byl označen jako „den nula“. Všechny následné imunizace byly prováděny výše popsaným způsobem s tou výjimkou, že suspenze bakteriálního imunogenu byly emulgovány pomocí IFA (GIBCO) místo CFA a při imunizaci v pozdějším časovém okamžiku byly místo čerstvě připravených suspenzí používány zmrazené uchovávané suspenze.

Imunizační schéma je uvedeno v tabulce 4.

Tabulka 4. Imunizační schéma

den imunizace	ošetření formalinem	použitý imunogenový preparát
0	1%, 1 h	čerstvě připravený
14	1 %, přes noc	Μ W
21	1%, přes noc	Η H
35	1%,48h	It »
49	1%, 72 h	»»
70	» M	zmrazený
85	>1 ,»	» »
105	»ř »	Μ M

c) Čištění anti-bakteriálních kuřecích protilátek

Z každé imunizační skupiny byla mezi dny 80 a 84 po počáteční imunizaci odebrána skupina čtyři vajec a kuřecí imunogíobulin (IgY) byl extrahován modifikovaným postupem podle A. Polsona a d., Immunol. Comm., 9:495 (1980). K oddělení žloutků od bílků byl použit mírný proud destilované vody ze střičky a žloutky byly rozrušeny prokapáním nálevkou do kalibrovaného válce. Pro každou skupinu byly spojeny čtyři žloutky. Tyto spojené a rozrušené žloutky byly pro zlepšení výtěžku protilátek smíseny se 4 objemy extrakčního pufru (extrakční pufr pro vejce tvoří 0,01 M fosforečnan sodný, 0,1 M NaCl, pH 7,5, a obsahuje 0,005 % thimerosalu) a byl přidán PEG 8000 (Amresco) do koncentrace 3,5 %. Když se veškerý PEG rozpustil, byly vzniklé sraženiny proteinů peletovány odstředěním při 13 000 x g po dobu 10 min. Supematanty byly dekantovány a přefiltrovány přes fáčovinu pro odstranění vrstvy lipidů a k supematantům byl přidán PEG do konečné koncentrace 12 % (bylo předpokládáno, že supematanty obsahují 3,5 % PEG): Po druhém odstředění byly supematanty odstraněny a pelety byly naposledy odstředěny k vypuzení zbylého PEG. Tyto surové pelety IgY pak byly rozpuštěny v původním objemu žloutku extrakčního pufru a skladovány při 4 °C. Jak další kontrola byl výše popsaným způsobem připraven roztok preimunního IgY s použitím vajec od neimunizovaných slepic.

d) Detekce antibakteriálních protilátek v čištěných preparátech IgY

Za účelem zhodnocení relativních hladin aktivity C. difficile ve výše popsaných preparátech IgY byla použita modifikovaná verze postupu ELISA pro celé organizmy podle N. V. Padhye a d., J. Clin. Microbiol. 29:99-103 (1990). Zmrazené organizmy obou výše uvedených kmenů C. difficile byly ponechány roztát a zředěny s použitím PBS, pH 7,2 na koncentraci přibližně 1.10⁷ organizmů/ml. Tímto způsobem byly připraveny dvě nanášecí suspenze, pro každý imunizační kmen jedna. Do jamek 96jamkových mikrotitračních destiček (Falcon, pro-Bind Assay Plates) byly umístěny objemy 100 μΐ nanášecích suspenzí. Tímto způsobem bylo na každou destičku umístěno celkem přibližně 1.10⁸ organizmů jednoho nebo druhého kmene. Destičky pak byly inkubovány přes noc při 4 °C. Příštího rána byly nanášecí suspenze dekantovány a všechny

-34CZ 296806 B6 jamky byly třikrát promyty pomocí PBS. Za účelem blokování nespecifických vazebných míst bylo pak do každé jamky přidáno 100 μΐ 0,5% BSA (Sigma) v PBS a destičky byly inkubovány 2 h při teplotě místnosti. Blokovací roztok byl dekantován a výše popsané objemy 100 μΐ preparátů IgY byly podrobeny počátečnímu ředění 1:500 roztokem 0,1 % BSA v PBS a pak postupně ředěny ve stupních 1:5. Do jamek byla umístěna tato ředění: 1:500, 1:2500, 1:62500, 1:312500 a 1:1562500. Destičky byly opět inkubovány 2 h při teplotě místnosti. Po této inkubaci byly roztoky obsahující IgY dekantovány a jamky byly promyty třikrát pomocí BBS-Tween (0,1 M kyselina boritá, 0,025 M boritan sodný, 1,0 M NaCl, 0,1 %Tween-20), pak dvakrát pomocí PBS-Tween (0,1 % Tween-20) a nakonec dvakrát pouze PBS. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ ředění 1:750 konjugátu králičí anti-kuřecí IgG (celá molekula)-alkalická fosfatáza (Sigma) (ředěno v 0,1 % BSA v PBS). Destičky byly opět inkubovány 2 h při teplotě místnosti. Roztoky konjugátu byly dekantovány a destičky byly promyty výše popsaným způsobem, přičemž konečné promývání bylo prováděno pomocí 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5, místo PBS. Destičky byly vyvíjeny přídavkem 100 μΐ roztoku obsahujícího 1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (Sigma), rozpuštěného v 50 mM Na₂CO₃, 10 mM MgCl₂, pH 9,5, do každé jamky a inkubací destiček při teplotě místnosti v temnu po dobu 45 min. Byla měřena absorbance každé jamky při 410 nm pomocí přístroje Dynatech MR 700. Tímto způsobem byl každý z výše popsaných čtyř preparátů IgY testován na reaktivitu proti oběma imunizujícím kmenům C. difficile·, byla stanovena kmenově specifická i křížová aktivita.

-35CZ 296806 B6

Tabulka 5, Výsledky ELISA celého organismu anti-C. difficile

	preparát IgY	ředění preparátu IgY	jamky s nánosem 43594	jamky s nánosem 43596
		1:500	1,746	1,801
		1:2500	1,092	1,670
	CD 43594, #1	1:12500	0,202	0,812
		1:62500	0,136	0,179
		1:312500	0,012	0,080
		1:1562500	0,002	0,020
		1:500	1,780	1,771
		1:2500	1,025	1,078
	CD 43594, #7	1:12500	0,188	0,382
		1:62500	0,052	0,132
		1:312500	0,022	0,043
		1:1562500	0,005	0,024
		1:500	1,526	1,790
		1:2500	0,832	1,477
	CD 43596, #1	1:12500	0,247	0,452
		1:62500	0,050	0,242
		1:312500	0,010	0,067
		1:1562500	0,000	0,036
		1:500	1,702	1,505
		1:2500	0,706	0,866
	CD 43596, #7	1:12500	0,250	0,282
		1:62500	0,039	0,078
		1:312500	0,002	0,017
		1:1562500	0,000	0,010
		1:500	0,142	0,309
		1:2500	0,032	0,077
	preimunní IgY	1:12500	0,006	0,024
		1:62500	0,002	0,012
	1:312500	0,004	0,010
	1:1562500	0,002	0,014

-36CZ 296806 B6

Tabulka 5 ukazuje výsledky ELISA celého organizmu. Všechny čtyři preparáty IgY vykazovaly významnou úroveň aktivity do zředění 1:62 500 nebo většího proti oběma kmenům imunizujícího organizmu. Protilátky, vytvořené proti jednomu kmeni, tedy byly vysoce křížově reaktivní s druhým kmenem a naopak. Imunizační koncentrace organizmů neměla významný vliv na produkci IgY, specifickou pro organizmus, protože obě koncentrace produkovaly přibližně ekvivalentní odpověď. Spodní imunizační koncentrace přibližně 1,5.10⁸ organizmů/slepici je tedy z obou testovaných koncentrací výhodnější. Preimunní IgY se zdál mít relativně nízkou hladinu reaktivity s C. difficile do ředění 1:500, pravděpodobně v důsledku předchozí expozice zvířat environmentálním klostridiím.

Počáteční test ELISA celého organizmu byl proveden s použitím preparátů IgY, vyrobených z jednotlivých vajec CD 43594, #1 a CD 435596, #1, sebraných kolem dne 50 (data neznázorněna). Zjistilo se, že specifické titry jsou 5 až lOkrát nižší než hodnoty uvedené v tabulce 5. Tyto výsledky demonstrují, že je možno začít imunizovat slepice před dobou, v níž začínají klást vejce, a získat s vysokým titrem specifický IgY z prvních snesených vajec. Jinak řečeno, před zahájením imunizačního schématu není nutno čekat, až budou slepice snášet vejce.

Příklad 2

Léčení infekce C. difficile protilátkou proti C. difficile

Za účelem zjištění, zda jsou imunní protilátky IgY, vytvořené proti celým organizmům

C. difficile, schopny inhibovat infekci křečků, vyvolanou C. difficile, byli použiti křečci, infikovaní těmito bakteriemi. [Lyerly a d., Infect. Immun. 59:2215-2218 (1991).] Tento příklad zahrnoval: (a) stanovení letální dávky organizmů C. difficile a (b) ošetření infikovaných zvířat imunní protilátkou nebo kontrolní protilátkou v živném roztoku.

a) Stanovení letální dávky organizmů C. difficile

Stanovení letální dávky organizmů C. difficile bylo prováděno podle modelu popsaného

D. M. Lyerlym a d., Infect. Immun. 59:2215-2218 (1991). Kmen C. difficile ATCC 43596 (sérotyp C, ATCC) byl nanesen na agar BH1 a kultivován anaerobně (systém BBL Gas Pak 100) 42 h při 37 °C. Organizmy byly z povrchu agaru setřeny pomocí sterilního tamponu s dacronovým hrotem a suspendovány ve sterilním 0,9% roztoku NaCl do hustoty 10⁸ organizmů/ml.

Pro stanovení letální dávky C. difficile v přítomnosti kontrolní protilátky a umělé výživy byla získána neimunní vejce od neimunizovaných slepic a byl vyroben 12% PEG preparát jako v příkladu 1 (c). Tento preparát byl rozpuštěn ve čtvrtině původního objemu žloutku Ensure® s vanilkovým aroma.

Počínaje dnem 1 byl skupinám samic zlatých syrských křečků (Harlan Sprague Dawley) ve stáří 8 až 9 týdnů o hmotnosti přibližně 100 g orálně podáván 1 ml preimunní formulace Ensure® v čase 0, 2 h, 6 h a 10 h. V čase 1 h bylo zvířatům orálně podáno 3,0 mg klindamycinu HC1 (Sigma) v 1 ml vody. Toto léčivo predisponuje křečky pro infekci C. difficile změnou normální střevní flóry. V den 2 bylo zvířatům podáno 1 ml preimunní formulace IgY/Ensure® v době 0, 2 h, 6 h a 10 h. V čase 1 h v den 2 byly různé skupiny zvířat orálně inokulovány salinickým roztokem (kontrola) nebo ΙΟ², ΙΟ⁴, 10⁶ nebo 10⁸ organizmů C. difficile v 1 ml salinickém roztoku. Od dnů 3 až 12 byl zvířatům podáván 1 ml preimunní formulace IgY/Ensure® třikrát denně a byl pozorován nástup průjmu a úhyn. Každé zvíře bylo umístěno v individuální kleci a dostávalo potravu a vodu ad libitum.

Podávání 10⁶ až 10⁸ organizmů vedlo k úhynu po 3 až 4 dnech, zatímco dávky 10² až 10⁴ organizmů způsobily smrt po 5 dnech. Cekální výtěry, odebrané zvířatům, indikovaly přítomnost

C. difficile. Za předpokladu účinnosti dávky 10² byl tento počet organizmů zvolen pro následující

-37CZ 296806 B6 experiment za účelem zjištění, zda by mohla hyperimunní anti-C. difficile protilátka blokovat infekci.

b) Ošetření infikovaných zvířat imunní protilátkou nebo kontrolní protilátkou v umělé výživě

Byl opakován experiment (a) s použitím tří skupin po sedmi křečcích. Skupina A nedostala klindamycin ani C. difficile a představovala kontrolu přežití. Skupina B dostala klindamycin, 10² organizmů C. difficile a preimunní IgY podle stejného schématu jako zvířata výše podle (a). Skupina C dostala klindamycin, 10² organizmů C. difficile a hyperimunní anti-C. difficile IgY podle stejného schématu jako skupina B. Anti-C. difficile IgY byl připraven jako v příkladu 1 stou výjimkou, že 12% PEG preparát byl rozpuštěn vEnsure®, odpovídajícím jedné čtvrtině objemu původního žloutku.

U všech zvířat byl pozorován nástup průjmu a dalších příznaků onemocnění a úhyn. Každé zvíře bylo umístěno v individuální kleci a dostávalo potravu a vodu ad libitum. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6. Účinnost orální aplikace hyperimunní protilátky IgY na infekci C. difficile

skupina zvířat	doba do průjmu®	doba do úhynu®
A pouze preimunní IgY	žádný průjem	žádný úhyn
B klindamycin, C. difficile, preimunní IgY	30 h	49 h
C klindamycin, C. difficile, imunní IgY	33 h	56 h

Křečci v kontrolní skupině A si nevyvinuli průjem a zůstali po dobu experimentu zdraví. Křečci ve skupinách B a C vyvinuli diaroické onemocnění. Anti-C. difficile IgY nechránil zvířata proti průjmu nebo uhynutí; všechna zvířata podlehla ve stejných časových intervalech jako zvířata ošetřená preimunním IgY. Zatímco tedy imunizace celými organizmy může zřejmě zlepšit subletální příznaky u konkrétních bakterií (viz patent US 5 080 895, H. Tokoro), nezdá se tento přístup být produktivní při ochraně proti letálním účinkům C. difficile.

Příklad 3

Produkce antitoxinu typu A C. botulinum u slepic

Za účelem zjištění, zdaje možno vytvořit protilátky proti toxinu produkovanému klostridiálnímu patogeny, které by byly účinné při léčbě klostridiálních onemocnění, byl produkován antitoxin k toxinu typu A C. botulinum. Tento příklad zahrnuje: (a) modifikaci toxinu, (b) imunizaci, (c) získání antitoxinu, (d) hodnocení antigenity a (e) zjišťování titru antitoxinu.

a) Modifikace toxinu

Toxoid typu A C. botulinum byl získán od B. R. DasGupta. Z něho byl vyčištěn aktivní neurotoxin typu A (MW přibližně 150 kD) do čistoty vyšší než 99 % podle publikovaných metod. [B.R. DasGupta & V. Athyamoorthy, Toxicon. 22:415 (1984).] Neurotoxin byl detoxifikován formaldehydem podle publikovaných metod. [B. R. Singh & B. R. DasGupta, Toxicon. 27:403 (1989).]

-38CZ 296806 B6

b) Imunizace

Toxoid C. botulinum pro imunizaci byl rozpuštěn v PBS (1 mg/ml) a byl emulgován přibližně stejným objemem CFA (GIBCO) při počáteční imunizaci nebo IFA při posilovači imunizaci. V den nula byl dvěma bílým leghomkám, získaným od místních chovatelů, na různých místech (intramuskulárně a subkutánně) aplikován 1 ml inaktivovaného toxoidu emulgovaného v 1 ml CFA. Následné posilovači imunizace byly prováděny podle tohoto schématu (dny injekce a množství toxoidu): dny 14 a 21 - 0,5 mg, den 171 - 0,75 mg, dny 394, 401, 409 - 0,25 mg. Jedna slepice dostala navíc posilovači dávku 0,150 mg v den 544.

c) Získání antitoxinu

Celkový imunoglobulin ze žloutku (IgY) byl extrahován způsobem popsaným v příkladu l(c) a peleta IgY byla rozpuštěna v PBS s thimerosalem o původním objemu žloutku.

d) Hodnocení antigenity

Vejce byla sbírána ode dne 409 do dne 423 a bylo zjišťováno, zdaje toxoid dostatečně imunogenní, aby vyvolal tvorbu protilátek, vejce od obou slepic byla spojena do jedné skupiny a protilátka byla získána standardním protokolem PEG. [Příklad l(c).J. Antigenita botulinálního toxinu byla hodnocena na Westernových blotech. Na SDS-polyakrylamidovém redukčním gelu byly odděleny detoxikovaný neurotoxin typu A 150 kD a nemodifikovaný toxický botulinální komplex typu A 300 kD (toxin používaný pro intragastrickou aplikaci v experimentech neutralizace zvířecích střev; viz příklad 6). Metoda Westernová blotu byla prováděna podle Towbina. [H. Towbin a d., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979).] Vzorky po 10 pg komplexu a toxoidu C. botulinum byly rozpuštěny v SED redukujícím pufru (1 % SDS, 0,5 % 2-merkaptoethanolu, 50 mM Tris, pH 6,8, 10 % glycerolu, 0,025% w/v bromfenolové modři, 10% β-merkaptoethanolu), zahřívány 10 min na 95 °C a děleny na 5% SDS-polyakrylamidovém gelu o tloušťce 1 mm. [K. Weber a M. Osbom, „Proteins and Sodium Dodecyl Sulfáte: Molecular Weight Determination on Polyacrylamide Gels and Related Procedures“, in: The Proteins, 3. vyd. (H. Neurath & R. L. Hill, ed.) str. 179-223 (Academie Press, NY, 1975).] Část gelu byla odříznuta a proteiny byly odbarveny pomocí Coomassiovy modři. Proteiny ve zbytku gelu byly s použitím elektroblotingového systému Milliblot-SDE (Millipore) podle pokynů výrobce přeneseny na nitrocelulózu. Nitrocelulózy byla dočasně obarvena pomocí 10% Ponceau S (S. B. Carroll a A. Laughon, „Production and Purification of Polyclonal Antibodies to the Foreign Segment of βgalactosidase Fusion Proteins“, in: DNA Cloning: A Practical Approach, sv. III (ed. D. Glover), str. 89-111, IRL Press, Oxford (1987)] za účelem vizualizace pruhů, pak odbarvena mírným proudem destilované vody, vedeným přes blot po dobu několika minut. Nitrocelulóza byla přes noc ponořena do PBS s obsahem 3 % BSA o teplotě 4 °C za účelem blokování zbylých míst vazby proteinu.

Blot byl rozřezán na proužky a každý proužek byl inkubován s příslušnou primární protilátkou. Ptačí anti-C. botulinum protilátky [popsané v (c)] a preimunní kuřecí protilátka (jako kontrola) byly po dobu 2 h při teplotě místnosti ředěny 1:125 v PBS s obsahem 1 mg/ml BSA. Bloty byly promyty postupně vždy dvěma velkými objemy PBS, BBS-Tween a PBS (každé promývání 10 min). Konjugát sekundární protilátky kozí anti-kuřecí IgG-alkalická fosfatáza (Fisher Biotech) byl zředěn 1:500 v PBS s obsahem 1 mg/ml BSA a inkubován s blotem 2 h při teplotě místnosti. Bloty byly promyty vždy dvěma velkými objemy PBS a BBS-Tween a pak jedním objemem PBS a 0,1 M Tris-HCl, pH 9,5. Bloty byly vyvíjeny v čerstvě připraveném pufru jako substrátu s alkalickou fosfatázou (100 pg/ml tetrazoliumnitromodří (Sigma), 50 pg/ml 5-brom4—chlor-3-indolylfosfátu (Sigma), 5 mM MgCl₂ v 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5).

Westernový bloty jsou znázorněny na obr. 1. Anti-C. botulinum IgY reagoval na redukčním gelu s toxoidem za vzniku širokého imunoreaktivního pásu při asi 145 až 150 kD. Tento toxoid je díky síťování formalinem odolný vůči disulfidickému štěpení redukčními činidly. Imunní IgY reago-39CZ 296806 B6 vat s aktivním toxinovým komplexem, těžkým řetězcem 97 kD a lehkým řetězcem 53 kD

C. botulinum typu A. Preimunní IgY byl ve Westernově blotu nereaktivní s komplexem

C. botulinum nebo toxoidem.

e) Titr antitoxinů

Titr protilátky IgY ktoxoidu C. botulinum typu A z vajec sebraných mezi dnem 409 a 423 byl zjišťován pomocí ELISA tímto způsobem: 96jamkové destičky Falcon Pro-bind byly přes noc při 4 °C opatřeny nánosem 100 μΐ/jamku toxoidu [B. R. Singh & B. R. DasGupta, Toxicon 27:403 (1989)] v koncentraci 2,5 μg/ml vPBS, pH 7,5, s obsahem 0,005 % thimerosalu. Následující den byly jamky po dobu 1 h při 37 °C blokovány PBS s obsahem 1 % BSA. IgY z imunních nebo preimunních vajec byl zředěn v pBS s obsahem 1 % BSA a 0,05 % Tween 20 a destičky byly inkubovány 1 h při 37 °C. Destičky byly promyty třikrát pomocí PBS s obsahem 0,05 % Tween 20 a třikrát samotným PBS. Kozí anti-kuřecí IgG, konjugovaný s alkalickou fosfatázou (Fisher Biotech) byl zředěn 1:750 v PBS s obsahem 1 % BSA a 0,05 % Tween 20, přidán k destičkám a inkubován 1 h při 37 °C. Destičky byly promyty stejným způsobem jako předtím a byl přidán p-nitrofenylfosfát (Sigma) v koncentraci 1 mg/ml v 0,05 M Na₂CO₃, pH 9,5, 10 mM MgCl₂.

Výsledky jsou znázorněny na obr. 2. Kuřata imunizovaná toxoidem vytvořila vysoké titry protilátky vůči imunogenu. Důležité je, že vejce od obou imunizovaných slepic měly významné titry anti-imunogenových protilátek ve srovnání s preimunními kontrolními vejci. Anti-C. botulinum IgY měl významnou aktivitu do ředění 1:93750 nebo většího.

Příklad 4

Příprava imunoglobulinu z ptačího vaječného žloutku v orálně aplikovatelné formě

Pro orální aplikaci ptačích protilátek IgY experimentálním myším bylo nutno stanovit účinný systém podávání IgY. Problém spočíval v tom, že pokud by byl surový IgY rozpuštěn v PBS, salinický roztok v PBS by vyvolával dehydrataci myší, což by mohlo být za dobu studie nebezpečné, proto byly testovány alternativní metody orální aplikace IgY. Příklad zahrnoval: (a) izolaci imunního IgY, (b) solubilizaci IgY ve vodě nebo PBS včetně následné dialýzy roztoku IgYPBS vodou za účelem eliminace nebo snížení obsahu solí (soli a fosfátu) v pufru a (c) (porovnání množství a aktivity získaného IgY na základě absorbance při 280 nm a PAGE a enzymové imunoanalýzy (ELISA).

a) Izolace imunního IgY

Za účelem zjištění nejúčinnějšího systému podávání IgY jsme použili IgY, který byl vytvořen protijedu Crotalus durissus terrificus. Od slepic imunizovaných jedem C. durissus terrificus byla sebrána tři vejce a ze žloutků byl extrahován IgY s použitím modifikovaného Polsonova postupu podle Thalley a Carroll [Bio/Technology, 8:934-938 (1990)], popsaného v příkladu l(c).

Vaječné žloutky byly odděleny od bílků, spojeny a smíseny se čtyřmi objemy PBS. Byl přidán práškový PEG do koncentrace 3,5 %. Směs byla odstřeďována 10 min při 10000 min^-1 za účelem peletizace vysráženého proteinu a supernatant byl přefiltrován přes fáčovinu k odstranění vrstvy lipidů. K supernatantu byl přidán práškový PEG pro úpravu konečné koncentrace PEG na 12 % (za předpokladu koncentrace PEG v supernatantu 3,5 %). Směs 12 % PEG/IgY byla rozdělena na dva stejné objemy a odstředěna za účelem peletizace IgY.

-40CZ 296806 B6

b) Solubilizace IgY ve vodě nebo PBS

Jedna peleta byla resuspendována v PBS o objemu 1/2 původního objemu žloutku a druhá peleta byla resuspendována ve vodě o objemu 1/2 původního objemu žloutku. Pelety pak byly odstře5 děny k odstranění částic nebo nerozpustného podílu. IgY v roztoku PBS se rozpouštěl snadno, avšak frakce resuspendované ve vodě zůstala zakalená.

Pro splnění předpokládaných požadavků na sterilitu orálně podávaných protilátek je nutno roztok protilátky podrobit sterilní filtraci (jako alternativa k tepelné sterilizaci, která by protilátky zniio čila). Preparát IgY resuspendováný ve vodě byl příliš zakalený, než aby prošel membránovým filtrem 0,2 nebo 0,45 pm, a proto bylo 10 ml frakce resuspendované v PBS dialyzováno přes noc při teplotě místnosti proti 250 ml vody. Následujícího rána byla dialýzní komůrka vyprázdněna a naplněna 250 ml čerstvé H₂O pro druhou dialýzu. Poté byl stanoven výtěžek rozpustné protilátky při OD₂₈₀, který je porovnán v tabulce 7.

Tabulka 7. Závislost výtěžku IgY na rozpouštědlech

frakce	absorbance ředění 1:10 při 280 nm	výtěžek %
rozpuštěná v PBS	1,149	100
rozpuštěná v H2O	0,706	61
rozpuštěná v PBS/dialyzovaná s H2O	0,885	77

Resuspendováním pelet v PBS s následnou dialýzou proti vodě se získalo více protilátek než 20 přímo resuspendováním pelet ve vodě (77 % proti 61 %). Ekvivalentní objemy preparátů IgY byly porovnávány pomocí PAGE a tyto výsledky jsou ve shodě s hodnotami absorbance (neuvedeny).

c) Aktivita IgY připraveného s různými rozpouštědly

Byla provedena ELISA za účelem porovnání aktivity IgY extrahovaného každým z výše uvedených postupů. Na každou jamku 96jamkové mikrotitrační destičky byl nanesen jed C. durissus terrificus (C.d.t.) v koncentraci 2,5 pg/ml v PBS. Zbývající proteinová vazebná místa byla blokována pomocí PBS s obsahem 5 mg/ml BSA. Byla přidána duplicitně ředění primární protilátky 30 (v PBS s obsahem 1 mg/ml BSA). Po 2 h inkubace při teplotě místnosti byla nenavázaná protilátka odstraněna promytím jamek pomocí PBS, BBS-Tween a PBS. Druhově specifická sekundární protilátka (konjugát kozího anti-kuřecího imunoglobulinu s alkalickou fosfatázou (Sigma)) byla zředěna 1:750 v PBS s obsahem 1 mg/ml BSA a přidána do každé jamky mikrotitrační destičky. Po 2 h inkubace při teplotě místnosti byla promytím stejným způsobem odstraněna nenavá35 zaná sekundární protilátka a do každé jamky byla jako substrát přidána čerstvě připravená alkalická fosfatáza (Sigma) v koncentraci 1 mg/ml v 50 mM Na₂CO₃, 10 mM MgCl₂, pH 9,5. Vývoj zbarvení byl měřen pomocí přístroje Dynatech MR 700 s použitím filtru 412 nm. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.

-41 CZ 296806 B6

Tabulka 8. Vazebná aktivita antigenu u IgY připraveného s různými rozpouštědly

ředění	preimunní	rozp. v PBS	rozp. v H2O	pbs/h2o
1:500	0,005	1,748	1,577	1,742
1:2500	0,004	0,644	0,349	0,606
1:12500	0,001	0,144	0,054	0,090
1:62500	0,001	0,025	0,007	0,016
1:312500	0,010	0,000	0,000	0,002

Výsledky vazebného testu odpovídají hodnotám výtěžku v tabulce 7, přičemž IgY rozpuštěný v PBS vykazoval mírně vyšší aktivitu než protilátka rozpuštěná v PBS a dialyzovaná proti H₂O. Protilátka rozpuštěná ve vodě měla značně nižší vazebnou aktivitu než druhý preparát.

Příklad 5

Přežití aktivity protilátky po průchodu gastrointestinálním traktem

Za účelem proveditelnosti orální aplikace protilátky bylo zajímavé zjistit, zda orálně podaný IgY přežije průchod gastrointestinálním traktem. Příklad zahrnoval: (a) orální podání specifické imunní protilátky smísené s výživnou směsí a (b) test aktivity protilátky extrahované ze stolice.

a) Orální aplikace protilátky

V tomto příkladu byly jako preparáty IgY použity protilátky proti jedu, rozpuštěné v PBS a dialyzované proti vodě, získané v příkladu 4, smísené se stejným objemem Enfamil®. V tomto experimentu byly použity dvě myši, z nichž každá dostávala jinou dietu:

1) voda a potrava j ako obvykle,

2) imunní preparát IgY dialyzovaný proti vodě a smísený 1:1 s Enfamil®. (Odpovídající směs byla myším podávána jako jejich jediný zdroj potravy a vody).

b) Aktivita protilátky po požití

Poté, co obě myši požili příslušnou tekutinu, bylo jako první věc ráno do každé trubky doplněno 10 ml příslušné tekutiny. V polovině dopoledne zůstalo v každé trubce asi 4 až 5 ml kapaliny.

V tomto okamžiku byly od každé myši odebrány vzorky stolice, zváženy a rozpuštěny v přibližně 500 μΐ PBS na 100 mg vzorku stolice. V l,5ml mikrofugálních zkumavkách bylo rozpuštěno 160 mg kontrolní stolice (bez protilátky) v 800 μΐ PBS a 99 mg experimentální stolice (specifická protilátka) v 500 μΐ PBS. Vzorky byly zahřívány 10 min na 37 °C a důkladně promíchávány. Experimentální stolice byla také drcena úzkou špachtlí. Každý vzorek byl 5 min odstřeďován v mikrofuze a byly odebírány supernatanty, u nichž byl předpoklad obsahu extraktů protilátek.

V případě, že byly třeba extrakty do budoucna, byly pelety uchovávány při 2 až 8 °C. Protože supernatanty byly zabarvené, byly pro počáteční ředění při enzymové imunoanalýze (ELISA) pětinásobně zředěny PBS s obsahem 1 mg/ml BSA. Po tomto počátečním zředění pak byly primární extrakty ředěny po řadě pětinásobně. Objem primárního extraktu, přidávaného do každé jamky, byl 190 μΐ. Analýza ELISA byla provedena přesně, jak uvedeno v příkladu 4.

-42CZ 296806 B6

Tabulka 9. Aktivita specifické protilátky po průchodu gastrointestinální traktem

ředění	preímunni IgY	kontrolní fekální extrakt	experimentální fekální extrakt
1:5	<0	0,000	0,032
1:25	0,016	<0	0,016
1:125	<0	<0	0,009
1:625	<0	0,003	0,001
1:3125	<0	<0	0,000

Ve fekálním extraktu myši, jíž byla podávána specifická protilátka ve formulaci Enfamil®, byla přítomna určitá aktivní protilátka, ale ve velmi nízkém množství, protože byly vzorky testovány při počátečním zředění 1:5, mohla by být pozorovaná vazba při méně zředěných vzorcích vyšší. Proto byla myším podávána dále buď obvyklá strava a voda, nebo specifický IgY ve formulaci Enfamil®, aby mohl být pokus opakován. Další destička ELISA byla opatřena přes noc nánosem 5 pg/ml jedu C.d.t v PBS.

Následujícího rána byla destička ELISA blokována 5 mg/ml BSA a fekální vzorky byly extrahovány stejně jako v předchozím případě, avšak místo, aby byly zahřívány na 37 °C, byly k omezení proteolýzy uchovávány na ledu. Vzorky byly testovány zpočátku naředěné a pak ředěné po řadě pětinásobně. Jinak byl test prováděn stejně jako v předchozím případě.

Tabulka 10. Přežití protilátky po průchodu gastrointestinálním traktem

ředění	preimunní IgY	kontrolní extrakt	experimentální extrakt
neředěná	0,003	<0	0,379
1:5	<0	<0	0,071
1:25	0,000	<0	0,027
1:125	0,003	<0	0,017
1:625	0,000	<0	0,008
1:3125	0,002	<0	0,002

Pokus potvrdil předchozí výsledky s výrazně vyšší aktivitou protilátky. Kontrolní fekální extrakt nevykázal žádnou aktivitu anti-C.d.t., ani neředěný, zatímco fekální extrakt z myši, živené anti-C.d.t. IgY/Enfamil®, vykázal značnou anti-C.d.t. aktivitu. Tento (a předchozí) pokus jasně demonstruje, že aktivní protilátka IgY přežívá průchod myším zažívacím traktem, což je zjištění s příznivými implikacemi pro úspěch orální aplikace IgY jako terapeutických nebo profylaktických prostředků.

-43CZ 296806 B6

Příklad 6

Neutralizace neurotoxinu C. botulinum typu A ptačí antitoxinovou protilátkou in vivo

Tento příklad demonstroval schopnost PEG-čištěného antitoxinu, získaného způsobem uvedeným v příkladu 3, neutralizovat letální účinek neurotoxinu typu A C. botulinum u myší. Za účelem stanovení orální letální dávky (LDioo) toxinu A byly skupinám myší BALB/c podávány různé dávky toxinu na jednotku tělesné hmotnosti (průměrná tělesná hmotnost 24 g). Pro orální aplikaci byl použit komplex toxinu A, který obsahuje neurotoxin asociovaný s jinými netoxinovými proteiny. Tento komplex je výrazně toxičtější než čištěný neurotoxin, je-li podáván orální cestou. [I. Ohishi a d., Infect. Immun., 16:106 (1977).] Komplex toxinu typu A C. botulinum, získaný od Erica Johnsona (University of Wisconsin, Madison) měl při parenterální aplikaci 250 pg/ml v 50 mM citrátu sodném, pH 5,5, specifická toxicita 3.10⁷ myší LD₅₀/mg. Umyší, živených obvyklou vodou a potravou, bylo obvykle fetálních 40 až 50 ng/g tělesné hmotnosti během 48 h. Jestliže myši dostávaly ad libitum dietu pouze Enfamilu®, byla koncentrace potřebná kvyvolání letality přibližně 2,5krát vyšší (125 ng/g tělesné hmotnosti). Umyší živených Enfamilem® s obsahem preimunního IgY (resuspendovaného v Enfamilu® v objemu původního žloutku) byly fatální koncentrace botulinálního toxinu přibližně 200 ng/g tělesné hmotnosti.

Byla rovněž stanovena orální LD₁₀₀ toxinu C. botulinum pro myši, které dostávaly známé množství preimunní IgY-Ensure®, podávané orálně injekčními stříkačkami. Pomocí stříkačky o velikosti 22 bylo každé myši podáno 1 h před a 1/2 h a 5 h po podání botulinálního toxinu vždy 250 μΐ směsi preimunní IgY-Ensure® (preimunní IgY rozpuštěn ve 1/4 původního objemu žloutku). Koncentrace toxinu podávaného orálně byly v rozmezí přibližně 12 až 312 ng/g tělesné hmotnosti (0,3 až 7,5 pg na myš). U všech myší byla letální koncentrace botulinálního toxinového komplexu přibližně 40 ng/g tělesné hmotnosti (1 pg na myš) za méně než 36 h.

Dvěma skupinám po 10 myších BALB/c byla orálně podána jednorázová dávka vždy 1 pg botulinálního toxinového komplexu ve 100 pl 50mM citrátu sodného, pH 5,5. Myši dostaly 1 h před a 1/2 h, 4 h a 8 h po podání botulinálního toxinu vždy 250 μΐ směsi buď preimunního, nebo imunního IgY v Ensure® (1/4 původního objemu žloutku). Ještě další dva dny dostávaly myši tři ošetření denně. Myši byly pozorovány po dobu 96 h. Přežití a mortalita je uvedena v tabulce 11.

Tabulka 11. Neutralizace botulinálního toxinu in vivo

dávka toxinu ng/g	typ protilátky	počet živých myší	počet mrtvých myší
41,6	neimunní	0	10
41,6	anti-botulinální toxin	10	0

Všechny myši, ošetřené směsí preimunní IgY-Ensure®, uhynuly do 46 h po podání toxinu. Průměrná doba úhynu myši byla 32 h po podání toxinu. Ošetření směsí preimunní IgY-Ensure® bylo po 24 h přerušeno v důsledku nadměrné paralýzy úst myší v této skupině. Naproti tomu všech deset myší, ošetřovaných směsí imunní anti-botulinální IgY-Ensure®, přežilo déle než 96 h. Pouze 4 myši v této skupině vykazovaly příznaky otravy botulismem (dvě myši asi 2 dny a dvě myši 4 dny po podání toxinu). Tyto myši nakonec uhynuly po 5 a 6 dnech. Šest myší v této imunní skupině nevykazovalo žádné nepříznivé účinky toxinu a zůstalo dlouhodobě živých a zdravých. Ptačí anti-botulinální protilátka tedy prokázala u experimentálních myší velmi dobrou ochranu proti letálním účinkům.

-44CZ 296806 B6

Příklad 7

Produkce ptačího antitoxinu proti toxinu A Clostridium difficile

Toxin A je účinný cytotoxin, vylučovaný patogenními kmeny C. difficile, který hraje přímou roli při poškození gastrointestinálních tkání. Ve vážnějších případech intoxikace C. difficile se může vyvinout pseudomembránová kolitis, která může být fatální. Tomu by se dalo zabránit neutralizací účinků tohoto toxinu v gastrointestinálním traktu. Jako první krok byly produkovány protilátky proti části toxinu. Příklad zahrnoval: (a) konjugaci syntetického peptidu toxinu A s hovězím sérovým albuminem, (b) imunizaci slepic konjugátem peptid-BSA a (c) detekci antitoxinových peptidických protilátek pomocí ELISA.

a) Konjugace syntetického peptidu toxinu A s hovězím sérovým albuminem

Syntetický peptid CQTIDGKKYYFN-NH₂ byl připraven komerčně (Multiple Peptide Systems, San Diego, CA) a vysokotlakou kapalinovou chromatografií byla zjištěna čistota > 80 %. Jedenáct aminokyselin za cysteinovým zbytkem představuje konsensuální sekvenci opakované sekvence aminokyselin nacházející se v toxinu A. [Wren a d., Infect. Immun., 59:3151-3155 (1991).] Cystein byl připojen pro usnadnění konjugace s nosným proteinem.

Za účelem přípravy nosiče pro konjugaci byl BSA (Sigma) rozpuštěn v 0,01 M NaPO4, pH 7,0 na konečnou koncentraci 20 mg/ml a n-maleinimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidester (MBS; Pierce) byl rozpuštěn v Ν,Ν-dimethylformamidu na koncentraci 5 mg/ml. 0,51 ml roztoku MBS bylo přidáno k 3,25 ml roztoku BSA a inkubováno 30 min při teplotě místnosti se zamícháním každých 5 min. BSA, aktivovaný MBS, pak byl čištěn chromatografií na sloupci Βίο-Gel P-10 (Bio-Rad; objem lože 40 ml), ekvilibrovaném pufřem 50 mM NaPO₄, pH 7,0. Píkové frakce byly spojeny (6,0 ml).

Lyofílizovaný peptid toxinu A (20 mg) byl přidán ke směsi aktivovaného BSA, míchán do rozpouštění peptidu a inkubován 3 h při teplotě místnosti. Během 20 min se reakční směs zakalila a vytvořila se sraženina. Po 3 h byla reakční směs odstředěna 10 min při 10 000 x g a supematant byl analyzován na obsah proteinu. Při 280 nm nebylo možno detekovat významné množství proteinu. Sraženina konjugátu byla promyta třikrát PBS a skladována při 4 °C. Byla provedena druhá konjugace s 15 mg aktivovaného BSA a 5 mg peptidu a konjugáty byly spojeny a suspendovány v koncentraci peptidu 10 mg/ml v 10 mM NaPO₄, pH 7,2.

b) Imunizace slepic peptidovým konjugátem

U dvou slepic byla provedena počáteční imunizace v den nula injekcí 1 mg peptidového konjugátu, který byl emulgován v CFA (GEBCO), do dvou subkutánních a dvou intramuskulámích míst. V den 14 a v den 21 dostaly slepice posilovači injekci 1 mg peptidového konjugátu emulgovaného v IFA (GIBCO).

c) Detekce antitoxinových peptidických protilátek pomocí ELISA

Ze dvou vajec, získaných před imunizací (preimunní) a dvou vajec, získaných 31 a 32 dní po počáteční imunizaci, byl pomocí frakcionace PEG, popsané v příkladu 1, vyčištěn IgY.

Na jamky 96jamkové mikrotitrační destičky (Falcon Pro-Bind Assay Plate) bylo přes noc při 4 °C naneseno 100 pg/ml roztoku syntetického peptidu toxinu A v PBS, pH 7,2, připraveného rozpuštěním 1 mg peptidu v 1,0 ml H₂O a zředěním PBS. Preimunní a imunní preparáty IgY byly po řadě pětinásobně ředěny v pufru obsahujícím 1 % PEG 8000 a 0,1 % Tween-20 (v/v) v PBS, pH 7,2. Jamky byly blokovány po dobu 2 h při teplotě místnosti pomocí 150 μΐ roztoku obsahujícího 5 % (v/v) netučného sušeného mléka Cemation® a 1 % PEG 8000 v PBS, pH 7,2. Po 2 h inkubace při teplotě místnosti byly jamky promyty, byl přidán konjugát sekundární králičí anti-45CZ 296806 B6 kuřecí IgG-alkalická fosfatáza (1:750), jamky byly znovu promyty a vyvíjení barvy bylo provedeno jako v příkladu 1. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 12.

Tabulka 12. Reaktivita IgY s toxinovým peptidem

	absorbance při 410 nm
ředění preparátu PEG	preimunní	imunní anti-peptid
1:100	0,013	0,253
1:500	0,004	0,039
1:2500	0,004	0,005

Je zřejmé, že imunní protilátky obsahují titry proti tomuto opakujícímu se epitopu toxinu A.

Příklad 8

Produkce ptačích antitoxinů proti nativním toxinům A a B Clostridium difficile

Za účelem zjištění, zda jsou ptačí protilátky účinné při neutralizaci toxinů C. difficile, byly 15 imunizovány slepice s použitím nativních toxinů A a B C. difficile. Získané protilátky z vaječného žloutku pak byly extrahovány a hodnocena jejich schopnost neutralizovat toxiny A a B in vitro. Příklad zahrnoval (a) přípravu toxinových imunogenů, (b) imunizaci, (c) čištění antitoxinů a (d) test aktivity neutralizace toxinů.

a) Příprava toxinových imunogenů

Jako imunogeny byly použity jak nativní toxiny A a B C. difficile, tak toxoidy C. difficile, připravené zpracováním nativních toxinů formaldehydem. Toxoidy A a B C. difficile, byly připraveny postupem, který byl modifikován podle publikovaných metod (Ehrich a d., Infect. Immun. 25 28:1041 (1980). Oddělené roztoky (v PBS) nativních toxinů A a B C. difficile (Těch Lab) byly upraveny na koncentraci 0,20 mg/ml a byl přidán formaldehyd do konečné koncentrace 0,4 %. Roztoky toxin/formaldehyd pak byly inkubovány 40 h při 37 °C. Ze vzniklých roztoků toxoidu pak byl odstraněn volný formaldehyd dialýzou proti PBS při 4 °C. Ve dříve publikovaných zprávách nebyla prováděna dialýza. V odpovídajících toxoidových preparátech tedy musel být příto30 men volný formaldehyd. Roztoky toxoidů byly zkoncentrovány pomocí koncentrační jednotky

Centriprep (Amicon) na konečnou koncentraci toxoidu 4,0 mg/ml. Zbývající dva preparáty byly označeny jako toxoid A a toxoid B.

Nativní toxiny C. difficile byly připraveny zkoncentrováním zásobních roztoků toxinu A 35 a toxinu B (Těch Lab., Inc.) pomocí koncentrační jednotky Centriprep (Amicon na konečnou koncentraci 4,0 mg/ml.

b) Imunizace

S použitím výše popsaných imunogenů toxoidu A a toxoidu B byly provedeny první dvě imunizace. Byly použity celkem 3 různé imunizační kombinace. V první imunizační skupině bylo 0,2 ml toxoidu A emulgováno ve stejném objemu adjuvans Titer Max (CytRx). Toto adjuvans bylo použito pro zachování množství použitého imunogenu a pro zjednodušení postupu imunizace. Tato imunizační skupina byla označena „CTA“. Ve druhé imunizační skupině bylo 0,1 ml 45 toxoidu B emulgováno ve stejném objemu adjuvans Titer Max. Tato skupina byla označena

-46CZ 296806 B6 „CTB“. Ve třetí imunizační skupině bylo 0,2 ml toxoidu A smíseno nejprve s 0,2 ml toxoidu B a vzniklá směs byla emulgována v 0,4 ml Titer Max. Tato skupina byla označena „CTAB“. Tímto způsobem byly připraveny tři různé emulze imunogenů, každá s obsahem konečné koncentrace

2,0 mg/ml toxoidu A (CTA), resp. toxoidu B (CTB) nebo směsi 0,2 mg/ml toxoidu A a

2,0 mg/ml toxoidu B (CTAB).

V den 0 byly imunizovány bílé leghornky, získané od místního chovatele, tímto způsobem: Skupina CTA: Byly imunizovány čtyři slepice, přičemž každá dostala 200 pg toxoidu A ve dvou intramuskulámích (I.M.) injekcích emulze 50 μΐ emulze CTA do oblasti hrudníku. Skupina CTB: Jedna slepice byla imunizována 200 pg toxoidu B ve dvou I.M. injekcích 50 pl emulze CTB do oblasti hrudníku. Skupina CTAB: Byly imunizovány čtyři slepice, přičemž každá dostala směs obsahující 200 pg toxoidu A a 200 pg toxoidu B ve dvou I.M. injekcích 100 pl emulze CTAB do oblasti hrudníku. Druhá imunizace byla provedena po uplynutí 5 týdnů v den 35 přesně stejně jako výše popsaná první imunizace.

Za účelem zjištění, zda slepice, které byly předtím imunizovány toxoidy C. difficile, mohou tolerovat následnou posilovači imunizaci pomocí nativních toxinů, byla jedna slepice ze skupiny CTAB imunizovány potřetí, tentokrát pomocí směsi nativního toxinu A a nativního toxinu B, popsaného výše v oddílu (a) (tyto toxiny nebyly ošetřeny formaldehydem a byly použity v aktivní formě). Účelem bylo zvýšit množství (titr) a afinitu specifické antitoxinové protilátky produkované slepicí, oproti hodnotě získané imunizací pouze toxoidy. V den 62 bylo připraveno 0,1 ml směsi toxinů, obsahující 200 pg nativního toxinu A a 200 pg nativního toxinu B. Tato směs toxinů pak byla emulgována v 0,1 ml adjuvans Titer Max. Vzniklou emulzí imunogenu pak imunizována jedna slepice CTAB ve dvou I.M. injekcích po 100 pl do oblasti hrudníku. Tato slepice byla označena páskou na křídle a pozorována za účelem zjištění případných nepříznivých účinků po dobu přibližně 1 týdne, po kterou se jevila v dobrém zdravotním stavu.

Protože výše uvedená slepice CTAB tolerovala posilovači imunizaci nativními toxiny A a B bez nepříznivých účinků, bylo rozhodnuto podat posilovači dávku nativního toxinu také zbylým slepicím. V den 70 byly provedeny posilovači imunizace tímto způsobem: Skupina CTA: 0,2 ml roztoku 4 mg/ml nativního toxinu A bylo emulgováno ve stejném objemu adjuvans Titer Max. Každá ze 4 slepic pak byla imunizována 200 pg nativního toxinu A způsobem popsaným výše pro imunizaci toxoidem A. Skupina CTB: 50 pl roztoku 4 mg/ml nativního toxinu B bylo emulgováno ve stejném objemu adjuvans Titer Max. Slepice byla imunizována 20 pg nativního toxinu B způsobem popsaným výše pro imunizaci toxoidem B. Skupina CTAB: 0,15 ml roztoku 4 mg/ml nativního toxinu A bylo smíseno nejprve s 0,15 ml roztoku 4 mg/ml nativního toxinu B. Vzniklá směs toxinů pak byla emulgována v 0,3 ml adjuvans Titer Max. Pak byly 3 zbylé slepice (slepice s páskou na křídle nebyla tentokrát imunizována) imunizovány 200 pg nativního toxinu A a 200 pg nativního toxinu B způsobem popsaným výše pro imunizaci toxoidem A + toxoidem B (CTAB). V den 85 dostaly všechny slepice druhou posilovači dávku nativních toxinů přesně stejným způsobem.

Všechny slepice tolerovaly posilovači imunizaci nativními toxiny bez nepříznivých účinků. Protože dříve publikovaná literatura popisuje použití toxoidů ošetřených formaldehydem, jedná se zřejmě o první případ, kdy byly prováděny imunizace spoužitím nativních toxinů C. difficile.

c) Čištění antitoxinů

Od slepic ve skupině CTB po 10 až 12 dnech po druhé imunizaci toxoidem (den 35 imunizace popsané výše v oddílu (b)) a od slepic ve skupinách CTA a CTAB po 20 až 21 dnech po druhé imunizaci toxoidem byla sbírána slepice. Pro získání preimunní (negativní) kontroly byla sbírána vejce také od ne imunizovaných slepic ze stejného hejna. Ze čtyř skupin vajec byl způsobem popsaným v příkladu 1 (c) extrahován ze žloutku imunoglobulin (IgY) a konečné pelety IgY byly solubilizovány v PBS v původním objemu žloutku bez thimerosalu. Thimerosal byl vyloučen,

-47CZ 296806 B6 protože by byl toxický vůči buňkám CHO, používaným v testech neutralizace toxinu, popsaných dále v sekci (d).

d) Test aktivity neutralizace toxinu

Aktivita roztoků IgY, připravený v oddílu (c), při neutralizaci toxinů byla stanovena testem, který byl modifikován podle publikovaných metod. [Ehrich a d., Infect. Immun. 28:1041-1043 (1992), a McGee a d., Microb. Path. 12:333-341 (1992).] Jako další kontrola byla aktivita při neutralizaci toxinů zjišťována také u afínitně čištěného kozího anti-toxinu A C. difficile (Těch Lab) a afínitně čištěného kozího anti-toxinu B C. difficile (Těch Lab).

Roztoky IgY a kozí protilátky byly sériově ředěny médiem F 12 (GIBCO), které bylo doplněno 2 % FCS (GIBCO) (tento roztok je ve zbytku tohoto příkladu označován jako „médium“). Vzniklé roztoky protilátek pak byly smíseny se standardizovanou koncentrací buď nativního toxinu A C. difficile (Těch Lab), nebo nativního toxinu B C. difficile (Těch Lab) v dále uvedených koncentracích. Po 60 min inkubace při 37 °C bylo do jamek 96jamkových mikrotitračních destiček (Falcon Microtest III), které obsahovaly 2,5.10⁴ ovariálních buněk čínského křečka CHO - na jamku (buňky CHO byly naneseny na destičky předchozí den, aby dobře přilnuly) přidán objem 100 μΐ směsi toxin-protilátka. Dále uvedená konečná koncentrace toxinu nebo uvedené ředění protilátky se vztahuje na konečnou testovanou koncentraci každé látky přítomné v příslušné jamce mikrotitrační destičky. Byly připraveny referenční toxinové jamky, které obsahovaly buňky CHO a toxin A nebo toxin B ve stejné koncentraci, jaká byla použita u směsí toxin plus protilátka (tyto jamky neobsahovaly protilátku). Byly rovněž připraveny zvláštní kontrolní jamky, které obsahovaly pouze buňky CHO a médium. Zkušební destičky pak byly inkubovány 18 až 24 h v inkubátoru se zvlhčenou atmosférou s 5 % CO₂ při 37 °C. Následujícího dne byly zbylé ulpívající (životaschopné) buňky v jamkách podrobeny barvení po dobu 10 min pomocí 0,2% krystalové violeti (Mallinckrodt) rozpuštěné ve 2 % ethanolu. Přebytek zbarvení byl odstraněn oplachem vodou a barvené buňky byly solubilizovány přídavkem 100 μΐ 1% SDS (rozpuštěného ve vodě) do každé jamky. Pak byla měřena absorbance každé jamky při 570 nm a bylo vypočteno procento cytotoxicity každého zkušebního vzorku nebo směsi podle vzorce absorbance vzorku % cytotoxicity buněk CHO = [1 - (-------------------)] x 100 absorbance kontroly

Na rozdíl od dříve publikovaných údajů, kde se výsledky kvantifikují visuálně počítáním zaoblených buněk na základě mikroskopie, byly v tomto příkladu ke kvantifikaci testu toxinů C. difficile použity spektrofotometrické metody. Pro stanovení aktivity CTA, CTAB a preimunních preparátů IgY, stejně jako afínitně čištěného kontrolního kozího antitoxinu A, při neutralizaci toxinu A byla jednotlivá ředění těchto protilátek podrobena reakci s 0,1 pg/ml nativního toxinu A (tj. přibližně 50 % cytotoxické dávky toxinu A v tomto testu). Výsledky jsou znázorněny na obr. 3.

K úplné neutralizaci došlo v případě IgY CTA (antitoxin A) ve zředění 1:80 nebo nižším a významná neutralizace se projevovala do zředění 1:320. IgY CTAB (antitoxin A + toxin B) vykazoval úplnou neutralizaci při ředění 1:320 až 1:160 a nižším a významnou neutralizaci to ředění 1:1280. Komerčně dostupný afínitně čištěný kozí antitoxin A neneutralizoval toxin A úplně při žádném z testovaných zředění, ale vykazoval významnou neutralizaci do zředění 1:1280. Preimunní IgY nevykazoval aktivitu při neutralizaci toxinu A v žádné testované koncentraci. Výsledky demonstrují, že IgY, čištěný z vajec, snášených slepicemi, imunizovanými samotným toxinem A nebo současně toxinem A a toxinem B, je účinným antitoxinem proti toxinu A.

Aktivita CTAB a preimunních preparátů IgY a rovněž afínitně čištěného kontrolního kozího antitoxinu B při neutralizaci toxinu B byla stanovována reakcí různých zředění těchto protilátek

-48CZ 296806 B6 s nativním toxinem B v koncentraci 0,1 ng/ml (přibližně 50% cytotoxické dávky toxinů B v testovaném systému). Výsledky jsou znázorněny na obr. 4.

K úplné neutralizaci toxinů B došlo u IgY CTAB (antitoxin A + toxin B) při zředění 1:40 a nižším a významná neutralizace se projevovala do zředění 1:320. Afínitně čištěný kozí antitoxin B vykazoval úplnou neutralizaci při zředění 1:640 a nižším a významná neutralizace se projevovala do ředění 1:2560. Preimunní IgY nevykazoval neutralizační aktivitu vůči toxinů B při žádné testované koncentraci. Tyto výsledky demonstrují, že IgY, čištěný z vajec, snášených slepicemi imunizovanými současně toxinem A a toxinem B, je účinným antitoxinem proti toxinů B.

V další studii byla zjišťována aktivita CTB, CTAB a preimunních preparátů IgY při neutralizaci toxinů B reakcí různých ředění těchto protilátek s nativním toxinem B v koncentraci 0,1 pg/ml (přibližně 100 % cytotoxické dávky toxinů B v tomto testovacím systému). Výsledky jsou uvedeny na obr. 5.

K významné neutralizaci toxinů B došlo v případě IgY CTAB (antitoxin B) ve zředění 1:80 a nižším, zatímco v případě IgY CTAB (antitoxin A + toxin B) byla zjištěna významná neutralizační aktivita při zředění 1:40 a nižším. Preimunní IgY nevykazoval neutralizační aktivitu vůči toxinů B v žádné testované koncentraci. Tyto výsledky demonstrují, že IgY, čištěný z vajec, snášených slepicemi imunizovanými samotným toxinem B nebo současně toxinem A a toxinem B, je účinným antitoxinem vůči toxinů B.

Příklad 9

Ochrana zlatých syrských křečků in vivo před onemocněním C. difficile pomocí ptačích antitoxinů proti toxinům, A a B C. difficile

Nej intenzivněji používaným zvířecím modelem pro studium onemocnění C. difficile je křeček. [Lyerly a d., Infect. Immun. 47:349-352 (1992).] Existuje několik jiných zvířecích modelů pro průjem vyvolaný antibiotiky, ale žádný z nich nesimuluje lidskou formu onemocnění tak blízce jako křeček. [R. Fekety, „Animal Models of Antibiotic-Induced Collitis“, in: O. Zak a M. Sande (ed.), Experimental Models in Antimicrobial Chemotherapy, sv. 2, str. 61-72 (1986).] V tomto modelu se zvířata nejprve predisponují pro onemocnění orálním podáním antibiotika, jako je klindamycin, které mění populaci normálně se vyskytující gastrointestinální flóry (Fekety, str. 61-72). Po orální imunizaci zvířat životaschopnými organizmy C. difficile se u křečků vyvine zánět slepého střeva a na střevní sliznici je patrné krvácení, ulcerace a zánět. [Lyerly a d., Infect. Immun. 47:349-352 (1985).] Zvířata se stanou letargickými, mají silný průjem a vysoké procento jich na onemocnění umírá. [Lyerly a d., Infect. Immun. 47:349-352 (1985).] Tento model se proto ideálně hodí pro vývoj terapeutických prostředků, navrhovaných pro léčbu nebo profylaxi onemocnění C. difficile.

Schopnost antitoxinů C. difficile, popsaných výše v příkladu 1, chránit křečky před onemocněním C. difficile, byla zjišťována pomocí zlatého syrského křečka jako modelu infekce C. difficile. Příklad zahrnoval (a) přípravu ptačích antitoxinů C. difficile, (b) ochranu křečků před onemocněním C. difficile léčbou pomocí ptačích antitoxinů a (c) dlouhodobé přežití ošetřených křečků.

a) Příprava ptačího antitoxinů C. difficile

Od slepic ze skupin CTA a CTAB, popsaných v příkladu 1 (b), byla sebrána vejce. Vejce použitá jako preimunní (negativní) kontrola byla zakoupena v místním supermarketu. Z těchto tří skupin vajec byl extrahován imunoglobulin IgY způsobem popsaným v příkladu l(c) a konečné pelety

IgY byly solubilizovány ve výživném prostředku Ensure® v objemu jedné čtvrtiny původního objemu žloutku.

-49CZ 296806 B6

b) Ochrana křečků in vivo proti onemocnění C. difficile ošetřením ptačím antitoxinem

Byla zjišťována schopnost ptačích antitoxinů C. difficile, připravených v oddíle (a), chránit křečky před onemocněním C. difficile, s použitím zvířecího modelu, modifikovaného podle publikovaných postupů. [Fekety, str. 61-72, Borriello a d., J. Med. Microbiol. 24:53-64 (1987), Kim a d., Infect. Immun. 55:2984-2992 (1987)), Borriello a d., J. Med. Microbiol. 25:191-196 (1988), Delmee a Avesani, J. Med. Microbiol. 33:85-90 (1990), a Lyerly a d., Infect. Immun. 59:2215— 2218 (1991).] pro tuto studii byly použity tři různé experimentální skupiny, každá tvořená 7 samicemi zlatých čínských křečků (Charles River) o stáří přibližně 10 týdnů a hmotnosti přibližně 100 g. Tyto skupiny byly označeny „CTA“, „CTAB“ a „preimunní“. Tato označení odpovídala antitoxinovým preparátům, jimiž byla zvířata v každé skupině ošetřována. Každé zvíře bylo umístěno v samostatné kleci a po celou délku studie dostávalo potravu a vodu ad libitum. V den 1 bylo každému zvířeti orálně podáno 1,0 ml jednoho ze tří antitoxinových preparátů (připravených výše v oddíle (a)) v těchto časových bodech: 0 h, 4 h a 8 h. V den 2 bylo opakováno ošetření jako v den 1. V den 3 v časovém bodě 0 byl každému zvířeti opět podán výše popsaným způsobem antitoxin. Po 1 h bylo každému zvířeti orálně podáno 3,0 mg klindamycin-HCl (Sigma) v 1 ml vody. Toto ošetření predisponuje zvířata k infekci C. difficile. Jako kontrola možné endogenní kolonizace C. difficile byly stejným způsobem dále podány 3,0 mg klindamycin-HCl ještě jednomu zvířeti ze stejné dodávky (neošetřenému). Toto kontrolní zvíře s klindamycinem bylo po zbytek sutide ponecháno bez ošetření (a bez infekce). V časových bodech 4 h a 8 h byl zvířatům výše uvedeným způsobem podán antitoxin. V den 4 v časovém bodě 0 h byl každému zvířeti opět výše uvedeným způsobem podán antitoxin. V 1 h bylo každé zvíře orálně imunizováno 1 ml inokula C. difficile, které obsahovalo přibližně 100 organizmů kmene 43596 C. difficile ve sterilním salinickém roztoku. Kmen C. difficile 43956, což je kmen sérotypu C, byl zvolen proto, že je zástupcem jednoho z nejčastějších sérotypů, izolovaných z pacientů s pseodomembránovou kolitis, vyvolanou antibiotiky. [Delmee a d., J. Clin. Microbiol., 28:2210-2214 (1985).] Navíc se tento kmen již dříve projevil jako virulentní nakřeččím modelu infekce. [Delmee a Avesani, J. Med. Microbiol. 33:85-90 (1990).]. V časových bodech 4 h a 8 h byl zvířatům výše uvedeným způsobem podán toxin. Ve dny 5 až 13 byl zvířatům 3x denně podáván antitoxin, jak je výše popsáno pro den 1, a byl pozorován nástup průjmu a úhyn. Ráno dne 14 byly shrnuty konečné výsledky studie. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13.

Tabulka 13. Výsledky ošetření

skupina	počet přeživších zvířat	počet uhynulých zvířat
preimunní	1	6
CTA (pouze antitoxin A)	5	2
CTAB (antitoxin A + antitoxin B)	7	0

U zástupců zvířat, uhynulých ve skupinách preimunního preparátu a CTA, byla provedena nekropsie. Z apendixů těchto zvířat byly kultivovány životaschopné organizmy C. difficile a makroskopická patologie gastrointestinálního traktu těchto zvířat byla konzistentní s očekáváním pro onemocnění C. difficile(zanícený, zvětšený, hemoragický apendix, vyplněný vodnatým diaroickým materiálem). Kontrolní zvířata s klindamycinem zůstala během celé doby studie zdravá, což ukazuje, že křečci, použití pro studii, nebyli před zahájením studie kolonizováni endogenními organizmy C. difficile. Po konečném ošetření antitoxinem v den 13 bylo usmrceno a porobeno pitvě i vždy jedno přeživší zvíře ze skupiny CTA a CTAB. U žádného nebyla zaznamenána patologie.

-50CZ 296806 B6

Ošetření křečků orálně podaným antitoxinem proti toxinu A a toxinu B (skupina CTAB) úspěšně chránilo 7 ze 7 (100 %) zvířat před onemocněním C. difficile. Ošetření křečků orálně podaným antitoxine proti toxinu A (skupina CTA) chránilo 5 ze 7 (71 %) těchto zvířat před onemocněním C. difficile. Ošetření pomocí preimunního IgY před onemocněním C. difficile nechránilo, protože přežilo pouze 1 ze 7 (14 %) těchto zvířat. Tyto výsledky demonstrují, že ptačí antitoxin proti toxinu A a ptačí antitoxin proti toxinu A + toxinu B účinně chrání křečky před onemocněním C. difficile. Z těchto výsledků rovněž vyplývá, že i když neutralizace toxinu A samotného poskytuje určitý stupeň ochrany proti onemocnění C. difficile, je pro dosažení maximální ochrany nutná současně aktivita antitoxinu A a antitoxinu B.

c) Dlouhodobé přežití ošetřených křečků

V literatuře bylo popsáno, že křečci, ošetřování orálně podávaným koncentrátem hovězího IgG, jsou chráněni před onemocněním C. difficile, pokud ošetřování trvá, ale jakmile se přeruší, vyvine se u nich průjem a zvířata během 72 h uhynou. [Lyerly a d., Infect. Immun. 59(6):2215-2218(1991).]

Za účelem zjištění, zda léčba onemocnění C. difficile pomocí ptačích antitoxinů podporuje dlouhodobé přežití po přerušení léčby, byla pozorována 4 přežívající zvířata ve skupině CTA a 6 přežívajících zvířat ve skupině CTAB po dobu 11 dní (264 h) po přerušení léčby antitoxinem, popsané výše v oddílu (b). Všichni křečci zůstali po celou tuto dobu zdraví. Tento výsledek demonstruje, že léčba ptačím antitoxinem nejen chrání před nástupem onemocnění C. difficile, (tj. je profylakticky účinná), ale podporuje i dlouhodobé přežití po skončení léčby, a tak poskytuje trvalé vyléčení.

Příklad 10

Léčba nepopiratelné infekce C. difficile u zlatých syrských křečků ptačími antitoxiny proti toxinům A a B C. difficile

Schopnost ptačích antitoxinů C. difficile, popsaných výše v příkladu 8, léčit stanovenou infekci C. difficile byla hodnocena pomocí modelu zlatého syrského křečka. Příklad zahrnoval (a) přípravu ptačích antitoxinů C. difficile, (b) léčbu křečků s nepopiratelnou infekcí C. difficile in vivo a (c) histologické hodnocení cekální tkáně.

a) Příprava ptačích antitoxinů C. difficile

Byla odebrána vejce od slepic skupiny CTAB, popsané výše v příkladu 8 (b), které byly imunizovány toxoidy C. difficile a nativními toxiny A a B. Vejce zakoupená v místním supermarketu byla použita jako preimunní (negativní) kontrola. Z obou skupin vajec byl extrahován imunoglobulin IgY způsobem popsaným v příkladu l(c) a konečné pelety IgY byly solubilizovány ve výživném prostředku Ensure® v objemu čtvrtiny původního objemu žloutku.

b) Léčba křečků s nepopiratelnou infekcí C. difficile in vivo

Ptačí antitoxiny C. difficile, připravené výše v oddílu (a), byly hodnoceny na schopnost léčit stanovenou infekci C. difficile u křečků s použitím zvířecího modelu, který byl modifikován podle postupu, který byl popsán pro studii ochrany křečků výše v příkladu 8(b).

Pro tuto studii byly použity čtyři experimentální skupiny, každá tvořená 7 samicemi zlatých syrských křečků (Charles River) o stáří přibližně 10 týdnů a hmotnosti přibližně 100 g. Každé zvíře bylo ustájeno samostatně a po celou dobu studie dostávalo potravu a vodu ad libitum.

-51 CZ 296806 B6

V den 1 studie byla provedena predispozice zvířat ve všech čtyřech skupinách infekcí C. difficile orálním podáním 3,0 mg klindamycin-HCl (Sigma) v 1 ml vody.

V den 2 bylo každé zvíře ve všech čtyřech skupinách orálně imunizováno 1 ml inokula C. difficile, které obsahovalo přibližně 100 organizmů kmene 43596 C. difficile ve sterilním salinickém roztoku. Kmen 43596 C. difficile byl zvolen proto, že je zástupcem jednoho z nejčastěji se vyskytujících sérotypů izolovaných z pacientů s pseudomembránovou kolitidou, spojenou s antibiotiky. [Delmee a d., J. Clin. Microbiol. 28:2210-2214 (1990).] Protože byl tento kmen použit ve všech předchozích příkladech, byl zde použit také z důvodu experimentální kontinuity.

V den 3 studie (24 h po infekci) byla zahájena léčba ve dvou ze čtyř skupin zvířat. Každé zvíře v jedné skupině dostalo orálně 1,0 ml preparátu IgY CTAB (připraveného výše v oddíle (a)) v časových bodech 0 h, 4 h a 8 h. Zvířata v této skupině byla označena „CTAB-24“. Zvířatům ve druhé skupině bylo orálně podáno 1,0 ml preimunního preparátu IgY (připraveného rovněž výše v oddíle (a)) ve stejných časových bodech jako v případě skupiny CTAB. Tato zvířata byla označena jako „Pre-24“. Ve zbylých dvou skupinách zvířat se v den 3 nic neprovádělo.

V den 4, 48 h po infekci, bylo ve skupinách CTAB-24 a Pre-24 opakováno stejné ošetření jako v den 3, které bylo také zahájeno ve stejných časových bodech ve zbylých dvou skupinách. Poslední dvě skupiny zvířat byly označeny „CTAB-48“ a „Pre-48“.

V den 5 až 9 byl zvířatům ve všech čtyřech skupinách podán 3x denně antitoxin nebo preimunní IgY, jak je popsáno výše pro den 4. Všechny čtyři skupiny jsou shrnuty v tabulce 14.

Tabulka 14. Experimentální skupiny

označení	experimentální ošetření
CTAB-24	infekce, léčba w/antitoxin IgY zahájení 24 h po infekci
Pre-24	infekce, léčba w/preimunní IgY zahájení 24 h po infekci
CTAB-48	infekce, léčba w/antitoxin IgY zahájení 48 h po infekci
Pre-48	infekce, léčba w/preimunní IgY zahájení 48 h po infekci

U všech zvířat byl pozorován nástup průjmů a úhyn do uzavření studie ráno 10. dne. Výsledky studie jsou znázorněny v tabulce 15.

Tabulka 15. Experimentální výsledky - den 10

skupina	počet přeživších zvířat	počet uhynulých zvířat
CTAB-24	6	1
Pre-24	0	7
CTAB-48	4	3
Pre-48	2	5

Přežilo 86 % zvířat, která začala dostávat léčbu IgY antitoxinu 24 h po infekci (CTAB-24), resp.

% zvířat, léčených IgY antitoxinu počínaje 48 h po infekci (CTAB-48). Naproti tomu nepře-52CZ 296806 B6 žilo žádné zvíře, které dostávalo preimunní IgY počínaje 24 h po infekci (Pre-24), a do závěru studie přežilo pouze 29 % zvířat, která začala dostávat léčbu preimunním IgY 48 po infekci (Pre48). Tyto studie demonstrují, že ptačí antitoxiny, vytvořené proti toxinům A a B C. difficile, jsou schopny úspěšně léčit nepopiratelnou infekci C. difficile in vivo.

c) Histologické hodnocení cekální tkáně

Pro další hodnocení schopnosti preparátů IgY, testovaných v této studii na schopnost léčit nepopiratelnou infekci C. difficile bylo provedeno histologické hodnocení vzorků cekální tkáně, získaných od reprezentativních zvířat ze studie popsané výše v oddílu (b).

Bezprostředně po smrti byly ze zvířat, která uhynula ve skupinách Pre-24 a Pre-48, odebrány vzorky cekální tkáně. Po dokončení studie byl usmrcen zástupce přeživších zvířat a byly odebrány vzorky cekální tkáně ze skupin CTAB-24 a CTAB-48. Bylo rovněž usmrceno jedno neošetřené zvíře ze stejné dodávky, jaká byla použita ve studii, a vzorek cekální tkáně byl odebrán jako normální kontrola. Všechny tkáňové vzorky byly fixovány přes noc při 4 °C v 10% pufrovaném formalinu. Fixované tkáně byly uloženy do parafínu, nařezány a umístěny na podložní sklíčka. Řezy tkání pak byly barveny pomocí hematoxylinu a eosinu (skvrna H a E) a zkoumány světelnou mikroskopií.

Při zkoumání nevykazovaly tkáně získané ze zvířat CTAB-24 a CTAB-48 žádné patologické známky a byly nerozeznatelné od normální kontroly. Toto zjištění poskytuje další důkaz schopnosti ptačích antitoxinů, vytvořených proti toxinům A a B C. difficile, účinně léčit nepopiratelnou infekci C. difficile a zabraňovat patologickým následkům, ke kterým vlivem C. difficile normálně dochází.

Naproti tomu bylo u zvířat ze skupin Pre-24 a Pre-48, která uhynula na onemocnění C. difficile, pozorováno charakteristické podstatné poškození a destrukce sliznic. Normální architektura tkáně byla u těchto dvou preparátů obliterována a většina tkáně sliznic odpadla a vyskytovaly se četné velké hemorrhagické oblasti obsahující masivní počty erytrocytů.

Příklad 11

Klonování a exprese fragmentů toxinu A C. difficile

Byl klonován a sekvenován gen toxinu A a bylo zjištěno, že kóduje protein o předpokládané MW 308 kD. [Dove a d., Infect, Immun., 58:480-488 (1990).] Vzhledem k nákladnosti a obtížnosti izolace nativního proteinu toxinu A by bylo výhodné používat jednoduché a nenákladné prokaryotické expresní systémy pro produkci a čištění vysokých hladin rekombinačního proteinu toxinu A pro účely imunizace. Ideálně by byl izolovaný rekombinační protein rozpustný, aby si uchoval nativní antigenitu, protože solubilizované proteiny inkluzních tělísek se často neskládají do nativních konformací. K usnadnění čištění by měl být rekombinační protein exprimován v hladinách vyšších než 1 mg/1 kultury E. coli.

Za účelem stanovení, zdaje možno v E. coli produkovat vysoké hladiny rekombinačního protein toxinu A, byly fragmenty genu toxinu A klonovány od různých prokaryotických expresních vektorů a zjišťována jejich schopnost exprimovat rekombinační protein toxinu A v E. coli. Byly použity tři prokaryotické expresní systémy. Tyto systémy byly zvoleny proto, že způsobovaly expresi buď fúzního (pMALc a pGEX2T), nebo nativního (pET23a-c) proteinu v E. coli do vysokých hladin a umožňovaly afínitní čištění exprimovaného proteinu na koloně obsahující ligandy. Fúzní proteiny exprimované z vektorů pGEX vážou glutathionové agarózové perličky a jsou eluovány redukovaným glutathionem. Fúzní proteiny pMAL vážou amylózovou pryskyřici a jsou eluovány maltózou. Buď na N-terminálním (pET16b), nebo na C-terminálním (pET23a-c) konci fúzních proteinů pET je přítomna polyhistidinová značka. Tato sekvence spe

-53CZ 296806 B6 cificky váže chelátové kolony Ni₂~ a je eluována imidazolovými solemi. Podrobný popis těchto vektorů je k dispozici (Williams a d. (1994), DNA Cloning: Expression Systems, v tisku) a zde není podrobně rozebírán. Příklad zahrnoval (a) klonování genu toxinu A, (b) expresi velkých fragmentů toxinu A v různých prokaryotických expresních systémech, (c) identifikaci menších fragmentů genu toxinu A, které účinně exprimují v E. coli, (d) čištění rekombinačního proteinu toxinu A afínitní chromatografíi a (e) demonstraci funkční aktivity rekombinačního fragmentu genu toxinu A.

a) Klonování genu toxinu A

Restrikční mapa genu toxinu A je znázorněna na obr. 6. Kódovaný protein obsahuje karboxyterminální vazebnou oblast ligandu, obsahující násobné repetice vazebné oblasti uhlohydrátů. [von Eichel-Streiber a Sauerbom, Gene 96:107-113 (1990).] Gen toxinu A byl klonován ve třech kusech s použitím buď polymerázové reakce (PCR) k amplifíkaci specifických oblastí (oblasti 1 a 2 na obr. 6), nebo screeningem konstruované genomové knihovny pro specifický fragment genu toxinu A (oblast 3 na obr. 6). Sekvence použitých primerů PCR:

P1: 5’ GGAAATT TAGCTGCAGCATCTGAC 3’ (SEQ ID NO:1)

P2: 5’ TCTAGCAAATTCGCTTGT GTTGAA 3’ (SEQ ID NO:2)

P3: 5’ CTCGCATATAGCATTAGACC 3’ (SEQ ID NO:3) a

P4: 5’ CTATCTAGGCCTAAAGTAT 3’ (SEQ ID NO:4).

Tyto oblasti byly klonovány do prokaryotických expresních vektorů, které exprimují v E. coli ve vysokých hladinách buď fúzní (pMALc a pGEX2T), nebo nativní (pET23a-c) protein a umožňují afínitní čištění exprimovaného proteinu na koloně obsahující ligandy.

Kmen 10463 Clostridium difficile VPI byl získán z ATCC (ATCC č. 43255) a kultivován za anaerobních podmínek v mozkovém a srdcovém nálevu (BBL). Vysokomolekulámí DNA. C. difficile byla získána v podstatě způsobem popsaným v Wren a Tabaqchali (1987), J. Clin. Microbiol., 25:2402, avšak k rozrušení bakterií byla použita proteináza K a dodecylsulfát sodný (SDS) a k odstranění uhlohydrátů zvyčeřeného lyzátu bylo použito srážení pomocí cetyltrimethylamoniumbromidu [jak uvádí Ausubel a d., Current Protocols in Molecular Biology (1989).]. Integrita a výtěžek genomové DNA byl hodnocen porovnáním se sériovým ředěním nedělené DNA lambda po elektroforéze na agarózovém gelu.

Fragmenty 1 a 2 byly klonovány pomocí PCR s použitím korekční termostabilní DNA polymerázy (nativní polymeráza pfu·, Stratagene). Vysoká věrnost této polymerázy snižuje mutační problémy spojené s amplifíkaci pomocí polymeráz náchylných k chybám (například polymerázy Taq). Amplifikace PCR byla prováděna s použitím uvedených primerů PCR (obr.6) v reakčních směsích po 50 μΐ, obsahujících 10 mM Tris-HCl (8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, vždy 200 μΜ dNTP, vždy 0,2 μΜ primerů a 50 ng genomové DNA C. difficile. Reakční směsi byly překryty 100 μΐ minerálního oleje, zahřívány 4 min na 94 °C a po přidání 0,5 μΐ nativní polymerázy pfu (Stratagene) podrobeny 30 cyklům 1 min při 94 °C, 1 min při 50 °C a 4 min při 72 °C, po nichž následovalo 10 min při 72 °C. Duplicitní reakční směsi byly spojeny, extrahovány chloroformem a vy sráženy ethanolem. Po promytí v 70% ethanolu byly pelety resuspendovány v 50 μΐ pufru TE [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0]. Alikvoty po 10 μΐ byly restrikčně štěpeny pomocí buď EcoRI/HincU (fragment 1), nebo EcoRI(ft7l (fragment 2) a příslušné restrikční fragmenty byly gelově čištěny s použitím soupravy Prep-A-Gene (BioRad) a ligovány buď s vektorem pGEX2T (Pharmacia), restringovaným EcoRI/Smál (fragment 1), nebo s vektorem EcoRI/Pstl pMAIc (New England Biolabs) (fragment 2). Předpokládá se, že oba klony produkují v rámci fúze buď s proteinem glutathion-S-transferázou (vektor pGEX), nebo s maltózu vázajícím proteinem (vektoru pMAL). Rekombinační klony byly izolovány

-54CZ 296806 B6 a potvrzeny restrikčním štěpením pomocí standardních rekombinačních metod molekulární biologie [Sambrook a d., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)] a označeny pGA30-660, resp. pMA660-l 100 (označení klonů viz obr. 6).

Fragment 3 byl klonován z genomové knihovny zvolených velikostí genomové DNA C. difficile, štěpené pomocí Pstl, s použitím standardních metod molekulární biologie (Sambrook a d.). Vzhledem k tomu, že v genomové DNA C. difficile je vnitřní místo Pstl fragmentu 3 chráněno před štěpením [Pice a d., Curr. Microbiol., 16:55-60 (1987)], byl gelově vyčištěn fragment o velikosti 4,7 kb z genomové DNA C. difficile, restringované Pstl, a ligován s DNA pUC9, restringovanou Pstl a ošetřenou fosfatázou. Získaná genomová knihovna byla podrobena screeningu oligonukleotidovým primerem specifickým pro fragmentem 3 a bylo izolováno více nezávislých klonů. Přítomnost fragmentu 3 v několika těchto klonech byla potvrzena restrikčním štěpením a klon s uvedenou orientací (obr. 6) byl restringován pomocí BamHI/Hindlll, uvolněný fragment byl přečištěn gelovou elektroforézou a ligován s podobně restringovanou DNA expresního vektoru pET23c (Novagen). Rekombinační klony byly izolovány a potvrzeny restrikčním štěpením. U tohoto konstruktu se předpokládá, že vytváří jak předpokládanou fúzi v rámci s vedoucí sekvencí proteinu pET, tak s předpokládanou C-terminální polyhistidinovou afínitní značkou, a je označen pPAl 100-2680 (označení klonů viz obr. 6).

b) Exprese velkých fragmentů toxinu NvE. coli

Byla vyvolána exprese proteinů ze tří expresních konstruktů, vyrobených podle odstavce (a), a byla provedena analýza Western blot s afinitně čištěným kozím polyklonálním antisérem, zaměřeným proti toxoidu toxinu A (Těch Lab). Postupy použité pro indukci proteinu, SDS-PAGE a analýzu Western blot jsou podrobně popsány v Williams a d. (1994). Stručně řečeno, bylo 5 ml 2X YT (16 g tryptonu, 10 g kvasničného extraktu, 5 g NaCl na litr, pH 7,5) + 100 pg/ml ampicilinu přidáno ke kulturám bakterií (BL21 pro plazmidy pMAI a pGEX a BL21(DE3)LysS pro plazmidy pET), obsahující příslušný rekombinační klon, ve kterých byla indukovány exprese rekombinačního proteinu přídavkem IPGT k 1 mM. Kultury byly kultivovány při 37 °C a indukovány po dosažení hustoty buněk 0,5 OD₆₀₀. Indukovaný protein byl ponechán akumulovat se dvě hodiny po indukcí. Vzorky proteinu byly připraveny peletizací 1 ml alikvotů bakterií odstředěním (1 min vmikrofuze) a resuspendováním peletovaných bakterií ve 150 μΐ vzorkového pufřu 2x SDS-PAGE [Williams a d. (1994)]. Vzorky byly zahřívány 5 min na 95 °C a ochlazené alikvoty po 5 nebo 10 μΐ byly naneseny na 7,5% SDS-PAGE gely. Byly naneseny rovněž vysokomolekulámí markéry BioRad, aby bylo možno odhadovat molekulovou hmotnost identifikovaných fúzních proteinů. Po elektroforéze byl protein detekován buď obecně barvením gelů pomocí Coomassieovy modři, nebo specificky Westernovým blotem na nitrocelulózu pro detekci specifického imunoreaktivního proteinu. Westernový bloty (prováděné, jak uvedeno v příkladu 3), které detekují protein reaktivní s toxinem A v buněčných lyzátech indukovaného proteinu z těchto tří expresních konstruktů, jsou znázorněny na obr. 7. Na tomto obrázku obsahují pruhy 1 až 3 buněčné lyzáty připravené z kmenů E. coli, obsahujících pPAl 100-2860 v buňkách BL21(DE3)lysE; pruhy 4 až 6 obsahují buněčné lyzáty připravené z kmenů E. coli obsahujících pPAl 100-2860 v buňkách BL21(DE3)lysS; pruhy 7 až 9 obsahují buněčné lyzáty připravené z kmenů E. coli obsahujících pMA660-1100. Pruhy byly sondovány s afinitně čištěnou kozí polyklonální protilátkou proti antitoxinu A (Těch Lab). Kontrolní lyzáty z neindukovaných buněk (pruhy 1, 7 a 10) obsahují velmi málo imunoreaktivního materiálu v porovnání s indukovanými vzorky ve zbylých pruzích. Pás s největší molekulovou hmotností, pozorovaný pro každý klon, je konzistentní s předpovídanou plnou délkou fúzního proteinu.

Každý konstrukt řídí expresi vysokomolekulámího (HMW) proteinu, který je reaktivní s protilátkou toxinu A. Velikost největších imunoreaktivních pásů z každého vzorku je konzistentní s odhady MW intaktních fúzních proteinů. Z toho vyplývá, že tyto tři fúzní proteiny jsou v rámci a žádný z klonů neobsahuje klonující artefakty, které porušují integritu kódovaného fúzního proteinu. Western blot však demonstruje, že fúzní protein ze dvou větších konstruktů (pGA30-660 a pPAl 100-2860) je vysoce degradován. Hladina exprese proteinů toxinu A

-55CZ 296806 B6 z těchto dvou konstruktů je také nízká, protože pásy indukovaného proteinu nejsou při barvení Coomassie viditelné (neznázorněno). Bylo konstruováno několik dalších expresních konstruktů, které fúzují velké podoblasti genu toxinu A buď s expresním vektorem pMALc, nebo pET23a-c, a testováno na indukci proteinů. Tyto konstrukty byly vyrobeny smísením gelově čištěných restrikčních fragmentů, odvozených od expresních konstruktů znázorněných na obr. 6, s příslušně štěpenými expresního vektory, ligací a selekcí rekombinačních klonů, v nichž restrikční fragmenty toxinu A ligovaly spolu a do expresního vektoru, jak se předpokládá pro fúze v rámci. Exprimovaný interval toxinu A v těchto konstruktech je znázorněn na obr. 8, stejně jako interní restrikční místa, použitá k výrobě těchto konstruktů.

Zde používaný výraz „interval“ se vztahuje na jakoukoli část (tj. kterýkoli segment toxinu, který je menší než celá molekula toxinu) klostridiálního toxinu. Ve výhodném provedení se „interval“ vztahuje na části toxinů C. difficile, jako je toxin A nebo toxin B. Předpokládá se rovněž, že tyto intervaly odpovídají epitopům s imunologickým významem, jako jsou antigeny nebo imunogeny, proti nimž se uskutečňuje odpověď neutralizující protilátky. Tento vynález se v žádném případě neomezuje na konkrétní intervaly nebo sekvence, popisované v těchto příkladech. Předpokládá se rovněž, že pro přípravky a způsoby podle vynálezu se budou používat podčásti intervalů (například epitop obsažený v jednom intervalu nebo přemosťující více intervalů).

Ve všech případech byl Westernovou analýzou každého z těchto konstruktů s kozí protilátkou antitoxinu A (Těch Lab) detekován vysokomolekulární fúzní protein o předpokládané velikosti (neznázoměn). To potvrzuje, že čtecí rámec každého z těchto klonů není předčasně ukončen a dochází k fúzi ve správném rámci s fúzním partnerem. Westernová analýza však odhalila, že ve všech případech je indukovaný protein vysoce degradován a jak vyplývá z absence identifikovatelných pásů indukovaného proteinu při barvení pomocí Coomassieovy modři, je exprimován pouze v nízké hladině. Z těchto výsledků vyplývá, že exprese vysoké hladiny rekombinačního proteinu intaktního toxinu A není možná, jsou-li pomocí těchto expresních vektorů exprimovány v E. coli velké oblasti genu toxinu A.

c) Vysoká hladina exprese malých fúzních proteinů toxinu A vE. coli

Zkušenost ukazuje, že obtíže při expresi se většinou vyskytují v případě exprese velkých (větších než 100 kD) fragmentů v E. coli. Byl konstruován určitý počet expresních konstruktů obsahujících menší fragmenty genu toxinu A za účelem zjištění, zda je možno ve vysoké hladině exprimovat malé oblasti genu bez rozsáhlé degradace proteinu. Souhrn těchto expresních konstruktů je znázorněn na obr. 9. Všechny byly konstruovány fúzemi v rámci vyhovujících restrikčních fragmentů toxinu A buď s vektorem pMAlc, nebo pET23a-c. Proteinové preparáty z indukovaných kultur každého z těchto konstruktů byly analyzovány jak barvením Coomassieovou modří, tak Westernovou analýzou jako v odstavci (b). Ve všech případech byla pozorována vyšší hladina intaktního fúzního proteinu o plné délce než s většími rekombinanty z odstavce (b).

d) Čištění rekombinačního proteinu toxinu A

Ve větším měřítku (500 ml) byly kultivovány kultury každého rekombinantu z odstavce (c), indukovány a byla izolována rozpustná a nerozpustná proteinová frakce. Z rozpustných proteinových extraktů byl afinitní chromatografíi popsaným způsobem [Williams a d. (1994)] izolován rekombinační fúzní protein. Stručně řečeno byly extrakty obsahující značené fúze pET naneseny na niklchelátový sloupec a eluovány pomocí imidazolových solí podle údajů distributora (Novagen). Byly připraveny extrakty obsahující rozpustný fúzní protein pMAl a chromatografovány v chromatografickém pufru (10 mM NaPO₄, 0,5 M NaCl, 10 mM β-merkaptoethanol, pH 7,2) na sloupci amylózové pryskyřice (New England Biolabs) s elucí chromatografickým pufrem obsahujícím 10 mM maltózy [Williams a d. (1994)]. Bylo-li zjištěno, že exprimovaný protein je převážně nerozpustný, byly extrakty nerozpustného proteinu připraveny způsobem popsaným výše v příkladu 17. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 17. Obr. 10 ukazuje čištění

-56CZ 296806 B6 vzorků rekombinačního proteinu toxinu A. Pruhy 1 a 2 na tomto obrázku obsahují MBP fúzní protein čištěný afinitním čištěním rozpustného proteinu.

Tabulka 16. Čištění rekombinačního proteinu toxinu A

klon(a)	rozpustnost proteinu	výtěžek afinitně čištěného rozpustného proteinu0’*	% intaktního rozpustného fúzního proteinu(c>	výtěžek intaktního nerozpustného fúzního proteinu
pMA30-270	rozpustný	4 mg/500 ml	10%	NA
PMA30-300	rozpustný	4 mg/500 ml	5 až 10 %	NA
pMA300-600	nerozpustný	—*	NA	10 mg/500 ml
pMA660-1100	rozpustný	4,5 mg/500 ml	50%	NA
pMA1100-1610	rozpustný	18 mg/500ml	10%	NA
pMA1610-1870	obojí	22 mg/500ml	90 %	20 mg/500 ml
pMA1450-1870	nerozpustný	—	NA	0,2 mg/500 ml
pPA1100-1450	rozpustný	0,1 mg/500 ml	90%	NA
pPA1100-1870	rozpustný	0,02 mg/500 ml	90%	NA
pMA1870-2680	obojí	12 mg/500 ml	80%	NA
pPA1870-2680	nerozpustný	—	NA	10 mg/500 ml

(a) pP = vektor pET23, pM = vektor pMALc, A = toxin A (b) vztaženo na 1,5 OD₂₈₀ = 1 mg/ml (extinkční koeficient MBP) (c) odhadnuto z barvení gelů SDS-PAGE pomocí Coomassie

Pruhy 3 a 4 obsahují fúzní protein MBP čištěný solubilizací nerozpustných inkluzních tělísek. Vzorky čištěného fúzního proteinu jsou pMAl 870-2680 (pruh 1), pMA660-1100 (pruh 2), pMA300-600 (pruh 3) a pMA1450-1870 (pruh 4).

Špatných výtěžků afinitně čištěného proteinu bylo dosaženo, když byly pro expresi použity vektory pET, značené polyhistidinovým úsekem (pPAl 10-1450, pPAl 100-1870). Významných výtěžků proteinu však bylo dosaženo z expresních konstruktů pMAL, zahrnujících celý gen toxinu A, přičemž výtěžky plné délky rozpustného fúzního proteinu činily od odhadovaných 200 až 400pg/500ml kultury (pMA30-300) do více než 20 mg/500ml kultury (pMA16101870). Pouze jeden interval byl exprimován ve vysokých hladinách jako striktně nerozpustný protein (pMA300-600). I když tedy nebyla pozorována vysoká úroveň exprese při použití velkých expresních konstruktů z genu toxinu A, bylo možno dosáhnout použitelných hladin rekombinačního proteinu zahrnujícího gen celého toxinu A izolací indukovaného proteinu ze řady menších expresních konstruktů pMAL, které zahrnují gen celého toxinu A. Jedná se o první demonstraci proveditelnosti exprese rekombinačního proteinu toxinu A v E. coli ve vysoké hladině.

-57CZ 296806 B6

e) Test hemaglutinace s použitím rekombinačních proteinů toxinů A

Karboxyterminální konec, tvořený opakujícími se jednotkami, obsahuje hemaglutinační aktivitu vazebné domény toxinů A C. difficile. Za účelem stanovení, zda si exprimované rekombinanty toxinů A podržují funkční aktivitu, byly provedeny testy hemaglutinace. Dva rekombinační proteiny toxinů A, jeden obsahující vazebnou doménu buď jako rozpustný afinitně čištěný protein (pMAl 870-2680), nebo SDS solubilizovaný protein inkluzních tělísek (pPA 1870-2680), a rozpustný protein z jedné oblasti mimo tuto doménu (pMAl 100-1610) byly testovány popsaným postupem. [H. C. Krivan a d., Infect. Immun. 53:573 (1986).] Citrátované králičí červené krvinky (RRBC) (Cocalico) byly několikrát promyty Tris pufrem (0,1 M Tris a 50 mM NaCl) s odstředěním při 450 g po dobu 10 min při 4 °C. Z balených buněk byla vytvořena 1% suspenze RRBC a resuspendována v Tris pufru.V Tris pufru byla vytvořena ředění rekombinačních proteinů a nativního toxinů A (Těch Labs) a ve dvou exemplářích přidána do 96jamkové mikrotitrační desky s kulatým dnem v konečném objemu 100 μΐ. Do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ 1% suspenze RRBC, promícháno jemným poklepem a byla provedena inkubace po dobu 3 až 4 h při 4 °C. K významné hemaglutinaci došlo pouze u rekombinačních proteinů obsahujících vazebnou doménu (pMAl 870-2680) a nativní toxin A. Rekombinační protein vně vazebné oblasti (pMAl 100-1610) hemaglutinační aktivitu nevykazoval. S použitím ekvivalentních koncentrací proteinu byl hemaglutinační titr pro toxin A 1:256, zatímco titr pro rozpustné a nerozpustné rekombinační proteiny vazebné oblasti byl 1:256 a asi 1:5000. Testované rekombinační protein si zřetelně ponechávaly funkční aktivitu a byly schopny vázat RRBC.

Příklad 12

Funkční aktivita IgY reaktivního vůči rekombinantům toxinů A

Exprese rekombinačního proteinu toxinů A jako několikanásobných fragmentů v E. coli prokázala možnost tvorby antigenů toxinů A s použitím metodiky rekombinace (příklad 11). Izolace těchto rekombinačních proteinů umožňuje stanovit imunoreaktivitu každé jednotlivé podoblasti proteinu toxinů A (tj. v souboru protilátek zaměřených proti proteinu nativního toxinů A). Tak jsou identifikovány oblasti (pokud existují), v nichž je vyvolána malá nebo žádná protilátková odezva, použije-li se jako imunogen úplný protein. Protilátky zaměřené proti specifickým fragmentům proteinu toxinů A lze čistit afinitní chromatografíí proti rekombinačnímu proteinu toxinů A a testovat na schopnost neutralizace. Tak je možno identifikovat veškeré podoblasti toxinů A, které jsou nezbytné pro produkci neutralizujících protilátek, porovnáním s hladinami imunitní odpovědi zaměřené proti těmto intervalům při použití nativního toxinů jako imunogenu je možno předpovídat, zdaje možno použitím rekombinačního proteinu zaměřeného proti jednotlivé oblasti místo proti úplnému proteinu produkovat potenciálně vyšší titry neutralizujících protilátek. Konečně protože není známo, zda protilátky reaktivní vůči rekombinačním proteinům toxinů A, produkovaným v příkladu 11, neutralizují toxin A stejně účinně jako protilátky vytvořené proti nativnímu toxinů A (příklady 9 a 10), byla testována ochranná schopnost souboru protilátek, afinitně čištěných proti rekombinačním fragmentům toxinů A, hodnocena z hlediska schopnosti neutralizovat toxin A.

Tento příklad zahrnoval (a) epitopové mapování proteinu toxinů A za účelem zjištění titru specifických protilátek zaměřených proti jednotlivým podoblastem proteinu toxinů A, je-li jako imunogen použit protein nativního toxinů A, (b) afinitní čištění IgY reaktivního vůči rekombinačním proteinům, pokrývajícím gen toxinů A, (c) testy neutralizace toxinů A safinitně čištěným IgY reaktivním vůči rekombinačnímu proteinu toxinů A za účelem identifikace podoblastí proteinu toxinů A, které vyvolávají produkci neutralizujících protilátek, a stanovení, zdaje možno směsí protilátek reaktivních vůči rekombinačnímu proteinu toxinů A vyvolat kompletní neutralizaci toxinů A.

-58CZ 296806 B6

a) Epitopové mapování genu toxinu A

Afínitní čištění rekombinačního proteinu toxinu A, specifického pro definované intervaly proteinu toxinu A, umožňuje epitopové mapování souborů protilátek, zaměřených proti nativnímu toxinu A. To dosud nebylo možné, protože dřívější exprese rekombinantů toxinu A byla hodnocena pouze Westernovou analýzou bez znalosti hladiny exprese proteinu [například von EichelStreiber a d., J. Gen. Microbiol. 135:55-64 (1989)]. Vysoká nebo nízká reaktivita rekombinačního proteinu toxinu A na Westernových biotech může tedy odrážet rozdíly v expresi proteinu, ale nikoli rozdíly v imunoreaktivitě. Kvantifikováním čištěného rekombinačního proteinu, vytvořeného v příkladu 11, tak byl vyřešen přesně problém imunoreaktivity jednotlivých oblastí proteinu toxinu A.

Pro účely tohoto příkladu byl protein toxinu A rozdělen na šest intervalů (1 až 6) číslovaných od aminoterminálního konce (interval 1) ke karboxyterminálnímu konci (interval 6).

Rekombinační proteiny, odpovídající těmto intervalům, byly z expresních klonů (označení klonů viz příklad 1 l(d)) pMA30-300 (interval 1), pMA300-660 (interval 2), pMA660-1100 (interval 3), pPAl 100-1450 (interval 4), pMA1450-1870 (interval 5) a pMAl 870-2680 (interval 6). Těchto 6 klonů bylo zvoleno, protože pokrývají celý protein od aminokyseliny s číslem 30 do aminokyseliny s číslem 2680, a dělí tak protein na 6 malých intervalů. V jednom intervalu (interval 6) je také specificky obsažena karbohydrátová vazebná repetice, což umožňuje hodnocení imunitní odpovědi specificky zaměřené vůči této oblasti. Westernový bloty gelů 7,5 % SDSPAGE s nánosem a elektroforézou s definovaným množstvím každého rekombinačního proteinu, byly sondovány buď s polyklonální protilátkou kozího antitoxinů A (Těch Lab), nebo s polyklonální protilátkou kuřecího antitoxinů A [IgY pCTA, příklad 8 (c)]. Bloty byly připraveny a vyvíjeny dříve popsaným postupem s alkalickou fosfatázou [Williams a d. (1994) viz výše]. Bylo zjištěno, že alespoň 90 % veškeré reaktivity jak v souborech kozích, tak kuřecích protilátek bylo zaměřeno proti vazebné doméně ligandu (interval 6). Zbylá imunoreaktivita byla zaměřena proti všem pěti zbývajícím intervalům a byla v souborech obou protilátek podobná s tím rozdílem, že kuřecí protilátka vykazovala mnohem nižší reaktivitu proti intervalu 2 než kozí protilátka.

Tím je jasně demonstrována skutečnost, že použije-li se jako imunogen u koz nebo kuřat nativní toxin A, je převážná část imunitní odpovědi zaměřena v proteinu proti vazebné oblasti ligandu a zbylá odpověď je rozdělena po celých zbylých 2/3 proteinu.

b) Afínitní čištění IgY reaktivního vůči rekombinačnímu proteinu toxinu A

Byly připraveny afínitní kolony, obsahující rekombinační protein toxinu A ze 6 intervalů, definovaných v odstavci (a), a použity k (i) afinitnímu čištění protilátek reaktivních vůči každému jednotlivému intervalu z preparátu IgY CTA [příklad 8(c)] a (ii) zbavení preparátu IgY CTA intervalově specifických protilátek. Afínitní kolony byly připraveny navázáním 1 ml pryskyřice Actigel (Sterogene), promyté PBS, na oblastně specifický protein s použitím 1/10 konečného objemu kondenzačního roztoku Aid (1 M kyanborohydrid sodný). Celkové množství oblastně specifického proteinu, přidané ke každé reakční směsi, bylo 2,7 mg (interval 1), 3 mg (intervaly 2 a 3), 0,1 mg (interval 4), 0,2 mg (interval 5) a 4 mg (interval 6). Proteiny pro intervaly 1, 3 a 6 tvořil afinitně čištěný fúzní protein pMAL v afinitním pufru (viz příklad 11). Interval 4 byl afínitně čištěný fúzní protein obsahující polyhistidinový úsek v PBS, intervaly 2 a 5 byly z preparátů inkluzních tělísek nerozpustného fuzního proteinu pMAL, intenzivně dialyzovaných v PBS. Alikvoty supernatantů z kondenzačních reakcí před a po kondenzaci byly hodnoceny pomocí barvení Coomassie na gelech 7,5 % SDS-PAGE. Na základě intenzit proteinových pásů byla ve všech případech odhadnuta vyšší účinnost kondenzace než 50 %. Pryskyřice byly nality do 5ml kolon BioRad, intenzivně promyty PBS a skladovány při 4°C.

-59CZ 296806 B6

Pro každou jednotlivou oblast byly dále uvedeným způsobem alikvoty preparátu polyklonální protilátky IgY CTA zbaveny protilátky. Vzorek 20 ml preparátu IgY CTA [příklad 8(c)J byl intenzivně dialyzován proti 3 dávkám PBS (1 litr na každou dialýzu), kvantifikován pomocí absorbance při OD₂₈₀ a skladován při 4 °C. Z dialyzovaného preparátu IgY bylo odebráno šest alikvotů po 1 ml a zbavováno protilátky jednotlivě pro každý ze šesti intervalů. Každý lml alikvot procházel příslušnou afinitní kolonu a dvakrát byl na kolonu nanesen eluát. Eluát byl shromážděn a spojen s promytím 1 ml PBS. Navázaná protilátka byla z kolony eluována promytím 5násobkem objemu kolony 4 M guanidin-HCl (v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0). Kolona byla reekvilibrována v PBS a opět byl nanesen zásobní roztok zbavený protilátky. Eluát byl shromážděn, spojen s promytím 1 ml PBS, kvantifikován absorbancí při OD₂₈₀ a skladován při 4 °C. Tímto způsobem bylo dvěma cykly afinitního čištění pro každý ze šesti intervalů toxinu A jednotlivě zbaveno protilátky 6 alikvotů preparátu IgY CTA. Specifíta každého získaného zásobního roztoku byla testována Westernovým přenosem. Vzorky proteinů, odpovídající všem 6 podoblastem toxinu A, byly naneseny na duplicitní gely 7,5 % SDS-PAGE. Po elektroforéze byl proveden blotting gelů a přenos proteinů byl potvrzen barvením pomocí Ponceau S [postup popisuje Williams a d. (1994), viz výše]. Po 1 h blokování blotů při 20 °C v PBS + 0,1 % Tween 20 (PBTS) s obsahem 5 % mléka (jako blokujícím pufru) bylo přidáno buď 4 ml dialyzovaného preparátu IgY CTA ve zředění 1/500 v blokujícím pufru, nebo ekvivalentní množství šesti zásobních roztoků, zbavených protilátek (s použitím OD₂₈₀ pro standardizaci koncentrace protilátky) a bloty byly další 1 h inkubovány při teplotě místnosti. Bloty byly promyty a vyvíjeny alkalickou fosfatázou (s použitím konjugátu králičí anti-kuřecí alkalické fosfatázy jako sekundární protilátky, jak dříve popsáno [Williams a d. (1994), viz výše]. Ve všech případech byl reaktivity protilátky zbaven pouze cílový interval a bylo specificky odstraněno alespoň 90 % reaktivity cílových intervalů.

Soubory oblastně specifických protilátek byly izolovány afinitní chromatografíí dále popsaným způsobem. Na každou afinitní kolonu bylo postupně naneseno 10 ml dialyzovaného preparátu IgY CTA tak, že k izolaci oblastně specifických protilátek, specifických pro každou ze šestí podoblastí, byl použit jediný alikvot 10 ml. Kolony byly postupně promyty 10 objemy PBS, 6 objemy BBS-Tween, 10 objemy TBS a eluovány 4 ml elučního média Actisep (Sterogene). Eluát byl intenzivně dialyzován proti několika dávkám PBS a získaná afinitně čištěná protilátka byla skladována při 4 °C. Během dialýzy vzrostl v každém případě objem eluátu na více než 10 ml v důsledku vysoké viskozity elučního média Actisep. Alikvoty každého vzorku byly pomocí mikrokoncentračního zařízení Centricon 30 (Amicon) 20x zkoncentrovány a skladovány při 4 °C. Specifíta každého oblastně specifických protilátek byla testována oproti dialyzovanému preparátu IgY CTA Westernovou analýzou přesně stejným postupem jako výše s tou výjimkou, že místo preparátů IgY CTA, zbavených protilátky, byly použity vzorky po 4 ml blokujícího pufru, obsahujícího 100 μΐ oblastně specifické protilátky (nezkoncentrované). Každý preparát afinitně čištěné protilátky byl specifický pro definovaný interval s tou výjimkou, že vzorky čištěné proti intervalům 1 až 5 reagovaly i s intervalem 6. To může být důsledkem nespecifické vazby na protein intervalu 6, protože tento protein obsahuje repetitivní vazebnou doménu ligandu, o níž bylo uvedeno, že váže protilátky nespecificky. [Lyerly a d., Curr. Microbiol. 19:303-306 (1989).]

Reaktivita každého preparátu afinitně čištěné protilátky vůči odpovídajícím proteinům byla přibližně stejná jako reaktivita standardního dialyzovaného preparátu IgY CTA ve zředění 1/500. Jestliže zásobní roztoky specifické protilátky měly ředění 1/40, ukazuje to, že nezkoncentrované zásobní roztoky afinitně čištěné protilátky obsahují 1/10 až 1/20 koncentrace specifických protilátek oproti výchozímu preparátu IgY CTA.

c) Test neutralizace toxinu A s použitím protilátek reaktivních vůči rekombinačnímu proteinu toxinu A

K hodnocení schopnosti ochuzených nebo obohacených vzorků, připravených podle odstavce (b), neutralizovat cytotoxicitu toxinu A byl použit test neutralizace toxinu CHO [příklad 8(d)].

-60CZ 296806 B6

Obecná schopnost afínitně čištěných protilátek neutralizovat toxin A byla hodnocena tak, že byly navzájem smíseny alikvoty všech 6 koncentrovaných zásobních roztoků afínitně čištěných vzorků, vytvořených podle odstavce (b) a byla testována schopnost neutralizovat toxin A v koncentraci 0,1 pg/ml. Výsledky, znázorněné na obr. 11, prokazují téměř kompletní neutralizaci toxinu A pomocí afínitně čištěné (AP) směsi. Některé epitopy uvnitř rekombinačních proteinů, použitých pro afinitní čištění, se pravděpodobně ztratily při denaturaci proteinů před afínitním čištěním [působením guanidin-HCl podle odstavce (b)]. Neutralizační schopnost protilátek zaměřených proti rekombinačnímu proteinu je tedy při použití těchto afínitně čištěných souborů protilátek pravděpodobně podhodnocena. Tento experiment prokazuje, že protilátky reaktivní s rekombinačním toxinem A mohou neutralizovat cytotoxicitu, z čehož by vyplývalo, že je možno získat neutralizující protilátky s použitím proteinu toxinu A jako imunogenu.

Na základě zjištění, že rekombinační expresní klony genu toxinu A dělí protein na 6 podoblastí, je možno hodnotit neutralizační schopnost protilátek zaměřených proti každé jednotlivé oblasti. Nejprve byla zjišťována neutralizační schopnost protilátek zaměřených proti vazebné doméně ligandu toxinu A.

V experimentu neutralizace toxinu, znázorněném na obr. 11, byly z dialyzovaného preparátu PEG odstraněny protilátky specifické pro interval 6 (interval 6 obsahuje vazebnou doménu ligandu) a byl hodnocen účinek na neutralizaci toxinu. Preparát byl zbaven protilátek buď použitím preparátu IgY CTA pro interval 6, zbaveného protilátek, připraveného podle odstavce (b) (na obr. 11 „-6 aff. depleted“), nebo přidáním proteinu intervalu 6 k preparátu IgY CTA (odhadováno jako lOnásobný molární přebytek vůči anti-interval 6 imunoglobulinu přítomnému v tomto preparátu), aby došlo ke kompetitivní soutěži o protein intervalu 6 (na obr. 11 „-6 prot depleted“). V obou případech snižuje odstranění specifických protilátek pro interval 6 neutralizační účinnost oproti výchozímu preparátu IgY CTA. Tím je demonstrováno, že protilátky zaměřené proti intervalu 6 přispívají k neutralizaci toxinu. Protože interval 6 odpovídá vazebné doméně ligandu v proteinu, demonstrují tyto výsledky, že protilátky zaměřené proti této oblasti v preparátu PEG přispívají k neutralizaci toxinu A v tomto testu. Je však signifikantní, že po odstranění těchto protilátek si preparát PEG ponechává významnou schopnost neutralizovat toxin A (obr. 11). Tato neutralizace je pravděpodobně důsledkem působení protilátek specifických k ostatním oblastem proteinu toxinu A, protože v ochuzeném vzorku, připraveném podle odstavce (b), bylo odstraněno alespoň 90 % protilátek, reaktivních s vazebnou oblastí ligandu. Tento závěr podporuje porovnání neutralizace toxinu afínitně čištěnou (AP) směsí oproti afínitně čištěné protilátce intervalu 6 samotné. Přestože byla pozorována určitá neutralizační schopnost u samotných AP protilátek intervalu 6, byla tato neutralizace významně nižší než v případě směsi všech AP zásobních roztoků protilátek (neznázoměno).

Vzhledem ktomu, že směs všech šesti afínitně čištěných vzorků neutralizovala cytotoxicitu toxinu A téměř úplně (obr. 11), byl stanoven relativní význam protilátek zaměřených proti intervalům 1 až 5 toxinu A ve směsi. Bylo to prováděno dvěma způsoby. Nejprve byly připraveny vzorky obsahující afínitně čištěné protilátky, reprezentující 5 ze 6 intervalů tak, že každý vzorek byl zbaven jedné oblasti. Obr. 12 znázorňuje neutralizační křivku vzorků, porovnávající neutralizační schopnost afínitně čištěných směsí protilátek bez protilátek specifických pro interval 4 (-4) nebo 5 (-5) vzhledem ke směsi všech 6 zásobních roztoků afínitně čištěných protilátek (pozitivní kontrola). Zatímco odstranění protilátek specifických pro interval 5 (nebo intervaly 1 až 3, neznázoměno) nemělo na neutralizaci toxinu žádný vliv, ztráta protilátek specifických pro interval 4 neutralizaci toxinu významně snížila (obr. 12).

Podobné výsledky byly pozorovány ve druhém experimentu, ve kterém byly k protilátkám specifickým pro interval 6 přidány afínitně čištěné protilátky, zaměřené proti jediné oblasti, a byly zkoumány účinky na neutralizaci toxinu. Pouze protilátky specifické pro interval 4 zvyšovaly výrazně neutralizaci, byly-li přidány k protilátkám specifickým pro interval 6 (obr. 13). Tyto výsledky demonstrují, že protilátky zaměřené proti intervalu 4 (odpovídající klonu pPAllOO1450 na obr. 9) jsou v tomto testu významné pro neutralizaci cytotoxicity. Epitopové mapování

-61 CZ 296806 B6 ukázalo, že vzniká pouze nízká hladina protilátek reaktivních s touto oblastí, použije-li se jako imunogen nativní toxin A [příklad 12(a)]. To vyvolává hypotézu, že imunizace rekombinačním proteinem, specifickým pro tento interval, vyvolá vyšší titr neutralizujících protilátek. Souhrnně lze říci, že tato analýza pomocí neutralizace CHO identifikovala v proteinu toxinu A dvě kritické oblasti, proti nimž jsou produkovány neutralizující protilátky.

Příklad 13

Produkce a hodnocení ptačího antitoxinu proti rekombinačním u polypeptidu toxinu A C. difficile

V příkladu 12 jsme demonstrovali neutralizaci cytotoxicity, zprostředkované toxinem A, afinitně čištěnými protilátkami, reaktivními s rekombinačními proteinem toxinu A. Za účelem zjištění, zda mohou být protilátky, získané imunizací fragmentem rekombinačního polypeptidu toxinu C. difficile, účinné při léčbě klostridiálních onemocnění, byly vytvořeny protilátky k rekombinačnímu proteinu toxinu A, reprezentujícímu vazebnou domény toxinu A, exprimující vazebnou oblast buď ve vektoru pMALc (pMA 1870-1680) nebo pET 23(pPAl870-2680). Protein pMAL byl afinitně čištěn jako rozpustný produkt [příklad 12(d)] a protein pET byl izolován jako nerozpustná inkluzní tělíska [příklad 12(d)J a solubilizován na imunologicky aktivní protein patentově chráněnou metodou (patentová přihláška USA 08/129027). Tento příklad zahrnuje (a) imunizaci, (b) shromažďování antitoxinu, (c) stanovení titru antitoxinové protilátky, (d) neutralizaci hemaglutinační aktivity toxinu A in vitro protilátkou proti rekombinačnímu toxinu A a (e) test neutralizační aktivity toxinu A in vitro.

a) Imunizace

K imunizaci slepic byl odděleně použit rozpustný preparát a preparát inkluzních tělísek. Oba čištěné polypeptidy toxinu A byly zředěny PBS a emulgovány přibližně stejným objemem CFA pro počáteční imunizaci a IFA pro posilovači imunizaci. V den nula bylo pro každý rekombinační preparát injekčně aplikováno dvěma bílým leghomským nosnicím (získaným od místního chovatele) na více místech (intramuskulámě a subkutánně) 1 ml adjuvantní směsi, obsahující přibližně 0,5 až 1,5 mg rekombinačního toxinu A. Posilovači imunizace 1,0 mg byla provedena v den 14 a v den 28.

b) Shromažďování antitoxinu

Ze žloutku byl standardním postupem PEG (jako v příkladu 1) extrahován celkový imunní IgY a konečná peleta IgY byla rozpuštěna ve sterilním PBS o původním objemu žloutky. Tento materiál se označuje „imunní rekombinační IgY“ nebo „imunní IgY“.

c) Titr antitoxinové protilátky

Za účelem zjištění, zdaje rekombinační protein toxinu A dostatečně imunogenní pro získání protilátek ve slepicích, byl pomocí ELISA stanoven titr protilátek rekombinačního polypeptidu toxinu A. V den 32 byla sebrána vejce od obou slepic, žloutky byly spojeny a popsanou metodou PEG byla izolována protilátka. Pro rozpustný rekombinační protein obsahující fúzi maltózu vázajícího proteinu vpMal (pMAl870-2680) byl stanoven titr imunní rekombinační protilátky IgY. 96jamkové destičky Falcon Pro-bind byly přes noc pokryty při 4 °C 100 μΐ/jamku rekombinantu toxinu A v koncentraci 2,5 μg/μl v PBS s obsahem 0,05 % thimerosalu. Pro porovnání reaktivity s fúzním partnerem byla jiná destička pokryta maltózu vázajícím proteinem (MBP) ve stejné koncentraci. Příští den byly jamky 1 h při 37 °C blokovány pomocí PBS s obsahem 1 % bovinního sérového albuminu (BSA). IgY, izolovaný z imunních nebo preimunních vajec, byl zředěn ředidlem protilátek (PBS s obsahem 1 % BSA a 0,05 % Tween-20) a přidán k blokovaným jamkám a inkubován 1 h při 37 °C. Destičky byly promyty třikrát PBS s obsahem 0,05 % Tween-20, pak třikrát PBS. Na destičku byl přidán králičí anti-kuřecí IgG, konjugovaný

-62CZ 296806 B6 s alkalickou fosfatázou (Sigma), zředěný ředidlem protilátek 1:1000. Destičky byly promyty stejně jako výše a byl přidán substrát [p-nitrofenylfosfát (Sigma)] v koncentraci 1 mg/ml v

0,05M Na₂CO₃, pH 9,5 a lOmM MgCl₂. Destičky byly kvantitativně hodnoceny na zařízení

Dynatech MR 300 Micro EPA při 410 nm asi 10 min po přidání substrátu.

Z výsledků tohoto testu ELISA vyplývá, že v kuřatech, imunizovaných rekombinačním polypeptidem toxinu A, byly produkovány vysoké titry protilátek, tento rekombinant se zdá vysoce imunogenní, protože byl schopen produkovat vysoké titry protilátek relativně rychle s málo imunizacemi. Titr imunního IgY zaměřeného specificky proti toxinové části rekombinantu byl vyšší než titr imunního IgY k jeho fúznímu partnerovi, maltózu vázajícímu proteinu, a významně vyšší než u preimunního IgY. Titr ELISA (reciproční k nejvyššímu zředění IgY poskytujícímu signál) vpreimunním IgY kMBP nebo rekombinantu byl méně než 1:30, zatímco titr IgY k MBP, resp. rekombinantu toxinu A byl 1:18 750, resp. více než 1:93 750. Významné je, že titry protilátek proti rekombinantu, vzniklých ve slepicích proti rekombinačnímu peptidů, jsou mnohem vyšší než v případě protilátek proti této oblasti, vzniklých imunizací nativním toxinem A. Titr protilátky k rekombinantu oblasti 1870-2680 v preparátu protilátek CTA je alespoň pětkrát nižší v porovnání s protilátkami vytvořenými rekombinantem (1:18750 versus více než 1:93750). Zdá se tedy, že lepší imunitní odpověď než v případě nativního toxinu A lze proti specifickému rekombinantu získat, použije-li se jako imunogen tento rekombinant.

Toto zjištění je významné, protože ukazuje, že k získání antitoxinových preparátů není nutno používat molekuly nativního toxinu, protože části rekombinantu stimulují produkci protilátek. Tak je možno odstranit problémy spojené s toxicitou nativního toxinu, což usnadňuje produkci antitoxinů ve velkém měřítku.

d) Neutralizace hemaglutinační aktivity toxinu A in vitro pomocí protilátky proti rekombinačnímu toxinu A

Toxin A má kromě cytotoxických a enterotoxických vlastností hemaglutinační aktivitu. Konkrétně toxin A sráží králičí erythrocyty vazbou na trisacharid (gal l-3Bl-4GlcNAc) na povrchu buněk. [H. Krivan a d., Infect. Immun. 53:573-581 (1986).] Zkoumali jsme, zda může protilátka proti rekombinačnímu toxinu A (imunní IgY, protilátky, získané imunizací nerozpustným produktem exprimovaným v pET) neutralizovat hemaglutinační aktivitu toxinu A in vitro. Postup testu hemaglutinace se řídil popisem v H. C. Krivan a d. Před provedením testu hemaglutinace byl imunní nebo pre-imunní IgY, frakcionovaný polyethylenglykolem, preabsorbován citrátovanými králičími erythrocyty, protože jsme zjistili, že i IgY samotný může srážet červené krvinky. Citrátované králičí červené krvinky (RRBC) (Cocalico) byly dvakrát promyty odstředěním při 450 g s izotonickým pufrem (0,1 M Tris-HCl, 0,05 M NaCl, pH 7,2). Protilátky v IgY, reaktivní sRRBC, byly odstraněny tak, že byla připravena 10% suspenze RRBC (přídavkem balených buněk k imunnímu nebo preimunnímu IgY) a směs byla inkubována 1 h při 37 °C. RRBC pak byly odstraněny odstředěním. Neutralizace hemaglutinační aktivity toxinu A protilátkou byla testována na 96jamkových mikrotítračních destičkách skulatým dnem. 25 μΐ toxinu A (36 μg/ml) (Těch Lab) v izotoníckém pufru bylo smíseno se stejným objemem různých ředění imunního nebo preimunního IgY v izotoníckém pufru a inkubováno 15 min při teplotě místnosti. Pak bylo přidáno 50 μΐ 1% suspenze RRBC v izotoníckém pufru a směs byla inkubována 3 h při 4 °C. Byly rovněž zahrnuty jamky s pozitivními kontrolami, obsahující konečnou koncentraci 9 pg/ml toxinu A po zředění bez IgY. Hemaglutinační aktivita byla hodnocena vizuálně, přičemž difúzní matrice RRBC, pokrývající dno jamky, představovala pozitivní hemaglutinační reakci a tuhý knoflík RRBC na dně představoval negativní reakci. Imunní IgY proti rekombinantu neutralizoval hemaglutinační aktivitu toxinu A s neutralizačním titrem 1:8. Preimunní IgY však nebyl schopen hemaglutinační schopnost toxinu A neutralizovat.

-63CZ 296806 B6

e) Test neutralizace toxinu A in vitro

Schopnost IgY proti rekombinačnímu toxinu (imunních protilátek IgY, získaných imunizací pomocí pMA 1870-2680, rozpustného rekombinačního proteinu s vazebnou doménou exprimovaného v pMAL, označených na obr. 14 Anti-tox. A-2 a uváděných jako rekombinační oblast 6) a preimunního IgY, připraveného podle příkladu 8(c), neutralizovat cytotoxickou aktivitu toxinu A byla hodnocena in vitro s použitím testu cytotoxicity buněk CHO a toxinu A (Těch Lab) v koncentraci 0,1 pg/ml způsobem popsaným v příkladu 8(c). Jako další kontrola byly použity preparáty IgY proti nativnímu toxinu A (CTA) a preimunního IgY, popsané v příkladu 8(c). Výsledky jsou znázorněny na obr. 14.

IgY proti rekombinačnímu toxinu vykázal pouze částečnou neutralizaci cytotoxické aktivity toxinu A, zatímco preimunní IgY významnou neutralizační aktivitu nevykázal.

Příklad 14

Neutralizace toxinu A. C. difficile in vivo

Byla hodnocena schopnost ptačích protilátek (IgY), získaných imunizací vazební doménou rekombinačního toxinu A, neutralizovat enterotoxinovou aktivitu toxinu A C. difficile in vivo s použitím zlatých syrských křečků. Příklad zahrnoval: (a) přípravu ptačího IgY proti rekombinačnímu toxinu A pro orální aplikaci, (b) ochranu křečků in vivo proti enterotoxicitě toxinu A C. difficile ošetřením toxinu A ptačím IgY proti rekombinačnímu toxinu A a (c) histologické hodnocení slepého střeva křečků.

a) Příprava ptačího IgY proti rekombinačnímu toxinu A pro orální aplikaci

Od slepic, které byly imunizovány fragmentem pMAl 870—2680 rekombinačního toxinu A C. í/z^zcz/e(popsaným v příkladu 13), byla získána vejce. Druhá skupina vajec, zakoupených v místním supermarketu, byla použita jako preimunní (negativní) kontrola. Z obou skupin vajec byl způsobem popsaným v příkladu 8(c) extrahován ze žloutku IgY a konečné pelety IgY byly solubilizovány ve čtvrtině původního objemu žloutku s použitím 0,lM karbonátového pufru (sms NaHCO₃ a Na₂CO₃), pH 9,5. Základní karbonátový pufr byl použit pro ochranu toxinu A před působením kyselého prostředí žaludku.

b) Ochrana křečků proti enterotoxicitě toxinu A C. difficile in vivo ošetřením toxinu A ptačím IgY proti rekombinačnímu toxinu A

Za účelem hodnocení schopnosti ptačího IgY proti rekombinačnímu toxinu A, připraveného podle odstavce (a), neutralizovat in vivo enterotoxinovou aktivitu toxinu A byl vyvinut model neutralizace toxinu in vivo s použitím zlatých syrských křečků. Tento model byl založen na publikovaných hodnotách minimálního množství toxinu A, nutného k vyvolání průjmu (0,08 mg toxinu A/kg tělesné hmotnosti) a úhynu (0,16 mg toxinu A/kg tělesné hmotnosti) při orálním podání křečkům (Lyerly a d., Infect. Immun. 47:349-352 (1985)).

Pro tuto studii byly použity čtyři oddělené experimentální skupiny, každá tvořená 7 samicemi zlatého syrského křečka (Charles River) o přibližném stáří tří a půl týdne a o hmotnosti přibližně 50 g. Zvířata byla ustájena ve skupinách po 3 a 4 a po celou délku studie měla přístup k potravě a vodě ad libitum.

Pro každé zvíře byla připravena směs obsahující buď 10 pg toxinu A (0,2 mg/kg), nebo 30 pg toxinu A (0,6 mg/kg) (toxin A C. difficile byl získán od Těch Lab) a 1 ml buď IgY proti rekombinačnímu toxinu A, nebo preimunního IgY (z odstavce (a)). Tyto směsi byly inkubovány 60 min při 37 °C a pak podány zvířatům orální cestou. Zvířata pak byla po dobu 24 h po podání směsi

-64CZ 296806 B6 toxin A + IgY sledována, zda dojde k nástupu průjmu nebo úhynu. Výsledky získané na konci této doby jsou uvedeny v tabulce 17.

Tabulka 17. Výsledky studie po 24 h

	výsledek studie po 24 h
experimentální skupina	zdravé1	průjem2	úhyn3
10 pg toxinů A + antitoxin proti intervalu 6	7	0	0
30 pg toxinů A + antitoxin proti intervalu 6	7	0	0
10 pg toxinů A + preimunní sérum	0	5	2
30 pg toxinů A + preimunní	0	5	2

zvířata zůstala po celých 24 h trvání studie zdravá ² u zvířat se vyvinul průjem, avšak nedošlo k úhynu ³ u zvířat se vyvinul průjem a následně uhynula

Předběžné ošetření toxinem A v obou testovaných dávkách s použitím IgY proti rekombinačnímu toxinů A zamezilo u křečků zjevným příznakům onemocnění. Předběžné ošetření toxinem A C. difficile s použitím IgY proti rekombinačnímu toxinů A tedy neutralizovalo enterotoxickou aktivitu toxinů A in vivo. Naproti tomu všechna zvířata ve dvou skupinách, které dostávaly toxin A a byly předběžně ošetřeny pomocí preimunního IgY, si vyvinula příznaky onemocnění, které sahaly od průjmu po úhyn. Průjem, který se vyvinul u 5 zvířat, která neuhynula v každé ze dvou preimunních skupin, do konce studie spontánně zmizel.

c) Histologické hodnocení slepých střev křečků

Pro další zhodnocení schopnosti IgY proti rekombinačnímu toxinů chránit křečky proti enterotoxinové aktivitě toxinů A bylo provedeno histologické hodnocení slepých střev křečků ze studie v odstavci (b).

Za účelem přípravy histologických vzorků byly usmrceny tři skupiny zvířat. První skupinu tvořilo po jednom reprezentativním zvířeti z každé ze 4 skupin přeživších křečků v závěru studie popsané v odstavci (b). Tato zvířata představovala ve studii časový bod 24 h.

Druhou skupinu tvořila dvě zvířata, která nebyl součástí výše popsané studie, ale byla oddělena ošetřena stejnými směsmi toxin A + preimunní IgY jako zvířata v odstavci (b). U obou těchto křečků se vyvinul průjem a byla usmrcena 8 h po podání směsi toxin A + preimunní IgY. V době usmrcení vykazovala obě zvířata příznaky průjmu. Tato zvířata představovala ve studii akutní fázi.

Konečná skupina byla tvořena jedním neošetřeným křečkem ze stejné dodávky jako zvířata použitá pro předchozí skupiny. Toto zvíře sloužilo jako normální kontrola.

Z těchto 7 zvířat byly odebrány vzorky cekální tkáně a fixovány přes noc při 4 °C s použitím

10% pufrovaného formalinu. Fixované tkáně byly uloženy do parafinu, rozřezány a přeneseny na skleněná mikroskopická podložní sklíčka. Poté byly řezy tkání barveny pomocí hematoxylinu a eosinu (barvení H a E) a zkoumány světelnou mikroskopií.

-65CZ 296806 B6

Tkáně získané ze dvou zvířat představujících časový bod 24 h, která dostala směs obsahující buď 10 pg, nebo 30 pg toxinu A a IgY proti rekombinačnímu toxinu A, byly nerozeznatelné od normální kontroly jak z hlediska hrubé patologie, tak na mikroskopické úrovni. Toto zjištění poskytuje další důkaz schopnosti IgY proti rekombinačnímu toxinu A účinně neutralizovat enterotoxinovou aktivitu toxinu A C. difficile in vivo, a tak bránit akutním nebo trvalým patologickým změnám, vyvolaným toxinem A.

Naproti tomu tkáně ze dvou zvířat, představujících časový bod 24 h, která dostala směs toxin A + preimunní IgY, vykazovaly významné patologické změny. V obou těchto skupinách byla pozorována menší organizace než u normální kontrolní tkáně. Cytoplazma epiteliálních buněk měla vakuolovitý vzhled a mezi epitelem a spodními vrstvami buněk byly přítomny mezery. Lamina propria z velké části chyběla. Střevní klky a krypty byly výrazně zmenšeny a zdály se přerostlé planární vrstvou epiteliálních buněk a fíbroblastů. Proto i když se jevilo, že se tato zvířata zotavila z akutních příznaků intoxikace toxinem A, došlo k trvalým patologickým změnám cekální sliznice.

Tkáně získané ze dvou zvířat, reprezentujících akutní fázi, která dostala směs toxinu A apreimunního IgY, vykazovaly nej významnější patologické změny. Na úrovni hrubé patologie bylo pozorováno, že obě zvířata mají vážně zvětšené slepé střevo, vyplněné vodnatým diaroickým materiálem. Na mikroskopické úrovni byla u zvířete, kterému byla podána směs obsahující 10 pg toxinu A a preimunní IgY, zjištěna vrstva sliznice, která měla potrhaný poškozený vzhled a dezorganizovanou zhutněnou kvalitu. Krypty ve velkém rozsahu chyběly a objevily se četné trhliny vepitelu. Došlo rovněž ke vnikání erythrocytů do prostorů mezi epiteliální vrstvou a spodní tkání. Zvíře, kterému byla podána směs obsahující 30 pg toxinu A a preimunní IgY, vykázalo nejvážnější patologické změny. Cekální tkáň tohoto zvířete měla vzhled velmi podobný jako u zvířat, která uhynula v důsledku C. difficile. Byla zaznamenána rozsáhlá destrukce sliznice a epiteliální vrstva byla odpadlá. Značně převládaly hemorrhagické oblasti, obsahující velký počet erythrocytů. U tohoto vzorku zcela chyběl vzhled normální architektury tkáně. Z hlediska výskytu patologických případů tento křeččí in vivo model intoxikace toxinem A velmi úzce koreluje s patologickými důsledky onemocnění C. difficile u křečků. Výsledky uvedené v tomto příkladu demonstrují, že zatímco IgY proti rekombinačnímu toxinu A (interval 6) je schopen pouze částečné neutralizace cytotoxické aktivity toxinu A C. difficile, neutralizuje táž protilátka účinně 100 % enterotoxinové aktivity toxinu in vivo. I když není úmyslem přihlašovatele omezovat vynález na tento mechanizmus, může to být důsledkem skutečnosti, že cytotoxicita a enterotoxicita toxinu A C. difficile představují dvě samostatné a oddělené biologické funkce.

Příklad 15

Neutralizace toxinu A C. difficile protilátkami proti rekombinačním polypeptidům toxinu A

V příkladu 14 byla demonstrována schopnost ptačích protilátek, zaměřených proti rekombinačnímu fragmentu 1870-2680 toxinu A C. difficile (exprimovanému v pMAl 870-2680, viz příklad 13) neutralizovat enterotoxickou aktivitu toxinu A. Dále byla zkoumána schopnost ptačích protilátek (IgY), zaměřených proti jiným rekombinačním epitopům toxinu A, neutralizovat nativní toxin A in vivo. Tento příklad zahrnoval (a) přípravu IgY proti rekombinačním polypeptidům toxinu A, (b) ochranu křečků in vivo proti toxinu A ošetřením IgY proti rekombinačnímu toxinu A a (c) kvantifikaci specifické koncentrace protilátek v preparátech CTA a IgY intervalu 6.

Nukleotidová sekvence kódující oblasti úplného proteinu toxinu A je uvedena pod SEQ ID NO:5.

Aminokyselinová sekvence úplného proteinu toxinu A je uvedena pod SEQ ID NO:6. Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky 1870 až 2680 toxinu A, je uvedena pod SEQIDNO:7.

Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky 1870 až 1960 toxinu A, je uvedena pod SEQ

-66CZ 296806 B6

IDNO:8. Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky 1873 až 2684 toxinu A, je uvedena pod

SEQ ID NO:29.

a) Příprava IgY proti rekombinačním polypeptidům toxinu A

Od leghornských slepic, které byly imunizovány rekombinačními polypeptidovými fragmenty toxinu C. difficile, zahrnujícími úplný protein toxinu A, byla získána vejce. Jako imunogeny byly použity tyto polypeptidové fragmenty: 1) pMA 1870-2680 (interval 6) 2) pPA 1100-1450 (interval 4) a 3) směsi fragmentů tvořených pMA 30-300 (interval 1), pMA 300-660 (interval 2), pMA 660-1100 (interval 3) a pMA 1450-1870 (interval 5). Tato směs imunogenů se označuje jako interval 1235. Umístění jednotlivých intervalů v molekule toxinu A je znázorněno na obr. 15A. Na obr. 15A jsou použity tyto zkratky: pP označuje vektor pET23 (New England Biolabs), pM označuje vektor pMAL^T -c (New England Biolabs), A označuje toxin A, čísla se vztahují na interval aminokyselin, exprimovaný v klonu. (Například označení pMA3O-3OO ukazuje, že rekombinační klon kóduje aminokyseliny 30 až 300 toxinu A a použitý vektor byl pMAL™-c.)

Rekombinační proteiny byly vytvořeny způsobem popsaným v příkladu 11. IgY byly extrahovány a solubilizovány pro orální aplikaci v 0,lM karbonátovém pufru o pH 9,5 postupem popsaným v příkladu 14(a). Reaktivita IgY proti jednotlivým rekombinačním intervalům byla hodnocena a pomocí ELISA způsobem popsaným v příkladu 13(c).

b) Ochrana křečků in vivo proti toxinu A ošetřením protilátkami proti rekombinačnímu toxinu A

Schopnost protilátek, vytvořených proti rekombinačním polypeptidům toxinu A, poskytovat in vivo ochranu proti enterotoxické aktivitě toxinu A, byla prověřována v modelovém systému křečka. Tento test byl prováděn způsobem popsaným v příkladu 14(b). Stručně řečeno bylo pro každou samici zlatého syrského křečka (Charles River) o hmotnosti 40 až 50 g smí seno 1 ml PEG preparátu IgY 4X (tj. resuspendovaného v 1/4 původního objemu žloutku) proti intervalu 6, intervalu 4 nebo intervalu 1235 s 30 pg (LD_1Oo orální dávky) toxinu A C. difficile (Těch Lab). Jako negativní kontrola sloužil preimunní IgY smísený s toxinem A. Jako pozitivní kontrola sloužily protilátky získané proti toxoidu A C. difficile (příklad 8), smísené s toxinem A (CTA). Směs byla inkubována 1 h při 37 °C a pak orálně aplikována lehce etherizovaným křečkům pomocí 18g krmící jehly. Pak byl u zvířat po dobu přibližně 24 h pozorován nástup průjmu a úhyn. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 18.

Tabulka 18. Výsledky studie po 24 h

experimentální skupina	zdravé1	průjem2	úhyn3
preimunní	0	0	7
CTA	5	0	0
interval 6	6	1	0
interval 4	0	1	6
interval 1235	0	0	7

zvířata nevykazovala známky onemocnění u zvířat se vyvinul průjem, avšak nedošlo k úhynu u zvířat se vyvinul průjem a uhynula

-67CZ 296806 B6

Předběžné ošetření pomocí IgY proti intervalu 6 bránilo průjmu u šesti ze sedmi a úplně zabránilo úhynu u všech sedmi křečků. Naopak provedlo-li se s preimunním IgY, IgY proti intervalu 4 a intervalu 1235, nemělo u křečků žádný vliv na nástup průjmu a úhyn.

c) Kvantifikace koncentrace specifické protilátky v PEG preparátech CTA a IgY intervalu 6

Za účelem stanovení čistoty PEG preparátů IgY byl alikvot PEG preparátu IgY pMA 1870-2680 (interval 6) chromatografován pomocí HPLC a kalibrované kolony KW-803 (Shodex). Vzniklý profil absorbance při 280 nm je znázorněn na obr. 16. Jediný velký vrchol odpovídá odhadované molekulové hmotnosti IgY. Integrace plochy pod tímto vrcholem ukázala, že v tomto vrcholu je přítomno více než 95 % proteinu, eluovaného z kolony. Tento výsledek demonstruje, že většina materiálu, absorbujícího při 280 nm, v PEG preparátu odpovídá IgY. Je tedy možno absorbanci při 280 nm použít ke stanovení celkové koncentrace protilátky vPEG preparátech.

Pro stanovení koncentrace protilátek specifických pro interval 6 (vyjádřeno jako procentický podíl z celkové protilátky) v PEG preparátech CTA a pMAl 870-2680 (interval 6) bylo afinitně čištěno definované množství těchto protilátkových preparátů na afinitní koloně pPA18702680(H) (schematicky znázorněno na obr. 15B) a byly kvantifikovány specifické protilátky. Na obr. 15B jsou použity tyto zkratky: pP označuje vektor pET23 (New England Biolabs), pM označuje vektor pMAL™-c (New England Biolabs), pG označuje vektor pGEX (Pharmacia), pB označuje vektor PinPoiont™ Xa (Promega), A označuje toxin A, čísla se vztahují na interval aminokyselin, exprimovaný v klonu. Plné elipsy představují MBP, šrafované elipsy přestavují glutathion S-transferázu, šrafované kroužky představují biotinovou značku a HHH představuje polyhistidinovou značku.

Afinitní kolona, obsahující repetici rekombinačního proteinu toxinu A, byla získána takto: Na 4 ml pryskyřice Actigel (Sterogene), promyté PBS, bylo v 15 ml zkumavce (Falcon), obsahující 1/10 konečného objemu kondenzačního roztoku Aid (1M kyanborohydrid sodný) navázáno 5 až 10 mg proteinu inkluzních tělísek pPAl870-2680 [připraveného postupem podle příkladu 17 a dialyzovaného do PBS). Alikvoty supematantu z kondenzačních reakcí před a po kondenzaci, byly hodnoceny barvením gelů 7,5 % SDS-PAGE pomocí Coomassieovy modři. Na základě intenzit proteinových pásů bylo na pryskyřici navázáno více než 6 mg rekombinačního proteinu. Pryskyřice byla nanesena na 1 Oml kolonu (BioRad), intenzivně promyta PBS, preeluována 4M guanidin-HCl (v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,005 % thimerosalu) a reekvilibrována PBS. Kolona byla skladována při 4 °C.

Na výše uvedené afinitní koloně byly následujícím způsobem čištěny alikvoty preparátů (PEGprep) pMAl 870-2680 (interval 6) nebo polyklonální protilátky IgY CTA. Kolona byla připojena na UV monitor (ISCO) a propláchnuta PBS. Pro čištění IgY pMAl870-2680 byl použit 2X PEG prep (sterilně filtrovaný na filtru 0,45 μ; přibližně 500 mg celkového IgY). Kolona byla propláchnuta PBS do znovunastolení základní hodnoty (průtok kolony byl uschován), promyta BBS Tween pro vymytí nespecificky vázaných protilátek a reekvilibrována pomocí PBS. Navázaná protilátka byla z kolony vymyta pomocí 4 M guanidin-HCl (v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,005 % thimerosalu). Celý eluční pík byl shromážděn v 15 ml zkumavce (Falcon). Kolona byla reekvilibrována a eluát byl rechromatografován výše popsaným způsobem. Preparát protilátky byl kvantifikován pomocí absorbance UV (k vynulování spektrofotometru byl použit eluční pufr). Celková čištěná protilátka činila přibližně 9 mg, resp. 1 mg z prvního a druhého průchodu chromatografií. Nízký výtěžek z druhého průchodu ukázal, že prvním průchodem chromatografií byly odstraněny nejvíce specifické protilátky. Odhadovaný procentický podíl protilátek specifických pro interval 6 v PEG prep pMAl 870-2680 je přibližně 2 %.

Procentický podíl protilátek specifických pro interval 6 v PEG prep CTA byl stanoven (pomocí stejné kolony a metody) jako přibližně 0,5 % celkového IgY.

-68CZ 296806 B6

4X Peg prep obsahuje přibližně 20 mg/ml IgY. V odstavci (b) tedy přibližně 400 pg specifické protilátky v PEG prep intervalu 6 in vivo neutralizovalo 30 pg toxinu A.

Příklad 16

Ošetření onemocnění C. difficile u křečků in vivo protilátkami proti rekombinačnímu intervalu 6

Byla zkoumána schopnost protilátek, zaměřených proti rekombinačnímu intervalu 6 toxinu A, chránit křečky in vivo proti onemocnění C. difficile. Tento příklad zahrnoval: (a) profylaktické ošetření onemocnění C. difficile a (b) terapeutické ošetření onemocnění C. difficile.

a) Profylaktické ošetření onemocnění C. difficile

Tento experiment byl prováděn způsobem podle příkladu 9(b). Tři skupiny po 7 samicích syrského křečka o hmotnosti 100 g (Charles River) byly profylakticky ošetřeny buď preimunní IgY, IgY proti nativním toxinům A a B [CTAB; viz příklad 8(a) a (b)], nebo IgY proti intervalu 6. IgY byly připraveny jako 4X PEG preparáty způsobem popsaným v příkladu 9(a).

Zvířatům bylo po dobu 12 dní třikrát denně zhruba ve 4h intervalech aplikováno po 1 ml preparátu protilátky zředěného v Ensure®. S použitím odhadů specifické koncentrace protilátek podle příkladu 15(c) obsahovala každá dávka preparátu protilátek intervalu 6 přibližně 400 pg specifické protilátky. V den 2 byl každý křeček predisponován k infekci C. difficile orálním podáním 3,0 mg klindamycin-HCl (Sigma) v 1 ml vody. V den 3 byli křečci orálně imunizováni 1 ml inokula kmene ATCC 43596 C. difficile ve sterilním salinickém roztoku, obsahujícím přibližně 100 organizmů. Pak byla zvířata pozorována z hlediska nástupu průjmu a následného úhynu během doby ošetření. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 19.

Tabulka 19. Letalita po 12 dnech ošetření

skupina	počet živých zvířat	počet mrtvých zvířat
preimunní	0	7
CTAB	6	1
interval 6	7	0

Ošetření křečků orálně podaným IgY proti intervalu 6 úspěšně ochránilo sedm ze sedmi (100 %) zvířat před onemocněním C. difficile. Jeden z křečků v této skupině vykazoval průjem, který pak v průběhu ošetření vymizel. Jak je již uvedeno v příkladu 9, vysokou ochrannou schopnost mají protilátky k nativnímu toxinu A a B. V tomto příkladu přežilo ve skupině ošetřované CTAB šest ze sedmi zvířat. Všichni křečci, ošetřovaní preimunním sérem, byli postiženi průjmem a uhynuli. Zvířata, která přežila ve skupině CTAB a skupině intervalu 6, zůstala po dobu 12 dní po skončení ošetření zdravá. Konkrétně šest ze sedmi křečků, ošetřovaných protilátkami proti intervalu 6, přežilo alespoň 2 týdny po skončení ošetření, z čehož vyplývá, že tyto protilátky poskytují dlouhodobé vyléčení. Tyto výsledky představují první důkaz toho, že protilátky vytvořené proti rekombinační oblasti toxinu A mohou při pasivním podání zvířatům zabránit CDAD. Tyto výsledky rovněž naznačují, že při profylaktickém podání mohou k ochraně zvířat proti onemocnění C. difficile postačovat pouze protilátky vytvořené proti intervalu 6.

Jiní autoři již získali protilátky proti toxinu A aktivní imunizací křečků proti rekombinačnímu polypeptidu umístěnému v oblasti intervalu 6 [Lyerly, D. M. a d. (1990), Curr. Microbiol. 21:29].

-69CZ 296806 B6

Na obr. 17 je schematicky znázorněno umístění Lyerlyho rekombinačního proteinu v intervalu 6 (při klonování do vektoru pUC) v porovnání s kompletním konstruktem intervalu 6 (pMAl870-2680), použitým podle vynálezu k vytvoření neutralizujících protilátek, zaměřených proti toxinů A. Na obr. 17 představuje plná elipsa MBP, který je v pMAl870-2680 fúzován s intervalem 6 toxinů A.

Protilátky podle Lyerlyho a d. (uvnitř intervalu 6) byly schopny chránit křečky před infekcí C. difficile pouze částečně, pokud jde o přežití (přežila čtyři z osmi zvířat), a navíc u žádného zvířete nezabránily průjmu. Mimoto zvířata, ošetřovaná protilátkami zvnitřku intervalu 6 [Lyerly a d. (1990)], po skončení ošetření uhynula.

V kontrastu s tím demonstruje výše popsaný experiment, že pasivní podávání protilátek proti intervalu 6 zabránilo u šesti ze sedmi zvířat průjmu a úplně zabránilo úhynu v důsledku CDAD. Pasivní aplikace protilátek proti intervalu 6 navíc poskytuje, jak výše uvedeno, dlouhodobé vyléčení (tj. ošetření je možno bez nebezpečí stáhnout).

b) Terapeutické ošetření onemocnění C. difficile·. Ošetření nepopiratelné infekce C. difficile in vivo u křečků protilátkami rekombinačního intervalu 6

Byla zkoumána schopnost protilátek proti rekombinačnímu intervalu 6 toxinů A působit při terapeutickém ošetření onemocnění C. difficile. Tento experiment byl prováděn v podstatě stejně jako v příkladu 10(b). Tři skupiny po sedmi až osmi samicích zlatého syrského křečka (o hmotnosti 100 g; Charles River), byly ošetřeny buď preimunním IgY, IgYproti nativnímu toxinů A a toxinů B (CTAB) a IgY proti intervalu 6. Protilátky byly připraveny postupem popsaným výše pro preparáty 4X PEG.

Křečci byli nejprve predisponováni pro infekci C. difficile dávkou 3 mg klindamycin-HCl (Sigma), podanou orálně v 1 ml vody. Přibližně po 24 h byla zvířata orálně exponována 1 ml kmene C. difficile ATCC 43596 ve sterilním salinickém roztoku, obsahujícím přibližně 200 organizmů. Jeden den po infekci byla k ověření nepopiratelnosti infekce zjišťována přítomnost toxinů A a B ve stolici křečků pomocí komerční imunoanalytické soupravy (Cytoclone A+B EPA, Cambridge Biotech). Testování byli čtyři náhodně vybraní členové každé skupiny. Jako negativní kontrola byla testována stolice neinfikovaného křečka. Všechna infikovaná zvířata měla pozitivní výsledek testu podle pokynů výrobce na přítomnost toxinů. Poté bylo přibližně 24 h po infekci zahájeno léčení.

Zvířatům byl podáván denně ve zhruba 4h intervalech 1 ml preparátu protilátky, zředěné v Ensure® (Ross Lab). Množství specifických protilátek, podané v jedné dávce (stanoveno afínitním čištěním), bylo odhadnuto jako asi 400 pg IgY proti intervalu 6 (pro zvířata ve skupině intervalu 6) a pro preparát CTAB 100 pg anti-toxinu A (specifického pro interval 6) a 70 pg anti-toxinu B (specifického pro interval 3; viz příklad 19). Zvířata byla podrobena léčení po dobu 9 dní a pak další 4 dny pozorována na výskyt průjmu a úhynu. Výsledky a počet zvířat, která přežila a která uhynula 4 dny po infekci, jsou uvedeny v tabulce 20.

Tabulka 20. Terapeutické ošetření in vivo protilátkami proti intervalu 6

skupina	počet živých zvířat	počet mrtvých zvířat
preimunní	4	3
CTAB	8	0
interval 6	8	0

-70CZ 296806 B6

Protilátky zaměřené současně proti intervalu 6 a CTAB úspěšně zabránily úhynu v důsledku

C. difficile, jestliže byly terapeuticky podány 24 h po infekci. Tento výsledek je významný, protože mnozí výzkumníci zahajují terapeutické ošetření křečků dosavadními léčivy (například vankomycinem, fenelfamyciny, tiacumiciny atd.) 8 h po infekci [Swanson a d., (1991), Antimicrobial Agents and Chemotherapy 35:1108 a (1989) J. Antibiotics 42:49].

Z křečků ošetřených preimunním IgY uhynulo 42 % v důsledku CD AD. Zatímco protilátky proti intervalu 6 zabránily u ošetřených křečků úhynu, neodstranily všechny příznaky CDAD, protože 3 zvířata vykazovala mírný průjem. 14 dní po infekci mělo průjem navíc jedno zvíře ošetřené CTAB a jedno zvíře ošetřené preimunním preparátem. Tyto výsledky ukazují, že protilátky proti intervalu 6 poskytují účinný prostředek terapie CDAD.

Příklad 17

Indukce protilátek neutralizujících toxin A vyžaduje rozpustný protein intervalu 6

Jak je uvedeno v příkladech 1 l(d) a 15, exprese rekombinačních proteinů vE. coli může vést k produkci buď rozpustného, nebo nerozpustného proteinu. Je-li produkován nerozpustný protein, je rekombinační protein před imunizací zvířat solubilizován. Za účelem stanovení, zdaje možno použít k vytvoření neutralizujících protilátek k toxinu A rozpustného nebo nerozpustného rekombinačního proteinu, byl proveden následující experiment. Tento příklad zahrnoval a) expresi repetic toxinu A a subfragmentů těchto repetic v E. coli pomocí různých expresních vektorů, b) identifikaci rekombinačních repetic toxinu A a podoblastí, na něž se vážou neutralizující protilátky a c) stanovení neutralizační schopnosti protilátek získaných proti rozpustnému a nerozpustnému repetičnímu imunogenu toxinu A.

a) Exprese repetic toxinu A a subfragmentů těchto repetic v E. coli pomocí různých expresních vektorů

Imunogenem intervalu 6, použitým v příkladech 15 a 16, byl protein pMA1870-2680, v němž jsou repetice toxinu A exprimovány jako rozpustný fúzní protein s MBP (popsán v příkladu 11). Je zajímavé, že exprese této oblasti (od místa Spěl na konec repetic, viz obr. 15B) ve třech jiných expresních konstruktech, jak nativním proteinu (pPAl870-2680), proteinu značeném poly-His [pPA1870-2680(H)], nebo proteinu značeném biotinem (pBA 1870-2680) vedla po indukci bakteriálního hostitele ke zcela nerozpustnému proteinu (viz obr. 15B). Pro expresi pBAl 870-2680 byl použit hostitelský kmen BL21 (Novagen) a pro expresi pPAl870-2680 a pPA1870-2680(H) hostitelský kmen BL21(DE3) (Novagen). Tyto nerozpustné proteiny se ve velkém množství akumulovaly v inkluzních tělískách. Exprese rekombinačních plazmidů v hostitelských kmenech E. coli, kultivovaných v médiu 2X YR, byla prováděna popsaným způsobem [viz výše Williams a d. (1994)].

Jak je shrnuto na obr. 15B, vedla exprese fragmentů repetic toxinu A (buď jako N-terminálních fragmentů Spel-EcoRI nebo C-terminálních fragmentů EcoRI) s použitím expresních systémů pGEX (pGA 1870-2190), PinPoint™-Xa (pBA1870-2190 a pBA2250-2680) a pET (pPA1870-2190) rovněž k vysokému výtěžku nerozpustného proteinu. Expresní systémy pGEX a pET jsou popsány v příkladu 11. Expresní systém PinPoint™-Xa řídí expresi fúzních proteinů v E. coli. Fúzní proteiny z vektorů PinPoint™-Xa obsahují na aminoterminálním konci biotinovou značku a mohou být afínitně čištěny avidinovou pryskyřicí SoftLink™ Soft Release (Promega) za podmínek mírné denaturace (5 mM biotinu).

Rozpustnost exprimovaných proteinů z expresních konstruktů pPG1870-2190 a pPA1870-2190 byla stanovena po indukci exprese rekombinačního proteinu za podmínek, o nichž se uvádí, že podporují rozpustnost proteinu [Tyto podmínky zahrnují růst hostitele při snížené teplotě (30 °C) a použití vysoké (1 mM IPTG) nebo nízké (0,1 mM IPTG) koncentrace induktoru [Williams a d.

-71 CZ 296806 B6 (1994)]. Veškerý exprimovaný rekombinační protein toxinu A byl za těchto podmínek nerozpustný. Exprese těchto fragmentů repetic toxinu A v expresních vektorech pET a pGEX vede k produkci nerozpustného rekombinačního proteinu, i když se hostitelské buňky kultivují za snížené teploty a s použitím nižších koncentrací induktoru. Přestože se expresí těchto fragmentů ve vektorech pMal získal afinitně čistitelný rozpustný fúzní protein, byl tento protein buď převážně nerozpustný (pMAl 870-2190), nebo nestabilní (pMA2250-2650). Pokusy o solubilizaci exprimovaného proteinu z expresního konstruktu pMA 1870-2190 s použitím snížené teploty nebo nižší koncentrace induktoru (jak výše uvedeno) nevedly ke zlepšení rozpustnosti fúzního proteinu.

Souhrnně tyto výsledky demonstrují, že exprese repetiční oblasti toxinu A v£. coli vede k produkci nerozpustného rekombinačního proteinu, ať je exprimován jako velký (aa 1870-2680) nebo malý (aa 1870-2190 nebo aa 2250-2680) fragment v různých expresních vektorech (nativní nebo pET značení poly-His, pGEX nebo PinPoint™-Xa) za podmínek růstu, o nichž je známo, že podporují rozpustnost proteinu. Výjimku z tohoto pravidla tvořily fúze s MBP, které podporovaly rozpustnost proteinu buď částečně (pMA1870-2190) nebo úplně (pMAl870-2680).

b) Identifikace rekombinačních repetic toxinu A a podoblastí, na něž se vážou neutralizující protilátky

Repetiční oblasti toxinu A, na něž se vážou neutralizující protilátky, byly identifikovány pomocí rekombinačních proteinů repetičních oblastí toxinu A, exprimovaných jako rozpustné nebo nerozpustné proteiny, za účelem odstranění ochranných protilátek z polyklonálního souboru protilátek proti nativnímu toxinu C. difficile. Pro hodnocení schopnosti proteinů vázat neutralizující protilátky byl vyvinut test in vivo.

Postup testu je následující. Rekombinační proteiny se nejprve předběžně smísí s protilátkami proti nativnímu toxinu A (protilátky CTA; vytvořené v příkladu 8) a nechají reagovat. Pak se přidá toxin A C. difficile v koncentraci pro křečky letální a směs se podává křečkům IP injekčně. Jestliže rekombinační protein obsahuje neutralizující epitopy, ztratí protilátky CTA schopnost vázat toxin A, což vede k průjmu a/nebo úhynu křečků.

Test byl prováděn takto: Letální dávka toxinu A, podávaná orálně devíti zlatým syrským křečkům (Sasco) o hmotnosti 40 až 50 g byla stanovena jako 10 až 30 μg. Preparát protilátek CTA, čištěný PEG, byl naředěn v 0,lM karbonátovém pufru, pH 9,5, na koncentraci 0,5X (tj. protilátky byly zředěny na dvojnásobek původního objemu žloutku). Ředění se provádělo v karbonátovém pufru pro ochranu před degradací kyselinami v žaludku. Koncentrace 0,5X byla použita proto, že byla identifikována jako nejnižší účinná koncentrace proti toxinu A. Koncentrace protilátek specifických pro interval 6 v 0,5X preparátu CTA byla odhadnuta na 10 až 15 μg/ml (odhadováno metodou popsanou v příkladu 15).

Schopnost vázat se na neutralizující protilátky proti toxinu A C. difficile (CTA) byla porovnávána u preparátu inkluzních tělísek [nerozpustný protein intervalu 6: pPA1870-2680(H)] a rozpustného proteinu intervalu 6 [pMAl 870-2680; viz obr. 15]. Konkrétně bylo 1 až 2 mg rekombinačního proteinu rozmícháno s 5 ml preparátu protilátky 0,5X CTA (podle odhadu obsahujícího 60 až 70 μg protilátky specifické pro interval 6). Po 1 h inkubace při 37 °C byl přidán CTA (Těch Lab) v konečné koncentraci 30 μg/ml a znovu inkubován 1 h při 37 °C. 1 ml této směsi, obsahující 30 pg toxinu A (a 10 až 15 pg protilátky specifické pro interval 6), bylo orálně podáno zlatým syrským křečkům (Sasco) o hmotnosti 40 až 50 g. Rekombinační proteiny, které vedou ke ztrátě neutralizační schopnosti protilátky CTA, by naznačovaly, že tyto proteiny obsahují neutralizující epitopy. Jako negativní, resp. pozitivní kontrola sloužila preimunní protilátka, resp. CTA (obě 0,5X) bez přídavku rekombinačního proteinu.

Byly testovány dva další preparáty inkluzních tělísek, oba exprimované jako nerozpustné produkty ve vektoru pET: jeden obsahoval odlišný inzert (fragment toxinu B), jiný než interval 6,

-72CZ 296806 B6 nazvaný pPB 1850-2070 (viz obr. 18), který sloužil jako kontrola pro nerozpustný interval 6, a druhý představoval zkrácenou verzi oblasti intervalu 6, nazvanou pPA1870-2190 (viz obr.

15B). Výsledky tohoto experimentu jsou uvedeny v tabulce 21.

Tabulka 21. Výsledky studie vazby neutralizujících protilátek rozpustným proteinem intervalu 6 po 24 h

experimentální skupina1	zdravé2	průjem3	úhyn4
preimunní Ab	0	3	2
CTAAb	4	1	0
CTA Ab + int 6 (rozpustná)	1	2	2
CTA Ab + int 6 (nerozpustná)	5	0	0
CTA Ab + pPB1850-2070	5	0	0
CTA Ab + pPAl870-2190	5	0	0

¹ každé skupině byl přidán toxin A C. difficile (CTA) ² zvířata nevykazovala známky onemocnění ³ u zvířat se vyvinul průjem, avšak nedošlo k úhynu ⁴ u zvířat se vyvinul průjem a uhynula

Preimunní protilátka byla neúčinná proti toxinů A, zatímco protilátky anti-CTA v 0,5x zředěné koncentraci téměř úplně chránily křečky proti enterotoxickým účinkům CTA. Přídavek rekombinačních proteinů pPB1850-2070 nebo pPA01870-2190 kprotilátce anti-CTA neměl na její ochrannou schopnost žádný vliv, což ukazuje, že se tyto rekombinační proteiny nevážou na neutralizující protilátky. Na druhé straně byl rekombinační protein intervalu 6 schopen se vázat na neutralizující protilátky anti-CTA a neutralizoval ochranný účinek protilátek anti-CTA in vivo. Čtyři z pěti zvířat ve skupině ošetřené protilátkami anti-CTA, smíšenými s rozpustným proteinem intervalu 6, vykazovalo toxicitu spojenou s toxinem (průjem a úhyn). Výsledky navíc ukázaly, že protein intervalu 6 musí být exprimován jako rozpustný protein, aby byl schopen se vázat na neutralizující protilátky anti-CTA, protože přídavek nerozpustného proteinu intervalu 6 neměl ne neutralizační schopnost preparátu protilátek anti-CTA žádný vliv.

c) Stanovení neutralizační schopnosti protilátek vytvořených proti repetičními imunogenu rozpustného a nerozpustného toxinů A

Za účelem stanovení, zda jsou vyvolávány protilátky proti solubilizovaným inkluzním tělískům, byl nerozpustný repetiční protein toxinů A solubilizován a byla vyvolána tvorba specifických protilátek v kuřatech. Nerozpustný protein pPAl870-2680 byl solubilizován metodou, popsanou Williamsem, viz výše (1994). Stručně řečeno byly indukované kultury (500 ml) peletizovány odstředěním při 4 °C po dobu 10 min při 3000 g; Pelety buněk byly opatrně resuspendovány v 10 ml sonifikačního pufru inkluzních tělísek (25 mM HEPES, pH 7,7, 100 mM KC1, 12,5 mM MgCl₂, 20 % glycerolu, 0,1 % (v/v) Nonidet P-40, 1 mM DTT). Suspenze byla přenesena do 30 ml neskleněné odstředivkové zkumavky. Bylo přidáno 500 μΐ lysozymu 10 mg/ml a zkumavky byly inkubovány na ledu po dobu 30 min. Suspenze pak byla alespoň na 1 h mrazena při 70 °C. Poté byla suspenze rychle roztavena ve vodní lázni o teplotě místnosti a pak umístěna na led. Pak byla suspenze sonifikována s použitím alespoň 15 s impulzů mikrosondy (Branson Sonicator, model č. 450), přerušovaných chlazením na ledu.

-73CZ 296806 B6

Sonifikovaná suspenze byla přenesena do 35 ml Oakridgeovy zkumavky a odstřeďována 10 min při 4 °C při 6000 g za účelem peletizace inkluzních tělísek. Peleta byla dvakrát promyta napipetováním nebo promícháním v čerstvém ledově chladném pufru RIPA [0,1 % SDS, 1 % Triton X-100, 1 % deoxycholátu sodného v TBS (25 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl)]. Inkluzní tělíska byla vysušena a pomocí malé kovové špachtle přenesena do 15 ml zkumavky (Falcon). Byl přidán 1 ml 10% SDS a peleta byla solubilizována opatrným pipetováním a vypouštěním roztoku pomocí 1 ml mikropipety. Solubilizace byla usnadněna zahříváním vzorku podle potřeby na 95 °C.

Jakmile byla inkluzní tělíska v roztoku, byly vzorky zředěny 9 objemy PBS. Roztoky proteinů byly dialyzovány přes noc při teplotě místnosti proti 100 násobnému objemu PBS s obsahem 0,05 % SDS. Dialýzní pufr pak byl vyměněn za PBS s obsahem 0,01 % SDS a vzorky byly dialyzovány při teplotě místnosti několik hodin až přes noc. Do použití byly vzorky skladovány při 4 °C. Před dalším použitím byly vzorky ohřátý na teplotu místnosti, aby případný vysrážený SDS přešel do roztoku.

Preparát inkluzních tělísek byl použit pro imunizaci slepic. Protein byl dialyzován do PBS a emulgován přibližně stejným objemem CFA při první imunizaci nebo IFA při následné posilovači imunizaci. V den nula bylo pro každý rekombinační preparát dvěma bílým leghomským nosnicím injekčně vpraveno na více místech (IM a SC) 1 ml směsi rekombinační protein-adjuvans s obsahem přibližně 0,5 až 1,5 mg rekombinačního proteinu. V den 14 a 28 byly podány posilovači injekce 1,0 mg. V den 32 byla sebrána vejce a pomocí PEG izolována protilátka, jak je popsáno v příkladu 14(a). Byly přítomny vysoké titry protilátek specifických pro toxin A (stanoveno pomocí ELISA způsobem popsaným v příkladu 13). Titry byly stanoveny pro obě protilátky proti rekombinačním polypeptidům pPA 1870-2680 a pMAl 870-2680 a bylo zjištěno, že jsou srovnatelné při > 1:62 500.

Protilátky proti rozpustnému proteinu intervalu 6 (pMAl 870-2680) a nerozpustnému proteinu intervalu 6 [(inkluzní tělísko), pPAl 870-2680] byly testovány na neutralizační aktivitu proti toxinu A s použitím testu in vivo popsaného v příkladu 15(b). Preimunní protilátky, resp. protilátky proti toxinu A (CTA) sloužily jako negativní, resp. pozitivní kontrola. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 22.

Tabulka 22. Výsledky studie neutralizace toxinu A protilátkami proti rozpustnému proteinu intervalu 6 po 24 h

experimentální skupina	zdravé1	průjem1 2	úhyn3
preimunní	1	0	4
CTA	5	0	0
interval 6 (rozpustná)4	5	0	0
interval 6 (nerozpustná)	0	2	3

¹ zvířata nevykazovala známky onemocnění ² u zvířat se vyvinul průjem, avšak nedošlo k úhynu ³ u zvířat se vyvinul průjem a uhynula ⁴ 400 pg/ml

Protilátky vytvořené proto nativnímu toxinu A chránily, zatímco preimunní protilátky měly malý vliv. Jak bylo zjištěno s použitím testu CHO in vitro [popsaného v příkladu 8(d)], kde protilátky vytvořené proti rozpustnému proteinu intervalu 6 mohly částečně neutralizovat účinky toxinu A,

-74CZ 296806 B6 zde byly schopny neutralizovat toxin A in vivo kompletně. Naproti tomu protilátky vytvořené proti nerozpustnému proteinu intervalu 6 nebyly schopny neutralizovat účinek toxinů A in vivo, jak je patrné výše (tabulka 22) ani in vitro, jak ukazuje test CHO [popsaný v příkladu 8(d)].

Tyto výsledky demonstrují, že rozpustný repetiční imunogen toxinů A je nutný pro vyvolání produkce neutralizujících protilátek u kuřat a že vytvoření tohoto rozpustného imunogenu se dosáhne pouze se specifickým expresním vektorem (pMal), obsahujícím oblast toxinů A zahrnující aa 1870-2680. To znamená, že protein, který je následně solubilizován, nevede k antigenů toxinů A, který by vyvolal vznik neutralizující protilátky.

Příklad 18

Klonování a exprese genu toxinů B C. difficile

Gen toxinů B byl klonován a sekvenován: aminokyselinová sekvence, odhadnutá ze sekvence klonovaného nukleotidu naznačuje pro toxin B molekulovou hmotnost 269,7 kD [Barroso a d., Nucl. Acids Res. 18:4004 (1990)]. Nukleotidová sekvence kódující oblasti celého genu toxinů B je uvedena jako SEQ ID NO:9. Aminokyselinová sekvence celého proteinu toxinů B je uvedena jako SEQ ID NO: 10. Aminokyselinová sekvence tvořená zbytky aminokyselin 1850 až 2360 toxinů B je uvedena jako SEQ ID NO:11. Aminokyselinová sekvence tvořená zbytky aminokyselin 1750 až 2360 toxinů B je uvedena jako SEQ ID NO:12. Aminokyselinová sekvence tvořená zbytky aminokyselin 1754 až 2362 toxinů B je uvedena jako SEQ ID NO:30.

Vzhledem k nákladnosti a obtížnosti izolace nativního proteinu toxinů B by bylo výhodné použít jednoduchých a levných prokaryotických expresních systémů pro produkci vysokých hladin rekombinačního proteinu toxinů B pro účely imunizace. Ideální by bylo, kdyby izolovaný rekombinační protein byl rozpustný, aby se uchovala nativní antigenicita, protože solubilizované proteiny inkluzních tělísek se často neskládají do nativních konformací. Jak je patrné z příkladu 17, byly neutralizující protilátky proti rekombinačnímu toxinů A získány skutečně pouze tehdy, byly-li jako imunogen použity rozpustné rekombinační polypeptidy toxinů A. Aby se usnadnilo čištění, měl by být protein exprimován v kultuře E. coli v hladině vyšší než 1 mg/1.

Pro zjištění, zdaje možno v E. coli produkovat vysoké hladiny rekombinačního proteinu toxinů B, byly fragmenty genu toxinů B klonovány do různých prokaryotických expresních vektorů a byla hodnocena jejich schopnost exprimovat v E. coli rekombinační protein toxinů B. Tento příklad zahrnoval (a) klonování genu toxinů B a (b) expresi genu toxinů B v£. coli.

a) Klonování genu toxinů B

Gen toxinů B byl klonován s použitím PCR amplifikace z genomové DNA C. difficile. Nejprve byl gen klonován ve dvou překrývajících se fragmentech pomocí dvojic primerů P5/P6 a P7/8. Poloha těchto primerů v genu toxinů B je schematicky znázorněna na obr. 18. Sekvence těchto primerů jsou:

P5: 5’ TAGAAAAAATGGCAAATGT 3’ (SEQ ID NO:11)

P6: 5’ TTTCATCTTGTA GAGTCAAAG 3’ (SEQ ID NO: 12)

P7: 5’ GATGCCACAAGATGATTTAGTG 3’ (SEQ ID NO:13) a

P8: 5' CTAATTGAGCTGTATCAGGATC 3’ (SEQ ID NO: 14).

Obr. 18 znázorňuje dále umístění těchto primerů v genu toxinů B: P9, který je tvořen sekvencí

5' CGGAATTCCTAGAAAAAATGGCAA ATG 3' (SEQ ID NO:15), P10, který je tvořen sekvencí 5' GCTCTAGAATGA CCATAAGCTAGCCA 3' (SEQ ID NO:16), Pil, který je tvořen

-75CZ 296806 B6 sekvencí 5'CGGAATTCGAGTTGGTAGAAAGGTGGA 3' (SEQ IDNO:17), P13, který je tvořen sekvencí 5' CGGAATTCGGTTATTATCTTAAGGATG 3' (SEQ ID NO: 18), a P14, který je tvořen sekvencí 5' CGGAATTCTTGATAACTGGAT TTGTGAC 3' (SEQ ID NO: 19). Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky aminokyselin 1852 až 2362 toxinu B, je uvedena jako SEQ ID NO:20. Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky aminokyselin 1755 až 2362 toxinu B, je uvedena jako SEQ ID NO:21. Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky aminokyselin 1754 až 2362 toxinu B, je uvedena jako SEQ ID NO:30.

Kmen VPI Clostridium difficile 10463 byl získán z Američan Type Culture Collection (ATCC 43255) a kultivován za anaerobních podmínek v mozkosrdcovém nálevu (Becton Dickinson). Vysokomolekulámí DNA C. difficile byla izolována v podstatě popsaným způsobem [Wren aTabaqchali (1987), J. Clin. Microbiol., 25:2402], avšak s výjimkou, že 1) k rozrušení bakterií bylo použito 100 pg/ml proteinázy K v 0,5% SDS a 2) k odstranění uhlohydrátů zvyčeřeného lyzátu bylo použito srážení cetyltrimethylamoniumbromidem(CTAB) [jak je popsáno v Ausubel a d., ed. Current Protocols in Molecular Biology, sv. 2 (1989) Current Protocols]. Stručně řečeno byl po rozrušení bakterií proteinázou K a SDS roztok upraven na přibližně 0,7 M NaCl přídavkem 1/7 objemu 5M NaCl. Byla přidána 1/10 objemu roztoku CTAB/NaCl (10 % CTAB v 0,7 M NaCl) a po důkladném promíchání byl roztok inkubován 10 min při 65 °C. Byl přidán stejný objem směsi chloroform/izoamylalkohol (24:1) a fáze byly důkladně promíchány. Organická a vodná fáze byla oddělena odstřeďováním v mikrofuze po dobu 5 min. Vodný supematant byl odebrán a extrahován směsí fenol/chloroform/izoamylalkohol (25:24:1). Odstřeďováním v mikrofuze po dobu 5 min byly odděleny fáze. Supematant byl přenesen do čerstvé zkumavky a pomocí izopropanolu byla vysrážena DNA. Sraženina DNA byla peletizována krátkým odstředěním v mikrofuze. K odstranění zbytkového CTAB byla peleta DNA promyta 70% ethanolem. Pak byla peleta DNA vysušena a opět rozpuštěna v pufru TE (10 mM Tris-HCI pH 8,0, 1 mM EDTA). Integrita a výtěžek genomové DNA byly hodnoceny srovnáním na základě postupného ředění nezkrácené DNA lambda po elektroforéze na agarózovém gelu.

Fragmenty toxinu B byly klonovány pomocí PCR s použitím korekční termostabilní DNA polymerázy [nativní Pfu polymeráza (Stratagene)]. Vysoká věrnost této polymerázy omezuje mutační problémy, související s amplifikací polymerázami náchylnými k chybám (například polymerázou Taq). PCR amplifikace byla provedena s použitím dvojic primerů P5 (SEQ IDNO:12) plus P6 (SEQ ID NO: 12) a P7 (SEQ ID NO: 13) plus P8 (SEQ ID NO: 14) v reakčních směsích po 50 μΐ, obsahujících 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 200 μΜ každého dNTP, 0,2 μΜ každého primerů a 50 ng genomové DNA C. difficile. Reakční směsi byly překryty 100 μΐ minerálního oleje, zahřívány 4 min na 94 °C, bylo přidáno 0,5 μΐ nativní polymerázy Pfu (Stratagene), načež byly podrobeny cyklům 30krát 1 min při 94 °C, 1 min při 50 °C, při 72 °C (2 min pro každý kb amplifikované sekvence) a 10 min při 72 °C. Zdvojené reakční směsi byly spojeny, extrahovány chloroformem a vysráženy ethanolem. Po promytí 70% ethanolem byly pelety resuspendovány v 50 μΐ pufru TE (10 mM Tris-HCI pH 8,0, 1 mM EDTA).

Produkt amplifikace P5/P6 byl dále popsaným způsobem klonován do pUC19. Alikvoty DNA po 10 μΐ byly gelově čištěny pomocí soupravy Prep-a-Gene (BioRad) a ligo vány do vektoru pUC19, restrikčně ošetřeného pomocí Smál. Rekombinační klony byly izolovány a potvrzeny restrikčním štěpením standardními metodami molekulární biologie (Sambrook a d., 1989). Byly identifikovány inzerty dvou nezávislých izolátů, v nichž byl inzert toxinu B orientován tak, že místa vektorů BamHl a Sací byla orientována 5', resp. 3' (pUCB10-1530). Fragment BamHUSacI, obsahující inzert, byl klonován do podobně štěpené DNA vektoru pET23a-ca v malém měřítku kultur identifikovaných klonů (5 ml) byla vyvolána exprese proteinu.

Totální extrakty proteinu byly izolovány, rozlišeny na gelech SDS-PAGE a protein toxinu B byl identifikován Westernovou analýzou pomocí afínitně čištěné kozí protilátky proti toxinu B (Těch Lab). Postupy indukce proteinu, SDS-PAGE a Westernové blotové analýzy byly prováděny, jak popisuje Williams a d. (1994), viz výše. Stručně řečeno byly 5 ml kultury bakterií,

-76CZ 296806 B6 pěstovaných v 2XYT s obsahem 100 pg/ml ampicilinu, obsahující příslušný rekombinační klon, indukovány k expresi rekombinačního proteinu přídavkem IPTG do 1 mM. Byli použiti hostitelé

E. coli BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LyS (Novagen) pro plazmidy pET.

Kultury byly indukovány přídavkem IPTG do konečné koncentrace 1,0 mM, když hustota buněk dosáhla 0,5 OD₆₀o a 2 h po indukci byl indukovaný protein ponechán nahromadit se. Vzorky proteinu byly připraveny peletizací alikvotů bakterií po 1 ml odstředěním (1 min vmikrofuze) a resuspendováním peletizováných bakterií ve 150 μΐ vzorkového pufru 2x SDS-PAGE (0,125 mM Tris-HCl pH 6,8, 2 mM EDTA, 6 % SDS, 20 % glycerolu, 0,025 % bromfenolové modři; před použitím se přidá β-merkaptoethanol do 5 %). Vzorky se zahřejí na 95 °C po dobu 5 min, pak se ochladí a na gely 7,5 % SDS-PAGE se nanesen 5 nebo 10 μΐ. Byly naneseny rovněž vysokomolekulární proteinové markéry (BioRad), aby bylo možno odhadovat molekulovou hmotnost identifikovaných fúzních protein. Po elektroforéze byl protein detekován buď obecně barvením gelů pomocí Coomassieovy modři, nebo specificky přenosem na nitrocelulózu pro westernovou detekci specifického imunoreaktivního proteinu. Molekulová hmotnost indukovaného proteinu reaktivního s toxinem B umožnila stanovit integritu čtecího rámce toxinu B.

Rekombinant pET23b (pPB10-1530) exprimoval konzistentně s odhadovanými hodnotami vysokomolekulámí protein reaktivní s toxinem B. To potvrzuje, že během PCR amplifikace nedošlo kterminačním chybám v rámci. Byl konstruován expresní klon pET23b, obsahující interval 101750aa genu toxinu B, fúzí fragmentu EcóRN-Spel amplifikačního produktu P7/P8 do intervalu P5-£coRV amplifikačního produktu P5/P6 (viz obr. 18) vpPB10-1530. Integrita tohoto klonu byla potvrzena restrikčním mapováním a westernovou detekcí exprimovaného rekombinačního proteinu toxinu B. Hladiny indukovaného proteinu jak zpPB10-1530, tak pPB10-1750 byly příliš nízké, než aby usnadnily čištění použitelných množství rekombinačního proteinu toxinu B. Zbývající interval 1750-2360 aa byl klonován přímo do expresního vektoru pMAL nebo pET z amplifikačního produktu P7/P8 způsobem popsaným dále.

b) Exprese genu toxinu B

i) Přehled metod exprese

Fragmenty genu toxinu B byly exprimovány v E. coli jako buď nativní, nebo fúzní proteiny. Nativní proteiny byly exprimovány v expresních vektorech buď pET23a-c, nebo pETlób (Novagen). Vektory pET23 obsahují ve všech čtecích rámcích extenzivní polylinkerovou sekvenci (vektory a-c), následovanou C-terminálním polyhistidinovým úsekem. Vektor pETlób obsahuje N-terminální polyhistidinovou sekvenci 5' bezprostředně za malým polylínkerem. Polyhistidinová sekvence se váže na Ni-chelátové kolony a umožňuje afinitní čištění značených cílových proteinů [Williams a d. (1994), viz výše]. Tyto afinitní značky jsou malé (10 aa pro pETlób, 6 aa pro pET23) a umožňují expresi a afinitní čištění nativních proteinů s pouze omezeným množstvím cizích sekvencí.

Byl konstruován N-terminálně histidinem značený derivát pETlób, obsahují extenzivní klonovací kazetu, k usnadnění klonování N-terminálně polyhistidinem značených expresních konstruktů toxinu B. Bylo to provedeno náhradou promotorové oblasti vektorů pET23a a b promotorovou oblastí expresního vektoru pETlób. Každý vektor byl restrikčně štěpen pomocí Bglll a Ndeí a reakční směsi byly rozděleny na 1,2% agarózovém gelu. Promotorová oblast pETlób (obsažená v 200 bp fragmentu BgRI-NdeT) a vektory pET23a nebo b bez promotoru byly z gelu vyříznuty, smíseny a čištěny pomocí Prep-A-gene (BioRad). Eluovaná DNA byla ligována a transformanty byly podrobeny screeningu na náhradu promotorů štěpením čištěné plazmidové DNA pomocí Ncol (promotor pETlób toto místo obsahuje, promotor pET23 ne). Tyto klony (označené pETHisa nebo b) obsahují promotor pETlób (tvořený promotorem pT7-lac, místem vazby ribosomů a polyhistidinovou (10 aa) sekvencí), fúzovaný v místě Ndel s extenzivním polylinkerem pET23.

-ΊΊCZ 296806 B6

Všechny fúzní proteiny MBP byly konstruovány a exprimovány ve vektorech pMAL™-c nebo pMAL™-p2 (New England Biolabs), v nichž je příslušný protein exprimován jako C-terminální fúze s MBP. Všechny plazmidy pET byly exprimovány buď v expresním hostiteli BL21(DE3), nebo BL21(DE3)LysS, zatímco plazmidy pMAL byly exprimovány s hostiteli BL21.

Ve větším měřítku (500 ml až 1 1) byly kultury každého rekombinantu kultivovány v médiu 2XYT, indukovány a frakce rozpustného proteinu byly izolovány popsaným způsobem [Williams a d. (1994), viz výše]. Extrakty rozpustného proteinu byly afínitně chromatografovány popsaným způsobem [Williams a d. (1994), viz výše] za účelem izolace rekombinačního fúzního proteinu. Stručně řečeno byly extrakty obsahující značené fúze pET chromatografovány na sloupci niklového chelátu a eluovány pomocí imidazolových solí nebo s použitím nízkého pH (pH 4,0) podle návodu distributora (Novagen nebo Qiagen). Byly připraveny extrakty obsahující rozpustný fúzní protein pMAL a chromatografovány v pufru PBS na sloupci amylózové pryskyřice (New England Biolabs) a eluovány pomocí PBS s obsahem 10 mM maltózy popsaným způsobem [Williams a d. (1994), viz výše], ii) Přehled exprese toxinu B

V obou velkých expresních konstruktech, popsaných v odstavci (a), byla detekována pouze nízká hladina (tj. méně než 1 mg/1 intaktního či nedegradovaného rekombinačního proteinu) rekombinačního proteinu. Poté bylo konstruováno větší množství expresních konstruktů, obsahujících menší fragmenty genu toxinu B, za účelem zjištění, zdaje možno exprimovat malé oblasti genu ve vysoké hladině. Všechny byly konstruovány fúzemi vyhovujících restrikčních fragmentů toxinu B v rámci do expresních vektorů pMAL-c, pET23a-c, pET16b nebo pETHisa-b nebo inženýrskou manipulací restrikčních míst ve specifických polohách s použitím amplifikace PCR [za stejných podmínek jako v odstavci (a)]. Ve všech případech byly klony ověřeny restrikčním mapováním, a je-li to uvedeno, sekvenováním DNA.

Byly analyzovány proteinové preparáty z indukovaných kultur každého z těchto konstruktů pomocí SDS-PAGE za účelem zjištění stability proteinu (barvení Coomassieovou modří) a imunoreaktivity proti specifickému antiséru proti toxinu B (Westernová analýza). U menších konstruktů byly v porovnání s většími rekombinanty pozorovány vyšší hladiny intaktních (tj. nedegradovaných) fúzních proteinů plné délky a byla konstruována řada expresních konstruktů, přemosťujících celý gen toxinu B (obr. 18,19 a 20 a tabulka 23).

Byly identifikovány konstrukty, které exprimovaly významnou hladinu rekombinačního proteinu toxinu B (více než 1 mg/1 intaktního rekombinačního proteinu) v E. coli, a řada těchto klonů, která přemosťuje gen toxinu B, je znázorněna na obr. 19 a shrnuta v tabulce 23. Tyto klony byly použity k izolaci čistého rekombinačního proteinu toxinu B z celého genu toxinu B. Významné výtěžky proteinu byly získány z expresních konstruktů pMAL, přemosťujících celý gen toxinu B, a výtěžky rozpustného fúzního proteinu o plné délce se pohybovaly od odhadovaných 1 mg/1 kultury (pMBl 100-1530) do více než 20 mg/1 kultury (pMB 1750-2360).

Příklady čištění MBP a rekombinantů toxinu B, značených polyhistidinem, jsou znázorněny na obr. 21 a 22. Obr. 21 znázorňuje gel 7,5 % SDS-PAGE, barvený Coomassie Blue, na němž byla prováděna elektroforéza různých vzorků proteinů, extrahovaných z bakterií obsahujících pMB 1850-2360. Vzorky byly nanášeny tímto způsobem: pruh 1: protein extrahovaný z neindukované kultury, pruh 2: protein z indukované kultury, pruh 3: totální protein z indukované kultury po sonifikaci, pruh 4: rozpustný protein a pruh 5: eluovaný afínitně čištěný protein. Obr. 22 znázorňuje čištění rekombinačních proteinů exprimovaných v bakteriích, obsahujících buď pPB1850-2360 (pruh 1 až 3), nebo pPB1750-2360 (pruhy 4 až 6). Vzorky byly nanášeny tímto způsobem: neindukovaný totální protein (pruhy 1 a 4), indukovaný totální protein (pruhy 2 a 5) a eluovaný afínitně čištěný protein (pruhy 3 a 6). Proteinové markéry molekulové hmotnosti v širokém rozmezí (BioRad) jsou znázorněny v pruhu 7.

-78CZ 296806 B6

I když tedy nebylo dosaženo vysoké hladiny exprese s použitím velkých expresních konstruktů z genu toxinu B, bylo dosaženo použitelných hladin rekombinačního proteinu po izolaci indukovaného proteinu z řady menších expresních konstruktů pMAL, přemosťujících celý gen toxinu B.

Tyto výsledky představují první důkaz schůdnosti exprese rekombinačního proteinu toxinu B v E. coli ve vysoké hladině. Exprese malých oblastí předpokládané vazebné domény ligandů (repetiční oblast) toxinu B jako nativního proteinu také vedla k získání nerozpustného proteinu, zatímco velké konstrukty nebo fúze s MBP byly rozpustné (obr. 19), což demonstruje, že pro produkci rozpustného fúzního proteinu z tohoto intervalu jsou nutné specifické metody.

iii) Konstrukce klonů a podrobnosti exprese

Část genu toxinu B, obsahující repetiční oblast toxinu B [aminokyselinové zbytky 1852-2362 toxinu B (SEQ ID NO:20)] byla izolována PCR amplifíkaci tohoto intervalu genu toxinu B z genomové DNA C. difficile. Sekvence a poloha obou PCR primerů [P7 SEQ ID NO: 13) a P8 (SEQ ID NO: 14)], použitých k amplifíkaci této oblasti, v genu toxinu B jsou znázorněny na obr. 18.

DNA z PCR amplifíkace byla čištěna výše popsaným způsobem extrakcí chloroformem a srážením ethanolem. Byla provedena restrikce pomocí 5pel a štěpená DNA byla rozdělena elektroforézou na agarózovém gelu. Restrikčním štěpením pomocí Spěl byl produkt amplifíkace 3,6 kb rozštěpen na dubletový pás 1,8 kb. Tento dubletový pás byl z gelu vyříznut a smísen s vhodně vyříznutým gelově čištěným vektorem pMALc nebo pET 23b. Tyto vektory byly připraveny štěpením pomocí Hindlll, vyplněním volných konců Klenowovým enzymem a štěpením pomocí Xbal (pMALc) nebo Nhel (pET23b). Gelově čištěné fragmenty DNA byly čištěny pomocí soupravy Prep-A-Gene (BioRad) a DNA byla ligována, transformována a předpokládané rekombinační klony byly analyzovány restrikčním mapováním.

Klony pET a pMAl, obsahující repetiční inzert toxinu B (interval aa 1750-2360 toxinu B) byly ověřeny restrikčním mapováním s použitím enzymů, které štěpily specifická místa v oblasti toxinu Β. V obou případech se odhaduje, že fúze místa Spěl toxinu B buď s kompatibilním místem Xbal (pMal), nebo s nekompatibilním místem Nhel (pET) vytváří fúzi in frame. To bylo potvrzeno v případě klonu pMB 1750-2360 sekvenováním DNA na spojení klonu a 5' konce inzertu toxinu B pomocí primeru specifického pro MBP (New England Biolabs). V případě konstruktu pET by fúzí zarovnaného 3' konce toxinu B s vyplněným místem J/znďlII měla v tomto vektoru vzniknout in frame fúze s C-terminální polyhistidinovou sekvencí. Vybraný klon pPB1750-2360 ztratil, jak bylo předpovězeno, místo Hindlll na napojení tohoto klonu; tím byla odstraněna možnost adice dalšího adenosinového zbytku na 3' konec produktu PCR v důsledku terminálně transferázové aktivity polymerázy Pfu, poněvadž fúzí tohoto adenosinového zbytku s vyplněným místem Hindlll by došlo k regeneraci restrikčního místa (což bylo pozorováno u několika klonů).

Byly pěstovány 1 1 kultury každého expresního konstruktu a fúzní protein byl čištěn afínitní chromatografií buď na sloupci amylózové pryskyřice (konstrukty pMAL, pryskyřice dodána z New England Biolabs), nebo sloupci Ni-chelátu (konstrukty pET; pryskyřice dodána z Qiagen nebo Novagen) popsaným způsobem [Williams a d. (1994), viz výše]. Integrita a čistota fúzních proteinů byla zjišťována barvením proteinů na gelech SDS-PAGE pomocí Coomassie a rovněž analýzou westernovým přenosem buď s afinitně čištěným kozím polyklonálním antisérem (Těch Lab), nebo kuřecím polyklonálním preparátem PEG, vytvořeným proti proteinu toxinu B (CTB), popsaným výše v příkladu 8. V obou případech se afinitním čištěním dosáhlo výtěžků nad 20 mg proteinu na litr kultury, z něhož podle odhadu více než 90 % bylo tvořeno rekombinačním proteinem plné délky. Je nutno uvést, že protein s polyhistidinovou afínitní značkou byl uvolněn z pryskyřice Qiagen Ni-NTA při nízké koncentraci imidazolu (60 mM), což vyžadovalo stupeň promývání 40 mM místo 60 mM imidazolem během čištění.

-79CZ 296806 B6

Periplazmaticky vylučovaná verze pMB 1750-2360 byla konstruována tak, že promotor a MBP kódující oblast tohoto konstruktu byly nahrazeny úseky z příbuzného vektoru (pMAL™-p2; New England Biolabs), v němž je na N-konci MBP přítomna signální sekvence, takže je exprimován fúzní protein. Bylo to provedeno substitucí fragmentu promotoru Bglll-EcoPN z pMALp2 do pMB 1750-23 60. Výtěžky vylučovaného, afínitně čištěného proteinu (získávaného z extraktů pomocí osmotických šoků, popisovaných vRiggs, Current Protocols in Molecular Biology, sv. 2, ed. Ausubel a d., (1989), Current Protocols, str. 166.6.1.16.6.14] z tohoto vektoru činily 6,5 mg/1 kultury, z čehož podle odhadu 50 % tvořil fúzní protein plné délky.

Interval byl exprimován rovněž ve dvou nepřekrývajících se fragmentech. pMB 1750-1970. Byl konstruován tak, že do pMB 1750-2360 byl zaveden posun restrikcí pomocí HindOl, vyplněním převislých konců a opětnou ligací plazmidu. Rekombinační klony byl selektovány podle ztráty místa HindíW a dále analýzou restrikční mapy. Exprese rekombinačního proteinu z tohoto vektoru činila více než 20 mg/1 nebo protein o čistotě více než 90 %.

Komplementární oblast byla exprimována vPMB1970-2360. Tento konstrukt byl vytvořen odstraněním intervalu 1750-1970 z pMB1750,2360. To bylo provedeno restrikcí tohoto plazmidu pomocí EcoRI (v polylinkeru pMalc 5' k inzertu) a ΙΠ, vyplněním převislých konců a opětnou ligací plazmidu. Vzniklý plazmid pMB 1970-2360 byl získán jak intracelulárně, tak s použitím vylučovaných verzí vektoru pMB1750-2360.

Ve verzi pMB 1970-2360 nedocházelo k sekreci fúzního proteinu, pravděpodobně v důsledku konformačního omezení, které brání exportu fúzního proteinu. Intracelulárně exprimovaný vektor však produkoval více než 40 mg/1 fúzního proteinu plné délky o čistotě více než 90 %.

Konstrukty pro přesnou expresi repetic toxinu B buď v pMalc (pMB 1850-23 60), nebo pET16 (pPB 1850-2360) byly konstruovány následujícím způsobem. Interval DNA, zahrnující repetice toxinu B, byl amplifíkován pomocí PCR výše popsaným způsobem s použitím primerů P14 (SEQ ID NO: 19) a P8 (SEQ ID NO: 14). Primer P14 dodává místo EcóBI jako bezprostředně lemující start repetic toxinu B.

Amplifikovaný fragment byl klonován do T-vektoru pT7 Blue (Novagen) a rekombinační klony, do nichž byly v jakékoli orientaci vloženy jednotlivé kopie PCR fragmentu, byly selektovány a potvrzeny restrikčním mapováním. Inzert byl vyříznut ze dvou příslušně orientovaných nezávisle izolovaných plazmidů pT71850-2360 s EcoRI (5' konec repetic) a Psň. (v lemujícím polylinkeru vektoru) a klonován do vektoru pMalc, štěpeného EcóBÁlPstl. Vzniklý konstrukt (pMB 1850-2360) byl potvrzen restrikční analýzou a poskytl po afmitní chromatografii 20 mg/1 rozpustného fúzního proteinu [více než z 90 % intaktního, tj. nedegradovaného]. Restrikcí tohoto plazmidu pomocí Hindlll a opětnou ligací vektoru došlo k odstranění intervalu 1970-2360. Vzniklý konstrukt (pMB 1850-1970) exprimoval více než 70 mg/1 90% fúzního proteinu o plné délce.

Konstrukt pPB 1850-2360 byl získán klonováním fragmentu EcoRI (vyplněn Klenowem)-5azwHI z vektoru pT71850-2360 (opačná orientace než byla použita při konstrukci pMB1850-2360) do vektoru pET16b, štěpeného Ndel (vyplněn)/BaznHI. Výtěžky afínitně čištěného rozpustného fúzního proteinu činily 15 mg/1 nebo fúzní protein plné délky o čistotě více než 90 %.

Bylo dále konstruováno několik menších expresních konstruktů z intervalu 1750-2070 ve vektorech pET, značených His, ale exprese těchto plazmidů v hostiteli BL21 (DE3) vedla k produkci vysokých hladin většinou nerozpustného proteinu (viz tabulku 23 a obr. 19). Tyto konstrukty byly získány následujícím způsobem.

pPB1850-1970 byl konstruován klonováním fragmentu Bglíl-HindBd pPB1850-2360 do vektoru pET23b, štěpeného pomocí BglGJHindHi. pPB 1850-2070 byl konstruován klonováním fragmentu 5g/II-PvwII pPB 1850-2360 do vektoru pET23b, štěpeného pomocí BglQJHincE.

-80CZ 296806 B6 pPB1850-1970(c) byl konstruován odstraněním vnitřního fragmentu HindlII vektoru pPB1750-2360, v němž bylo místo vektoru HindlII regenerováno během klonování (pravděpodobně adicí zbytku A na amplifíkovaný produkt PCR terminálně transferázovou aktivitou polymerázy Pfu). Konstrukt pPBl750-1970)n) byl získán vložením inzertu, obsahujícího fragment Ndéí-HindUI pPB1750-2360, do identicky štěpeného vektoru pETHisb. Všechny konstrukty byly potvrzeny restrikčním štěpením.

Ve vektoru pMalc byl konstruován expresní konstrukt, který řídí expresi intervalu 10-470 aa toxinu B, tímto způsobem: fragment Nhél (místo 5' vůči inzertu ve vektoru pET23)-4/7II (vyplněný) genu toxinu B zpPB10-1530 byl klonován do vektoru pMalc Xbal (kompatibilní s Nhel)!HindlII (vyplněný). Integrita konstruktu (pMB 10-470) byla ověřena restrikčním mapováním a sekvencováním DNA spoje 5' klonu s použitím DNA primerů specifického pro MBP (New England Biolabs). Všechen exprimovaný protein však byl degradován na molekulovou hmotnost monomemího MBP.

Druhý konstrukt, přemosťující tento interval (aa 10-470), byl konstruován klonováním produktu amplifikace PCR z reakční směsi obsahující primery P9 (SEQ ID NO: 15) a P10 (SEQ ID NO: 16) (obr. 18) do vektoru pETHisa. Bylo to provedeno klonováním produktu PCT jako tupého fragmentu EcoRI do vektoru DNA, restringovaného pomocí EcoRl-HincII; rekombinační klony byly ověřeny restrikčním mapováním. I když tento konstrukt (pPB10-520) umožňoval expresi a čištění (s použitím N-terminální polyhistidinové afinitní značky) intaktního fúzního proteinu, byly výtěžky odhadnuty na méně než 500 pg/l kultury.

Vyššího výtěžku rekombinačního proteinu z tohoto intervalu (aa 10-520) bylo dosaženo expresí intervalu ve dvou překrývajících se klonech. Interval 10-33 aa byl klonován jak ve vektoru pETHisa, tak pMalc s použitím fragmentu DNA BamHI-AflíII (vyplněný) zPB10-520. Tento fragment byl klonován do vektoru pMalc, restringovaného BamRI-HindlII (vyplněný) nebo pETHisa, restringovaného BamHI-HincII. Rekombinační klony byly ověřeny restrikčním mapováním. Byla získána vysoká hladina jak nerozpustného (pET), tak rozpustného (pMal) fúzního proteinu. Celkové výtěžky fúzního proteinu z konstruktu pMB 10-330 (obr. 18) byly 20 mg/1 kultury, z čehož podle odhadu 10 % tvořili fúzní protein plné délky. I když byly výtěžky tohoto intervalu vyšší a při expresi z konstruktu pET byl produkován více než 90% rekombinační protein plné délky, byla použita fúze pMal, protože exprimovaný protein byl rozpustný, a tudíž měl větší pravděpodobnost nativní konformace.

Klon pMB260-520 byl konstruován klonováním amplifikované DNA, štěpené EcoRI-Xhal, zPCR reakční směsi, obsahující DNA primery Pil (SEQ ID NO:17 a P10 (SEQ ID NO:16) (obr. 18) do podobně restringovaného vektoru pMalc. Výtěžek afinitně čištěného proteinu byl 10 mg/1, z čehož podle odhadu přibližně 50 % bylo tvořeno rekombinačním proteinem plné délky.

Interval aa 510-1110 byl exprimován dále popsaným způsobem. Tento celý interval byl exprimován jako fúze pMal klonováním fragmentu Nhel-HindlII pUCB10-1530 do vektoru pMalc, štěpeného Xbal-HindlII. Integrita konstruktu (pMB510-1110) byla ověřena restrikčním mapováním a sekvenováním DNA spoje 5' klonu pomocí primerů DNA, specifického pro MBP. Výtěžek afinitně čištěného proteinu byl 25 mg/1 kultury, z čehož podle odhadu 5 % bylo tvořeno fúzním proteinem plné délky (1 mg/1).

Ve snaze dosáhnout vyšších výtěžků byla tato oblast exprimována ve dvou fragmentech (aa 510-820 a 820-1110) ve vektoru pMalc. Klon pMB510-820 byl konstruován vložením fragmentu DNA Sací (v polylinkeru pMal 5' vůči inzertu)-fipal zpMB510-1110 do vektoru pMalc, restringovaného Sací/Stul. Vektor pMB820-1110 byl konstruován vložením fragmentu Hpal-HindUI pUCB10-1530 do vektoru pMalc, štěpeného ŘamHI (vyplněný)/HindIIL Integrita

-81 CZ 296806 B6 těchto konstruktů byla ověřena restrikčním mapováním a sekvenováním DNA spoje 5' klonu pomocí primeru DNA specifického pro MBP.

Rekombinační protein, exprimovaný z vektoru pMB510-820, byl vysoce nestabilní. Z konstruktu pMB820-l 105 však byly získány vysoké hladiny (20 mg/1) více než 90% fuzního proteinu plné délky. Kombinace částečně degradovaného proteinu pMB510-1110 (obohaceného na interval 510-820) s proteinem pMB820-1110 poskytuje použitelná množství rekombinačního antigenu z tohoto intervalu.

Interval aa 1100-1750 byl exprimován dále popsaným způsobem. Celý interval byl exprimován ve vektoru pMalc z konstruktu, v němž byl fragment Accl(vyplnéný)-Spel pPB10-1750 vložen do pMalc, restringovaného pomocí StuI(XbaI (Xbal je kompatibilní se Spek, místa Stul a vyplněné Accl mají zarovnané konce). Integrita tohoto konstruktu (pMBl 100-1750) byla ověřena restrikčním mapováním a sekvenováním DNA spoje klonu s použitím primeru DNA specifického pro MBP. I když bylo z buněk obsahujících tento konstrukt izolováno 15 mg/1 afínitně čištěného proteinu, byl protein z více než 99 % degradován na velikost monomeru MBP.

Menší derivát pMB 1100-1750 byl konstruován restrikční pMB 1100-1750 pomocí Affi a Sall (v pMalc polylinker 3' vůči inzertu), vyplněním převislých konců a opětnou ligací plazmidu. Vzniklý klon (ověřený restrikčním štěpením a sekvenováním DNA), který měl vypuštěnýinterval aa 1530-1750, byl označen pMBl 100-1530. pMBl 100-1530 exprimoval rekombinační protein ve výtěžku větším než 40 mg/1, z čehož podle odhadu 5 % tvořil fúzní protein o plné délce.

Pro expresi zbývajícího intervalu byly vytvořeny tři konstrukty. Nejprve byl fragment RspHRvyplněnýýnSpel zpPB10-1750 klonován do vektoru pMalc, štěpeného pomocí £coRI(vyplněný)/A&aI. Integrita tohoto konstruktu (pMB1570-1750) byla ověřena restrikčním mapováním a sekvenováním DNA spoje klonu 5' pomocí primeru DNA, specifického pro MBP. Exprese rekombinačního proteinu z tohoto plazmidu byla velmi nízká, přibližně 3 mg afínitně čištěného proteinu na litr, a protein byl z větší části degradován na velikost monomeru MBP. Tato oblast pak byla exprimována z fragmentu DNA, amplifikovaného pomocí PCR. Na genomovou DNA C. difficile byla výše popsaným způsobem aplikována PCR reakce s použitím primerů P13 [SEQ ID NO: 18; P13 byl konstruován za účelem zavedení místa EcoRI 5' vůči sekvencím amplifikovaného toxinu B] a P8 (SEQ ID NO: 14). Amplifíkovaný fragment byl štěpen pomocí jEcoRI a Spěl a klonován do vektoru pMalc, štěpeného pomocí EcóRX/Xbak Vzniklý klon (pMB 1530-1750) byl ověřen analýzou restrikční mapy a rekombinační protein byl exprimován a čištěn. Výtěžek byl vyšší než 20 mg proteinu na litr kultury a podle odhadu byl z 25 % tvořen fůzním proteinem plné délky; tato hodnota byla významně vyšší než u původního klonu pMB1570-1750. Inzert pMB1530-1750 (ve fragmentu EcoBl-Salk) byl přenesen do vektoru pETHisa (štěpen pomocí EcoRl/Xhol, konce Xhol a Salí jsou kompatibilní). Z rozpustných lyzátů buněk, indukovaných k expresi fúzního proteinu z tohoto konstruktu, nebyl na sloupcích Nichelátu vyčištěn žádný detekovatelný fúzní protein.

-82CZ 296806 B6

Tabulka 23. Přehled expresních konstruktů toxinu B^a

klon	afínitní značka	výtěžek (mg/l)	% plné délky
pPB10-1750	žádná	nízký (odhadnuto z hybridizace	?
		Westernová blotu)
pPB10-1530	žádná	nízký (dtto)	?
pMB10-470	MBP	15 mg/i	0%
pPB10-520	poly-his	0,5 mg/l	20%
pPB10-330	poly-his	> 20 mg/l (nerozpustný)	90%
pMB10-330	MBP	20 mg/l	10%
pMB260-520	MBP	10 mgfí	50%
pMB510-1110	MBP	25 mg/l	5%
pMB510-820	MBP	degradován (hybridizací Westernová blotu)
pMB820-1110	MBP	20 mg/l	90%
pMB1100-1750	MBP	15 mg/l	0%
pMB1100-1530	MBP	40 mg/l	5%
pMB1570-1750	MBP	3 mg/l	<5%
pPB 1530-1750	poly-his	nedetekován čištěný protein	?
pMB1530-1750	MBP	20 mg/l	25%
pMB1750-2360	MBP	> 20 mg/l	>90%
pMBp1750-2360	MBP	6,5 mg/l (sekrece)	50 %
pPB1750-2360	poly-his	> 20 mg/l	> 90 %
pMB 1750-1970	MBP	> 20 mg/l	> 90 %
PMB1970-2360	MBP	40 mg/l	> 90 %
pMBpl 970-2360	MBP	(bez sekrece)	NA
pMB1850-2360	MBP	20 mg/l	> 90 %
pPB1850-2360	poly-his	15 mg/l	> 90 %
pMB1850-1970	MBP	70 mg/l	>90%
pPB1850-1970	poly-his	> 10 mg/l (nerozpustný)	> 90 %
pPB1850-2070	poly-his	> 10 mg/l (nerozpustný)	> 90 %
pPB1750-1970(c)	poly-his	>10 mg/l (nerozpustný)	> 90 %
pPB1750-1970(n)	poly-his	>10 mg/l (nerozpustný)	> 90 %

^a Klony uváděné kurzivou se v současné době používají k čištění rekombinačního 5 proteinuz každého zvoleného intervalu.

-83CZ 296806 B6

Příklad 19

Identifikace, čištění a indukce neutralizujících protilátek proti rekombinačnímu proteinu toxinu B C. difficile

Pro zjištění, zda mohou fragmenty rekombinačního polypeptidu toxinu B vytvářet neutralizující protilátky, se zvířata typicky nejprve imunizují rekombinačními proteiny a vytvoří se protilátky proti rekombinačním proteinům. Tyto protilátky proti rekombinačním proteinům se pak testují in vivo nebo in vitro na neutralizační schopnost. V závislosti na imunogenním charakteru rekombinačního polypeptidu může tvorba vysokého titru protilátek proti tomuto proteinu trval několik měsíců. Pro urychlení tohoto procesu a identifikaci, který rekombinační protein nebo proteiny mohou být nejlepšími kandidáty na tvorbu neutralizujících protilátek, byly provedeny testovací studie. Konkrétně byly rekombinační polypeptidy toxinu B podrobeny pre-screeningu, při němž bylo zjišťováno, zda mají schopnost vázat ochranné protilátky z preparátu protilátek CTB, a tudíž tyto protilátky zbavovat jejich neutralizační schopnosti. Rekombinační polypeptidy, které vázaly CTB, pak byly použity pro vytvoření neutralizujících protilátek. Tento příklad zahrnoval: a) identifikaci rekombinačních podoblastí v toxinu B, na něž se vážou neutralizující protilátky, b) identifikaci protilátek, specifických pro podoblasti toxinu B, které neutralizují toxin B in vivo, a c) tvorbu a hodnocení protilátek, reagujících s rekombinačními polypeptidy toxinu B.

a) Identifikace rekombinačních podoblastí v toxinu B, na něž se vážou neutralizující protilátky

Podoblasti v toxinu B, na něž se vážou neutralizující protilátky, byly identifikovány s použitím rekombinačních proteinů toxinu B k odstranění ochranných protilátek z polyklonální skupiny protilátek proti nativnímu toxinu B C. difficile. Byl proveden pokus in vivo za účelem hodnocení preparátů z hlediska schopnosti vázat neutralizující protilátky. Rekombinační proteiny byly předem smíseny s protilátkami zaměřených proti nativnímu toxinu B (protilátky CTB; viz příklad 8) a ponechány reagovat 1 h při 37 °C. Poté byl přidán toxin B C. difficile (CTB; Těch Lab) v koncentraci letální pro křečky a inkubován další 1 h při 37 °C. Po inkubaci byla tato směs intraperitoneálně (IP) injekčně aplikována křečkům. Jestliže rekombinační polypeptid obsahuje neutralizující epitopy, ztratí protilátky CTB svou schopnost chránit křečky proti úhynu v důsledku CTB. Existuje-li částečná nebo úplná ochrana směsí protilátka CTB - rekombinant, pak rekombinant obsahuje pouze slabé ne neneutralizující epitopy toxinu B. Tento pokus byl prováděn následujícím způsobem:

Protilátky proti CTB byly vytvořeny vleghomských nosnicích, jak je popsáno v příkladu 8. Letální dávka (LD_1Oo) toxinu B C. difficile, je-li podána IP samicím zlatých syrských křečků (Charles River) o hmotnosti 40 g, byla stanovena jako 2,5 až 5 pg. Při výše uvedené IP dávce byly protilátky, vytvořené proti CTB a čištěném srážením PEG, schopny křečky kompletně ochránit. Bylo rovněž stanoveno minimální množství protilátky CTB, potřebné k dosažení dobré ochrany proti 5 pg CTB, aplikované injekčně IP křečkům (lx PEG). Pomocí těchto experimentů byly definovány parametry potřebné k testování, zda daný rekombinační protein může odstraňovat ochranné CTB protilátky.

Klonované oblasti, testované na neutralizační schopnost, pokrývají celý gen toxinu B a byly označeny jako intervaly (INT) 1 až 5 (viz obr. 19). Byla testována přibližně ekvivalentní koncentrace pro každý rekombinační polypeptid. Byly použity tyto rekombinační polypeptidy: 1) směs intervalů 1 a 2 (INT-1,2), 2) směs intervalů 4 a 5 (INT-4,5) a 3) interval 3 (INT-3). Rekombinační proteiny (každý v množství asi 1 mg celkového proteinu) byly nejprve preinkubovány 1 h při 37 °C s konečnou koncentrací protilátky CTB IX [tj. peleta rozpuštěná v původním objemu žloutku, jak je popsáno v přikladu l(c)] v konečném objemu 5 ml. Pak bylo přidáno 25 pg CTB (v koncentraci 5 pg/ml), postačující k usmrcení 5 křečků, a směs pak byla inkubována 1 h při 37 °C. Každé z pěti samic křečků (Charles River) o hmotnosti 40 g v každé pokusné skupině bylo

-84CZ 296806 B6 pak podáno IP 1 ml směsi s použitím tuberkulinové injekční stříkačky s jehlou velikosti 27.

Výsledky tohoto experimentu jsou uvedeny v tabulce 24.

Tabulka 24. Vazba neutralizujících protilátek proteinem intervalu 3

skupina1	počet živých zvířat	počet mrtvých zvířat
protilátky CTB	3	2
protilátky CTB+ INT1,2	3	2
protilátky CTB + INT4.5	3	2
protilátky CTB + INT 3	0	5

Každé skupině byl podán toxin B C. difficile (CTB)

Jak je znázorněno v tabulce 24, přídavek rekombinačních proteinů zINT-1,2 nebo INT-4,5 neměl žádný vliv na ochrannou schopnost preparátu protilátek CTB oproti preparátu CTB samotnému. Naproti tomu rekombinační polypeptid INT-3 byl schopen odstranit veškerou neutralizační schopnost protilátek CTB neutralizovat toxin B, což demonstruje úhyn všech křečků v této skupině.

Výše uvedený experiment byl opakován s použitím dvou menších exprimovaných fragmentů (pMB1750-1970 a MB1970-2360, viz obr. 19), zahrnujících doménu INT-3, za účelem zjištění, zda by tato doména mohla být rozdělena na menší neutralizující epitopy. Navíc byl na neutralizační aktivitu testován polypeptid INT-3 plné délky, exprimovaný jako protein značený niklem (pPB1750-2360), a porovnán s fúzí MBP, exprimovaného v původním INT-3 (pMB 1750-2360). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 25.

Tabulka 25. Odstranění neutralizujících protilátek proteiny obsahujícími repetice

skupina1	počet živých zvířat	počet mrtvých zvířat
protilátky CTB	5	0
protilátky CTB + pPB1750-2360	0	5
protilátky CTB + pMB1750-2360	0	5
protilátky CTB + pMB1970-2360	3	2
protilátky CTB + pMB1750-1970	2	3

¹ Každé skupině byl podán toxin B C. difficile (CTB)

Výsledky, shrnuté v tabulce 25, naznačují, že menší polypeptidické fragmenty v doméně INT-3, pMB1750-1970 a pMB1970-2360, částečně ztrácejí schopnost odstraňovat neutralizující protilátky ze skupiny protilátek CTB. Tyto výsledky demonstrují, že k úplnému odstranění neutralizujících protilátek ze skupiny protilátek CTB je nutný polypeptid INT-3 plné délky. Tento experiment dále ukazuje, že neutralizační epitop INT-3 může být exprimován v alternativních vektorových systémech a výsledky jsou nezávislé na použitém vektoru nebo doprovázejícím fúzním partneru.

-85CZ 296806 B6

Následně byly na schopnost odstraňovat neutralizující protilátky ve skupině protilátek CTB výše popsaným způsobem testovány další proteiny, specifické pro interval 3. Proteiny specifické pro interval 3, použité v těchto studiích, jsou shrnuty na obr. 23. Na obr. 23 jsou použity tyto zkratky: pP označuje vektor pET23, pM označuje vektor pMALc, B označuje toxin B, čísla označují interval aminokyselin, exprimovaný v klonu. Plné černé o války představují MBP a HHH označuje polyhistidinovou značku.

Vázat se a úplně odstraňovat neutralizující protilátky ze skupiny protilátek CTB mohou pouze rekombinační proteiny zahrnující celou repetiční doménu toxinu B (pMB 1750-2360, pPB1750-2360 a pPB 1850-2360). Rekombinační proteiny, obsahující pouze část repetiční domény toxinu B, nebyly schopny úplně odstraňovat neutralizující protilátky ze skupin protilátek CTB (pMB1750-1970 a pMB1970-2360 mohly odstraňovat neutralizující protilátky částečně, zatímco pMB1850-1970 a pPB1850-2070 neodstraňovaly ze skupiny protilátek CTB žádné neutralizující protilátky).

Výše uvedené výsledky demonstrují, že pouze kompletní vazebná doména ligandu (repetiční oblast) genu toxinu B může vázat a úplně odstraňovat neutralizující protilátky ze skupiny protilátek CTB. Tyto výsledky ukazují, že protilátky zaměřené proti celé repetiční oblasti toxinu B jsou nezbytné pro neutralizaci toxinu in vivo (viz obr. 23; pouze rekombinační proteiny, exprimované vektory pMB1750-2360, pPB1750-2360 a pPB1850-2360, jsou schopny kompletně odstraňovat neutralizující protilátky ze skupiny protilátek CTB).

Tyto výsledky reprezentují první náznak, že pro vytvoření protilátek schopných neutralizovat toxin B je nezbytná celá repetiční oblast toxinu B a pro vytváření maximálních titrů neutralizujících protilátek nemusejí postačovat podoblasti.

b) Identifikace protilátek specifických pro podoblast toxinu B, které neutralizují toxin B in vivo

Za účelem zjištění, zda protilátky, zaměřené proti repetiční oblasti toxinu B, postačují pro neutralizaci, byly afinitně čištěny oblastně specifické protilátky v preparátu CTB a testovány na neutralizaci in vivo. Afinitní kolony, obsahující rekombinační proteiny repetic toxinu B, byly získány dále popsaným způsobem. Byla připravena zvláštní afinitní kolona s použitím každého z těchto rekombinačních proteinů repetic toxinu B: pPB1750-2360, pPB1850-2360, pMB1750-1970 a pMB 1970-2360.

Pro každou připravovanou afinitní kolonu bylo přes noc při teplotě místnosti kondenzováno 4 ml pryskyřice Actigel (Sterogene), promyté PBS, s 5 až 10 mg afinitně čištěného rekombinačního proteinu (nejprve intenzivně dialyzovaného do PBS) v 15ml zkumavkách (Falcon), obsahujících 1/10 konečného objemu kondenzačního roztoku Aid (1 M kyanoborohydrid sodný). Alikvoty supernatantů z kondenzačních reakcí před kondenzací a po ní byly hodnoceny barvením gelů 7,5 % SDS-PAGE pomocí Coomassie. Na základě intenzit proteinových pásů byla odhadnuta účinnost kondenzace ve všech případech větší než 30 %. Pryskyřice byly nality do lOml kolon (BioRad), promyty intenzivně PBS, preeluovány 4M guanidin-HCl (v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) a reekvilibrovány v PBS. Kolony byly uchovávány při 4 °C.

Alikvoty preparátu polyklonální protilátky CTB IgY (prep PEG) byly dále popsaným způsobem afinitně čištěny na každé ze čtyř kolon. Kolony byly napojeny na UV monitor (ISCO), promyty PBS a byly naneseny alikvoty 2X prep PEG po 40 ml (filtračně sterilizované pomocí filtru 0,45 pm). Kolony byly promývány PBS do znovuustavení základní hodnoty. Pak byly kolony promyty pomocí BBStween pro vymytí nespecificky se vážících protilátek a reekvilibrovány pomocí PBS. Navázaná protilátka byla z kolony eluovány v 4M guanidin-HCl (v ÍOmM Tris-HCl, pH 8,0). Eluovaná protilátka byla okamžitě intenzivně dialyzována proti alespoň dvěma dávkám PBS a byla získána afinitně čištěná protilátka, která byla uchovávána při 4 °C. Preparáty protilátek byly kvantifikovány absorbancí UV. Eluční objemy byly v rozmezí 4 až

-86CZ 296806 B6 ml. Všechny aflnitně čištěné zásobní roztoky obsahovaly podobné celkové koncentrace protilátky v rozmezí 0,25 až 0,35 % z celkového proteinu, naneseného na kolony.

Schopnost afinitně čištěných preparátů protilátek neutralizovat in vivo toxin B byla stanovena pomocí testu, popsaného v odstavci a). Před testováním byla afinitně čištěná protilátka zředěna 1:1 v PBS. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 26.

Tabulka 26. Neutralizace toxinu B afinitně čištěnými protilátkami

skupina3	počet živých zvířat15	počet mrtvých zvíratb
preimunní1	0	5
CTB1; 400 pg	5	0
CTB (AP na pPB1750-2360)2; 875 pg	5	0
CTB (AP na pMB1750-1970)2; 875 pg	5	0
CTB (AP na pMB1970-2360)2; 500 pg	5	0

K protilátce se přidá toxin B C. difficile (CTB) (Těch Lab; v koncentraci 5 pg/ml, celkově 25 pg) v koncentraci letální pro křečky a inkubuje se 1 h při 37 °C. Po inkubaci se tato směs intraperitoneálně (IP) aplikuje křečkům. Každá skupina dostávala toxin, předem smísený s protilátkou, vytvořenou proti uvedenému proteinu, tj. bud’¹ 4X prep PEG protilátky, nebo² afinitně čištěnou (AP) protilátku (z prep PEG CTB v označených sloupcích). Je uvedeno množství konkrétní protilátky v každém preparátu; množství se pro afinitně čištěné preparáty stanovuje přímo a pro 4X CTB se odhaduje způsobem popsaným v příkladu 15.

Počty v každé skupině představují počty živých nebo mrtvých křečků po 2 h po IP podání směsi toxin/protilátka.

Ve všech případech byla pozorována podobná úroveň neutralizace toxinu, takže letalita byla ve všech skupinách oproti preimunní kontrolní skupině zpožděna. Tento výsledek demonstruje, že pro neutralizaci toxinu B in vivo postačují protilátky reagující s repetiční oblastí genu toxinu B. Křečci ve všech skupinách nakonec uhynou, ale tento úhyn je pomocí protilátek prep PEG CTB maximálně odložen. Neutralizace afinitně čištěnými (AP) protilátkami tedy není tak úplná, jak bylo pozorováno u prep CTB před afínitní chromatografií. Tento výsledek může být důsledkem ztráty aktivity během denaturace guanidinem (během eluce protilátek z afínitní kolony) nebo přítomnosti protilátek specifických pro jiné oblasti genu toxinu B, které mohou přispívat k neutralizaci toxinu (přítomny v prep PEG CTB).

Zjištění, že protilátky, afinitně čištěné proti nepřekrývajícím se proteinům pMB1750-1970 a pMB 1970-2360, neutralizují toxin B, naznačilo možnost, že buď 1) jsou k neutralizaci toxinu B postačující protilátky specifické pro repetiční podoblasti nebo 2) mohou proteiny specifické pro podoblasti, vázat většinu nebo všechny protilátky, specifické pro repetice, přítomné ve skupině polyklonálních CTB. To by bylo pravděpodobně důsledkem konformačních podobností mezi repeticemi, protože homologie primárních aminokyselinových sekvencí mezi různými repeticemi je v rozmezí pouze 25 až 75 % [Eichel-Streiber a d., (1992), Molec. Gen. Genetics 233:260]. Tyto možnosti byly testovány afínitní chromatografií.

Preparát CTB PEG byl postupně 2x čištěn na sloupci pMB1750-1970; po druhé chromatografií byl pozorován pouze malý eluční pík, což ukazuje, že většina reaktivních protilátek byla odstraněna. Tento preparát CTB, zbavený tohoto intervalu, byla pak chromatografována na sloupci pPB 1850-2360; na sloupec se nenavázala žádná protilátka. Pak byla pomocí ELISA postupem

-87CZ 296806 B6 podle příkladu 13(c) stanovena reaktivita preparátů CTB a CTB (čištěný na pMB 1750-1970) vůči proteinům pPB1750-2360, pPB1850-2360, pMB1750-1970 a pMB1970-2360. Stručně řečeno byly 96jamkové mikrotitrační destičky (Falcon, Pro-Bind, Assay Plates) povlečeny rekombinačním proteinem přídavkem 100 μΐ proteinu v koncentraci 1 až 2 pg/ml v PBS s obsahem 0,005 % thimerosalu do každé jamky a inkubaci při 4 °C přes noc. Příští ráno byla nanesená suspenze dekantována a jamky byly třikrát promyty PBS. Za účelem blokování nespecifických vazebných míst pak bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ 1,0% BSA (Sigma) v BPS (blokující roztok) a destičky byly inkubovány 1 h při 37 °C. Blokující roztok byl dekantován a do první jamky ředicí série byly přidány dvojené vzorky 150 μΐ zředěné protilátky. Počáteční ředění testovacího séra bylo 1/200 pro prep. CTB (koncentrace čištěného CTB byla standardizována podle OD₂₈₀) v blokujícím roztoku obsahujícím 0,5 % Tween 20, načež bylo do tohoto roztoku provedeno 5násobné ředění, a sice postupným přenášením alikvotů po 30 μΐ do 120 μΐ pufru, promícháním a opakováním ředění do čerstvé jamky. Po konečném zředění bylo z každé jamky odebráno 30 μΐ, takže všechny jamky obsahovaly konečný objem 120 μΐ. Bylo provedeno celkem 5 takovýchto ředění (celkem 4 jamky). Destičky byly inkubovány 1 h při 37 °C. Po této inkubaci byly sériově ředěné vzorky dekantovány a jamky byly třikrát promyty s použitím PBS s obsahem 0,5 % Tween 20 (PBST) a pak dvakrát po 5 min promyty s použitím BBS-Tween a nakonec třikrát s použitím PBST. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ sekundární protilátky ve zředění 1/1000 [králičí anti-kuřecí IgG alkalická fosfatáza (Sigma) zředěná v blokujícím roztoku s obsahem 0,5 % Tween 20] a destička byla inkubována 1 h při 37 °C. Roztoky konjugátu byly dekantovány a destičky byly promyty ókrát v PBST, pak jednou v50mM Na₂CO₃, 10 mM MgCl₂, pH 9,5. Destičky byly vyvíjeny přídavkem 100 μΐ roztoku obsahujícího 1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (Sigma), rozpuštěného v 50 mM Na₂CO₃, 10 mM MgCl₂, pH 9,5, do každé jamky. Pak byly destičky inkubovány v temnu při teplotě místnosti po dobu 5 až 45 min. Byla měřena absorbance každé jamky při 410 nm pomocí přístroje Dynatech MR 700.

Jak vyplývá z výsledků afinitní chromatografie, čištěním preparátů CTB na sloupci pMB1750-1970 byla odstraněna veškerá reaktivita vůči proteinu pMB1970-2360. Reciproční čištění preparátu CTB, který byl čištěn na sloupci pMB 1970-2360 nevedlo k navázání protilátky při chromatografování na sloupci pMB1750-1970. Z těchto výsledků vyplývá, že všechny opakující se reaktivní protilátky ve skupině polyklonálních CTB rozpoznávají zachovanou strukturu, která je přítomna v nepřekrývajících se repeticích. I když je možné, že tato zachovaná struktura představuje vzácné zachované lineární epitopy, zdá se pravděpodobnější, že neutralizující protilátky rozpoznávají specifickou konformaci proteinu. Tento závěr vyplývá také z výsledků analýzy reaktivity CTB těchto rekombinačních proteinů pomocí hybridizace Westernových blotů.

Westernové bloty gelů 7,5% SDS-PAGE s naneseným definovaným množstvím každého rekombinačního proteinu, podrobeným elektroforéze, byly sondovány s preparáty polyklonální protilátky CTB. Bloty byly připraveny a vyvíjeny s alkalickou fosfatázou, jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky jsou uvedeny na obr. 24.

Obr. 24 zobrazuje porovnání imunoreaktivity protilátky IgY, vytvořené proti buď nativnímu, nebo rekombinačnímu antigenu toxinu B. Bylo naneseno duplicitně stejné množství proteinů pMB1750-1970 (pruh 1), pMB1970-2360 (pruh 2), pPB1850-2360 (pruh 3) a sériové ředění proteinu pPB1750-2360 (pruhy 4 až 6, obsahující ředění lx, l/10x a 1/1 lx) a vyvíjeno na gelu 7,5% SDS-PAGE. Každá polovina blotu byla hybridizována s protilátkami IgY, preparovanými PEG, z kuřat imunizovaných buď nativním CTB, nebo proteinem pPB1750-2360. Je nutno upozornit, že protein pMB 175 0-1970 plné délky byl identifikován pouze protilátkami reaktivním vůči rekombinačnímu proteinu (šipky).

Přestože preparát CTB reaguje s proteiny pPB 1750-2360, pPB 1850-2360 a pMB 1970-2360, nebyla pozorována reaktivita vůči proteinu pMB1750-1970 (obr. 24). Vzhledem ktomu, že všechny protilátky reaktivní s repeticemi mohou být tímto proteinem navázány během afinitní

-88CZ 296806 B6 chromatografie, naznačuje tento výsledek, že tento protein se nemůže na Westernových blotech správně skládat. Protože je takto eliminována veškerá reaktivita s protilátkami, je nepravděpodobné, že protilátky reaktivní s repeticemi v preparátu CTB rozpoznávají lineární epitopy. To může naznačovat, že pro vyvolání ochranných protilátek bude nutno, aby se rekombinační protein toxinu B správně skládal.

c) Tvorba a hodnocení protilátek reaktivních s rekombinačními polypeptidy toxinu B

i) Tvorba protilátek reaktivních s rekombinačními proteiny toxinu B

Protilátky proti rekombinačním proteinům byly vytvořeny v leghomských nosnicích, jak je popsáno v příkladu 13. Tvorba protilátek byla vyvolána [s použitím Freundova adjuvans (Gibco), není-li uvedeno jinak] proti těmto rekombinačním proteinům: 1) směs proteinů intervalu 1+2 (viz obr. 18), 2) směs proteinů intervalu 4 a 5 (viz obr. 18), 3) protein pMB 1970-2360, 4) protein pPB1750-2360, 5) pMB1750-2360, 6) pMB1750-2360 [adjuvans Titermax (Vaxcell)], 7) pMB 1750-2360 [Gerbu adjuvans (Biotech)], 8) protein pMBpl750-2360, 9) pPB1850-2360 a 10) pMB 1850-2360.

Kuřatům byly podány alespoň 3 posilovači dávky rekombinačního proteinu, dokud nebyla reaktivita ELISA [postupem popsaným v odstavci (b), avšak s výjimkou, že destičky byly pokryty proteinem pPB 1750-2360] polyklonálních preparátů PEG alespoň rovná reaktivitě PEG preparátu polyklonální protilátky CTB. Pro PEG preparáty ze všech výše uvedených imunogenů byly stanoveny titry ELISA a bylo zjištěno, že jsou porovnatelné a leží v rozmezí od 1:12500 do 1:62500. Ve všech případech bylo dosaženo vysokých titrů s výjimkou 6) pMB 1750-2360, kdy nebyly pozorovány silné titry s použitím adjuvans Titermax, a tento preparát nebyl dále testován.

ii) Hodnocení protilátek reaktivních s rekombinačními proteiny Westernovou hybridizaci

Westernový bloty gelů 7,5% SDS-PAGE s nánosem definovaného množství rekombinačního proteinu, podrobeného elektroforéze (proteiny pMB1750-1970, pPB1850-2360 a pMB19702360 a sériové ředění pPB 1750-23 60 pro umožnění kvantifikace reaktivity), byly sondovány s preparáty polyklonálních protilátek CTB, pPB1750-2360, pMB1750-2360 apMB1970-2360 (z kuřat imunizovaných s použitím Freundova adjuvans). Bloty byly připraveny a vyvíjeny alkalickou fosfatázou, jak je popsáno v odstavci b).

Jak je znázorněno na obr. 24, preparáty CTB a pMB1970-2360 silně reagovaly s proteiny pPB1750-2360, pPB1850-2360 a pMB1970-2360, zatímco preparáty pPB1750-236% a pMB 1970-23 60 (Gerbu) reagovaly silně se všemi čtyřmi proteiny. Reaktivita Westernových blotů preparátů pPB1750-2360 a pMB1970-2360 (Gerbu) byla ekvivalentní preparátu CTB, zatímco reaktivita preparátu pMB1970-2360 (Gerbu) byla ekvivalentní preparátu CTB. Navzdory ekvivalentním reaktivitám ELISA byla u PEG preparátů z dvou nezávislých skupin imunizovaných proteinem pMB1750-2360 a jedné skupiny imunizované preparátem pMB1750-2360 s použitím Freundova adjuvans pozorována pouze slabá reaktivita (přibližně 1 %) vůči rekombinačním proteinům.

Ke zjištění, zda tento rozdíl imunoreaktivity podle analýzy Westernovým blotem odráží různé titry protilátek, bylo použito afinitní čištění. Na afinitní koloně pPB1750-2360 z odstavce b) bylo popsaným způsobem chromatografováno 50 ml Ex preparátů PEG z kuřat imunizovaných buď proteinem pMB1750-2360, nebo pMB1970-2360. Výtěžek afinitně čištěné protilátky (% celkového proteinu) v preparátu (byl ekvivalentní výtěžku získanému z PEG preparátu CTB v odstavci b). Rozdíly westernové reaktivity tedy odrážejí kvalitativní rozdíl skupin protilátek spíše než kvantitativní rozdíly. Z těchto výsledků vyplývá, že určité rekombinační proteiny jsou při vytváření vysoce afinitních protilátek účinnější (testováno hybridizaci Westernových blotů).

-89CZ 296806 B6 iii) Neutralizace toxinu B in vivo s použitím protilátek reaktivních s rekombinačním proteinem

K hodnocení schopnosti neutralizace protilátek, vytvořených proti rekombinačním proteinům toxinu B, byl použit křeččí model in vivo [popsaný v příkladech 9 a 14(b)]. Výsledky tří pokusů jsou uvedeny dále v tabulkách 27 až 29.

Byla kompilována schopnost každého imunogenu neutralizovat toxin B in vivo a hodnoty jsou uvedeny v tabulce 30. Jak vyplývá ze studií premixu rekombinační protein-CTB (tabulka 24), ochrannou schopnost mají pouze protilátky k intervalu 3 (1750-2366) a nikoli k jiným oblastem toxinu B (tj. intervalům 1 až 5). Neočekávané je zjištění, že protilátky vytvořené proti oblasti INT-3, exprimované ve vektoru pMAL (pMB1750-2360 a pMB1750-2360) spomocí Freundova adjuvans, nemají neutralizační schopnost. Toto zjištění je reprodukovatelné, protože nebyl pozorována neutralizace během dvou nezávislých imunizací pMB1750-2360 a jedné imunizace pMpB1750-2360. Skutečnost, že pětinásobné množství afínitně čištěných specifických protilátek pro repetice toxinu B z preparátů pMB 1750-2360 PEG nemůže toxin B neutralizovat, zatímco jednonásobné množství afínitně čištěných protilátek anti-CTB jej neutralizovat může (tabulka 28), dokazuje, že rozdílná schopnost protilátek CTB neutralizovat toxin B je důsledkem spíše kvalitativních než kvantitativních rozdílů mezi těmito preparáty protilátek. Neutralizující protilátky se vytvořily pouze pokud byla tato oblast exprimována v alternativním vektoru (pPB17502360) nebo s použitím alternativního adjuvans pro protein pMB1750-2360. Významné je, že protilátky vytvořené s použitím Freundova adjuvans kpPB 1850-2360, který obsahuje fragment, který je pouze o 100 aminokyselin menší než rekombinační pPB1750-2360, nejsou schopny neutralizovat toxin B in vivo (tabulka 27); je nutno rovněž upozornit, že pro pPB 1850-2360 a pPB1750-2360 byl použit týž vektor.

Tabulka 27. Neutralizace toxinu B in vivo

skupina“	počet živých zvířat*1	počet mrtvých zvířat6
preimunní	0	5
CTB	5	0
1NT1+2	0	5
I NT 4+5	0	5
pMB1750-2360	0	5
pMB1970-2360	0	5
pPB1750-2360	5	0

K protilátce se přidá toxin B C. difficile (CTB) (Těch Lab; v koncentraci 5 pg/ml, celkově 25 pg) v koncentraci letální pro křečky a inkubuje se 1 h při 37 °C. Po inkubaci se tato směs intraperitoneálně (IP) aplikuje křečkům. Každá skupina dostávala toxin, předem smísený s protilátkou, vytvořenou proti uvedenému proteinu, jako 4X prep PEG protilátky.

Počty v každé skupině představují počty živých nebo mrtvých křečků po 2 h po IP podání směsi toxin/protilátka.

-90CZ 296806 B6

Tabulka 28. Neutralizace toxinů B afínitně čištěnými protilátkami

skupina8	počet živých zvířat*5	počet mrtvých zvířat”
preimunní(l)	0	5
CTB(1)	5	0
pPB1750-2360(1)	5	0
1,5 mg anti-pMB1750-2360 (2)	1	4
1,5 mg anti-pMB1970-2360(2)	0	5
300 pg anti-CTB(2)	5	0

K protilátce se přidá toxin B C. difficile (CTB) (Těch Lab; v koncentraci 5 pg/ml, celkově 25 pg) v koncentraci letální pro křečky a inkubuje se 1 h při 37 °C. Po inkubaci se 1 ml této směsi intraperitoneálně (IP) aplikuje křečkům. Každá skupina dostávala toxin, předem smíšený s protilátkou, vytvořenou proti uvedenému proteinu, tj. buď (1) 4X prep PEG protilátky nebo (2) afínitně čištěnou protilátku (na pryskyřici pPB1750-2360), buď 1,5 mg/skupinu (anti-pMB 1750-2360 a anti-pMB1970-2360; použita neředěná afínitně čištěná protilátka) nebo 350 pg/skupinu (anti-CTB, specifická pro repetici; použita protilátka anti-CTB ředěná 1/5).

Počty v každé skupině představuje počty mrtvých nebo živých křečků 2 h po IP podání směsi toxin/protilátka.

Tabulka 29. Tvorba neutralizujících protilátek s použitím Gerbuho adjuvans

skupina8	počet živých zvířat”	počet mrtvých zvířat”
preimunní	0	5
CTB	5	0
pMB1970-2360	0	5
pMB1850-2360	0	5
pPB 1850-2360	0	5
pMB1750-2360 (Gerbu adj.)	5	0

K protilátce se přidá toxin B C. difficile (CTB) (Těch Lab) v koncentraci letální pro křečky a inkubuje se 1 h při 37 °C. Po inkubaci se tato směs intraperitoneálně (IP) aplikuje křečkům. Každá skupina dostávala toxin, předem smísený s protilátkou, vytvořenou proti uvedenému proteinu jako 4X prep PEG protilátky.

Počty v každé skupině představují počty živých nebo mrtvých křečků po 2 h po IP podání směsi toxin/protilátka.

-91 CZ 296806 B6

Tabulka 30. Neutralizace toxinu B in vivo

imunogen	adjuvans	testovaný preparát®	antigen použitý pro AP	neutralizace in vivob
preimunní	NA1	PEG	NA	ne
CTB (nativní)	Titermax	PEG	NA	ano
CTB (nativní)	Titermax	AP	pPB 1750-2360	ano
CTB (nativní)	Titermax	AP	pPB 1850-2360	ano
CTB (nativní)	Titermax	AP	pPB1750-1970	ano
CTB (nativní)	Titermax	AP	pPB1970-2360	ano
pMB1750-2360	Freund	PEG	NA	ne
pMB 1750-2360	Freund	AP	pPB1750-2360	ne
pMB 1750-2360	Gerbu	PEG	NA	ano
pMB1970-2360	Freund	PEG	NA	ne
pMB 1970-2360	Freund	AP	pPB 1750-2360	ne
pPB1750-2360	Freund	PEG	NA	ano
pPB1850-2360	Freund	PEG	NA	ne
pMB1850-2360	Freund	PEG	NA	ne
INT 1+2	Freund	PEG	NA	ne
INT 4+5	Freund	PEG	NA	ne

Buď preparát PEG (PEG), nebo afínitně čištěné protilátky (AP).

„Ano“ označuje úplnou neutralizaci (0/5 mrtvých), a „ne“ označuje žádnou neutralizaci (5/5 mrtvých) toxinu B po 2 h po podání směsi.

„NA“ znamená „nepoužito“.

Skupina protilátek pPB1750-2360 poskytuje výraznou ochranu in vivo, ekvivalentní jako v případě afínitně čištěných protilátek CTB. Koreluje to s pozorovanou vysokou afinitou této skupiny protilátek (oproti skupině pMB1750-2360 nebo pMB1970-2360) podle výsledků Western blot analýzy (obr. 24). Tyto výsledky představují první důkaz toho, že protilátky neutralizující in vivo mohou být indukovány pomocí rekombinačního proteinu toxinu B jako imunogenu.

Neschopnost neutralizace v případě vysokých koncentrací protilátek vytvořených proti proteinu pMB1750-2360 (s použitím Freundova adjuvans), zatímco použitím Gerbuho adjuvans a proteinu pMB 1750-2360 vzniká neutralizující odpověď, dokazuje, že pro indukci neutralizujících protilátek je nutná konformace nebo prezentace tohoto proteinu. Tyto výsledky jsou konzistentní se zjištěním, že se zdá, že neutralizující protilátky, produkované s použitím CTB jako imunogenu rozpoznávají konformační epitopy [viz výše odstavec (b)]. Jedná se o první důkaz toho, že konformace nebo prezentace rekombinačního toxinu B je nezbytná pro vznik vysokých titrů neutralizujících protilátek.

-92CZ 296806 B6

Příklad 20

Stanovení kvantitativních a kvalitativních rozdílů mezi preparáty pMB 1750-2360, pMB17502360 (Gerbu) a polyklonálních protilátek pPB1750 IgY

V příkladu 19 bylo demonstrováno, že tvorbu neutralizujících protilátek toxinu B je možno vyvolat pomocí specifických rekombinačních proteinů toxinu B (pPB 1750-2360) nebo specifických adjuvans. Protilátky vytvořen proti pMB 1750-2360 byly schopny neutralizovat enterotoxický účinek toxinu B, jestliže byl k imunizaci slepic použit rekombinační protein ve spojení s Gerbuho adjuvans, ale nikoli při použití Freundova adjuvans. Pro zjištění důvodu těchto omezení ohledně antigenů a adjuvans byly afínitní chromatografií izolovány protilátky, specifické pro toxin B, přítomné v neutralizujících a neneutralizujících preparátech PEG, a testovány na kvalitativní nebo kvantitativní rozdíly. Příklad zahrnoval: a) čištění specifických protilátek anti-toxin B z PEG preparátů pMB1750-2360 a pPB1750-2360 a b) neutralizaci toxinu B s použitím afinitně čištěné protilátky in vivo.

a) Čištění specifických protilátek z PEG preparátů pMB 1750-2360 a pPB 1750-2360

Za účelem čištění a stanovení koncentrace specifických protilátek (vyjadřované jako procento celkové protilátky) v PEG preparátech pPB1750-2360 (Freund a Gerbu) a pPB1750-2360 bylo definované množství těchto preparátů chromatografováno na afínitní koloně obsahující celou repetiční oblast toxinu B (pPB1750-2360). Pak bylo kvantifikováno množství afinitně čištěné protilátky.

Afínitní kolona, obsahující rekombinační repetiční protein toxinu B, pPB1750-2360, byla získána tímto způsobem: 4 ml pryskyřice Actigel (Sterogene), promyté pomocí PBS, byly v 15ml zkumavce (Falcon), obsahující 1/10 konečného objemu kondenzačního roztoku Aid (1M kyanoborohydridu sodného) kondenzovány s 5 mg afinitně čištěného proteinu pPB 1750-2360 (dialyzovaného do PBS; podle odhadu jej tvoří více než 95 % plné délky fúzního proteinu). Alikvoty supematantu z kondenzačních reakcí před a po kondenzaci byly hodnocena barvením gelů SDSPAGE 7,5% pomocí Coomassie. Podle intenzit proteinových pásů bylo na pryskyřici navázáno více než 95 % (přibližně 5 mg) rekombinačního proteinu. Pryskyřice s navázaným proteinem byla nalita na 10 ml sloupce (BioRad), promyta intenzivně PBS, preeluována 4M guanidin-HCl (v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,005 % thimerosal), reekvilibrována v PBS a uchovávána při 4 °C.

Alikvoty preparátů pMB 1750-2360, pMB 1750-2360 (Gerbu) nebo polyklonální protilátky IgY pPB1750-2360 (preparáty PEG) byly na výše uvedené koloně afinitně čištěny tímto způsobem: Kolona byla připojena k monitoru UV (ISCO) a promyta PBS. Byly použity 40ml alikvotypreparátů 2x PEG (před chromatografií sterilně filtrovaných s použitím filtru 0,45 pm a kvantifikovaných pomocí OD₂₈o)· Kolona byla promývána PBS do znovuobnovení základní hodnoty (průtok byl uschován), promyta BBS-Tween pro vymytí nespecificky se vážících protilátek a reekvilibrována PBS. Navázaná protilátka byla z kolony eluovány v 4M guanidin-HCl (v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,005 % thimerosal) a celý eluční pík byl shromážděn v 15ml zkumavce (Falcon). Kolona byla reekvilibrována, a eluát z kolony byl rechromatografován výše uvedeným postupem. Preparáty protilátek byly kvantifikovány pomocí UV absorbance (k vynulování spektrofotometru byl použit eluční pufr). Po eluci prvního průchodu chromatografií byly získány přibližně lOnásobně vyšší koncentrace celkové čištěné protilátky vzhledem ke druhému průchodu. Nízký výtěžek z druhého průchodu chromatografií ukazoval, že během prvního průchodu byla odstraněna většina specifických protilátek.

Pro preparáty pMB1750-2360, pMB1750-2360 (Gerbu) nebo polyklonální protilátky IgY pPB 1750-2360 byly dialýzou eluátů z kolony po prvním průchodu připraveny skupiny afinitně čištěných protilátek. Eluáty byly jímány na ledu a ihned dialyzovány po dobu 2 h při 4 °C proti lOOnásobnému objemu PBS. Vzorky byly pak dialyzovány při 4 °C proti 3 dávkám 65násobného objemu PBS. Dialýza byla prováděna s jednou dávkou PBS minimálně 8 h. Dialyzované vzorky

-93CZ 296806 B6 byly shromážděny, odstředěny pro odstranění nerozpustných zbytků, kvantifikovány pomocí

OD₂8o a uchovávány při 4 °C.

Procentický podíl protilátek, specifických pro repetici toxinů B, přítomných v každém preparátu, byl stanoven pomocí kvantifikace výtěžků protilátek z prvního průchodu kolonou (množství specifické protilátky získané po prvním průchodu/celkový nanesený protein). Výtěžek afinitně čištěné protilátky, specifické pro repetici (vyjádřený jako procentický podíl celkového proteinu v preparátu) v 1) PEG preparátu pMB1750-2360 byl přibližně 0,5 %, 2) preparátu pMB17502360 (Gerbu) byl přibližně 2,3 % a 3) preparátu pPB1750-2360 byl přibližně 0,4 %. Čištění preparátu polyklonálních protilátek IgY CTB na stejné koloně prokázalo, že koncentrace protilátek specifických pro repetici toxinů B v preparátu CTB je 0,35 %.

Tyto výsledky ukazují, že 1) použití Gerbuho adjuvans zvýšilo titr specifické protilátky, produkované proti proteinu pMB 1750-2360, pětinásobně oproti imunizaci s použitím Freundova adjuvans a 2) rozdíly pozorované v neutralizační schopnosti in vivo u PEG preparátů pMB1750-2360 (neneutralizující) a pPB1750-2360 (neutralizující) a CTB (neutralizující) v příkladu 19, nejsou důsledkem rozdílů titru specifických protilátek v těchto třech preparátech, protože titr protilátky specifické pro repetici byl pro všechny tři preparáty podobný; rozdílná schopnost těchto tří preparátů neutralizovat toxin B tedy musí odrážet kvalitativní rozdíly indukovaných protilátek, specifických pro repetici toxinů B. Pro potvrzení, že existují kvalitativní rozdíly mezi protilátkami vytvořeným ve slepicích, imunizovaných různými rekombinačními proteiny a/nebo s různými adjuvans bylo křečkům podáno stejné množství afinitně čištěných protilátek proti repetici toxinů B (aa 1870-2360 toxinů B) z různých preparátů s použitím dále popsaného křeččího modelu in vivo.

b) Neutralizace toxinů B s použitím afinitně čištěné protilátky in vivo

K hodnocení neutralizační schopnosti afinitně čištěných protilátek vytvořených proti rekombinačnímu toxinů B, čištěných podle odstavce (a), byl použit křeččí model in vivo. Stejně tak byl na neutralizaci in vivo testován 4X IgY PEG preparát z druhé nezávislé imunizace s použitím antigenu pPB1750-2360 s Freundovým adjuvans. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 31.

-94CZ 296806 B6

Tabulka 31. Neutralizace toxinu B in vivo s použitím afínitně čištěných protilátek

skupina3 *	počet Živých zvířat*5	počet mrtvých zvířat15
preimunní1	0	5
CTB (300 pg)2	5	0
CTB (100 pg)2	1	4
pMB1750-2360 (G) (5 mg)2	5	0
pMB 1970-2360 (G) (1,5 mg)2	5	0
pMB1970-2360 (G) (300 pg)2	5	0
pMB1970-2360 (F) (1,5 mg)2	0	5
pPB1970-2360 (F) (1,5 mg)2	5	0
pPB1970-2360 (F) (300 pg)2	1	4
CTB (100 pg)3	2	3
pPB1970-2360 (F) (500 pg)1	5	0

³ K protilátce (je uvedeno množství konkrétní protilátky) se přidá toxin B C. difficile (CTB) (Těch Lab) v koncentraci letální pro křečky (25 pg) a inkubuje se 1 h při 37 °C. Po inkubaci se tato směs IP aplikuje křečkům (1/5 celkové směsi na křečka). Každá skupina dostávala toxin, předem smísený s protilátkou, vytvořenou proti uvedenému proteinu (G = Gerbuho adjuvans, F = Freundovo adjuvans). ¹ 4X prep PEG IgY protilátky,² afínitně čištěná protilátka na pryskyřici pPB 1850-2360,³ IX IgY PEG preparát.

^b Počty v každé skupině představují počty živých nebo mrtvých křečků po 2 h po IP podání směsi toxin/protilátka.

Výsledky uvedené v tabulce 31 demonstrují, že

1) Jak je uvedeno v příkladu 19 a zde reprodukováno, 1,5 mg afínitně čištěné protilátky ze slepic, imunizovaných pMB 1750-2360 s použitím Freundova adjuvans toxin B in vivo neneutralizuje. 300 pg afínitně čištěné protilátky z podobně imunizovaných slepic s použitím Gerbuho adjuvans však vykázalo kompletní neutralizaci toxinu B in vivo. Z toho vyplývá, že Gerbuho adjuvans kromě toho, že zvyšuje titr protilátek reaktivních s antigenem pMB 1750-2360 vzhledem k Freundovu adjuvans (demonstrováno v odstavci (a)), také zvyšuje výtěžek neutralizujících protilátek proti tomuto antigenu, a to více než 5násobně.

2) Kompletní neutralizace toxinu B in vivo byla pozorována s 1,5 mg afínitně čištěné protilátky ze slepic imunizovaných antigenem pPB1750-2360, ale nikoli s antigenem pMB1750-2360, bylo-li použito Freundovo adjuvans. Z toho vyplývá, že při použití standardizovaných koncentrací specifických protilátek k repetici toxinu B jsou indukovány neutralizující protilátky, použijeli se jako antigen s Freundovým adjuvans pPB1750-2360 a nikoli pMB1750-2360.

3) Kompletní neutralizace in vivo byla pozorována s použitím 300 pg protilátky pMB17502360 (Gerbu), ale nikoli 300 pg protilátky pPB1750-2360 (Freund). Protilátka pMB1750-2360 (Gerbu) má tedy vyšší titr neutralizujících protilátek než protilátka pPB1750-2360 (Freund).

-95CZ 296806 B6

4) Kompletní neutralizace toxinů B byla pozorována při použití 300 pg) protilátky CTB [afínitně čištěné (AP)], ale nikoli 100 pg protilátky CTB (AP nebo PEG prep). Z toho vyplývá, že k neutralizaci 25 pg toxinů in vivo v tomto pokusu je třeba více než 100 pg protilátky specifické pro repetici toxinů B a že afinitně čištěné protilátky specifické pro repetiční interval toxinů B neutralizující toxin B stejně účinně jako PEG prep IgY získaný proti celému proteinu CTB (prokázáno v tomto pokusu).

5) Jak bylo pozorováno pro počáteční PEG preparát pPB 1750-2360 (IgY) (příklad 19), úplná neutralizace byla pozorovány v případě PEG preparátu IgY izolovaného z druhé nezávislé skupiny slepic imunizovaných pPB1750-2360 (Freund). To ukazuje, že neutralizující protilátky jsou reprodukovatelně produkovány, jestliže jsou slepice imunizovány proteinem pPB1750-2360 s použitím Freundova adjuvans.

Příklad 21

Diagnostická enzymová imunoanalýza na toxiny A a B C. difficile

Byla zkoumána schopnost rekombinačních toxinových proteinů a protilátek vytvořených proti těmto rekombinačním proteinům (popsaných ve výše uvedených příkladech) tvořit základ diagnostických analýz pro detekci klostridiálního toxinů ve vzorku. Pro kvantitativní detekci toxinů A a toxinů B C. difficile z biologického vzorku byly testovány dva formáty imunoanalýzy. První formát zahrnoval kompetitivní test, při němž bylo pevné množství rekombinačního toxinů A nebo B imobilizováno na pevném nosiči (například jamkách mikrotitrační destičky), načež byl přidán biologický vzorek s obsahem toxinů, smísený s afinitně čištěnými nebo PEG frakcionovanými protilátkami proti rekombinačnímu toxinů A nebo B. Je-li ve vzorku přítomen toxin, soutěží tento toxin s mobilizovaným rekombinačním toxinovým proteinem o vazbu na protilátku proti rekombinačnímu proteinu, čímž snižuje signál, získaný po přídavku reporterového činidla. Reportérové činidlo detekuje přítomnost protilátky navázané na imobilizovaný toxinový protein.

Ve druhém formátu byla vyvinuta sendvičová imunoanalýza s použitím afinitně čištěných protilátek k rekombinačnímu toxinů A a B. Tyto afinitně čištěné protilátky k rekombinačnímu toxinů A a B byly použity k pokrytí mikrotitračních jamek místo rekombinačních polypeptidů (které byly použity v kompetitivním formátu testu). Do jamek pak byly přidány biologické vzorky obsahující toxin A nebo B a poté reportérové činidlo pro detekci přítomnosti navázaného toxinů v jamce.

a) Kompetitivní imunoanalýza pro detekci toxinů C. difficile

Rekombinační toxin A nebo B byl navázán na pevný nosič tak, že 96jamkové mikrotitrační destičky byly pokryty proteinem v koncentraci 1 pg/ml v PBS. Destičky byly inkubovány přes noc při 2 až 8 °C. Následující ráno byly povlékací roztoky odstraněny a zbylá vazebná místa na jamkách byla blokována zaplněním každé jamky roztokem PBS obsahujícím 0,5 % BSA a 0,05 % Tween-20. Nativní toxin A nebo B C. difficile (Těch Lab) byl zředěn na 4 pg/ml extrakty stolice zdravých syrských křečků (Sasco). Extrakty stolice byly získány vložením fekálních pelet do 15ml odstředivkové zkumavky; bylo přidáno 2 ml PBS na peletu a zkumavka byla provířena pro vytvoření rovnoměrné suspenze. Pak byla zkumavka odstřeďována 5 min při teplotě místnosti rychlostí 2000 múr¹. Byl odebrán supematant; ten obsahuje extrakt stolice. 50 μΐ extraktu křeččí stolice bylo napipetováno do každé jamky mikrotitračních destiček, kde sloužilo jako ředidlo pro sériové ředění vzorků toxinů 4 pg/ml. Do první řady jamek mikrotitrační destičky bylo napipetováno 100 μΐ vzorků toxinů o koncentraci 4 μg/ml, načež byly odebrány alikvoty po 50 μΐ a na destičce směrem dolů sériově ředěny ve dvou exemplářích. Do příslušných jamek byl přidán stejný objem afinitně čištěných protilátek proti rekombinačnímu toxinů [pro detekci toxinů A bylo použito 1 ng/jamku protilátky anti-pMAl 870-2680; pro detekci toxinů B bylo použito

-96CZ 296806 B6

0,5 ng/jamku anti-pMB1750-2360(Gerbu)] a destičky byly inkubovány za mírného míchání 2 h při teplotě místnosti. Jamky sloužící jako negativní kontrola obsahovaly protilátku, ale neobsahovaly nativní toxin, který by soutěžil o vazbu.

Nenavázaný toxin a protilátka byly odstraněny promytím destiček 3 až 5krát pomocí PBS obsahujícího 0,05 % Tween-20. Po promývacím stupni bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ králičí anti-kuřecí protilátky IgG konjugované s alkalickou fosfatázou (Sigma) a destičky byly inkubovány 2 h při teplotě místnosti. Pak byly destičky pro odstranění nenavázané sekundární protilátky promyty stejným způsobem jako předtím. Do každé jamky byl přidán čerstvě připravený substrát alkalické fosfatázy (1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (Sigma) v 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5, 10 mM MgCl₂). Jakmile se vyvinulo dostatečné zbarvení, byly destičky odečteny na čtečce Dynatech MR700 s použitím filtru 410 nm.

Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 32 a 33. V případě výsledků uvedených v tabulce 32 byly destičky pokryty rekombinačním proteinem toxinu A (pMAl 870-2680). Je uvedeno množství nativního toxinu A (přítomného jako přídavek k solubilizované křeččí stolici) přidaného do dané jamky (0 až 200 ng). Protilátka vytvořená proti rekombinačnímu proteinu toxinu A, pMAl870-2680, byla afinitně čištěna na afínitní koloně obsahující pPAl 870-2680 (popsané v příkladu 20). Jak je znázorněno v tabulce 32, může být rekombinační protein toxinu A a afinitně čištěný toxin použit pro základ kompetitivní imunoanalýzy pro detekci toxinu A v biologických vzorcích.

Podobné výsledky byly získány s použitím rekombinačního toxinu B, pPB 1750-2360 a protilátek vytvořených proti pMB1750-2360(Gerbu). V případě výsledků uvedených v tabulce 33 byly jamky pokryty rekombinačním proteinem toxinu B (pPB1750-2360). Je uvedeno množství nativního toxinu B (přítomného jako přídavek k solubilizované křeččí stolici), přidaného k dané jamce (0 až 20 ng). Protilátka vytvořená proti rekombinačnímu proteinu toxinu B, pMB1750-2360(Gerbu), byla afinitně čištěna na afínitní koloně obsahující pPB1850-2360 (popsané v příkladu 20). Jak je znázorněno v tabulce 33, může být rekombinační protein toxinu B a afinitně čištěný antitoxin použít jako základ kompetitivní imunoanalýzy pro detekci toxinu B v biologických vzorcích.

V tomto kompetitivním testu je redukce považována za významnou ve všech bodech nad pozadím; tento test může být proto použit k detekci vzorků obsahujících méně než 12,5 ng toxinu A/jamku a pouze 50 až 100 ng toxinu B/jamku.

Tabulka 32. Kompetitivní inhibice anti-C. difficile toxinu A nativním toxinem A

ng toxinu A/jamku	odečtená hodnota OD410
200	0,176
100	0,253
50	0,240
25	0,259
12,5	0,309
6,25	0,367
3,125	0,417
0	0,590

-97CZ 296806 B6

Tabulka 33. Kompetitivní inhibice anti-C. difficile toxinu B nativním toxinem B

ng toxinu B/jamku	odečtená hodnota OD„10
200	0,392
100	0,566
50	0,607
25	0,778
12,5	0,970
6,25	0,902
3,125	1,040
0	1,055

Tyto kompetitivní testy inhibice prokazují, že nativní toxiny C. difficile a rekombinační proteiny toxinu C. difficile mohou soutěžit o vazbu na protilátky, vytvořené proti rekombinačním toxinům C. difficile, což dokazuje, že tyto protilátky proti rekombinačnímu toxinu poskytují účinná diagnostická činidla.

b) Sendvičová imunoanalýza pro detekci toxinu C. difficile

Afinitně čištěné protilátky proti rekombinačnímu toxinu A nebo toxinu B byly mobilizovány na 96 jamkových mikrotitračních destičkách tímto způsobem: Jamky byly pasivně pokryty přes noc při 4 °C afinitně čištěnými protilátkami vytvořenými proti buď pMA 1870-2680 (toxin A), nebo pMB1750-2360(Gerbu) (toxin B). Protilátky byly afinitně čištěny způsobem popsaným v příkladu 20. Protilátky byly použity v koncentraci 1 pg/ml a do každé mikrotitrační jamky bylo přidáno 100 μΐ. Jamky pak byly blokovány 200 μΐ 0,5% BSA v PBS po dobu 2 h při teplotě místnosti, načež byl blokovací roztok dekantován. Vzorky stolice od zdravých syrských křečků byly resuspendovány v PBS, pH 7,4 (k resuspendování pelet bylo použito 2 ml PBS/peletu stolice a vzorek byl odstřeďován výše popsaným způsobem). Do suspenze stolice pak byl v koncentraci 4 pg/ml přidán nativní toxin A nebo B C. difficile (Těch Lab). Suspenze stolice s obsahem toxinu (buď toxinu A, nebo toxinu B) pak byly ve dvou exemplářích sériově ředěny suspenzí stolice bez toxinu a do pokrytých mikrotitračních jamek bylo ve dvou exemplářích přidáno 50 μΐ. Jamky obsahující suspenzi stolice bez toxinu sloužily jako negativní kontrola.

Destičky byly inkubovány 2 h při teplotě místnosti a pak byly promyty třikrát PBS. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ buď kozího anti-nativního toxinu A, nebo kozího anti-nativního toxinu B (Těch Lab), zředěného 1:1000 v PBS s obsahem 1 % BSA a 0,05 % Tween 20. Destičky byly inkubovány další 2 h při teplotě místnosti. Pak byly destičky promyty stejně jako předtím a bylo přidáno 100 μΐ králičího anti-kozího IgG konjugovaného s alkalickou fosfatázou (Cappel, Durham, N.C.) ve zředění 1:1000. Destičky byly inkubovány další 2 h při teplotě místnosti. Pak byly destičky promyty stejně jako předtím a pak vyvíjeny přídavkem 100 μΐ/jamku roztoku substrátu s obsahem 1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (Sigma) v 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5, 10 mM MgCl₂. Pomocí čtečky (Dynatech) byla měřena absorbance každé jamky při 410 nm. Výsledky testu jsou uvedeny v tabulkách 34 a 35.

-98CZ 296806 B6

Tabulka 34. Detekce toxinu A C. difficile ve stolici s použitím afinitně čištěných protilátek proti toxinu A

ng toxinu A/jamku	odečtená hodnota OD410
200	0,9
100	0,8
50	0,73
25	0.71
12,5	0,59
6,25	0,421
0	0

Tabulka 35. Detekce toxinu B C. difficile ve stolici s použitím afinitně čištěných protilátek proti toxinu B

ng toxinu B/jamku	odečtená hodnota OD410
200	1,2
100	0,973
50	0,887
25	0,846
12,5	0,651
6,25	0,431
0	0,004

Výsledky uvedené v tabulkách 34 a 35 ukazují, že protilátky vytvořené proti rekombinačním fragmentům toxinu A a toxinu B mohou být použity k detekci přítomnosti toxinu C. difficile ve vzorcích stolice. Tyto protilátky tvoří základ pro citlivou sendvičovou imunoanalýzou, která je schopna detekovat až pouze 6,25 ng toxinu A nebo B v 50 μΐ vzorku stolice. Jak je patrné z tabulek 34 a 35, je pozadí pro tuto sendvičovou imunoanalýzu extrémně nízké; proto je citlivost tohoto testu mnohem nižší než 6,25 ng toxinu/jamku. Je pravděpodobné, že by tímto testem bylo možno detekovat hladiny toxinu 0,5 až 1,0 pg/jamku.

Výsledky uvedené v tabulkách 32 až 35 prokazují zřejmou použitelnost rekombinačních činidel v detekčních systémech pro toxin C. difficile.

Příklad 22

Konstrukce a exprese fúzních proteinů fragmentu C C. botulinum

-99CZ 296806 B6

Byl klonován a sekvenován neurotoxinový gen typu A C. botulinum [Thompson a d., Eur., J. Biochem. 189:73(1990)]. Nukleotidová sekvence tohoto toxinového genu je k dispozici v bankách sekvenčních dat EMBL/GenBank pod přírůstkovým číslem X52066; nukleotidová sekvence kódující oblasti je uvedena jako SEQ ID NO:27. Aminokyselinová sekvence neurotoxinu typu A C. botulinum je uvedena jako SEQ ID NO:28. Neurotoxinový gen typu A je syntetizován jako jednoduchý polypeptidový řetězec, který je zpracován za vzniku dimerů, složeného z lehkého a těžkého řetězce, které jsou spojeny disulfídickými vazbami. Karboxyterminální část těžkého řetězce 50 kD se označuje jako fragment C nebo doména HcPředchozí pokusy jiných pracovníků exprimovat polypeptidy zahrnující fragment C toxinu typu A C. botulinum jako nativní polypeptid (například nikoli jako fúzní protein) v E. coli byly neúspěšné [H. F. LaPenotiere a d., in Botulinum and Tetanus Neurotoxins, ed. DasGupta, Plenům Press, New York (1993), str. 463-466]. Bylo popsáno, že exprese fragmentu C jako fúze s MBP E. coli vede k produkci nerozpustného proteinu (H. F. LaPenotiere a d., viz výše).

Za účelem produkce rozpustných rekombinačních proteinů fragmentu C v E. coli byly konstruovány fúzní proteiny obsahující syntetický gen fragmentu C, odvozený od toxinu typu A C. botulinum, a buď část proteinu toxinu C. botulinum, nebo MBP. Tento příklad zahrnoval: a) konstrukci plazmidů kódujících fúzní proteiny fragmentu C a b) expresi fúzních proteinů fragmentu C. botulinum v E. coli.

a) Konstrukce plazmidů kódujících fúzní proteiny fragmentu C

V příkladu 11 bylo demonstrováno, že je možno účinně exprimovat a čistit v E. coli repetiční doménu toxinu A C. botulinum buď jako nativní (exprese ve vektoru pET 23a v klonu pPA 1870-26780), nebo fúzní (exprese ve vektoru pMALc jako fúze sMBP E. coli v klonu pMAl 870-2680), nebo fúzní (exprese ve vektoru pMALc jako fúze sMBP E. coli v klonu pMAl 870-2680) protein. Byly konstruovány fúzní proteiny obsahující fúzi mezi MBP, částmi repetiční domény toxinu A C. botulinum (ukázalo se, že je exprimována jako rozpustný fúzní protein) a fragmentem C toxinu typu A C. botulinum. Byl také konstruován fúzní protein obsahující fragment C toxinu typu A C. botulinum a MBP.

Obr. 25 poskytuje schematické znázornění botulinálních fúzních proteinů spolu s donorovými konstrukty obsahujícím sekvence toxinu A C. difficile nebo sekvence fragmentu C C. botulinum, které byly použity k vytvoření botulinálních fúzních proteinů. Plné čtverečky na obr. 25 představují sekvence genu toxinu A. C. difficile, prázdné čtverečky představují sekvence fragmentu C C. botulinum a plné černé oválky představují MBP E. coli. Je-li název restrikčního enzymu uveden v závorce, znamená to, že restrikční místo bylo během konstrukce zničeno. Hvězdička u názvu restrikčního enzymu znamená, že toto restrikčnímísto bylo na klonovacím spoji obnoveno.

Na obr. 25 je znázorněna restrikční mapa konstruktů pMAl 870-2680 a pPAl 100-2680 (popsaných v příkladu 11), které obsahují sekvence odvozené od repetiční domény toxinu A C. difficile·, tyto konstrukty byly použity jako zdroj sekvencí genu toxinu A C. difficile pro konstrukci plazmidů kódujících fúze mezi genem fragmentu C C. botulinum a genem toxinu A C. difficile. Expresní konstrukt pMAl 870-2680 exprimuje vysokou hladinu rozpustného intaktního fúzního proteinu (20 mg/1 kultury), který může být afinitně čištěn na amylózové koloně (čištění popsáno v příkladu lid).

Jako zdroj sekvencí genu fragmentu C C. botulinum pro botulinální fúzní proteiny byl použit konstrukt pAlterBot (obr. 25). pAlterBot byl získán od J. Middlebrooka a R. Lemley na ministerstvu obrany USA. pAterBot obsahuje syntetický fragment C C. botulinum, vložený do vektoru pALTER-1® (Promega). Tento syntetický gen fragmentu C kóduje stejné aminokyseliny jako přirozeně se vyskytující gen fragmentu C. Sekvence přirozeně se vyskytujícího fragmentu C jsou jako většina klostridiálních genů extrémně bohaté na A/T (Thompson a d., viz výše). Tento vysoký obsah A/T způsobuje obtíže při expresi v E. coli a kvasinkách v důsledku změněné frek-100CZ 296806 B6 vence použití kodonů, resp. náhodných polyadenylačních míst. Pro zlepšení exprese proteinů fragmentu CvF. coli byla vytvořena syntetická verze genu, v níž jsou neoblíbené kodony nahrazeny preferovanými kodony.

Nukleotidová sekvence sekvencí genu fragmentu C C. botulinum, obsažených v pAlterBot, je uvedena jako SEQ ID NO:22. Prvních šest nukleotidů (ATGGCT) kóduje methioninový, resp. alaninový zbytek. Tyto dvě aminokyseliny vznikly vložením sekvencí fragmentu C. botulinum do vektoru pALTER® a poskytují iniciační methioninový zbytek. Aminokyselinová sekvence fragmentu C C. botulinum, kódovaného sekvencemi obsaženými vpAlterBot, je uvedena jako SEQ ID NO:23. První dvě aminokyseliny (Met Ala) jsou kódovány sekvencemi odvozenými do vektoru. Počínaje třetím aminokyselinovým zbytkem (Arg) je aminokyselinová sekvence identická jako v genu toxinu typu A C. botulinum.

Konstrukty pMAl 870-2680, pPAl 100-2680 a pAlterBot byly použity jako progenitorové plazmidy pro vytvoření expresních konstruktů, v nichž byly s použitím expresního vektoru pMAL-c (New England Biolabs) exprimovány fragmenty repetiční domény toxinu A C. difficile jako genetické fúze s genem fragmentu C C. botulinum. Expresní vektor pMAL-c vytváří fúzní proteiny, které obsahují na aminoterminálním konci MBP. Byl konstruován konstrukt pMBot, v němž byl gen fragmentu C C. botulinum exprimován jako fúze pouze s MBP (obr. 25). Exprese fúzního proteinu byla indukována z kmenů E. coli, obsahujících výše uvedené plazmidy, a indukovaný protein byl afínitně čištěn na sloupci amylózové pryskyřice.

i) Konstrukce pBlueBot

Pro usnadnění klonování genu fragmentu C C. botulinum do určitého počtu požadovaných konstruktů byly sekvence botulinálního genu odebrány z pAlterBot a vloženy do plazmidu pBluescript (Stratagene) za vzniku pBluBot (obr. 25). pBlueBot byl konstruován tímto způsobem: Bakterie obsahující plazmid pAlterBot byly pěstovány v médiu obsahujícím tetracyklin a plazmidová DNA byla izolována pomocí soupravy QIAprep-spin Plazmid Kit (Qiagen). 1 pg DNA pAlterBot byl štěpen Ncol a vzniklý ustupující lepivý konec 3' byl ztupen s použitím Klenowova fragmentu DNA polymerázy I (dále jen Klenowův fragment). DNA pAlterBot pak byla štěpena pomocí HindlII k uvolnění sekvencí botulinálního genu (inzert Bot) jako tupý (s vyplněným místem Ncol) fragment HindlII. DNA vektoru pBluescript byla připravena štěpením 200 ng DNA pBluescript pomocí Smál a HindlII. Produkty štěpení obou plazmidů byly rozděleny na agarózovém gelu. Příslušné fragmenty byly odděleny z gelu, smíseny a čištěny s použitím soupravy Prep-a-Gene kit (BioRad). Eluovaná DNA pak byla ligována pomocí T4 DNA ligázy a použita k transformaci kompetentních buněk DH5a (Gibco-BRL). Hostitelské buňky byly učiněny kompetentními pro transformaci s použitím postupu s chloridem vápenatým podle Sambrooka a d., viz výše, při 1,82-1,83. Rekombinační klony byly izolovány a potvrzeny restrikčním štěpením s použitím standardních technik rekombinační molekulární biologie (Sambrook a d., viz výše). Vzniklý klon pBlueBot obsahuje několik vhodných jednotlivých restrikčních míst obklopujících inzert Bot (tj. sekvence fragmentu C C. botulinum, odvozené od pAlterBot), jak je znázorněno na obr. 25.

ii) Konstrukce fúzních proteinů C. difficile/C. botulinum/MBP

Konstrukty, kódující fúze mezi genem toxinu A C. difficile a genem fragmentu C C. botulinum a MBP, byly získány stejnými metodami rekombinace DNA, jaké jsou popsány výše; tyto proteiny obsahovaly různá množství repetiční domény toxinu A C. difficile.

Klon MABot obsahuje inzert 2,4 kb, odvozený od genu toxinu A C. difficile, fúzovaného s inzertem Bot (tj. sekvence fragmentu C C. botulinum, odvozené od pAlterBot). pMABot (obr. 25) byl konstruován smísením gelově čištěné DNA z pBlueBot štěpeného NotVHindlR (fragment Bot 1,2 kb), pPA 1100-2680 štěpeného SpéUNotl (fragment repetice toxinu A

C. difficile 2,4 kb) a vektoru pMAL-c štěpeného XballHindlII. Rekombinační klony byly izolo-101 CZ 296806 B6 vány, potvrzeny restrikčním štěpením a čištěny s použitím soupravy QIAprep-spin Plazmid Kit (Qiagen). Tento klon exprimuje repetice toxinů A a sekvence botulinálního fragmentu C jako inframe fúzi s MBP.

Konstrukt pMCABot obsahuje inzert 1,0 kb, odvozený od genu toxinů A C. difficile, fúzovaného s inzertem Bot (tj. sekvence fragmentu C C. botulinum, odvozené od pAlterBot). pMCABot byl konstruován štěpením klonu pMABot pomocí EcoRl k odstranění konce 5' repetice toxinů A C. difficile (viz obr. 25; vektor pMAL-c obsahuje místo EcoRi 5' vůči inzertu C. difficile v klonu pMABot). Restrikční místa byla vyplněna a po gelovém čištění navzájem opět ligována. Vzniklý klon (pMCABot, obr. 25) vytvořil in-frame fúzi mezi MBP a zbývající 3' částí repetiční domény toxinů A C. difficile fúzovanou s genem Bot.

Klon pMNABot obsahuje fragment SpelJEcoVA (vyplněný) 1 kb z repetiční domény toxinů A C. difficile (odvozený z klonu pPAl 100-2680) a gen fragmentu C C. botulinum 1,2 kb jako fragment Ncol (vyplněný)/77zÁďIII (odvozený z pAlterBot). Tyto dva fragmenty byly vloženy do vektoru pMAL-c štěpeného pomocí XballHincRll. Oba vkládané fragmenty byly vytvořeny štěpením příslušného plazmidu pomocí EcoRI (pPAl 100-2680) nebo Ncol (pAlterBot) s následným ošetřením Klenowovým fragmentem. Po ošetření Klenowovým fragmentem byly plazmidy štěpeny druhým enzymem (buď Spěl nebo Hindlll). Všechny tři fragmenty byly gelově čištěny, smíseny a před ligací čištěny pomocí Prep-a-Gene. Po ligaci a transformaci byly předpokládané rekombinace analyzovány restrikční analýzou; bylo zjištěno, že na fúzním spoji bylo regenerováno místo EcoRI, jak bylo předpovězeno pro fúzi mezi vyplněným místemEcoRI a Ncol.

Byl konstruován konstrukt kódující fúzní protein mezi genem botulinálního fragmentu C a genem MBP (tj. v této fúzi chybějí veškeré sekvence genu toxinů A C. difficile) a označen pMBot. Konstrukt pMBot byl získán odstraněním sekvencí toxinů A C. difficile z konstruktu pMABot a fúzí sekvencí genu fragmentu C s MBP. Bylo to provedeno štěpením DNA pMABot pomocí Stul (umístěno v polylinkeru pMALc 5' vůči místu Xbal) a Xbal (umístěno na fúzním spoji toxA-Bot 3' vůči místu Notl), vyplněním místa Á&tzl pomocí Klenowova fragmentu, gelovým čištěním požadovaného restrikčního fragmentu a ligací tupých konců za vzniku kruhového plazmidu. Po ligaci a transformaci byly předpokládané rekombinanty analyzovány restrikčním mapováním inzertu Bot (tj. sekvencí fragmentu C C. botulinum).

b) Exprese fúzních proteinů fragmentu C C. botulinum v E. coli

Ve větším měřítku (1 litr) byly vypěstovány kultury vektoru pMAL-c a každého rekombinačního konstruktu, popsaného výše v odstavci a), indukovány a izolovány frakce rozpustného proteinu způsobem popsaným v příkladu 18. Pro izolaci rekombinačního fúzního proteinu byly extrakty rozpustného proteinu chromatografovány na amylózových afinitních kolonách. Čištěné rekombinační fúzní proteiny byly analyzovány nanesením na gely SDS-PAGE s následným barvením Coomassie a popsanou analýzou Western blot [Williams a d. (1994), viz výše]. Stručně řečeno byly připraveny extrakty a chromatografovány v kolonovém pufru (10 mM NaPO₄, 0,5 M NaCl, 10 mM β-merkaptoethanolu, pH 7,2) proti sloupci amylóžové pryskyřice (New England Biolabs) a eluovány kolonovým pufrem s obsahem 10 mM maltózy, jak popsáno [Williams a d. (1994), viz výše]. Gel SDS-PAGE, obsahující čištěné vzorky proteinu, barvené Coomassieovou modří, je znázorněn na obr. 26.

Na obr. 26 byly naneseny tyto vzorky: Pruhy 1 až 6 obsahují protein čištěný zE. coli obsahující plazmidy pMAL-c, resp. pPAl 870-2680, resp. pMABot, resp. pMNABot, resp. pMCABot, resp. pMBot. Pruh 7 obsahuje markéry molekulové hmotnosti v širokém rozmezí (BioRad).

Vzorky proteinů byly připraveny pro elektroforézu smísením 5 μΐ eluovaného proteinu s 5 μΐ

2x SDS-PAGE vzorkového pufru (0,125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2 mM EDTA, 6 % SDS, 20 % glycerol, 0,025 % bromfenolové modři; před použitím se přidá β-merkaptoethanol do 5 %).

-102CZ 296806 B6

Vzorky byly zahřívány 5 min na 95 °C, pak ochlazeny a naneseny na gel SDS-PAGE s 7,5 % agarózy. Byly rovněž naneseny markéry molekulové hmotnosti pro široké rozmezí pro umožnění odhadu molekulové hmotnosti identifikovaných fúzních proteinů. Po elektroforéze byl protein detekován obecně barvením gelu pomocí Coomassieovy modři.

Ve všech případech činil výtěžek více než 20 mg fúzního proteinu na litr kultury (viz tabulku 36) a s výjimkou proteinu pMCABot mělo vysoké procento (tj. více než 20 až 50 % celkového eluovaného proteinu) eluovaného fúzního proteinu molekulovou hmotnost odhadovanou pro fúzní protein plné délky (obr. 26). Bylo odhadnuto (vizuální kontrolou), že jako fúzní protein plné 10 délky bylo exprimováno méně než 10 % fúzního proteinu pMCABot.

Tabulka 36. Výtěžek afinitně čištěných fúzních proteinů fragment C C. botulinum/MBP

konstrukt	výtěžek (mg/l kultury)	procento celkového rozpustného proteinu
pMABot	24	5,0
pMCABot	34	5,0
pMNABot	40	5,5
pMBot	22	5,0
pMA1870-2680	40	4,8

Výsledky prokazují, že s použitím expresního systému pMAL-c je v E. coli dosažitelná vysoká hladina exprese intaktních fúzních proteinů fragment C C. botulinum/toxin A C. difficile. Tyto výsledky jsou v rozporu s výsledky uváděnými H. F. LaPenotierem a d. (1993), viz výše. Navíc tyto výsledky ukazují, že pro získání rozpustného fúzního proteinu s použitím systému pMAL-c v E. coli není nutno fúzovat gen botulinálního fragmentu C s genem toxinu A C. difficile.

Za účelem zjištění, zda jsou výše uvedené botulinální fúzní proteiny rozpoznány protilátkami proti toxinu A C. botulinum, byly provedeny Westernový bloty. Byly analyzovány vzorky obsahující afinitně čištěné proteiny zE. coli obsahující plazmidy pMABot, pMCABot, pMNABot, pMBot, pMA 1870-2680 nebo pMALc. Na gely SDS-PAGE (7,5 % akrylamidu) byly naneseny 25 vzorky proteinů, čištěných z každého expresního konstruktu. Po elektroforéze byly gely blotovány a přenos proteinů byl potvrzen barvením pomocí Ponceau S (jak je popsáno v příkladu 12b).

Po přenosu proteinů byly bloty blokovány inkubací po dobu 1 h při 20 °C v blokovacím pufru [PBST (PBS s obsahem 0,1 % Tween 20 a 5 % sušeného mléka)]. Pak byly bloty inkubovány 30 v 10 ml roztoku obsahujícího primární protilátku; tento roztok obsahoval PEG prep IgY proti toxinu A C. botulinum (popsán v příkladu 3) ve zředění 1/500 v blokovacím pufru. Bloty byly inkubovány 1 h při teplotě místnosti v přítomnosti primární protilátky. Pak byly bloty promývány a vyvíjeny s použitím konjugátu králičí anti-kuřecí alkalické fosfatázy (Boehringer Mannheim) jako sekundární protilátky tímto způsobem: Králičí anti-křečcí protilátka byla zředěna blokova35 cím pufrem na 1 μg/ml (10 ml konečného objemu na blot) a bloty byly inkubovány 1 h při teplotě místnosti v přítomnosti sekundární protilátky. Pak byly bloty postupně promývány PBST, BBSTween a 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5. Bloty byly pak vyvíjeny v čerstvě připraveném substrátovém pufru alkalické fosfatázy (100 pg/ml tetrazoliové nitromodři, 50 pg/ml 5-bromchlorindolylfosfátu, 5 mM mgCl₂,v 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5). Vyvíjení bylo zastaveno přelitím blotů destilo40 vanou vodou a pak byly bloty vysušeny vzduchem.

-103CZ 296806 B6

Touto westernovou analýzou byly detekovány proteiny reaktivní vůči toxinu C. botulinum ve vzorcích proteinů pMABot, pMCABot, pMNABot a pMBot (odpovídajících předpokládaným proteinům plné délky, identifikovaným na obr. 26 barvením Coomassie, jak uvedeno výše), ale nikoli ve vzorcích proteinů pMAl 100-2680 nebo pMALc.

Z těchto výsledků vyplývá, že relevantní fúzní proteiny, čištěné na amylózové pryskyřici, popsané v odstavci a), obsahovaly podle předpokladu imunoreaktivní protein fragmentu C C. botulinum.

Příklad 23

Získávání neutralizujících protilátek nasální aplikací proteinu pMBot

Byla hodnocena schopnost rekombinačních botulinálních proteinů, produkovaných v příkladu 22, stimulovat systémovou imunitní odpověď proti epitopům botulinálního toxinu. Tento příklad zahrnoval: a) hodnocení indukce sérových titrů IgG, produkovaných nasální nebo orální aplikací fúzních proteinů toxin A C. difficile obsahujících bobulinální toxin a b) neutralizaci neurotoxinu typu A C. botulinum protilátkami proti rekombinačnímu fragmentu C C. botulinum in vivo.

a) Hodnocení indukce sérových titrů IgG produkovaných nasální nebo orální aplikací fúzních proteinů toxinu A C. difficile, obsahujících botulinální toxin

Šest skupin po pěti samicích krys CF (Charles River) o stáří 6 týdnů bylo nasálně nebo orálně imunizováno jednou ze tří následujících kombinací s použitím proteinu připraveného v příkladu 22: (1) 250 pg proteinu pMBot na krysu (nasálně a orálně), (2) 250 pg proteinu pMABot na krysu (nasálně a orálně), (3) 125 pg pMBot ve směsi s 125 pg pMA1870-2680 na krysu (nasálně a orálně). Druhá sada pěti skupin po 3 samicích krys CF byla nasálně nebo orálně imunizována jednou z těchto kombinací: (4) 250 pg proteinu pMNABot na krysu (nasálně a orálně) nebo (5) 250 pg proteinu pMAL-c na krysu (nasálně a orálně).

Fúzní proteiny byly pro imunizaci připraveny takto: Proteiny (v kolonovém pufru s obsahem 10 mM maltózy) byly zředěny 0,1 M karbonátovým pufrem, pH 9,5 a podány orálně nebo nasálně v obsahu 200 pl. Krysy byly před podáním mírně zklidněny etherem. Orální aplikace byla provedena s použitím dávkovači jehly velikosti 20. Nasální aplikace byla provedena s použitím mikropipetovacího zařízení P-200 (Gilson). Po 14 dnech po primární imunizaci byla krysám aplikována výše popsanými metodami popisovači dávka a po dalších 7 dnech jim byla odebrána krev. Krysy z každé skupiny byly mírně etherizovány a krev jim byla odebrána z ocasu. Krev byla ponechána se vysrážet po dobu 1 h při 37 °C a bylo shromážděno sérum.

Sérum od jednotlivých krys bylo analyzováno pomocí ELISA za účelem zjištění sérového titru IgG proti toxinu typu A C. botulinum. Použitý postup ELISA byl modifikací postupu popsaného v příkladu 13c. Stručně řečeno byly 96jamkové mikrotitrační destičky (Falcon, Pro-Bind Assay Plates) povlečeny toxoidem typu A C. botulinum (připraveným podle postupu v příkladu 3a) tak že do každé jamky byl vložen objem 100 pl toxoidu typu A C. botulinum o koncentraci 2,5 pg/ml v PBS s obsahem 0,005 % thimoresalu a byla provedena inkubace přes noc při 4 °C. Příští ráno byla povlékací suspenze dekantována a všechny jamky byly promyty třikrát pomocí PBS.

Za účelem blokování nespecifických vazebných míst pak bylo do každé jamky přidáno 100 pl blokovacího roztoku [0,5 % BSA v PBS] a jamky byly 1 h inkubovány při 37 °C. Blokovací roztok byl dekantován a do první jamky ředicí série byly přidány zdvojené vzorky 150 pl zředěného krysího séra. Počáteční zkušební ředění séra bylo 1:30 v blokovacím roztoku s obsahem

0,5 % Twwen 20 s následným 5násobným ředěním do tohoto roztoku. To bylo provedeno sériovým přenosem alikvotů po 30 pl do 120 pl blokovacího roztoku s obsahem 0,5 % Tween 20,

-104CZ 296806 B6 rozmícháním a opakováním ředění do čerstvé jamky. Po konečném ředění bylo zjamky odebráno 30 μΐ, takže všechny tyto jamky obsahovaly konečný objem 120 μΐ. Byla provedena celkem 3 takováto ředění (celkem 4 jamky). Destičky byly 1 h inkubovány při 37 °C. Po této inkubaci byly sériově ředěné vzorky dekantovány a jamky byly promyty šestkrát pomocí PBS s obsahem 0,5 % Tween 20 (PBST). Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ králičího anti-krysího IgG-alkalické fosfatázy (Sigma) ve zředění (1/1000) v blokovacím pufru s obsahem 0,5 % Tween 20 a destička byla 1 h inkubována při 37 °C. Roztok konjugátu byly dekantovány a destičky byly promyty výše popsaným způsobem přičemž bylo PBST při konečném promytí nahrazeno 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5. Destičky byly vyvíjeny přídavkem 100 μΐ roztoku obsahujícího 1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (Sigma), rozpuštěného v 50 mM Na₂CO₃, 10 mM mgCl₂, pH 9,5 do každé jamky a inkubací destiček po dobu 5 až 45 min v temnu při teplotě místnosti. Pomocí čtečky Dynatech MR 700 byla měřena absorbance každé jamky při 410 nm. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 37 a 38 a představují průměrné reaktivity séra u jednotlivých myší.

Tabulka 37. Stanovení sérových titrů IgG proti toxinů typu A C. botulinum po imunizaci fúzními proteiny obsahujícími fragment C C. botulinum

cesta imunizace	nasální	orální
imunogen	preimunní	pMBot	pMBot & pMA1870- 2680	pMABot	pMBot	pMBot & pMA18702680	pMABot
ředění
1:30	0,080	1,040	1,030	0,060	0,190	0,080	0,120
1:150	0,017	0,580	0,540	0,022	0,070	0,020	0,027
1:750	0,009	0,280	0,260	0,010	0,020	0,010	0,014
1:3750	0,007	0,084	0,090	0,009	0,009	0,010	0,007
testované krysy		5	5	5	5	2	2

* čísla představují průměrné hodnoty získané ze dvou destiček ELISA, standardizovaných s použitím preimunní kontroly.

-105CZ 296806 B6

Tabulka 38. Stanovení sérových titrů IgG proti toxinu typu A C. botulinum po imunizaci fúzními proteiny obsahujícími fragment C C. botulinum

cesta imunizace	nasální	orální
imunogen	preimunní	pMBot	PMABot	pMNABot	pMNABot
ředění
1:30	0,040	0,557	0,010	0,015	0,010
1:150	0,009	0,383	0,001	0.003	0,002
1:750	0,001	0,140	0,000	0,000	0,000
1:3750	0,000	0,040	0,000	0,000	0,000
testované krysy		1	1	3	3

Výše uvedené výsledky ELISA demonstrují, že reaktivita vůči botulinálním fúzním proteinům byla nejsilnější při nasální cestě aplikace; pokud byly botulinální fúzní proteiny podávány orálně, byly stimulovány pouze slabé odpovědi. Největší odpověď sérového IgG vyvolal nasálně podaný pMBot a pMBot ve směsi s pMAl 870-2680. Z těchto výsledků vyplývá, že k vyvolání této odpovědi je nezbytný pouze protein pMBot, protože přídavek proteinu pMA 1870-2680 protilátkou odpověď nezvyšoval (tabulka 37). Umístěním fragmentu toxinu A C. difficile mezi MBP a protein fragmentu C C. botulinum došlo k dramatickému snížení titru anti-bt IgG (viz výsledky s použitím proteinů pMABot, pMCABot a pMNABot).

Tato studie demonstrují, že protein pMBot při nasálním podání indukuje silnou odpověď sérového IgG zaměřenou proti toxinu typu A C. tobulinum.

b) Neutralizace neurotoxinu typu A C. botulinum protilátkami proti rekombinačnímu fragmentu C C. botulinum

Schopnost protilátek proti toxinu typu A C. botulinum, získaných nasální aplikací rekombinačních botulinálních fúzních proteinů krysám (příklad 22), neutralizovat toxin typu A C. botulinum byla testována na myším neutralizačním modelu. Tento myší model je uznávanou metodou detekce botulinálních toxinů v tělních tekutinách a hodnocení proti-botulinálních protilátek [E.J. Schantz a D.A. Kautter, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61:96 (1990) a přihláška Investigational New Drug (BB-IND-3703), podaná generálním lékařem ministerstva obrany Federálnímu úřadu po potraviny a léčiva]. Protilátky proti toxinu typu A C. botulinum byly připraveny tímto způsobem:

Krysy ze skupiny, kterým byl nasálně podán protein pMBot, dostaly druhou posilovači dávku 250 pg proteinu pMBot na krysu a po 7 dnech bylo odebráno sérum. Sérum z jedné krysy z této skupiny a zpreimunní krysy bylo testováno na neutralizující aktivitu proti toxinu typu A C. botulinum na dále popsaném myším neutralizačním modelu.

Intraperitoneální (IP) metodou Schantze a Kauttera [J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61:96 (1978)] byla s použitím 18 až 22 myších samic ICR stanovena hodnota LD₅₀ roztoku čištěného komplexu toxinu typu A C. botulinum, získaného od Dr Erica Johnsona (University of Wisconsin Madison) a bylo zjištěno, že činí 3500 LD₅₀/ml. Stanovení LD₅₀ bylo provedeno následovně: Byl připraven standard toxinu typu A rozpuštěním čištěného komplexu toxinu typu A v 25 mM pufru na bázi fosforečnanu sodného, pH 6,8, na zásobní roztok toxinu o 3,15.10⁷ LD₅₀/mg. Byla stanovena

-106CZ 296806 B6 hodnota OD₂₇₈ roztoku a koncentrace upravena na 10 až 20 pg/ml. Roztok toxinu pak byl zředěn gel-fosfátem (30 mM fosfátu, pH 6,4, 0,2 % želatiny) 1:100. Další ředění roztoku toxinu byla prováděna, jak je uvedeno v tabulce 39. Pomocí 0,5 ml každého uvedeného ředění byly injekčně ošetřeny vždy dvě myši a pozorovány na výskyt příznaků botulismu po dobu 72h.

Tabulka 39: Stanovení LD₅₀ čištěného komplexu toxinu typu A C. botulinum

ředění	počet úhynů po 72 h
1:320	2/2
1:640	2/2
1:1280	2/2
1:2560	0/2 (onemocnění po 72 h)
1:5120	0/2 (žádné příznaky)

Z výsledků uvedených v tabulce 39 byl titr toxinu odhadnut mezi 2560 LD₅₀/ml a 5120 LD₅o/ml ío (čili asi 3840 LD₅₀/ml). tato hodnota byla pro účely výpočtu zaokrouhlena na 3500 LD₅₀/ml.

Poté bylo stanoveno množství neutralizujících protilátek, přítomných v séru krys, imunizovaných nasálně proteinem pMBot. Následujícím způsobem bylo testováno sérum ze dvou krys s výše uvedenou posilovači dávkou proteinu pMBot a preimunní sérum z jedné krysy. Toxinový stan15 dard byl zředěn 1:100 gel-fosfátem na konečnou koncentraci 350 LD₅₀/ml. 1 μΐ zředěného toxinového standardu byl smísen s 25 μΐ séra z každé ze tří krys a 0,2 ml gel-fosfátu. Směsi byly inkubovány 30 min při teplotě místnosti s občasným zamícháním. 0,5 ml směsí bylo IP injekčně aplikováno každé ze dvou myší. Myši byly 72 h pozorovány na známky botulismu. Myši, které dostaly sérum z krys imunizovaných proteinem pMBot, tuto dávku neutralizovaly. Myši, které 20 dostaly sérum preimunních krys, uhynuly za méně než 24 h.

Poté bylo kvantifikováno množství neutralizujících protilátek proti toxinu, přítomných v séru krys imunizovaných proteinem pMBot. Titrace sérových protilátek byly provedeny smísením 0,1 ml každého ředění protilátky (viz tabulka 40) s 0,1 ml ředění 1:10 zásobního roztoku toxinu 25 (3,5.104 LD₅₀/ml) s 0,1 ml gel-fosfátu a injekcí 0,5ml IP do 2 myší najedno ředění. Myši pak byly 3 dny (72 h) pozorovány na známky botulismu. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 39.

Jak je znázorněno v tabulce 40, sérum pMBot neutralizovalo komplex toxinu typu A C. botulinum, bylo-li použito v ředění 1:320 nebo menším. Pro sérum pMBot byla získána střední hodnota 30 neutralizace 168 IU/ml (jedna IU je definována jako 10000 myší LD₅₀). Tato hodnota se převádí na titr cirkulujícího séra asi 3,7 IU/mg sérového proteinu. Tento neutralizační titr je srovnatelný s komerčně dostupný (Connaught Laboratories, Ltd.) baleným koncentrovaným koňským antisérem proti C. botulinum. lOml ampule Connaughtova antiséra obsahují asi 200 mg/ml proteinu; každý mililitr může neutralizovat 750 IU toxinu typu A C. botulinum. Po podání jedné ampule 35 člověku bude titr Connaughtova preparátu v cirkulujícím séru za předpokladu průměrného objemu séra 3 1 přibližně 25 IU/ml). Titr anti-C. butulinum, pozorovaný v cirkulujícím séru u krys nasálně imunizovaných proteinem pMBot (168 IU/ml), je tedy 6,7krát vyšší než titr cirkulující protilátek proti C. botulinum, potřebný pro ochranu v případě člověka.

-107CZ 296806 B6

Tabulka 40. Kvantifikace neutralizujících protilátek v séru pMBot

	pMBoť
ředěni	krysa 1	krysa 2
1:20	2/2	2/2
1:40	2/2	2/2
1:80	2/2	2/2
1:160	2/2	2/2
1:320	2/2b	2/2b
1:640	0/2	0/2
1:1280	0/2	0/2
1:2560	0/2	0/2

^a čísla představují počty myší, přeživších po 72 h, které dostaly sérum odebrané krysám, imunizovaným proteinem pMBot.

^b tyto myši po 72 h přežily, ale onemocněly

Tyto výsledky demonstrují, že při použití rekombinačního fúzního proteinu fragmentu C C. botulinum, produkovaného vE. coli, jako imunogenu jsou indukovány protilátky schopné neutralizovat toxin typu A C. botulinum.

Příklad 24

Produkce rozpustného proteinu fragmentu C C. botulinum, v podstatě prostého kontaminace endotoxinem

V příkladu 23 bylo demonstrováno, že neutralizující protilátky se vytvoří imunizací proteinem pMBot, exprimovaný v E. coli. Tyto výsledky prokázaly, že fúzní protein pMBot je dobrým kandidátem na vakcínu. Imunogeny vhodné pro použití jako vakcíny však kromě schopnosti indukce neutralizujících protilátek musejí být apyrogenní. Byly vyvíjeny expresní klony a podmínky, které by usnadňovaly produkci proteinu fragmentu C C. botulinum pro použití jako vakcína.

Tento příklad zahrnoval: (a) stanovení obsahu pyrogen v proteinu pMBot, (b) vytvoření proteinu fragmentu C. C. botulinum, prostého MBP, (c) expresi proteinu fragmentu C C. botulinum s použitím různých expresních vektorů a (d) čištění rozpustného proteinu fragmentu C C. botulinum pro odstranění významné kontaminace endotoxiny.

a) Stanovení obsahu pyrogenů v proteinu pMBot

Pro použití rekombinačního antigenu jako vakcíny u člověka u jiných živočichů musí antigenový preparát prokázat pyrogenitu. Nej významnějším pyrogenem, přítomným v preparátech rekombinačních proteinů indukovaných v gramnegativních bakteriích, jako je E. coli, je endotoxin [F.C. pearson, Pyrogens: endotoxins, LAL testing and depyrogenation (1985), Marcel Dekker, New York, str. 23-56]. Pro hodnocení použitelnosti proteinu pMBot jako kandidáta na vakcínu byl stanoven obsah endotoxinů ve fúzních proteinech MBP.

-108CZ 296806 B6

Obsah endotoxinů ve vzorcích rekombinačních proteinů byl zjišťován pomocí Limulova testu (LAL kit: Associates of Cápe Cod) podle pokynů výrobce. Bylo zjištěno, že vzorky afínitně čištěného proteinu pMal-c a pMAl 870-2680 obsahující vysoké hladiny endotoxinu [> 50000 EU/mg proteinu; EU (endotoxinová jednotka)]. Z toho vyplývá, že fúze obsahující MBP nebo repetice toxinu A s botulinálním fragmentem C budou rovněž obsahovat vysoké hladiny endotoxinu. Proto byl učiněn následující pokus o odstranění endotoxinu z afínitně čištěných proteinových preparátů pMal-C a pMBot.

Pro zjištění, zda je možno endotoxin snadno odstranit, byly vzorky proteinu pMal-C a pMBot depyrogenizovány polymyxinem. Bylo použito toto množství proteinu: 29 ml při OD₂8o/ml pro Mal-C a 19 ml při 1,44 OD₂₈₀/ml pro pMBot. Vzorky proteinů byly intenzivně dialyzovány proti PBS a smíseny v 50ml zkumavce (Falcon) s 0,5 ml PBS-ekvilibrovaného polymyxinu B (AFFiPrep Polymyxin, BioRad). Vzorky byly rozmíchávány v otáčejících se zkumavkách přes noc při 4 °C. Polymyxin byl peletizován odstředěním po dobu 30 min maximální rychlostí (přibližně 2000 g) ve stolní odstředivce a supematant byl odstraněn. Získaný protein (v supematantu byl kvantifikován pomocí OD₂₈₀ a endotoxinová aktivita byla testována pomocí LAL. V obou případech byla získána pouze přibližně 1/3 vstupního proteinu a polymyxinem ošetřený protein si uchoval významnou kontaminaci endotoxinem (přibližně 7000 EU/mg pMBot).

Depyrogenizační experiment byl opakován s použitím nezávisle čištěného preparátu proteinu pMal-C byly získány podobné výsledky. Z těchto studii byl učiněn závěr, že významné množství endotoxinu se odstraní spolu s čištěním od fúzních proteinů MBP pomocí amylózové pryskyřice. Tento endotoxin navíc nelze snadno odstranit působením polymyxinu.

Z těchto výsledků vyplývá, že přítomnost sekvencí MPB ve fúzním proteinu komplikuje odstranění endotoxinu z preparátů proteinu pMBot.

b) Vytvoření proteinu fragmentu C C. botulinum, prostého MBP

V odstavci (a) bylo demonstrováno, že fúzní protein pMBot nelze snadno vyčistit od kontaminujícího endotoxinu. Dále byla zkoumána možnost produkovat apyrogenní (například endotoxinu prostý preparát rozpustného proteinu botulinálního fragmentu C, prostého navázaného MPB. Byl sestaven expresní konstrukt pMBot pro usnadnění čištění botulinálního fragmentu C od navázaného MBP štěpením fúzního proteinu s použitím zkonstruovaného místa štěpení faktorem Xa, přítomného mezi MBP a botulinálním fragmentem C. Štěpení faktorem Xa bylo provedeno následovně.

Faktor Xa (New England Biolabs) byl přidán v proteinu pMBot (s použitím poměru 0,1 až 1,0 % faktoru Xa/protein pMBot) v různém složení pufru [například PBS-NaCl (PBS s obsahem 0,5 mM NaCl), PBS-NaCl s obsahem 0,2 % Tween 20, PBS, PBS s obsahem 0,2 % Tween 20, PBS-C (PBS s obsahem 2mM CaCl₂), PBS-C s obsahem buď 0,1, nebo 0,5% Tween 20, PBS-C s obsahem buď 0,1, nebo 0,5 % NP-40, PBS-C s obsahem buď 0,1, nebo 0,5 % Tritonu X-100, PBS-C s obsahem 0,1 % deoxycholátu sodného, PBS-C s obsahem 0,1% SDS]. Štěpené směsi s faktorem Xa byly inkubovány 12 až 72 h při teplotě místnosti.

Rozsah odštěpení byl hodnocen Westernovým blotem nebo Coomassie barvením proteinů po elektroforéze na denaturujících gelech SDS-PAGE, popsané v příkladu 22. Štěpené reakční směsi (a kontrolní vzorky neštěpené proteinu pMBot) byly před nanesením na gel 2 min odstřeďovány v mikrofuze pro odstranění nerozpustných proteinů. Vzorky ošetřené faktorem Xa byly porovnávány s neštěpenými neodstřeďovanými vzorky pMBot na tomtéž gelu. Výsledky této analýzy jsou shrnuty dále.

1) Odstředěním bylo možno odstranit většinu (asi 90 %>) proteinu pMBot, i když byly použity neštěpené kontrolní vzorky. Z toho vyplývá, že fúzní protein pMBot nebyl plně rozpustný

-109CZ 296806 B6 (tj. existuje spíše jako suspenze než jako roztok). [Tento výsledek byl konzistentní s pozorováním, že většina afínitně čištěného proteinu pMBot se po dlouhodobém skladování (> 2 týdny) při 4 °C vysráží. Navíc po sonifíkaci a vyčeření indukovaných E. coli zůstává většina (tj. 75 %) indukovaného proteinu pMBot v peletě. Resuspendováním těchto nerozpustných pelet v PBS s následnou sonifíkaci dojde k částečné solubilizaci nerozpustného protein u pMBot v peletách.]

2) Ta část proteinu pMBot, která je plně v roztoku (asi 10 % proteinu pMBOt), je kompletně rozštěpena faktorem Xa, ale odštěpený (uvolněný) botulinální fragment C je relativně nerozpustný, takže plně v roztoku zůstává pouze odštěpený MBP.

3) Žádné z výše uvedených reakčních podmínek nevedly ke zvýšení rozpustnosti bez současného snížení účinnosti štěpení. Podmínky, za kterých by byl odštěpený botulinální fragment C účinně solubilizován, byly identifikovány.

4) Použití 0,1 % SDS v pufru použitém pro odštěpení faktoru Xa zvýšilo rozpustnost proteinu pMBot (veškerý protein pMBot byl rozpustný). Přítomnost SDS však zabránila veškerému štěpení fúzního proteinu faktorem Xa.

5) Analýza peletizovaného proteinu ze štěpných reakcí ukázala, že během inkubace se sráží jak pMBot plné (tj. neštěpený), tak odštěpený protein botulinálního fragmentu C.

Tyto výsledky demonstrují, že čištění rozpustného proteinu butulinálního fragmentu C po štěpení fúzního proteinu pMBot je komplikováno nerozpustností jednak proteinu pMBot a jednak odštěpeného proteinu botulinálního fragmentu C.

d) Exprese fragmentu C C. botulinum s použitím různých expresních vektorů

Za účelem zjištění, zda dojde ke zvýšení rozpustnosti botulinálního fragmentu C expresí proteinu fragmentu C jako nativního proteinu, proteinu N-terminálně značeného His nebo jako fúze s glutathion-S-transferázou (GST) byly konstruovány alternativní exp resní plazmidy. Tyto expresní konstrukty byly vytvořeny s použitím postupů uvedených v případě 22. Dále popsané vektory jsou schematicky znázorněny na obr. 27.

Na obr. 27 jsou použity tyto zkratky: pP označení vektor pET23, pHIS označuje vektor pETHisa, pBlue označuje vektor pBluescript, pM označuje vektor pMAL-c a pG označuje vektor pGEX3T (popsaný v příkladu 11). Plné černé čáry označují sekvence genu fragmentu C C. botulinum plné černé oválky představují MBP, šrafované oválky představují GST, „HHHHH“ představuje polyhistidinovou značku. Je-li název restrikčního enzymu na obr. 27 v závorce, znamená to, že restrikční místo bylo během konstrukce zničeno. Hvězdička u názvu restrikčního enzymu označuje, že toto restrikční místo bylo během konstrukce zničeno. Hvězdičky u názvu restrikčního enzymu označuje, že toto restrikční místo bylo na klonovacím spoji obnoveno.

i) Konstrukce pPBot

Za účelem expres fragmentu C C. botulinum jako nativního (tj nefúzovaného) proteinu byl následujícím způsobem konstruován plazmid pPBot (znázorněno schematicky na obr. 27). Sekvence fragmentu C, přítomné v pAlterBot (příklad 22) byly uvolněny štěpením pAlterBot pomocí Nco\ a HindíQ.. Insert fragmentu C Ncol/Hindlll byl ligován s vektorem pETHisa (popsaným v příkladu 18b), který byl štěpen pomocí TVcol a HindlII. Tato ligace vytváří expresní konstrukt, v němž je Ncol-kódovaný methionin botulinálního fragmentu C iniciačním kodonem a řídí expresi nativního botulinálního fragmentu C iniciačním kodonem a řídi expresi nativního botulinálního fragmentu C. Produkt ligace byl použit k transformaci kompetentních buněk BL21(DE3)pLysS (Novagen). Rekombinační klony pak byly identifikovány restrikčním mapováním.

-110CZ 296806 B6 ii) Konstrukce pHisBot

Za účelem exprese fragmentu C C. botulinum, obsahujícího na aminoterminálním konci rekombinačního proteinu polyhistidinovou značku, byl následujícím způsobem konstruován plazmid pHisBot (schematicky znázorněn na obr. 27). Insert botulinálního fragmentu C NcoMHindlII z pAlterBot bylo ligováno do vektoru pETHisa, který byl štěpen pomocí Nhel a HindW.. Místo Ncol (na insertu fragmentu C) a Nhel (na vektoru pETHisa) byla před ligaci vyplněna Klenowovým fragmentem; tato místa byla ligována tupými konci (místo Ndel bylo podle předpokladu regenerováno na klonovém spoji). Produkty ligace byly použity k transformaci kompetentních buněk LB21(DE3)pLysS a rekombinační klony byly identifikovány restrikčním mapováním.

Výsledný klon pHisBot exprimuje protein botulinálního fragmentu C s N-terminálním prodloužením histidinovou značkou o sekvenci MetGlyHisHisHisHisHisHisHisHisHisHisSerSerGlyHislleGluGlvArgHisMetAla (SEQ ID NO:24); aminokyseliny kódované genem botulinálního fragmentu C jsou podtrženy a vektorem kódované aminokyseliny jsou uvedeny normálním písmem. Nukleotidová sekvence přítomnosti ve vektoru pETHisa, který kóduje fúzní protein pHisBot, je uvedena jako SEQIDNO:25. Aminokyselinová sekvence proteinu pHisBot je uvedena jako SEQ ID NO:26.

iii) Konstrukce pGBot

Protein botulinálního fragmentu C byl exprimován jako fúze s proteinem glutathion-Stransferázou pomocí konstrukce plazmidu pGBot (schematicky znázorněno na obr. 27). tento expresní konstrukt byl vytvořen klonováním insertu fragmentu C NotUSaU, přítomného v pBlueBot (příklad 22) do vektoru pGEX3T, který byl štěpen Smál a Xho. Místo Notl (přítomné na botulinálním fragmentu) bylo před ligaci ztupeno Klenowovým fragmentem. Produkty ligace byly použity k transformaci kompetentních buněk BL21.

Pro potvrzení integrity výše uvedených expresních konstruktů byl každý konstrukt testován restrikčním štěpením.

Postupem podle příkladu 22 byly ve velkém měřítku (11) kultury pPBot [hostitel LB21(DE3)pLysS] pHisBot [hostitel BL21(DE3)pLysS] a pGBot (hostitel BL21) pěstování v médiu 2X Yt a indukovány po dobu 3 h (s použitím IPTG do 0,8 až 1,0 mM). Z 1 ml alikvotů každé kultury byly připraveny preparáty celkového, rozpustného a nerozpustného proteinu [Wiolliams a d. (1994), viz výše] a analyzovány pomocí SDS-PAGE. Coomassie barvením nebyl ve vzorcích pPBot nebo pHisBot detekovatelný žádný zřejmý indukovaný pás, zatímco ve vzorku pGBot byl detekován prominentní pás o předpokládané molekulové hmotnosti. Byly připraveny rozpustné lyzáty kultur pGBot (resuspendováno v PBS) a pHisBot [resuspendováno ve vazebném pufru Novagen IX (5 mM imidazolu,0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9)] a použity následujícím způsobme k afinitnímu čištění rozpustného afínitně značeného proteinu.

Lyzát pGBot byl afínitně čištěn na glutathion-agarózové pryskyřici (Pharmacia) přesně postupem podle Smitha a Corcorana [Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 28 (1994), str 16.7.1-16.7.7]. Protein pHisBot byl čištěn na pryskyřici His-Bind (Novagen) s použitím soupravy His-Bind (Novagen) přesně podle pokynů výrobce.

Vzorky z čištění pak proteinů pGBot, tak pHisBot (zahrnující neindukovaný, indukovaný, celkový, rozpustný a afínitně čištěný eluovaný protein) byly děleny na gelech SDS-PAGE. Po elektroforéze byly proteiny analyzovány coomassieovým barvením nebo detekci Western blot s použitím kuřecí protilátky proti toxoidu typu A C. botulinum (jak uvedeno v příkladu 22).

-111 CZ 296806 B6

Tyto studie ukázaly, že za použitých podmínek byl protein pGBot téměř úplně nerozpustný, zatímco protein pHisBot byl rozpustný. Afínitní čištění proteinu pHisBot na tento první pokus bylo neúspěšné, jak pokud jde o výtěžek (většina imunoreaktivního botulinálního proteinu se navázala na pryskyřici His-Bind), tak pokud jde o čistotu (bylo odhadnuto, že botulinální protein zahrnuje přibližně 20 % celkového eluovaného proteinu).

d) Čištění rozpustného proteinu fragmentu C C. botulinum, v podstatě prostého endotoxinové kontaminace

Výše popsané studie ukázaly, že protein pHisBot byl exprimován n E. coli jako rozpustný protein. Afínitní čištění tohoto proteinu na pryskyřici His-bins vak bylo velmi neúčinné. Pro zlepšení fínitního čištění rozpustného proteinu pHisBot (jak jde o výtěžek, tak o čistotu) byla použita alternativní polyhistidin vážící afínitní pryskyřice (pryskyřice Ni-NTa; Qiagen). uvádí se, že pryskyřice Ni-NTA má oproti pryskyřici His-Bind vyšší vazebnou afinitu (K_d = 1.10'¹³ při pH 8,0; uživatelská příručka Qiagen).

Výše popsaným způsobem byl připraven rozpustný lyzát (v IX vazebném pufru Novagen) z 1 1 indukované kultury 2X Yt. Stručně řečeno byla kultura pHisBot [hostitel B121 (DE3)pLysS] pěstovaná při 37 °C do OD₆₀o 0,7 v 1 1 média 2X Yt s obsahem 100 pg/ml ampicilinu, 34 pg/ml chloramfenikolu a 0,2 % glukózy. Exprese proteinů byla indukována přídavkem IPTG do 1 mM. Po 3 h po přídavku IPTG byly buňky po dobu 15 min chlazeny v lázni vody a ledu a pak odstřeďovány po dobu 10 min při 5000 min’¹ a 4 °C v odstředivce JA10 (Beckman). Pelety byly resuspendovány v celkovém objemu 40 ml vazebného pufru IX Novagen (5 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9) přeneseny do dvou 35ml zkumavek Oakridge a zmrazovány po dobu alespoň 1 h na -70 °C. Zkumavky byly roztaveny a buňky lyžovány sonifikací (impulsy 4 X 20 s pomocí přístroje Branson Sonifier 450 s nastavením výkonu 6 až 7) na ledu. Suspenze byla vyčeřena odstřeďováním po dobu 20 min při 9000 min'¹ (10 000 g) v odstředivce JA-17 (Beckman).

Rozpustný lyzát byl upraven na 0,1 % NP40 a pak byl po dávkách absorbován do 7 ml suspenze 1:1 pryskyřice Ni-NTA ve vazebném pufru mícháním po dobu 1 h při 4 °C. Suspenze byla nalita do kolony o vnitřním průměru 1 nebo 2,5 cm (BioRad). Kolona pak byla promyta postupně 15 ml lx vazebného pufru Novagen s obsahem 0,1 % NP40, 15 ml IX vazebného pufru Novagen, 15 ml promývacího pufru (60 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9) a 15 ml promývacího pufru NaHPO₄ (50 mM NaHPO₄, pH 7,0, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu). Navázaný protein byl eluován protonací pryskyřice s použitím elučního pufru (50 mM NaHPO₄, pH 4,0, 0,3 M NaCl, 10 % glycerol). Eluovaný protein byl skladován při 4 °C.

Vzorky celkového, rozpustného a eluovaného proteinu byly děleny pomocí SDS-PAGE. Vzorky proteinu byly připraveny pro elektroforézu, jak je uvedeno v příkladu 22b. Pro vizualizaci rozdělených proteinů byly zdvojené gely barveny pomocí Coomassieovy modří a protein reaktivní s toxinem typu A C. botulinum byl detekován analýzou Wester blob, popsanou v příkladu 22b. Reprezentativní gel, barvený Coomassieovou modří, je znázorněn na obr. 28. Na obr. 28 byly na 12,5 % akrylamidový gel naneseny tyto vzorky: Pruhy 1 až 4 obsahují celkový protein, resp. rozpustný protein, resp. rozpustný protein přítomný v průtoku kolony Ni-NTA, resp. afinitně čištěný protein pHisBot (tj. protein uvolněný z pryskyřice Ni-NTA protonací). Pruh 5 obsahuje vysokomolekulámí proteinové markéry (BioRad).

Čištění proteinu pHisBot vedlo k výtěžku 7 mg afinitně čištěného proteinu z 11 výchozí kultury buněk BL21(DE3)pLysS, obsahujících plazmid pHisBot. Výtěžek čištěného proteinu pHisBot představoval přibližně 0,4 % celkového rozpustného proteinu v indukované kultuře. Analýzou čištěného proteinu pHisBot pomocí SDS-PAGE bylo zjištěno, že alespoň 90 až 95 % proteinu bylo přítomno jako jediný pás (obr. 28) o předpokládané molekulové hmotnosti (50 kD). Tento pás proteinu 50 kD byl imunoreaktivní s protilátkami proti toxinu typu A C. botulinum. Bylo

-112CZ 296806 B6 zjištěno, že extinkční koeficient proteinového preparátu je 1,4 (s použitím testu Pierce BCA) nebo 1,45 (s použitím Lowryho testu) Οϋ₂₈₀ na 1 mg/ml roztoku.

Vzorky pH neutralizovaného eluovaného proteinu pHisBot byly děleny na koloně KB 803 HPLC (Shodex). Přestože jsou touto kolonou zadržovány His-značené proteiny (snad v důsledku inherentní schopnosti vazby kovů na proteiny), byla relativní mobilita proteinu pHisBot konzistentní s hodnotou očekávanou pro neagregovaný protein v roztoku. Bylo zjištěno, že za výše uvedených podmínek růstu a solubilizace je většina indukovaného proteinu pHisBot rozpustná (tj. na základě srovnání hladin proteinu pHisBot pozorovaných ve vzorcích celkového a rozpustného proteinu, připravených z buněk BL21(DE3)pLysS, obsahujících plazmid pHisBot, bylo zjištěno, že více než 90 % proteinu pHisBot je rozpustných). SDS-PAGE analýza vzorků získaných po odstředění prodlouženém, skladování při -20 °C a alespoň 2 cyklech zmrazování a rozmrazování nedetekovala úbytek proteinu (v důsledku srážení), což ukazuje, že protein pHisBot je rozpustný v elučním pufru (tj. 50 mM NaHPO₄, pH 4,0, 0,3 M NaCl, 10 % glycerol).

Stanovení endotoxinové kontaminace afínitně čištěného preparátu pHisBot (po neutralizaci pH) pomocí testu LAL (Associates of Cápe Cod) nedetekovalo významnou kontaminaci endotoxinem. Test byl prováděn s použitím koncové chromogenní metody (bez diazokopulace) podle návodu výrobce. Touto metodou je možno detakovat koncentrace endotoxinu větší nebo rovné 0,03 Eu/ml (EU označuje endotoxinové jednotky). Test LAL byl prováděn s použitím 0,5 ml roztoku zahrnujícího 0,5 mg proteinu pHisBot v 50 mM NaHPO₄, pH 7,0, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu; v 0,5 ml vzorku bylo detekováno 30 až 60 EU. Afínitně čištěný preparát pHis Bot tedy obsahuje 60 až 120 EU/mg proteinu. Předpisy FDA pro podávání parenterálních léčiv vyžadují, aby přípravek podávaný lidem obsahoval méně než 5 EU/kg tělesné hmotnosti (průměrná lidská tělesná hmotnost je 70 kg; v parenterální dávce je proto možno podat až 349 jednotek EU). Protože ve vakcínovém preparátu se podává pouze velmi malé množství proteinu (obecně v rozmezí 10 až 500 pg proteinu), je při aplikaci afínitně čištěného pHisBot s obsahem 60 až 120 EU/mg proteinu dodáno pouze malé procento povolené endotoxinové zátěže. Například podáním 10 až 500 pg čištěného pHisBot člověku o hmotnosti 70 kg, kdy proteinový preparát obsahuje 60 EU/mg proteinu, se zavede pouze 0,6 až 30 EU [tj. 0,2 až 8,6 % maximální povolené endotoxinové zátěže na parenterální dávku (méně než 5 EU/kg tělesné hmotnosti)].

Výše uvedené výsledky demonstrují, že endotoxin (LPS) se při výše uvedeném schématu čištění nečistí spolu s proteinem pHisBot. přípravky rekombinačně produkovaného proteinu pHisBot s nízkou hladinou endotoxinu (méně než nebo rovno 2 EU/mg rekombinačního proteinu) lze získávat promýváním kolony Ni-NTA promývacím pufrem do návratu OD₂₈₀ na základní úroveň (tj dokud z kolony nepřestane vycházet UV absorbující materiál).

Výše uvedené výsledky demonstrují způsob produkce a čištění rozpustného proteinu botulinálního fragmentu C, v podstatě prostého endotoxinu.

Příklad 25

Optimalizace exprese a čištění proteinu pHisBot

Výsledky uvedené v příkladu 24d demonstrovaly, že protein pHisBot je vynikajícím kandidátem pro použití jako vakcína, protože je možno jej získávat v E. colijsko rozpustný protein a protože čištěním je možno odstranit pyrogenní aktivitu. Za účelem optimalizace exprese a čištění proteinu pHisBot byly testovány různé podmínky růstu a čištění.

a) Růstové parametry ii) Hostitelské kmeny

-113CZ 296806 B6

Byl vyšetřován vliv použitých hostitelských kmenů na produkci rozpustného proteinu pHisBot. Čištění pHisBot ve velkém měřítku [popsané výše v příkladu 24d] bylo provedeno s použitím hostitele BL21(DE) (Novagen) místo BL21 (DE3)pLysS. Vypuštění plazmidu pLysS v hostiteli BL21(DE3) vedlo k vyšší úrovni exprese v důsledku dereprese promotoru T7-lac tohoto plazmidu. Výtěžek afinitně čištěného rozpustného rekombinačního proteinu však byl velmi nízký (přibližně 600 pg/l kultury), probíhalo-li čištění za stejných podmínek jako v příkladu 24d. Tento výsledek byl důsledkem skutečnosti, že exprese v hostiteli BL21(De) vedla k velmi vysoké úrovni exprese proteinu pHisBot jako nerozpustných infuzních tělísek, jak ukazuje SDS-PAGE analýza proteinu připraveného z indukovaných kultur BL21(DE3) (obr. 29, pruhy 1 až 7, popsané dále). Tyto výsledky demonstrují, že protein pHisBot není vůči buňkám E. coli inherentně toxický a s použitím vhodné kombinace promotor/hostitel může být exprimován do vysoké hladiny.

Obr. 29 znázorňuje gel SDS-PAGE barvený Coomassieovou modří (12,5 % akrylamidu), na nějž byly naneseny extrakty připravené z buněk BL21(DE3) obsahujících plazmid pHisBot. V případě každého pruhu byl nanesen vzorek 2,5 pl vzorkového pufru 2X SDS. Vzorky byly zpracovány postupem popsaným v příkladu 22b. Na gel byly nanášeny následující vzorky: Pruhy 1 až 7 obsahují protein izolovaný z hostitele BL21(DE3). pruhy 8 až 14 obsahují proteiny izolované z hostitele BL21(DE3)pLysS. Celkový protein byl nanesen v pruzích 1, 2, 4, 6, 8, 10 a 12. Rozpustný protein byl nanesen 3, 5, 7, 9, 11 a 13. pruh 1 obsahuje protein z neindukovaných hostitelských buněk. Pruhy 2 až 13 obsahují protein z hostitelských buněk indukovaných po dobu 3 h. IPTG byl přidáván do konečné koncentrace 0,1 mM (pruhy 6 až 7), 0,3 mM (pruhy 4 až 5) nebo 1,0 mM (pruhy 2, 3, 8 až 13). Kultury byl pěstovány v médiu LB (pruhy 8 až 9), médiu 2X YT (pruhy 10-11) nebo v médiu Terrifíc (pruhy 1 až 7, 12 až 13). Protein pHisBot, pozorovaný v pruzích 3, 5, a 7, je nerozpustný protein, který přetekl z pruhů 2, resp. 4, resp. 6. V pruhu 14 byly naneseny vysokomolekulámí markéry (BioRad).

Byly testovány různé podmínky exprese za účelem zjištění, zda je možno použít hostitele BL21(DE3) pro expresi rozpustného proteinu pHisBot ve vhodně vysoké hladině (tj. asi 10 mg/ml). Měnila se teplota (kultivace při 37 nebo 30 °C), kultivační médium (2X YT, LB nebo Terrifíc) a hladina induktoru (0,1, 0,3 nebo 1,0 mM IPTG). Byly testovány všechny kombinace těchto proměnných a pak byla hodnocena hladina indukce a rozpustnost analýzou SDS-PAGE celkových a rozpustných extraktů [připravených z 1 ml vzorků postupem podle Williamse a d. (1994), viz výše].

Všechny kultury byly pěstovány v 15ml zkumavkách (Falcon č. 2057). Všechny kultivační média byla přes noc předehřátá na příslušnou teplotu a doplněna 100 pg/ml ampicilinu a 0,2 % glukózy. Médium Terrifíc obsahuje 12 g/1 baktotryptonu, 24 g/1 bakto-kvasničného extraktu a 100ml/l roztoku zahrnujícího 0,17 Μ KH2PO4, 0,72 M K₂HPO₄. Kultury byly pěstovány v inkubátoru na otočném disku (pro zajištění aerace) do OD₆₀o přibližně 0,4 a indukovány přídavkem IPTG. Ve všech případech byla pozorována vysoká úroveň exprese nerozpustného proteinu pHisBot bez ohledu na teplotu, médium nebo koncentraci induktoru.

Pak byly vyšetřovány účinky různých koncentrací IPTG na kulturu 2X YT, pěstované při 23 °C. IPTG byl přidán do konečné koncentrace buď 1 mM, 0,1 mM, 0,05 mM, nebo 0,01 mM. Při této teplotě byly při buď 1, nebo 0,1 mM IPTG indukovány podobné hladiny proteinu pHisBot; tyto hladiny exprese byly nižší než při vyšších teplotách. Hladina indukovaného proteinu byla při 0,05 mM IPTG snížena a při 0,01 mM IPTG chyběla (oproti indukcím 1,0 a 0,1 mM IPTG při 23 °C). Nebyly však pozorovány žádné podmínky, za nichž by byl protein pHisBot v tomto hostiteli rozpustný. I když jsou tedy hladiny exprese v hostiteli BL21(DE3) vyšší (v porovnání s hostitelem BL21(DE3)pLysS), podmínky, které usnadňují produkci rozpustného proteinu v tomto hostiteli, nelze identifikovat.

-114CZ 296806 B6

Tyto výsledky demonstrují, že produkce rozpustného proteinu pHisBot bylo dosaženo s použitím hostitele BL21(DE3)pLysS ve spojení s promotorem T7-lac.

ii) Účinek měnící se teploty, média a koncentrace IPTG a délky indukce

Byl vyšetřován účinek pěstování hostitelských buněk v různých médiích na expresi rekombinančního botulinárního proteinu z expresního konstruktu pHisBot [v hostiteli BL21(DE3)pLysS], Buňky BL21(DE3)pLysS obsahující plazmid pHisBot byly pěstovány při 37 °C v médiu LB, 2X YT nebo Terrific. Buňky byly indukovány s použitím 1 mM IPTG během indukční doby 3 h. Bylo zjištěno, že exprese pHisBot je nejvyšší, byly-li buňky pěstovány v médiu 2X YT (viz obr. 29, pruhy 8 až 13).

Poté byly buňky pěstovány při 30 °C v médiu 2X YT a koncentrace IPTG byla měněna do 1,0, 0,3 nebo 1 mM a doba indukce byla buď 3, nebo 5 h. Exprese proteinu pHisBot byla podobná při všech 3 použitých koncentracích induktoru a hladiny indukovaného proteinu byl vyšší po 5h indukci v porovnání s 3h indukcí.

S použitím podmínek, zjištěný jako optimální pro expresi proteinu pHisBot byla kultura pěstována ve velkém měřítku za účelem poskytnutí dostatku materiálu pro čištění proteinu pHisBot ve velkém měřítku. Tři kultury po 1 1 byly pěstovány v médiu 2X YT s obsahem 10 pg/ml ampicilinu, 34 pg/ml chloramfenikolu a 0,2 % glukózy. Kultury byly pěstovány při 30 °C a pak indukovány po dobu 5 h s 1,0 mM IPTG. Kultury byly odebrány s postupem podle příkladu 18 byl připraven rozpustný lyzát. Čištění ve velkém měřítku bylo prováděno postupem podle příkladu 24d s tou výjimkou, že rozpustný lyzát byl šaržovitě absorbován po dobu 3 h místo 1 h. Konečný výtěžek byl 13 mg proteinu pHisBot/litr kultury. Proteinu pHisBot představoval 0,75 % celkového rozpustného proteinu.

Uvedené výsledky demonstrují růstové podmínky, za kterých je produkován rozpustný protein pHisBot (tj. použití hostitel BL21(DE3)pLysS, médium 2X YT, 30 °C, 1,0 mM IPTG po dobu 5 h).

b) Optimalizace parametrů čištění

Pro optimalizaci podmínek čištění byly výše popsaným postupem pěstovány velké kultury (3x11) při 30 °C a indukovány po dobu 5 h pomocí 1 mM IPTG. Kultury byly spojeny, rozděleny do odstředivkových lahví, ochlazeny a peletovány jako v příkladu 24d. Před použitím byla peleta buněk zmrazená na -70 °C. Každá peleta představovala 1/3 1 výchozí kultury a pro každý dále popsaný optimalizační experiment byly používány jednotlivé lahve. Tímto byly standardizovány přijaté bakterie pro každý experiment, takže bylo možno porovnávat výtěžky afinitně čištěného proteinu pHisBot mezi různými optimalizačními experimenty.

i) Vazebná specificita (protonace pH)

Byl připraven lyzát, kultury pHisBot v PBS (pH 8,0) a s použitím chromatografického systému Econo (BioRad) nanesen na 3 ml kolonu Ni-NTA, ekvilibrovanou v PBS (pH 8,0), s průtokem 0,2 ml/min (3 až 4 objemy kolony/h). Kolona byla promývána PBS (pH 8,0) do dosažení základní hodnoty absorbance (OD₂8o)· Pak byl průtok zvýšen na 2 ml/min a kolona byla ekvilibrována v PBS (pH 7,0). Pro vymytí navázaného proteinu pHisBot z kolony byl aplikován gradient pH (pH 7,0 až 4,0 v PBS). Frakce byly shromážděny a alikvoty byl děleny na gelech SDSPAGE. Gely PAGE byly podrobeny Westemovu blottingu a protein pHisBot byl detekován s použitím kuřecí protilátky proti toxoidu typu A C. botulinum, jak je popsáno v příkladu 22.

Z analýzy Westernových blotů bylo stanoveno, že protein pHisBot se začíná vymývat z kolony

Ni-NTA při pH 6,0. To je konzistentní s předpovídanou elucí proteinového monomeru, značeného His, při pH 5,9.

- 115CZ 296806 B6

Tyto výsledky demonstrují, že pH, při kterém je protein pHisBot protonován (uvolňován) z pryskyřice Ni-NTA v pufru PBS, je 6,0.

ii) Vazebná specificita (kompetice s imidazolem)

Za účelem definování podmínek čištění, za kterých je možno odstranit nativní proteiny E. coli z kolony Ni-NTA, byl proveden následující experiment, byl připraven lyzát kultury pHisBot v 50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl, 8 mM imidazolu (pH 7,0). Tento lyzát byl s použitím chromatografického systému Econo (RioRad) aplikován na sloupec 3 ml Ni-NTA, ekvilibrovaný v 50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl (pH 7,0). Byl použit průtok 0,2 ml/min (3 až 4 objemy kolony/h). Kolona byla promývána 50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl (pH 7,0), dokud se absorbance vymývaného roztoku nevrátila na základní hodnotu. Pak byl průtok zvýšen na 2 ml/min.

Kolona byla eluována s použitím stupňovitého gradientu imidazolu [v 50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl (pH 7,0)]. Eluční stupně představovaly 20 mM, 40 mM, 60 mM, 100 mM, 200 mM, 1,0 M imidazolu s následným promytím 0,1 mM EDTA (pro oddělení niklu z kolony a odstranění veškerého zbylého proteinu). V každém stupni se v promývání pokračovalo, dokud se OD₂₈o nevrátilo na základní hodnotu. Frakce byly děleny na gelech SDS-PAGE, podrobeny Westemovu blottingu a protein pHisBot byl detekován s použitím kuřecí protilátky proti toxoidu typu A C. botulinum, jak je popsáno v příkladu 22. Pro detekci eluovaného proteinu v každé frakci byly zdvojené gely barveny Coomassieovou modří.

Výsledky analýzy PAGE ukázaly, že promytím 20 mM imidazolem byla odstraněna většina nespecificky navázaného bakteriálního proteinu a zbylý protein byl odstraněn promytím 40 a 60 mM imidazolu. protein pHisBot se začal vymývat při 100 mM imidazolu a byl kvantitativně eluován v 200 mM imidazolu.

Tyto výsledky přesně definovaly okénko pro vymývání imidazolem, ve kterém dochází k optimálnímu odstranění proteinů E. coli z kolony se současným specifickým zadržením proteinu pHisBot v tomto pufru. Poskytly tak podmínky, za kterých je možno odstranit z proteinu pHisBot kontaminující hostitelské proteiny.

ii) Čisticí pufry a optimalizované čisticí protokoly

Během vývoje optimalizovaného protokolu pru šaržovité čištění rozpustného proteinu pHisBot byly testovány různé parametry čištění. Výsledky těchto analýz jsou shrnuty dále.

Šaržovité čištění bylo prováděno (jak je popsáno v příkladu 24d) s použitím několika pufrů za účelem stanovení, je-li možno pro vazbu proteinu pHisBot na kolonu Ni-NTA použití alternativní pufry. Bylo zjištěno, že kvantitativní vazby proteinu pHisBot na pryskyřici Ni-NTA se dosáhne buď v pufru Tris-HCl (pH 7,9), nebo NaHPO₄ (pH 8,0). Vazba proteinu pHisBot v pufru NaHPO4 nebyla inhibována při použití 5 mM, 8 mM nebo 60 mM imidazolu. Kvantitativní eluce navázaného proteinu pHisBot bylo dosaženo v pufrech obsahujících 50 mM NaHPO₄, 0,3 m NaCl (pH 3,5 až 4,0), s nebo bez 10 % glycerolu. Kvantifikací rozpustného afínitně čištěného proteinu pHisBot před a po zmrazení a rozmražení (po několika týdnech skladování afínitně čištěného eluátu při -20 °C) však bylo zjištěno, že s použitím pufru s obsahem glycerolu bylo regenerováno 94 % proteinu, ale při použití pufru bez glycerolu pouze 68 % proteinu. Z toho vyplývá, že glycerol zvyšovat rozpustnost proteinu pHisBot v tomto pufru o nízkém pH, byl-li eluovaný protein uchováván za teplot zmrazování (například -20 °C). Neutralizace pH přídavkem pufru NaH₂PO₄ nevedla ke zjevnému srážení proteinu.

Bylo zjištěno, že ke kvantitativnímu navázání proteinu pHisBot s použitím šaržovitého formátu došlo po 3 h (obr. 30), ale nikoli po 1 h vazby při 4 °C (pryskyřice byla během navazování míchána). Obr. 30 znázorňuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassieovou modří (7,5 % akryl-116CZ 296806 B6 amidu), obsahující vzorky proteinů izolovaných během čištění proteinu pHisBot z lyzátu připraveného z hostitele BL21(DE3)pLysS. Na každý pruh bylo naneseno 5 μΐ vzorku proteinu smíšeného s 5 μΐ 2X vzorkového pufru a zpracováno jako v příkladu 22b. Pruh 1 obsahuje markéry vysoké molekulové hmotnosti (BioRad). Pruhy 2 a 3 obsahují protein eluovaný z pryskyřice NiNTA. pruh 4 obsahuje rozpustný protein po 3 h šaržovité inkubace s pryskyřicí Ni-NTA. Pruhy 5 a 6 obsahují rozpustný, resp. celkový protein. Obr. 30 demonstruje, že protein pHisBot je kompletně rozpustný [srovnej pruhy 5 a 6, které ukazují podobné množství proteinu pHiSBot 50 kD; kdyby bylo podstatné množství (větší než 20 %) proteinu pHisBot částečně nerozpustné v buňce hostitele, bylo by v pruhu 6 (celkový protein) pozorováno oproti pruhu 5 (rozpustný protein) více proteinu pHisBot)]. Obr. 30 demonstruje dále, že protein pHisBot ze z lyzátu kompletně odstraněn po šaržovité absorpci pryskyřicí Ni-NTA po dobu 3 h (srovnej pruhy 4 a 5).

Z uváděné vysoké afínitní interakce pryskyřice Ni-NTA s proteiny značenými His (K_d = 1.10'¹³ při pH 8,0) vyplývá, že by mělo být možné manipulovat s komplexy proteinu navázaného na pryskyřici bez významného uvolnění navázaného proteinu. Skutečně bylo zjištěno, že po navázání rekombinančního proteinu u na pryskyřici Ni-NTA je komplex pryskyřice-pHisBot vysoce stabilní a zůstává navázaný po opakovaných 2 min cyklech odstřeďování pryskyřice při 1600 g. Bylo-li toto odstřeďování prováděno v 50 ml zkumavce (Falcon), vznikla pevná peleta pryskyřice. Tím bylo umožněno odstranění spotřebovaného rozpustného lyzátu slitím supematantu s následným resuspendováním pelety v promývacím pufru. Další promývání je možno provádět odstřeďováním. Možnost provádět další promývání umožňuje vyvinout protokoly pro šaržovitou absorpci velkých objemů lyzátu s odstraněním použitého lyzátu prostým odstředěním po navázání rekombinačního proteinu na pryskyřici.

Byl vyvinut následující zjednodušený integrovaný protokol čištění. Byl získán rozpustný lyzát resuspendováním pelety indukovaných buněk ve vazebném pufru [50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl, 60 mM imidazolu (pH 8,0)], sonifíkací 4 x 20 s a odstřeďování po dobu 20 min při 10000 g. Byl přidán NP-40 do 0,1 % a pryskyřice Ni-NTA (ekvilibrovaná ve vazebném pufru). Na litr výchozí kultury bylo použito 8 ml suspenze 11: (pryskyřice:vazebný pufr). Směs byla míchána 3 h při 4 °C. Suspenze byla nalita do kolony o vnitřním průměru 1 cm (BioRad), promyta vazebným pufrem s obsahem 0,1 % NP40, pak vazebným pufrem do ustavení základní hodnoty (tyto stupně je možno alternativně provádět odstředěním pryskyřice, resuspendováním ve vazebném pufru s obsahem NP a následným odstředěním a resuspendováním ve vazebném pufru). Imidazol byl odstraněn promytím pryskyřice 50 mM NaHPO₄, 0,3 M NaCl (pH 7,0). Protein navázaný na pryskyřici byl eluován s použitím stejného pufru (50 mM NaHPO₄, 0,3 M NaCl) se sníženým pH (pH 3,5 až 4,0).

Podle tohoto protokolu bylo provedeno pilotní čištění a bylo získáno 18 mg/1 afinitně čištěného pHisBot. Protein pHisBot měl čistotou vyšší než 90 %, hodnoceno Coomassie barvením gelu SDS-PAGE. To představuje nejvyšší pozorovaný výtěžek afinitně čištěného proteinu pHisBot a tento protokol eliminuje potřebu zvláštních vazebných a promývacích pufrů s obsahem imidazolu. Kromě zjednodušeného a účinného protokolu afinitního čištění rekombinačního proteinu pHisBot výše uvedené výsledky poskytují různé podmínky čištění, za nichž je možno izolovat protein pHisBot.

Příklad 26

Protein pHisBot je účinný imunogen

V příkladu 23 bylo demonstrováno, že po nasální imunizaci proteinem pMBot jsou v myším séru vytvářeny neutralizující protilátky. Bylo však zjištěno, že protein pMBot se čistí spolu s významným množstvím endotoxinu, který nelze snadno odstranit. Protein pHisBot může být naproti tomu izolován jako prostý významné kontaminace endotoxinem, což jej činí nejlepším kandidá-117CZ 296806 B6 tem pro výrobu vakcíny. Pro další hodnocení vhodnosti pHisBot jako vakcíny byla následujícím způsobem stanovena imunogenita proteinu pHisBot a provedeno porovnání relativní imunogenity proteinů pMBot a pHisBot u myší.

Dvě skupiny po osmi myších BALBc byly imunizovány buď proteinem pMBot, nebo proteinem pHisBot s použitím Gerbuho adjuvans (CC Biotech). Protein pMBot (v PBS s obsahem 10 mM maltózy) nebo protein pHisBot (v 50 mM NaHPO₄, 0,3 m NaCl, 10 % glycerolu, pH 4,0) byl smísen s Gerbuho adjuvans a použit k imunizaci myší. Každá myš dostala v den 0 IP injekci 100 μΐ směsi antigen/adjuvans (50 μg antigenů plus 1 pg adjuvans). Posilovači dávky byly podávány výše popsaným způsobem s tou výjimkou, že v den 14 a 28 byly podávány IM cestou. V den 77 byla myším odebrána krev a byly stanoveny titry proti toxoidu typu A. C. butolinum s použitím séra odebraného od jednotlivých myší v každé skupině (jak je popsáno v příkladu 23). Výsledky j sou uvedeny v tabulce 41.

Tabulka 41. Titry sérového IgG proti toxoidu typu A. C. botulinum u jednotlivých myší imunizovaných proteinem pMBot nebo pHisBot

	preimunní1	pMBot2	pHisBot2
	ředění vzorku	ředění vzorku	ředění vzorku
myš	1:50	1:250	1:1250	1:6250	1:50	1:250	1:1250	1:6250	1:50	1:250	1:1250	1:620
1					0,678	0,190	0,055	0,007	1,574	0,799	0,320	0,093
2					1,161	0,931	0,254	0,075	1,513	0,829	0,409	0,134
3					1,364	0,458	0,195	0,041	1,596	1,028	1,453	0,122
4					1,622	1,189	0,334	0,067	1,552	0,840	0,348	0,090
5					1,612	1,030	0,289	0,067	1,629	1,580	0,895	0,233
6					0,913	1,242	0,069	0,013	1,485	0,952	0,477	0,145
7					0,910	0,235	0,058	0,014	1,524	0,725	0,269	0,069
8					0,747	0,234	0,058	0,014	1,274	0,427	0,116	0,029
stř. titr	0,048	0,021	0,011	0,002	1,133	0,564	0,164	0,037	1,518	0,896	0,411	0,411

preimunní vzorek představuje průměr ze dvou sad jamek obsahujících sérum z jednotlivé myši imunizované rekombinačním antigenem enterotoxinu B Staphylococcus (SEB). Tento antigen není imunologický příbuzný toxinů C. botulinum a poskytuje kontrolní sérum ² průměr ze zdvojených jamek

Výsledky uvedené v tabulce 41 demonstrují, že jak protein pMBot, tak protein pHisBot je u myší imunogenní, protože 100 % myší (8/8) v každé skupině sérokonvertovalo z neimunního do imunního stavu. Výsledky dále ukazují, že průměrný titr IgG proti toxoidu typu A C. botulinum je po imunizaci proteinem pHisBot 2 až 3krát vyšší oproti proteinem pMBot. Z toho vyplývá, že protein pHisBot může být lepším imunogenem než protein pMBot.

-118CZ 296806 B6

Příklad 27

Imunizace rekombinačním proteinem pHisBot vytváří neutralizující protilátky

Výsledky uvedené v příkladu 26 demonstrují, že jak protein pHisBot, tak protein pMBot je schopen indukovat v imunizovaných hostitelích vysoký titr protilátek reaktivních proti toxoidu typu A C. botulinum. Pomocí myšího neutralizačního testu, popsaného v příkladu 23b, byla zjišťována schopnost imunního séra z myší, imunizovaných buď proteinem pHisBot nebo pMBot, neutralizovat toxoid typu A C. butolinum in vivo.

Dvě skupiny po osmi myších BALBc, imunizované v příkladu 26 buď proteinem pMBot, nebo proteinem pHisBot, dostaly po jednom týdnu po odebrání krve v den 77 další posilovači dávku. Tato dávka byla provedena smísením proteinu pMBot (v PBS s obsahem 10 mM maltózy) nebo proteinu pHisBot (v 50 mM NaHPO₄, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu, pH 4,0) s Gerbuho adjuvans podle příkladu 26. Každá myš dostala IP injekci 100 μΐ směsi antigen/adjuvans (50 pg antigenu plus 1 pg adjuvans). 6 dní po této posilovači dávce byla myším odebrána krev a sérum z myší ve skupině bylo spojeno. Rovněž bylo odebráno sérum preimunních myší (toto sérum je stejné jako sérum uvedené v poznámce k tabulce 40).

Přítomnost neutralizujících protilátek ve spojeném nebo preimunním séru byla detekována imunizací myší 5 jednotkami LD₅₀ toxoidu typu A smíšeného se 100 μΐ spojeného séra. Imunizace byla prováděna smísením (pro každou ošetřovanou myš) 100 μΐ séra z každé skupiny se 100 μΐ čištěného standardu čištěného toxinu typu A (50 LD₅₀/ml připraveného podle příkladu 23b) a 500 μΐ gel-fosfátu. Tyto směsi byly inkubovány 30 min při teplotě místnosti s občasným zamícháním. Směsi byly injekčně IP aplikovány každé ze čtyř myší (0,7/myš). Po dobu 72 h byly myši sledovány z hlediska znaků botulismu. Myši, které dostaly toxin smísený se sérem z myší imunizovaných buď proteinem pHisBot, nebo pMBot, nevykazovaly žádné znaky intoxikace botulismem. Naproti tomu myši, které dostaly preimunní sérum, během méně než 24 h uhynuly.

Tyto výsledky demonstrují, že použije-li se jako imunogen kterýkoli z rekombinačních proteinů pHisBot nebo pMBot fragmentu C C. botulinum, jsou indukovány protilátky schopné neutralizovat toxin typu A C. botulinum.

Příklad 28

Exprese a čištění rekombinačních proteinů toxinu A C. difficile, obsahujících interval 1870-2680, 1870-2190 a 1960-2680

Jiní autoři již vytvořili protilátky proti toxinu A. C. difficile aktivní imunizací křečků proti rekombinačnímu polypeptidů umístěnému v oblasti intervalu 6 [Lyerly D.M. a d. (1990), Curr. Microbiol. 21:29]. Struktura rekombinačního klonu, použitého Lyerlym a d. [(1990), Curr. Microbio.. 21:29], je schematicky znázorněna na obr. 31 jako pUC 1960-2680.

Na obr. 31 jsou použity následující zkratky pP označuje vektor pET23, pM označuje vektor pMal-c, pGEX označuje vektor pGEX, Trx označuje thioredoxin, pUC označuje vektor pUC9, A označuje toxin A C. difficile. Čísla označují interval aminokyselin, exprimovaný v daném konstruktu. Plné černé čtverečky přestavují kódující oblasti, prázdný čtvereček na 3' konci konstruktu pUC1960-2680 představuje část α-peptidu genu lacZ, který jek kódován sekvencemi vektoru. Plné oválky představují MBP. „HHH“ představuje polyhistidinový úsek. Prázdné kroužky představují thioredoxin. Srafované oválky představují GST.

-119CZ 296806 B6

S použitím křeččího modelu nemoci související s C. difficile, (CDAD), kdy se protilátky podávají profylakticky, byly pouze protilátky Lyerlyho a d. (intra-interval 6; pUC 1960—2680) schopny částečně chránit křečky proti infekci C. difficile, hodnoceno přežitím (přežila 4 z 8 zvířat), a tyto protilátky navíc nezabránily u žádného zvířete průjmu. Zvířata ošetřovaná protilátkami intra-interval 6 [Lyerly a d. (1990), viz výše] navíc po skončení ošetření uhynula. Naproti tomu bylo v příkladu 16 demonstrováno, že pasivní aplikace protilátek proti intervalu 6 (anti-pMA1870-2680) zabraňuje průjmu u 6 ze 7 zvířat a v modelovém systému profylaktického ošetření kompletně brání úhynu v důsledku CDAD. Pasivní aplikace protilátek proti intervalu 6 navíc poskytuje dlouhodobé vyléčení (tj. léčbu je možno bez nehody zastavit).

Zatímco se o Lyerlyho protilátkách uvádí, že poskytuje určitou ochranu proti CDAD, nebyl zaznamenána integrita a čistota rekombinačního proteinu exprimovaného z konstruktu pUC1960-2680. Konstrukt pUC1960-2680 potenciálně exprimuje ve vektoru pUC9 interval a 1960-2680 toxinů A C. difficile·, tento interval je uložen v klonu pMAl 870-2680 (viz obr. 31).

Tento příklad zahrnoval: (a) konstrukci pUC 1960-2680 a charakterizaci exprimovaného proteinu Western blot analýzou, (b) klonování a expresi intervalu 1960-2680 jako afinitně značeného proteinu ve vektorech pET a pMal a (c) afinitní čištění a charakterizaci rozpustných proteinů, značených MBP, z klonů exprimujících intervaly 1870-2680, 1870-2190 nebo 1960-2680.

a) Konstrukce pUC 1960-2680 a charakterizace exprimovaného proteinu Western blot analýzou

Konstrukt pUC1960-2680 obsahuje fragment genu toxinů A C. difficile, kódující 33 z 38 opakujících se jednotek; tento konstrukt byl vytvořen, aby poskytl stejný rekombinační protein, jaký použit Leyrly a d. [(1990) Curr. Microbio.. 21:29] pro vytvoření protilátek proti toxinů a C. difficile. pUC1960-2680 byl konstruován tímto způsobem: Stručně řečeno byl z pPAl 100-2680 (příklad 11) odebrán fragment Pstl, obsahující repetice toxinů A. C. difficile, a klonován do pUC9, který byl rozštěpen Pstl a defosforylován. Defosforylační reakce byla provedena s použitím telecí střevní alkalické fosfatázy (CIP) podle pokynů výrobce (New England Biolabs). Po restrikčním štěpení a ošetření CIP byly reakční produkty rozděleny na agarózovém gelu a příslušné fragmenty byl vyříznuty, smíseny a čištěny pomocí soupravy Prep-a-Gene (BioRad). eluovaná DNA byla ligována, transformována do kompetentních buněk JMI09 a byly izolovány rekombinační klony a potvrzeny restrikčním štěpením s použitím standardních metod molekulární biologie. Plazmidová DNA byla izolována pomocí soupravy QIA-prep spin plazmid (Qiagen).

Byly kultivovány JM109 obsahující konstrukt pUC1960-2680, indukovány a popsány způsobem [Lyerly a d. (1990), Curr Microbiol. 21:29] byly připraveny totální a rozpustné extrakty. Stručně řečeno bylo 500 ml kultury média Terrifíc inokulováno pUC1960-2680 (v JM109) a kultivováno při 37 °C do časné stacionární fáze/0,8 OD₆₀o)· Byl přidán IPTG do konečné koncentrace 1 mM a kultura byla indukována po dobu 2 h. Před přídavkem IPTG byl odebrán alikvot 1 ml kultury a soužil jako neindukovaný vzorek. Po 2 h kultivace v přítomnosti IPTG byl odebrán další alikvot 1 ml kultury a sloužil jako indukovaný vzorek. Oba tyto vzorky byly zpracovány následovně. Bakterie byly peletovány odstředěním. Pelety buněk byly resuspendovány ve 100 μΐ 2x vzorkového pufru (0,125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2mM EDTA, 6% SDS, 20% glycerolu, 0,25 % bromfenolové modři; před použitím byl přidán β-merkaptoethanol do 5 %).

Zbylá kultura pak byla zpracována pro přípravu totálního a rozpustného extraktu pro analýzu. Kultura byla rozdělena do 500 ml odstředivkových lahviček. Lahvičky byly 15 min chlazeny v lázni ledu a vody a buňky byly peletovány odstředěním při 5000 min'¹ v odstředivce Beckman JA10. Peleta buněk byla resuspendována v 1/10 počátečního objemu kultury (tj. 50 ml) TBS (0,05 M tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH 7,5) a rozdělena do dvou 35 ml zkumavek Oakridge. Do každé zkumavky bylo přidáno 1,25 ml 10 mg/ml roztoku lysozymu (v TBS) a směsi byly inokulovány 20 min na ledu. Zkumavky byly ponechány přes noc při -70 °C. Jedna ze dvou zkumavek

-120CZ 296806 B6 z indukované kultury pak byla rozmražena a sonifíkována na ledové vodě s použitím čtyř dvacetisekundových impulsů (Branson Sonifíer model 450 nastavený na hodnotu 5 až 6). Vzorek byl vyčeřen odstřeďováním po dobu 20 min při 9000 min'¹ (Beckman J2-21) a rozpustný lyzát byl sterilně filtrován přes filtr 0,45 pm. Pro elektroforézu byl připraven totální (před odstředěním) a rozpustný (po sterilní filtraci) extrakt smísením 4 μΐ extraktu se 16 μΐ PBS a 20 μΐ 2x vzorkového pufru.

Vzorky proteinů byly rozděleny elektroforézou na gelu 12,5 % SDS-PAGE a proteiny byly detekovány buď barvením Coomassie blue (detekuje všechny proteiny) a analýzou Westernových blotů (detekuje specifické proteiny) s použitím kozí protilátky specifické proti toxinu A (TechLebs) následovně. Na gely 12,5 % SDS-PAGE byly naneseny vzorky proteinů. Po elektroforéze byl gel rozdělen na dva díly polovina byla obarvena Coomassie blue a proteiny na druhé polovině byly přeneseny na pevný nosič pro analýzu westernových blotů. Přenos proteinů byl potvrzen barvením pomocí Ponceau S (jako v příkladu 12b). Blot byl pak inkubován po dobu 1 h při 20 °C a PBS s obsahem 0,1 % Tween 20 (PBST) a 5 % mléka (blokující pufr). Pak bylo přidáno 10 ml roztoku obsahujícího ředění 1/1000 afinitně čištěné kozí protilátky proti toxinu A C. difficile (Těch Lab) v blokujícím pufru a blot byl indukován 1 h při teplotě místnosti. Pak byl blot promyt a přítomnost navázané protilátky proti C. difficile byla detekována pomocí králičího antikozího konjugátu alkalické fosfatázy jako sekundární protilátky, jak je uvedeno v příkladu 3. Výsledný gel, obarvený Coomassie blue, a vyvinutý Westemův blot jsou znázorněny na obr. 32.

Na obr. 32 je gel obarvený Coomassie blue znázorněn vlevo (pruhy 1 až 5) a Westernův blot vpravo (pruhy 6 až 9). Jsou použity tyto zkratky: neindukovaný (U), indukovaný (I), totální (T), rozpustný (S) a molekulární markéry pro široké rozmezí (M; BioRad). Velikost markérů molekulové hmotnosti je uvedena čísly napravo od pruhu 5. Obr. 32 ukazuje, že barvením Coomassie blue nejsou detekovatelné indukované pásy odpovídající velikosti očekávané pro rekombinační protein pUC 1960-2680. Detekce materiálu, reaktivního s toxinem A C. difficile, Westernovým blotem však odhalila převládající indukovatelný protein o molekulové hmotnosti předpokládané pro plnou délku rekombinačního proteinu toxinu A C. difficile. Přestože je určitá část indukovaného proteinu rozpustná, jeho většina je nerozpustná [srovnej množství proteinu reaktivního s protilátkou přítomnou v pruzích 8 (celkový) a 9 (rozpustný)]. Rekombinační protein, produkovaný p UC1960-2680, byl rovněž jasně nestabilní, protože rozkladné produkty byly detekovány i v neindukovaných (pruh 6) nebo indukovaných (pruh 7) vzorcích kultury.

b) Klonování a exprese intervalu 1960-2680 jako afinitně značeného proteinu ve vektorech pET a pMal

Jak výše prokázáno, je protein produkovaný konstruktem pUC 1960-2680 nestabilní (tj. náchylný k proteolytické degradaci) a dále nemá afinitní značku. Nestabilita proteinu pUC 1960-2680 může být důsledkem přítomnosti α-peptidu genu lacZ na C-terminálním konci fúzního proteinu; je známo, že přítomnost těchto sekvencí na fúzním proteinu vede k produkci nestálého proteinu. Za účelem zjištění, zdaje možno izolovat rozpustný stabilní afinitně čištěný fúzní protein představující interval pUC1960-2680, byly připraveny následující dva konstrukty: Konstrukt pPAl960-2680 obsahuje interval 1960-2680 toxinu A C. difficile ve vektoru pET23c (Novagen). Řada vektorů pET23 umožňuje expresi vložených genů ve formě fúzního proteinu obsahujícího polyhistidinovou značku buď na C-terminálním, nebo N-terminálním konci fúzního proteinu; konstrukt pPAl 960-2680 exprimuje repetiční oblast toxinu A C. difficile jako fúzní protein obsahující C-terminální polyhistidinový úsek. Konstrukt pMA1960-2680 obsahuje interval 1960-2680 toxinu A C. difficile ve vektoru pMal-c (New England BioLabs) a exprimuje fúzní protein, obsahující na N-terminálním konci MBP.

Konstrukt pPA1960-2680 byl získán následně: Způsoby uvedenými v odstavci (a) byl izolován klon pUC 1960-2680, v němž byl 2,1 kb fragment Pstl v opačné transkripční orientaci (vzhledem ke směru transkripce skrz sekvence LacZ na vektoru). Insert toxinu A C. difficile byl oddělen

-121 CZ 296806 B6 štěpením BamHI a HindlII a způsobem uvedeným v odstavci (a) byl klonován do vektoru pET23c (Novagen), štěpeného pomocí TLzmHI a F/zníZUI.

Konstrukt pMAl 960-2680 byl vytvořen klonováním repetí ční oblasti toxinu A C. difficile, z pPAl960-2680 ve formě Nhel-HindW. fragmentu do vektoru pMal-c, štěpeného Xbal (konce Xbal jsou kompatibilní s konci Nhel) a HindGL

Exprese rekombinačního proteinu z těchto dvou plazmidů byla hodnocena v malém měřítku v kulturách pěstovaných při 30 °C s použitím hostitelů BL21(DE3)pLysS (pPA 1960-2680) nebo BL21pLysS (pMA1960-2680). Byly měněny tyto podmínky: kultivační médium (2X YT, LB, Terrific) a množství induktoru (0,1, 0,3 nebo 1,0 mM IPTG). Byly testovány všechny kombinace těchto proměnných [kromě média Terrific, v němž byla testována pouze jedna koncentrace (1 mM) IPTG]. Množství rekombinačního proteinu, exprimovaného po indukci, a rozpustnost rekombinačního proteinu byla hodnocena SDS-PAGE analýzou celkového a rozpustného extraktu (připraveného ze vzorků po 1 ml, jak je uvedeno v příkladu 25). Všechny kultury byly pěstovány v 15 ml zkumavkách (Falcon 2057); veškeré kultivační médium bylo přes noc předehřátou na příslušnou teplotu a doplněno 100 pg/ml ampicilinu a glukózou do 0,2 %. Kultury byly pěstovány v inkubátoru na otočném disku (k zajištění provzdušňování) do hodnoty OD₆₀o přibližně 0,5 až 0,7 a indukovány uvedenou koncentraci IPTG.

Ve všech případech byla pozorována vysoká úroveň exprese nerozpustného proteinu pPAl960-2680 bez ohledu na použité médium nebo koncentraci induktoru. Protein pMAl960-2680 byl za všech testovaných podmínek částečně rozpustný, přičemž maximální množství rozpustného proteinu bylo produkováno v médiu 2X YT při nižších koncentracích induktoru (tj. 0,1 a 0,3 mM IPTG).

Tyto výsledky demonstrují, že exprese intervalu 1960-2680 toxinu A C. difficile v konstruktu pPY 1960-2680 vede za testovaných podmínek k produkci nerozpustného rekombinačního proteinu. Exprese tohoto intervalu v konstruktu pMAl960-2680 umožnila expresi určitého množství rozpustného proteinu.

c) Afinitní čištění a charakterizace rozpustných MBP-značených proteinů z konstruktů exprimujících intervaly 1870-2680, 1870-2190 nebo 1960-2680 toxinu A C. difficile.

Byly pěstovány větší (1 litr) kultury vektoru pMal-c(tj. velkou neobsahujícího insert) a každého z dále uvedených konstruktů, načet byly indukovány a byly izolovány frakce rozpustného proteinu: pMA 1870-2190 (příklad 17), pMA1960-2680 (příklad 28b) a pMA1870-2680 [příklad 11: interval 6; interval 6 obsahuje aminokyselinové zbytky 1873 až 2684 (SEQ ID NO: 29) proteinu toxinu A C. difficile). Tyto kultury byly pěstovány při 32 °C v médiu 2X YT a exprese rekombinačního proteinu byla indukována přídavkem IPTG to 0,3 mM při OD₆₀o 0,6. Kultury byly indukovány po dobu 4 až 5 h a pak byly buňky získávány. Byly připraveny extrakty rozpustných proteinů a podrobeny afinitní chromatografií za účelem izolace rekombinačního fúzního proteinu (příklad lid) a analyzovány barvením Coomassie a Westernovou analýzou (popsanou v příkladu 1 lb).

Stručně řečeno byly připraveny rozpustné extrakty a naneseny v PBS na sloupec amylózové pryskyřice (New England Biolabs). Sloupec byl eluován PBS s obsahem 10 mM maltózy. Výtěžek proteinu činil pro každý rekombinant 40 mg na 11 výchozího objemu (tj. 11 kultury). Vzorky proteinů byly analyzovány elektroforézou na 7,5% SDS-PAGE gelech s následným barvením Coomassieovou modří a analýzou Westernových blotů, jak je uvedeno v odstavci (a). Vzorky proteinů byly připraveny elektroforézou smísením 1 μΐ celkového (T) nebo rozpustného (S) proteinu s 4 μΐ PBS a 5 μΐ 2X vzorkového pufru nebo 5 μΐ eluovaného (E) proteinu a 5 μΐ 2X vzorkového pufru nebo 0,5 μΐ eluovaného proteinu, 4,5 μΐ PBS a 5 μΐ 2X vzorkového pufru (1/10E). Na gelu byly rovněž rozděleny vzorky pMA1870-2680 a pPA1870-2680 (preparáty

-122CZ 296806 B6 inkluzních tělísek popsané v příkladu 11). Vzorky byly zahřívány 5 min na 95 °C, pak ochlazeny a naneseny na gel 7,5 % SDS-PAGE. Byly naneseny rovněž markéry širokého rozmezí molekulové hmotnosti (BioRad) pro odhad molekulové hmotnosti identifikovaných fúzních proteinů.

Po elektroforéze byl protein detekován barvením Coomassieovou modří nebo byly proteiny podrobeny Westemovu blotu s použitím kozí protilátky proti toxinu A (Těch Labs), jak je uvedeno v odstavci (a). Výsledný gel a Westernův blot je znázorněn na obr.33.

Na obr. 33 je gel barvený Coomassieovou modří znázorněn vlevo (pruhy 1 až 10) a Westernův blot vpravo (pruhy 1' až 10'). Pruhy 1 až 10 a 1' až 10' představují navzájem zrcadlové obrazy a obsahuje tyto vzorky: pruhy 1 a 1' obsahují pMA1870-2190 (T), pruhy 2 a 2' obsahují pMAl 870-2190 (E), pruhy 3 a 3' obsahují pMA1960-2680 (T), pruhy 4 a 4' obsahují pMA1960-2680 (S), pruhy 5 a 5' obsahují pMA1960-2680 (E), pruhy 8 a 8' obsahují pMA1870-2680 (1/10 E), pruhy 9 a 9' obsahují pPA1870-2680 (N/C) (E) [pPA1870-2680(N/C) je popsán v příkladech 15 a 29d] a pruhy 10 a 10' obsahují markéry molekulové hmotnosti.

Výsledky znázorněné na obr. 33 demonstrují, že:

1) Protein pMAl 870-2190 byl za použitých růstových podmínek nestálý, ale alespoň částečně rozpustný. Afínitně čištěný preparát pMA1870-2190 však neobsahuje významné koncentrace fúzního proteinu o plné délce (obr. 33, pruh 2).

2) Protein pMAl960-2680 byl částečně rozpustný (srovnej pruhy 3' a 4' na obr. 33) a integrita afínitně čištěného proteinu (obr. 33, pruhy 5' a 6') byla srovnatelná s preparátem pMAl870-2680 (obr. 33, pruh 2).

3) Proteiny plné délky pMAl960-2680, pMAl 870-2680 a pPAl 870-2680 vážou protilátku proti toxinu A C. difficile, zatímco protein plné délky pMA1870-2190 ji neváže (avšak menší rozkladné produkty proteinu pMAl 870-2190 se na protilátku vážou, jak je znázorněno na obr. 33, pruhy 1' a 2'). To implikuje, že buď jsou epitopy identifikované protilátkou přítomny pouze na C-terminálním konci repetic, nebo že protilátky rozpoznávají konformaci, která nemže vzniknout s N-terminálním fragmentem, představovaným pMA1870-2190. Toto zjištění je podobné nedostatku reaktivity N-terminálních fragmentů genu toxinu B C. difficile (pMB 1750-1970) s protilátko proti toxinu B (Těch Labs) na Westernových blotech, pozorovanému v příkladu 19b (obr. 24).

Výše uvedené výsledky poskytují postup získání afínitně čištěného rekombinačního proteinu toxinu A C. difficile z intervalů 1870-2190 a 1960-2680. Tyto výsledky jsou v rozporu s výsledky získanými při použití konstruktu pUC 1960-2680, který byl připraven podle popisu Lyerlyho a d. [(1990) Curr. Microbiol. 21:29]. Protein exprimovaný konstruktempUC 1960-2680 byl převážně nerozpustný a nemohl být afínitně čištěn pro nepřítomnost afínitní značky na rekombinačním proteinu.

Příklad 29

Čištění rozpustného proteinu pPAl 870-2680 (N/C), v podstatě prostého endotoxinu

Pro potenciální použití jako humánní vakcína (tj. pro vyvolání aktivní imunity) nebo jako antigeny v hostitelském živočichovi pro vyvolání tvorby ochranných protilátek (tj. antitoxinu) pro pasivní imunizaci lidí je třeba, aby proteinový antigen byl 1) snadno čistitelný, 2) dobře charakterizovatelný a s vysokou čistotou, 3) s nízkým obsahem pyrogenů (používá-li se jako humánní vakcína), 4) imunogenní a 5) schopný indukovat ochrannou imunitní odpověď. V případě repetičního antigenů toxinu A C. difficile musí být protein rozpustný a schopný zaujímat konformaci,

-123CZ 296806 B6 která vyvolá ochrannou reakci. Jak bylo prokázáno v příkladu 17, byl-li protein pPAl 8702680(N/C), který byl exprimován jako nerozpustný protein uvnitř inkluzních tělísek, solubilizován pomocí SDS a pak použit k imunizaci kuřat, nebyly produkovány žádné ochranné protilátky proti toxinu A.

V tomto příkladu byly exprimovány rekombinační proteiny toxinu A C. difficile a hodnoceny s použitím výše uvedených kriterií z hlediska použitelnosti pro vakcíny. Tento příklad zahrnoval:

a) hodnocení použitelnosti afinitně čištěného proteinu pMAl870-2680 jako vakcínového antigenu, b) konstrukci, čištění a hodnocení proteinu pGA 1870-2680, c) vývoj postupu pro produkci rozpustného pPAl870-2680, d) konstrukci pPA1870-2680(N) a čištění N, C a N/C-his značeného proteinu 1870-2680 ve velkém měřítku, e) konstrukci pPTrxA1870-2680(N) (C) a (N/C) a čištění N, a C a N/C-his značených proteinů Trx 1870-2681 ve velkém měřítku, f) afínitní čištění proteinů pPA1870-2680 a pPB1750-2360 ve velkém měřítku a stanovení hladin endotoxinu a g) konstrukci, afínitní čištění pPB 1750-2360 (N/C) ve velkém měřítku a stanovení hladin endotoxidnů.

a) Hodnocení použitelnosti afinitně čištěného proteinu pMAl 870-2680 jako vakcínového antigenu.

I když se ukázalo, že protein pMA-1870-2680 (příklad 11) je snadno čistitelný, imunogenní a schopný indukovat ochrannou odpověď (příklad 17), je možnost použít tento protein jako vakcínu limitován špatnou čistotou afinitně čištěného proteinu (vi obr. 33, pruhy 7' a 8'). Bylo odhadnuto, že pouze 50 % afinitně čištěného proteinu představuje fúzní protein plné délky. Zbytek proteinů v afinitně čištěném preparátu, jak bylo zjištěno, je primárně MBP samotný a kontaminující protein E. coli.

Za účelem zjištěním, zdaje možno použít afinitně čištěný protein pMAl870-2680 jako případnou vakcínu, byl stanoven obsah endotoxinu ve dvou nezávisle afinitně čištěných preparátech pMAl870-2680. Obsah pyrogenů ve vzorku byl zjišťován testem Limulus (kit LAL; Associates of Cápe Cod), jak je popsán v příkladu 24d. Bylo zjištěno, že oba vzorky afinitně čištěného pMAl 870-2680 obsahují vysokou hladinu endotoxinu (>50000 EU/mg čištěného rekombinačního proteinu). Jak je zřejmé z příklad 24a a 24b, bylo zjištěno, že vysoká endotoxinová zátěž je obecným znakem afinitně čištěných fúzních proteinů MBP nebo MBP samotného. Výše uvedené výsledky naznačují, že fúzní proteiny toxinu A C. difficile,afinitně čištěné současnými postupy, nejsou vhodné pro použití jako vakcínové antigeny.

Expresní konstrukt pMAl870-2680 byl navržen pro usnadnění čištění proteinu toxinu A od značky MBP rozštěpením fúzního proteinu na vytvořeném místě štěpení faktorem Xa, umístěném mezi doménou MBP a doménou proteinu toxinu A. Byla hodnocena schůdnost získávání v podstatě endotoxinu prostého propustného proteinu toxinu A C. difficile čištěním odštěpeného proteinu toxinu A C. difficile od fúzního proteinu MBP-toxin A. Faktor Xa (New England Biolabs) byl přidán k afinitně čištěnému proteinu pMA 1870-2680 (poměr 0, 0,2, 0,5, 1,0 a 2,5 % faktoru Xa/protein pMAl 870-2680) v PBS s obsahem 10 mM maltózy a směsi byly inkubovány 5,5 a 20 h při teplotě místnosti. Rozsah štěpení byl hodnocen barvením proteinů pomocí Coomassie blue po elektroforéze na gelech SDS-PAGE.

Výsledky prokázaly, že u vzorku s 2,5 % faktoru Xa bylo zaznamenáno určité štěpení po 20 h, ale toho štěpení bylo pouze částečné. Naznačuje to, že štěpení pMA 1870-2680 s použitím výše testovaných reakčních podmínek není účinná purifíkační strategie pro získání rozpustného endotoxinu prostého repetičního proteinu toxinu A C. difficile.

b) Konstrukce, čištění a hodnocení proteinu pG 1870-2680

Pro usnadnění hodnocení proteinů obsahujících GST jako prostředku pro velkoobjemovou produkci antigenů byly repetice toxinu A C. difficile exprimovány jako fúze s GST. Repetice toxinu

-124CZ 296806 B6

A C. difficile byly izolovány štěpením pPAl 100-2680 (příklad 11) Spěl s následným ošetřením

Klenowovým fragmentem pro vyplnění konců; Dna pak byla štěpena pomocí Xhol. Fragment

Spěl (Klenowem vyplněný) Xho\ byly klonovány do EcoRI (Klenowem vyplněnýj-AT/ol-štěpeného vektoru pGEX3T (Pharmacia) za vzniku expresního konstruktu pGAl870-2680.

Velkoobjemová (1 litr) kultura pGAl 870-2680 [v hostitelských buňkách BL21 (Novagen)] byla pěstována v médiu 2X YT s obsahem 50 pg/ml ampicilinu a indukována (s použitím IPTG do 1,0 mM) po dobu 3 h při 30 °C způsobem popsaným v příkladu 28. Byl připraven rozpustný lyzát velkoobjemové kultury pGAl870-2680 (resuspendované v PBS) a použit kafinitnímu čištění rozpustného afinitně značeného proteinu. Lyzát pGAl 870-2680 byl afinitně čištěn na pryskyřici glutathionagaróza (Pharmacia) postupem podle [Smith a Corcoran, Current Protocols inMolecular Biology, Suppl. 28 (1994), str. 16.7.1—16.7.7] s výjimkou, že navázání proteinu na pryskyřici probíhalo po dobu 1 h při 4 °C.

Stručně řečeno byly po 3 h indukce 1 1 kultury buňky získány odstředěním po dobu 10 min při teplotě místnosti při 5000 g. Peleta buněk byla resuspendována v 10 ml ledově chladného PBS. Pak byly buňky porušeny sonifikací, jak je uvedeno v příkladu 24 d. Byl přidán Triton X-100 do konečné koncentrace 1 % a vzorek byl důkladně promíchán. Nerozpustný odpad byl odstraněn odstřeďováním vzorku po dobu 5 min při 4 °C při 10 000 g. Supematant byl opatrně odebrán a přidán k 1 ml 50% suspenze glutathion-agarózovým kuličkám (Pharmacia). Směs byla ponechána inkubovat po dobu 1 h při 4 °C pro navázání GST-značeného fúzního proteinu na pryskyřici. Glutathion-agarózové kuličky pak byly promyty přídavkem 50 ml ledově chladného PBS, rozmícháním a odstřeďováním po dobu 10 s při teplotě místnosti při 500g. Promývací krok byl dvakrát opakován (tj. celkem 3 promytí). Pryskyřice byla resuspendována v 1 ml ledově chladného PBS a přenesena do 1,5 ml mikrocentrifugovací nádobky. Pryskyřice byla peletována odstředěním po dobu 10 s při teplotě místnosti při 500 g. Supematant byl odebrán a fúzní protein byl z pryskyřice vymyt přídavkem 1 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) a 5 mM redukovaného glutathionu. Nádobka byla 2 min mírně promíchávána a pak odstřeďována 1% s při teplotě místnosti při 500 g. Eluce byla dvakrát opakována a supematanty byly spojeny. Spojený supematant, obsahující eluovaný fúzní protein, byl uchováván v roztoku obsahujícím 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM redukovaného glutathionu a 10 % glycerolu. Obsah endotoxinů v čištěném fuzním proteinu byl stanoven s použitím Kitu LAL, jak je uvedeno v příkladu 24d.

Vzorky ze stupně kultivace, indukce a čištění (neindukovaným indukovaným totální, rozpustný a afinitně čištěný eluát) byly děleny na gelech SDS-PAGE a proteiny byly detekovány barvením Coomassieovou modří (jak uvedeno v příkladu 28). Bylo zjištěno, že fúzní protein je částečně rozpustný (tj. většina proteinu zůstala v peletě) a afinitně čištěno bylo přibližně 0,5 mg/1 výchozí kultury proteinu převážně plné délky. Afinitně čištěný preparát obsahoval přibližně 5000 EU/mg afinitně čištěného fúzního proteinu. Z těchto výsledků vyplývá, že za výše uvedených podmínek expresní systém pGEX neusnadňuje vysokou produkci rekombinačního fúzního proteinu toxinu A C. difficile a získaný protein obsahuje významnou kontaminaci endotoxinem.

c) Vývoj pracovního postupu pro produkci rozpustného pPAl 870-2680

V příkladu 11 bylo prokázáno, že indukovaný protein pPAl 870-2680, je-li produkován kultivací při 37 °C, je téměř zcela nerozpustný. Pro zjištění, zda je možno rozpustnost zvýšit expresí při nižší teplotě, byla pěstována kultura pPA 1870-2680 (N/C) při 30 °C a stanovena hladina rozpustného afinitně čistitelného proteinu. Rozpustný lyzát (v IX vazebném pufru Novagen) z indukovaného 1 1 kultury 2X YT byl připraven dále popsaným způsobem.

Stručně řečeno byla kultura pPAl 870-2680 (N/C) [v hostiteli BL21(DE3)pLysS] pěstována při °C do OD₆₀o 0,9 v 1 1 média 2X YT s obsahem 100 pg/ml ampicilinu, 34 pg/ml chloramfenikolu a 0,2 % glukózy. Exprese proteinu byla indukována přídavkem IPTG do 1 mM. Po 5 h indukce byly buňky po dobu 15 min chlazeny na lázni ledové vody a pak odstřeďovány 10 min

-125CZ 296806 B6 při 4 °C při 50000g v odstředivce JA10 (Beckman). pelety byl resuspendovány v celkovém objemu 40 ml IX vazebného pufru Novagen (5 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9), přeneseny do dvou nádobek Oakridge a zmrazovány po dobu alespoň 1 h na -70 °C. Nádobky byly rozmraženy a buňky lyžovány sonifíkací (4 x 20 s impulsy) na ledu s použitím přístroje Branson Sonifier 450 s nastavením výkonu na 6 až Ί. Suspenze byla vyčeřena odstředěním po dobu 20 min při 9000 min'¹ (10000 g) v přístroji JA-17. Rozpustný lyzát (po přídavku NP40 do 0,1 %) byl po dávkách absorbován do 7 ml suspenze 1:1 pryskyřice Ni-NTA (Qiagen) : vazebný pufr [50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl, 60 mM imidazolu (pH 8,0)] mícháním směsi po dobu 3 h při 4 °C. Suspenze byla nalita do kolony s vnitřním průměrem 1 cm (BoiRad) a promyta postupně těmito roztoky: 15 ml vazebného pufru s obsahem 0,1% NP40, 15 ml vazebného pufru, 15 promývacího pufru (40 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9). Navázaný protein byl eluován ve 200 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9.

Vzorky celkového, rozpustného a eluovaného proteinu byly děleny pomocí SDS-PAGE. Celkový protein byl detekován barvením gelu Coomassieovou modří. Čistěním se získalo 34 mg afínitně čištěného proteinu z 1 1 výchozí kultury (3,2 % celkového rozpustného extraktu), u něhož bylo zjištěno, že alespoň 90 až 95 % proteinu migrovalo jako jediný pás o předpokládané molekulové hmotnosti (90 kD) pro rekombinační fúzní protein toxinu A C. difficile [tj. protein pPA1870-2682(N/C)].

Tyto výsledky poskytují postup s použitím snížené teploty kultivace, který usnadňuje účinné čištění vysokých hladin rozpustného rekombinačního proteinu toxinu A. C. difficile s použitím expresního plazmidu pPA1870-2680(N/C).

d) Konstrukce pPAl 870-2680(N) a velkoobjemové čištění N, C a N/C His-značeného proteinu 1870-2680

Expresní plazmidy, které usnadňují expresi intervalu 1870-2680 toxinu A C. difficile buď s N-terminální značkou bis [pPAl870-2680 (N)], C-terminální značkou his [pPA18702680(C)], nebo se značkami his na C- i N- konci [pPA1870-2680(N/C)] byly hodnoceny z hlediska velkoobjemový produkce a afínitního čištění repetičního proteinu toxinu A. C. difficile.

Znaky expresních vektorů pPAl 870-2680© a pPAl 870-2680 (N/C) byly popsány v příkladech 11 a 15. V příkladu 112 byl pPA1870-2680(C) označen jako pPA1870-2682 a v příkladu 15 byl pPA1870-2680(N/C) označen jako pPA1870-2680(H). Pro jasnější identifikaci polohy polyhistidinového úseku (značky his) jsou plazmidy v dalším označovány příponami (C), (N) a (N/C). Tyto tři expresní plazmidy byly konstruovány následovně:

pPA1870-2680(C) byl konstruován vložením repetice toxinu A C. difficile, obsahující Fragment Spe\-Hindlll zpPA1000-2680 (příklad 11a) do vektoru pPET23b (Novagen), štěpeného Nhe\ a HindHí.

Plazmid pPA1870-2680(N/C) byl konstruován nahrazením promotorové oblasti pPAl 8702680(C), obsažené na fragmentu BglE-Ndél, odpovídajícím fragmentem BglE-Ndel z vektoru pET16B (Novagen).

Vektor pPA1870-2680(N) byl vytvořen štěpením pPA1870-2680(N/C) na C-terminálním místě Z/mJIII s následným ošetřením Klenowovým enzymem pro vyplnění vyříznutých konců. Ztupený plazmid pak byl ligací cirkularizován za vzniku pPA1870-2680(N).

Byly kultivovány velkoobjemové kultury pPA1870-2680(N) a pPA1870-2680(C) (s použitím hostitele BL21(DE3)pLysS), indukovány a rozpustný protein byl afínitně čištěn a eluován stejně jako v odstavci (c). V každém případě bylo získáno 10 až 20 mg afínitně čištěného proteinu

-126CZ 296806 B6 a analýzou SDS-PAGE bylo odhadnuto, že se jedná o více než z 50 % o protein plné délky.

Velká část proteinu pPA1860-2680(C) se však vymývala ve 40 mM promývacím pufru. Ve snaze identifikovat podmínky, které by nevedly keluci významných množství proteinu pPA1860-2680(C), byl proveden následující experiment.

Výše popsaným způsobem byl kultivován 1 1 kultury pPA1870-2680(C) a čištěn vazbou a použitím fosfátového pufru, promývacího a elučního pufru. Buňky byly resuspendovány ve fosfátovém vazebném pufru (50 mM NaPO₄, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazolu, pH 8,0) a postupně promyty ve fosfátovém vazebném pufru obsahujícím buď 20, 40, nebo 200 mM imidazolu. Rekombinační protein se vymýval při všech třech elucích (5,5, resp. 12,5, resp. 12 mg celkového proteinu), což ukazuje, že C-terminální his-značený protein není při koncentraci imidazolu 40 mM v žádném z použitých pufrovacích systémů pryskyřicí zadržován.

Z uvedených výsledků vyplývá, že rozpustný afínitně čištěný protein toxinu A C. difficile byl izolován z použitím kteréhokoli z expresních plazmidů pPAl 870-2680 (N), (C) nebo (N/C).

c) Konstrukce pPTrxA1870-2680(N), (C) a (N/C) a velkoobjemové čištění N, C a N/C his-značených proteinů Trx 1870-2680

Thioredoxinový (Trx) expresní systém (Invitrogen) byl vyvinut pro usnadnění exprese normálně nerozpustných nebo obtížně exprimovatelných proteinů. Geny jsou klonovány do vektoru pTrxFus a exprimovány jako fúze s thioredoxinovým proteinem E. col; toto spojení často propůjčuje fúznímu proteinu rozpustnostní charakteristiky thioredoxinu [La Vallie a d., (1993), Bio/Technology 11:187]. Vektor pTrxFus má však několik vlastností, které jsou po expresní vektor nežádoucí. Všechny plazmidy musejí být pěstovány ve specifických kmenech a kultivační médiích, protož exprese fúzního proteinu v tomto systému je indukovatelná tryptofanem. Kromě toho není promotor striktně kontrolován, takže při nižších teplotách (tj. 30 °C) dochází knízké expresi fúzního proteinu, konečně expresní vektor neobsahuje afinitní značku, která by usnadňovala vysokou hladinu afinitního čištění rozpustného fúzního proteinu.

Pro usnadnění konstrukce IPTG-indukovatelných afínitně značených fúzních proteinů Trx byl konstruován vektor pETHisTrx. Thioredoxinový gen pTrxFus (Invitrogen) byl vyříznut jako Wel-Ra/wHI fragment DNA a klonován do Ndel-ΒαηϊΆ štěpeného vektoru pETHisb (příklad 18) za vzniku vektoru pETHisTrx.

Ve vektoru pEtHisTrx je gen Trx exprimován z promotoru pEtlób a proto konstrukci C-terminálních genetických fúzí obsahuje před Trx N-terminální leader sekvenci pETlób a sekvenci histidinové značky a za genem Trx polylinker pET23b (od místa BízwiHI). Expresní konstrukty, které usnadňují expresi fúze Trx-interval 1870-2680 toxinu A jako N, C nebo N/C-terminální histidinové značky, byly konstruovány následovně.

Konstrukt pTrxA1870-2680(NPC) byl konstruován ligací Ndél-BarriRl (vyplněno) Trx genu (izolovaného z vektoru pTrxFus) a Spěl (vyplněno) -Xhól fragmentu obsahujícího gen 1870-2680 toxinu A C. difficile [izolovaného z konstruktu pPAl 100-2680 (příklad 11)] do Ndel-Xhol štěpeného vektoru pETHis (vyplněná místa Ra/nHI a Spe\ se ligují tupými konci a vytvářejí in-frame fúzi Trx-toxin A C. difficile).

Výše uvedená fúze Trx-toxin A C. difficile byla vyříznuta jako Ndel-Hindfil fragment a vložena do Ndel-HindW. štěpeného vektoru pET23a (Novagen) za vzniku pPTrxA1870-2680(C).

Místo Hindlll pPTrxA1870-2680(N/C) bylo štěpeno, vyplněno působením Klenowova enzymu a religováno za vzniku pPTrxA1870-2680(N).

Výše uvedené konstrukce byly prováděny standardními technikami molekulární biologie, popsanými v příkladu 29.

-127CZ 296806 B6

Byly pěstovány velkoobjemové kultury všech tří fúzí TrxA1870-2680 [tj. pPTrxA1870-260(C), pPTrxA1870-2680(N) a pPTrxA1870-2680(N/C)] a postupem uvedeným v odstavci (c) byl izolován rozpustný afínitně čištěný protein. Ve všech případech byly afínitně čištěné fúzní proteiny

Trx podobné, pokud jde o rozpustnost, výtěžek v mg/1 kultury a čistotu, s paralelními konstrukty pPAl 870-2680 N, C nebo N/C, popsanými v odstavci (d).

f) Velkoobjemové afínitně čištění proteinů pPAl 870-2680 a pPB1750-2360 a stanovení hladiny endotoxinů

Byly získány preparáty afínitně čištěných proteinů pPA1870-2680(N/C) (příklad 15) a pPB1750-2360 (příklad 15b) za účelem stanovení hladiny endotoxinů v čištěných vzorcích. Všechny pufry byly sterilně přefiltrovány a po celou dobu přípravy pufrů byly nošeny rukavice pro snížení endotoxinové kontaminace čištěných vzorků rekombinačních proteinů, zprostředkované pufrem. Velkoobjemové čištění proteinů pPA1870-2680(C) a pPB1750-2360 bylo prováděno následovně.

Stručně řečeno byly kultury pPA1870-2680(N/C) a pPB1750-2360 [v hostiteli BL21(DE3)pLysS] pěstovány při 30 °C do OD_éoo 1,0 v 1 1 média 2X YT s obsahem 100 pg/ml ampicilinu, 34 pg/ml chloramfenikolu a 0,2 % glukózy. Exprese rekombinačního proteinu byla indukována přídavkem IPTG do 0,3 mM. Po 5 až 6 h indukce byly buňky chlazeny po dobu 15 min v lázni ledu a vody a pak odstřeďovány 10 min při 4 °C při 5000 min'¹ v odstředivce JA10 (Beckman).. Pelety buněk byly přes noc zmrazovány při -70 °C a pak rozmraženy a resuspendovány v celkovém objemu 40 ml vazebného pufru (5 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 50 mM NaPO4, pH 8,0) a přeneseny do dvou 35 ml Oakridgeových nádobek. Buňky byly lyžovány sonifikací (8 x 20 s impulsy) postupem uvedeným v příkladu 29c. Suspenze byla vyčeřena odstřeďováním po dobu 30 min při 9000 min¹ (10000 g) v odstředivce JA-17 (Beckman). Supematant byl odebrán (tvoří rozpustný lyzát) a byl přidán NP40 do konečné koncentrace 1 %. Rozpustný lyzát (po přídavku NP40 do 0,1 %) byl po dávkách mícháním po dobu 3 h při 4 °C absorbován do 8 ml suspenze 1:1 pryskyřice NiNTA (Qiagen) : vazebný pufr. Suspenze byla 1 min odstřeďována při 500 g v 50 ml nádobce (Falcon), resuspendována v 5 ml vazebného pufru s obsahem 0,1 % NP40 a nalita do kolony o průměru 2,5 cm (BioRad). Pryskyřice pak byla promyta 20 ml vazebného pufru s obsahem 0,1 % NP40. Kolona byla připojena na UV monitor (ISCO) a pak promývána vazebným pufrem do ustavení základní hodnoty. Po ustavení základní hodnoty absorbance byla kolona promyta promývacím pufrem [20 mM (pPB1750-2360) nebo 40 mM (pPAl 870-2680) imidazolu, 0,5 M NC1, 50 mM NaPO4, pH 8,0] do nového ustavení základní hodnoty. Imidazol byl odstraněn promytím kolony 50 mM NaPO₄, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu, pH 7,0, a navázané proteiny byly eluovány 50 mM NaPO₄, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu, pH 3,5 až 4,0. Proteinové vzorky z různých stupňů čisticího procesu byly rozdělovány elektrofézou na gelu SDS-PAGE; vzniklý gel je znázorněn na obr. 34.

Obr. 34 znázorňuje gel, barvený pomocí Coomassie blue, a ukazuje stupně čištění. Vzorky proteinů byly pro elektroforézu připraveny smísením 1 μΐ celkového (T) nebo rozpustného (S) proteinu pro rozpustného proteinu po navázání na pryskyřici NiNTA a odstředění (A) se 4 μΐ PBS a 5 μΐ vzorkového pufru 2X SDS-PAGE nebo 5 μΐ eluovaného (E) proteinu a 5 μΐ 2X vzorkového pufru. Vzorky byly zahřívány 5 min na 95 °C, pak ochlazeny a naneseny na 7,5% SDS-PAGE gel. Byly naneseny rovněž markéry molekulové hmotnosti v širokém rozmezí (M; BioRad) pro odhad molekulové hmotnosti identifikovaných fúzních proteinů, po elektroforéze byl protein detekován obecně barvením gelu Coomassieovou modří. Na obr. 34 obsahují pruhy 1 a 4 protein z čištění proteinu pPAl 870-2680 a pruhy 5 až 8 obsahují protein z čištění proteinu pPB17502360.

Čištění vedlo k výtěžku přibližně 30 mg/1 afínitně čištěného proteinu z 1 1 výchozích kultur (2 až

2,5 % celkového rozpustného extraktu) u obou proteinů, z čehož alespoň 90 až 95 % proteinu

-128CZ 296806 B6 migrovalo jako jednotlivé pás o předpokládané molekulové hmotnosti (90 kD) pro rekombinační protein toxinu A C. difficile. N obou případech byla většina (tj. více než 90 %) indukovaného proteinu za použitých podmínek čištění rozpustná a kvantitativně navázaná na pryskyřici.

Hladina endotoxinu v čištěných rekombinačních proteinech byla stanovena s použitím kitu LAL (příklad 24d) a pro pPAl 870-2680(N/C) byla nižší než l,0EU/mg čištěného proteinu a pro pPB 1750-2360 vyšší než 250 EU/mg čištěného proteinu. Rozdíl hladin endotoxinu mezi těmito dvěma čištěnými rekombinačními proteiny může odrážet méně striktní promývání, použité během čištění proteinu PB1750-2360.

g) Konstrukce, velkoobjemové afinitní čištění pPB 1750-2360 (N/C) a stanovení hladiny endotoxinu

Jak výše uvedeno, afinitně čištěný protein pPB1750-2360 obsahoval vyšší hladinu endotoxinu než čištěný protein pPA1870-2680(N/C). Protein pPB1750-2360 obsahuje polyhistidinový úsek na karboxyterminálním konci, zatímco pPA1870-2680(N/C) obsahuje polyhistidinový úsek jak na aminoterminálním, tak na karboxyterminálním konci. Přítomnost polyhistidinového úseku na obou koncích fúzního proteinu umožnila použití striktnějších podmínek promývání během afinitního čištění pPA1870-2680(N/C) v porovnání s pPB1750-2360 (40 mM imidazolu versus 20 mM imidazolu).

Pro získání fúzního proteinu zahrnujícího interval 1750-2360 toxinu B C. difficile, obsahujícího polyhistidinový úsek jak je na aminoterminálním, tak na karboxyterminálním konci, byl následujícím způsobem konstruován pPB1750-2360(N/C). pPB1750-2360 (příklad 15b) byl štěpen Nde\ aXhól a 1,5 kb fragment Ndel!Xho\ byl izolován a vložen do vektoru pETHisb (příklad 18), štěpeného pomocí Nde\ a Xho. Pro tuto konstrukci byly použity rutinní postupy, popsané v předchozích příkladech.

Velkoobjemové čištění pPB 1750-2360(N/C) bylo prováděno stejně jako v odstavci (f) v případě pPB 1750-2360, stou výjimkou, že promývací pufr obsahoval 40mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 50 mM NaPO₄. pH 8,0. Po promývacím stupni byl imidazol odstraněn promytím kolony 50 mM NaPO₄, 0,3 M NaCl, 10% glycerolu, pH 7,0. Pak byla kolona propláchnuta 50 mM NaPO₄, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu, pH 3,0, ve snaze vymýt navázaný protein. Za těchto podmínek se pPB1750-2360(N/C) nevymýval.

Poté bylo velkoobjemové čištění opakováno výše uvedeným způsobem s tou výjimkou, že po promývacím stupni s použitím promývacího pufru s obsahem 40 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 50 mM NaPO₄, pH 8,0 byl navázán protein eluován s použitím roztoku s obsahem 200 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 50 mM NaPO₄, pH 8,0. Z eluovaného proteinu byly imidazol odstraněn dialýzou proti PBS.

Analýza eluovaného pPB1750-2360(N/C) na gelech SDS-PAGE, barvených Coomassie blue, odhalila jediný pás o molekulové hmotnosti, očekávané pro fúzní protein plné délky.

Hladiny endotoxinu v čištěném proteinu pPB1750-2360(N/C) byly stanoveny pomocí kitu LAL (příklad 24d). Byla prováděna nezávislá stanovení a byla zjištěna hladina endotoxinu 80, 300 nebo 450 EU/mg, čištěného rekombinačního proteinu. Bez omezení na určený konkrétní mechanismus se má za to, že nekonsistentní výsledky testu LAL, pozorované u pPB17502360(NPC), a vysoká hodnota pozorovaná u pPB 1750-2360 (viz odstavec f) je důsledkem nespecifické aglutinace komponent LAL uhlohydrátovými vazebnými jednotkami, přítomnými na sekvencích toxinu B C. difficile, přítomných na těchto proteinech. Bez ohledu na to, zde je skutečná hladina endotoxinu 80 nebo 450 EU/mg čištěného proteinu, představuje afinitně čištěný preparát PPB1750-2360(N/C) v podstatě endotoxinu prostý preparát rekombinačního proteinu (Podání 10 až 500 pg čištěného pPB1750-2360(NPC) by vedlo k zavedení pouze 4,5 až 225 EU; u 70 kg člověka činí toto množství endotoxinu 1,3 až 64,5 % maximální povolené dávky).

-129CZ 296806 B6

Výše uvedené výsledky poskytují postup pro afínitní čištění v podstatě endotoxinu prostých preparátů z rekombinačního repetičních proteinů toxinu A a B C. difficile ve vysokých výtěžcích.

Příklad 30

Čištění rozpustných proteinů pPA1870-2680(NPC), pPA1960-2680 a pPA1870-2190

V příkladu 29 byly popsány způsoby výroby rozpustných, v podstatě endotoxinu prostých vzorků pPA1870-2680(N), (C) nebo (N/C), které vedly k získání proteinů, splňujících počáteční kriteria stanovená pro produkci antigenů, tzn. že proteiny jsou 1) snadno čistitelné, 2) dobře charakterizované a o vysoké čistotě a 3) v podstatě endotoxinu prosté. V tomto příkladu byla zkoumána možnost produkovat podobně čistý antigen z expresních konstruktů pPA1870-2190 nebo pPA1960-2680. Tento příklad zahrnoval a) velkoobjemové čištění rozpustných proteinů pPAl 870-2190 a pPAl960-2680 a b) konstrukci vektoru pPTrxAl 870-2190 a velkoobjemové čištění rozpustného proteinu pPTrxl 870-2190.

a) Velkoobjemové čištění rozpustných proteinů pPA1870-2190 a pPA1960-2680

Dřívější pokusy o produkci afinitně čištěného proteinu s použitím vektorů pPA1870-2190 (příklad 17a) nebo pPAl960-2680 (příklad 28) byly neúspěšné, jak bylo zjištěno analýzou celkového a rozpustného proteinu produkovaného v maloobjemových kulturách. Rozpustnost™ vlastnosti proteinu, stanovené s použitím maloobjemových kultur nebo minikultur, se v důsledku rozdílností pufrů, podmínek sonifíkace apod. nemusejí přenášet na velkoobjemové kultury. Úspěšná exprese rozpustného repetičního proteinu toxinu A C. difficile, v podstatě prostého endotoxinu, s použitím konstruktů pPl870-2680 N, C nebo N/C, skutečně naznačuje, že podmínky použité pro solubilizaci těchto proteinů by mohly také zvýšit rozpustnost proteinů pPA 1870-2190 a pPAl960-2680. Tato hypotéza byla testována následovně.

Velkoobjemové kultury pPA1870-2190 a pPA1960-2680 byly pěstovány a rozpustný protein čištěn na pryskyřici Ni-NTA způsobem uvedeným v příkladu 29c. Pro pPA1960-2680 byl použit jak hostitel BL21(DE3), tak BL21(DE3)pLysS, a pro pPA1870-2190 byl použit hostitel BL21(DE3)pLysS. Kultura pPA1870-2680(N/C) [v hostiteli BL21(DE3)pLysS] byla pěstována při 30 °C od OD₆oo 0,9 v 1 1 média 2X YT s objemem 100 pg/ml ampicilinu a 0,2 % glukózy; jestliže použitý hostitel obsahoval plazmid LysS, bylo k uvedenému médiu přidáno 34 pg/ml chloramfenikolu. Exprese proteinu byla indukovány přídavkem IPTG do 1 mM. po 5 h indukce byly buňky chlazeny po dobu 15 min v lázni ledu a vody a pak 10 min odstřeďována při 4 °C při 5000 min'¹ v zařízení JA10 (Beckman). Pelety byly resuspendovány v celkovém objemu 40 ml lx vazebného pufru Novagen (5 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9), přeneseny do dvou 35ml Oakrigeových nádobek a zmrazovány po dobu alespoň 1 h při -70 °C. Poté byly nádobky rozmraženy a buňky lyžovány sonifíkací (impulzy 4 x 20 s s použitím zařízení Branson Sonifier 450 s nastavením výkonu na 6 až 7) na ledu. Suspenze byla vyčeřena odstřeďováním po dobu 20 min při 4 °C při 9000 min¹ (10000 g) v zařízení JA-17 (Beckman). Rozpustný lyzát (po přídavku NP40 do 0,1 %) byl po dávkách mícháním po dobu 3 h při 4°C absorbován do 7 ml suspenze 1:1 pryskyřice NiNTA (Oiagen):Novagen IX vazebný pufr. Suspenze byla vlita do kolony o vnitřním průměru 1 cm (BioRad) a promyta postupně těmito roztoky: 15 ml IX vazebného pufru Novagen s obsahem 0,1 % NP40, 15ml IX vazebného pufru Novagen, 15 promývacího pufru (40 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9). Navázaný protein byl eluován pomocí 200 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9.

Vzorky celkového, rozpustného a eluovaného proteinu (jak z vymývání 40 mM a 200 mM, tak eluční pufry) byly rozděleny pomocí SDS-PAGE. Celkový protein byl detekován barvením

Coomassie a protein reaktivní s toxinem A C. difficile (v případě pPA 1960-2680) byl detekován

-130CZ 296806 B6 pomocí Westernových blotů s použitím afínitně čištěné protilátky proti toxinu A způsobem, uvedeným v příkladu 28.

Výsledky těchto analýz ukazuje, že v případě proteinu pPA1870-219 bylo vymýváním 200 mM imidazolem vyčištěno pouze 600 pg proteinu/litr kultury. Protein toxinu A C. difficile byl s tímto konstruktem exprimován ve vysokých hladinách, avšak většina indukovaného proteinu byla nerozpustná. Protein pPA1870-2190 rovněž představoval méně než 10 % celkového eluovaného proteinu. U konstruktu pPA1960-2680 byl celkový výtěžek rozpustného afínitně čištěného proteinu buď 1 mg [hostitel B121(DE3)pLysS] nebo 200 pg [hostitel BL21(DE3)] ve 200 mM eluční frakci. Coomassie a Westernová analýza ukazuje, že protein pPAl960-2680 byl exprimován do vysoké hladiny, ale většina indukovaného proteinu byla nerozpustná, a že eluované proteinové preparáty obsahovaly pouze přibližně 20 % proteinu reaktivního s toxinem C. difficile.

Výše uvedené výsledky demonstrují, že podmínky použité pro solubilizaci proteinu pPAl870-2680 úspěšně nevytvořily rozpustný repetiční protein toxinu A C. difficile, exprimovaný buď konstruktem pPA1960-2680, nebo pPA1870-2190.

b) Konstrukce plazmidu pPTrxA1870-2190 a velkoobj emové čištění rozpustných proteinů

Pro stanovení, zda je možno zvýšit rozpustnost rekombinačních proteinů, zahrnujících interval 1870-2680 toxinu A C. difficile, využitím solubilizačních vlastností proteinu Trx, byl konstruován fúzní konstrukt, v němž byl interval 1870-2680 exprimován jako fúze s thioredoxinem (Trx).

Konstrukt pPTrxA 1870-2190 byl vytvořen ve dvou stupních. Nejdříve byl interval 1870-2190 klonován do vektoru pTrxFus (Invitrogen). Bylo to provedeno ligaci Kpnl-Sall fragmentu pMAl 870-2190, který obsahuje interval 1870-2190 toxinu A C. difficile, do vektoru pTrxFus, štěpeného pomocí Kpnl-Sall. Byl vybrán rekombinační klon obsahující příslušné fragmenty DNA a s použitím Ndel a Sall byly vyříznuty sekvence, kódující fuzní protein Trx - toxin A C. difficile, a klonovány do vektoru pETHis (příklad 18), štěpeného Ndél a Xhól. Vzniklý konstrukt, pPTrxAl870-2190, obsahuje N-terminálně his-značenou fúzi Trx - toxin A C. difficile, řízenou promotorem pET16b.

Čištění rozpustného afínitně čištěného proteinu Trx-toxin A C. difficile, z konstruktu pTrxAl870-2190 bylo prováděno z velkoobjemové kultury způsobem uvedeným v odstavci (a). Celkový, rozpustný a eluční vzorek byly děleny na 12,5 % SDS-PAGE gelu a protein byl detekován barvením Coomassieovou modří.

Výsledky této analýzy odhalily, že celkový výtěžek afínitně čištěného rekombinačního proteinu činí při eluci 200 mM imidazolu 2 mg proteinu o čistotě vyšší než 50 %. Tento výtěžek 1 mg specifického proteinu (50 % z 2 mg celkového čištěného proteinu) představuje desetinásobný vzrůst oproti výtěžku získaného z konstruktu pPA 1870-2190 (10 % ze 600 pg čili méně než 100 pg specifického proteinu) a demonstruje solubilizační vlastnosti proteinu Trx. Většina indukovaného proteinu však byla nerozpustná v případě obou konstruktů (tj. pPTrxA 1870-2190 i pPAl 870-2190) a celkový výtěžek afínitně čistitelného proteinu s vektorem pPTrxAl870-2190 byl ještě méně než 20krát nižší než v případě konstruktů pPAl 870-2680.

Příklad 31

Ochrana křečků proti onemocnění C. difficile ptačími protilátkami (IgY) proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B C. difficile

V tomto příkladu byly prováděny experimenty za účelem zjištění, zda může orálně aplikovaný

IgY proti rekombinačnímu fragmentu toxinu A C. difficile, a/nebo rekombinačnímu toxinu B

C. difficile účinně bránit křečky před onemocněním C. difficile. Tento příklad zahrnoval

-131 CZ 296806 B6

a) imunizaci slepic rekombinačním proteinem toxinu A nebo B C. difficile, b) čištění, detekci a kvantifikaci IgY proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B C. difficile a c) studii in vivo ochrany proti infekci s použitím buď IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, nebo směsi

IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a IgY proti rekombinačnímu toxinu C. difficile.

a) Imunizace slepic rekombinačními proteiny toxinu A nebo B C. difficile

Každá z leghornských nosnic byla imunizována rekombinačním proteinem pMAl 870-2680 toxinu A C. difficile (interval 1870-2680 toxinu A C. difficile, se označuje jako interval A-6) nebo rekombinačním proteinem pPB 1870-2360 toxinu B C. difficile (interval 1750-2360 toxinu B C. difficile je označen jako interval B-3). Oba rekombinační proteiny byla exprimovány jako rozpustné produkty a čištěny způsobem uvedeným v příkladu 28 (pMA 1870-2680) a příkladu 29 (pPB 1750-2360). Asi 1 mg každého rekombinačního proteinu byl smísen s kompletním Freundovým adjuvans (připraveným způsobem uvedeným v příkladu 1) a podán slepicím subkutánně na několika místech. Slepice byly imunizovány desetkrát. První čtyři imunizace byly provedeny v den 1, 14, 21 a 35. Zbylé imunizace byly prováděny ve čtyřtýdenních intervalech.

b) Čištění, detekce a kvantifikace IgY proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B C. difficile

Asi po 1 týdnu pod poslední posilovači dávce byla sebrána vejce a IgY byly extrahovány způsobem uvedeným v příkladu 1. IgY proti rekombinačnímu toxinu A a B C. difficile byly resuspendovány jako 4X PEG koncentrát (tj. resuspendovány v 1/4 původního objemu žloutku) v 0,1 M karbonátovém pufru, pH 9,5. Celková koncentrace proteinu v obou 4X koncentrátech byla 20 mg/ml na základě absorbance při 280 nm. Relativní hladiny IgY, specifické pro reaktivitu s imunogenem, byly detekovány pomocí ELISA:

Mikrotitrační destičky byly povrstveny 100 pg/jamku buď 0,05 pg/ml rekombinačního proteinu toxinu A C. difficile pPAl 870-2680 (příklad 11), nebo 1 pg/ml rekombinačnímu toxinu B C. difficile pPB1750-2360 (příklad 18b). Postup ELISA byl stejný jako v příkladu 13c. Výsledek této analýzy ukázal, že oba titry protilátek byly vyšší než 1:125000. (Titr protilátky je definován jako převrácená hodnota nejvyššího zředění protilátky, které poskytuje při ELISA signál alespoň 3krát větší než preimunní IgY). Množství specifického IgY proti rekombinačnímu toxinu A a proti rekombinačnímu toxinu B bylo stanoveno afinitním čištěním, jak je popsáno v příkladu 15c. Množství specifických protilátek proti rekombinačnímu toxinu A a B C. difficile, přítomné v preparátech anti-pMAl870-2680 a anti-pPB 1750-2360, bylo stanoveno jako asi 160 pg/ml, resp. 200 pg/ml.

c) Studie in vivo ochrany proti infekci s použitím buď IgY pro rekombinačnímu toxinu A C. difficile, nebo směsi IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, a IgY proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile

S použitím křeččího modelu C. difficile byla provedena studie ochrany in vivo s použitím protilátek vytvořených proti pMA1870-2680 (příklad 15) a pPB1750-2360 (příklad 18b). V této studii byl použit křeččí model, který byl modifikován z modelu použitého v příkladu 9, následujícím způsobem.

Křečci byli predisponováni vůči infekci C. difficile I.P. aplikací 1 mg/100 g tělesné hmotnosti klindamycin fosfátu (Boomol) v 1 ml sterilní vody. Kindamycin byl I.P. podáván pomocí 1 ml tuberkulinové stříkačky (Terumo). Po asi 20 až 24 h byl každý křeček orálně infikován 1 ml salinického roztoku s obsahem 1.10⁴ C. difficile (ATCC 43596). C. difficile bylo před infekcí kultivováno asi 48 h na destičkách CCFA (selektivní aga C. difficile) (BBL)

S použitím výše uvedených modifikací křeččího modelu byl časový průběh infekce (zejména doba nástupu onemocnění) mnohem více konzistentní a rychlejší v porovnání s výsledky získanými za podmínek popsaných v příkladu 9. V současné studii byly 3 skupiny po 8 křečcích

-132CZ 296806 B6 (Sasco) ošetřovány vždy 2 ml 4X koncentrátu preimunního IgY nebo IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, obsahujícího 40 mg celkového IgY; množství specifické protilátky proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile bylo přibližně 400 pg. Třetí skupina byla ošetřována 2 ml stejné směsi 4X koncentrovaných IgY proti rekombinačním toxinům A a B s výslednou koncentrací specifické protilátky proti každému 2X (množství specifického IgY proti rekombinačnímu toxinu A a B bylo v obou případech přibližně 200 pg). Třetí skupina má tedy poloviční množství specifických protilátek proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile v porovnání s ošetřením pouze protilátkou proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile.

Křečci byly ošetřování 3krát denně ve zhruba 4h intervalech, počínaje 24 h před infekcí. Ošetřování trvalo 5 dní; tedy zhruba o týden méně než v příkladu 9. Výsledek této studie profytaktického ošetření je znázorněn na obr. 35.

Na obr. 35 je na ose souřadnic uveden procentický podíl souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba ošetření je označena pomocí úsečky mezi dny 0 a 4. Je označeno podávání klindamycinu a inokulace pomocí C. difficile (označeno na obr. 35 jako „infekce“). Plné čtverečky představují křečky, kteří dostávali preimunní IgY; prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-interval A-6) a plné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali směsi IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile (antiinterval A-6/B-3).

Výsledky znázorněné na obr. 35 demonstrují, že za těchto modelových podmínek se u všech křečků, ošetřovaných preimunním IgY, vyvinul do méně než 24h po inokulaci průjem. Jeden den po inokulaci byla všechna zvířata v této skupině mrtvá. Naproti tomu za podmínek použitých v příkladu 9 trvalo u skupiny ošetřované preimunním IgY několik dní, než se objevil nástup onemocnění a na onemocnění často několik členů neuhynulo.

Jak je znázorněno na obr. 35, křečci ošetřovaní buď IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-pMAl870-2680), nebo směsí proti rekombinačnímu toxinu A (anti-pMA18702680) a toxinu B (anti-pPB 1750-2360) C. difficile byli před uhynutím chráněni; z každé skupiny přežilo 62, resp. 88 %. Analýza chi-square výsledků skupiny ošetřovaných protilátkou proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a skupiny ošetřované směsi byla statisticky významná v porovnání se skupinou ošetřovanou preimunní protilátkou s hodnotami P menšími než 0,05, resp. než 0,005. Přestože porovnání na bázi úhynu jako koncového bodu mezi oběma zkušebními skupinami nebylo statisticky významné (P < 0,75), byl průjem pozorovány u zvířat, která dostávala směs IgY proti rekombinačnímu toxinu A a B C. difficile, méně úporný než u preimunní kontroly skupiny.

Tyto výsledky s použitím vysoce agresivního křeččího modelu CDAD ukazují, že IgY proti rekombinačnímu proteinu toxinu C. difficile (pMAl870-2680) chrání, ale přídavek protilátek proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile (pPB1750-2360) poskytuje ochranu navíc (tj. zmenšení síly příznaků nemoci).

Příklad 32

Ošetření křečků s nepopiratelnou infekci C. difficile ptačími protilátkami (IgY) proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B C. difficile

Za účelem zjištění, zda je orálně podávaný IgY proti rekombinačnímu proteinu toxinu A

C. difficile a/nebo rekombinačnímu toxinu B C. difficile schopen účinně léčit křečky infikované

C. difficile, byly provedeny následující experimenty. Tento příklad zahrnoval a) imunizaci slepic rekombinačním proteinem toxinu A nebo B C. difficile, b) čištění a detekci kuřecího IgY proti rekombinačnímu toxinu A a B C. difficile, c) studii infekce in vivo, kdy byly křečci ošetřováni

IgY proti buď rekombinačnímu toxinu A, nebo rekombinačnímu toxinu B C. difficile (infekční

-133CZ 296806 B6 studie č. 1). Kromě toho byla k ošetřování křečků po infekci C. difficile použita také směs IgY proti rekombinačním toxinů A a B (infekční studie č. 2). Opakováním podmínek použitých v infekční studii č. 2 byla provedena infekční studie č. 3.

a) Imunizace slepic rekombinačními proteiny toxinu A nebo B C. difficile

Každá z leghornských nosnic byla imunizována rekombinačním proteinem pMA 1870-2680 rekombinačního toxinu A C. difficile (interval A-6) nebo rekombinačním pPB 175 0-2360 toxinu B C. difficile (interval B-3). Každý rekombinant zahrnuje repetiční oblasti toxinu A a toxinu C. difficile. Oba rekombinační proteiny byly exprimovány jako rozpustné proteiny s použitím vektoru pMal pro rekombinant toxinu A (příklad 15) a pET pro rekombinant toxinu B (příklad 18b).

Asi 1 mg každého rekombinačního proteinu bylo smíseno s 500 pg Fowlova adjuvans (RIBI Immunochemical Research) pro rekombinant toxinu A C. difficile a Freundova adjuvans (připraveného jak uvedeno v příkladu 1) pro rekombinant toxinu B C. difficile. Každá slepice byla subkutánně imunizována asi 7krát ve zhruba dvou- až čtyřtýdenních intervalech.

b) Čištění a detekce kuřecích IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile

Asi 1 týden po poslední dávce byla sebrána vejce a popsaným postupem (příklad 1) byly pomocí PEG extrahovány protilátky. IgY byly resuspendovány jako 8X nebo 4X koncentrát (tj. resuspendování v 1/8 nebo 1/4 objemu žloutku 0,1 M karbonátového pufru, pH 9,5). Relativní hladiny specifických protilátek proti rekombinačním imunogenům byly detekovány pomoci ELISA jako v příkladu 13c s těmito modifikacemi: 96jamková mikrotitrační destička byla povrstvena 0,05 pg/ml rekombinačního proteinu pPTrxA1870-2680N/C toxinu A (příklad 29e) nebo 1 pg/ml rekombinantu pPB1750-2360 toxinu B (příklad 18b) v množství 100 μΐ/jarnku. Byl proveden standardní formát ELISA pro detekci protilátek proti rekombinačnímu toxinu A nebo B C. difficile (příklad 13c). Pomocí ELISA bylo zjištěno, že oba titry protilátek jsou větší než 1:125 000.

c) Infekční studie in vivo

S použitím křeččího modelu popsaného v příkladu 31 byly provedeny tři infekční studie, č. 1, č. 2 a č. 3.

i) Infekční studie č. 1

V infekční studii č. 1 byly použity tři oddělené experimentální skupiny, každá tvořená 12 zlatými syrskými křečky (Sasco) o hmotnosti přibližně 80 až 90 g. Zvířata byla ustájena v klecích po 3 a během studie dostávala otravu a vodu ad libitum. Křeččí model byl proveden postupem uvedeným v příkladu 31. Na začátku studie byl každý křeček predisponován vůči infekci intraperitoneální aplikací klindamycin fosfátu (Biomol) v množství 1 mg/100 g tělesné hmotnosti v 1 ml vody s použitím 1 ml tuberkulinové stříkačky (jehla velikosti 27). Po přibližně 24 h bylo každé zvíře s použitím krmné jehly velikosti 18 orálně imunizováno 1 ml C. difficile (kmen ATCC 43 596) s přibližně 10³ až 10⁴ organismy ve sterilním salinickém roztoku. Před infikováním byly organismy kultivovány 48 h na destičkách CCFA (BBL).

h po inokulaci (den 1) bylo zahájeno ošetřování obou skupin. K ošetřování byla použita krmná jehla o velikosti 18 k podávání 2 ml 4X koncentrátu buď preimunního IgY, nebo specifického imunního IgY proti buď rekombinačnímu toxinu A (pMA 1870-2680; interval A-6), nebo toxinu B (pPB1750-2360; interval B-3) C. difficile. V den 1 byli křečci ošetřeni ještě dvakrát ve dvouhodinových intervalech. Ve dny 2 až 4 byly každému křečkovi podány 2 ml příslušného preparátu protilátky třikrát denně ve zhruba čtyřhodinových intervalech. Každá 2 ml dávka obsahovala asi 40 mg IgY, z čehož asi 400 pg je specifický IgY (stanoveno afinitním čištěním postupem

-134CZ 296806 B6 podle příklad 15c) k rekombinačnímu toxinovému proteinu, nebo asi 1200 pg specifické protilátky proti toxinovému proteinu C. difficile za den. Během doby ošetření a po ní byla zvířata sledována z hlediska nástupu průjmu a úhynu. Výsledky jsou znázorněny na obr. 36.

Na obr. 36 je na ose souřadnic uveden procentický podíl souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba ošetření je označena pomocí úsečky mezi dny 1 a 4. Je označeno podávání klindamycinu a organismů C. difficile („infekce“). Plné čtverečky představují křečky, kteří dostávali preimunní IgY; prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali 4X preparát IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-interval A-6) a plné kosočtverce představují křečky, kteří dostávají 4X preparát IgY proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile (anti-interval B-3).

Výsledky uvedené na obr. 36 demonstrují, že polovina křečků (6/12), ošetřovaných po infekci protilátkami proti rekombinantu toxinu A C. difficile, byla chráněna před úhynem v důsledku CDAD. Stupeň ochrany ve skupině protilátek proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile byl statisticky významný (P < 0,025 pomocí analýzy chi-square). Většina křečků (10/12) v této skupině vykazovala průjem. Zdá se, že při testované koncentraci nejsou protilátky proti rekombinantu toxinu a C. difficile schopny průjmu u křečků zabránit. Naproti tomu se u všech křečků ošetřených preimunní protilátkou a protilátkou proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile vyvinul průjem a krátce nato uhynuli.

Z těchto výsledků vyplývá, že IgY, vytvořený proti rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile (pMAl 870-2680), může chránit křečky před úhynem v důsledku CDAD.

ii) Infekční studie č. 2

Druhý experiment byl prováděn v zásadě stejně s tou výjimkou, že na schopnost chránit křečky před CDAD byla testována směs protilátek proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile. Byly smíseny stejné objemy 8X koncentrátů IgY k oběma rekombinantům (pMAl870-2680 a pPB 1750-23 60), takže konečná koncentrace pro každý rekombinant byla 4X. Každá dávka (2 ml) obsahovala přibližně 80 mg/ml proteinu s obsahem asi 400 pg specifického IgY (1 % specifického proteinu proti toxinu C. difficile oproti celku) ke každému rekombinantu. Množství specifického anti-rekombinantního IgY proti každému toxinovému rekombinantu bylo stanoveno afinitním čištěním s použitím příslušného rekombinačního proteinu. Vzniklý preparát proto obsahuje stejnou konečnou koncentraci protilátky proti rekombinačnímu toxinu A jako v předchozím proteinu. Z důvodu tohoto rozdílu byla sestavena další zkušební skupina a ošetřována stejnými objemy 8X koncentrátů IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a preimunního IgY. Jako kontrola byla třetí skupina křečků ošetřována 8X koncentrátem pouze preimunního IgY. Devět křečků v každé skupině bylo infikováno 1.10⁴ organismů C. difficile (ATCC 43596) a po 4 h jim bylo podáno 2 ml buď preimunního IgY, IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, smíšeného s preimunním IgY, nebo směsi IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile. Zvířata byla ošetřována stejně jako v odstavci c (i) třikrát denně po dobu 4 dní. Výsledky tohoto experimentu jsou znázorněny na obr. 37.

Na obr. 37 je na ose souřadnic uveden procentický podíl souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech).Doba ošetření je označena pomocí úsečky mezi dny 1 a 4. Je označeno podávání klindamycinu a organismů C. difficile („infekce“). Plné čtverečky představují křečky, kteří dostávali 8X preparát preimunního IgY; prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali směs 8X preparátů preimunního séra a IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-interval A-6) a plné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali směs 8X preparátů IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile (anti-interval A-6 a B-3).

Výsledky uvedené na obr. 37 demonstrují, že směs IgY k toxinům A a B C. difficile (pMA1870-2680 a pPB1750-2360) chránila kompletně všechny křečky před úhynem na CDAD.

Pouze 1/3 (3 z 9) zvířat, ošetřených směsí protilátek k toxinům A a B C. difficile, vykazovala průjem (jedno mělo velmi mírný průběh). Křečci, ošetřovaní směsí protilátky IgY proti rekombi-135CZ 296806 B6 načnímu toxinu A C. difficile (anti-interval A-6) a preimunního IgY, byli částečně chráněni s procentem přežití 56 %. Všichni kromě jednoho křečka ve skupině anti-interval 6/preimunní IgY vykazoval průjem. Podíl přežití v této skupině byl srovnatelný s hodnotou pozorovanou v infekčním studii č. 1 (50 %) s použitím pouze IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile bez přídavku preimunního IgY. To naznačuje, že přídavek preimunního IgY pravděpodobně měl malý nebo neměl žádný účinek (pokud jde o specifickou ochranu proti proteázám v gastrointestinálním traktu) na účinnost IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile. Ošetření zvířat samotnými preimunními protilátkami jako obvykle křečky nechránilo před infekcí C. difficile a všichni křečci uhynuli do 2 dnů po infekci. Poměry přežití, pozorované v důsledku podání IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a proti rekombinačním toxinům A a b C. difficile, byly oba statisticky významné ve srovnání s preimunním IgY s hodnotami menšími než 0,05, resp. 0,001. Hodnota P při porovnání obou skupin ošetřovaných rekombinanty byla nižší než 0,10.

Zvířata, která přežila o obou infekčních studiích č. 1 a 2, přežívala dlouhodobě (tj. po dobu větší nebo rovnou 30 dní po přerušení léčby; po asi jednom měsíci po přerušení léčby, kdy byl experiment ukončen, byla zvířata euthanatizována). U těchto zvířat navíc nebyla pozorována recidiva (recidiva je běžně pozorována u živočichů, včetně člověka, ošetřovaných léčivy, jako je vankomycin nebo metronidazol, pro potírání infekce C. difficile). Tyto výsledky reprezentují první případ, kdy byly protilátky, vytvořené proti rekombinačním proteinům odvozených od toxinů A a B C. difficile, kompletně účinné u zvířat, kterým byla podána letální infekce C. difficile.

iii) Infekční studie č. 3

Po několika dalších imunizacích slepic samostatným rekombinačním toxinem A C. difficile (pMAl 870-2680) a rekombinanty toxinu A/B C. difficile (směs pMA1870-2680 a pPB1750-2360) byla opakována výše popsaná terapeutická studie (infekční studie č. 2) s použitím směsi obou protilátek (infekční studie č. 3). Tři skupiny křečků po 10 členech byly ošetřovány 4 h po infekci buď preimunním IgY, IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, nebo směsí IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile s použitím stejných dávek a dob jako prve.Výsledky této studie jsou znázorněny na obr. 38.

Na obr. 38 je na ose souřadnic uveden procentický podíl souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba ošetření je označena pomocí úseček mezi dny 1 a 4. Je označeno podávání klindamycinu a organismů C. difficile („infekce“). Plné čtverečky představují křečky, kteří dostávali 8X preparát preimunního IgY; prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali směs 8X preparátů preimunního séra a IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-interval A-6) a plné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali směs 8X preparátů IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile (anti-interval A-6 a B-3).

Jak je z obr. 38 patrné, křečci ošetřovaní směsí protilátek k oběma rekombinačním toxinům A a B C. difficile byli kompletně chráněni před úhynem, jak bylo prokázáno v předchozím experimentu (infekční studie č. 2), ale navíc žádné z ošetřených zvířat (proti rekombinačním toxinům A a B) nevykázalo průjem. Zatímco křečci, ošetřovaní protilátkou proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, byli rovněž chráněni před úhynem (uhynul pouze jeden z deseti), měli všichni kromě jednoho (90 %) průjem. U všech křečků ošetřovaných preimunním IgY se vyvinul průjem a uhynuli do 48 h po infekci.

prevence mortality s použitím protilátek k rekombinačnímu toxinu A a k toxinům A a B C. difficile byla statisticky významný (P < 0,001) v porovnání s výsledky získanými s použitím preimunní protilátky. Jak je prokázáno v předchozích příkladech (16 i a ii), všichni ošetřovaní křečci také dlouhodobě přežívali bez známek recidivy. Prevence morbidity u křečků, která zahrnuje přítomnost průjmu a úbytku hmotnosti, ošetřováním IgY proti rekombinantům A a B je dokumentována v tabulce 42.

-136CZ 296806 B6

Tabulka 42. Protilátky intervalu A-6 a B-3 snižují morbiditu CD AD

skupina	% zvířat s průjmem	P	% úbytku hmotnosti3	P
preimunní	100		Nab
pmA1870-2680 (A-6)	90	NSC	16	< 0,001
pmA1870-2680 plus pPB 1750-2360 (A-6/B-3)	0	< 0,001	1	NS

^a úbytek hmotnosti přeživších zvířat, vypočtených jako rozdíl mezi výchozí hmotností a hmotností po skončení ošetření ^b nehodí se ^c nevýznamný

Jak je z tabulky 42 patrné, procento úbytku hmotnosti u přeživších zvířat, ošetřených samotným IgY proti rekombinančnímu toxinů A C. difficile (pMAl 870-2680; A-6) činilo v porovnání se střední hmotností před infekcí asi 16 %. Křečci, ošetřovaní oběma protilátkami k oběma rekombinantům (pMA1870-2680 a pPB1750-2360; A-6/B-3) ztratili pouze 1 % své střední výchozí hmotnosti. Tyto výsledky demonstrují, že protilátky vytvořené proti rekombinantu A C. difficile chránily křečky proti fatálnímu stadiu CDAD, ale pro prevenci diaroického stadia spojeného s CDAD byl nutný přídavek protilátek k rekombinantu toxinů B C. difficile.

Příklad 33

Recidiva během ošetření křečků infikovaných C. difficile in vivo s použitím vankomycinové terapie

Pro stanovení, zda se po vankomycinové léčbě, použité v předchozích terapeutických studiích, objevuje recidiva C. difficile, byl proveden následující experiment.

Podmínky použité pro křeččí model byl stejné jako podmínky použité v příkladu 32. Tři skupiny křečků (Sasco) po 6 členech byly ošetřovány 0,2, 1 nebo 5 mg/kg vankomycinu (Vancomycin HC1, Lilly) v 1 ml sterilní vody. Dávky byly podávány jednou denně po dobu 5 dní. Jako kontrola byla použita další neošetřená skupina. Křečci byli orálně infikováni 1.10³ organismů C. difficile (ATCC 43596) a pak byla 3 h po infekci zahájena léčba vankomycinem. Výsledky experimentu po 20 dnech po infekci jsou znázorněny na obr. 39.

Na obr. 39 je na ose souřadnic uveden procentický podíl souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba ošetření je označena pomocí úsečky mezi dny 1 a 5. Je označeno podávání klindamycinu a organismů C. difficile („infekce“). Plné čtverečky představují křečky, kteří nebyli ošetřování (neošetření); prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali 0,2 mg/kg vankomycinu; plné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali 1,0 mg/kg vankomycinu a prázdné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali 5,0 mg/kg vankomycinu.

Výsledky znázorněné na obr. 39 demonstrují, že všichni křečci, ošetřovaní 0,2 mg/kg vankomycinu, v průběhu léčby uhynuli. Křečci ošetřovaní 1 nebo 5 mg/kg vankomycinu byli během doby léčby chráněni, ale rychle recidivovali a většina uhynula po skončení léčby. U všech ošetřovaných křečků se vyvinul průjem a 83 % (5/6) křečků ošetřovaných 1 mg/kg vankomycinu,

-137CZ 296806 B6 resp. 100 % (6/6) křečků ošetřovaných 5 mg/kg vankomycinu uhynulo 7 nebo 9 dní po přerušení léčby.

Tento recidivující účinek při použití vankomycinu, jak je zde ilustrován, nebo metronidazolu k léčbě infekcí C. difficile v křeččím modelu nebo u lidí je běžným jevem, který byl často zaznamenán. Recidivuje až 100 % křečků a asi 25 % lidí, léčených jedním z těchto dvou léčiv. Tento recidivující účinek je ve výrazném kontrastu k účinku projevujícímu se při aplikaci tohoto vynálezu, jsou -li křečci infikováni C. difficile ošetřovaní IgY vytvořenými proti buď nativnímu, nebo rekombinačnímu toxinů A nebo B C. difficile. Jsou-li zvířata ošetřována IgY proti toxinů C. difficile, dochází k recidivě zřídka nebo vůbec nikdy. Prevence recidivy podáváním IgY proti toxinů C. difficile tedy představuje významnou terapeutickou výhodu oproti běžné léčbě antibiotiky.

Příklad 34

Porovnání neutralizace toxinů A C. difficile in vivo s použitím IgY proti třem různým rekombinačním proteinům obsahujícím repetici toxinů A C. difficile

Ve vektoru pMal-c byly exprimovány tři rekombinační proteiny toxinů A C. difficile z repetiční oblasti toxinů A C. difficile. Byly vytvořeny protilátky proti každému znich a porovnávána jejich schopnost neutralizovat toxin A C. difficile u křečků. Příklad zahrnoval a) imunizaci slepic, b) čištění a detekci IgY proti rekombinačnímu toxinů a a c) neutralizační studii toxinů A C. difficile u křečků s použitím IgY proti rekombinačnímu toxinů A.

a) Imunizace slepic

Tři skupiny leghomských nosnic byly imunizovány různými rekombinačními proteiny toxinů A, produkovanými ve vektoru pMal. Všechny byly exprimovány jako fúze MBP. Jednalo se o proteiny pMAl 870-2190 (příklad 17), pMAl960-2680 (příklad 28) a pMAl 870-2680 (příklad 11). První dva rekombinační proteiny zahrnují překrývající se subfragmenty z intervalu obsaženého v rekombinačním pMA1870-2680.

Každé slepici bylo podáno přibližně 1 mg každého rekombinačního proteinu s Freundovým adjuvans. Byl proveden standardní postup imunizace s tímto adjuvans, popsaný v příkladu 1. Slepice byly imunizovány čtyřikrát na více místech v časových intervalech uvedených v příkladu 32a.

b) Čištění a detekce IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. difficile

Protilátky byly pomocí PEG extrahovány z vajec sebraných alespoň jeden týden po poslední dávce. Jako kontroly byl také připraven IgY proti toxinů A C. difficile (CTA) a preimunní IgY.IgY byly resuspendovány v 0,1 M karbonátovém pufru (pH 9,5) ve 4x koncentraci (1/4 původního objemu žloutku). Hladina specifických protilátek z každé skupiny byla stanovena použitím ELISA. Byla stanovena reaktivita proti rozpustnému rekombinačnímu proteinu toxinů A pPTrxl 870-2680. Protein pPTrxl 870-2680 neobsahuje MBP jako zbylé tři imunogeny a proto je reaktivita ELISA specifická pouze pro rekombinant toxinů A. Byl použit standardní postup ELISA (příklad 13c). Z výsledků ELISA se ukázalo, že všechny čtyři IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. difficile mají velmi podobné titry, v porovnání s preimunním IgY větší než 1:31250.

c) Neutralizační studie toxinů A C. difficile křečků s použitím IgY proti rekombinačnímu toxinů A

Schopnost výše uvedených IgY proti rekombinačnímu toxinů A (tj. pMAl870-2190, pMAl 960-2680 a pMAl 870-2680) poskytovat ochranu proti toxinů A C. difficile byla zjišťo-138CZ 296806 B6 vána na křeččím modelu. Dvě skupiny křečků dostávaly IgY proti pMA 1870-2680; proto bylo vyšetřováno celkem 6 skupin. Test byl prováděn postupem uvedeným vpříkladu 14.

ml IgY byl smísen a 1 h preinkubován s 30 pg toxinu C C. difficile (Těch Labs) a pak orálně podán zlatým syrským křečkům o hmotnosti 30 až 40 g (Charles River). Jako negativní, resp. pozitivní kontrola sloužil preimunní IgY, resp. IgY CTA (příklad 8). Zvířata byla pozorována po dobu 24 h a byl označen počet mrtvých zvířat v každé skupině. Výsledky experimentu jsou uvedeny v tabulce 43.

Tabulka 43. Tvorba protilátek neutralizujících toxin A proti různým rekombinačním fragmentům toxinu A

skupina	živá1	mrtvá1
preimunní	0	5
CTA	5	0
pMA 1870-2190	0	5
pMA 1960-2680	5	0
pMA 1870-2680 a	5	0
pMA 1870-2680 b	3	2

výsledky studie po 24 h

Jak z tabulky 43 vyplývá, předběžné ošetření toxinu A C. difficile pomocí IgY proti pMAl 870-2680 zabránilo úhynu u všech 5 ošetřených křečků ve skupině označené „pMAl870-2680 a“ a u 3 z 5 křečků ve skupině označené „pMAl870-2680 b“. Protilátky vytvořené proti pMA 1870-2680 i mírně menšímu karboxyterminálnímu polypeptidů pMA 1960-2680 zabránily úhynu u všech 5 zvířat. Naproti tomu, stejně jako u preimunního IgY neměl IgY vytvořený proti aminoterminálnímu polypeptidů pMA 1870-2190 žádný vliv na prevenci úhynu. Podle očekávání byli křečci, ošetřovaní IgY CTA, kompletně chráněni před enterotoxickými účinky toxinu A C. difficile.

Příklad 35

Identifikace adjuvans, která optimálně indukují neutralizující protilátky proti nativnímu toxinu A. C. difficile in vivo

Za účelem porovnání schopnosti různých adjuvans vyvolávat tvorbu neutralizujících protilátek proti toxinu C. difficile u slepic s použitím rekombinačního proteinu toxinu A C. difficile jako imunogenu byly provedeny následující experimenty. Příklad zahrnoval a) imunizaci slepic rekombinačním proteinem toxinu A C. difficile s použitím čtyř různých adjuvans, b) stanovení titrů IgY proti rekombinačnímu toxinu A. C. difficile pomocí ELISA a c) testování neutralizační schopnosti IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile vůči toxinu A C. difficile in vivo.

a) Imunizace slepic rekombinačním proteinem toxinu A C. difficile s použitím čtyř různých adjuvans

Osm skupin leghornských nosnic, každá po 4 slepicích, byly imunizovány buď 100 pg, nebo mg rekombinačního proteinu toxinu A (pMAl 870-2680; příklad 11) v kombinaci se čtyřmi

-139CZ 296806 B6 různými adjuvans. Byla testována jako adjuvans: Freundovo (GIBCO), Fowlovo LES-STM (dále označováno jak adjuvans RIBI; RIBI Immunochemical Reseach, lne.), Gerbuho (Biotech) a Quil

A (Accutere Chemical). Každé adjuvans bylo testováno při obou koncentracích antigenů. Příprava a podávání každého adjuvans se prováděla postupem podle pokynů výrobce. Dávka adjuvans pro slepice byla rovněž stanovena podle případných pokynů výrobce.

Pro imunizaci sFreundovým adjuvans byl použit standardní postup (příklad 1). Stručně řečeno byl 1 objem antigenů emulgován v 1,2 objemu buď úplného Freundova adjuvans při první imunizaci, nebo neúplného Freundova adjuvans pro následné posílení dávky. Každé slepici byl podán 1 ml směsi antigen/Freund na čtyřech místech, protože Freundovo adjuvans obsahuje olej, vyžaduje míšení Freundova adjuvans s imunogenem intenzivní emulgaci materiálu pomocí dvou stříkaček spojených válcovou spojkou až do ztuhnutí. Ostatní tři adjuvans (RIBI, Gemu a Quil A) mají složení na bázi vody a rovnoměrné promísení s rekombinačním antigenem bylo oproti Freundovu adjuvans mnohem snadnější. Pro rozmíchání těchto tří adjuvans postačovalo pouze mírné promísení. Konečná směs s použitím těchto vodných adjuvans zůstala rovněž homogenní kapalinou, umožňující snadnější podávání slepicím v porovnání s použitím Freundova adjuvans.

Při použití Adjuvans RIBI dostávala každá slepice 500 μΐ směsi antigen/adjuvans v jednom místě s obsahem 100 μg adjuvans. Doporučená dávka Quil-A pro morčata, resp. králíky, je 50 μg, resp. 100 pg. Extrapolaci hmotnosti bylo každé slepici podáno 75 pg adjuvans Quil A v jednom místě s objemem směsi antigen/adjuvans 500 μΐ. Při použití Gerbuho látky dostala každá slepice 5 pg adjuvans v 500 pg antigenní směsi v jednom místě. Všechny slepice byly imunizovány subkutánně 4krát ve zhruba dvoutýdenních intervalech.

b) Stanovení titrů IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. difficile pomocí ELISA

Hladiny protilátek k rekombinačnímu toxinů A, vytvořených s použitím různých adjuvans, byly porovnávány pomocí ELISA. Po asi 1 týdnu po poslední dávce byla sebrána alespoň 3 vejce z každé z 8 skupin spolu s preimunními vejci, žloutky spojeny podle skupin a IgY extrahovány pomocí PEG jako v příkladu 1. Čištěné IgY proti rekombinačnímu toxinů A pak byly resuspendovány v PEG v IX objemu žloutku. Koncentrace proteinů v každém preparátu, stanovená na základě absorbance při 280 nm, byla ve všech případech podobná, asi 4 až 5 mg/ml. Reaktivita IgY a titr každého jednotlivého preparátu proti pMAl870-2680 byly stanoveny pomocí ELISA proti rozpustnému (pPTrxA1870-2680N/C; příklad 29) a nerozpustnému (pPA1870-2190; příklad 17a) analogu intervalu 1870-2680 toxinů A C. difficile. Tyto rekombinační analogy toxinů A C. difficile byly použity k povrstvení mikrotítračních destiček pro ELISA místo rekombínantu použitého při imunizaci (pMA 1870-2680), protože ani pPTrxA1870-2680N/C ani pPA18702680 nebyly na rozdíl od imunogenu pMAl870-2680 exprimovány jako fúze sMBP. Bylo to provedeno za účelem stanovení reaktivity protilátky vůči konkrétně toxinové části rekombínantu toxinů A C. difficile spíše než MBP části fúzního proteinu.

Rozpustný analog pPTrxA1870-2680N/C, použitý k povrstvení mikrotitrační destičky, byl exprimován jako fúze s thioredoxinem, což napomáhá rozpustnosti a vzniklý fúzní protein pravděpodobně existuje v nativní konformaci. Nerozpustný analog pPA1870-2190, který pravděpodobně obsahuje denaturované epitopy, byl rovněž použit k povrstvení mikrotítračních destiček. Byla testována ELISA reaktivita každého IgY jak vůči rozpustnému, tak nerozpustnému analogu pro zjištění, zde existuje preferenční reaktivita vůči jednomu nebo druhému analogu, jsou-li pro vytvoření IgY použita různá adjuvans.

Byl použit standardní postup ELISA, popsaný v příkladu 13c, stou výjimkou, že kpovrstvení mikrotítračních destiček (Falcon, destičky Pro-Bind Assay) bylo použito 20 až 40krát menší množství proteinu pPTrxA1870-2680N/C než normálně za účelem redukce pozadí. Přes noc při

4°C byl ponechán nános 0,1 μΐ/jamku s rozpustným proteinem pPTrxA1870-2680N/C v koncen-140CZ 296806 B6 traci 0,05 pg/ml nebo nerozpustným proteinem pPAl870-2680 v koncentraci 1 pg/ml. Výsledky jsou znázorněny na obr. 40.

Na obr. 40 jsou znázorněny výsledky ELISA reaktivity, porovnávající titr protilátek pro každou kombinaci adjuvans/antigen vůči buď nerozpustnému (I), nebo rozpustnému (S) rekombinantu toxinu A C. difficile. Byly použity tyto zkratky: Pl (preimunní); adjuvans byla označena F (Freundovo), R (RIBI), Q (Quil-A) a G (Gerbuho) při buď 1 mg (1), nebo 100 pg (100).

Navíc byl porovnáván titr protilátky v každé skupině po 3 nebo 4 imunizacích za účelem stanovení, zda má alespoň protilátky prodlevu (na obr. 40 označeno pomocí -3 nebo -4). Všechny čtyři adjuvans byla schopna vyvolat u slepic protilátkovou odpověď do určitého stupně, alejejich odpovědi na rozpustný či nativní antigen a nerozpustný či denaturovaný antigen byly odlišné. Freundovo adjuvans vyvolalo větší reakci na nerozpustný analog oproti rozpustnému analogu. Téměř žádná reaktivita nebyla pozorována při použití Freundova adjuvans se 100 pg antigenů vůči nerozpustnému analogu. Nebyl rozdíl v odpovědi s soužitím Freundova adjuvans vůči nerozpustnému analogu u obou koncentrací (100 pg nebo 1 mg) imunogenu, zatímco byl pozorován vzestup reaktivity vůči rozpustnému analogu při vyšší oproti nižší koncentraci. Naproti tomu byla reaktivita protilátek vůči rozpustnému analogu při použití ostatních tří vodných adjuvans obecně větší než u nerozpustného analogu. Reaktivity protilátek při ELISA vůči rozpustnému analogu byly v porovnání s nerozpustným analogem asi 2krát vyšší. Reaktivita protilátek se zlepšila ve skupinách Gerbu, RIBI a Quil-A při použití zvýšené dávky antigenů (1 mg oproti 100 pg) a byla výraznější vůči rozpustnému oproti nerozpustnému analogu. Hladina protilátek k nerozpustnému i rozpustnému analogu se ve většině skupin zvýšila po další posilovači dávce v porovnání s 3. a 4. imunizací.

Z výsledků na obr. 40 je zřejmé, že imunizace kuřat Freundovým adjuvans s použitím rozpustného rekombinačního imunogenu toxinu A. C. difficile vyvolává tvorbu protilátek primárně proti nerozpustnému analogu. Toto zjištění je významné, jsou-li požadovány konformační protilátky, poskytující ochranu in vivo. Jsou-li požadovány konformační protilátky, byla byl preferována alternativní adjuvans, jako jsou zde použitá Gerbu nebo RIBI. Použíje-li se Freundovo adjuvans, může dojít k denaturaci rozpustného antigenů v důsledku nutnosti drsnějšího emulgačního postupu oproti jiným adjuvans. Vzniklý denaturovaný antigen by pak pravděpodobně vyvolával tvorbu protilátek primárně proti nerozpustnému nebo nekonformačnímu analogu. Tento účinek použití Freundova adjuvans je možno překonat použitím většího množství antigenů pro imunizaci, protože se denaturuje méně než celkové množství a je přítomno větší množství nativního antigenů. Skutečně také při vyšší koncentraci imunogenu došlo ke zvýšení reaktivity rozpustného analogu protilátky, zatímco nebyl rozdíl reaktivity nerozpustné protilátky mezi oběma koncentracemi imunogenu.

c) Testování schopnosti neutralizace IgY k rekombinačnímu toxinu A. C. difficile vůči toxinu A C. difficile in vivo

Byla porovnávána in vivo schopnost výše popsaných protilátek proti proteinu pMAl 870-2680, vytvořených výše popsaným způsobem s použitím různých adjuvans, neutralizovat toxin A. PEG-čištěné IgY z vajec slepic, imunizovaných každým ze čtyř adjuvans při koncentraci imunogenu 1 mg, byly zředěny na 0,5X objem žloutku karbonátovým pufrem 0,1 M, pH 9,5. Tato koncentrace protilátek (0,5X) byla zvolena proto, že nejlépe osvětluje rozdíly v neutralizační schopnosti IgY s použitím různých adjuvans. Jako kontroly byly připraveny preimunní protilátky také v koncentraci 0,5X v karbonátu. Protilátky byly ředěny karbonátovým pufrem, aby mohly být podávány orálně s menší degradací kyselinou v žaludku.

Koncentrace proteinu IgY podle absorbance při 280 nm všech 0,5X preparátů byla 2,4 až

2,5 mg/ml z čehož 25 až 50 pg/ml byla specifická protilátka proti rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile. Studie ochrany křečků in vivo proti toxinu A C. difficile s použitím pěti

-141 CZ 296806 B6 preparátů IgY byla prováděna postupem podle příkladů 14(c). Bylo použito pět skupin po čtyřech samečcích zlatých syrských křečků (Charles River) o hmotnosti 30 až 40 g. Každému křečkovi byla podávána směs 30 pg toxinu A C. difficile (Těch Labs) a 1 ml IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile nebo preimunního IgY. Před orální aplikací byla nejprve tato směs podrobena preinkubaci po dobu 1 h při 37 °C. Po aplikaci byla zvířata pozorována po dobu 24 h na přítomnosti průjmu a úhyn. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 44.

Tabulka 44. Tvorba protilátek neutralizujících toxin A s použitím různých adjuvans s pMA 1870-2680

skupina	zdraví3	průjem3	mrtví3
preimunní	0	1	3
Freund	0	0	4
Gerbu	4	0	0
RIBI	4	0	0
Quil A	4	0	0

^a výsledek studie po 24 h

Z výsledků uvedených v tabulce 44 je zřejmé, že preimunní toxin A C. difficile s 0,05X IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, vytvořeným s použitím adjuvans Gerbu, RIBI a Quil A, před podáním u křečků zabránil všem zjevným příznakům a úhynu v důsledku onemocnění. Naproti tomu všechna zvířata ošetřovaná IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, vytvořeným s použitím Freundova adjuvans (jako 0,5X preparát protilátky), ve směsi s toxinem A C. difficile nebyla chráněna a během 24 h si křečci vyvinuli průjem a uhynuli. Tři ze čtyř křečků, ošetřovaných preimunním IgY, uhynuli a ten, který přežil, měl těžký průjem. Tyto výsledky prokázaly, že IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, vytvořené s použitím adjuvans Gerbu, RIBi a Quil A, jsou schopny neutralizovat aktivitu toxinu A C. difficile in vivo, zatímco IgY vytvořený s pomocí Freundova adjuvans ve stejné koncentraci toho schopen není. Neschopnost neutralizovat toxin A C. difficile pomocí IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile vytvořeného s Freundovým adjuvans koreluje s jeho nízkou reaktivitou ELISA vůči rozpustnému analogu toxinu A. Naopak všechna ostatní adjuvans vyvolávala tvorbu vysokých hladin protilátek k rozpustnému analogu, které byly neutralizující. Tyto výsledky naznačují, že neutralizační potenciál protilátek koreluje dobře s jejich reaktivitou vůči rozpustnému, avšak nikoli nerozpustnému analogu. Tyto výsledky naznačují dále, že při tvorbě neutralizujících protilátek je významné udržování rozpustného nebo konformačního imunogenu toxinu A C. difficile. Volba adjuvans, jako je RIBI nebo Gerbu, je tedy významná pro zachovávání konformace imunogenu, která je důležitá při tvorbě protilátek proti toxinu A C. difficile, které chrání in vivo.

Příklad 36

Neutralizace toxinu A in vivo s použitím protilátek proti rekombinačnímu proteinu pPAl 870-2680

Za účelem zjištění, zda imunizace slepic rekombinantem pPA1870-2680(N/C) toxinu A

C. difficile vyvolává tvorbu neutralizujících protilátek, byl proveden následující experiment. Příklad zahrnoval: a) imunizaci slepic rekombinantem pPA1870-2680(N/C) toxinu A C. difficile

-142CZ 296806 B6 s použitím čtyř různých adjuvans, b) čištění a detekci IgY proti rekombinantu s c) neutralizační studii in vivo na křečcích s použitím protilátek proti pPA 1870-2680 inkubovaných s toxinem A.

a) Imunizace slepic rekombinantem pPS 1870-2680 toxinu A C. difficile s použitím čtyř různých adjuvans

Každá zleghomských nosnic byla imunizována rekombinantem pPA1870-2680(N/C) toxinu A C. difficile (příklad 29d). Tento rekombinační protein je exprimován ve vektoru pET a ukázalo se, že je schopen izolovat e velmi čisté formě s velmi nízkým obsahem endotoxinu v porovnání se stejnou oblastí exprimovanou v jiných vektorech, jako je pMal-c (příklad 11). Tyto výsledky naznačují, že rekombinační protein pPAl870-2680 může být kompatibilní pro použití ve vakcíně. Proto byla testována schopnost pPAl 870-2680 stimulovat reakci protilátek.

Čtyři skupiny slepic (po 2 slepicích) byly imunizovány 100 g pPA1870-2680(N/C) (čištěného postupem podle příkladu 29d) s použitím 4 různých adjuvans. Byla použita adjuvans Freund (GIBCO), Fowl (RIBI) (RIBI Immunochemical), Gerbu (Biotech) a Quil A (Accurate Chemical). Množství každého adjuvans použitého pro rekombinant je uvedeno v příkladu 35. Všechny slepice byly imunizovány čtyřikrát ve dvoutýdenních intervalech.

b) Čištění a detekce IgY proti rekombinantu

Hladiny pPA1870-2680(N/C) s použitím různých adjuvans byly porovnávány pomocí ELISA. Po asi 1 týdnu od poslední dávky byly z vajec od každé skupiny připraveny standardní preparáty PEG a resuspendovány v koncentraci 4X (všechny obsahovaly asi 20 mg/ml IgY) v 0,1 M karbonátovém pufru, pH 9,5. Standardním postupem ELISA (příklad 13c) byla zjišťována reaktivita specifických protilátek k rozpustnému imunogenu pPAl870—2680. Výsledky ELISA jsou znázorněny na obr. 41.

Na obr. 41 je vynesena absorbance při 410 nm proti logio zředění každého testované protilátky. Plné černé čtverečky představují výsledky ELISA s použitím preimunního IgY; prázdné čtverečky, černé kosočtverce, prázdné kosočtverce, resp. černé trojúhelníky představují výsledky ELISA s použitím adjuvans Gerbu (G-A2), Quil A (Q-A2), RIBI (R-A2), resp. Freundova (F-A2).

Po 4 imunizacích vytvořily všechny slepice specifickou odpověď IgY proti rekombinantnímu toxinu A C. difficile, exprimovanému ve vektoru pET [tj. pPA1870-260(N/C)J. Jak je z obr. 41 patrné, byly odpovědi získané s použitím adjuvans Freundova, Fowlova (RIBI) a Quial A srovnatelné. U slepic imunizovaných pomocí Gerdu byla pozorována nižší odpověď protilátek. Je zajímavé, že použití Freundova adjuvans s pPA1870-2680(N/C) poskytlo nejvyšší aktivitu proti rekombinantu, zatímco v předchozím příkladu (příklad 35) vyvolalo Freundovo adjuvans s použitím stejné rekombinační oblasti exprimované v pMal-c (pMAl 870-2680) nejslabší odpověď. Ostatní adjuvans vyvolává při porovnání obou rekombinantů podobnou odpověď protilátek. Tyto výsledky naznačují, že úroveň odpovědi protilátek s použitím Freundova adjuvans může být závislá na tom, jaký typ antigenu je použit.

c) Neutralizační studie in vivo na křečcích s použitím protilátek proti pPAl870-2680 (N/C) inkubovaných s toxinem A C. difficile

Schopnost protilátek neutralizovat toxin A C. difficile byla porovnávána s použitím protilátek vyvolaných proti proteinu pPA1870-2680(N/C), vytvořených spomocí adjuvans RIBi a Freundova. Tento pokus byl prováděn postupem uvedeným v příkladu 35c s tou výjimkou, že protilátky byly zředěny na koncentraci 2X s obsahem 10 mg/ml proteinu IgY. Toxin A C. difficile (Těch Labs) byl smísen s protilátkami vytvořenými s použitím Freundova a Fowlova (RIBI) adjuvans a orálně aplikován křečkům. Jako kontrola sloužili křečci ošetření preimunním

-143 CZ 296806 B6

IgY. Počet křečků, kteří do 20 h po podání IgY zůstali zdraví, měli průjem nebo uhynuli, je uveden v tabulce 45.

Tabulka 45. Tvorba protilátek neutralizujících toxin A s použitím různých adjuvans spPA 1870-2680

skupina	zdraví	průjem	mrtví
preimunní	0	0	4
Freund	4	0	0
RIBI	4	0	0

Jak je z tabulky 45 patrné, bylo jak Freundovo, tak RIBI adjuvans, použité ve spojení s pPAl 870-2680 (N/C), schopno vyvolávat in vivo neutralizující protilátky proti toxinu a C. difficile na rozdíl od preimunního IgY. Schopnost protilátek neutralizovat toxin A C. difficile, prokázaná v tomto příkladu a a v příkladu 35, jak se zdá, dobře koreluje s jejich ELISA reaktivitou vůči rozpustnému (nativnímu) rekombinačnímu proteinu. Z těchto výsledků vyplývá, že rekombinant toxinu A C. difficile, pPA1870-2680(N/C) je u slepic imunogenní a je schopen in vivo vytvářet neutralizující protilátky; protein pPA1870-2680(N/C) je tedy vynikající potenciální vakcínou.

Příklad 37

Enterosolventní povlak IgY, vytvořeného proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, pro orální aplikaci

Pro zjištění, zda je možno ptačí protilátky (IgY), vytvořené proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, opatřit enterosolventním povlakem, aby si případně ponechaly ochranné schopnosti in vivo, byl proveden následující experiment. Příklad zahrnoval a) enterosolventní povlékání protilátek proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, b) rozpouštěcí studii pro stanovení kinetiky desintegrace enterosolventně povlečených IgY v závislosti na pH a c) stanovení stability reaktivity protilátky po povlečení a rozpuštění pomocí ELISA.

a) Enterosolventní povlékání protilátek proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile

Pro nalezení efektivního postupu povlékání byly provedeny předběžné studie. Ptačí protilátky, opatření enterosolventním povlakem, by měly být v porovnání s protilátkami dodávanými v rozsahu odolnější vůči degradaci v žaludku, prová-li se aplikace orální cestou. Enterosolventní povlaky by měly zůstat v oblasti nízkého pH, nacházející se v žaludku, intaktní, a tudíž by měl být IgY schopen projít žaludkem bez degradace, ale rozpouštět se až při vyšším pH (asi 6,0) a uvolňovat se ve střevech. Dostatečnou vlastností enterosolventních filmů, zvolených pro testování, je skutečnost, že jsou během povlékacího procesu kompatibilní ve vodných roztocích místo organických rozpouštědel. Tato vlastnost enterosolventního filmu by pravděpodobně umožnila zachovat konformaci a integritu protilátky IgY během povlékacího procesu. Protože místem onemocnění C. difficile jsou střeva, umožnil by enterosolventní povlak IgY k toxinu C. difficile koncentrovat množství protilátek, jsoucích k dispozici v místě infekce, a tak zlepšit účinnost a snížit potřebnou účinnou dávku v porovnání s použitím nepovlečeného IgY.

Protilátky proti toxinu A C. difficile byly povlékány následujícím způsobem. Bylo připraveno g lyofilizovaných protilátek proti rekombinačnímu proteinu pMAl 870-2680 toxinu A

-144CZ 296806 B6

C. difficile (příklad 11). IgY z vajec slepic, imunizovaných rekombinačním proteinem, byl čištěn srážením PEG. Pelety IgY po čištění byly resuspendovány v 0,lX PBS, pH 7,4 o asi 1/4 výchozího objemu žloutku (4X) a množství 200 až 250 ml byla přenesena do 600 ml lyofilizačních baněk (Labconco). Roztoky IgY byly v baňkách mžikově zmrazený otočením v lázni reagenčního alkoholu, obsahující suchý led. Zmrazené protilátky byly lyofilizovány na zařízení Lamconco Freeze Dry System/Lyph Lock 4.5 unit podle pokynů výrobce. Z asi 250 ml 4X preparátu IgY se po lyofilizaci získalo asi 10 g sušiny.

Lyofilizovaný IgY byl odebrán do The Coating Plače lne. (Verona, WI) pro opatření enterosolventním povlakem. Protilátky byly enkapsulovány pomocí Wursterova kapslovací komory, která je velmi vhodná pro účinné a rovnoměrné povlékání materiálů v malém měřítku v jediné operaci. Enkapsulované IgY byly připraveny pomocí dvou různých procesů povlékání, buď jednostupňového přímého procesu, nebo dvoustupňového procesu s použitím nonpareil (tj. cukrové částice o velikosti 40 až 60 mesh). Lyofilizovaný IgY byl buď přímo překrýván filmovým povlakem, nebo byl prováděn dvoustupňový postup, při němž byl nejprve použit IgY k povlečení nonpareile. Cukrová částice, povlečená IgY, pak byla překryta enterosolventním filmem. Použití cukrové částice poskytuje objem navíc, který je potřebný k udržení protilátek v kapslovací komoře a může napomoci rovnoměrnějšímu nanesení enterosolventního filmu.

Byly vybrány dva různé vodné enterosolventní filmy a použity v každém povlékacím procesu. Lyofilizovaný IgY byl povlečen buď filmem Aquatec (FMC Corp.) nebo Eudragit^(R) L30D (Rohm Těch lne.). Oba tyto povlaky jsou vodorozpustné enterosolventní filmové povlaky, které se rozpouštějí při pH 6,5, resp. 5,5. Oba tyto filmy byly vybrány proto, že splňují výběrová kriteria vhodná pro výše uvedené potřeby. Každým z různých povlékacích postupů s použitím obou enterosolventních filmů byl získán produkt protilátky s enterosolventním povlakem. Dvoustupňový proces s použitím cukrové částice technicky usnadňoval celkový postup povlékání ve Wursterově zařízení, neboť vedl k menším ztrátám materiálu a tudíž vyšším výtěžkům konečného produktu. S použitím přímé metody bylo na IgY naneseno přibližně 27 až 30 % hmotnostních enterosolventního povlaku. Asi 70 % zbylé hmotnosti tohoto materiálu s enterosolventním povlakem tvořil IgY. S použitím cukrových částic, překrývaných IgY, bylo dosaženo asi 32 až 33 % enterosolventního povlaku. Zbylých 67 % hmotnostních enterosolventní částice bylo z asi 40 až 50 % tvořeno cukrovou částicí a asi z 20 % IgY.

b) Rozpouštěcí studie pro stanovení kinetiky desintegrace enterosolventního IgY v závislosti na pH

Pro každý IgY s enterosolventním povlakem byl stanoven rozpouštěcí profil. Správně povlečené částice IgY s enterosolventními filmy byl měly zůstat intaktní v žaludečních šťávách o pH 1 až 2, ale měly by se rozpouštět a uvolňovat IgY ve střevním prostředí o pH 7,5. Simulovaná žaludeční tekutina o pH asi 1,2 a simulovaná střevní tekutina o pH 7,5 byly připraveny podle metodiky USP, avšak s vynecháním trávicích enzymů [Uniterd States Pharmacopeia, sv. XXII (1990), Uniter States Pharmacopeia Convention, Rockville, MD, str. 1788-1789]. Na 1 ml těchto simulovaných tekutin bylo přidáno 10 mg každého enterosolventně povlečeného preparátu (tj. s povlaky Aquatic a Eudragit^(R)) a mírně mícháno po dobu 1 až 2 h při teplotě místnosti. V různých časových intervalech byl odebírán alikvot roztoku a zjišťována v něm přítomnost proteinu, uvolněného do roztoku. Množství proteinu v roztoku bylo stanoveno buď absorbancí při 280 nm, nebo s použitím proteinového testu BCA (Pierce).

Provedené studie demonstrovaly, že IgY, přímo povlékaný jak povlakem Aquateric, tak Eudragit^(R), a cukrové částice, překryté povlakem Aquatec, se při rozpouštěcí studii nechovají adekvátně. Po přídavku těchto částic byl během několika minut IgY uvolněn do roztoku jak při pH 1,2 tak 7,5. Rozpouštěcí profil pro cukrové částice IgY s povlakem Aquateric, monitorovaný absorbancí, je znázorněn na obr. 42. Rozpouštěcí profil pro cukrové částice IgY s povlakem Eudragit^(R) je znázorněn na obr. 43.

-145CZ 296806 B6

Na obr. 42 je vynesena absorbance při 280 nm proti času v minutách uvolňování IgY z částice překryté pomocí Aquateric v simulované žaludeční tekutině je znázorněno plnými čtverečky; uvolňování IgY z povlečené částice v simulované střevní tekutině je znázorněno prázdnými čtverečky. Protože film Aquateric samotný absorbuje UV při podobné vlnové délce jako protein (275 až 276 nm), není možno absorbanci UV při 280 nm použít k přesné kvantifikaci množství IgY v roztoku. Pro přesné stanovení koncentrace proteinu byl tedy protein kvantifikován po 1 h (60 min) rozpouštění metodou BCA.

Jak z obr. 42 vyplývá, bylo množství IgY, nalezené po rozpuštění preparátu s povlakem Aquateric v obou tekutinách podobné: 4 mg/ml při pH 1,2 a 4,9 mg/ml při H 7,5. Rozdíl v absorbanci, patrný z obr. 42 mezi žaludeční a střevní tekutinou, je důsledkem přítomnosti většího množství rozpouštěného filmu Aquateric ve střevní tekutině.

Na rozdíl od těchto nevyhovujících povlaků se cukrová částice slgY překrytá povlakem Eudragit^(R), řádně otvírala a uvolňovala IgY do roztoku v simulované střevní tekutině, a to v závislosti na čase, zatímco v žaludeční tekutině zůstávala intaktní. Rozpouštěcí profil cukrové částice s IgY, překryté povlakem Eudragit^(R), v žaludeční a střevní tekutině v závislosti na čase je znázorněn na obr. 43.

Na obr. 43 je vynesena absorbance při 280 nm proti času v minutách. Uvolňování IgY z částice překryté povlakem Eudragit^(R) v simulované žaludeční tekutině je znázorněno plnými čtverečky; uvolňování IgY z povlečené částice v simulované střevní tekutině je znázorněno prázdnými čtverečky. Protože Eudragit^(R) v množství, nalézajícím se v povlaku, UV neabsorbuje, je možno hodnoty absorbance při 280 nm přímo převést na koncentraci proteinu.

Jak z obr. 43 vyplývá, v žaludeční tekutině bylo uvolněno pouze málo nebo žádný protein, zatímco do střevní tekutiny byl protein uvolňován po asi 2 h. Z 10 mg/ml částic s povlakem Eudragit^(R) bylo pod rozpuštění získáno 2 až 2,5 mg/ml IgY. Částice s povlakem Eudragit^(R) v žaludeční tekutině zůstaly intaktní po dlouhou dobu, dokonce i po další inkubaci při 4 °C po dobu ještě jednoho týdne.

Rozpouštěcí profil cukrových částic s IgY s povlakem Eudragit^(R) byl stanoven za podmínek, které simulují normální fyziologické podmínky (tj. simulovaný průchod gastrointestinálním traktem). Částice byla nejprve vložena na 120 min do žaludeční tekutiny a pak 180 min inkubována ve střevní tekutině. Obě tyto inkubace probíhaly za mírného míchání při 37 °C. Za těchto podmínek (tj. inkubace v žaludeční tekutině následovaná inkubací ve střevní tekutině) nebyl IgY z cukrové částice s pohledem Eudragit^(R) uvolněn do proteinu žaludeční tekutiny, jako tomu je na obr. 42 (tj. inkubace pouze v žaludeční tekutině), ale v podobných hladinách jako na obr. 42 (2 až 2,5 mg/ml proteinu uvolněného po 2 h) byl uvolněn a detekován pouze ve střevní tekutině.

Výše popsané rozpouštěcí studie demonstrovaly, že IgY proti rekombinačnímu toxinů a C. difficile lze úspěšně povlékat s použitím Eudragit^(R) a nonpareil.

c) Stanovení stability reaktivity protilátky po povlečení a rozpuštění pomocí ELISA

Byla zjišťována stabilita IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. difficile po procesu povlékání. Testování bylo prováděno porovnáváním reaktivity ELISA protilátek před povlékáním a pak po povlečení s následným rozpouštěním při ph 1,2 a pak pH 7,5. Preimunní IgY, lyofilizovaný výchozí IgY proti rekombinačnímu toxinů A a IgY proti rekombinačnímu toxinů A, získaný z cukrové částice s IgY s povlakem Eudragit^(R) po rozpuštění byly nejprve kvantifikovány na protein a normalizovány na 2 mg/ml v PBS (pH 7,4). Postupem podle příkladu 35 b byla provedena ELISA, detekující protilátky proti rekombinačnímu toxinů A pTrxA1870-2680N/C. Výsledky ELISA jsou shrnuty v tabulce 46.

-146CZ 296806 B6

Tabulka 46. Porovnání titrů anti-rekombinantového toxinu A pomocí ELISA před a po enterosolventním povlékání

ředění	preimunní IgY*	anti-rekombinant A před povlakem	anti-rekombinant A po povlaku
1:50	0,017	1.4	1,2
1:250	0,005	0,59	0,38
1:1250	0,004	0,15	0,10
1:6250	0,005	0,037	0,026
1:31250	0,007	0,015	0,009
1:156250	0,009	0,009	0,007

* průměr hodnot A280

Výsledky uvedené v tabulce 46 demonstrují, že reaktivita IgY k rekombinantnímu toxinu A C. difficile před a po povlečení Eudragitem^(R) vůči rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile, byla velmi podobná. Tyto výsledky naznačují, že proces povlékání není vůči IgY škodlivý a IgY zůstává po rozpouštění za fyziologických podmínek aktivní a funkční.

Výše uvedené výsledky prokázaly, že byl vytvořen IgY s enterosolventním povlakem, který zůstal stabilní a aktivní.

Příklad 38

Vakcinace křečků proti infekci C. difficile rekombinačními proteiny toxinu A C. difficile

Za účelem zjištění, zda si křečci, vakcínovaní rekombinačními proteiny toxinu A C. difficile, vytvoří ochranné protilátky, proti infekci C. difficile, byl proveden následující experiment. Byly porovnávány tři různé rekombinanty toxinu A C. difficile, exprimované ve vektoru pMal-c nebo pEt. Příklad zahrnoval a) imunizaci křečků, b) detekci humorální a mukosální odpovědi protilátek proti rekombinantu pomocí ELISA a c) expoziční studii křečků s použitím C. difficile.

a) Imunizaci křečků

Tři skupiny po 9 až 11 samicích zlatých syrských křečků (Charler River) o hmotnosti 90 až lOOg byly testovány následujícím způsobem. Křečci z každé skupiny byli pro identifikaci jednotlivě označeni tetováním uší. Zvířata z každé skupiny byla ustájena společně a v průběhu experimentu jim byla podávána potrava a voda ad libitum. Křečci byli imunizováni dvěma různými rekombinačními fragmenty repetic proteinu toxinu A C. difficile, produkovanými ve vektoru pMal-c a exprimovanými s fúzí maltózu vázajícího proteinu (MBP), a jedním rekombinačním fragmentem repetic toxinu A C. difficile, produkovaným ve vektoru pET. Zvířata byla imunizována subkutánně 25 pg čištěného proteinu, buď pPA1870-2680N/C (příklad 15), pMAl 870-2680, subfragmentu pMA1870-2680 označeného pMA1960-2680, nebo samotného MBP (pMal-c) jako kontroly. Všechny tři rekombinační vektory pMal byly pěstovány a protein čištěn a exprimován postupem uvedeným v příkladu 28c. Rekombinační pPA1870-2680N/C byl čištěn postupem uvedeným v příkladu 29f.

-147CZ 296806 B6

Směsi, obsahující 200 μΐ antigenu a kompletní Freundovo adjuvans (pro první injekci) a nekompletní Freundovo adjuvans (pro následné injekce), byly podány subkutánně za krk. Vakcinace byla prováděna s použitím 1 ml tuberkulinové stříkačky velikosti 27 po lehké etherizaci zvířat.

Zvířata byla vakcínována pětkrát ve zhruba dvoutýdenních intervalech.

b) Detekce humorální a mukosální odpovědi protilátek proti rekombinantu

Detekce humorálního a mukosálního titru IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile u křečků byla prováděna pomocí ELISA. Pro humorální odpověď bylo shromážděno sérum z každé skupiny a testováno na hladinu IgY proti rekombinačnímu toxinu A. Alespoň 1 týden po poslední dávce byli křečci etherizováni, odebrána krev kardiální punkcí a shromážděno sérum. 96jamkové mikrotitrační destičky (Probind, Falcon) byly přes noc povlečeny rozpustným rekombinantem toxinu A C. difficile, pTrxA1870-2680N/C (příklad 29e) o koncentraci 0,05 pg/ml v PBS (pH 7,4) v množství 100 μΐ na jamku. Byl použit standardní postup ELISA, jak je popsán v příkladu 35b. Jako sekundární protilátka byl použit kozí antikřeččí IgG-alkalická fosfatáza (Southem Biotech) ve zředění 1/2000. Průměrná absorbance při 410 nm ze zdvojených testovacích jamek každého vzorku séra, zředěného 1/250, je zobrazena na obr. 44.

Na obr. 44 jsou uvedeny hodnoty OD₄i₀ při zředění séra 1:250, odebraného křečkům imunizovaným buď pMal-c (vektor pMal-c bez insertu), pMal870-2680 (příklad 28c), pMA1960-2680 (příklad 28b) nebo pPA1870-2680 (příklad 15). Čísla uvedená na ordinátě představují čísla přidělená zvířatům ve skupině.

Výsledky zobrazené na obr. 44 demonstrují, že všichni křečci, imunizovaní rekombinanty toxinu A C. difficile, reagovali produkcí IgG proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile v séru. Existovala určitá varianta odpovědi mezi křečky ve skupině, avšak tento rozdíl nebyl větší než 4násobný, průměrná reakce na pMA1960-2680 a pPA1870-2680 byla jednotně vyšší než odpověď na pMAl 870-2680. Křečci imunizovaní proteinem pMal neprodukovali odpověď anti-sérového IgG na rekombinační protein toxinu A C. difficile.

Pomocí ELISA bylo rovněž stanoveno, zda došlo k mukosální reakci IgA po imunizaci. Byla shromážděna čerstvě izolovaná stolice od 4 členů každé skupiny, zvážena a resuspendována promícháním ve 300 μΐ PBS, pH 7,4, s obsahem 0,05 % themerosalu na 100 mg stolice. Fekální suspenze byla odstřeďována 5 min při 14 000 min¹ v mikrocentrifuze. Výše uvedeným způsobem byly rekombinačním antigenem povrstveny mikrotitrační destičky. Byly použity standardní postupy ELISA s kozím anti-myším IgA-alkalickou fosfatázou (Southem Biotech) při 1/1000 jako sekundární protilátkou. Tento konjugát byl použit místo anti-křeččího IgA, protože anti-křeččí IgA není komerčně dostupný a již dříve bylo uvedeno, že anti-myší protilátky s křeččím, IgA křížově reaguje. V žádném vzorku fekálních extraktů nebyl pomocí ELISA detekován mukosální IgA proti rekombinačnímu toxinu A. Tyto výsledky potvrzují předchozí studie [Kim a Rolfe (1989), Microbial Ecology in Health and Disease 2:47], při nichž nebyl u křečků, imunizovaných toxoidem připraveným z toxinu A C. difficile, detekován IgA proti toxoidu A.

c) Expoziční studie křečků pomocí C. difficile

Vakcínovaní křečci (popsaní v odstavci a) byli vystaveni působení C. difficile za účelem zjištění, zda protilátky proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile chrání proti onemocnění C. difficile. Normální křečci, infikovaní toxigenním kmenem C. difficile, si vyvinou fatální onemocnění, začínající průjem, a nakonec uhynou v důsledku silní enterokolitidy apendixu (proximálního tlustého střeva) a ilea (jak uvedeno v příkladu 9).

Čtyři skupiny vakcínovaných křečků byly nejprve predisponovány intraperitoneální dávkou klindamycin-fosfátu (Biomol) v 1 ml vody v množství 1 mg na 100 g tělesné hmotnosti. Po asi 24 h byli křečci orálně exponováni pomocí krmné jehly o velikosti 18 1.10⁶ organismů C. difficile, v ml sterilního salinického roztoku. Před podáním byla zvířata lehce anestetizována etherem. Byl

-148CZ 296806 B6 použit toxigenní kmen C. difficile ATCC 43596 po 48 h kultivaci na destičkách CCFA (BBL).

Jeden křeček ze skupiny imunizované pMA 1960-2680 uhynul náhodně v důsledku předávkování etheru a snížil tak počet zvířat ve skupině z 9 na 8. Výsledky imunizační studie jsou uvedeny v tabulce 47.

Tabulka 47. Vakcinace proti letální enterokolitidě C. difficile pomocí rekombinačních fragmentů toxinu A

skupina	% ochrany
pMal-c (MBP)	10% (1/10)
pMA1960-2680	62 % (5/8)
pMA1870-2680	30% (3/10)
pPA1870-2680	19% (2/11)

Výsledky uvedené v tabulce 47 demonstrují, že k ochraně proti úhynu došlo u některých křečků, imunizovaných každým z rekombinačních proteinů toxinu A (tj. pMA1960-2680 a pMA18702680). Tyto výsledky nejsou statisticky významné ve srovnání s fúzní kontrolou (pMal-c, který exprimuje pouze MBP) s hodnotou P 0,05 nebo menší při analýze chi-square. V kontrolní skupině imunizované fúzním proteinem (pMal-c) došlo k devadesátiprocentní mortalitě. Procento mortality ve skupině imunizované pMA1960-2680 bylo 38 %. Procento mortality ve skupině imunizované pMA1870-2680 bylo 70% a ve skupině imunizované pPAl 870-2680 81 %. Doba do úhynu nebyla ve skupině vakcínované rekombinačním toxinem A C. difficile nebyla oproti kontrole prodloužena a činila až 3 dny po infekci. Nekropsie uhynulých křečků ukázala typickou patologii, jako je silné megacékum.

Specifické hodnoty P pro zkušení skupiny ve srovnání s kontrolní skupinou pro pMAl960-2680, pMAl 870-2680 a pMAl 870-2680 byly menší než 0,10, resp. menší než 0,75, resp. menší než 0,90. Všichni křečci až na jednoho ve skupině imunizované pMAl 870-2680 měli do 1 až 2 dnů po infekci průjem. Zdá se, že není korelace mezi titry protilátek proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a úrovní ochrany. Například křeček č. 6 ve skupině imunizované pMA1960-2680 měl nižší titr ELISA oproti křečkovi č. 2 (viz obr. 44), a přesto č. 6 přežilo a č. 2 nebylo chráněno a uhynulo. Z těchto výsledků vyplývá, že křečci, vakcínovaní kterýmkoli z repetičních proteinů rekombinačního toxinu A C. difficile, nebyli chráněni před průjmem, vyvolaným C. difficile, a z 19 až 62 % byli chráněni před letálním stadiem nemoci.

Výše uvedené výsledky korelují s dříve publikovanou prací [Lyerly a d. (1990), Curr. Microbiol. 21:29], která ukázala, že křečci, vakcínovaní menším rekombinačním fragmentem toxinu A C. difficile (interval 1960-2680), exprimovaným vpUC9, mohli být před letálním stadiem nemoci chráněni také pouze částečně a žádný z těchto křečků nebyl chráněn proti průjmu. Lyerly a d. [(1990)], Curr. Microbiol. 21:29] uvedli, že testované protilátky k rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile nezabránily diaroickému stadiu nemoci a úhyn u poloviny křečků byl důsledkem různých hladin neutralizujících sérových protilátek k rekombinantu toxinu A. Na základě těchto výsledků je možno soudit, že rozdíly titrů proti rekombinačnímu toxinu a C. difficile mezi křečky nemusejí vysvětlovat, proč k ochraně nedochází u všech zvířat. Tyto výsledky naznačují, že pro účinnější vakcínu proti onemocnění C. difficile je pravděpodobně potřebná další složka, pravděpodobně rekombinační protein toxinu B.

-149CZ 296806 B6

Příklad 39

Vakcinace křečků proti infekci C. difficile rekombinačními proteiny toxinu A a toxinu B C. difficile

Křečci byli imunizováni rekombinačním toxinem a nebo rekombinačním toxinem B C. difficile samotným nebo v kombinaci za účelem zjištění, zda to vyvolá humorální odpověď na tyto rekombinační proteiny. Dále byla testována schopnost protilátek, produkovaných těmito vakcinacemi, chránit křečky před infekcí C. difficile. Konkrétně bylo zjištěno, zda protilátky, vytvořené proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile, budou poskytovat nějakou ochranu in vivo jako takové nebo nad ochranu poskytovanou vakcinací rekombinačním toxinem A C. difficile samotným. Příklad zahrnoval a) imunizaci křečků, b) stanovení humorální a mukosální odpovědi pomocí ELISA a c) expoziční studie in vivo u vakcínovaných křečků.

a) Imunizace křečků

Pro vakcinací byl použit rekombinační protein toxinu A C. difficile pPA1870-2680N/C (příklady 11 a 29) a rekombinační protein toxinu B C. difficile pPB1750-2360 (příklad 15b). Rekombinační proteiny byly místo vektoru pMal-c, použitém v příkladu 38, exprimovány ve vektoru pET, protože bylo zjištěno, že proteiny exprimované a izolované pomocí vektoru pET jsou schopny vyčištění na vyšší úroveň čistoty s nižší hladinou endotoxinu. Produkce rekombinačních proteinů ve vektoru pET je zvlášť vhodná v případě potenciálního využití rekombinačního proteinu jako humánní vakcíny, která vyžaduje vysokou čistotu a nízkou hladinu potenciálně škodlivého endotoxinu.

Pro imunizaci bylo smíseno 100 pg pPA1870-2680, 100 pg pPB1750-2360 nebo 100 pg každého z nich v kombinaci (celkem 200 pg) s 2 pg Gerbuho adjuvans (Biotech). Kontrolní skupina byla imunizována 100 pg bovinního sérového albuminu (BSA) s Gerbuho adjuvans. Každá skupina (z celkem čtyř) byla tvořena 9 až 10 samicemi zlatých syrských křečků (Charles River) o hmotnosti 100 g. Zvířata byla po identifikaci individuálně označena. Před subkutánní injekcí za krk pomocí 1 ml stříkačky s jehlou velikosti 27 byli křečci lehce anestetizováni. Křečci byli imunizováni čtyřikrát ve zhruba dvoutýdenních intervalech.

b) Stanovení humorální a mukosální odpovědi protilátek pomocí ELISA

Pomocí ELISA bylo sérum ode všech jedinců ze všech výše uvedených skupin testováno na hladinu IgG proti rekombinačnímu proteinu. Alespoň 1 týden po poslední dávce byla zvířatům z každé skupiny odebrána kardiální punkcí krev a bylo shromážděno sérum. Ve vzorcích séra byly pomocí ELISA stanovovány protilátky proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a proti rekombinačnímu toxinu C. difficile. 96jamkové mikrotitrační destičky (Probind, Falcon) byly přes noc překryty při 4 °C buď proteinem pPAl 870-2680 v koncentraci 0,05 pg/ml, nebo proteinem pPB1750-2360 v koncentraci 1,0 pg/ml v PBS (pH 7,4) v množství 100 pl na jamku. Byly použity standardní postupy ELISA přesně podle uvedeného postupu (příklad 13c). Výsledky jsou znázorněny na obr. 45 a 46.

Na obr. 45 až 46 je uvedena průměrná absorbance zdvojených vzorků séra ve zředění 1/250. Obr. 45 ukazuje individuální reaktivitu protilátek vůči rekombinantu toxinu A C. difficile ve skupinách imunizovaných buď rekombinantem toxin A C. difficile (pPAl 870-2680) nebo menší rekombinačních toxinů A a B C. difficile (pPA1870-2680 a pPB 1750-2360). Obr. 46 znázorňuje reaktivitu protilátek vůči rekombinačnímu toxinu B C. difficile ve skupinách imunizovaných buď rekombinantem toxinu B C. difficile (pPB 1750-23 60), nebo směsí rekombinačních toxinů A a B C. difficile (pPA1870-2680 a pPB 1750-2360).

-150CZ 296806 B6

Výsledky znázorněné na obr. 45 a 46 demonstrují, že ve všech případech každé zvíře reagovalo a produkovalo specifickou odpověď protilátky IgG vůči imunogenu. Jak bylo očekáváno, křečci imunizovaní BSA (negativní kontrolní skupina) nevyvolali žádnou odpověď protilátek vůči rekombinačním antigenům. Odpověď vůči rekombinačnímu toxinu A nebo B C. difficile u členů téže skupiny byla podobná.

Pomocí ELISA bylo rovněž provedeno stanovení, zda byla po imunizaci vyvolána také mukosální odpověď IgA proti rekombinačnímu toxinu a C. difficile nebo rekombinačnímu toxinu B C. difficile. Byla shromážděna čerstvě izolovaná stolice od 4 členů každé skupiny, zvážena a zpracována postupem uvedeným v příkladu 21. Destičky byly převrstveny výše uvedeným antigenem rekombinačního toxinu A C. difficile nebo rekombinačního toxinu B C. difficile za účelem zjištění hlavy sérového IgG. byly použity standardní postupy ELISA (příklad 13c) ve spojení s kozí anti-myší IgA-alkalickou fosfatázou (Southem Biotech, Birmingham, AL). V žádném vzorku fekálního extraktu nebyl detekován IgA proti rekombinačnímu toxinu A nebo B. Tento výsledek s použitím různých rekombinantů opět potvrzuje, co již bylo zjištěno v příkladu 38 a dřívějších studiích [Kim a Rolfe (1989), viz výše].

c) Expoziční studie u vakcínovaných křečků in vivo

Vakcínovaní křečci, popsaní v odstavci a), byli vystaveni působení C. difficile za účelem zjištění, zda odpověď protilátek séra vůči rekombinačním toxinům A nebo B C. difficile jednotlivým nebo v kombinaci chrání proti CDAD. Každá ze čtyř skupin vakcínovaných křečků byla nejprve predisponována vůči CDAD intraperitoneální dávkou klindamycin-fosfátu (Biomol) v 1 ml vody v množství 1 mg na 100 g hmotnosti. Po asi 24 h bylo křečkům pomocí krmné jehly o velikosti 18 orálně podáno 1.10⁶ organismů C. difficile v 1 ml sterilního salinického roztoku. Před podáním byla zvířata lehce anestetizována etherem. Byl použit toxigenní kmen ATCC 43596 po 48 kultivaci na destičkách CCFA (BBL). Výsledky imunizační studie jsou uvedeny v tabulce 48.

Tabulka 48. Vakcinace proti letální enterokolitidě C. difficile pomocí rekombinačních polypeptidů toxinu a a toxinu B

skupina3	% ochrany
BSA	0 % (0/10)
pPA1870-2680N/C	20% (2/10)
pPB1750-2360	0%(0/10)
pPA1870-2680N/C & pPB1750-2360	100% (9/9)

^a vakcínováni subkutánně čtyřikrát ve dvoutýdenních intervalech 100 pg rekombinačního proteinu na křečka

Jak z tabulky 48 vyplývá, po jednom až třech dnech po expozici C. difficile se u všech křečků imunizovaných buď pPA1870-2680, nebo pPB1750-2360 a kontrolní skupiny BSA vyvinul průjem. Všichni křečci v těchto třech skupinách, kromě dvou členů imunizovaných pPAl 870-2680, uhynuli po několika až 48 h po detekovaném nástupu průjmu. Nekropsie zvířat ukázala silnou enterokolitidu se zaníceným a zvětšeným apendixem, charakteristickým pro onemocnění C. difficile. Naproti tomu křečci, imunizovaní vakcínou obsahující kombinaci proteinů pPAl 870-2680 a pPB 1750-2360, nevykazovali žádné známky onemocnění, jako je průjem, a zůstali zdraví po celou dobu 14 dní pozorování po infekci. Ve skutečnosti zůstala tato zvířata zdravá po dobu alespoň 5 měsíců po infekci; tyto výsledky demonstrují, že vakcinace kombinací

-151 CZ 296806 B6 proteinů pPAl 870-2680 a pPB1750-2360 poskytuje kompletní a dlouhodobou ochranu křečků, inokulovaných pomocí C. difficile.

Ochranný účinek, pozorovaný u kombinované vakcíny, nebyl důsledek rozdílného titru protilátek v této skupině oproti titrům protilátek u křečků vakcínovaných pouze rekombinačním toxinem A C. difficile nebo toxinem B C. difficile. Ochrana křečků, imunizovaných kombinací toxinů A/B C. difficile (tj. pPA1870-2680 a pB1750-2360), byla ve srovnání s kontrolou statisticky významná; hodnota P byla stanovena jako méně než 0,001.

Uvedené výsledky demonstrují, že oba rekombinační proteiny toxinu A a toxinu B C. difficile jsou klíčovými složkami účinné vakcíny proti C. difficile a vyvolání protilátek proti rekombinačním toxinům A nebo B C. difficile samotným nepostačuje k dodání kompletní ochrany. Protilátky vytvořené proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile navíc k rekombinačnímu toxinu A C. difficile spolu poskytují ochranu a působí synergicky při neutralizaci průjmu a úhynu spojeného s C. difficile. I když není vynález omezen na určitý mechanismus, může ochrana sérovými protilátkami proti toxinu C. difficile vyplývat z úniku protilátek, neutralizujících toxin A a B C. difficile, do tkání nebo do střevní dutiny během zánětu, který doprovází časná stadia enterokolitidy C. difficile.

Výsledky uvedené výše (vakcinace křečků rekombinačními toxiny A a B C. difficile) a v příkladu 32(c)(iii) (podávání antitoxinu obsahujícího směs protilátek vytvořených proti oběma toxinům A a B C. difficile) se navzájem silně podporují. Společně demonstrují, že plná ochrana před CDAD (tj. ochrana před morbiditou i mortalitou) vyžaduje použití rekombinačních proteinů odvozených od obou toxinů A i b C. difficile pro buď aktivní, nebo pasivní imunizaci.

Příklad 40

Ochrana in vivo pro infekci C. difficile parenterálním podáním protilátek proti rekombinačním proteinům, toxinu A a B C. difficile

Výsledky uvedené v příkladu 39 demonstrují, že vakcinace křečků proteiny A a B C. difficile vytváří u příjemců neutralizující sérové protilátky, které poskytují kompletní ochranu (tj. ochranu před morbiditou i mortalitou) proti zhoubným účinkům infekce C. difficile. Příklad 38 demonstruje, že vakcinace křečků rekombinačními proteiny toxinu A C. difficile produkuje neutralizující sérové protilátky proti toxinu A (IgG), ale nedetekovatelnou hladinu mukosálních (IgG) protilátek proti toxinu A. Produkce sérových protilátek pro toxinu A a B je dostatečná pro ochranu proti CDAD. Pro zjištění, zda účinným způsobem léčby infekce C. difficile je parenterální aplikace IgY proti rekombinačním toxinům A a B, se provádí následující experiment.

Šest skupin samic zlatých syrských křečků (Charles River) po 9 až 10 členech o hmotnosti 80 až 100 g se způsobem uvedeným v příkladu 32c) infikuje C. difficile. Zvířata jsou ustájena ve klecích po třech a během studie dostávají potravu a vodu ad libitum. Na začátku studie je každý křeček predisponován vůči infekci intraperitoneální aplikací klindamycin-fosfátu (Biomol) v množství 1 mg/100 g tělesné hmotnosti v 1 ml vody pomocí 1 ml tuberkulinové stříkačky (velikost jehly 27). Po přibližně 24 h se každému zvířeti podá pomocí krmné jehly o velikosti 18 1 ml C. difficile (kmen ATCC 43596) s přibližně 10³ až 10⁴ organismy ve sterilním salinickém roztoku. Před infekcí se organismy kultivují 48 h na destičkách CCFA (BBL).

h po infekci (den 3) se následujícím způsobem zahájí léčba. Každý křeček dostane 2 ml roztoku obsahujícího buď preimunní IgY (jako 8X PEG preparát), nebo směs látek proti rekombinačním toxinů A a B (tj. antitoxin vytvořený proti pMAl870-2680 a pPB 1750-2360). 8X PEG preparáty se připraví a mísí způsobem uvedeným v příkladu 32(c)(ii) s tou výjimkou, že IgY se místo v karbonátovém pufru resuspendují ve sterilním salinickém roztoku. Preparáty IgY se podávají

-152CZ 296806 B6 intraperitoneální injekcí. Preparáty IgY se podávají jednou, dvakrát nebo třikrát denně po dobu 4 dnů (doba léčby).

Zvířata se pozorují z hlediska nástupu průjmu a úhynu během doby léčby a po ní. Vypočte se úroveň ochrany poskytnutá každou léčebnou dávkou. Poskytuje-li nejnižší dávka ochranu u významného počtu křečků, testují se v následných experimentech za výše uvedených podmínek nižší dávky. Například se zjištění nejnižší intraperitoneální dávky, dostatečné pro ochranu, testuje 1,0 a 0,5 ml preparátu IgY na zvíře během 4 dnů. Jsou-li po dodání ochrany intraperitoneální injekcí potřebné pouze velmi malé dávky IgY, dodává se IgY i intravaskulámí injekcí za účelem zjištění, zda ochranu před infekcí C. difficile poskytuje také intravaskulámí aplikace PEG preparátů IgY.

Příklad 41

Léčba křečků infikovaných C. difficile pomocí enterosolventně povlečeného IgY proti rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile

Pro zjištění, zdaje enterosolventně povlečený IgY proti rekombinačnímu toxinu A (příklad 37a) účinný při léčbě infekce C. difficile u křčků v nižší dávce, která je potřebná v případě použití stejného IgY bez enterosolventního povlaku, byl proveden následující experiment.

Křečci model infekce se provádí přesně podle údajů v příkladu 32c, avšak s tou výjimkou, že místo nepovlečeného IgY v karbonátovém pufru se použije enterosolventně povlečený antitoxin (pMAl 870-2680 nanesený na nonpareil a poté povlečený Eudragitem^(R)). Stručně řečené se tři skupiny křečků (Sasco) po 7 členech predisponují vůči infekci pomocí klindamycin-fosfátu (Biomol) v dávce 1 mg/100 g tělesné hmotnosti. Po 24 h se každému zvířeti orálně podá pomocí krmné jehly o velikosti 18 1 ml C. difficile (ATCC 43596) s obsahem přibližně 1.10³ organismů ve sterilním salinickém roztoku. Před infekcí se organismy 48 h kultivují na destičkách CCFA (BBL).

Po 3 h po infekci (den 1) se zahájí léčba orální aplikací různých koncentrací antitoxinu IgY s povlakem Eudragitu^(R): Každá skupina dostává po dobu 4 dní jednou denně 0 (kontrolní skupina), 2, 20, 50, 100 nebo 600 mg IgY s enterosolventním povlakem. Orální aplikace enterosolventně povlečených částic křečků se provádí tak, že každá dávka se vloží do mikrocentrifugační nádobky, částice se resuspendují v pufru o nízkém pH, jako je acetát (pufiru o nízkém pH se používají pro zabránění uvolňování IgY z enterosolventně povlečené částice před dodáním křečkovi); pak se suspenze orálně podává pomocí krmné jehly o velikosti 14. Během doby léčby a po jejím skončení se zvířata pozorují z hlediska nástupu průjmu a úhynu. Vypočte se procento souhrnné mortality (tj. úhynu) a morbidity (tj. průjmu).

Výsledky výše uvedeného experimentu (podávání enterosolventně povlečeného IgY) se porovnávají s výsledky získanými v příkladu 32c. V příkladu 32c byly použity stejné podmínky infekce, ale protilátky proti toxinu A byly podávány v karbonátovém pufru a neměly enterosolventní povlak. V příkladu 32c bylo 50 % křečků, léčených pro infekci nepovleČeným IgY, chráněno před úhynem v důsledku C. difficile. Množství celkového IgY, podané za den v příkladu 32c, bylo asi 120 mg. Z této dávky činilo množství specifické protilátky za den, potřebné k dosažení této úrovně ochrany (tj. 50 % přežití), asi 1200 pg specifického IgY. V nynějším příkladu bylo každému křečkovi podáváno 2, 20, 50, 100 nebo 600 mg enterosolventně povlečeného IgY. Protože IgY tvoří pouze 1/5 hmotnosti takovéhoto enterosolventního materiálu, je skutečné množství IgY, podávané v dávkách 2, 20, 50, 100 a 600 mg asi 0,40 mg, 4 mg, 10 mg, 20 mg, resp. 120 mg. Z toho asi 1 % je specifický IgY proti rekombinačnímu toxinu A. Dávka 600 mg enterosolventní částice (tj. preparátu IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, povlečeného Eudragitem^(R)) je zhruba ekvivalentní množství protilátky dodané v karbonátovém pufřu v příkladu 32c, která poskytla 50% ochranu. Porovnání dávky enterosolventních částic, potřebné

-153CZ 296806 B6 k poskytnutí stejné (tj. 50%) úrovně ochrany, ukazuje stupeň zvýšené účinnosti, poskytuje enterosolventním povlečením preparátu IgY. Výsledky výše uvedeného demonstrují, zda je enterosolventně povlečený IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (příklad 37a) účinný při léčbě infekce C. difficile u křečků při nižší dávce ve srovnání s nepovlečenou protilátkou k rekombinačnímu toxinu A.

Podobně se způsobem uvedeným v příkladu 37a enterosolventně povleče také IgY rekombinačního toxinu B C. difficile (tj. anti-pPB 1750-2360). Enterosolventně povlečený IgY proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile je testován na výše popsaném křeččím modelu infekce samotný nebo v kombinaci s enterosolventně povlečenou protilátkou proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (tj. povlečeným preparátem IgY proti pMAl870-2680). Výsledky těchto experimentů demonstrují, zda jsou enterosolventně povlečené IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile (příklad 37a) účinné při kompletní ochraně zvířat před morbiditou a mortalitou spojenou s infekcí C. difficile při nižších dávkách oproti použití nepovlečených IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile.

Příklad 42

Stanovení minimální účinné dávky ptačích protilátek v karbonátovém pufru proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B C. difficile pro léčbu křečků infikovaných C. difficile

Byla stanovena minimální účinná dávka ptačích protilátek (IgY), vytvořených proti rekombinačnímu proteinu toxinu A a rekombinačnímu proteinu B, potřebná k léčbě onemocnění spojeného s C. difficile (CDAD) u křečků. Experiment zahrnoval infekční studio in vivo, při níž byli křečci ošetřováni různými koncentracemi IgY, vytvořených proti rekombinačnímu toxinu A a rekombinačnímu toxinu B.

Byly vytvořeny protilátky proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (pMAl 870-2680 - interval A-6) s použitím adjuvans RIBI a proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile (pPB 1750-2360; interval B-3) s použitím Freundova adjuvans. Postup imunizace byl prováděn podle příkladu 35. Protilátky byly přečištěny pomocí PEG a resuspendovány v koncentraci 8X (všechny obsahovaly asi 40 mg/ml IgY) v 0,1 M karbonátovém pufru, pH 9,5.

Infekční studie zahrnovala testování tří experimentálních skupin (I, II a III). Zvířata ve skupině I dostávala 2 ml preimunního IgY. Zvířata ve skupině II dostávala 1 ml směsi obsahující IgY proti toxinu A C. difficile a proti toxinu B C. difficile. Zvířata ve skupině ΙΠ dostávala 2 ml směsi podávané skupině II. Každou skupinu tvořilo osm zlatých syrských křečků (Sasco), vážících v průměru 79 ± 3,2 g. Křečci byli ustájeni v klecích po dvou nebo třech a během studie jim byla podávána potrava a voda ad lilbitum. Infekční studie byla prováděna postupem uvedeným v příkladu 31c.

Křečci byli predisponováni vůči infekci C. difficile I.P. aplikací 1 mg/100 g tělesné hmotnosti klindamycin-fosfátu (Biomol) v 1 ml sterilní vody. I.P. aplikace klindamycinu byla prováděna pomocí 1 ml tuberkulinové stříkačky (Terumo) o velikosti 27. Po asi 24 h byl každý křeček orálně infikován přibližně 1 ml sterilního salinického roztoku s obsahem 1.10⁴. C. difficile (kmen ATCC 43596). Před inokulací bylo C. difficile kultivováno asi 48 h na destičkách CCFA (agar cykloserin-ceroxitinfruktóza-vaječný žloutek, médium selektivní a diferenciální pro C. difficile) (BBL).

Po 8 h od inokulace (den 1) byla zahájena léčba. Křečci v každé ze tří skupin byli pomocí krmné jehly o velikosti 18(Popper) ošetřováni jedním ze tří způsobů. Skupina I dostávala 2 ml preimunního IgY (jako 8X PEG) preparát), skupina II dostávala 1 ml imunního IgY (tj. směs protilátek vytvořených proti pMA1870-2680 [interval A-6] a pPB1750-2360 [interval B-3]) a skupina III dostávala 2 ml imunního IgY.

-154CZ 296806 B6

Směs imunního IgY byla připravena smísením stejných objemů 8X koncentrátu IgY, vytvořeného proti pMAl870-2680, a 8X koncentrátu IgY vytvořeného proti pPB 1750-2360; výsledná směs byla označena A-6/B-3 IgY. Množství specifických protilátek proti toxinovému proteinu, obsaženého v této směsi A-6/B-3 IgY bylo asi 1,2 mg/ml IgY proti rekombinačnímu toxinu A a asi 400 pg/ml IgY proti rekombinačnímu toxinu B. Tato množství byla stanovena afinitním čištěním postupem podle příkladu 15c. Množství celkového IgY v dávce 2 ml IgY bylo asi 80 mg a v dávce 1 ml asi 40 mg.

Křečci byli ošetřováni jednou denně po dobu 3 dní. [Dávkovači schéma se v tomto léčebném režimu liší od schématu použitého v předchozích příkladech (například příkladu 32), kdy byli křečci ošetřováni po dobu 3 dní třikrát denně 2 ml.] Všichni křečci byli během doby léčby a po ní pozorováni z hlediska nástupu průjmu a úhynu. Výsledky jsou znázorněny na obr. 47 a tabulce 49.

Na obr. 47 je na ose souřadnic zobrazena úhrnná mortalita (vyjádřená procentem) a na ose úseček čas (vyjádřený ve dnech). Délka doby léčby, označená na obr. 47 vodorovnou úsečkou, byla 3 dny. Podání klindamycinu a inokulace pomocí C. difficile („infekce“) jsou označeny šipkami. Plné čtverečky představují křečky ze skupiny I (tj. křečky ošetřované 2 ml preimunního IgY). Prázdné čtverečky představují křečky ze skupiny II (tj. křečky ošetřované 1 mg IgY A-6/B-3). Plné kosočtverce představují křečky ze skupiny III (tj. křečky ošetřované 2ml IgY A-6/B-3).

Výsledky znázorněné na obr. 47 demonstrují, že všichni křečci (tj. 8/8) ve skupině III byli chráněni proti úhynu. Naproti tomu ve skupinách I a II přežilo pouze 13 % (tj. 1/8) křečků. Stupeň ochrany ve skupině III byl pomocí analýzy chi-square statisticky významný s hodnotou P <0,005.

V následující tabulce jsou uvedeny výsledky získané s použitím IgY A-6/B-3. Dávka uvedená v této tabulce se vztahuje na koncentraci celkového (nikoli specifického) IgY, podávaného zvířatům v dávce 1 nebo 2 ml.

Tabulka 49. Prevence morbidity in vivo pomocí IgY A-6/B-3

skupina	% zvířat s průjmem	střední hmotnost1
preimunní, 80 mg (skupina 1)	100	67,3 ± 3,9
A-6/B-3,40 mg (skupina II)	100	69 ± 4,2
A-6/B-3, 80 mg (skupina III)	0	81,6 ±5,5

¹ hmotnost vyjádřená v gramech ± SD; střední výchozí hmotnost křečků byla 79 ± 3,2 g. U zvířat, která uhynula, byla hmotnost zjišťována v době smrti. U přeživších byla hmotnost zjišťována po skončení léčby.

Z výsledků uvedených v tabulce 49 vyplývá, že morbiditě bylo zabráněno také jestliže byli křečci ošetřováni s použitím 2 ml IgY A-6/B-3 denně. Morbidita v důsledku CD AD je zde definována jako zahrnující průjem a úbytek hmotnosti. Jak je patrné z tabulky 49, žádný křeček ve skupině II neměl průjem. Naproti tomu křečci, ošetřovaní buď 1 ml IgY A-6/B-3 (skupina II), nebo 2 ml preimunního IgY (skupina I) průjem vykazovali. Navíc všichni až na jednoho křečka ve skupinách I a II do asi 48 h po nástupu průjmu uhynuli prevence průjmu ve skupině III byla v porovnání se zbylými dvěma skupinami statisticky významná (P < 0,001).

-155CZ 296806 B6

Výsledky uvedené v tabulce 49 navíc ukazují, že křečci ošetřovaní buď 2 ml preimunního IgY (skupina I) nebo 1 ml IgY A-6/B-3 (skupina II) ztratili 14 % své střední výchozí hmotnosti před infekcí. Naproti tomu zvířata ošetřovaná 2 ml IgY A-6/B-3 (skupina III) po skončení léčby přibyla o asi 2 % své střední výchozí hmotnosti.

Na základě výše uvedených výsledků je minimální účinná terapeutická dávka specifické IgY k oběma rekombinačním toxinům A a B C. difficile (pMAl 870-2680 a pPB 1750-2360;, interval A-6, resp. B-3), nutná k prevenci mortality a morbidity v důsledku CDAD u křečků za výše uvedených podmínek (tj. v karbonátovém pufru), asi 2,4 mg IgY A-6 a asi 800 pg IgY B-3 denně po dobu 3 dní.

Příklad 43

Stanovení specifického IgY ve slepém střevu křečka ošetřovaného protilátkami proti rekombinačního toxinu A C. difficile a proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile

Bylo zjišťováno množství specifického IgY proti toxinu C. difficile, nacházející se ve slepém střevě křečka, ošetřovaného protilátkami, vytvořeným proti rekombinačnímu toxinu A (pMAl 870-2680; A-6) a rekombinačnímu toxinu B (pPB 1750-2360; B-3). Výsledky této studie poskytují přibližnou velikost terapeutické dávky IgY proti rekombinačnímu toxinu A a rekombinačnímu toxinu B (IgY A-6/B-3), která musí být přítomna v místě infekce, aby chránilo zvíře infikované C. difficile.

Tento příklad zahrnoval a) získání cekálního obsahu od neošetřovaného křečka a od křečka ošetřovaného IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile (tj. IgY A-6/B-3), b) přímé stanovení množství specifického IgY A-6 a IgY B-3 v cekálním obsahu pomocí ELISA a c) přímé stanovení celkového IgY ve slepém střevě pomocí ELISA a nepřímé stanovení specifického IgY..

a) Získání cekálního obsahu od neošetřeného křečka a od křečka ošetřeného IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile (IgY A-6/B-3)

Křeček byl ošetřován postupem pro skupinu III, uvedeným v příkladu 42 (tj. křeček úspěšně léčený na CDAD pomocí 2 ml 8X IgY A-6/B-3 denně po dobu 3 dní). Po 4 h po podání poslední dávky IgY byl křeček usmrcen pomocí esteru. Kontrolní křeček byl pro predispozici vůči infekce C. difficile ošetřen klindamycinem, avšak nedostal ani IgY, ani C. difficile a sloužil jako negativní kontrola. Kontrolní křeček byl usmrcen dva dni po podání klindamycinu.

Oběma křečkům bylo odebráno slepé střevo a většina cekálního obsahu byla shromážděna do 15 ml odstředivkové nádobky. Každá nádobka obsahovala několik ml cekálního materiálu. Obsah každé nádobky byl promíchán a z každé nádobky byl odebrán alikvot 1 ml do 1,5 ml mikrocentrifugační nádobky. Tyto nádobky byly podrobeny mikrocentrifugaci po dobu 1 min při 14 000 min¹. Byl sebrán získaný supematant a ve vzorcích byl pomocí ELISA kvantifikován specifický IgY.

b) Přímé stanovení množství specifického IgY A-6 a IgY B-3 v cekálním obsahu pomocí ELISA

Hladiny IgY proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B, přítomného v cekálním obsahu, byly detekovány pomocí ELISA postupem uvedeným v příkladu 13c s těmito modifikacemi: 96jamkové mikrotitrační destičky byly přes noc při 4 °C povlečeny (100 μΐ/jamku) pomocí 0,05 pg/ml rekombinačního proteinu toxinu a C. difficile [pPAl 870-2680 (N/C) (příklad 29)] nebo 1 pg/ml rekombinačního proteinu toxinu B C. difficile [pPB1750-2360 (příklad 18b)] vpBS, pH 7,4.

Cekální vzorky byly nejprve dvojnásobně zředěny PBS a umístěny do jamek. Zředěné vzorky

-156CZ 296806 B6 pak byly v mikrotitračních jamkách pětinásobně sériově ředěny. Všechny vzorky byly testovány zdvojeně.

Kvantifikace hladin specifického IgY v cekálních vzorcích byla při testech ELISA prováděna porovnáváním reaktivity protilátek, zaměřené buď proti rekombinačnímu toxinu A, nebo rekombinačnímu toxinu B, s reaktivitou vyvolanou známým množstvím afinitně čištěného IgY. IgY, specifické pro rekombinační toxiny A a B C. difficile, byly čištěny postupem uvedeným v příkladu 15c. Stručně řečeno byly zPEG-čištěny IgY z vajec slepic, imunizovaných buď pMA1870-2680 (interval A-6), nebo pPB1750-2360 (interval B-3), izolovány afinitně čištěné protilátky. PEG-čištěný IgY proti pMA 1870-2680 byl afinitně čištěn pomocí sloupce, obsahujícího pMAl 870-2680 vázaný na Actigel (Sterogene). PEG-čištěný IgY proti pPB1750-2360 byl afinitně čištěn pomocí sloupce Actigel, obsahující pPB1850-2360 (příklad 15c), což je rekombinační protein toxinu B C. difficile, o 100 aminokyselin menší než pPB1750-2360.

Afinitně čištěné IgY proti pMA1870-2680 (A-6) a proti pPB1750-2360 (B-3) byly kvantifikovány měřením absorbance při 280 nm a každý preparát byl zředěn na koncentraci 10 pg/ml v PBS. Afinitně čištěné IgY byly pomocí ELISA testovány počínaje výchozí koncentrací 10 pg/ml a sériovým pětinásobným ředěním v odpovídající povlečené mikrotitrační destičce podél cekálních extraktů. Jako sekundární protilátka pro detekci navázaného IgY pomocí ELISA byl použit králičí anti-kuřecí IgY konjugovaný s alkalickou fosfatázou (Sigma) ve zředění 1:750.

Porovnání ekvivalence reaktivity ELISA vůči známým koncentracím afinitně čištěného IgY mezi cekálními extrakty umožnilo odhadnout množství specifického IgY proti rekombinantů, přítomného v cekálních extraktech. Z výsledků ELISA bylo zjištěno, že množství specifické IgA proti pMA1870-2680 (A-6) je asi 12 pg/ml. Množství specifického IgY proti pPB1750-2360 (B-3) bylo stanoveno jako asi 800 ng/ml. Tyto koncentrace specifických IgY poskytují odhad účinných terapeutických koncentrací potřebných k dosažení ochrany v místě infekce. Protože množství specifické IgY, podávané orálně před odebráním cekální tekutiny, bylo asi 2400 až 2800 pg proti rekombinantů toxinu A a 400 až 800 pg proti rekombinantů toxinu B, došlo přibližně k 200 až 233násobnému snížení, resp. 500 až lOOOnásobnému snížení detekovatelného množství IgY proti rekombinačnímu proteinu toxinu nacházejícího se ve slepém střevě, zaměřeného proti intervalu A-6, resp. intervalu B-3.

Těchto výsledků bylo dosaženo s použitím protilátek přítomných v karbonátovém pufru. Kdyby byly orálně podávané IgY proti rekombinačnímu toxinu chráněny před degradací během průchodu gastrointestinálním traktem (tj. použitím enterosolventního povlaku, popsaného v příkladu 37), byly by účinná terapeutická dávka, potřebná pro orální aplikaci, menší než je u vedeno v příkladu 42.

c) Nepřímé stanovení množství specifických IgY proti rekombinačnímu toxinu A a B C. difficile v cekálním obsahu pomocí ELISA

Za účelem potvrzení hodnot, stanovených v příkladu 43(b) pro hladiny IgY proti rekombinačním toxinům, nacházející se ve slepém střevě ošetřovaného křečka, byl proveden následující experiment. Není-li uvedeno jinak, byl použit standardní formát ELISA (popsaný v příkladu 13c).

V tomto experimentu byl použit cekální extrakt z neošetřeného křečka (sloužící jako negativní kontrola) a křečka ošetřovaného IgY jak proti rekombinačnímu toxinu A, tak proti rekombinačnímu toxinu B [jak popsáno výše v odstavci (a)]. Přímo byl stanoven celkový cekální IgY, nikoli jen množství cekálního IgY, specifického pro rekombinační proteiny C. difficile. Protože byla známa procentická množství specifické protilátky obsažené v preparátech IgY, umožnilo tedy stanovení hladiny celkového IgY, přítomného v cekálních extraktech, vypočítat množství specifické protilátky v cekálním extraktu.

- 157CZ 296806 B6

Pro zachycení IgY v cekálním materiálu byl použit následující sendvičový test ELISA. Mikrotitrační destičky byla přes noc při 4 °C pokryta králičím anti-kuřecím IgG (Cappel) v koncentraci 0,1 pg/ml vPBS (100 μΐ na jamku). Oba cekální extrakty byly testovány v počátečním zředění 1:50 a se sériovým pětinásobným ředěním do konečného zředění 1:312 500. Všechna zředění vzorků byla testována zdvojeně. Afinitně čištěné protilátky, zaměřené proti rekombinačnímu toxinu A (pPAl 870-2680, interval A-6), byly zředěny na 0,1 pg/ml a pak dále sériově pětinásobně ředěny do konečné koncentrace 0,16 ng/ml a byly také testovány pomocí ELISA, aby byla umožněna kvantifikace srovnáním. Po inkubaci a promytí byla k destičkám přidána králičí anti-kuřecí alkalická fosfatáza-IgG (Sigma) (ve zředění 1:1000). Po promytí destiček pak byl přidán substrát (p-nitrofenylfosfát) a destičky byly hodnoceny podle příkladu 13c.

Jak je uvedeno v příkladu 43(b), byla reaktivita ELISA získaná pomocí afinitně čištěného IgY proti rekombinačnímu toxinu A, za účelem kvantifikace množství celkového IgY ve slepém střevě ošetřována křečka přiřazena k reaktivitě ELISA získané ředěním cekálního extraktu.

Na základě výsledků testu ELISA bylo množství celkového IgY ve slepém střevě ošetřeného křečka odhadnuto jako 50 pg/ml. Studie afinitním čištěním ukázaly, že celkové preparáty IgY obsahovaly asi 7 % či 3,5 pg/ml IgY specifického pro rekombinační toxin A (anti-A-6 IgY) a asi 1 až 2 % či 500 až 1000 ng/ml IgY specifického pro anti-rekombinační toxin B (anti-B-3 IgY). Koncentrace obou takto detekovaných specifických IgY dosti úzce korelují s množstvím detekovaným v příkladu 43(b), tj. 3,5 pg/ml oproti 12 pg/ml pro anti-interval A-6 a 800 ng/ml oproti 500 až 1000 ng/ml pro anti-interval B-3.

Tyto výsledky a výsledky v odstavci (b) tohoto příkladu ukazují, že v místě infekce C. difficile byly detekovány velmi nízké hladiny specifických IgY proti intervalu A-3 a B-3. Protože byl křeček chráněn proti CD AD, je tato hladina antirekombinačního toxinu A a B v terapeutickém rozmezí. Tyto výsledky rovněž podporují názor, že pokud by byly IgY proti rekombinačním toxinům podávány s použitím ochrany proti degradaci v gastrointestinálním traktu (tj. enterosolventního povlaku), bylo by nutno orálně podávat pouze značně nižší dávky.

Příklad 44

Léčba diaroických křečků s použitím IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile

Pro zjištění, zda křečci, vykazují po infekci C. difficile průjem, mohou být účinně léčeni pomocí IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile samotným nebo je-li nutná kombinace IgY proti rekombinačnímu toxinu A a B, byl proveden následující experiment.

Křečkům byl podán klindamycin a byli infikováni C. difficile v podstatě způsobem uvedeným v příkladu 32c. IgY proti rekombinačnímu toxinu A byl produkován proti pMA1870-2680 (interval A-6) a IgY proti rekombinačnímu toxinu B byl produkován proti pPB 1750-2360 (interval B-3).

Tři skupiny křečků (Sasco) byly predisponovány vůči infekci C. difficile I.P. injekcí 1 ml klindamycin-fosfátu (Biomol) v množství 1 mg/100 g tělesné hmotnosti. Po asi 24 h byla každému křečkovi podána pomocí jehly o velikosti 18 provokační dávka lml inokula s obsahem přibližně 1.10⁴ organismů C. difficile (ATCC 43596) ve sterilním salinickém roztoku. Bakterie byly před infekcí pěstovány asi 48 h na plotnách agaru CCFA (BBL).

Všem třem skupinám po 9 až 10 členech byly pomocí krmné jehly podány preparáty IgY. Skupina I dostala preimunní IgY; skupina II dostala IgY proti rekombinačnímu toxinu A (anti-A-6 IgY); skupina III dostala směs IgY proti rekombinačnímu toxinu A a IgY proti rekombinačnímu toxinu B (anti-A-6/B-3/IgY). Každý preparát IgY zahrnoval 8X PEG preparát v

-158CZ 296806 B6

0,1 M karbonátovém pufru, pH 9,5 a obsahoval adi 40 mg/ml proteinu. K vytvoření směsi anti-A-6/B-3 IgY byly navzájem smíseny stejné objemy dvou 8X koncentrátů (tj. anti-A-6 a anti-B-3). Množství specifického IgY proti toxinu A C. difficile v preparátu anti-A-6-IgY bylo asi 2,8 mg/ml. Množství specifického IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile v preparátu anti-A-6/B-3 IgY na ml bylo tedy poloviční než v preparátu IgY A-6 (tj. 1,4 mg/ml). V preparátu anti-A-6/B-3 IgY bylo přítomno asi 200 až 400 pg/ml specifického IgY proti rekombinačnímu toxinu B.

Poté, co byl u každého jednotlivého křečka detekován nástup průjmu, bylo zvířeti podáno 2 ml příslušného preparátu (tj. buď preimunního, anti-A-6 IgY, nebo anti-A-6/B-3 IgY). Nástup průjmu byl u křečků detekován 20 až 44 h po inokulaci C. difficile. Většina křečků (82 %) vykazovala průjem do 24 h po inokulaci organismu. Většině zvířat byly podány 3 dávky IgY denně ve zhruba čtyřhodinových intervalech po dobu 2 dní; některým křečkům však byla podána jen jedna nebo dvě dávky první den léčby v důsledku pozdějšího nástupu průjmu.

Výsledky tohoto experimentu ukázaly, že IgY proti A-6 byl schopen ochránit mnoho křečků před úhynem i v případě podání po nástupu průjmu. Asi polovin (55 %) křečků ošetřených anti-A-6 IgY přežila přibližně jeden měsíc, zatímco z křečků ošetřených preimunním IgY přežilo pouze 11 % a z křečků ošetřených anti-A-6/B-3 IgY přežilo 20 %.

Protože se zdá, že anti-A-6 IgY je v křeččím modelu nej významnější složkou z hlediska prevence úhynu (například příklad 32(a)), byly výsledky získané u křečků ošetřených anti-A-6/B-3 IgY (který obsahuje polovinu množství specifického IgY proti A-6 v porovnání se samotným preparátem A-6 IgY) neočekávané (pouze 20 % zvířat) bylo chráněno před úhynem). V tomto příkladu nebyl anti-A-6 IgY samotným schopen zachránit úhynu u 50 % křečků a anti-B-3 IgY samotný neposkytoval ochranu. Kromě toho výsledky získané v předchozích studiích (například příklad 32c) ukázaly, že protilátky anti-B-3 jsou významnější při prevenci nástupu průjmu než při prevenci úhynu v důsledku CDAD.

Všechna zvířata, která byla úspěšně léčena anti-A-6 IgY, vykazovala před zahájením léčby mírný průjem. Pokud byl průjem před zahájením léčby silný a byly přítomny neurologické příznaky, nebyla orální aplikace anti-A-6 IgY schopna poskytnout úspěšnou léčbu.

Výše uvedený experiment s křečky byl opakován s tou výjimkou, že byl podáván pouze preimunní nebo anti-A-6 IgY. Skupinám po 10 až 11 zvířatech bylo podáno 2 ml 8X IgY koncentrátů poté, co byl u každého jednotlivého zvířete detekován průjem. Schéma podávání bylo stejné jako v předchozím případě.

Průjem byl u křečků detekován asi 20 až 45 h po inokulaci C. difficile. 85 % zvířat (17/20) vykázalo průjem asi 28 h po infekci. Data z těchto dvou studií byla spojena a jsou znázorněna na obr. 48.

Na obr. 48 je na ose souřadnic zobrazeno procento souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba léčby je vyznačena úsečkou mezi dny 2 a 3. Podání klindamycinu a inokulace organismy C. difficile (označena na obr. 48 jako „infekce“) je označena šipkami. Plné čtverečky představují křečky, kteří dostávali preimunní IgY, a prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali anti-A-6 IgY.

Údaje znázorněné na obr. 48 prokazují, že 45 % křečků, ošetřovaných po průjmu anti-A-6 IgY, po léčbě přežilo (průjem se u většiny těchto křečků upravil sám). Výsledky získané s použitím anti-A-6 IgY v porovnání s výsledky získanými s použitím preimunního IgY byly statisticky významné s hodnotou P < 0,05. Všichni křečci, ošetřovaní anti-A-6 IgY, přežívali po léčbě dlouhodobě (> 1 měsíc) do skončení experimentu.

-159CZ 296806 B6

Tyto výsledky poskytují první popisu léčebného režimu, který může být použit k léčbě křečků po nástupu průjmu v důsledku infekce C. difficile. Navíc demonstrují, že IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile je účinným terapeutickém i při podání v pozdních stadiích CDAD (tj po nástupu průjmu).

Příklad 45

Léčba nepopiratelné infekce C. difficile pomocí IgY proti rekombinačnímu proteinu toxinu A a proteinu toxinu B C. difficile s použitím dvou různých adjuvans

Byla zkoumána schopnost rekombinačních proteinů toxinu A toxinu B, produkovaných s použitím vektoru pEt, vyvolávat tvorbu neutralizujícího IgY u slepic, schopného chránit křečky před infekcí C. difficile. V předchozích studiích (příklad 32 nebo 44) byl vytvořeny IgY proti rekombinačním proteinům toxinu A C. difficile, exprimovaným s použitím vektoru pMal (pMAl 870-2680, interval A-6). Protože rekombinační proteiny, exprimované s použitím systému PET, mohly být izolovány v čistší formě oproti proteinům exprimovaným s použitím vektoru pMal, byla dána přednost produkci protilátek proti rekombinantu toxinu A, produkovanému v pET (pPAl 870-2680, A-6).

IgY proti pPAl 870-2680 byly testovány na křeččím modelu spolu s protilátkami proti proteinu toxinu B, exprimovanému rovněž s použitím vektoru pET (pPB 1750-2360, interval B-3). Použití společného expresního systému k produkci obou rekombinačních toxinů má určité výrobní výhody. Například je možno pro oba rekombinanty použít stejné kolony pro afinitní čištění a stejné postupy a oba antigeny by měly mít srovnatelnou čistotu a výtěžek.

Dalším cílem tohoto vynálezu byl vytvořit protilátky proti oběma proteinům toxinů A-6 a B-3, získaných pomocí pET, s použitím stejného adjuvans. V předchozích příkladech (příklad 32 nebo 44) byly testované IgY vytvořeny buď proti rekombinantu A-6, nebo B-3 pomocí různých adjuvans (pro IgY proti rekombinačnímu toxinu A bylo použito adjuvans RIBI a pro IgY rekombinačního toxinu B Freundovo adjuvans).

Tento příklad zahrnoval a) imunizaci slepic rekombinačními proteiny toxinů C. difficile, exprimovanými pomocí vektoru pET a 2 různých adjuvans, a stanovení titrů IgY proti rekombinačním proteinům pomocí ELISA a b) ošetření křečků, infikovaných C. difficile, pomocí směsi IgY proti rekombinačnímu toxinu A (A-6) a toxinu B (B-3), vytvořených pomocí Gerbu nebo Quil A.

a) Imunizace slepic rekombinačními proteiny toxinu C. difficile, exprimovanými s použitím vektoru pET a dvou různých adjuvans, a stanovení titrů IgY proti rekombinačním proteinům pomocí ELISA

Slepice byly imunizovány rekombinačními proteiny exprimovanými s použitím vektoru pET; proteiny rekombinačního toxinu A (pPA 1870-2680) nebo rekombinačního toxinu B (pPB1750-2360), afínitně čištěné na niklové koloně, byly smíseny buď s adjuvans Quil A (Accurate Scientific), nebo Gerbu (CC Biotech). Tato dvě adjuvans byla vybrána na základě vlastností (uvedeny v příkladu 35) a ceny. Imunizace byla prováděna v podstatě postupem uvedeným v příkladu 35.

Stručně řečeno byly slepice imunizovány nejprve čtyřmi imunizacemi 100 pg pPAl 870-2680 a pak dvěma imunizacemi s použitím 1 mg proteinu. Proteinem pPB1750-2360 byly slepice imunizovány šestkrát s použitím 1 mg na imunizace. Každé slepici bylo subkutánně podáno 500 μΐ roztoku obsahujícího jeden z rekombinačních toxinových proteinů a buď 5 pg adjuvans Gerbu, nebo 75 pg adjuvans Quil A. Asi po 1 týdnu po poslední injekci byla sebrána vejce a v každé skupině (čtyři skupiny slepic s použitím obou toxinových rekombinantů a obou

-160CZ 296806 B6 adjuvans) byl pomocí PEG extrahován IgY postupem uvedeným v příkladu 1. Byl rovněž zpracován IgY z preimunní ch vajec.

IgY byly resuspendovány v 0,1 M karbonátovém pufru, pH 9,5, v 8X koncentraci žloutku (asi 40 mg/ml) a byla provedena ELISA (způsobem popsaným v příkladu 35) pro stanovení titrů proti rekombinačnímu toxinu A a proti rekombinačnímu toxinu B. Bylo zjištěno, že titr protilátek, vytvořených buď proti proteinu pPA1870-2680 (A-6), nebo pPB1750-2360 (B-3) s použitím buď adjuvans Gerbu, nebo Quil A, je 1:62.500. Po afinitním čištění bylo s použitím adjuvans Gerbu množství specifického A-6 IgY 4,3 % a specifického B-3 IgY 1,0 %. Množství specifického IgY s použitím adjuvans Quil A bylo 2,2 % pro A-6 a 1,9 % pro B-3.

b) Léčba křečků, infikovaných C. difficile, pomocí směsi IgY proti rekombinačnímu toxinu A (A-6) a toxinu B (B-3), vytvořených s použitím buď adjuvans Gerbu, nebo Quil A

Byly smíseny stejné objemy PEG preparátů anti-A-6 a anti-B-3 IgY, vytvořené podle odstavce (a) s použitím stejného adjuvans. Tyto preparáty byly označeny jako A-6/B-3 Gerbu a A-6/B-3 Quil A. Studie ošetření křečků byla provedena přesně jako je uvedeno v příkladu 42. Po 6 h po expozici 10⁴ organismů C. difficile (kmen ATCC 43596) bylo křečkům podáno 2 ml preparátu buď preimunního, nebo imunního IgY (A-6/B-3 Gerbu a A-6/B-2 Quil A). Křečci pak dostávali 2 ml IgY ještě po dva dny jednou denně.

Výsledky této studie léčby křečků jsou znázorněny na obr. 49. Na obr. 49 je na ose souřadnic uvedeno procento souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba léčby je označena úsečkou mezi dny 1 a 3. Podání klindamycinu a inokulace organismy C. difficile (na obr. 49 označena jako „infekce“) je označena šipkami. Plné čtverečky představují křečky, kteří dostávali preimunní IgY; prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali anti-A-6/B-3 Gerbu IgY a plné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali anti-A-6/B-3 Quil A IgY.

Výsledky znázorněné na obr. 49 ukazují, že oba imunní preparáty IgY (A-6/B-3 Gerbu i A-6/B-3 Quil A) chránily křečky kompletně před úhynem v důsledku CDAD. Infekci C. difficile přežilo devět z devíti křečků, ošetřených kterýmkoli z imunních preparátů IgY, zatímco všech devět křečků, ošetřených preimunním IgY, uhynulo. Poměry přežití, pozorované u každého z preparátů A-6/B-3 Gerbu nebo A-6/B-3 Quil A, byly statisticky významné v porovnání s výsledkem získaným u preimunního IgY (hodnota P pomocí analýzy chi-square <0,001).

U tří z devíti zvířat ošetřovaných A-6/B-3 Gerbu a jednoho z devíti zvířat ošetřovaných A-6/B-3 Quil A se projevil (oproti úplné absenci průjmu, pozorované v předchozích příkladech, například příkladu 32) může být důsledkem nižšího titru protilátek ve zde použitých preparátech (1:62 500 oproti 1:125 000). Další posilovači imunizace slepic imunizovaných s použitím adjuvans Gerbu nebo Quil A by měly zvýšit titr na rozmezí 1:125.000, a to zvýšit terapeutickou účinnost vůči průjmu.

Výše uvedené výsledky naznačují, že je možno s použitím vektoru pET (místo vektoru pMal) produkovat rekombinační proteiny toxinu A a B C. difficile bez nepříznivého účinku na produkci neutralizujícího antitoxinu. Kromě toho je možno stejného adjuvans použití ve spojení s pET-produkovanými proteiny k vyvolání tvorby neutralizujícího IgY in vivo. Stejné adjuvans může být navíc použito s oběma rekombinačními proteiny k vyvolání terapeutické odpovědi IgY proti rekombinantu in vivo.

Příklad 46

Produkce protilátek s použitím směsi obsahující rekombinační toxiny A a B C. difficile ve slepicích

-161 CZ 296806 B6

Byla zkoumána schopnost vyvolávat tvorbu kuřecích protilátek, zaměřených proti oběma rekombinačním toxinů A a B C. difficile, s použitím směsi obou proteinů jako kombinovaného imunogenu. Příklad zahrnoval a) imunizaci slepic směsí rekombinačních proteinů toxinů A a B C.

difficile a b) čištění a detekci IgY proti rekombinačnímu toxinů A a toxinů B C. difficile.

a) Imunizace slepic směsí rekombinačních proteinů toxinů A a B C. difficile

Leghornské nosnice byly imunizovány směsí proteinů rekombinačního toxinů A (pPAl870-2680, interval A-6) a rekombinačního toxinů B (pPB1750-2360, interval B—3); oba rekombinační proteiny byly exprimovány pomocí vektorového systému pET. Dvě skupiny slepic (každá po 4 slepicích) byly imunizovány 500 pg každého rekombinačního proteinu, smíšeného buď s adjuvans Quil A (Accurate Scientific), nebo Gerbu (CC Biotech). Každé slepici byl podán celkový objem 1 ml, obsahující rekombinační protein a buď 5 pg adjuvans Gerbu, nebo 75 pg adjuvans Quil A. Imunizace pro každé adjuvans byla prováděna postupem uvedeným v příkladu 35. Slepice byly imunizovány dvakrát v odstupu 2 týdnů.

b) Čištění a detekce IgY proti rekombinačnímu toxinů A a toxinů B C. difficile

Po asi 1 týdnu po poslední dávce byla sebrána 3 vejce od každé skupiny a pomocí PEG byl způsobem uvedeným v příkladu 1 extrahován IgY. IgY byly resuspendovány vPBS (pH 7,4) v koncentraci 4X s obsahem asi 20 mg/ml celkového proteinu. Jako negativní kontrola sloužil preimunní IgY.

Množství protilátek proti rekombinačnímu toxinů A (A-6 IgY) a proti rekombinačnímu toxinů B (B-3 IgY), přítomné v obou imunních preparátech IgY, bylo stanoveno pomocí ELISA v podstatě způsobem uvedeným v příkladu 13c nebo 43b. Stručně řečeno byly jamky mikrotitrační destičky pasivněji povlečeny buď rekombinantem toxinů A (pPAl870-2680) nebo rekombinantem toxinů B (pPB1750-2360). Vzorky IgY byly nejprve zředěny 250násobně a pak postupně 5násobně ředěny. Všechny vzorky byly testovány zdvojeně. Pro detekci specifického IgY byla použita králičí anti-kuřecí IgG alkalická fosfatáza (Sigma) ve zředění 1:1000.

Výsledky těchto testů ELISA odhalily, že antigeny osou rekombinačních toxinů jsou schopny vyvolat u slepic odpověď IgY. Titry protilátek jsou vyjadřovány jako převrácená hodnota nejvyššího zředění, u kterého byla zjištěna asi 3krát vyšší reaktivita ELISA v porovnání s preimunní, tj. negativní kontrolou ve stejném zředění. Titry obou IgY anti-A-6 i anti-B-3 s použitím Gerbuho adjuvans byly velmi nízké a činily asi 1:250. Titr proti anti-A-6 IgY a anti-B-3 IgY, vytvořené s použití adjuvans Quil A, byl ve srovnání s Gerbuho adjuvans 5 až 25krát vyšší. Titr protilátek vytvořených s použitím adjuvans Quil A pro anti-A-6 IgY byl větší než 1:6250 a pro anti-B3 IgY větší než 1:1250.

Zatímco titry IgY proti rekombinačním toxinům s použitím Quil A jsou nižší než úroveň dosažená v předchozích příkladech (například v příkladu 32) (hlavně proto, že slepice v tomto příkladu byly imunizovány pouze dvakrát; naproti tomu slepice v předchozích příkladech byly imunizovány 5 až 10 nebo vícekrát a získané titry antitoxinového proteinu dosahovaly 1:100 000 nebo více), naznačují výsledky, že oba rekombinační toxinové proteiny jsou u slepic stejně antigenní a protilátky produkované proti nim oběma jsou přítomny ve srovnatelných hladinách. Výsledky také naznačují, že hladina vyvolané odpovědi protilátek závisí na použitém adjuvans. Bylo zjištěno, že adjuvans Quil A ve srovnání s výsledky získanými s použitím adjuvans Gerbu vyvolává vyšší odpověď IgY proti A-6 a proti B-3 v časném stadiu imunizačního procesu.

-162CZ 296806 B6

Příklad 47

Afinitní čištění nativního toxinu A C. difficile s použitím protilátek proti rekombinačnímu toxinu C. difficile

Ptačí protilátky (IgY), vytvořené proti rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile, byly afínitně čištěny s použitím intervalu A-6 jako afinitní ligandu. Vzniklé specifické protilátky pak byly imobilizovány na pevném nosiči za účelem přečištění nativního toxinu A z organismů C. difficile (ATCC 43255), pěstovaných v dialýzních sáčcích, ponořených v médiu BHI. Následující příklad popisuje a) afinitní čištění ptačích protilátek zaměřených proti rekombinačnímu fragmentu toxinu a a vytvoření afinitní kolony toxinu A, b) kultivaci organismů C. difficile, pro produkci toxinu A a B v supematantech kultury dialýzních sáčků, c) afinitní čištění toxinu A, d) charakterizace afínitně čištěného toxinu A C. difficile in vitro, e) vyšetřování alternativní strategie pro namáhání anti-A-6 IgY na pevný nosič pro afinitní čištění toxinu A, f) afinitní čištění toxinu A C. difficile na afinitní koloně vytvořené oxidací A-6 IgY jodistan a g) charakterizaci afínitně čištěného toxinu A C. difficile in vitro.

a) Afinitní čištění ptačích protilátek zaměřených proti rekombinačnímu fragmentu toxinu A a vytvoření afinitní kolony toxinu a

Protilátky specifické pro interval A (aa 1870-2680) toxinu A C. difficile byly afínitně čištěny pro získání činidel pro vytvoření afinitní kolony, umožňující čištění toxinu A C. difficile z kapalných supernatantů kultur a poskytují činidlo pro imunoanalýzu, umožňující detekci toxinu C. difficile v supematantu kultury a afínitně čištěných vzorcích toxinu A C. difficile.

ii) Afínitně čištění A-6 IgY

Hyperimunní IgY z vajec obsahujících protilátky k rekombinačnímu proteinu A-6 s použitím freundova adjuvans byl extrahován pomocí frakcionační metody PEG (příklad 1). Supematant s obsahem protilátky byly naneseny na afinitní kolonu A-6, získanou kovalentním navázáním proteinu pPAl 870-2680 (připraveného podle příkladu 29) na afinitní pryskyřici Actigel (Sterogene Biochemicals) podle pokynů výrobce. Na 5 ml afinitní pryskyřice Actigel bylo navázáno přibližně 10,2 mg proteinu pPAl870-2680 (A-6). Anti-A-6 IgY byl eluován pomocí elučního média Actisep (Sterogene Biochemicals) postupem podle příkladu 15c a dialyzován proti PBS po dobu 24 až 48 h při 2 až 8 °C.

ii) Navázání afínitně čištěného anti-A-6 IgY na aktivovanou afinitní pryskyřici za vzniku afinitní kolony toxinu A C. difficile

Původní afinitní kolona toxinu A byla připravena postupem uvedeným dále v příkladu 48a navázáním anti-A-6 na afinitní pryskyřici Actigel A. Porovnáním hodnot absorbance IgY při 580 nm před navázáním a po navázání bylo odhadnuto, že na afinitní pryskyřici bylo navázáno 58 % čili asi 7,5 mg anti-A-6 IgY.

b) Kultivace organismů C. difficile za vzniku toxinů A a B v kultuře v dialýzních sáčcích

Kmen C. difficile 43255 byl kultivován postupem uvedeným dále v příkladu 49b, část (iv) a (v). Přítomnost toxinu A v supematantech kultury dialýzních sáčků C. difficile byla hodnocena na základě analýzy SDS-PAGE/Westem blot následujícím způsobem.

Vzorky supematantu kultury dialýzních sáčků a vzorek známého toxinu A, zakoupený na trhu, byly analyzovány způsobem uvedeným v příkladu 49b, část (iv), s tou výjimkou, že však byl jako primární protilátka pro westernový blot použit afínitně čištěný A-6 IgY.

-163CZ 296806 B6

Po analýze SDS-PAGE (5 % polyakrylamidový gel) byly proteiny přeneseny na nitrocelulózu pomocí přenosového zařízení Milliblot (Millipore) podle pokynů výrobce. Blot byl dočasně obarven pomocí 10% Ponceau S a blokován přes noc v PBS s obsahem 1 mg/ml sušeného mléka. Primární preimunní a anti-A-6 IgY protilátky byly zředěny na 1 pg/ml pomocí PBS s obsahem 1 mg/ml BSA a příslušná protilátka byla inkubována s odpovídajícím blotem s mírným mícháním po dobu 2 h při teplotě místnosti. K odstranění nenavázané primární protilátky byly pruhy promyty PBS (10 mM fosfát sodný, 150 mM NaCl, pH 7,2), BBS-Tween (0,1 M kyselina boritá, 0,025 M borát sodný, 1 M NaCl, 0,1 % v/v Tween 20) a PBs a inkubovány se sekundární protilátkou, konjugovanou a králičí anti-kuřecí IgG alkalickou fosfatázou (Sigma Chemical Co.), zředěnou 1:2000 a PBS/BSA. Bloty byly promyty k odstranění nenavázané sekundární protilátky a pruhy byly vyvíjeny v roztoku substrátu BCIP/NBT (popsán dále v příkladu 48).

Při analýze westernovým blotem se jevily, že oba analyzované vzorky supematantu kultur obsahující imunoreaktivní toxin A C. difficile. Tento protein komigroval s komerčním toxinem A a byl rozpoznáván afinitně čištěným anti-A-6 IgY. Před afínitním čištění toxinu A byly vzorky supernatantů kultur spojeny. Supematanty spojených kultur nebyly před nanesením na fínitní kolonu koncentrovány.

c) Afinitní čištění toxinu A C. difficile

Vzorky supernatantů kultur C. difficile byly afinitně čištěny způsobem popsaným v příkladu 48c. Objem frakce Actisep po eluci a dialýze činil 42 ml, z čehož bylo 15 ml odebráno a před analýzou zkoncentrováno na 3 ml. Ke zkoncentrování vzorku byl použit přístroj Centricon 30 (Amicon).

d) Analýza supematantu kultur C. difficile, eluované frakce Actisep a eluátu z kolony na přítomnost toxinu A

Za účelem zjištění přítomnosti nebo nepřítomnosti toxinu A ve vzorku eluovaném pomocí Actise p a v odtékající kapalině z afinitní kolony byly tyto vzorky analyzovány pomocí SDS-PAGE a westernovým blotem spolu s výchozím materiálem supematantu kultury. Tyto analýzy byly prováděny způsobem popsaným v odstavci (b) za účelem zjištění relativního množství toxinu a ve vzorcích a účinnosti afinitního čištění.

Získaný western blot je znázorněn na obr. 50. Pruhy 1 až 3 na obr. 50 byly inkubovány s preimunním IgY jako primární protilátkou a pruhy 4 až 6 s anti-A-6 IgY jako primární protilátkou. Pruhy 1 a 4 obsahují výchozí materiál supematantu kultury; pruhy 2 a 5 obsahují materiál proteklý kolonou a pruhy 3 a 6 obsahují afinitně čištěný toxin A.

Výsledky, zobrazené na obr. 50, ukazují, že imunoreaktivní toxin A byl detekován ve výchozím materiálu supematantu kultury a ve frakci Actisep. Ve vzorku proteklém kolonou nebyl pozorován žádný toxin A, což ukazuje, že většina toxinu byla naváhána na afinitní kolonu. Zdá se, že ve výchozím materiálu byly významně více toxinu a než ve frakci Actisep.Protože materiál proteklý kolonou zjevně toxin A neobsahuje, ukazuje rozdíl mezi množstvím toxinu A ve výchozím materiálu a ve frakci Actisep na to, že i po eluci Actisep zůstalo na kolonu navázáno dosud významné množství toxinu. Jedno z možných vysvětlení neschopnosti Actisep eluovat veškerý toxin A spočívá v tendenci toxinu A nespecificky se vázat na uhlohydrátovou oblast molekul, jako jsou imunoglobuliny. To je možné proto, že anti-A-6 IgY na koloně je navázán přes primární aminy, což by umožňovalo navázání subpopulace IgY přes oblast Fab, čímž zůstane přístupné pro vazbu na toxin A oblast Fc, obsahující uhlohydráty.

e) Výzkum alternativní strategie navázání anti-A-6 IgY na pevný nosič za účelem afinitního čištění toxinu A

-164CZ 296806 B6

Dále byla zkoumána možnost navázání IgY na pevný nosič oxidací jodistanem v uhlohydrátové oblasti. Bylo předpokládáno, že tímto způsobem navázání se dosáhne: 1) navázání IgY na nosič přes oblast Fc za ponechání přístupu pro vazbu toxinů C. difficile v oblasti Fab a 2) dostatečné změny uhlohydrátů, aby byla eliminována nebo redukována nespecifická vazba toxinů A

C. difficile.

i) Oxidace anti-A-6 IgY jodistanem sodným

Oxidace anti-A-6 IgY s použitím jodistanu sodného (Sigma Chemical Co) byla prováděna následujícím způsobem. Byl připraven zásobní roztok jodistanu sodného rozpuštěním 25 mg jodistanu sodného v 1,2 ml destilované deionizované vody. K 6 ml A-6 IgY (2,7 mg/ml) v 15ml polystyrénové zkumavce byly přidáno 600 μΐ (0,1 objemu) zásobního roztoku jodistanu sodného. Zkumavka pak byla zakryta aluminiovou fólií a 1 h a 20 min mírně míchána za teploty místnosti. Poté byl přidán glycerol do konečné koncentrace 20 mM a zkumavka byla na dalších 10 min převrácena. Pak byl roztok dialyzován proti 100 mM acetátu sodnému, 150 mM NaCl, pH 5,5, k odstranění jodistanu sodného.

ii) Navázání oxidovaného IgG na hydrazidový gel Affi-Gel Hz (BioRad) ml pryskyřice Affi-Gel bylo promyto kondenzačním pufrem (100 mM acetát sodný, pH 5,5, a 150 mM chlorid sodný). Oxidovaný anti-—6 IgY byl přefiltrován přes filtr s jehlou se skleněnou vatou po odstranění sraženiny, která se vytvořila během procesu oxidace, a byl odebrán alikvot 100 μΐ analýzu A₂₈₀. Promytá pryskyřice Affi-Gel byla v 15ml polystyrénové zkumavce přidána k oxidovanému IgY a zkumavka byla přes noc ponechána v převrácené poloze (celkový objem 12 ml).

iii) Stanovení účinnosti navázání

Afinitní pryskyřice anti-A-6 IgY-Affi-Gel byla vlita do kolony BioRad Econo a nenavázaná protilátka byla z pryskyřice vymyta a uchována pro analýzu A₂₈₀. Pak byla pryskyřice promyta 1 objemem lože PBS (10 mM fosfát sodným 0,5 M NaCl, pH 7,2). Tento podíl byl rovněž uschován pro analýzu A₂₈₀. Poté byla pryskyřice promyta ještě několika objemy PBS a pro odstranění veškeré zbylé nenavázané protilátky byla promyta elučním pufrem Actisep (Sterogene Bioseparations). Porovnáním hodnot A₂₈o před a po navázání bylo odhadnuto, že na pryskyřici bylo navázáno 95 % čili 8,4 mg IgY.

f) Afinitní čištění toxinů A C. difficile na afinitní koloně vytvořené oxidací anti-A-6 IgY jodistanem

Supernatanty kultury ze dvou dialýzních sáčků, kultivovaných způsobem popsaným v příkladu 48b, oddíl (iv) a (v), byly spojeny a objem byl pomocí zařízení Amicon centriprep zkoncentrován na asi 10,5 ml. Tento materiál byl pak nanesen na afinitní kolonu Affi-Gel s anti-A-6 IgY a několikrát sbírán a vracen na kolonu za účelem navázání co největšího množství toxinů, nenavázaný protein pak byl odstraněn promytím kolony několika objemy lože PBS a navázaný toxin A byl eluován 2 objemy lože elučního média Actisep. Látka vytékající z kolony byl uschována pro analýzu za účelem hodnocení účinnosti afinitního čištění. Toxin eluovaný pomocí Actisep pak byl dialyzován 24 až 48 h při 2 až 8 °C proti TBS a zkoncentrován pomocí zařízení Centriprep (Amicon) z 53 na 3 ml.

g) Charakterizace afinitně čištěného toxinů A C. difficile in vitro

i) Analýza proteinů

-165CZ 296806 B6

Pomocí proteinové analýzy BCA (Pierce) byla stanovena koncentrace čištěného toxinů a bylo zjištěno, že činí 70 pg/ml čili celkem asi 210 pg z 37 ml supernatantu kultury, což ukazuje, že v supernatantu kultury bylo asi 5,7 pg toxinu/ml.

ii) Porovnání čistoty toxinů a retenčních časů pomocí HPLC

K porovnání jak čistoty, tak retenčních časů afínitně čištěných vzorků toxinů A byla použita analýza HPLC. Na HPLC kolonu Shodex KW 803 byly naneseny vzorky komerčního a afínitně čištěného toxinů A a byly eluovány pomocí PBS s použitím systému HPLC Waters. Retenční časy toxinů A byly pro oba vzorky toxinů přibližně 7 min, z čehož vyplývá, že toxiny jsou identické. Navíc i čistota obou toxinů byla podobná.

iii) Western blotová analýza výchozího materiálu supernatantu kultury, afínitně čištěného toxinů A a materiálu proteklého kolonou

Pro zhodnocení účinnosti afínitního čištění a pro imunochemickou identifikaci byly vzorky afinitně čištěného toxinů A, supernatantu kultury a materiálu proteklého kolonou podrobeny standardními metodami elektroforéze SDS-PAGE na 5% gelu za redukčních podmínek a přeneseny na nitrocelulózu. Blot byl dočasně obarven 10% Ponceau Sk vyznačení pruhů a zbylá vazebná místa proteinů byla blokována přes noc při 2 až 8 °C roztokem PBS s obsahem 1 mg/ml sušeného mléka. Blot byl rozříznut na dvě poloviny, z nichž jedna byla inkubována s primární protilátkou anti-A-6 IgY, zředěnou PBS s obsahem 1 mg/ml BSA na 1 pg/ml, a druhá s preimunním IgY, zředěným PBS/BSA na 1 pg/ml BSA na 1 pg/ml, a druhá s preimunním IgY, zředěným PBS/BSA na 1 pg/ml. Po 2 h inkubace v přítomnosti primární protilátky (za mírného míchání byla odstraněna nenavázaná protilátka postupným promytím PBS, BBS-Tween a PBS. Ke každému blotu pak byla jako sekundární protilátka přidán králičí anti-kuřecí IgY konjugovaný s alkalickou fosfatázou, zředěný 1:2000 pomocí PBS s obsahem 1 mg/ml BSA. Po 2 h byly bloty promyty k odstranění nenavázané sekundární protilátky a vyvíjeny pomocí substrátové roztoku BLIP/NBT (Kirkegaard a Perry). Vyvíjení barvy bylo zastaveno zalitím blotů vodou. Výsledný westernový blot je znázorněn na obr. 51.

Pruhy 1 až 7 na obr. 51 byly jako s primární protilátkou konjugovány s anti-A-6 IgY a pruhy 8 až 15 s preimunním IgY. Pruhy 1 a 9 obsahují markéry širokého rozmezí molekulových hmotností (BioRad). Pruhy 2 a 10 obsahují supematant kultury C. difficile č. 1. Pruhy 3 a 11 obsahují supematant kultury C. difficile č. 2. Pruhy 4 a 12 obsahují supematanty kultury C. difficile č. 1 a 2 (spojené). Pruhy 5 a 13 obsahují materiál proteklá kolonou. Pruhy 6 a 14 obsahují afínitně čištěný toxin A (vysoká náplň, tj. 2x náplň uvedená v pruzích 7 a 15). Pruhy 7 a 15 obsahují afínitně čištěný toxin A (nízká náplň). Pruh 8 neobsahuje žádný vzorek (slepý pokus).

Vzorek afínitně čištěného toxinů A (pruh 7) byl 3,5krát koncentrovanější než vzorek spojeného výchozího materiálu (pruh 4); byla však nanesena 1/3 objemu (5 pl oproti 15 pl) afínitně čištěného vzorku oproti vzorku spojeného výchozího materiálu. Byla-li z kolony získána většina toxinů A, měly by pak být hladiny toxinů A, detekované na westernových blotech, podobné. Jak je patrné z obr. 51, jsou signály, odpovídající hlavním pásům molekulové hmotnosti, srovnatelné. Zdá se tedy, že regenerace toxinů A z afinitní kolony je kvantitativní.

Příklad 48

Afinitní čištění nativního toxinů B C. difficile s použitím protilátek proti rekombinačnímu toxinů B C. difficile

Ptačí protilátky (IgY), vytvořené proti rekombinačnímu proteinu toxinů B C. difficile (pPB 1750-2360; interval B-3) byly afínitně čištěny s použitím intervalu B-3 (tj. aa 1750-2360

-166CZ 296806 B6 toxinu B C. difficile) jako afinitního ligandu. Vzniklé čištěné specifické protilátky proti intervalu

B-3 pak byly imobilizovány na pevném nosiči k usnadnění čištění nativního toxinu B získaného z organismů C. difficile (ATCC 43555), kultivovaných za podmínek příznivých produkci toxinu.

Tento příklad zahrnoval a) afinitní čištění ptačích protilátek zaměřených proti rekombinačnímu fragmentu toxin B C. difficile a vytvoření afinitní kolony B C. difficile, b) kultivaci organismů C. difficile pro produkci toxinu A a B v kapalné kultuře a supematantech kultury dialýzních sáčků, c) afinitní čištění toxinu B C. difficile a d) charakterizaci afinitně čištěného toxinu B z C. difficile in vitro a in vivo.

a) Afinitní čištění ptačích protilátek zaměřených proti rekombinačnímu fragmentu toxinu B C. difficile a vytvoření afinitní kolony toxinu B C. difficile

Protilátky, specifické pro interval B-3 proteinu toxinu B C. difficile, byly afinitně čištěny pro získání činidel pro vytvoření afinitní kolony, umožňující čištění toxinu B C. difficile z kapalných supematantů kultur a k získání imunoanalytických činidel umožňujících detekci toxinu B C. difficile ve vzorcích supernatantů kultur a afinitně čištěného toxinu C. difficile.

i) Afinitní čištění anti-B-3 IgY

Hyperimunní IgY byl získán z vajec obsahujících protilátky k rekombinačnímu proteinu interval b-3 (pPB 1750-2360), vytvořené s použitím Gerbuho adjuvans (viz příklad 45), pomocí frakcionační metody PEG (příklad 1). Supematant s obsahem protilátek byl nanesen na afinitní kolonou intervalu B-3, získanou kovalentním navázáním proteinu pPB 1750-2360 (připraveného podle příkladu 29) na afinitní pryskyřici Actigel A (Sterogene), popsaného v příkladu 15c. Tento fragment byl vybrán z toho důvodu, že obsahuje repetiční oblasti toxinu B C. difficile a neobsahuje oblasti homologie s proteinem toxinu A C. difficile, takže by vzniklá čištěná protilátka neměla křížově reagovat s toxinem A C. difficile. Protilátky proti intervalu B-3 (anti-B-3 IgY) byly z kolony eluovány pomočí 4M guanidin HC1, pH 8,0, a dialyzovány 24 až 48 h při 2 až 8 °C proti PBS ii) Navázání afinitně čištěného anti-B-3 IgY na aktivovanou afinitní pryskyřici pro získání afinitní kolony toxinu B C. difficile

Afinitní kolona toxinu B C. difficile byla získána navázáním 11 mg afinitně čištěných ptačích anti-B-3 protilátek, připravených výše uvedeným způsobem, na 5 ml afinitní pryskyřice Actigel (Sterogene). Místo minimálně 2 h, doporučovaných výrobcem, byla použita doba navázání 30 min, aby byl minimalizován počet míst, kde je na pryskyřici navázána každá molekula protilátky, aby byla protilátka vůči toxinu více přístupná. Kromě toho byla kolona vystavena pouze působení vysoce solných pufrů nebo elučnímu pufru Actisep (Sterogene); během přípravy kolony nebyly použity žádné roztoky guanidinu, aby byla minimalizována denaturace protilátek anti-B3. Porovnáním hodnot absorbance IgY při 289 nm před a po navázání bylo zjištěno, že na pryskyřici bylo navázání podle odhadu přibližně 62 % či asi 6,8 mg anti-B-3 IgY.

b) Kultivace organismů C. difficile při produkci toxinů A a B v kapalné kultuře a supematantech kultury dialýzních sáčků

i) Kapalná kultura C. difficile v médiu BHI

Zmrazená zásobní lahvička C. difficile (TCC 43255) byla rozmražena, nanesena na plotny CCFA (BB1) a pěstována v anaerobním komoře 36 až 48 h při 37 °C. Sklizené kolonie byly použity k inokulaci 20 ml kapalné kultury média HBI (BBL). Tato kultura byla pěstována přibližně 24 h při 37 °C a v anaerobní nádobě. 10 ml této kultury bylo použito k inokulaci 500 ml kapalné kultury média BHI a kultura byla pěstována přibližně 72 h při 37 °C v anaerobní komoře.

-167CZ 296806 B6 ii) Sklizeň supernatantu kapalné kultury

Kultura po 72 h byla odstředěna po dobu 10 min při 5000 min’¹ (4420 g) v odstředivce Beckman J2-21 za účelem peletizace organismů C. difficile a supernatant byl přefiltrován přes filtr 0,45 pm (Nalgene) a uschován při 2 až 8 °C pro čištění toxinu a analýzu.

iii) Analýza supernatantu kultury in vitro pro detekci přítomnosti toxinu B C. difficile

Za účelem stanovení, zde je v supernatantu kultury přítomen toxin B C. difficile, byl supernatant následujícím způsobem analyzován pomocí nativního PAGE a westernového blottingu. Sklizený supernatant kultury byl před elektroforézo na nativních gelech PAGE asi 1 Okřát zkoncentrován pomocí zařízení Centricon 30 (Amicon). Koncentrovaný vzorek byl smíchán se stejným objemem vzorkového pufru nativního gelu (50% sacharóza, 0,1 % bromfenolové modři) a nanesen na gel s gradientem 4 až 15 % Tris-glycin (Bio-Rad) spolu se známým vzorkem toxinu B C. difficile, zakoupeným od Techlab. Vzorky byly podrobeny elektroforéze po dobu 3 h při konstantním napětí 150 V s použitím zdroje napětí Hoefer. Po elektroforéze byl gel rozříznut na polovinu a jedna polovina byla obarvena Coomassieovou modří a pro vizualizaci proteinových pásů obarvena roztokem obsahujícím 10 % ledové kyseliny octové a 40 % methanolu, druhá polovina gelu byla podrobena blottingu a sondována s použitím afínitně čištěné anti-B-3 protilátky (viz odstavec (i)).

Gel obarvený Coomassieovou modří je znázorněn na obr. 52. Pruh 1 na obr. 52 obsahuje markéry širokého rozmezí molekulové hmotnosti. Pruh 2 obsahuje komerční toxin B (Teclab); pruh 3 obsahuje médium BHI; pruh 4 obsahuje supernatant kultury a pruh 5 obsahuje koncentrovaný supernatant kultury.

Jak je z obr. 52 zřejmé, byl komerční toxin B detekovatelný na gelu, barveném Coomassieovou modří. Koncentrovaný supernatant kultury vykazoval několik relativně slabých pásů, avšak žádné detekovatelné proteiny ve vzorcích supernatantu nemigrovaly spolu se známým vzorkem toxinu B C. difficile. Navíc nebyly v supernatantu kultury detekovány westernovým blotem žádné proteiny, které jsou rozpoznávány afínitně čištěnou protilátkou anti-B-3. Z těchto výsledků vyplývá, že výše uvedené podmínky růstu nejsou optimální pro produkci toxinu.

iv) Produkce toxinu B C. difficile v kultuře dialýzních sáčků

Pro identifikaci optimálních růstových podmínek pro produkci toxinu B C. difficile byl proveden následující experiment. Výše popsaným způsobem byla přes noc pěstována kapalná kultura C. difficile 43255. Tato kultura byla použita v inokulaci velkoobjemových kultur, pěstovaných v dialýzních sáčcích s obsahem PBS a ponořených v médiu BHI, podle Meadora a Twetena [Infectio and Immunity, 56:7 (1988). Stručně řečeno bylo do dvou kultivačních lahví se širokým hrdlem o objemu 500 ml vloženo 400 ml média HBI. Dialýzní sáček s řezem molekulové hmotnosti 12 000-14000 (Spectrapor), obsahující 25 ml PBS byla na obou koncích zavázán a ponořen do média BHI v každé 500 ml láhvi. Láhve s dialýzními sáčky pak byly 30 min autoklávovány za účelem sterilizace média a PBS. Poté byly láhve inkubovány 1 h při 37 °C za anaerobních podmínek k ochlazení kapalin a odstranění kyslíku z média.

PBS v každém dialýzním sáčku pak bylo inokulováno 10 ml kultury, získané přes noc, s použitím injekční stříkačky 10 ml, opatřené jehlou o velikosti 27, kterou byly sáčky propíchnuty nad hladinou média. Láhve pak byly inkubovány 48 až 72 za anaerobních podmínek při 37 °C. Obě láhve vykazovaly masivní růst uvnitř dialýzních sáčků, jedna z lahví však vykazovala i zákal v médiu BHI mimi dialýzní sáček, což ukazuje na to, že BHI bylo kontaminováno. Obsah obou dialýzních sáčků byl proto uchováván odděleně do doby, než bylo možno jej odděleně analyzovat. Mělo se za to, že růst BHI v kontaminovaném sáčku nastal vlivem C. difficile, které mohlo spadnou z jehly během inokulace dialýzního sáčku.

-168CZ 296806 B6

v) Sklizeň supernatantů kultur dialýzních sáčků

Obsah dialýzních sáčků byl odebrán, buňky byly peletovány odstředěním při 5000 min”¹ (3440x g) pro dobu 10 min a supematanty kultur dialýzních sáčků byly manipulovány odděleně: každý byl přefiltrován přes filtr 0,45 pm a zkoncentrován pomocí koncentrátu Centriprep 30 (Amicon). Oba vzorky byly zkoncentrovány z 35 na 3 ml a uchovávány při 2 až 8 °C.

Supematanty kapalných kultur z dialýzních sáčků byly analyzovány pomocí nativního PAGE a westernového blotu za účelem zjištění množství toxinu B, produkovaného v supematantech kultur dialýzních sáčků.

vi) Analýza supernatantů dialýzních kultur C. difficile pomocí nativní PAGEPWestem blot Způsobem popsaným výše v části (iii) byly alikvoty koncentrovaných supernatantů kultur dialýzních sáčků a známý vzorek toxinu B C. difficile podrobeny elektroforéze na 4 až 15% gelu s trisglycinem (Bio-Rad). Jedna polovina gelu byla obarvena Coomassieovou modří a druhá polovina byla přenesena na nitrocelulózovou membránu pro analýzu westernovým blotem s použitím zařízení pro přenos za polosuchá (Millipore) a standardních podmínek přenosu (12 V, konstantní napětí po dobu 30 min). Zbylá vazebná místa proteinů na membráně byla přes noc blokována v PBS s obsahem 1 mg/ml sušeného mléka.

Obr. 53 znázorňuje výsledný gel, obarvený Coomassiovou modří, a westernový blot. Pruhy 1 až 4 na obr. 53 představují bloty, obarvené Coomassieovou modří, a pruhy 6 až 9 představují westernový blot. Pruhy 1 a 6 obsahují markéry v širokém rozmezí molekulových hmotností; pruhy 2 a 7 obsahují komerční toxin B (Techlab); pruhy 3 a 8 obsahují supematant kultury dialýzních sáčků z kultury se sterilním médiem BHI; pruhy 4 a 9 obsahují supematant kultury dialýzních sáčků s „kontaminovaným“ médiem BHI; pruh 5 je slepý.

Z obr. 53 je zřejmé, že přítomnost toxinu B C. difficile byla detekována inkubací pásů blotu s afinitně čištěným anti-B-3 IbY. Po promytí blotů k odstranění nenavázaných protilátek anti-B-3 byly detekovány navázané protilátky anti-B-3 inkubací pásů se sekundární protilátkou, zahrnující králičí anti-kuřecí Ig, konjugovaný s alkalickou fosfatázou (Sigma). Bloty byly opět promyty k odstranění veškeré nenavázané sekundární protilátky a bloty byly vyvíjeny v čerstvě připraveném roztoku substrátu BLIP/NBP. Vyvíjení bylo zastaveno přelití blotů vodou, jakmile byl získán adekvátní signál.

Výsledky PAGE a westernové analýzy ukázaly, že množství toxinu B, přítomné ve vzorcích supernatantu dialýzních sáčků, bylo příliš zředěné, aby mohlo být detekováno barvením pomocí Coomassieovy modři. Oba vzorky supernatantů kultur (jeden z láhve se sterilním médiem BHI a jeden z láhve s kontaminovaným médiem BHI) obsahovaly imunoreaktivní toxin B, byly-li analyzovány westernovým blottingem. Jediný pozorovaný rozdíl mezi dvěma vzorky supernatantů kultur se zdál být v množství produkovaného toxinu B. Zdálo se, že vzorek se sterilním médiem obsahuje více toxinu B než vzorek s kontaminovaným médiem.

Porovnání vzorku komerčního toxinu B s toxinem produkovaným ve vzorcích supernatantů kultur dialýzních sáčků ukázalo, že vzorek supernatantu kultury obsahuje vyšší procento intaktního proteinu toxinu B (tj. je zde mnohem méně důkazů degradace ve formě menších imunoreaktivních pásů, přítomných ve vzorcích supernatantů kultur). Protože oba vzorky supernatantů kultur obsahovaly toxin B (i když v různých koncentracích), byly před afínitním čištěním spojeny.

c) Afínitní čištění toxinu B C. difficile

Vzorky supernatantů kultur dialýzních sáčků byly spojeny a naneseny na afínitní kolonu toxinu B [připravenou podle odstavce (a)]. Nespecifické proteiny byly odstraněny promytím kolony pomocí PBS do dosažení základní hodnoty OD. Navázaný protein byl eluován elučním médiem

-169CZ 296806 B6

Actisep (Sterogene) a pak dialyzován proti fyziologickém roztoku s Tris pufrem, pH 7,5 (50 mM

Tris, 150 mM NaCl). Po dialýze byla fínitně čištěný protein zkoncentrován ze 40 na 4,5 ml pomocí koncentrátoru Centricon 30 (Amicon).

d) Charakterizace afinitně čištěného toxinu B z C. difficile in vitro a in vivo

Pro zjištění přítomnosti nebo nepřítomnosti toxinu B C. difficile ve vzorku eluovaném pomocí Actisep a v kapalině vytékající z afinitní kolony (tj. průtoku) byly tyto vzorky analyzovány nativním PAGE a Westernovým blottingem spolu s výchozím materiálem supernatantu kultury. Analýzy byly prováděny pro zjištění relativního množství toxinu B C. difficile v supernatantu kultury a účinnosti afinitního čištění.

Vzorky toxinu B C. difficile z afinitního čištění, supernatantu kultury, průtoku kolony a komerčního toxinu B C. difficile byly vždy smíseny se stejným objemem nativního vzorkového pufru a naneseny na nativní gel a gradientem 4 až 15 %. Trisglycinu (Bio-Rad). Vzorky byly podrobeny elektroforéze po dobu přibližně 2,5 h při konstantním napětí 200 V s použitím zdroje napětí Hoefer a přeneseny na nitrocelulózu pomocí blottingového zařízení za polosuchá (Millipore) podle pokynů výrobce. Blot byl blokován přes noc pomocí roztoku obsahujícího 1% sušeného mléka v PBS. Pak byl blot inkubován s afinitně čištěným anti-B-3 IgY jako primární protilátkou a s králičím anti-kuřecím konjugátem s alkalickou fosfatázou jako sekundární protilátkou. Bloty byly zpracovány postupem uvedeným v odstavci b(vi), umožňujícím vizualizaci proteinu toxinu B C. difficile.

Obr. 54 znázorňuje bel, obarvený Coomassieovou modří, a odpovídající westernové bloty. Pruhy 1 až 3 na obr. 54 byly obarveny Coomassieovou modří; pruhy 5 až 10 byly sondovány santi-B-3 IgY a pruhy 8 až 10 byly sondovány s preimunním IgY. Pruhy 1, 5 a 8 obsahují afinitně čištěný toxin B; pruhy 2, 6 a 9 obsahující průtok kolony; pruhy 3, 7 a 10 obsahují komerční toxin B (Techlab). Pruh 4 neobsahuje žádný protein (slepý).

Analýzou westernovým blottingem byly získány následující výsledky. Všechny tři vzorky (supematant kultury, eluovaný protein a průtok) obsahovaly imunoreaktivní toxin b. Tyto výsledky naznačují, že postup afinitního čištění byl úspěšný při čištění určitého množství toxinu B. Protože vak bylo zjištěno, že proteklá frakce obsahuje významná množství toxinu B, bylo prokázáno, zda jsou další modifikace schopny dále optimalizovat proces čištění (například navázání B-3 IgY na hydrazidový nosič Affigel (BioRad) oxidací IgY jodistanem).

ii) Výtěžek afinitně čištěného toxinu B C. difficile

Výtěžek afinitně čištěného toxinu B C. difficile byl stanoven proteinovou analýzou BCA (Pierce) s použití BSA jako proteinového standardu. Tato analýza ukázala, že koncentrace toxinu B je 73 pg/ml x 4,5 ml (objem afinitně čištěného materiálu) = 365 pg toxinu B. Jako výchozí materiál byl použito přibližně 80 ml supernatantu kultury dialýzních sáčků; na mililitr kultury tedy bylo získáno asi 5 pg toxinu B. Tento výtěžek byl konzistentní s dříve uváděnými výtěžky při použití této metody kultivace C. difficile [7,8 pg toxinu B/ml supernatantu kultury; Meador a Tweten (1988), viz výše].

iii) Měření aktivity afinitně čištěného toxinu B C. difficile in vivo

Aktivita afinitně čištěného toxinu B C. difficile in vivo byla stanovena tak, že různá množství čištěného preparátu toxinu B (dále popsaného) byla injekčně vpravena do samic syrských křečků o hmotnosti 30 až 40 g. Jiné skupině křečků bylo injekčně aplikováno různé množství komerčního preparátu toxinu B (TechLabs) pro srovnání s dříve získanými výsledky. Bylo zjištěno, že LDioo preparátu toxinu B. C. difficile TechLabs je asi 5 pg na 30 až 40 g křečka, podává-li se I.P. (příklad 19). Pří této koncentraci (5 pg/30-40 g křeček) křečci uhynuli po asi 3 h po injekci.

-170CZ 296806 B6

Koncentrace LD_iOo afínitně čištěného toxinu B byla stanovena I.P. injekcí 1 ml roztoku obsahujícího buď 5, nebo 50 pg afínitně čištěného toxinu B, zředěného fyziologickým roztokem, dvěma 30 až 40 g křečkům byla injekčně aplikována každá koncentrace afínitně čištěného toxinu B. Křečci, kteří dostali 50 pg afínitně čištěného materiálu, uhynuli během 2 h; křečci, kteří dostali 5 pg afínitně čištěného toxinu B, uhynuli během 4 h. Tyto výsledky demonstrují, že toxicita preparátu afínitně čištěného toxinu B C. difficile je srovnatelná s komerčně dostupným toxinem B C. difficile.

Příklad 49

Diagnostický aglutinační test pro detekci toxinu A a toxinu B C. difficile

V tomto příkladu byl vyvinut rychlý aglutinační test, určený pro detekci toxinu A a toxinu B C. difficile buď v supematantech kultur, nebo biologických vzorcích, jako je stolice. Afínitně čištěné protilátky proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B ze slepic byly použity k pasivnímu pokrytí malých polystyrénových částic. Částice potažené specifickými ptačími protilátkami (IgY) k toxinu A a toxinu B by měly při smísení se vzorkem obsahujícím tyto toxiny v principu tvořit viditelné agregáty. Tento formát by měl poskytnout specifický, citlivý a rychlý test. Afínitně čištěný IgY v tomto případě dodává specifícitu a citlivost vůči toxinu C. difficile, zatímco snadnost použití a rychlost testu je způsobena použitím formátu aglutinačního testu. Tento příklad popisuje: a) počáteční vývoj aglutinačního testu pro detekci toxinu A a toxinu B C. difficile a b) hodnocení a optimalizaci aglutinačního testu.

a) Vývoj aglutinačního testu pro detekci toxinu A a toxinu B C. difficile

Protilátky byly vytvořeny ve slepicích pomocí rekombinantu toxinu A (pMAL 1870-2680) a rekombinantu toxinu B (pPB 1750-2360) s použitím Freundova adjuvans, jak je opsáno v předchozích příkladech. Protilátky proti rekombinantu toxinu A (A-6 IgY) a protilátky proti rekombinantu toxinu Β (B-3 IgY) byly frakcionovány pomocí PEG a pak afínitně čištěny, jak je popsáno v příkladu 15c. A-6 IgY byl afínitně čištěn proti pPAl870-2680 a B-3 IgY byl afínitně čištěn proti pB1750-2369. Afínitně čištěné protilátky pak byly posuvně naneseny na polystyrénové částice.

Pro každý nanášený preparát IgY byl odebráno 100 μΐ 5% suspenze kuliček o velikosti 1 pm (Spherotech lne., Libertyville, IL) a 2 min odstřeďováno při 14000x g v mikrofuze Beckman za účelem peletizace částic. Částice pak byly promyty TBS (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8), PBS-Tween (10 mM fosfátu sodného, 150 mM NaCl, pH 7,2 + 0,05 % Tween 20) a TBS. Po každém promytí byly částice 2 min odstřeďovány a promývací pufr byly kanalizován. Po posledním promytí TBS byly částice resuspendovány v 1 ml povlékacího roztoku protilátek: afínitně čištěného ptačího A-6 nebo B-3 IgY v koncentraci 100 pg/ml vTBA. Stejným způsobem byl povlečen i PEG-frakcionovaný preimunní IgY, který sloužil při aglutinačních testech jako negativní kontrola. Suspenze částic pak byly ponechány 18 až 24 h při teplotě místnosti v převrácené poloze, aby došlo k dokonalému nanesení IgY.

Pro odstranění nenavázané protilátky byly suspenze 2 min odstřeďovány, roztok protilátky byl kanalizován a částice byly promyty stejným způsobem jako dříve (TBS, PBS-Tween, TBS). Po posledním promytí TBS byly částice, povlečené IgY, resuspendovány ve 200 μΐ TBS, čímž se získala 2,5% suspenze částic.

Pro důkaz, že byly částice povlečeny IgY, bylo 10 μΐ částic inkubováno v jamkách s 5 μΐ neředěného kozího anti-kuřecího IgG (Fisher Biotech). Vzorky pak byly hodnoceny na makroskopic-171 CZ 296806 B6 kou aglutinamic. Částice, které nebyly povlečeny IgY, nevykázaly při tomto postupu žádnou aglutinaci.

Pro důkaz proveditelnosti při použití afinitně čištěného polyklonálního IgY v tomto typu testu byla hodnocena schopnost částic, povlečených A-6 IgY, aglutinovat v přítomnosti různých koncentrací toxinu A.

Komerční toxin A (Těch labs) byl 1 Okřát sériově ředěn z výchozí koncentrace 0,29 mg/ml s použitím PBS s obsahem 1 mg/ml BSA jako ředidla. 10 μΐ každého ředění bylo n a sklíčku s vyhloubenou jamkou rozmícháno s 10 μΐ povlečených kuliček a směs byla inkubována 20 min při 37 °C. Sklíčka pak byla makroskopicky analyzována zhlediska aglutinace.

Silná aglutinace byla pozorována při ředění 1:10a 1:100 a slabá při ředění 1:1000. Ředění větší než 1:1000 nevykazovala žádnou aglutinaci. Částice povlečené preimunním preparátem neaglutinovaly při žádném testovaném ředění. Ředění toxinu A 1:100 mělo koncentraci 2,9 pg/ml. 10 μΐ tohoto ředění 2,9 pg/ml obsahuje 29 ng toxinu A, test je tedy citlivý na 29 ng toxinu A, čili 2,9 pg/ml. Zdá se, že formát tohoto aglutinačního testu je vhodný pro detekci toxinů A a B C. difficile.

Kpovlékání částic byly nejběžněji používány afinitně čištěné polyklonální ptačí protilátky, ale bylo zkoumáno i použití PEG-frakcionovaných a vodou ředěných preparátů IgY za účelem zjištění, zdaje možno zvýšit citlivost aglutinačního testu použitím polyklonálních protilátek, které by mohly obsahovat populaci vysoce afinních protilátek ztracených během afinitního čištění.

PEG-frakcionovaný A2 IgY byl použit k povlečení 1 μιη polystyrénových částic za stejných podmínek, jaké jsou popsány výše, a částice byly hodnoceny na citlivost v aglutinačním testu toxinu A C. difficile. Tyto částice byly méně citlivé než částice povlečené afinitně čištěných IgY.

Pro prozkoumání možnosti, že by zbytkový PEG v PEG-frakcionovaném IgY mohl inhibovat aglutinaci částic během testu, byl A-2 IgY extrahován metodou ředění okyselenou vodou, popsanou v Akita a Nakai [J. od Food Science, 57:629 (1992)]. Vodou ředěný IgY pak byly povlékány polystyrénové částice za stejných podmínek, jaké jsou popsány výše, a byla hodnocena citlivost částic v aglutinačním testu toxinu A C. difficile.

Bylo zjištěno, že částice, podvlečené vodou ředěnými preparáty IgY, jsou méně citlivé než částice povlečené afinitně čištěným IgY. Zdá se tedy, že při tomto formátu testu více vyhovuje afinitně čištěný IgY než šaržově frakcionované preparáty IgY. Pro zvýšení citlivosti a uchování specificity aglutinačních testů jsme dále hodnotili vliv různých dalších proměnných na průběh testu.

b) Hodnocení a optimalizace aglutinačního testu toxinu A a toxinu B C. difficile

Kuličky povlečené A-6 a B-3 IgY byly hodnoceny z hlediska schopnosti aglutinace s nejmenším množstvím toxinu (tj. citlivosti) a specificity. Místo PEG-fřakcionovaného preimunního IgY byl jako negativní kontrola k povlečení částic použit afinitně čištěný IgY proti irelevantnímu antigenu, jedu hada C. atrox. Bylo provedeno sériové ředění toxinu A a toxinu B v PBS z 1 pg/ml na 0,1 ng/ml. 10 μΐ suspenze kuliček bylo v jamkách skleněných aglutinačních destiček smíseno s 20 μΐ vzorku a po dobu 2 min podrobeno rotaci na mutátoru (Lab Quke) nebo ručně. Aglutinace byla zjišťována po 2 min. Zcela rovnoměrná suspenze byla označena jako mírně zrnitý vzhled byl označen „±“ a zřetelná aglutinace byla hodnocena kako „+“ nebo „++“ podle velikosti agregátů.

Byly hodnoceny různé parametry, které ovlivňují citlivost a/nebo specificitu testu, jako je velikost kuliček, koncentrace povlékací protilátky, teplota reakce, pH povlékacího pufru, protilátky

-172CZ 296806 B6 vytvořené s použitím různých adjuvans, konečná hustota kuliček (% w/v) a ředidla vzorků. Původně byly hodnoceny čtyři různé velikosti kuliček 0,39 pm, 0,81 pm, 1 pm a 1,2 pm. Kuličky 1 pm aglutinovaly velmi rychle a tvořily velké agregáty téměř bez nespecifické aglutinace. Proto byla pro další optimalizační studie zvolena velikost kuliček 1 pm. Vzorky byl původně ředěny v PBS. Jestliže kuličky v PBSD autoaglutinovaly, bylo použito PBS s 1 mg/ml BSA nebo PBS s 0,01 % Tween-20. Obě tato ředidla bránila autoaglutinaci, ale PBS s Tween-20 také inhibovalo specifický signál. Jak ředidla byla hodnocena různá jiná blokující činidla, jako je sacharóza, BSA ve vyšší koncentraci a želatina. Bylo zjištěno, že PBS s obsahem 1 mg/ml BSA optimálně brání autoaglutinaci bez inhibice specifického signálu.

Byla hodnocena rovněž hustota kuliček v konečné suspenzi. Za účelem zlepšení citlivosti a specificity byla testována aglutinabilita latexových částic, povlečených A-6 nebo B-3 IgY, v suspenzích 2,5 %,1,25 % a 0,2 %. Všechny suspenze kuliček kromě 2,5% neposkytovaly téměř žádný signál. Protilátky vytvořené s použitím různých adjuvans mají různé avidity a afinity, a tudíž různě aglutinují. Bylo známo, že protilátky s vyšší aviditou a afinitou tvoří velké a jednotlivé agregáty. A-6 a B-3 IgY, vytvořené s použitím adjuvans Freund a Gerbu, byly hodnoceny z hlediska aglutinability při nejnižší koncentraci toxinu. Bylo zjištěno, že protilátky vytvořené s použitím Gerbuho adjuvans poskytují odlišené a velké agregáty při 1 Okřát nižších koncentracích toxinu A a toxinu B v porovnání s protilátkami vytvořenými pomocí Freundova adjuvans.

Byl rovněž testován vliv koncentrace protilátky/mg kuliček při nižší nebo vyšší inkubační teplotě. Polystyrénové částice byly povlečeny 20 pg IgY nebo 50 pg IgY/mg kuliček a inkubovány při teplotě místnosti, 37 °C nebo 56 °C. Existovala přímá korelace mezi vyšší koncentrací povlékací protilátky a vyšší teplotou vzhledem ke zvýšení citlivosti. Bylo však zjištěno, že povlékání částic při vyšší teplotě veden rovněž ke zvýšení nespecifického signálu. Pro optimalizaci maximální citlivosti a specificity byly hodnoceny pufry s nízkým pH a s vysokým pH. Polystyrénové částice, povlékané v 50 mM acetát sodný, 150 mM chlorid sodný, pH 5,5 (pufr s nízkým pH), aglutinovaly nespecificky, zatímco u kuliček povlékaných s použitím 50 mM uhličitanu sodného, pH 9,5 (pufr s vysokým pH), pufr zvyšoval citlivost a specificitu pro částice povlečené A-6 IgY, ale nikoli pro částice povlečené B-3 IgY. Citlivost a specificita částic, senzitizovaných A-6 nebo B-3 IgY, s použitím různých metod, je shrnuta v tabulce 50.

-173CZ 296806 B6

Tabulka 50.

Shrnutí výsledků

né kuličky |

<T 'o s <J· £X 40

L> Ui

1

1

+ 4

1 4

1 4

4 4

4-

?u υ §

1

1

+ +

t

i

4 u-

4 4

> o £ a <D 03 « > JP m

60 θ c C c R

1

1

♦ +

1

1

1 +

1 4-

£ >

”w) c

l

+i

+ +

1

1

i 4

1 4-

ca

’Σλ c u l/)

2 £ ” eo G

+

+ +

4 4·

1

1

1 4-

+ 1

§ 1 — en c

+ 4”

4+

_ra £

-2

4- 4

+ 1

+ 1

4.

4

E

n ·-» G

& u

ř «j uj

1

+ +

4· -i-

+ 4

4 4

+ 4

4 4-

• 4·

1

4· 4-

í

υ v CL CO

'o t> F*· •g 09

1

+ 4-

+ 4·

4 4

4 4

4 4

4 4

4 4

4 4-

1

+ 4·

'1 a > O

JO ώ s C C

1

1

1

1

1

>

1

1

1

Α·6 IgY-sensíbiliz

_ E *Q0 c

1

1

t

1

1

1

> 1 u CO

o — ¢0 c

1

1

4·

1

4 +

i

1

4·

1

1

+1

© “*> w c

1

+ 1

+ +

4

4 +

1

1

4 4-

+ 1

+

·+· +

o ·§ © 60 «— g

+ +

+ +

+ +

+ +

4 4

+1

+ 1

4 4

4 4

4* 4*

+ +

f£

co a 3P E fc. Sů v> =-r© w· 21

(Λ m i— jP eí Ι’δ Μ iA r** § X Μ» Q,

ΙΛ a j£ í a g

υ v r* s •n. rX o.

co a r* jí Ϊ 00 a. o v*» Γ4

P O! □ r-* X cl

CO a H jí E 60 4. O 1Λ CM

Z*S o r* C 2- n. r- X CL

4> O >Q £ •_t4 E 3 P * § 60> E th *· =L — O «? ΓΛ O

jí2 5 E cs ao>E C to a. »«> © n Γ*·» O

to a <p, “S? i 0 •*r· v Sx ® — Q_X

£ DO cT Έ St. O *A

P t£ δ Ί\ 1A *^5 X Λ o to «0 Á Η X»

CO a áp — aí ě’ “ $ Ή *b o o X — CL

co a h Íp oi g δ W vy gx — CL.

<

á

u

Q

•jj

X

□

w*

·>

-174CZ 296806 B6

Tabulka 50 - pokračování

			1		4	4
			1		4 4*	4
			1		4	4
			1		+	4
			+1		4 4»	4 4
TO	TO		4	TO G	4 4
+ 1	4 4	i	1	4 4	4-	4
+ 1	•4» 4-		1	4	4 4-	4 4
	t	1	1	+	1	1
i	1		1	1	4-
+ 1	+ 1	1	4-	4 4·	4« 4	+ 4
4 4·	4 4	4- 4	+ 4	4 4	4 4	4 4
4 4	4 4	4 4	4 4	4 4	4 4“	4 4
CO CO H *P Έ Uaů ui o _ v~> X Q. • ♦	P CÉ Lil * X ξ* cO ~ X'TO Γ4 < Σ	P -r až O 7c U t aú <X Έ ΐ. ’&β - !Q 2. z	P -S? o d o cJ> * o >. fs| JC· ó	č o rL. 2?oo o r £ -j· J· E α ~ « *“<-> o S. £ Έ L· fN Λ O	X G- í P 'Sbi x ·*-* © V< »n ~ (N O·* 5	R. stejně jako Q, ale pó překrytí wZBSA

F IgY vytvořený s použitím Freundova adjuvans

G IgY vytvořený S použitím Gerbuho adjuvans

E. coli kolonie E. coli byla vyzvednuta z agarové plotny a resuspendována v 500 μΐ ředidla

Stolice¹ 50 mg myší stolice bylo suspendováno v 500 μΐ ředidla, rozmícháno a odstřeďováno 2 min při 14000x g; supematant byl použit při testu

-175CZ 296806 B6

Na základě informací z různých testovaných parametrů byly navrženy následující postupy povlékání kuliček pomocí A-6 a B-3 IgY:

i) Částice povlečené A-6 IgY pro detekci toxinu A přímo ze stolice lidských pacientů mg polystyrénových částic (1 μιη, Spherotech lne., Libertyville, IL) bylo vloženo do zkumavky a promyto 1 ml TBS, PBS-T a TBS s dalším promytím pufrem 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5.

V posledně uvedeném pufru byly kuličky resuspendovány do konečného objemu 1 ml. Ke kuličkám byl přidán A-6 IgY (afínitně čištěný, vytvořený pomocí Gerbu) do konečné koncentrace 250 pg/ml a byla provedena inkubace přes noc při teplotě místnosti na nutátoru. Příští den byly IgYsenzibilizované částice promyty TBS, PBS-T a TBS a resuspendovány v TBS do konečné koncentrace 2,5 %. Tyto IgY-senzibilizované částice byly do použití skladovány při 4 °C.

ii) Latexové částice, povlečené B-3, pro detekci toxinu B přímo ze stolice lidských pacientů mg polystyrénových částic (1 pm, Spherotoch lne., Libertyville, IL) bylo vloženo do zkumavky a promyto 1 ml TBS, PBS-T a TBS s dalším promytím pufrem 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5.

V posledně uvedeném pufru byly kuličky resuspendovány do celkového objemu 1 ml. Ke kuličkám byl přidán B-3 IgY (afínitně čištěný, vytvořený pomocí Gerbu) do konečné koncentrace 100 pg/ml a inkubován přes noc při teplotě místnosti na nutátoru. Příští den byly IgY-senzibilizované latexové částice promyty TBS, PBS-T a TBS a byly resuspendovány v TBS do konečné koncentrace 2,5 % Tyto IgY-senzibilizované latexové částic byly do použití skladovány při 4 °C.

Aglutinační test pro detekci toxinu A a B ze stolice byl porovnán s komerčně dostupnými testy pro detekci toxinu A a toxinu B ze vzorků lidské stolice. Pro srovnání byly použity produkty Cyclotone^(tm) A+B EIA (Cambridge Biotech), který detekuje oba toxiny A a B, a Prernier^(tm) C. difficile Toxin A Test (meridian Diagnostics lne.), který detekuje pouze toxin A. Vzorky přírodní lidské stolice byly zpracovány podle pokynů každého výrobce. Ke vzorkům stolice byly přidány 1 μg/ml toxinu A nebo toxinUB a bylo provedeno sériové lOnásobné ředění na 0,01 ng/ml toxinu A a 0,1 ng/ml toxinu B. Pro aglutinační test byla stolice ředěna 5násobně pomocí PBS s obsahem 1 mg/ml BSA a odstřeďována 3 min při 25000x g. Supematant pak byl použit v testu.

Analýza EIA byly prováděny podle pokynů výrobce a výsledky byly odečítány spektrofotometricky. Interpretace výsledků byla prováděna na základě hodnot optické hustoty a doporučení výrobce. Pro aglutinační test bylo do jamek skleněných aglutinačních destiček vloženo 10 μΐ suspenze částic senzibilizovaných A-6, B-3 IgY nebo nespecifických IgY. Do každé jamky bylo přidáno 20 μΐ vzorku, dobře promícháno a podrobeno otáčení na nutátoru. Aglutinace byla odečítána visuálně po 2 min otáčení. Interpretace výsledků byla provedena výše zmíněným způsobem. Shrnutí výsledků je uvedeno v tabulce 51. Aglutinačním testem podle vynálezu byl detekován toxin A v koncentraci 1 ng/ml, zatímco jak v příkladě Cyclotone^(tm) A+B EIA, tak Premier^(tm) C. difficile toxin A test byly toxiny detekovány v 1 Okřát nižší hladině. Toxin B byl detekován v koncentraci 1 ng/ml jak při aglutinačním testu, tak pomocí Cycklotone A+B EIA. Tyto výsledky ukazují, že aglutinační test podle vynálezu je jednoduchý, snadno proveditelný a velmi rychlý, protože výsledky je možno získat během 5 min.

-176CZ 296806 B6

Tabulka 51. Porovnání tří různých metod detekce toxinu A a toxinu B přidaného ke vzorkům normální lidské stolice

parametr	Cyclotone™ A+B ElA Cambridge Biotech	Premier™ C. difficile toxin A test Meridian Diagnostic	aglutinační test na toxin A & B Ophidian Pharmaceuticals
stolice s přídavkem toxinu A 100 ng/ml	++	4*4*	+4’
10 ng/ml	++	++	++
1 ng/ml	++	++	+
0,1 ng/ml	+	++	-
0,01 ng/ml	-	ND	ND
stolice s přídavkem toxinu B 100 ng/ml	++	N/A	++
10 ng/ml	++		++
1 ng/ml	±		±
0,1 ng/ml	-		-
celková doba	150 min	150 min	5 min

ND nestanoveno

N/A nehodí se

Příklad 50

Charakterizace křečků po úspěšném ošetření ptačími protilátkami, zaměřenými proti rekombinačním proteinům toxinu A a toxinu B C. difficile

Za účelem zjištění, proč křečci, ošetření před nebo po expozici C. difficile IgY zaměřenými proti rekombinačnímu toxinu A (A-6 IgY) a rekombinačnímu toxinu B (B-3 IgY) po skončení léčby nerecidivují a neonemocní znovu nemocí související s C. difficile (CDAD), byl proveden následující experiment.

U křečků (jak dokazuje příklad 33) a lidí, ošetřovaných léčivy, jako je vankomycin nebo metronidazol, proti CDAD jsou po skončení medikace běžně pozorovány recidivy. Naproti tomu z údajů uvedených v příkladech 16 a 32 vyplývá, že je možno IgY, zaměřené proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile samotnému (podávané profylakticky), nebo směs, obsahující IgY zaměřené proti rekombinačním proteinům toxinů A a B (podávanou terapeuticky), použít k úspěšné prevenci nebo léčbě CDAD a také k prevenci recidiv.

-177CZ 296806 B6

Tento příklad zahrnoval a) detekci organismů a toxinů C. difficile ve stolici křečků, ošetřovaných anti-A-6/B-3 IgY, b) detekce IgG proti toxinu A C. difficile a proti toxinu B C. difficile v séru léčených křečků pomocí ELISA, c) detekci IgA proti toxinu A C. difficile a proti toxinu B

C. difficile ve slinách ošetřovaných křečků pomocí ELISA a d) reexpozicí A-6/B-3 ošetřovaných křečků antibiotiky.

a) Detekce organismů a toxinů C. difficile nq stolici křečků ošetřovaných A-6/B-3 IgY křečků, kteří byli úspěšně ošetřováni 2 mm A-6/B-3 IgY denně, spolu s jediným přežívajícím křečkem, ošetřovaným 1 ml A-6/B-3 IgY denně (příklad 42), bylo testováno na přítomnosti C. difficile a toxinu A a toxinu B ve fekálním materiálu po skončení léčby. Toto stanovení bylo prováděno za účelem zjištění, zda jsou křečci, ošetřovaní A-6/B-3 IgY, chráněni před recidivou, protože ošetření pomocí IgY buď redukuje, nebo kompletně eliminuje organismy a toxiny C. difficile z GI traktu ošetřovaných křečků.

Od 7 jednotlivých křečků byla odebrána stolice 4 dny po skončení ošetření A-6/B-3 IgY. Ze vzorků byla následujícím postupem vytvořena suspenze: 50 mg stolice bylo přidáno ke 100 pg PBS (pH 7,4) a směs byla promícháním vzorku suspendována. Alikvot (50 pl) každé suspenze byl naočkován na selektivní agarovou desku pro C. difficile (desky CCFA; BB1) a desky byly inkubovány za anaerobních podmínek 48 h. Zbylá suspenze byla testována na přítomnost toxinu A a toxinu B s p užitím aglutinačního testu toxinů, popsaného v příkladu 49.

Výsledky, získané kultivací suspenzí stolice na deskách CCFA, prokázaly, že všichni křečci, úspěšně ošetřovaní A-6/B-3 IgY, ještě 4 dny po léčbě obsahovali organismy C. difficile (v rozmezí přibližně 6 až 100 kolonií). Toxin A C. difficile byl kromě toho detekován ve stolici všech devíti ošetřovaných křečků pomocí aglutinačního testu (příklad 49). Překvapivé je, že ve stolici žádného ze zvířat nebyl detekován toxin C. difficile.

Od stejných 7 křečků byly odebrány vzorky stolice ještě po asi 5 týdnech po skončení léčby protilátkami. Byly připraveny suspenze a výše popsanými způsobem umístěny na desky CCFA. Po této prodloužené době byla přítomnost C. difficile detekována pouze ve stolici jednoho z křečků. Je zajímavé, že organismy byly detekovány v tom křečkovi, který byl ošetřován nižší (1 ml) dávkou A-6/B-3 IgY. Ve stolici tohoto zvířete byl detekován pouze nízký počet kolonií (5 kolonií). U kontrolních zvířat, jak je běžné, nebyly detekovány žádné organismy, pouze velmi malé procento křečků mělo detekovatelnou hladinu organismů.

Tyto výsledky ukazují, že i když jsou křečci, ošetřovaní A-6/B-3, úspěšně vyléčení z CD AD a nemoc nerecidivuje, vylučují krátce po skončení léčby organismy C. difficile a mají ve stolici toxin A. Protilátky proti rekombinačnímu toxinu A a B C. difficile (tj. A-6/B-3 IgY) zjevně eliminují příznaky nemoci, aniž by kompletně eliminovaly organismy nebo toxin A C. difficile z gastrointestinálního traktu ošetřovaných křečků. Přestože se vynález neomezuje na určitou teorii působení, mohou ptačí IgY svůj terapeutický účinek vykonávat tak, že snižují hladinu přítomného toxinu a tak pravděpodobně dostatečně snižují počet organismů, takže nejen chrání před CDAD, ale i před její recidivou, protože je možné, že toxin A může napomáhat kolonizaci C. difficile.

Po pěti týdnech po skončení léčby preparátem ptačího antitoxinu nebyly organismy C. difficile detekovány ve stolici většiny (7/8) ošetřovaných křečků. Tyto výsledky ukazují, že po léčbě pomocí A-6/B-3 IgY nedochází k dlouhodobé kolonizaci gastrointestinálního traktu C. difficile.

b) Detekce IgG proti toxinu A C. difficile a toxinu B C. difficile v séru ošetřovaných křečků pomocí ELISA

Od křečků po ošetření anti-A-6/B-3 IgY bylo odebráno sérum za účelem zjištění, zda byla u ošetřovaných křečků vyvolána endogenní sérová odpověď IgG, zaměřená proti toxinům

-178CZ 296806 B6

C. difficile. Vyvolání antítoxinové odpovědi IgG by mohl odpovídat za prevenci následných recidiv u zvířat.

Čtyři dny po skončení léčby byla od sedmi křečků, kteří byli po pěti týdnech ještě v dispozici (jak popsáno výše), odebrána kardiální punkcí krev. Krev byla ponechána vysrážet a odstředěním bylo odděleno sérum. Bylo odebráno také sérum od neinfíkovaného křečka a od křečka vakcínovaného směsí rekombinačních proteinů toxinů A a toxinů B (příklad 39), které sloužilo jako negativní, resp. pozitivní kontrola. Byla provedena ELISA postupem popsaným v příkladu 1. Stručně řečeno byly jamky mikrotitrační plotny potaženy 0,05 pg/ml rekombínantu toxinů A pPA1870-2680 (A-6) nebo 1,0 pg/ml rekombínantu toxinů B pPB 1750-2360 (B-3) v množství 100 pl na jamku. Vzorky séra byly testovány při výchozím ředění 1:50 s následným 5násobným sériovým ředěním. Jako sekundární protilátka byla použita kozí antikřeččí IgG alkalická fosfatáza (Southern Biotechnology Assoc.) ve zředění 1:1000. Všechny inkubace protilátek byly prováděny po dobu 2 h při 37 C. Plotny byly vyvíjeny po dobu 30 min s použitím p-nitrofenylfosfátu (Sigma.)

Výsledky ELISA prokázaly, že všechny vzorky séra od testovaných křečků obsahovaly významně nižší hladinu IgG proti toxinů A a proti toxinů B v porovnání s pozitivním kontrolním sérem (sérum od křečka, který si vytvořil ochrannou odpověď IgG po aktivní imunizaci rekombinačními proteiny toxinů A a B). Titry protilátek, přítomných v séru od 7 ošetřovaných křečků byly srovnatelné s hodnotami přítomnými v negativní kontrole. Tyto výsledky ukázaly, že ochrana před recidivou CDAD, dosahovaná ošetřením křečků pomocí A-6/B-3 IgY, pravděpodobně není důsledkem aktivní odpovědi sérového IgG u křečků po infekci organismy C. difficile.

c) Detekce odpovědi IgA ve slinách proti toxinů A C. difficile a proti toxinů B C. difficile u ošetřovaných křečků pomocí ELISA

Za účelem zjištění, zda je ochrana před recidivou CDAD, pozorovaná u křečků, ošetřovaných anti-A-6/B-3 IgY, důsledkem vyvolá odpovědí mukosálního IgA u zvířat, byl proveden následující experiment. Od 6 křečků, předtím ošetřovaných anti-A-6/B-3 IgY (příklad 42; 2 ml), byly s použitím pilokarpinu (Sigma), který vyvolává hypersekreci slin, odebrány sliny. Křečkům byl I.P. injekčně vpraven roztok obsahující pilokarpin (1 mg/ml) ve sterilní vodě; zvířatům byly podáno 1 až 3 mg pilokarpinu. Sliny byly těchto 6 křečkům odebírány pomocí pipety. Jako negativní kontrola byly odebrány sliny od myši, které bylo podáno 200 pg pilokarpinu. Myší vzorek byl jako negativní kontrola použit proto, že jediný komerčně dostupný anti-IgA konjugát je kozí anti-myší IgA (bylo uvedeno, že toto činidlo křížově reaguje skřeččích IgA).

Test ELISA byl prováděn výše popsaným způsobem (odstavec (b)) s následujícími modifikacemi. Vzorky slin byly testovány při počátečním zředění 1:10 s následnými pětinásobnými sériovými ředěními. Jako sekundární protilátka byl použit kozí anti-myší IgA (Southern Biotechnology Asocc.) ve zředění 1:1000.

Výsledky ELISA ukázaly, že sliny pouze od 2 ze 6 ošetřených křečků obsahují hladiny IgA proti toxinů A a proti toxinů B vyšší než se vyskytují u myší negativní kontroly. Sliny od těchto dvou křečků, pozitivních na IgA proti toxinů, měly značně nízké titry (mezi 1:250 a 1:11250). Typické hyperimunní titry IgA se pohybují kolem 1:10 000 nebo výše. Zbylí 4 křečci nevykazovali v porovnání s negativní kontrolou významnou odpověď antitoxinového IgA buď v toxinů A, nebo toxinů B. Protože všech 6 křečků bylo úspěšně ošetřeno proti recidivě CDAD a většina (4/6) ošetřených křečků neprodukovala významnou odpověď antitoxinového IgA, je nepravděpodobné, že prevence recidivy byla důsledkem vytvoření odpovědi IgA proti toxinů A nebo toxinů B u křečka.

Výsledky uvedené v odstavcích (a) a (b) ukazují, že ochrana proti recidivě, pozorovaná u křečků, úspěšně léčených pomocí IgY, zaměřeného proti intervalům A-6 a B-3 C. difficile, není důsled-179CZ 296806 B6 kem produkce humorální odpovědi proti toxinu C. difficile u hostitele. Ochrana před recidivou je tedy funkcí podávání preparátů IgY. To ukazuje, že imunitní status hostitele nemusí být z hlediska odhadu vývoje nemoci (tj. přežití) nebo z hlediska výskytu recidivy relevantní. To je významné, protože mnozí pacienti, pro něž by byla léčba preparátem A-6/B-3 IgY největším přínosem, mají oslabený imunitní systém.

d) Opětná expozice křečků, ošetřovaných A-6/B-3, antibiotiky

Jak je uvedeno výše v odstavci (a), mají ošetření křečci dosud ve stolici organismy C. difficile (4 dny po skončení léčby IgY), a tudíž mají potenciál vývoje CDAD. Byl proveden experiment za účelem zjištění, zda opětná expozice těchto ošetřených křečků klindamycinem vyvolá nástup CDAD.

Čtyři z těchž křečků, kteří byli použiti ve výše uvedených experimentech (například v příkladu 42), kteří byli úspěšně léčeni A-6/B-3 IgY, byli opět predisponování vůči infekci C. difficile podáním klindamycin-fosfátu. Sedm dní po skončení počáteční léčby antibiotiky byla křečkům podána další I.P. injekce klindamycin-fosfátu (Biomol) v množství 1 mg/100 g tělesné hmotnosti. 12 dní po klindamycinové predispozici (tj. po druhém podání klindamycinu) se u žádného křečka nevyvinuly žádné známky CDAD.

Tyto výsledky prokázaly, že jakmile byli křečci úspěšně vyléčeni anti-A-6/B-3 IgY, byli odolní vůči vývoji CDAD i po další expozici klindamycinem. K dalšímu potvrzení tohoto výsledku bylo týmž křečkům podáno jiné antibiotikum, totiž Cefoxitin (Sigma), o němž je rovněž známo, že predisponují křečky vůči infekci C. difficile. Důvodem byla existence možnosti, že prevence CDAD u křečků po opětném ošetření klindamycinem je důsledkem vytvoření normální flóry, resistentní vůči klindamycinu, které mohla zabránit kolonizaci gastrointestinálního traktu C. difficile. Každému z těchto 4 křečků byla podána subkutánní injekce 10 mg Cefolitinu ve fyziologickém roztoku 11 dní poté (18 dní po ošetření pomocí A-6/B-3 IgY). Je známo, že tato dávka Cefoxitinu křečky predisponuje vůči CDAD.

dní po ošetření Cefoxitinem se u 1 ze 4 křečků vyvinul průjem a křeček uhynul. Zbylí 3 křečci zůstali zdraví a dlouhodobě přižili (tj. alespoň jeden měsíc). Výsledky získané po ošetření Cefoxitinem ukazují, že ochrana před recidivou CDAD u ošetřených křečků pravděpodobně není důsledkem vzniklé odolnosti proti určitému antibiotiku (tj. rezistence vůči klindamycinu) ve flóře křečka.

Výše uvedené výsledky společně ukazují, že křečci, léčení na CDAD pomocí anti-A-6/B-3 IgY, obsahují krátce po skončení léčby v gastrointestinálním traktu životaschopné organismy C. difficile a toxin A C. difficile a přesto nerecidivují. Ještě více překvapivé je zjištění, že zatímco křečci mají ještě C. difficile ve vnitřnostech, jsou odolní při následné expozici s použitím antibiotik schopných je predisponovat vůči CDAD. Jak je výše uvedeno, 5 týdnů po odebrání ptačího antitoxinu již křečci nevylučují organismy do stolice a pravděpodobně již tedy nejsou kolonizováni C. difficile. Tyto výsledky dále ukazují, že orálním podáním A-6/B-3 IgY křečků je možno nejen úspěšně léčit CDAD, ale i dodat odolnost vůči recidivě. A-6/B-3 IgY navíc chránil křečky před CDAD z opakované predispozice antibiotiky při použití dvou různých antibiotik.

Z výše uvedených skutečností je zřejmé, že vynález poskytuje antitoxiny a vakcíny pro léčbu a prevenci onemocnění C. difficile. Tyto antitoxiny navíc zabraňují recidivě onemocnění C. difficile, která je běžně pozorována při obvyklých postupech léčby, navíc poskytuje vynález rychlý aglutinační test pro detekci toxinů A a B C. difficile ve vzorcích.

-180CZ 296806 B6

Příklad 51

Tvorba a enterosolventní povlékání tablet obsahujících ptačí antitoxin zaměřený proti klostridiálním toxinovým proteinům pro orální aplikaci

Tento příklad popisuje tvorbu tablet obsahujících kuřecí IgY, zaměřený proti klostridiálním toxinovým proteinům, vhodných pro orální aplikaci pro účinnou léčbu onemocnění C. difficile. Jak je uvedeno v příkladu 43, podávají-li se IgY křečkům orálně v karbonátovém pufru, je ve slepém střevě, což je relevantní místo, kde dochází k infekci, detekováno jen velmi malé množství dodané protilátky. Většina IgY je pravděpodobně hydrolyzována v kyselém prostředí nebo degradována proteázami v žaludku. Většina zbylého funkčního IgY, který projde žaludkem, je pak však rozložena různými enzymy, nacházejícími se v tenkém střevě. Nízké hodnoty obsahu IgY, nacházeného ve slepém střevě ošetřených křečků, jsou podpořeny prací Losche ad., kteří v experimentech in vitro zjistili, že kuřecí IgY jsou velmi citlivé vůči účinkům nízkého pH a střevních proteáz. Pro maximalizaci účinnosti dané dávky orálního léčiva s obsahem protilátky byly prováděny experimenty za účelem zjištění, zdaje možno PEG-frakcionované IgY tabletovat pro snadné podávání a enterosolventně povlékat pro zamezení degradace v gastrointestinálním traktu. Tento příklad zahrnoval (a) tvorbu tablet s obsahem PEG-čištěného anti-A-6 IgY, (b) povlékání tablet IgY pH-citlivým enterosolventním filmem, (c) testování rozpouštěcího profilu povlečených tablet IgY, (d) stanovení stability reaktivity IgY po tabletování, enterosolventním povlékání a rozpouštění pomocí ELISA a (e) demonstraci zachování schopnosti tabletovaného IgY neutralizovat toxin A C. difficile in vivo.

a) Tvorba tablet obsahujících PEG-čištěná anti-A-6 IgY

Kuřecí IgY ze slepic, imunizovaných rekombinačním proteinem toxinu A C. difficile pMA 1870-2680 (oblast A-6), byl frakcionován pomocí PEG, jak je popsáno v příkladu 37(a), tj. IgY z vajec, sebraných od slepic, imunizovaných rekombinačním proteinem, byly čištěny srážením PEG a po čištění byly pelety IgY resuspendovány v 0,lx PBS, pH 7,4. Tento postup se mírně liší od postupu uvedeného v příkladu vtom, že místo lx PBS (příklad 1) je zde (a v příkladu 37a) použito 0,lx PBS. Úprava na 0,lx PBS byla provedena primárně pro snížení konečného poměru soli ve vztahu k IgY v konečném vysušeném preparátu.

Bylo frakcionováno 113 vajec a konečná peleta IgY po stupni s 12% PEG byla resuspendována v provozní vodě o 1/4 objemu žloutku. Resuspendovaný IgY byl přenesen do lyofilizačních nádob a rychle zmrazen na suchém ledu sreagenčním alkoholem. Nádoby rotovaly v lázni suchého ledu, aby došlo k rovnoměrném zamrzání roztoku IgY ukládáním vrstev na stěnách nádoby. Zmrazený roztok IgY byl umístěn na zařízení Labconco Freeze-Dry System/Lyph Lock 4.5 a lyofilizován po dobu asi 18 h do sucha. Konečný lyofilizovaný IgY vážil 13,56 g, čili asi 120 mg sušiny na vejce.

g lyofílizovaného IgY bylo v tabletovacím lisu Stokes B2 zpracováno na 40 tablet po 250 mg. Byla použita konvenční vytlačovací hlava s plochým povrchem o velikosti 6,35 mm (1/4 inch). Tablety byly připravovány dvojím lisováním pod tlakem 4500 liber, byly tvrdé a měly plochý povrch a průměrnou hmotnost 256 ± 6 mg.

b) Povlékání tablet IgY enterosolventním filmem, citlivým na pH

Tablety byly povlékány produktem Eudragit S-100 (Rohm Těch, lne., Malden, MA), což je enterosolventní filmový povlak (kopolymer kyseliny methakrylové, typ B, USP/NF), který je rozpustný v roztocích od pH 7,0 a výše. Zásobní roztok Eudragit S-100 byl připraven podle pokynů výrobce. Stručně řečeno byl Eudragit S-100 rozpuštěn smísením 13 dílů (hmotnostních) Eudragit S-100 (12,5 % suché polymemí substance) ve směsi 82 dílů (hmotnostních) izopropylalkoholu a 5 dílů (hmotnostních) provozní vody. Enterosolventní povlékací film byl připraven hmotnostně z: 480 g 12,5% roztoku Eudragit S-100, 6 g triethylcitrátu jako změkčovadla, 30 g talku jako anti-181 CZ 296806 B6 adhesiva, 50 g provozní vody a 434 g izopropylalkoholu. Obsah pevného podílu konečné suspenze byl 9,6 % a obsah sušiny polymeru byl 6,0 %.

Směs pro enterosolventní povlak byl umístěn do kádinky a pomocí pinzety s jemnými konci byly do roztoku ponořovány jednotlivé tablety na dobu asi 1 s. Povlečené tablety pak byly ponechány schnout při teplotě místnosti na listu parafilmu. Některé tablety byly do enterosolventního povlaku ponořeny ještě dvakrát se sušením při teplotě místnosti mezi povlékáním. Důvodem bylo zajistit úspěšnější pokrytí tablet. Tablety ponořené do enterosolventního roztoku jednou, resp. třikrát, byly označen jak tablety lx, resp. 3x.

c) Testování rozpouštěcího profilu povlečených tablet IgY

Byly prováděny rozpouštěcí studie pro stanovení desintegrační kinetiky enterosolventních tablet s použitím metod popsaných v příkladu 37(b). Rozpouštění tablet bylo prováděno za dvojích podmínek: buď v simulované žaludeční šťáva o pH 1,2, nebo v simulovaném střevním roztoku o pH 7,5, připravených v obou případech podle návodu USP. Každá tableta byla zvážena a umístěna do kádinky obsahující příslušný roztok v množství 10 mg tablet na ml roztoku. Byly testovány tyto formy tablet: 1) nepovlečené tablety IgY, 2) lx povlečené tablety a 3) 3x povlečené tablety IgY.

Tablety byly rozpouštěny mírným mícháním pomocí tyčového míchadla při teplotě místnosti. V různých časových okamžicích byly odebírány alikvoty každého roztoku IgY a byla měřena absorbance při 280 nm pro kvantifikaci množství IgY v roztoku. Rozpouštěcí profil tablet IgY, povlečených Eudragitem, je znázorněn na obr. 55.

Na obr. 55 je vynesena absorbance při 280 nm při času v minutách. Uvolňování IgY z nepovlečených tablet IgY v žaludečním nebo střevním roztoku je znázorněno plnými čtverečky, resp. prázdnými kosočtverci. Jak je na obr. 55 patrném rychlost rozpouštění nepovlečených tablet IgY byla v žaludečním roztoku oproti střevnímu roztoku menší. Tato inherentní fyzikální vlastnost nepovlečené tablety je její neočekávanou výhodou, která ji činí přirozeně odolnější vůči rozpouštění v žaludku.

Rozpouštěcí profil lx a 3x povlečených tablet IgY, umístěných do střevního roztoku, je na obr. 55 znázorněn plnými, resp. prázdnými trojúhelníky. Jak je z obr. 55 patrné, lx i 3x povlečené tablety se rozpouštěly podobnou rychlostí a k úplnému rozpuštění došlo po asi 1 h. Navíc byla rozpouštěcí rychlost ve střevním roztoku a enterosolventních povlečených tablet mírně větší než u nepovlečených tablet. Naproti tomu se 1 x nebo 3x povlečené tablety IgY v žaludečním roztoku (znázorněno na obr. 55 prázdnými čtverečky, resp. plnými trojúhelníky) rozpouštěly velmi pomalu a do roztoku byl uvolněn pouze malý zlomek celkového IgY, obsaženého vtabletě. Rozdíl rozpouštěcího profilu lx nebo 3x povlečených tablet IgY byl minimální. Z těchto výsledků vyplývá, že tablety IgY, povlečené Eudragitem, se správně otevíraly do roztoku v simulovaném střevním roztoku o pH 7,5 v závislosti na čase zatímco v simulovaném žaludečním roztoku o pH 1,2 zůstávaly převážně intaktní.

Výše popsané rozpouštěcí studie prokazují, že IgY, formulovaný jako tableta, může být úspěšně enterosolventně povlékán.

d) Stanovení stability reaktivity IgY po tabletování, enterosolventním povlékání a rozpouštění pomocí ELISA

Stabilita IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-A-6 IgY) po tabletování (tj. formování do tablet) a povlékání enterosolventním povlakem byla zjišťována porovnáváním reaktivity ELISA u lyofilizovaného výchozího materiálu A-6 (netabletovaného) a tablet anti-A-6 IgY, buď enterosolventně povlečených Eudragitem S-100, nebo nepovlečených.

Enterosolventně povlečené (3x tablety) nebo nepovlečené tablety IgY byly ponechány rozpustit

-182CZ 296806 B6 se v simulovaném střevním roztoku o pH 7,5 v koncentraci 10 mg/ml. Ve střevním roztoku byl ve stejné koncentraci rozpouštěn také výchozí netabletovaný IgY (označený jako objemná protilátka). Byla provedena standardní ELISA detekující přítomnost protilátek zaměřených proti rekombinačnímu proteinu pPAl 870-2680 N/C toxinů A (A-6), jak je popsána v příkladu 35. Jako negativní kontrola byl testován také preimunní IgY ve stejné normalizované koncentraci (označen jako placebo; na obr. 56 znázorněn čtverečky). Výsledky ELISA jsou znázorněny na obr. 56.

Na obr. 56 je vynesena absorbance při 410 nm proti reciproké hodnotě ředění testované protilátky. Výsledky znázorněné na obr. 56 demonstrují, že reaktivita anti-A-6 IgY po tabletování (ben enterosolventního povlaku; plné kosočtverce) a anti-A-6 IgY po tabletování a enterosolventním povlékání směsí Eudragitu S—100 (3x povlečené tablety; prázdné kosočtverce) je velmi podobná výchozímu objemovému anti-A-6 IgY (objemová protilátka; prázdné čtverečky). Z výsledků vyplývá, že procesy tabletování a opatřování enterosolventním povlakem nejsou pro preparát IgY škodlivé a anti-A-6 IgY zůstává po rozpouštění za fyziologických podmínek aktivní funkční.

Zvýše uvedených výsledků vyplývá, že byly získány enterosolventně povlečené tablety IgY, které jsou stabilní a reaktivní.

e) Demonstrace uchování schopnosti tabletovaného IgY neutralizovat toxin C. difficile in vivo

Byla zjišťována schopnost tablety A-6 IgY po rozpuštění neutralizovat in vivo toxin A C. difficile. Pro Testování neutralizace toxinů A byly použity myši místo křečků, protože myši vyžadují pro LDioo méně toxinů.

Hodnota LD_)Oo toxinů A C. difficile pro myši byla stanovena I.P. injekcí 1 ml PBS s obsahem buď 50 ng, 500 ng, nebo 5000 ng toxinů A C. difficile myším Balb/c o hmotnosti 25 g. Toxin A C. difficile, použitý v této studii, byl zakoupen od Dade Intemational, lne., bartells Division Seattle, WA. Bylo zjištěno, že minimální testovaná letální dávka činí 50 ng toxinů A C. difficile, při níž všechny myši do 24 h po ošetření uhynuly. Když bylo podáno 500, resp. 5000 ng, toxinů A C. difficile, uhynuly všechny myši do 3, resp. 4 h.

Byl rovněž testován efekt injekce toxinů A C. difficile v přítomnosti preimunního IgY pro zjištění, zda IgY snižuje toxicitu in vivo. 50 ng toxinů A bylo před podáním myším preinkubováno po dobu 1 h při 37 °C s až 50 000 ng (lOOnásobné množství) preimunního IgY. Bylo zjištěno, že i v přítomnosti preimunního IgY je 50 ng toxinů A C. difficile letálních pro myši během 24 h.

Schopnost tablety anti-A-6 IgY neutralizovat toxin A C. difficile in vivo byla porovnávána se schopností objemového anti-A-6 IgY (před tabletováním) neutralizovat toxin. Jedna tableta 250 mg anti-A-6 IgY (tableta byla předtím uchovávána 3 týdny při teplotě místnosti) byla rozpuštěna v simulovaném střevním roztoku a množství IgY v roztoku bylo kvantifikováno absorbancí při 280 nm. Byl rovněž připraven lyofilizovaný A-6 IgY před tabletováním (objemový) a preimunní (PI) IgY ve střevním roztoku a kvantifikován absorbancí při 280nm.S 50 ng/ml toxinů A C. difficile bylo 1 h při 37 °C preinkubováno 5000 ng, 25 000 ng a 50 000 ng/ml preimunního IgY, objemového anti-A-6 IgY nebo rozpuštěné tablety anti-A-6 IgY. To představuje lOOnásobné, 500násobné, resp. lOOOnásobné množství IgY v porovnání s množstvím toxinů (hmotnostně).

Po 1 h inkubace byly směsi (celkem 9) intraperitoneálně podány myším Balb/c o hmotnosti 20 až

g. Bylo testováno celkem devět skupin po třech myších. Po skončení doby pozorování, trvající h, byl zjištěn počet přežívajících myší v každé skupině. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 52.

-183CZ 296806 B6

Tabulka 52

	skupina (ng IgY ve směsi s 50 ng toxinu A)	přežití (%)
1	5000 ng tablety anti-A-6	100 % (3/3)
2	250000 ng tablety anti-A-6	100% (3/3)
3	500000 ng tablety anti-A-6	100 % (3/3)
4	5000 ng obj. anti-A-6	100% (3/3)
5	250000 ng obj. anti-A-6	100 % (3/3)
6	500000 ng obj. anti-A-6	66 % (2/3)
7	5000 ng PI	0 % (0/3)
8	250000 ng PI	0 % (0/3)
9	500000 ng PI	33 % (1/3)

Z uvedených výsledků vyplývá, že tableta anti-A-6 po rozpuštění při pH 7,5 je schopna neutralizovat letální účinky toxinu A C. difficile způsobem srovnatelným jako v případě, kdy byl použit výchozí (tj. objemový nebo nepovlečený) materiál. Tyto výsledky ukazují, že tabletovací proces nemá nepříznivé účinky na schopnost anti-A-6 IgY neutralizovat toxin A C. difficile. Na rozdíl od výsledků získaných s použitím preimunního IgY byl jak objemový, tak tabletovaný preparát anti-A-6 IgY schopen neutralizovat toxin A C. difficile při srovnatelném lOOnásobném přebytku proteinu (5000 ng A-6 IgY neutralizovalo 50 ng toxinu).

Tyto výsledky demonstrují schopnost formulovat IgY proti klostridiálním toxinům v pevné dávkové formě (tj. tabletě), která je opatřena enterosolventním povlakem pro uvolňování v tlustém střevě. IgY proti klostridiálnímu toxinu, přítomný v tabletě, navíc zůstává stabilní, aktivní a funkční.

Příklad 52

Profylaktické ošetření onemocnění C. difficile u křečků protilátkami proti rekombinačnímu intervalu 6 toxinu A

Tento experiment zahrnoval infekci křečků pomocí C. difficile a léčbu onemocnění, vyvolaného C. difficile, protilátkami, vytvořenými proti rekombinačnímu toxinu A (IgY). Protilátky IgY byly vytvořeny proti rekombinantu toxinu A C. difficile pMAl870-2680 (interval A-6). Kontrolními zvířaty byly infikovaní křečci, ošetřovaní frakcí preimunizačního imunoglobulinu (PI). Surový PI a IgY byly frakcionovány polyethylenglykolem a resuspendovány v 8x koncentraci (40 mg/ml) v 0,1 M karbonátovém pufru o pH 9,5.

Dvě skupiny křečků obsahovaly po devíti nebo deseti samicích zlatých syrských křečků (Sasco; kříženci LVG) o hmotnosti asi 80 g. Křečci byli umístěni v klecích po třech a během celé studie dostávali potratu a vodu ad libitum.

Křečci byli predisponováni vůči infekci C. difficile metodou podle Leyerlyho (Lyerly a d., Infect

Immun. 59(6): 2215-2218 (1991)). Každému křečkovi byl intragastricky žaludeční sondoupodán klindamycin-HCl (Sigma) v dávce 3 mg/100 g tělesné hmotnosti v 1 ml sterilní vody. Po 2 a 4 h

-184CZ 296806 B6 od podání klindamycinu byla křečkům orálně podána dávka 2 ml 8x PI nebo 8x IgY. Po 24 h od podání klindamycinu byli křečci exponováni 1 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) o pH 7,2 s obsahem přibližně 10⁸ organismů C. difficile VPI 7698. Expoziční dávka byla připravena z kultur v mozkosrdcovém nálevu (BHI), pěstovaných přes noc anaerobně v anaerobní komoře Gaspak při 37 °C (podmínky kultivace se řídily podle Lyerlyho a d.). 1 h před touto expozicí a 8 h po ní bylo křečkům podáno 8x PI nebo 8x IgY. Dávkování pokračovalo ještě dva dny (celkem 4 dny) dvakrát denně v přibližně 8h intervalech.

Výsledky jsou znázorněny na obr. 57. Doba ošetření je znázorněna vodorovnou úsečkou pod osou souřadnic. Podání klindamycinu a C. difficile (infekce) je označeno šipkami. Plné čtverečky představují křečky ošetřované PI a prázdné čtverečky křečky ošetřované A-6 IgY.

Křečci ošetřovaní PI si do 24 až 48 h vyvinuli průjem a do 24 h po nástupu průjmu uhynuli. Všech devět křečků, ošetřovaných PI, bylo 48 h po expozici mrtvých. Naproti tomu 60 % (6/10) křečků, kteří dostali anti-A-6 IgY, přežívalo ještě 19 dní po expozici, kdy bylo ukončeno monitorování. Nástup úhynu u zbylých čtyř křečků, ošetřovaných anti-A-6 IgY, byl ve srovnání s křečky, ošetřovanými PI, opožděn o 1 až 3 dny. Úroveň dlouhodobé ochrany pomocí anti-A-6 IgY byla statisticky významná (analýza chi square s hodnotou P < 0,025). I když se u většin (8 z 10) křečků, ošetřovaných anti-A-6 IgY, vyvinul průjem, pouze polovina z těch, kteří měli průjem, uhynula v důsledku infekce C. difficile. Bez ohledu na nástup průjmu anti-A-6 IgY podporoval přežití nemocných křečků.

Tyto výsledky ukazují, že nízké profýlaktické dávky anti-A-6 IgY chrání křečky dlouhodobě před nejvážnějšími účinky onemocnění vyvolané C. difficile. Této ochrany bylo dosaženo dávkovacím režimem, spočívajícím v osmi podáních během 4 dnů, z čehož pouze 3 dávky byly provedeny před infekcí. Toto minimální ošetření kontrastuje s režimem podle Lyerlyho a d., kde byli křečci profylakticky ošetřeni celkem 39krát: třikrát denně počínaje 3 dny před expozicí a pak ještě 10 dní po expozici byl podáván bovinní antitoxin. Leyerlyho dávky bovinního antitoxinu byly také větší než v experimentu podle vynálezu (tj. 300 mg bovinní protilátky/dávku oproti 80 mg ptačí protilátky/dávku). Navíc, na rozdíl od našich zjištění, Lyerly uvádí, že zvířata nevykazovala dlouhodobou ochranu po skončení léčby (všechny uhynula do 72 h po ošetření) nebo jakmile se vyvinul průjem.

Na rozdíl od Lyerlyho studie prokazují výsledky podle vynálezu, že ptačí protilátky proti rekombinačnímu toxinu A jsou účinným profylaktickým prostředkem, jehož ochranné účinky trvají dlouho po skončení léčby.

Příklad 53

Terapeutické ošetření onemocnění C. difficile u křečků protilátkami proti intervalu 6 rekombinantu toxinu A

V dalším experimentu byli křečci terapeuticky ošetřováni (po infekci) anti-A-6 IgY. Tento přístup je obtížnější a Lyerlym nebyl zaznamenán.

Byl použit stejný kmen C. difficile, kultivační médium, expoziční dávka a postup infekce jako v příkladu 52. Dvě skupiny po devíti samicích křečků (Sasco) byly exponovány přibližně 10⁸ organismů kmene C. difficile VPI 7698. 4 h po expozici byla zahájena léčba 2 ml buď PI, nebo anti-A-6 IgY ve stejné koncentraci jako v příkladu 52. Křečci byli ošetřeni ještě po asi 4 h a pak ještě dvakrát denně po 2 dny v 8h intervalech. Celkem byli křečci ošetřeni šestkrát během 3 dnů.

Výsledky jsou znázorněny na obr. 58. Doba ošetření je znázorněna vodorovnou úsečku pod osou souřadnic a podání klindamycinu a expozice C. difficile jsou označeny šipkami.

-185CZ 296806 B6

Křečci, kteří byli terapeuticky ošetřeni anti-A-6 IgY (prázdné čtverečky) měli nižší souhrnnou mortalitu než kontrolní skupina (plné čtverečky). Kromě toho byl nástup průjmu u skupiny ošetřované anti-A-6 IgY v porovnání se skupinou ošetřovanou PI odložen o alespoň 24 h. Všichni 5 křečci, ošetřovaní PI, si vyvinuli průjem a během 2 dní uhynuli, což prokazuje chybějící ochranu před onemocněním při použití kontrolní imunitní frakce. 55 % (5/9) křečků, ošetřovaných anti-a6, dlouhodobě přežilo (doba pozorování byla 20 dní). Ochrana poskytovaná anti-A-6 IgY (přežití) byla statisticky významná v porovnání se skupinou ošetřovanou PI (hodnota P při analýze chi square < 0,05).

Tyto výsledky prokazují, že křečkům, infikovaným C. difficile za podmínek stejných jako podle Leyrlyho, poskytl ptačí anti-A-6 IgY účinnou terapeutickou ochranu a dlouhodobé přežití.

-186CZ 296806 B6

SEZNAM SEKVENCÍ (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

GGAAATTTAG CTGCAGCATC TGAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC; jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ID NO;2;

TCTAGCAAAT TCGCTTGTGT TGAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (Xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

CTCGCATATA GCATTAGACC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:4:

CTATCTAGGC CTAAAGTAT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO;S:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8133 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC; jednoduchý

-187CZ 296806 B6 (D) TOPOLOGIE; lineární

(ii) TYP MOLEKULY;

DNA (genomová)

(ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLIČ:

CDS

(B) POLOHA: :

1..8130

(xi) POPIS

SEKVENCE: SEQ ID NO: 5 :

ATG

TCT

TTA

ATA

TCT

AAA

GAA

GAG

TTA

ATA

AAA

CTC

GCA

TAT

AGC

ATT

48

Met

Ser

Leu

Ile

Ser

Lys

Glu

Glu

Leu

Ile

Lys

Leu

Ala

Tyr

Ser

Ile

1

5

10

15

AGA

CCA

AGA

GAA

AAT

GAG

TAT

AAA

ACT

ATA

CTA

ACT

AAT

TTA

GAC

GAA

96

Arg

Pro

Arg

Glu

Asn

Glu

Tyr

Lys

Thr

Ile

Leu

Thr

Asn

Leu

Asp

Glu

20

25

30

TAT

AAT

AAG

TTA

ACT

ACA

AAC

AAT

AAT

GAA

AAT

AAA

TAT

TTG

CAA

TTA

144

Tyr

Asn

Lys

Leu

Thr

Thr

Asn

Asn

Asn

Glu

Asn

Lys

Tyr

Leu

Gin

Leu

35

40

45

AAA

AAA

CTA

AAT

GAA

TCA

ATT

GAT

GTT

TTT

ATG

AAT

AAA

TAT

AAA

ACT

192

Lys

Lys

Leu

Asn

Glu

Ser

Ile

Asp

Val

Phe

Met

Asn

Lys

Tyr

Lys

Thr

50

S5

60

TCA

AGC

AGA

AAT

AGA

GCA

CTC

TCT

AAT

CTA

AAA

AAA

GAT

ATA

TTA

AAA

240

Ser

Ser

Arg

Asn

Arg

Ala

Leu

Ser

Asn

Leu

Lys

Lys

Asp

Ile

Leu

Lys

65

70

75

80

GAA

GTA

ATT

CTT

ATT

AAA

AAT

TCC

AAT

ACA

AGC

CCT

GTA

GAA

AAA

AAT

208

Glu

Val

Ile

Leu

Ile

Lys

Asn

Ser

Asn

Thr

Ser

Pro

Val

Glu

Lys

Asn

B5

90

95

TTA

CAT

TTT

GTA

TGG

ATA

GGT

GGA

GAA

GTC

AGT

GAT

ATT

GCT

CTT

GAA

336

Leu

His

Phe

Val

Trp

Ile

Gly

Gly

Glu

Val

Ser

Asp

Ile

Ala

Leu

Glu

100

10S

110

TAC

ATA

AAA

CAA

TGG

GCT

GAT

ATT

AAT

GCA

GAA

TAT

AAT

ATT

AAA

CTG

384

Tyr

Ile

Lys

Gin

Trp

Ala

Asp

Ile

Asn

Ala

Glu

Tyr

Asn

Ile

Lys

Leu

115

120

125

TGG

TAT

GAT

AGT

GAA

GCA

TTC

TTA

GTA

AAT

ACA

CTA

AAA

AAG

GCT

ATA

432

Trp

Tyr

Asp

ser

Glu

Ala

Phe

Leu

Val

Asn

Thr

Leu

Lys

Lys

Ala

Ile

130

135

140

GTT

GAA

TCT

TCT

ACC

ACT

GAA

GCA

TTA

CAG

CTA

CTA

GAG

GAA

GAG

ATT

480

Val

Glu

Ser

Ser

Thr

Thr

Glu

Ala

Leu

Gin

Leu

Leu

Glu

Glu

Glu

Ile

145

150

155

160

CAA

AAT

CCT

CAA

TTT

GAT

AAT

ATG

AAA

TTT

TAC

AAA

AAA

AGG

ATG

GAA

528

Gin

Asn

Pro

□ ln

Phe

Asp

Asn

Met

Lys

Phe

Tyr

Lys

Lys

Arg

Met

Glu

165

170

175

TTT

ATA

TAT

GAT

AGA

CAA

AAA

AGG

TTT

ATA

AAT

TAT

TAT

AAA

TCT

CAA

576

Phe

Ile

Tyr

Asp

Arg

Gin

Lys

Arg

Phe

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Ser

Gin

180

185

190

ATC

AAT

AAA

CCT

ACA

GTA

CCT

ACA

ATA

GAT

GAT

ATT

ATA

AAG

TCT

CAT

£24

-188CZ 296806 B6

Ile Asn

Lys 195

Pro Thr

Val

Pro Thr 200

Ile

Asp

Asp

Xle

Ile 205

Lys

Ser

His

CTA

GTA

TCT

GAA

TAT

AAT

AGA

GAT

GAA

ACT

GTA

TTA

GAA

TCA

TAT

AGA

672

Leu

Val

Ser

Glu

Tyr

Asn

Arg

Asp

Glu

Thr

Val

Leu

Glu

Ser

Tyr

Arg

210

215

220

ACA

AAT

TCT

TTG

AGA

AAA

ATA

AAT

AGT

AAT

CAT

GGG

ATA

GAT

ATC

AGG

720

Thr

Asn

Ser

Leu

Arg

Lys

Ile

Asn

Ser

Asn

His

Gly

Ile

Asp

Ile

Arg

225

230

235

240

GCT

AAT

AGT

TTG

TTT

ACA

GAA

CAA

GAG

TTA

TTA

AAT

ATT

TAT

AGT

CAG

768

Ala

Asn

Ser

Leu

Phe

Thr

Glu

Gin

Glu

Leu

Leu

Asn

Ile

Tyr

Ser

Gin

245

250

255

GAG

TTG

TTA

AAT

CGT

GGA

AAT

TTA

GCT

GCA

GCA

TCT

GAC

ATA

GTA

AGA

816

Glu

Leu

Leu

Asn

Arg

Gly

Asn

Leu

Ala

Ala

Ala

Ser

Asp

Ile

Val

Arg

260

265

270

TTA

TTA

GCC

CTA

AAA

AAT

TTT

GGC

GGA

GTA

TAŤ

TTA

GAT

GTT

GAT

ATG

864

Leu

Leu

Ala

Leu

Lys

Asn

Phe

Gly

Gly

Val

Tyr

Leu

Asp

Val

Asp

Met

275

280

285

CTT

CCA

GGT

ATT

CAC

TCT

GAT

TTA

TTT

AAA

ACA

ATA

TCT

AGA

CCT

AGC

912

Leu

Pro

Gly

Ile

His

Ser

Asp

Leu

Phe

Lys

Thr

Ile

Ser

Arg

Pro

Ser

290

295

300

TCT

ATT

GGA

CTA

GAC

CGT

TGG

GAA

ATG

ATA

AAA

TTA

GAG

GCT

ATT

ATG

950

Ser

Ile

Gly

Leu

Asp

Arg

Trp

Glu

Met

Ile

Lys

Leu

Glu

Ala

Ile

Met

305

310

315

320

AAG

TAT

AAA

AAA

TAT

ATA

AAT

AAT

TAT

ACA

TCA

GAA

AAC

TTT

GAT

AAA

1008

Lys Tyr

Lys

Lys

Tvr 325

Ile

Asn Asn

Tyr

Thr 330

Ser Glu

Asn Phe

Asp 335

Lys

CTT GAT 1056

CAA

CAA

TTA

AAA

GAT

AAT

TTT

AAA

CTC

ATT

ATA

GAA

AGT

AAA

Leu Asp

Gin

Gin 340

Leu

Lys

Asp

Asn

Phe 345

Lys

Leu

Ile

Xle

Glu 350

Ser

Lys

AGT GAA 1104

AAA

TCT

GAG

ATA

TTT

TCT

AAA

TTA

GAA

AAT

TTA

AAT

GTA

TCT

Ser Glu

Lys 355

Ser

Glu

Ile

Phe

Ser 360

Lys

Leu

Glu

Asn

Leu 365

Asn

val

Ser

GAT CTT 1152

GAA

ATT

AAA

ATA

GCT

TTC

GCT

TTA

GGC

AGT

GTT

ATA

AAT

CAA

Asp Leu 370

Glu

Ile

Lys

Xle

Ala 375

Phe

Ala

Leu

Gly

Sér 380

Val

Ile

Asn

Gin

GCC TTG 1200

ATA

TCA

AAA

CAA

GGT

TCA

TAT

CTT

ACT

AAC

CTA

GTA

ATA

GAA

Ala Leu 385

Ile

Ser

Lys

Gin 390

Gly

Ser

Tyr

Leu

Thr 395

Asn

Leu

Val

Ile

Glu 400

CAA GTA

AAA

AAT

AGA

TAT

CAA

TTT

TTA

AAC

CAA

CAC

CTT

AAC

CCA

GCC

1248 Gin Val

Lys

Asn

Arg 405

Tyr

Gin

Phe

Leu

Asn 410

Gin

His

Leu

Asn

Pro 415

Ala

ATA GAG

TCT

GAT

AAT

AAC

TTC

ACA

GAT

ACT

ACT

AAA

ATT

TTT

CAT

GAT

1295

-189

Ile Glu

Ser

Asp 420

Asn Asn

Phe

Thr

Asp 425

Thr

Thr

Lys

Ile

Phe 430

His

Asp

TCA TTA 1344

TTT

AAT

TCA

GCT

ACC

GCA

GAA

AAC

TCT

ATG

TTT

TTA

ACA

AAA

Ser Leu

Phe 435

Asn

Ser

Ala

Thr

Ala 440

Glu

Asn

Ser

Met

Phe 445

Leu

Thr

Lys

ATA GCA 1392

CCA

TAC

TTA

CAA

GTA

GGT

TTT

ATG

CCA

GAA

GCT

CGC

TCC

ACA

Ile Ala 450

Pro

Tyr

Leu

Gin

Val 455

Gly

Phe

Met

Pro

Glu 460

Ala

Arg

Ser

Thr

ATA AGT 1440

TTA

AGT

GGT

CCA

GGA

GCT

TAT

GCG

TCA

GCT

TAC

TAT

GAT

TTC

ile Ser 465

Leu

Ser

Gly

Pro 470

Gly

Ala

Tyr

Ala

Ser 475

Ala

Tyr

Tyr

Asp

Phe 480

ATA AAT 1488

TTA

CAA

GAA

AAT

ACT

ATA

GAA

AAA

ACT

TTA

AAA

GCA

TCA

GAT

Ile Asn

Leu

Gin

Glu 485

Asn

Thr

Ile

Glu

Lys 490

Thr

Leu

Lys

Ala

Ser 495

Asp

TTA ATA 1536

GAA

TTT

AAA

TTC

CCA

GAA

AAT

AAT

CTA

TCT

CAA

TTG

ACA

GAA

Leu Ile

Glu

Phe 500

Lys

Phe

Pro

Glu

Asn 505

Asn

Leu

Ser

Gin

Leu 510

Thr

Glu

CAA GAA 1584

ATA

AAT

AGT

CTA

TGG

AGC

TTT

GAT

CAA

GCA

AGT

GCA

AAA

TAT

Gin Glu

Ile SIS

Asn

Ser

Leu

Trp

Ser 520

Phe

Asp

Gin

Ala

Ser 525

Ala

Lys

Tyr

CAA TTT 1632

GAG

AAA

TAT

GTA

AGA

GAT

TAT

ACT

GGT

GGA

TCT

CTT

TCT

GAA

Gin Phe 530

Glu

Lys

Tyr

Val

Arg 535

Asp

Tyr

Thr

Gly

Gly 540

Ser

Leu

Ser

Glu

GAC AAT 1680

GGG

GTA

GAC

TTT

AAT

AAA

AAT

ACT

GCC

CTC

GAC

AAA

AAC

TAT

Asp Asn 545

Gly

Val

Asp

Phe 550

Asn

Lys

Asn

Thr

Ala 555

Leu

Asp

Lys

Asn

Tyr 560

TTA TTA 1728

AAT

AAT

AAA

ATT

CCA

TCA

AAC

AAT

GTA

GAA

GAA

GCT

GGA

AGT

Leu Leu

Asn

Asn

Lys 565

Ile

Pro

Ser

Asn

Asn 570

Val

Glu

Glu

Ala

Gly 575

Ser

AAA AAT 1776

TAT

GTT

CAT

TAT

ATC

ATA

CAG

TTA

CAA

GGA

GAT

GAT

ATA

AGT

Lys Asn

Tyr

Val 580

His

Tyr

Ile

Ile

Gin 585

Leu

Gin

Gly

Asp

Asp 590

Ile

Ser

TAT GAA 1824

GCA

ACA

TGC

AAT

TTA

TTT

TCT

AAA

AAT

CCT

AAA

AAT

AGT

ATT

Tyr Glu

Ala 595

Thr

Cys

Asn

Leu

Phe 600

Ser

Lys

Asn

Pro

LVS 605

Asn

Ser

Ile

ATT ATA 1872

CAA

CGA

AAT

ATG

AAT

GAA

AGT

GCA

AAA

AGC

TAC

TTT

TTA

AGT

Ile Ile 610

Gin

Arg

Asn

Met

Asn 615

Glu

Ser

Ala

Lys

ser 620

Tyr

Phe

Leu

Ser

GAT GAT 1920

GGA

GAA

TCT

ATT

TTA

GAA

TTA

AAT

AAA

TAT

AGG

ATA

CCT

GAA

Asp Asp 62 S

Gly

Glu

Ser

Ile 630

Leu

Glu

Leu

Asn

Lys 635

Tyr

Arg

Ile

Pro

Glu 64 0

AGA TTA

AAA

AAT

AAG

GAA

AAA

GTA

AAA

GTA

ACC

TTT

ATT

GGA

CAT

GGT

1968

-190CZ 296806 B6

Arg Leu

AAA GAT 2016

Lys Asp

CTT TCC 2064

Leu Ser

TCA,CCT 2112 Ser Pro

690

TAT GAT

2160

Tyr Asp

705

ATT ATG

2208 Ile Met

ATT ACT 2256 Ile Thr

AGA AAA 2304

Arg Lys

GCT ATT

2352

Ala Ile

770

ATA GAT

2400

Ile Asp

785

TCA ATA

2448

Ser Ile

CCT GAT 24 96

Pro Asp

TCT ATT 2544

Ser Ile

ATA ATT 2592 Ile Ile

850

GAA AAT

2640

Lys Asn

GAA TTC

Glu Phe

660

AAT GAG

Asn Glu 675

AAA AAT

Lys Asn

TTT AAT

Phe Asn

GAC AAA

Asp Lys

ATA GGA

Ile Gly

740

GAA CTT

Glu Leu

755

ATG AGC

Met Ser

AAT AAG

Asn Lys

TCA GAA

Ser Glu

ACA AAA

Thr Lys

820

GGG GAT

Gly Asp

835

CAC AAT

His Asn

GTA TCT

Lys Glu

645

AAC ACA Asn Thr

ATA AGT Ile Ser

GTA GAA

Val Glu

GTT GAA

Val Glu

710

ATT ACT

Ile Thr

725

GCA AAT

Ala Asn

CTG GCT

Leu Ala

GAT TTA

Asp Leu

CTA AAA

Leu Lys

790

GAT ATA

Asp Ile

805

TTT ATT Phe Ile

TAC ATT

Tyr Ile

TCT ATA

Ser Ile

GAT GAA

Lys Val

AGC GAA

Ser Glu

TCA TTT

Ser Phe

0

GTA AAC

Val Asn

695

GAA ACT

Glu Thr

TCC ACT

Ser Thr

CAA TAJ

Gin Tyr

CAC TCA

His Ser

760

TCT AGT

Ser Ser

775

GCA AAG

Ala Lys

AAA ACA

Lys Thr

TTA AAT

Leu Asn

TAT TAT

Tyr Tyr

840

GAT GAT

Asp Asp

855

TTA TAT

Lys Val

650

TTT GCT

Phe Ala

665

TTA GAT

Leu Asp

TTA CTT
Leu	Leu
TAT	CCT
Tyr	Pro
TTA	CCT
Leu	Pro 730

GAA GTA

Glu Val 745

GGT AAA

Gly Lys

AAA GAA

Lys Glu

TCC AAG

Ser Lys

TTA TTA

Leu Leu

810

AAT CTT

Asn Leu

825

GAA AAA

Glu Lys

TTA ATA

Leu Ile

GAA TTA

Thr Phe

AGA TTA

Arg Leu

ACC ATA

Thr Ile

GGA TGT

Gly Cys

700

GGG AAG

Gly Lys

715

GAT GTA

Asp Val

AGA ATT

Arg Ile

TGG ATA

Trp Ile

TAC ATT

Tyr Ile

780

AAT ATT

Asn Ile

795

CTT GAT Leu Asp

AAG CTT Lys Leu

TTA GAG Leu Glu

GAT GAG

Asp Glu

860

AAA AAA

Ile Gly

AGT GTA

Ser Val

670

AAA TTA

Lys Leu

685

AAT ATG

Asn Met

TTG CTA

Leu Leu

AAT AAA

Asn Lys

AAT AGT

Asn Ser

750

AAT AAA

Asn Lys

765

Phe Phe

CCA GGA

Pro Gly

GCA AGT

Ala Ser

AAT ATT

Asn Ile

830

CCT GTT

Pro val

845

TTC AAT Phe Asn

TTA AAT

His Gly

655

GAT TCA

Asp Ser

GAT ATA

Asp Ile

TTT AGT

Phe Ser

TTA AGT

Leu Šer

720

AAT TCT

Asn Ser

735

GAG GGA

Glu Gly

GAA GAA

Glu Glu

GAT TCT

Asp Ser

TTA GCA

Leu Ala

800

GTT AGT

Val Šer

815

GAA TCT

Glu Ser

AAA AAT

Lys Asn

CTA CTT

Leu Leu

AAT CTA

- 191 CZ 296806 B6

Glu Asn Val 865

Ser Asp Glu 870

Leu

Tyr

Glu Leu

Lys 875

Lys

Leu

Asn

Asn

Leu 880

GAT GAG 2688

AAG

TAT

TTA

ATA

TCT

TTT

GAA

GAT

ATC

TCA

AAA

AAT

AAT

TCA

Asp Glu

Lys

Tyr

Leu 885

Ile

Ser

Phe

Glu

Asp 890

Ile

Ser

Lys

Asn

Asn 895

Ser

ACT TAC 2736

TCT

GTA

AGA

TTT

ATT

AAC

AAA

AGT

AAT

GGT

GAG

TCA

GTT

TAT

Thr Tyr

ser

Val 900

Arg

Phe

Ile

Asn

Lys 905

Ser

Asn

Gly

Glu

Ser 910

Val

Tyr

GTA GAA 2784

ACA

GAA

AAA

GAA

ATT

TTT

TCA

AAA

TAT

AGC

GAA

CAT

ATT

ACA

Val Glu

Thr 915

Glu

Lys

Glu

Ile

Phe 920

Ser

Lys

Tyr

Ser

Glu 925

His

Ile

Thr

AAA GAA 2832

ATA

AGT

ACT

ATA

AAG

AAT

AGT

ATA

ATT

ACA

GAT

GTT

AAT

GGT

Lys Glu 930

Ile

Ser

Thr

Ile

Lys 935

Asn

Ser

Ile

Ile

Thr 940

Asp

Val

Asn

Gly

AAT TTA 2880

TTG

GAT

AAT

AŤA

CAG

TTA

GAT

CAT

ACT

TCT

CAA

GTT

AAT

ACA

Asn Leu 945

Leu

Asp

Asn

Ile 950

Gin

Leu

Asp

His

Thr 955

Ser

Gin

Val

Asn

Thr 960

TTA AAC 2928

GCA

GCA

TTC

TTT

ATT

CM

TCA

TTA

ATA

GAT

TAT

AGT

AGC

AAT

Leu Asn

Ala

Ala

Phe 965

Phe

Ile

Gin

Ser

Leu 970

Ile

Asp

Tyr

Ser

Ser 975

Asn

AAA GAT 2976

GTA

CTG

AAT

GAT

TTA

AGT

ACC

TCA

GTT

AAG

GTT

CAA

CTT

TAT

Lys Asp

Val

Leu 980

Asn

Asp

Leu

Ser

Thr 985

Ser

Val

Lys

Val

Gin 990

Leu

Tyr

GCT CAA 3024

CTA

TTT

AGT

ACA

GGT

TTA

AAT

ACT

ATA

TAT

GAC

TCT

ATC

CAA

Ala Gin

Leu 995

Phe

Ser

Thr

Gly

Leu Asn 1000

Thr

Ile

Tyr

Asp Ser 1005

Ile

Gin

TTA GTA 3072

AAT

TTA

ATA

TCA

AAT

GCA

GTA

AAT

GAT

ACT

ATA

AAT

gta

CTA

Leu Val Asn 1010

Leu

Ile

Ser

Asn Ala 1015

Val

Asn

Asp

Thr Ile 1020

Asn

Val

Leu

CCT ACA 3120

ATA

ACA

GAG

GGG

ATA

CCT

ATT

GTA

TCT

ACT

ATA

TTA

GAC

GGA

Pro Thr 1025

Ile

Thr

Glu

Gly Ile 1030

Pro

Ile

Val

Ser Thr 1035

Ile

Leu

Asp

Gly 1040

ATA AAC 3168

TTA

GGT

GCA

GCA

ATT

AAG

GAA

TTA

CTA

GAC

GAA

CAT

GAC

CCA

Ile Asn

Leu

Gly

Ala Ala 1045

Ile

Lys

Glu

Leu Leu 1050

Asp

Glu

His

Asp Pro 1055

TTA CTA 3216

AAA

AAA

GAA

TTA

GAA

GCT

AAG

GTG

GGT

GTT

TTA

GCA

ATA

AAT

Leu Leu

Lys

Lys Glu 1060

Leu

Glu

Ala

Lys Val 1065

Gly

Val

Leu

Ala Ile 1070

Asn

ATG TCA 3264

TTA

TCT

ATA

GCT

GCA

ACT

GTA

GCT

TCA

ATT

GTT

GGA

ATA

GGT

Met Ser

Leu Ser 1075

Ile

Ala

Ala

Thr Val 1080

Ala

Ser

Ile

Val Gly 108 5

Ile

Gly

GCT GAA

GTT

ACT

ATT

TTC

TTA

TTA

CCT

ATA

GCT

GGT

ATA

TCT

GCA

GGA

3312

-192CZ 296806 B6

Ala Glu Val 1090

Thr

Ile

Phe

Leu Leu Pro 1095

Ile Ala

Gly Ile 1100

Ser Ala Gly

ATA CCT 3360

TCA

TTA

GTT

AAT

AAT

GAA

TTA

ATA

TTG

CAT

GAT

AAG

GCA

ACT

Ile Pro 1105

Ser

Leu

Val

Asn Asn 1110

Glu

Leu

Ile

Leu His 1115

Asp

Lys

Ala

Thr 1120

TCA GTG 3408

GTA

AAC

TAT

TTT

AAT

CAT

TTG

TCT

GAA

TCT

AAA

AAA

TAT

GGC

Ser Val

Val

Asn

Tyr Phe 1125

Asn

His

Leu

Ser Glu 1130

Ser

Lys

Lys

Tyr Gly 1135

CCT CTT 3456

AAA

ACA

GAA

GAT

GAT

AAA

ATT

TTA

GTT

CCT

ATT

GAT

GAT

TTA

Pro Leu

Lys

Thr Glu 1140

Asp

Asp

Lys

Ile Leu 1145

Val

Pro

Ile

Asp Asp 1150

Leu

GTA ATA 3504

TCA

GAA

ATA

GAT

TTT

AAT

AAT

AAT

TCG

ATA

AAA

CTA

GGA

ACA

Val Ile

Ser Glu 1155

Ile

Asp

Phe

Asn Asn 1160

Asn

Ser

Ile

Lys Leu 1165

Gly

Thr

TGT AAT 3552

ATA

TTA

GCA

ATG

GAG

GGG

GGA

TCA

GGA

CAC

ACA

GTG

ACT

GGT

Cys Asn Ile 1170

Leu

Ala

Met

Glu 1175

Gly

Gly

Ser

Gly

His Thr 1180

Val

Thr

Gly

AAT ATA 3600

GAT

CAC

TTT

TTC

TCA

TCT

CCA

TCT

ATA

AGT/ TCT

CAT

ATT

CCT

Asn Ile 1185

Asp

His

Phe

Phe Ser 1190

Ser

Pro

Ser

Ile Ser 1195

Ser

His

Ile

Pro 1200

TCA TTA 3648

TCA

ATT

TAT

TCT

GCA

ATA

GGT

ATA

GAA

ACA

GAA

AAT

CTA

GAT

Ser Leu

Ser

ile

Tyr Ser 1205

Ala

Ile

Gly

Ile Glu 1210

Thr

Glu

Asn

Leu Asp 1215

TTT TCA 3696

AAA

AAA

ATA

ATG

ATG

TTA

CCT

AAT

GCT

CCT

TCA

AGA

GTG

TTT

Phe Ser

Lys

Lys Ile 1220

Met

Met

Leu

Pro Asn 1225

Ala

Pro

Ser

Arg Val 1230

Phe

TGG TGG 3744

GAA

ACT

GGA

GCA

GTT

CCA

GGT

TTA

AGA

TCA

TTG

GAA

AAT

GAC

Trp Trp

Glu Thr 1235

Gly

Ala

Val

Pro Gly 1240

Leu

Arg

Ser

Leu Glu 1245

Asn

Asp

GGA ACT 3792

AGA.

TTA

CTT

GAT

TCA

ATA

AGA

GAT

TTA

TAC

CCA

GGT

AAA

TTT

Gly Thr Arg 1250

Leu

Leu

Asp

Ser Ile 1255

Arg

Asp

Leu

Tyr Pro 1260

Gly

Lys

Phe

TAC TGG 3840

AGA

TTC

TAT

GCT

TTT

TTC

GAT

TAT

GCA

ATA

ACT

ACA

TTA

AAA

Tyr Trp 1265

Arg

Phe

Tyr

Ala Phe 1270

Phe

Asp

Tyr

Ala Ile 1275

Thr

Thr

Leu

Lys 1280

CCA GTT 3888

TAT

GAA

GAC

ACT

AAT

ATT

AAA

ATT

AAA

CTA

GAT

AAA

GAT

ACT

Pro Val

Tyr

Glu

Asp Thr 1285

Asn

Ile

Lys

Ile Lys 1290

Leu

Asp

Lys

Asp Thr 1295

AGA AAC 3936

TTC

ATA

ATG

CCA

ACT

ATA

ACT

ACT

AAC

GAA

ATT

AGA

AAC

AAA

Arg Asn

Phe

Ile Met 1300

Pro

Thr

Ile

Thr Thr 1305

Asn

Glu

Ile

Arg Asn 1310

Lys

TTA TCT

TAT

TCA

TTT

GAT

GGA

GCA

GGA

GGA

ACT

TAC

TCT

TTA

TTA

TTA

3984

-193CZ 296806 B6

Leu ser

Tyr Ser 1315

Phe

Asp

Gly Ala Gly 1320

Gly Thr Tyr Ser Leu Leu Leu 1325

TCT TCA 4032

TAT

CCA

ATA

TCA

ACG

AAT

ATA

AAT

TTA

TCT

AAA

GAT

GAT

TTA

Ser Ser Tyr 1330

Pro

Ile

Ser

Thr 1335

Asn

Ile

Asn

Leu

Ser Lys 1340

Asp Asp

Leu

TGG ATA 4080

TTT

AAT

ATT

GAT

AAT

GAA

GTA

AGA

GAA

ATA

TCT

ATA

GAA

AAT

Trp Ile 134S

Phe

Asn

Ile

Asp 135C

Asn 1

Glu

Val

Arg

Glu Ile 1355

Ser

Ile

Glu

Asn 1360

GGT ACT 4128

ATT

AAA

AAA

GGA

AAG

TTA

ATA

AAA

GAT

GTT

TTA

AGT

AAA

ATT

Gly Thr

Ile

Lys

Lys 136E

Gly

Lys

Leu

Ile

Lys Asp 1370

Val

Leu

Ser

Lys Ile 1375

GAT ATA 4176

AAT

AAA

AAT

AAA

CTT

ATT

ATA

GGC

AAT

CAA

ACA

ATA

GAT

TTT

Asp Ile

Asn

Lys Asn 1380

Lys

Leu

Ile

Ile Gly 1385

Asn

Gin

Thr

Ile Asp 1390

Phe

TCA GGC 4224

GAT

ATA

GAT

AAT

AAA

GAT

AGA

TAT

ATA

TTC

TTG

ACT

TGT

GAG

Ser Gly

Asp Ile 1395

Asp

Asn

Lys

Asp Arg 1400

Tyr

Ile

Phe

Leu Thr 1405

Cys

Glu

TTA GAT 4272

GAT

AAA

ATT

AGT

TTA

ATA

ATA

GAA

ATA

AAT

CTT

GTT

GCA

AAA

Leu Asp Asp 1410

bys

Ile

Ser

Leu Ile 141S

Ile

Glu

Ile

Asn Leu 1420

Val

Ala

Lys

TCT TAT 4320

AGT

TTG

TTA

TTG

TCT

GGG

GAT

AAA

AAT

TAT

TTG

ATA

TCC

AAT

Ser Tyr 1425

Ser

Leu

Leu

Leu Ser 1430

Gly

Asp

Lys

Asn Tyr 1435

Leu

Ile

ser

Asn 1440

TTA TCT 4368

AAT

ACT

ATT

GAG

AAA

ATC

AAT

ACT

TTA

GGC

CTA

GAT

AGT

AAA

Leu Ser

Asn

Thr

Ile Glu 1445

Lys

Ile

Asn

Thr Leu 14 50

Gly

Leu

Asp

Ser Lys 1455

AAT ATA 4416

GCG

TAC

AAT

TAC

ACT

GAT

GAA

TCT

AAT

AAT

AAA

TAT

TTT

GGA

Asn Ile

Ala

Tyr Asn 1460

Tyr

Thr

Asp

Glu Ser 1465

Asn

Asn

Lys

Tyr Phe 1470

Gly

GCT ATA 4 464

TCT

AAA

ACA

AGT

CAA

AAA

AGC

ATA

ATA

CAT

TAT

AAA

AAA

GAC

Ala Ile

Ser Lys 1475

Thr

Ser

Gin

Lys Ser 14B0

Ile

Ile

His

Tyr Lys 1485

Lys

Asp

AGT AAA 4512

AAT

ATA

TTA

GAA

TTT

TAT

AAT

GAC

AGT

ACA

TTA

GAA

TTT

AAC

Ser Lys Asn 1490

Ile

Leu

Glu

Phe Tyr 1495

Asn

Asp

Ser

Thr Leu 1500

Glu

Phe

Asn

AGT AAA 4560

GAT

TTT

ATT

GCT

GAA

GAT

ATA

AAT

GTA

TTT

ATG

AAA

GAT

GAT

Ser Lys 1505

Asp

Phe

Ile

Ala Glu 1510

Asp

Ile

Asn

Val Phe 1515

Met

Lys

Asp

Asp 1520

ATT AAT 4608

ACT

ATA

ACA

GGA

AAA

TAC

TAT

GTT

GAT

AAT

AAT

ACT

GAT

AAA

Ile Asn

Thr.

Ile

Thr Gly 1525

Lys

Tyr

Tyr

Val Asp 1530

Asn

Asn

Thr

Asp Lys 1535

AGT ATA

GAT

TTC

TCT

ATT

TCT

TTA

GTT

AGT

AAA

AAT

CAA

GTA

AAA

GTA

4656

-194CZ 296806 B6

Ser Ile

Asp

Phe Ser Ile Ser Leu Val Ser Lys Asn

Gin Val Lvs 1550

Val

1540

1545

AAT GGA 4704

TTA

TAT

TTA

AAT

GAA

TCC

GTA

TAC

TCA

TCT

TAC

CTT

GAT

TTT

Asn Gly

Leu

Tyr

Leu

Asn

Glu

Ser

Val

Tyr

Ser

Ser

Tyr

Leu

Asp

Phe

1555

1560

1565

GTG AAA 4752

AAT

TCA

GAT

GGA

CAC

CAT

AAT

ACT

TCT

AAT

TTT

ATG

AAT

TTA

Val Lys

Asn

Ser

Asp

Gly

His

His

Asn

Thr

Ser

Asn

Phe

Met

Asn

Leu

1570

1575

1580

TTT TTG 4600

GAC

AAT

ATA

AGT

TTC

TGG

AAA

TTG

TTT

GGG

TTT

GAA

AAT

ATA

Phe Leu

Asp

Asn

Ile

ser

Phe

Trp

Lys

Leu

Phe

Gly

Phe

Glu

Asn

Ile

1565

1590

1595

1600

AAT TTT

GTA

ATC

GAT

AAA

TAC

TTT

ACC

CTT

GTT

GGT

AAA

ACT

AAT

CTT

4848 Asn Phe

Val

Ile

Asp

Lys

Tyr

Phe

Thr

Leu

Val

Gly

Lys

Thr

Asn

Leu

1605

1610

1615

GGA TAT

GTA

GAA

TTT

ATT

TGT

GAC

AAT

AAT

AAA

AAT

ATA

GAT

ATA

TAT

4896 Gly Tyr

Val

Glu

Phe

Ile

Cys

Asp

Asn

Asn

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Tyr

1620

1625

1630

TTT GGT 4944

GAA

TGG

AAA

ACA

TCG

TCA

TCT

AAA

AGC

ACT

ATA

TTT

AGC

GGA

Phe Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Ser

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ile

Phe

Ser

Gly

1635

164 0

1645

AAT GGT 4 992

AGA

AAT

GTT

GTA

GTA

GAG

CCT

ATA

TAT

AAT

CCT

GAT

ACG

GGT

Asn Gly

Arg

Asn

Val

Val

Val

Glu

Pro

Ile

Tyr

Asn

Pro

Asp

Thr

Gly

1650

1655

1660

GAA GAT

ATA

TCT

ACT

TCA

CTA

GAT

TTT

TCC

TAT

GAA

CCT

CTC

TAT

GGA

5040 Glu Asp

Ile

Ser

Thr

Ser

Leu

Asp

Phe

Ser

Tyr

Glu

Pro

Leu

Tyr

Gly

1665

1670

1675

1680

ATA GAT

AGA

TAT

ATA

AAT

AAA

GTA

TTG

ATA

GCA

CCT

GAT

TTA

TAT

ACA

5088 Ile Asp

Arg

Tyr

Ile

Asn

Lys

val

Leu

Ile

Ala

Pro

Asp

Leu

Tyr

Thr

1685

1690

1695

AGT TTA

ATA

AAT

ATT

AAT

ACC

AAT

TAT

TAT

TCA

AAT

GAG

TAC

TAC

CCT

5136 Ser Leu

Ile

Asn

Ile

Asn

Thr

Asn

Tyr

Tyr

Ser

Asn

Glu

Tyr

Tyr

Pro

1700

1705

1710

GAG ATT

ATA

GTT

CTT

AAC

CCA

AAT

ACA

TTC

CAC

AAA

AAA

GTA

AAT

ATA

5164 Glu Ile

Ile

Val

Leu

Asn

Pro

Asn

Thr

Phe

His

Lys

Lys

Val

Asn

Ile

1715

1720

1725

AAT TTA 5232

GAT

AGT

TCT

TCT

TTT

GAG

TAT

AAA

TGG

TCT

ACA

GAA

GGA

AGT

Asn Leu

Asp )

Ser

Ser

Ser

Phe

Glu

Tyr

Lys

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

1731

1735

1740

GAC TTT

ATT

TTA

GTT

AGA

TAC

TTA

GAA

GAA

AGT

AAT

AAA

AAA

ATA

TTA

5280 Asp Phe

Ile

Leu

Val

Arg

Tyr

Leu

Glu

Glu

Ser

Asn

Lys

Lys

Ile

Leu

1745

1750

1755

1760

CAA AAA

ATA

AGA

ATC

AAA

GGT

ATC

TTA

TCT

AAT

ACT

CAA

TCA

TTT

AAT

S328

-195CZ 296806 B6

Gin Lys

Ile Arg

Ile Lys Gly Ile 1765

Leu

Ser Asn Thr Gin Ser 1770

Phe Asn 1775

AAA ATG

AGT

ATA

GAT

TTT

AAA

GAT

ATT

AAA

AAA

CTA

TCA

TTA

GGA

TAT

5376 Lys Met

Ser

Ile

Asp

Phe

Lys

Asp

Ile

Lys

Lys

Leu

Ser

Leu

Gly 1

Tyr

1780

1785

179C

ATA ATG

AGT

AAT

TTT

AAA

TCA

TTT

AAT

TCT

GAA

AAT

GAA

TTA

GAT

AGA

5424 Ile Met

Ser

Asn

Phe

Lys

Ser

Phe

Asn

Ser

Glu

Asn

Glu

Leu

Asp

Arg

1795

1800

1805

GAT CAT

TTA

GGA

TTT

AAA

ATA

ATA

GAT

AAT

AAA

ACT

TAT

TAC

TAT

GAT

5472 Asp His

Leu

Gly

Phe

Lys

Ile

Ile

Asp

Asn

Lys

Thr

Tyr

Tyr

Tyr

Asp

1810

IBIS

1820

GAA GAT

AGT

AAA

TTA

GTT

AAA

GGA

TTA

ATC

AAT

ATA

AAT

AAT

TCA

TTA

5520 Glu Asp

Ser

Lys

Leu

Val

Lys

Gly

Leu

Ile

Asn

Ile

Asn

Asn

Ser

Leu

1825

1830

1835

1840

TTC TAT

TTT

GAT

CCT

ATA

GAA

TTT

AAC

TTA

GTA

ACT

GGA

TGG

CAA

ACT

5S68 Phe Tyr

Phe

ASp

Pro

Ile

Glu

Phe

Asn

Leu

Val

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

1845

1B50

1855

ATC AAT

GGT

AAA

AAA

TAT

TAT

TTT

GAT

ATA

AAT

ACT

GGA

GCA

GCT

TTA

5616 Ile Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Ile

Asn

Thr

Gly

Ala

Ala

Leu

1860

1865

1870

ACT AGT

TAT

AAA

ATT

ATT

AAT

GGT

AAA

CAC

TTT

TAT

TTT

AAT

AAT

GAT

5664 Thr Ser

Tyr

Lys

Ile

Ile

Asn

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

Asn

Asn

Asp

1875

1880

1885

GGT GTG

ATG

CAG

TTG

GGA

GTA

TTT

AAA

GGA

CCT

GAT

GGA

TTT

GAA

TAT

5712 Gly Val

Met

Gin

Leu

Gly

val

Phe

Lys

Gly

Pro

ASp

Gly

Phe

Glu

Tyr

1890

1895

1900

TTT GCA

CCT

GCC

AAT

ACT

CAA

AAT

AAT

AAC

ATA

GAA

GGT

CAG

GCT

ATA

5760 Phe Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Gin

Asn

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

1905

1910

1915

1920

GTT TAT 5808

CAA

AGT

AAA

TTC

TTA

ACT

TTG

AAT

GGC

AAA

AAA

TAT

TAT

TTT

Val Tyr

Gin

Ser

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

1925

1930

1935

GAT AAT 5856

AAC

TCA

AAA

GCA

GTC

ACT

GGA

TGG

AGA

ATT

ATT

AAC

AAT

GAG

Asp Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Arg

Ile

Ile

Asn

Asn

Glu

194(

1945

1950

AAA TAT 5904

TAC

TTT

AAT

CCT

AAT

AAT

GCT

ATT

GCT

GCA

GTC

GGA

TTG

CAA

Lys Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Asn

Asn

Ala

Ile

Ala

Ala

Val

Gly

Leu

Gin

1955

1960

1965

GTA ATT

GAC

AAT

AAT

AAG

TAT

TAT

TTC

AAT

CCT

GAC

ACT

GCT

ATC

ATC

5952 val Ile

Asp

Asn

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Asp

Thr

Ala

Ile

Ile

1970

1975

1980

TCA AAA

GGT

TGG

CAG

ACT

GTT

AAT

GGT

AGT

AGA

TAC

TAC

TTT

GAT

ACT

6000

-196CZ 296806 B6

Ser Lys 1985

Gly

Trp Gin Thr Val Asn Gly Ser Arg Tyr

Tyr Phe Asp

Thr 2000

1990

1995

GAT ACC 6048

GCT

ATT

GCC

TTT

AAT

GGT

TAT

AAA

ACT

ATT

GAT

GGT

AAA

CAC

Asp Thr

Ala

Ile

Ala

Phe

Asn

Gly

Tyr

Lys

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

His

2005

2010

2015

TTT TAT

TTT

GAT

AGT

GAT

TGT

GTA

GTG

AAA

ATA

GGT

GTG

TTT

AGT

ACC

6096 Phe Tyr

Phe

Asp

Ser

Asp

Cys

Val

Val

Lys

Ile

Gly

Val

Phe

Ser

Thr

2020

2025

2030

TCT AAT 6144

GGA

TTT

GAA

TAT

TTT

GCA

CCT

GCT

AAT

ACT

TAT

AAT

AAT

AAC

Ser Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Tyr

Asn

Asn

Asn

2035

2040

2045

ATA GAA

GGT

CAG

GCT

ATA

GTT

TAT

CAA

AGT

AAA

TTC

TTA

ACT

TTG

AAT

6192 Ile Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Val

Tyr

Gin

Ser

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

2050

2055

2060

GGT AAA 6240

AAA

TAT

TAC

TTT

GAT

AAT

AAC

TCA

AAA

GCA

GTT

ACC

GGA

TTG

Gly Lys

Lvs

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Leu

2065

2070

2075

2080

CAA ACT

ATT

GAT

AGT

AAA

AAA

TAT

TAC

TTT

AAT

ACT

AAC

ACT

GCT

GAA

6288 Gin Thr

Xle

Asp

Ser

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala

Glu

2085

2090

2095

GCA GCT

ACT

GGA

TGG

CAA

ACT

ATT

GAT

GGT

AAA

AAA

TAT

TAC

TTT

AAT

6336 Ala Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

2100

2105

2110

ACT AAC

ACT

GCT

GAA

GCA

GCT

ACT

GGA

TGG

CAA

ACT

ATT

GAT

GGT

AAA

6384 Thr Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

2115

2120

2125

AAA TAT 6432

TAC

TTT

AAT

ACT

AAC

ACT

GCT

ATA

GCT

TCA

ACT

GGT

TAT

ACA

Lys Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala

Ile

Ala

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

2130

213S

2140

ATT ATT

AAT

GGT

AAA

CAT

TTT

TAT

TTT

AAT

ACT

GAT

GGT

ATT

ATG

CAG

64 BO Ile Ile

Asn

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

2145

2150

2155

2160

ATA GGA 6528

GTG

TTT

AAA

GGA

CCT

AAT

GGA

TTT

GAA

TAT

TTT

GCA

CCT

GCT

Ile Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

2165

2170

2175

AAT ACG

GAT

GCT

AAC

AAC

ATA

GAA

GGT

CAA

GCT

ATA

CTT

TAC

CAA

AAT

6576 Asn Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Leu

Tyr

Gin

Asn

2180

2185

2190

GAA TTC 6624

TTA

ACT

TTG

AAT

GGT

AAA

AAA

TAT

TAC

TTT

GGT

AGT

GAC

TCA

Glu Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Ser

Asp

Ser

2195

2200

2205

AAA GCA

GTT

ACT

GGA

TGG

AGA

ATT

ATT

AAC

AAT

AAG

AAA

TAT

TAC

TTT

6672

-197CZ 296806 B6

Lys Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Arg

Ile

Ile

Asn

Asn

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

2210

2215

2220

AAT CCT

AAT

AAT

GCT

ATT

GCT

GCA

ATT

CAT

CTA

TGC

ACT

ATA

AAT

AAT

6720

Asn Pro

Asn

Asn

Ala

Ile

Ala

Ala

Ile

His

Leu

Cys

Thr

Ile

Asn

Asn

2225

2230

2235

2240

GAC AAG

TAT

TAC

TTT

AGT

TAT

GAT

GGA

ATT

CTT

CAA

AAT

GGA

TAT

ATT

6768

Asp Lys

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ile

Leu

Gin

Asn

Gly

Tyr

Ile

2245

2250

2255

ACT ATT

GAA

AGA

AAT

AAT

TTC

TAT

TTT

GAT

GCT

AAT

AAT

GAA

TCT

AAA

6816

Thr Ile

Glu

Arg

Asn

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Ala

Asn

Asn

Glu

Ser

Lys

2260

2265

2270

ATG GTA

ACA

GGA

GTA

TTT

AAA

GGA

CCT

AAT

GGA

TTT

GAG

TAT

TTT

GCA

6864

Met Val

Thr

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

2275

2280

2285

CCT GCT

AAT

ACT

CAC

AAT

AAT

AAC

ATA

GAA

GGT

CAG

GCT

ATA

GTT

TAC

6912

Pro Ala

Asn

Thr

His

Asn

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Val

Tyr

2290

2295

2300

CAG AAC

AAA

TTC

TTA

ACT

TTG

AAT

GGC

AAA

AAA

TAT

TAT

TTT

GAT

AAT

6960

Gin Asn

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asn

2305

2310

2315

2320

GAC TCA

AAA

GCA

GTT

ACT

GGA

TGG

CAA

ACC

ATT

GAT

GGT

AAA

AAA

TAT

7008

Asp Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

2325

2330

2335

TAC TTT

AAT

CTT

AAC

ACT

GCT

GAA

GCA

GCT

ACT

GGA

TGG

CAA

ACT

ATT

7056

Tyr Phe

Asn

Leu

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

2340

2345

2360

GAT GGT

AAA

AAA

TAT

TAC

TTT

AAT

CTT

AAC

ACT

GCT

GAA

GCA

GCT

ACT

7104

Asp Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Leu

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

2355

2360

2365

GGA TGG

CAA

ACT

ATT

GAT

GGT

AAA

AAA

TAT

TAC

TTT

AAT

ACT

AAC

ACT

7152

Gly Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

2370

2375

2380

TTC ATA

GCC

TCA

ACT

GGT

TAT

ACA

AGT

ATT

AAT

GGT

AAA

CAT

TTT

TAT

7200

Phe Ile

Ala

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

Ser

Ile

Asn

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

2385

2390

2395

2400

TTT AAT

ACT

GAT

GGT

ATT

ATG

CAG

ATA

GGA

GTG

TTT

AAA

GGA

CCT

AAT

7248

Phe Asn

Thr

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

2405

2410

2415

GGA TTT

GAA

TAC

TTT

GCA

CCT

GCT

AAT

ACG

GAT

GCT

AAC

AAC

ATA

GAA

7296

Gly Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

2420

2425

2430

GGT CAA

GCT

ATA

CTT

TAC

CAA

AAT

AAA

TTC

TTA

ACT

TTG

AAT

GGT

AAA

7344

-198CZ 296806 B6

Gly Gin

Ala Ile 2435

Leu

Tyr

Gin Asn Lys 2440

Phe

Leu

Thr Leu Asn 2445

Gly Lys

AAA TAT 7392

TAC

TTT

GGT

AGT

GAC

TCA

AAA

GCA

GTT

ACC

GGA

CTG

CGA

ACT

Lys Tyr Tyr 2450

Phe

Gly

Ser

Asp Ser 2455

Lys

Ala

Val

Thr Glv 2460

Leu

Arg

Thr

ATT GAT 7440

GGT

AAA

AAA

TAT

TAC

TTT

AAT

ACT

AAC

ACT

GCT

GTT

GCA

GTT

Ile Asp 2465

Gly

Lys

Lys

Tyr Tyr 2470

Phe

Asn

Thr

Asn Thr 2475

Ala

Val

Ala

Val 2480

ACT GGA 74 88

TGG

CAA

ACT

ATT

AAT

GGT

AAA

AAA

TAC

TAC

TTT

AAT

ACT

AAC

Thr Gly

Trp

Gin

Thr Ile 2485

Asn

Gly

Lys

Lys Tyr 2490

Tyr

Phe

Asn

Thr Asn 2495

ACT TCT 7536

ATA

GCT

TCA

ACT

GGT

TAT

ACA

ATT

ATT

AGT

GGT

AAA

CAT

TTT

Thr Ser

Ile

Ala Ser 2500

Thr

Gly

Tyr

Thr Ile 2505

Ile

Ser

Gly

Lys His 2510

Phe

TAT TTT 75B4

AAT

ACT

GAT

GGT

ATT

ATG

CAG

ATA

GGA

GTG

TTT

AAA

GGA

CCT

Tyr Phe

Asn Thr 2515

Asp

Gly

Ile

Met Gin 2520

Ile

Gly

Val

Phe Lys 2525

Gly

Pro

GAT GGA 7632

TTT

GAA

TAC

TTT

GCA

CCT

GCT

AAT

ACA

GAT

GCT

AAC

AAT

ATA

Asp Gly Phe 2S30

Glu

Tyr

Phe

Ala Pro 2535

Ala

Asn

Thr

Asp Ala 254 0

Asn

Asn

Ile

GAA GGT 7680

CAA

GCT

ATA

CGT

TAT

CAA

AAT

AGA

TTC

CTA

TAT

TTA

CAT

GAC

Glu Gly 2545

Gin

Ala

Ile

Arg Tyr 2550

Gin

Asn

Arg

Phe Leu 2555

Tyr

Leu

His

Asp 2560

AAT ATA 7728

TAT

TAT

TTT

GGT

AAT

AAT

TCA

AAA

GCG

GCT

ACT

GGT

TGG

GTA

Asn Ile

Tyr

Tyr

Phe Gly 2565

Asn

Asn

Ser

Lvs Ala 2570

Ala

Thr

Gly

Tm Val 2575

ACT ATT 7776

GAT

GGT

AAT

AGA

TAT

TAC

TTC

GAG

CCT

AAT

ACA

GCT

ATG

GGT

Thr Ile

Asp

Glv Asn 2580

Arg

Tyr

Tyr

Phe Glu 2585

Pro

Asn

Thr

Ala Met 2590

Gly

GCG AAT 7824

GGT

TAT

AAA

ACT

ATT

GAT

AAT

AAA

AAT

TTT

TAC

TTT

AGA

AAT

Ala Asn

Gly Tyr 2595

Lys

Thr

Ile

Asp Asn 2600

Lys

Asn

Phe

Tyr Phe 2605

Arg

Asn

GGT TTA 7872

CCT

CAG

ATA

GGA

GTG

TTT

AAA

GGG

TCT

AAT

GGA

TTT

GAA

TAC

Gly Leu Pro 2610

Gin

Ile

Gly

Val Phe 2615

Lys

Gly

Ser

Asn Gly 2620

Phe

Glu

Tyr

TTT GCA 7920

CCT

GCT

AAT

ACG

GAT

GCT

AAC

AAT

ATA

GAA

GGT

CAA

GCT

ATA

Phe Ala 2625

Pro

Ala

Asn

Thr Asp 2630

Ala

Asn

Asn

Ile Glu 2635

Gly

Gin

Ala

Ile 2640

CGT TAT 7968

CAA

AAT

AGA

TTC

CTA

CAT

TTA

CTT

GGA

AAA

ATA

TAT

TAC

TTT

Arg Tyr

Gin

Asn

Arg Phe 2645

Leu

Mis

Leu

Leu Gly 2650

Lys

Ile

Tyr

Tyr Phe 2655

GGT AAT

AAT

TCA

AAA

GCA

GTT

ACT

GGA

TGG

CAA

ACT

ATT

AAT

GGT

AAA

8016

-199CZ 296806 B6

Gly

Asn Asn Ser Lvs Ala 2660

Val Thr

Gly 266Í

Trp Gin Thr

Ile Asn Gly Lys 2670

GTA

TAT

TAC

TTT

ATG

CCT

GAT

ACT

GCT

ATG

GCT

GCA

GCT

GGT GGA

CTT

8084

Val

Tyr

Tyr

Phe

Met

Pro

Asp

Thr

Ala

Met

Ala

Ala

Ala

Gly Gly

Leu

2675

2680

2685

TTC

GAG

ATT

GAT

GGT

GTT

ATA

TAT

TTC

TTT

GGT

GTT

GAT

GGA GTA

AAA

8112

Phe Glu Ile Asp 2690

Gly Val

Ile Tyr 2695

Phe

Phe Gly

Val Asp 2700

Gly Val

Lys

GCC

CCT

GGG

ATA

TAT

GGC

TAA

8133

Ala

Pro

Gly

Ile

Tyr

Gly

2705

2710

(2)

INFORMACE PRO

SEQ

ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA

SEKVENCE:

(A)

DÉLKA:

2710 aminokyselin

(B)

TYP: aminokyselina

(D)

TOPOLOGIE:

lineární

(ii)

TYP

MOLEKULY: protein

(xi)

POPIS SEKVENCE:

SEQ ID

NO:

6 :

Met

Ser

Leu

ile

Ser

Lys

Glu

Glu

Leu

Ile

Lys

Leu

Ala

Tyr

Ser

Ile

1

5

10

15

Arg

Pro

Arg

Glu

Asn

Glu

Tyr

LyS

Thr

Ile

Leu

Thr

Asn

Leu

Asp

Glu

20

25

30

Tyr

Asn

Lys

Leu

Thr

Thr

Asn

Asn

Asn

Glu

Asn

Lys

Tyr

Leu

Gin

Leu

35

40

45

Lys

Lys

Leu

Asn

Glu

Ser

Ile

Asp

Val

Phe

Met

Asn

Lys

Tyr

Lys

Thr

50

55

60

Ser

Ser

Arg

Asn

Arg

Ala

Leu

Ser

Asn

Leu

Lvs

Lys

Asp

Ile

Leu

Lys

65

70

75

80

Glu

Val

Ile

Leu

Ile

Lys

Asn

Ser

Asn

Thr

Ser

Pro

Val

Glu

Lys

Asn

85

90

95

Leu

His

. Phe

Val

Trp

Ile

Gly

Gly

Glu

Val

Ser

Asp

Ile

Ala

Leu

Glu

100

105

110

Tyr

Ile

Lys

Gin

Trp

Ala

ASp

Ile

Asn

Ala

Glu

Tyr

Asn

Ile

Lys

Leu

115

120

12 5

Trp

Tyr

Asp

Ser

Glu

Ala

Phe

Leu

Val

Asn

Thr

Leu

Lys

Lys

Ala

Ile

130

135

140

Val

Glu

Ser

Ser

Thr

Thr

Glu

Ala

Leu

Gin

Leu

Leu

Glu

Glu

Glu

Ile

14 5

150

155

160

Gin

Asn

Pro

Gin

Phe

Asp

Asn

Met

Lys

Phe

Tyr

Lys

Lys

Arg

Met

Glu

165

170

175

Phe

Ile

Tyr

Asp

Arg

Gin

Lys

Arg

Phe

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Ser

Gin

1B0

185

190

Ile

Asn

Lys

Pro

Thr

Val

Pro

Thr

Ile

Asp

Asp

Ile

Ile

Lys

Ser

His

195

200

205

Leu

Val

Ser

Glu

Tyr

Asn

Arg

Asp

Glu

Thr

Val

Leu

Glu

Ser

Tyr

Arg

210

215

220

-200CZ 296806 B6

Thr Asn 225

Ser Leu

Arg Lys 230

Ile Asn

Ser Asn His Gly Ile 235

Asp

Ile Arg 240

Ala

Asn

Ser

Leu

Phe 245

Thr

Glu

Gin

Glu

Leu 250

Leu

Asn

Ile

Tyr

Ser 255

Gin

Glu

Leu

Leu

Asn 260

Arg

Gly

Asn

Leu

Ala 26S

Ala

Ala

ser

Asp

Ile 270

Val

Arg

Leu

Leu

Ala 275

Leu

Lys

Asn

Phe

Gly Gly 280

Val

Tyr

Leu

Asp 285

Val

Asp

Met

Leu

pro 290

Gly

Ile

His

Ser

Asp 295

Leu

Phe

Lys

Thr

Ile 300

Ser

Arg

Pro

Ser

Ser 305

Ile

Gly

Leu

Asp

Arg 310

Trp

Glu

Met

Ile

Lys 315

Leu

Glu

Ala

Ile

Met 320

Lys

Tyr

Lys

Lys

Tyr 325

Ile

Asn

Asn

Tyr

Thr 330

Ser

Glu

Asn

Phe

Asp 335

Lys

Leu

Asp

Gin

Gin 340

Leu

Lys

Asp

Asn

Phe 345

Lys

Leu

Ile

Ile

Glu 350

Ser

Lys

Ser

Glu

Lys 355

Ser

Glu

Ile

Phe

Ser 360

Lys

Leu

Glu

Asn

Leu 365

Asn

Val

Ser

Asp

Leu 370

Glu

Ile

Lys

Ile

Ala 375

Phe

Ala

Leu

Gly

Ser 380

Val

Ile

Asn

Gin

Ala 385

Leu

Ile

Ser

Lys

Gin 390

Gly

Ser

Tyr

Leu

Thr 395

Asn

Leu

Val

Ile

Glu 400

Gin

Val

Lys

Asn

Arg 405

Tyr

Gin

Phe

Leu

Asn 410

Gin

His

Leu

Asn

Pro 415

Ala

Ile

Glu

Ser

Asp 420

Asn

Asn

Phe

Thr

Asp 425

Thr

Thr

Lys

Ile

Phe 430

His

Asp

Ser

Leu

Phe 435

Asn

Ser

Ala

Thr

Ala 44 0

Glu

Asn

Ser

Met

Phe 445

Leu

Thr

Lys

Ile

Ala 450

Pro

Tyr

Leu

Gin

Val 4S5

Gly

Phe

Met

Pro

Glu 460

Ala

Arg

ser

Thr

Ile 465

Ser

Leu

Ser

Gly

Pro 470

Gly

Ala

Tyr

Ala

Ser 475

Ala

Tyr

Tyr

Asp

Phe 480

Ile

Asn

Leu

Gin

Glu 485

Asn

Thr

Ile

Glu

Lys 490

Thr

Leu

Lys

Ala

Ser 495

Asp

Leu

Ile

Glu

Phe 500

Lys

Phe

Pro

Glu

Asn 505

Asn

Leu

Ser

Gin

Leu 510

Thr

Glu

Gin

Glu

Ile 515

Asn

Ser

Leu

Trp

Ser 520

Phe

Asp

Gin

Ala

Ser 525

Ala

Lys

Tyr

Gin

Phe 530

Glu

Lys

Tyr

Val

Arg 535

Asp

Tyr

Thr

Gly

Gly 540

Ser

Leu

Ser

Glu

Asp 545

Asn

Gly

Val

Asp

Phe 550

Asn

Lys

Asn

Thr

Ala 555

Leu

Asp

Lys

Asn

Tvr 560

Leu

Leu

Asn

Asn

Lys 565

Ile

Pro

Ser

Asn

Asn 570

Val

Glu

Glu

Ala

Gly 575

Ser

Lys

Asn

Tyr

Val 580

His

Tyr

Ile

Ile

Gin 585

Leu

Gin

Gly

Asp

Asp 590

Ile

Ser

Tyr

Glu

Ala

Thr

Cys

Asn

Leu

Phe

Ser

Lys

Asn

Pro

Lys

Asn

Ser

Ile

-201 CZ 296806 B6

595

600

605

Ile

Ile

Gin

Arg

Asn

Met

Asn

Glu

Ser

Ala

Lys

Ser

Tyr

Phe

Leu

Ser

610

615

620

Asp

Asp

Gly

Glu

Ser

Ile

Leu

Glu

Leu

Asn

Lys

Tyr

Arg

Ile

Pro

Glu

625

630

635

640

Arg

Leu

Lys

Asn

Lys

Glu

Lys

Val

Lys

Val

Thr

Phe

Ile

Gly

His

Gly

645

650

655

Lys

Asp

Glu

Phe

Asn

Thr

Ser

Glu

Phe

Ala

Arg

Leu

Ser

Val

Asp

Ser

660

665

670

Leu

Ser

Asn

Glu

Ile

Ser

Ser

Phe

Leu

Asp

Thr

Ile

Lys

Leu

Asp

Ile

675

680

6B5

Ser

Pro

Lys

Asn

Val

Glu

Val

Asn

Leu

Leu

Gly

Cys

Asn

Met

Phe

Ser

690

695

700

Tyr

Asp

Phe

Asn

Val

Glu

Glu

Thr

Tyr

Pro

Gly

Lys

Leu

Leu

Leu

Ser

705

710

715

720

Ile

Met

Asp

Lys

Ile

Thr

Ser

Thr

Leu

Pro

ASp

Val

Asn

Lys

Asn

Ser

725

730

735

Ile

Thr

Ile

Gly

Ala

Asn

Gin

Tyr

Glu

Val

Arg

Ile

Asn

Ser

Glu

Gly

740

745

750

Arg

Lys

Glu

Leu

Leu

Ala

His

Ser

Gly

Lys

Trp

Ile

Asn

Lys

Glu

Glu

755

760

765

Ala

Ile

Met

Ser

Asp

Leu

Ser

Ser

Lys

Glu

Tyr

Ile

Phe

Phe

Asp

Ser

770

775

780

Ile

Asp

Asn

Lys

Leu

Lys

Ala

Lys

Ser

Lys

Asn

ile

Pro

Gly

Leu

Ala

785

790

795

8 00

Ser

Ile

Ser

Glu

Asp

Ile

Lys

Thr

Leu

Leu

Leu

Asp

Ala

Ser

Val

Ser

805

810

815

Pro

Asp

Thr

Lys

Phe

Ile

Leu

Asn

Asn

Leu

Lys

Leu

Asn

Ile

Glu

Ser

820

825

830

Ser

Ile

Gly

Asp

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Glu

Lys

Leu

Glu

Pro

Val

Lys

Asn

83S

840

84S

Ile

Ile

His

Asn

Ser

Ile

Asp

Asp

Leu

Ile

Asp

Glu

Phe

Asn

Leu

Leu

850

855

860

Glu

Asn

Val

Ser

Asp

Glu

Leu

Tyr

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Asn

Asn

Leu

665

870

875

880

Asp

Glu

Lys

Tyr

Leu

Ile

Ser

Phe

Glu

Asp

Ile

Ser

Lys

Asn

Asn

Ser

885

890

895

Thr

Tyr

Ser

Val

Arg

Phe

Ile

Asn

Lys

Ser

Asn

Gly

Glu

Ser

Val

Tyr

900

905

910

Val

Glu

Thr

Glu

Lys

Glu

Ile

Phe

Ser

Lys

Tyr

Ser

Glu

His

Ile

Thr

915

920

925

Lys

Glu

Ile

Ser

Thr

Ile

Lys

Asn

Ser

Ile

Ile

Thr

Asp

Val

Asn

Gly

930

935

940

Asn

Leu

Leu

Asp

Asn

Ile

Gin

Leu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Val

Asn

Thr

945

950

955

960

-202CZ 296806 B6

Leu Asn	Ala Ala	Phe 965	Phe	Ile Gin Ser	Leu Ile Asp Tyr 970	Ser	Ser 975	Asn
Lys Asp	Val Leu	Asn	Asp	Leu Ser Thr	Ser Val Lys Val	Gin	Leu	Tyr
	980			985		990
Ala Gin	Leu Phe	Ser	Thr	Gly Leu Asn	Thr Ile Tyr Asp	Ser	Ile	Gin
	995			1000	1005
Leu Val	Asn Leu	Ile	Ser	Asn Ala Val	Asn Asp Thr Ile	Asn	Val	Leu
1010			1015	1020
Pro Thr	Ile Thr	Glu	Gly	Ile Pro Ile	Val Ser Thr Ile	Leu	ASp	Gly
1025			1030	1035			1040
Ile Asn	Leu Gly	Ala	Ala	Ile Lys Glu	Leu Leu Asp Glu	His	Asp	Pro
		1045		1050		1055
Leu Leu	Lys Lys	Glu	Leu	Glu Ala Lys	Val Gly Val Leu	Ala	Ile	Asn
	1060		1065	1070
Met Ser	Leu Ser	Ile	Ala	Ala Thr Val	Ala Ser Ile Val	Gly	Ile	Gly
	1075			1080	1085
Ala Glu	Val Thr	Ile	Phe	Leu Leu Pro	Ile Ala Gly Ile	Ser	Ala	Gly
1090			1095	1100
Ile Pro	Ser Leu	Val	Asn	Asn Glu Leu	Ile Leu His Asp	Lys	Ala	Thr
1105			1110	1115			1120
Ser Val	Val Asn	Tyr	Phe	Asn His Leu	Ser Glu Ser Lys	Lys	Tyr	Gly
		1125		1130		1135
Pro Leu	Lys Thr	Glu	Asp	Asp Lys Ile	Leu Val Pro Ile	Asp	Asp	Leu
	1140		1145	1150
Val Ile	Ser Glu	Ile	Asp	Phe Asn Asn	Asn Ser Ile Lys	Leu	Gly	Thr
	1155			1160	1165
Cys .Asn	Ile Leu	Ala	Met	Glu Gly Gly	Ser Gly His Thr	Val	Thr	Gly
1170			1175	1180
Asn Ile	Asp His	Phe	Phe	Ser Ser Pro	Ser Ile Ser Ser	His	Ile	Pro
1185			1190	1195			1200
Ser Leu	Ser Ile	Tyr	Ser	Ala Ile Gly	Ile Glu Thr Glu	Asn	Leu	Asp
		1205		1210		1215
Phe Ser	Lys Lys	Ile	Met	Met Leu Pro	Asn Ala Pro Ser	Arg	Val	Phe
	1220		1225	1230
Trp Trp	Glu Thr	Gly	Ala	Val Pro Gly	Leu Arg Ser Leu	Glu	Asn	Asp

1235 1240 1245

Gly Thr Arg Leu Leu Asp Ser Ile Arg Asp Leu Tyr Pro Gly Lys Phe 1250 12551260

Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala Phe Phe Asp Tyr Ala Ile Thr Thr LeuLys

1265 1270 12751280

Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Lys Ile Lys Leu Asp Lys AspThr

1285 12501295

-203 CZ 296806 B6

Arg	Asn	Phe	Ile Met 1300	Pro Thr	Ile Thr Thr Asn 1305	Glu	Ile	Arg Asn 1310	Lys
Leu	Ser	Tyr	Ser Phe	Asp Gly	Ala Gly Gly Thr	Tyr	Ser	Leu Leu	Leu
		1315		1320		1325
Ser	Ser	Tyr	Pro Ile	Ser Thr	Asn Ile Asn Leu	Set	Lys	Asp Asp	Leu
	1330		1335	1340
Trp	Ile	Phe	Asn Ile	Asp Asn	Glu Val Arg Glu	Ile	Set	Ile Glu	Asn
1345			1350	1355			1360
Gly	Thr	Ile	Lys Lys	Gly Lys	Leu Ile Lys Asp	Val	Leu	Ser Lys	Ile
			1365	1370			1375
Asp	Ile	Asn	Lvs Asn	Lys Leu	Ile Ile Gly Asn	Gin	Thr	Ile Asp	Phe
			1380		1385			1390
Ser	Gly	Asp	Ile Asp	Asn Lys	Asp Arg Tyr Ilé	Phe	Leu	Thr Cys	Glu
		1395		1400		1405
Leu	Asp	Asp	Lys Ile	Ser Leu	Ile Ile Glu Ile	Asn	Leu	Val Ala	Lys
	1410		1415	142 0
Ser	Tvr	Ser	Leu Leu	Leu ser	Gly Asp Lys Asn	Tyr	Leu	Ile Ser	Asn
1425			1430	1435			144 0
Leu	Ser	Asn	Thr Ile	Glu Lys	Ile Asn Thr Leu	Gly	Leu	Asp Ser	Lys
			1445	1450			1455
Asn	Tle	Ala	Tyr Asn	Tyr Thr	Asp Glu Ser Asn	Asn	Lys	Tyr Phe	Gly
			1460		14 6 S			1470
Ala	Ile	Ser	Lys Thr	Ser Gin	Lys Ser Ile Ile	His	Tyr	Lys Lys	Asp
		1475		148 0		1485
Ser	Lys	Asn	Ile Leu	Glu Phe	Tyr Asn Asp Ser	Thr	Leu	Glu Phe	Asn
	1490		1495	1500
Ser	Lys	Asp	Phe Ile	Ala Glu	Asp Ile Asn Val	Phe	Met	Lys Asp	Asp
1505			1510	1515			1520
Ile	Asn	Thr	Ile Thr	Gly Lys	Tyr Tyr Val Asp	Asn	Asn	Thr Asp	Lys
			1525	1530			1535
Ser	Ile	Asp	Phe Ser	Ile Ser	Leu Val Ser Lys	Asn	Gin	Val Lys	Val
			1540		1545			1550
Asn	C-ly	Leu	Tyr Leu	Asn Glu	Ser Val Tyr Ser	Ser	Tyr	Leu Asp	Phe
		1555		1560		1565
Val	Lys	Asn	Ser Asp	Gly His	His Asn Thr Ser	Asn	Phe	Met Asn	Leu
	1570		1575	1580
Phe	Leu	Asp	Asn Ile	Ser Phe	Trp Lys Leu Phe	Gly	Phe	Glu Asn	Ile
15Θ5			1590	1S95			1600
	Phe	Val	Ile Asp	Lys Tyr	Phe Thr Leu Val	Gly	Lys	Thr Asn	Leu
			1605	1610			1615
Gly Tyr	Val	Glu Phe	Ile Cys	Asp Asn Asn Lys	Asn	Ile	Asp Ile	Tyr
			1620		1625			1630

-204CZ 296806 B6

Phe Gly Glu Trp	Lys Thr	ser Ser Ser 1640	Lys	Ser Thr	Ile Phe 1645	Ser	Gly
	1635
Asn	Gly Arg Asn	Val Val	Val Glu Pro	Ile	Tyr Asn	Pro Asp	Thr	Gly
	1650		1655		1660
Glu	Asp Ile Ser	Thr Ser	Leu ASp Phe	Ser	Tyr Glu	Pro Leu	Tyr	Gly
1665	1670		1675			1680
Ile	Asp Arg Tyr	Ile Asn	Lys Val Leu	Ile	Ala Pro	Asp Leu	Tyr Thr
		1685		1690		1695
Ser	Leu Ile Asn	Ile Asn	Thr Asn Tyr	Tyr	Ser Asn	Glu Tyr	Tyr	Pro
	1700	1705		1710
Glu	Ile Ile Val	Leu Asn	Pro Asn Thr	Phe	His Lys	Lys Val	Asn	Ile
	1715		1720			1725
Asn	Leu Asp Ser	Ser Ser	Phe Glu Tyr	Lys	Trp Sér	Thr Glu	Gly	Ser
	1730		1735		1740
Asp	Phe Ile Leu	Val Arg	Tyr Leu Glu	Glu	Ser Asn	Lys Lys	Ile	Leu
1745	1750		1755			1760
Gin	Lys Ile Arg	Ile Lys	Gly Ile Leu	Ser	Asn Thr	Gin Ser	Phe	Asn
		1765		1770		1775
Lys	Met Ser Ile	Asp Phe	Lys Asp Ile	Lys	Lys Leu	Ser Leu	Gly	Tyr
	1780	1785		1790
Ile	Met Ser Asn	Phe Lys	Ser Phe Asn	Ser	Glu Asn	Glu Leu	Asp	Arg
	1795		1800			1805
Asp	His Leu Gly	Phe Lys	Ile Ile Asp	Asn	Lys Thr	Tyr Tyr	Tyr	Asp
	1810		1815		1820
Glu	Asp Ser Lys	Leu Val	Lys Gly Leu	Ile	Asn Ile	Asn Asn	Ser	Leu
1825	1830		1835			1840
Phe	Tyr Phe Asp	Pro Ile	Glu Phe Asn	Leu	Val Thr	Gly Trp	Gin	Thr
		1845		1850		1855
Ile	Asn Gly Lys	Lys Tyr	Tyr Phe Asp	Ile	Asn Thr	Gly Ala	Ala	Leu
	1860	1865		1870
Thr	Ser Tyr Lys	Ile Ile	Asn Gly Lys	His	Phe Tyr	Phe Asn	Asn	Asp
	1875		1880			1885
Gly	Val Met Gin	Leu Gly	Val Phe Lys	Gly	Pro Asp	Gly Phe	Glu	Tyr
	1890		1895		1900
Phe	Ala Pro Ala	Asn Thr	Gin Asn Asn	Asn	Ile Glu	Gly Gin	Ala	Ile
1905	1910		1915			1920
Val	Tyr Gin Ser	Lys Phe	Leu Thr Leu	Asn	Gly Lys	Lys Tyr	Tyr	Phe
		1925		1930		1935
Asp	Asn Asn Ser	Lys Ala	Val Thr Gly	Trp	Arg Ile	Ile Asn	Asn	Glu
	194 0	1945		1950
Lys	Tyr Tyr Phe	Asn Pro	Asn Asn Ala	Ile	Ala Ala	Val Gly	Leu	Gin
	1955		1960			1965

-205CZ 296806 B6

Val	Ile Asp Asn Asn Lys 1970	Tyr Tyr 1975	Phe	Asn	Pro	Asn Thr 1980	Ala	Ile	Ile
Ser	Lys Gly Trp Gin Thr	Val Asn	Gly	Ser	Arg	Tyr Tyr	Phe	Asp	Thr
1985 1990			1995			2000
Asp	Thr Ala Ile Ala Phe	Asn Gly	Tyr	Lys	Thr	Ile Asp	Gly	Lys	His
	2005			2010			2015
Phe	Tyr Phe Asp Ser Asp	Cys Val	Val	Lys	Ile	Gly Val	Phe	Ser	Thr
	2020		2025			2030
Ser	Asn Gly Phe Glu Tyr	Phe Ala	Pro	Ala	Asn	Thr Tyr	Asn	Asn	Asn
	2035	2040			204 5
Ile	Glu Gly Gin Ala Ile	Val Tyr	Gin	Ser	Lys	Phe Leu	Thr	Leu	Asn
	2050	2055				2060
Gly	Lys Lys Tyr Tyr Phe	Asp Asn	Asn	Ser	Lys	Ala Val	Thr	Gly	Leu
2065 2070			2075			2080
Gin	Thr Ile Asp Ser Lys	Lys Tyr	Tyr	Phe	Asn	Thr Asn	Thr	Ala	Glu
	2085			2090			2095
Ala	Ala Thr Gly Trp Gin	Thr Ile	Asp Gly	Lys	Lys Tyr	Tyr	Phe	Asn
	2100		2105			2110
Thr	Asn Thr Ala Glu Ala	Ala Thr	Gly	Trp	Gin	Thr Ile	Asp	Gly	Lys
	2115	2120			2125
Lys	Tyr Tyr Phe Asn Thr	Asn Thr	Ala	Ile	Ala	Ser Thr	Gly	Tyr	Thr
	2130	2135				2140
Ile	Ile Asn Gly Lys His	Phe Tyr	Phe	Asn	Thr	Asp Gly	Ile	Met	Gin
2145 2150			21S5			2160
Ile	Gly Val Phe Lys Gly	Pro Asn	Gly	Phe	Glu	Tyr Phe	Ala	Pro	Ala
	2165			2170			2175
Asn	Thr Asp Ala Asn Asn	Ile Glu	Gly	Gin	Ala	Ile Leu	Tyr	Gin	Asn
	2180		2185			2190
Glu	Phe Leu Thr Leu Asn	Gly Lys	Lys	Tyr	Tyr	Phe Gly	Ser	Asp	Ser
	2195	2200			2205
Lys	Ala Val Thr Gly Trp	Arg Ile	Ile	Asn	Asn	Lys Lys	Tyr	Tyr	Phe
	2210	2215				2220
Asn	Pro Asn Asn Ala Ile	Ala Ala	Ile	His	Leu	Cvs Thr	Ile	Asn	Asn
2225 2230			2235			2240
Asp	Lys Tyr Tyr Phe Ser	Tyr Asp	Gly	Ile	Leu	Gin Asn	Gly	Tyr	Ile
	2245			250			2255
Thr	Ile Glu Arg Asn Asn	Phe Tyr	Phe	Asp	Ala	Asn Asn	Glu	Ser	Lys
	2260		2265			2270
Met	Val Thr Gly Val Phe	Lys Gly	Pro	Asn	Gly	Phe Glu	Tyr	Phe	Ala
	2275	2280			2285
Pro	Ala Asn Thr His Asn	Asn Asn	Ile	Glu	Gly	Gin Ala	Ile	val	Tyr

2290 2295 2300

-206CZ 296806 B6

Gin Asn 2305	Lys	Phe	Leu Thr Leu 2310	Asn Gly Lys	Lys 231'	Tyr	Tyr	Phe	Asp	Asn 2320
Asp Ser	Lys	Ala	Val Thr Gly	Trp Gin Thr	Ile	Asp	Gly	Lys	Lys	Tyr
			2325	2330				2335
Tyr Phe	Asn	Leu	Asn Thr Ala	Glu Ala Ala	Thr	Gly	Trp	Gin	Thr	Ile
		2340	2345				2350
Asp Gly	Lys	Lys	Tyr Tyr Phe	Asn Leu Asn	Thr	Ala	Glu	Ala	Ala	Thr
	2355		2360			2365
Gly Trp	Gin	Thr	Ile Asp Gly	Lys Lys Tyr	Tyr	Phe	Asn	Thr	Asn	Thr
2370		2375		2380
Phe Ile	Ala	Ser	Thr Gly Tyr	Thr Ser Ile	Asn	Gly	Lys	His	Phe	Tyr
2385			2390		2395				2400
Phe Asn	Thr	Asp	Gly Ile Met	Gin Ile Gly	Val	Phe	Lys	Gly	Pro	Asn
			2405	2410				2415
Gly Phe	Glu	Tyr	Phe Ala Pro	Ala Asn Thr	Asp	Ala	Asn	Asn	Ile	Glu
		2420	2425				2430
Gly Gin	Ala	Ile	Leu Tyr Gin	Asn Lys Phe	Leu	Thr	Leu	Asn	Gly	Lys
	2435		244 0			2445
Lys Tyr	Tyr	Phe	Gly Ser Asp	Ser Lys Ala	Val	Thr	Gly	Leu	Arg	Thr
2450		2455		2460
Ile Asp	Gly	Lys	Lys Tyr Tyr	Phe Asn Thr	Asn	Thr	Ala	Val	Ala	Val
2465			2470		2475				2480
Thr Gly	Trp	Gin	Thr Ile Asn	Gly Lys Lys	Tyr	Tyr	Phe	Asn	Thr	Asn
			2485	2490				2495
Thr Ser	Ile	Ala	Ser Thr Gly	Tyr Thr Ile	Ile	Ser	Gly	Lys	His	Phe
		2500	2505				2510
Tyr Phe	Asn	Thr	Asp Gly Ile	Met Gin Ile	Gly	Val	Phe	Lys	Gly	Pro
	2515		2520			2525
Asp Gly	Phe	Glu	Tyr Phe Ala	Pro Ala Asn	Thr	Asp	Ala	Asn	Asn	Ile
2530		2535		2540
Glu Gly	Gin	Ala	Ile Arg Tyr	Gin Asn Arg	Phe	Leu	Tyr	Leu	His	Asp
2545			2550		2555				2560
Asn Ile	Tyr	Tyr	Phe Gly Asn	Asn Ser Lys	Ala	Ala	Thr	Gly	Trp	Val
			2565	2570				2575
Thr Ile	Asp	Gly	Asn Arg Tyr	Tyr Phe Glu	Pro	Asn	Thr	Ala	Met	Gly
		2580	2505				2590
Ala Asn	Gly	Tyr	Lys Thr Ile	Asp Asn Lys	Asn	Phe	Tyr	Phe	Arg	Asn
	2595		2600			2605
Gly Leu	Pro	Gin	Ile Gly Val	Phe Lys Gly	Ser	Asn	Gly Phe	GlU	Tyr
2610		2615		2620
Phe Ala	Pro	Ala	Asn Thr Asp	Ala Asn Asn	Ile	Glu	Gly Gin	Ala	Ile

2625 2630 2635 2640

-207CZ 296806 B6

Arg

Tyr

Gin

Asn Arg

Phe

Leu

His

Leu Leu

Gly

Lys

Ile

Tyr Tyr

Phe

2645

2650

2655

Gly

Asn

Asn

Ser Lys

A1A

Val

Thr

Gly Trp

Gin

Thr

Ile

Asn Gly

Lys

2660

2665

2670

Val

Tyr

Tyr

Phe Met

Pro

Asp

Thr

Ala Met

Ala

Ala

Ala

Gly Gly

Leu

2575

2680

2685

Phe

Glu

Ile

Asp Gly

Val

Ile

Tyr

Phe Phe

Gly

Val

Asp Gly Val

Lys

2590

2695

2700

Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

2705 2710 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 7 :

(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 811 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

Ser Tyr 1

Lys

Ile

Ile 5

Asn

Gly Lys His

Phe Tyr Phe 10

Asn Asn

Asp 15

Gly

Val

Met

Gin

Leu

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asp

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

20

25

30

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Gin

Asn

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Val

35

40

45

Tyr

Gin

Ser

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

50

55

60

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

val

Thr

Gly

Trp

Arg

Ile

Ile

Asn

Asn

Glu

Lys

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Asn

Asn'

Ala

Ile

Ala

Ala

Val

Gly

Leu

Gin

Val

B5

90

95

Ile

Asp

Asn

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Asp

Thr

Ala

Ile

Ile

Ser

100

105

110

Lys

Gly

Trp

Gin

Thr

Val

Asn

Gly

Ser

Arg

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Thr

Asp

115

120

125

Thr

Ala

Ile

Ala

Phe

Asn

Gly

Tyr

Lys

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

His

Phe

130

135

140

Tyr

Phe

Asp

Ser

Asp

Cys

Val

Val

Lys

Ile

Gly

Val

Phe

Ser

Thr

Ser

145

150

155

160

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Tyr

Asn

Asn

Asn

Ile

165

170

175

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Val

Tyr

Gin

Ser

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

180

185

190

-208CZ 296806 B6

Lys Lys

Tyr 195

Tyr Phe

Asp Asn Asn 200

Ser Lys Ala

Val

Thr 205

Gly

Leu

Gin

Thr

Ile

Asp

Ser

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

210

215

220

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

225

230

235

240

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

245

250

255

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala

Ile

Ala

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

Ile

260

265

270

Ile

Asn

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

Ile

275

280

285

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

290

295

300

Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Leu

Tyr

Gin

Asn

Glu

305

310

315

320

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Ser

Asp

Ser

Lys

325

330

335

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Arg

Ile

Ile

Asn

Asn

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

340

345

350

Pro

Asn

Asn

Ala

Ile

Ala

Ala

Ile

His

Leu

Cys

Thr

Ile

Asn

Asn

Asp

355

360

365

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ile

Leu

Gin

Asn

Gly

Tyr

Ile

Thr

370

375

380

Ile

GlU

Arg

Asn

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Ala

Asn

Asn

Glu

Ser

Lys

Met

3BS

390

395

400

Val

Thr

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

405

410

415

Ala

Asn

Thr

His

Asn

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Val

Tyr

Gin

420

42 5

430

Asn

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asn

Asp

435

440

44 5

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

450

455

460

Phe

Asn

Leu

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

465

470

475

480

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Leu

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

Gly

485

490

495

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Phe

500

505

510

Ile

Ala

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

Ser

Ile

Asn

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

515

520

525

-209CZ 296806 B6

Asn Thr Asp 530

Gly Ile Met

Gin 535

Ile Gly Val

Phe Lys 540

Gly Pro

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

ile

Glu

Gly

545

550

555

560

Gin

Ala

Ile

Leu

Tyr

Gin

Asn

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

565

570

575

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Ser

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Leu

Arg

Thr

Ile

580

585

590

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala

val

Ala

Val

Thr

S95

600

605

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

610

615

620

Ser

Ile

Ala

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

Ile

Ile

Ser

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

625

630

635

640

Phe

Asn

Thr

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asp

645

650

655

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

660

665

670

Gly

Gin

Ala

Ile

Arg

Tyr

Gin

Asn

Arg

Phe

Leu

Tyr

Leu

His

Asp

Asn

675

680

685

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Val

Thr

690

695

700

Ile

Asp

Gly

Asn

Arg

Tyr

Tyr

Phe

Glu

Pro

Asn

Thr

Ala

Met

Gly

Ala

705

710

715

720

Asn

Gly

Tyr

Lys

Thr

Ile

Asp

Asn

Lys

Asn

Phe

Tyr

Phe

Arg

Asn

Gly

725

730

735

Leu

Pro

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Ser

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

740

745

750

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Arg

755

760

765

Tyr

Gin

Asn

Arg

Phe

Leu

His

Leu

Leu

Gly

Lys

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Gly

770

775

780

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asn

Gly

Lys

Val

785

790

795

800

Tyr

Tyr

Phe

Met

Pro

Asp

Thr

Ala

Met

Ala

Ala

805

810

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 91 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

Ser 1

Tyr

Lys

Ile

Ile Asn Gly 5

Lys

His

Phe 10

Tyr

Phe

Asn

Asn

Asp 15

Gly

Val

Met

Gin

Leu

Gly Val Phe

Lys

Gly

Pro

Asp

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

-210CZ 296806 B6

25 jo

Ala

Pro

Ala Asn Thr Gin Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gin Ala

Ile

Val

35

40

45

Tyr

Gin

Ser

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

50

55

60

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Arg

Ile

Ile

Asn

Asn

Glu

Lys

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Asn

Asn

Ala

Ile

Ala

Ala

90 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7101 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (li) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..7098 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ÍD NO:9:

ATG AGT TTA GTT A O

AAT AGA

AAA CAG Lys Gin

TTA Leu

GAA AAA Glu Lys 10

ATG GCA

AAT GTA AGA

Met 1

Ser

Leu

Val

Asn S

Arg

Met

Ala

Asn Val 15

Arg

TTT 96

CGT

ACT

CAA

GAA

GAT

GAA

TAT

GTT

GCA

ATA

TTG

GAT

GCT

TTA

GAA

Phe

Arg

Thr

Gin 20

Glu

Asp

Glu

Tyr

Val 25

Ala

Ile

Leu

Asp

Ala 30

Leu

Glu

GAA 144

TAT

CAT

AAT

ATG

TCA

GAG

AAT

ACT

GTA

GTC

GAA

AAA

TAT

TTA

AAA

Glu

Tyr

His 35

Asn

Met

Ser

Glu

Asn 40

Thr

Val

Val

Glu

Lys 45

Tyr

Leu

Lys

TTA 192

AAA

GAT

ATA

AAT

AGT

TTA

ACA

GAT

ATT

TAT

ATA

GAT

ACA

TAT

AAA

Leu

Lys

Asp

Ile

Asn

Ser

Leu

Thr

Asp

Ile

Tyr

Ile

Asp

Thr

Tyr

Lys

50

55

60

AAA

TCT

GGT

AGA

AAT

AAA

GCC

TTA

AAA

AAA

TTT

AAG

GAA

TAT

CTA

GTT

240

Lys

Ser

Gly

Arg

Asn

Lys

Alá

Leu

Lys

Lys

Phe

Lys

Glu

Tyi'

Leu

Val

65

70

75

80

ACA

GAA

GTA

TTA

GAG

CTA

AAG

AAT

AAT

AAT

TTA

ACT

CCA

GTT

GAG

AAA

288

Thr

Glu

Val

Leu

Glu

Leu

Lys

Asn

Asn

Asn

Leu

Thr

Pro

Val

Glu

Lys

85

90

95

AAT

TTA

CAT

TTT

GTT

TGG

ATT

GGA

GGT

CAA

ATA

AAT

GAC

ACT

GCT

ATT

336

Asn

Leu

His

Phe

Val

Trp

Ile

Gly

Gly

Gin

Ile

Asn

Asp

Thr

Ala

Ile

100

105

110

AAT

TAT

ATA

AAT

CAA

TGG

AAA

GAT

GTA

AAT

AGT

GAT

TAT

AAT

GTT

AAT

384

Asn

Tyr

Ile

Asn

Gin

Trp

Lys

Asp

Val

Asn

Ser

Asp

Tyr

Asn

Val

Asn

lis

120

125

-211 CZ 296806 B6

GTT TTT

TAT Tyr

GAT Asp

AGT AAT GCA

TTT TTG Phe Leu

ATA Ile

AAC ACA

TTG AAA AAA

ACT Thr

432 Val

Phe 130

Ser

Asn

Ala 135

Leu

Lys

Lys

Asn

Thr 140

GTA

GTA

GAA

TCA

GCA

ATA

AAT

GAT ACA

CTT

GAA

TCA

TTT

AGA

GAA

AAC

480

Val

Val

Glu

Ser

Ala

Ile

Asn

Asp Thr

Leu

Glu

Ser

Phe

Arg

Glu

Asn

145

150

155

160

TTA

AAT

GAC

CCT

AGA

TTT

GAC

TAT AAT

AAA

TTC

TTC

AGA

AAA

CGT

ATG

528

Leu

Asn

Asp

Pro

Arg

Phe

Asp

Tyr Asn

Lys

Phe

Phe

Arg

Lys

Arg

Met

165

170

175

GAA

ATA

ATT

TAT

GAT

AAA

CAG

AAA AAT

TTC

ATA

AAC

TAC

TAT

AAA

GCT

576

Glu

Ile

Ile

Tyr

Asp

Lys

Gin

Lys Asn

Phe

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Ala

180

185

190

CAA

AGA

GAA

GAA

AAT

CCT

GAA

CTT ATA

ATT

GAT

GAT

ATT

GTA

AAG

ACA

624

Gin

Arg

Glu

Glu

Asn

Pro

Glu

Leu Ile

Xle

Asp

Asp

Ile

Val

Lys

Thr

195

200

205

TAT

CTT

TCA

AAT

GAG

TAT

TCA

AAG GAG

ATA

GAT

GAA

CTT

AAT

ACC

TAT

672

Tyr

Leu

Ser

Asn

Glu

Tyr

Ser

Lys Glu

Ile

Asp

Glu

Leu

Asn

Thr

Tyr

210

215

220

ATT

GAA

GAA

TCC

TTA

AAT

AAA

ATT ACA

CAG

AAT

AGT

GGA

AAT

GAT

GTT

720

Ile

Glu

Glu

Ser

Leu

Asn

Lys

Ile Thr

Gin

Asn

Ser

Gly

Asn

Asp

Val

225

230

235

240

AGA

AAC

TTT

GAA

GAA

TTT

AAA

AAT GGA

GAG

TCA

TTC

AAC

TTA

TAT

GAA

768

Arg

Asn

Phe

Glu

G1U

Phe

Lys

Asn Gly

Glu

Ser

Phe

Asn

Leu

Tyr

Glu

245

250

255

CAA GAG TTG

GTA GAA AGG

TGG AAT

TTA GCT GCT GCT TCT

GAC ATA

TTA Leu

816 Gin

Glu

Leu

Trp

Asn

Leu Ala 265

Ala

Ala

Ser

Val 260

Glu

Arg

Asp 270

Ile

AGA

ATA

TCT

GCA

TTA

AAA

GAA

ATT

GGT

GGT

ATG

TAT

TTA

GAT

GTT

GAT

864

Arg

Ile

Ser

Ala

Leu

Lys

Glu

Ile

Gly

Gly

Met

Tyr

Leu

Asp

Val

Asp

275

280

285

ATG

TTA

CCA

GGA

ATA

CAA

CCA

GAC

TTA

TTT

GAG

TCT

ATA

GAG

AAA

CCT

912

Met

Leu

Pro

Gly

Ile

Gin

Pro

Asp

Leu

Phe

G1U

Ser

Ile

Glu

Lys

Pro

290 295 300

AGT

TCA

GTA

ACA

GTG

GAT

TTT

TGG

GAA

ATG

ACA

AAG

TTA

GAA

GCT

ATA

960 Ser 305

Ser

Val

Thr

Val

Asp 310

Phe

Trp

Glu

Met

Thr 315

Lys

Leu

Glu

Ala

Ile 320

ATG

AAA

TAC

AAA

GAA

TAT

ATA

CCA

GAA

TAT

ACC

TCA

GAA

CAT

TTT

GAC

.1008 Met

Lys

Tyr

Lys

Glu 325

Tyr

Ile

Pro

Glu

Tyr 330

Thr

Ser

Glu

His

Phe 335

Asp

ATG 1056 Met

TTA

GAC

GAA

GAA

GTT

CAA

AGT

AGT

TTT

GAA

TCT

GTT

CTA

GCT

TCT

I Leu

Asp

Glu 340

Glu

Val

Gin

Ser

Ser 345

Phe

Glu

Ser

Val

Leu 350

Ala

Ser

-212CZ 296806 B6

AAG TCA 1104

Lys Ser

TCA CCA 1152 Ser Pro 370

CAA GGG

1200

Gin Gly

385

AAA CAA 1248

Lys Gin

GCT ATT

1296

Ala Ile

GAT AGT 1344

Asp Ser

GAA CTA

1392

Glu Leu

450

ACT ATT

1440

Thr Ile

465

TTA TTA

1488

Leu Leu

GAT TTA 1536

Asp Leu

GAA CAA

1584

Glu Gin

GCT CAA

1632

Ala Gin

530

GAA GAT

1680

Glu Asp

545

TAT CTT

1728

Tyr Leu

GAT AAA

Asp Lys

355

CTA GAA Leu Glu

CTA ATT

Leu Ile

ATC GAG Ile Glu

AGC GAG

Ser Glu

420

ATA ATG Ile Met

435

GGA AAG

Gly Lys

AAC TTA

Asn Leu

ATG TTT

Met Phe

AGA AAC

Arg Asn

500

GAA ATG

Glu Met

515

TTT GAA

Phe Glu

GAT AAT

Asp Asn

TTA GAA

Leu Glu

TCA GAA

Ser Glu

GTT AAA

Val Lys

TCT GTG

Ser Val

390

AAT AGA

Asn Arg

405

GAT AAT

Asp Asn

GCT GAA

Ala Glu

TAT TTA

Tyr Leu

AGT GGC

Ser Gly

470

AAA GAA

Lys Glu

485

TTT GAA

Phe Glu

GCT AGC

Ala Ser

GAA TAT

Glu Tyr

CTT GAT

Leu Asp

550

AAA ATA

Lys Ile

565

ATA TTC Ile Phe

360

ATT GCA

Ile Ala

375

AAA GAC Lys Asp

TAT AAA

Tyr Lys

GAT TTT

Asp Phe

GCT AAT

Ala Asn

440 AGA GTT Arg Val

455

CCT GAA Pro Glu

GGC AGT

Gly Ser

ATC TCT Ile Ser

TTA TGG

Leu Trp

520

AAA AGG

Lys Arg

535

TTT TCT

Phe Ser

TCT TCA

Ser Ser

TCA TCA Ser Ser

TTT AAT

Phe Asn

TCA TAT Ser Tyr

ATA TTG

Ile Leu

410 AAT ACT Asn Thr

425

GCA GAT Ala Asp

GGT TTC

Gly Phe

GCA TAT

Ala Tyr

ATG AAT

Met Asn

490

AAA ACT

Lys Thr

505

TCA TTT Ser Phe

AAT TAT

Asn Tyr

CAA AAT

Gin Asn

TTA GCA

Leu Ala

570

CTT GGT

Leu Gly

AGT AAG

Ser Lys

380

TGT AGC

Cys Ser

395

AAT AAT

Asn Asn

ACA ACG

Thr Thr

AAT GGT

Asn Gly

TTC CCA Phe Pro

460

GCG GCA

Ala Ala

475

ATC CAT Ile His

AAT ATT

Asn Ile

GAC GAT

Asp Asp

TTT GAA

Phe Glu

540

ATA GTA

Ile Val

555

AGA AGT

Arg Ser

GAT ATG

Asp Met 365

GGT ATT

Gly Ile

AAT TTA

Asn Leu

AGT TTA

Ser Leu

AAT ACC

Asn Thr

430

AGA TTT

Arg Phe

445

GAT GTT

Asp Val

GCT TAT

Ala Tyr

TTG ATA

Leu Ile

TCT CAA

Ser Gin

510

GCA AGA

Ala Arg

525

GGT TCT

Gly Ser

GTT GAC

Val Asp

TCA GAG

Ser Glu

GAG GCA

Glu Ala

ATA AAT

Ile Asn

ATA GTA

Ile Val

400

AAT CCA

Asn Pro

415

TTT ATT

Phe Ile

ATG ATG

Met Met

AAA ACT

Lys Thr

CAA GAT

Gin Asp

480

GAA GCT

Glu Ala

495

TCA ACT

Ser Thr

GCT AAA

Ala Lys

CTT GGT

Leu Gly

AAG GAG

Lys Glu

560

AGA GGA

Arg Gly

575

-213CZ 296806 B6

TAT ΑΤΑ 1776

CAC TAT

ATT GTT

CAG TTA

CAA Gin 585

GGA GAT AAA

ATT AGT

TAT Tyr

GAA Glu

Ile

Ser 590

Tyr Ile

His

Tyr 580

Ile

Val

Gin

Leu

Gly

Asp

Lys

GCA GCA 1824

TGT

AAC

TTA

TTT

GCA

AAG

ACT

CCT

TAT

GAT

AGT

GTA

CTG

TTT

Ala Ala

Cys 595

Asn

Leu

Phe

Ala

Lys 600

Thr

Pro

Tyr

Asp

Ser 605

Val

Leu

Phe

CAG AAA 1872

AAT

ATA

GAA

GAT

TCA

GAA

ATT

GCA

TAT

TAT

TAT

AAT

CCT

GGA

Gin Lys 610

Asn

Ile

Glu

Asp

Ser 615

G1U

Ile

Ala

Tyr

Tyr 620

Tyr

Asn

Pro

Gly

GAT GGT 1920

GAA

ATA

CAA

GAA

ATA

GAC

AAG

TAT

AAA

ATT

CCA

AG

ATA

ATT

Asp Gly 625

Glu

Ile

Gin

Glu 630

Ile

Asp

Lys

Tyr

Lys 635

Ile

Pro

Ser

Ile

Ile 640

TCT GAT 1968

AGA

CCT

AAG

ATT

AAA

TTA

ACA

TTT

ATT

GGT

CAT

GGT

AAA

GAT

Ser Asp

Arg

Pro

Lys 645

Ile

Lys

Leu

Thr

Phe 650

Ile

Gly

His

Gly

Lys 655

Asp

GAA TTT 2016

AAT

ACT

GAT

ATA

TTT

GCA

GGT

TTT

GAT

GTA

GAT

TCA

TTA

TCC

Glu Phe

Asn

Thr 660

Asp

Ile

Phe

Ala

Gly 665

Phe

Asp

Val

Asp

Ser 670

Leu

Ser

ACA GAA 2064

ATA

GAA

GCA

GCA

ATA

GAT

TTA

GCT

AAA

GAG

GAT

ATT

TCT

CCT

Thr Glu

Ile 675

Glu

Ala

Ala

Ile

Asp 680

Leu

Ala

Lys

Glu

Asp 685

Ile

Ser

Pro

AAG TCA 2112

ATA

GAA

ATA

AAT

TTA

TTA

GGA

TGT

AAT

ATG

TTT

AGC

TAC

TCT

Lys Ser 690

Ile

Glu

Ile

Asn

Leu 695

Leu

Gly

Cys

Asn

Met 700

Phe

Ser

Tyr

Ser

ATC AAC 2160

GTA

GAG

GAG

ACT

TAT

CCT

GGA

AAA

TTA

TTA

CTT

AAA

GTT

AAA

Ile Asn 705

Val

Glu

Glu

Thr 710

Tyr

Pro

Gly

Lys

Leu 715

Leu

Leu

Lys

Val

Lys 720

GAT AAA 2208

ATA

TCA

GAA

TTA

ATG

CCA

TCT

ATA

AGT

CAA

GAC

TCT

ATT

ATA

Asp Lys

Ile

Ser

Glu 725

Leu

Met

Pro

Ser

Ile 730

Ser

Gin

Asp

Ser

Ile 735

Ile

GTA AGT 2256

GCA

AAT

CAA

TAT

GAA

GTT

AGA

ATA

AAT

AGT

GAA

GGA

AGA

AGA

Val Ser

Ala

Asn 740

Gin

Tyr

Glu

Val

Arg 745

Ile

Asn

Ser

Glu

Gly 750

Arg

Arg

GAA TTA 2304

TTG

GAT

CAT

TCT

GGT

GAA

TGG

ATA

AAT

AAA

GAA

GAA

AGT

ATT

Glu Leu

Leu 755

Asp

His

Ser

Gly

Glu 760

Trp

Ile

Asn

Lys

Glu 765

Glu

Ser

Ile

ATA AAG 2352

GAT

ATT

TCA

TCA

AAA

GAA

TAT

ATA

TCA

TTT

AAT

CCT

AAA

GAA

Ile Lys

Asp

Ile

Ser

Ser

Lys

Glu

Tyr

Ile

Ser

Phe

Asn

Pro

Lys

Glu

770 775 780

AAT AAA

ATT

ACA

GTA

AAA

TCT

AAA

AAT

TTA

CCT

GAG

CTA

TCT

ACA

TTA

2400

Asn Lys

Ile

Thr

Val

Lys

Ser

Lys

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Ser

Thr

Leu

785

790

795

800

-214CZ 296806 B6

TTA CAA 2448 Leu Gin

GAA ATT AGA AAT AAT TCT AAT TCA AGT

GAT ATT GAA CTA GAA

Asp

Ile Glu

Leu Glu 815

Glu

Ile

Arg Asn 805

Asn

Ser

Asn Ser Bio

Ser

GAA AAA 2496

GTA

ATG

TTA

ACA

GAA

TGT

GAG

ATA

AAT

GTT

ATT

TCA

AAT

ATA

Glu Lys

Val

Met 820

Leu

Thr

Glu

Cys

Glu 825

Ile

Asn

Val

Ile

Ser 830

Asn

Ile

GAT ACG 2544

CAA

ATT

GTT

GAG

GAA

AGG

ATT

GAA

GAA

GCT

AAG

AAT

TTA

ACT

Asp Thr

Gin 835

Ile

Val

G1U

Glu

Arg 840

Ile

Glu

Glu

Ala

Lys 845

Asn

Leu

Thr

TCT GAC 2592

TCT

ATT

AAT

TAT

ATA

AAA

GAT

GAA

TTT

AAA

CTA

ATA

GAA

TCT

Ser Asp 850

Ser

Ile

Asn

Tyr

Ile 855

Lys

Asp

Glu

Phe

Lys 860

Leu

Ile

Glu

Ser

ATT TCT 2640

GAT

GCA

CTA

TGT

GAC

TTA

AAA

CAA

CAG

AAT

GAA

TTA

GAA

GAT

Ile Ser 865

Asp

Ala

Leu

Cys B70

Asp

Leu

Lys

Gin

Gin 875

Asn

Glu

Leu

Glu

Asp 880

TCT CAT 2688

TTT

ATA

TCT

TTT

GAG

GAC

ATA

TCA

GAG

ACT

GAT

GAG

GGA

TTT

Ser His

Phe

Ile

Ser 885

Phe

Glu

Asp

Ile

Ser 890

Glu

Thr

Asp

Glu

Gly 895

Phe

AGT ATA 2736

AGA

TTT

ATT

AAT

AAA

GAA

ACT

GGA

GAA

TCT

ATA

TTT

GTA

GAA

ser Ile

Arg

Phe 900

Ile

Asn

Lys

Glu

Thr 905

Gly

Glu

Ser

Ile

Phe 910

Val

Glu

ACT GAA 2784

AAA

ACA

ATA

TTC

TCT

GAA

TAT

GCT

AAT

CAT

ATA

ACT

GAA

GAG

Thr Glu

Lys 915

Thr

Ile

Phe

Ser

Glu 920

Tyr

Ala

Asn

HiS

Ile 925

Thr

Glu

Glu

ATT TCT 2832

AAG

ATA

AAA

GGT

ACT

ATA

TTT

GAT

ACT

GTA

AAT

GGT

AAG

TTA

Ile Ser 930

Lys

Ile

Lys

Gly

Thr 935

Ile

Phe

Asp

Thr

Val 940

Asn

Gly

Lys

Leu

GTA AAA 2880

AAA

GTA

AAT

TTA

GAT

ACT

ACA

CAC

GAA

GTA

AAT

ACT

TTA

AAT

Val Lys 945

Lys

val

Asn

Leu 950

Asp

Thr

Thr

His

Glu 955

Val

Asn

Thr

Leu

Asn 960

GCT GCA 2928

TTT

TTT

ATA

CAA

TCA

TTA

ATA

GAA

TAT

AAT

AGT

TCT

AAA

GAA

Ala Ala

Phe

Phe

Ile 965

Gin

Ser

Leu

Ile

Glu 970

Tyr

Asn

Ser

Ser

Lys 975

Glu

TCT CTT 2976

AGT

AAT

TTA

AGT

GTA

GCA

ATG

AAA

GTC

CAA

GTT

TAC

GCT

CAA

Ser Leu

Ser

Asn 980

Leu

Ser

Val

Ala

Met 985

Lys

Val

Gin

Val

Tyr 990

Ala

Gin

TTA TTT

AGT

ACT

GGT

TTA

AAT

ACT

ATT

ACA

GAT

GCA

GCC

AAA

GTT

GTT

3024 Leu Phe

ser 995

Thr

Gly

Leu

Asn

Thr Ile 1000

Thr

Asp

Ala

Ala Lys 1005

Val

Val

GAA TTA 3072

GTA

TCA

ACT

GCA

TTA

GAT

GAA

ACT

ATA

GAC

TTA

CTT

CCT

ACA

Glu Leu

Val

Ser

Thr

Ala

Leu

Asp

Glu

Thr

Ile

Asp

Leu

Leu

Pro

Thr

1Q1Q 1015 1020

-215CZ 296806 B6

TTA TCT 3120 Leu Ser 1025

GAA Glu

GGA Gly

TTA Leu

CCT ATA Pro Ile 1030

ATT Ile

GCA Ala

ACT Thr

ATT ATA Ile Ile 1035

GAT Asp

GGT Gly

GTA Val

AGT Ser 1040

TTA GGT

GCA

GCA

ATC

AAA

GAG

CTA

AGT

GAA

ACG

AGT

GAC

CCA

TTA

TTA

3168

Leu Gly

Ala

Ala

Ile

Lys

Glu

Leu

Ser

Glu

Thr

Ser

Asp

Pro

Leu

Leu

1045

1050

1055

AGA CAA

GAA

ATA

GAA

GCT

AAG

ATA

GGT

ATA

ATG

GCA

GTA

AAT

TTA

ACA

3216

Arg Gin

Glu

Ile

Glu

Ala

Lys

Ile

Gly

ile

Met

Ala

Val

Asn

Leu

Thr

1060

1065

1070

ACA GCT

ACA

ACT

GCA

ATC

ATT

ACT

TCA

TCT

TTG

GGG

ATA

GCT

AGT

GGA

3264

Thr Ala

Thr

Thr

Ala

Ile

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu

Gly

Ile

Ala

Ser

Gly

1075

1080

1085

TTT AGT

ATA

CTT

TTA

GTT

CCT

TTA

GCA

GGA

ATT

TCA

GCA

GGT

ATA

CCA

3312

Phe Ser

Ile

Leu

Leu

Val

Pro

Leu

Ala

Gly

Ile

Ser

Ala

Gly

Ile

Pro

1090

1095

1100

AGC TTA

GTA

AAC

AAT

GAA

CTT

GTA

CTT

CGA

GAT

AAG

GCA

ACA

AAG

GTT

3360

Ser Leu

Val

Asn

Asn

Glu

Leu

Val

Leu

Arg

Asp

Lys

Ala

Thr

Lys

Val

1105

1110

1115

1120

GTA GAT

TAT

TTT

AAA

CAT

GTT

TCA'

TTA

GTT

GAA

ACT

GAA

GGA

GTA

TTT

3408

Val Asp

Tyr

Phe

Lys

His

Val

Ser

Leu

Val

Glu

Thr

G1U

Gly

val

Phe

1125

1130

1135

ACT TTA

TTA

GAT

GAT

AAA

ATA

ATG

ATG

CCA

CAA

GAT

GAT

TTA

GTG

ATA

3456

Thr Leu

Leu

Asp

Asp

Lys

Ile

Met

Met

Pro

Gin

Asp

Asp

Leu

Val

Ile

1140

1145

1150

TCA GAA

ATA

GAT

TTT

AAT

AAT

AAT

TCA

ATA

GTT

TTA

GGT

AAA

TGT

GAA

3504

Ser Glu

Ile

Asp

Phe

Asn

Asn

Asn

Ser

Ile

Val

Leu

Gly

Lys

Cys

GiU

1155

1160

1165

ATC TGG

AGA

ATG

GAA

GGT

GGT

TCA

GGT

CAT

ACT

GTA

ACT

GAT

GAT

ATA

3552

Ile Trp

Arg

Met

Glu

Gly

Gly

Ser

Gly

His

Thr

Val

Thr

Asp

Asp

Ile

1170

1175

1180

GAT CAC

TTC

TTT

TCA

GCA

CCA

TCA

ATA

ACA

TAT

AGA

GAG

CCA

CAC

TTA

3600

Asp His

Phe

Phe

Sér

Ala

Pro

Ser

Ile

Thr

Tyr

Arg

Glu

Pro

HiS

Leu

1185

1190

1195

1200

TCT ATA

TAT

GAC

GTA

TTG

GAA

GTA

CAA

AAA

GAA

GAA

CTT

GAT

TTG

TCA

3648

Ser Ile

Tyr

Asp

Val

Leu

Glu

Val

Gin

Lys

Glu

Glu

Leu

Asp

Leu

Ser

1205

1210

1215

AAA GAT

TTA

ATG

GTA

TTA

CCT

AAT

GCT

CCA

AAT

AGA

GTA

TTT

GCT

TGG

3696

Lys Asp

Leu

Met

Val

Leu

Pro

Asn

Ala

Pro

Asn

Arg

Val

Phe

Ala

Trp

1220

1225

1230

GAA ACA

GGA

TGG

ACA

CCA

GGT

TTA

AGA

AGC

TTA

GAA

AAT

GAT

GGC

ACA

3744

Glu Thr

Gly

Trp

Thr

Pro

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

Glu

Asn

Asp Gly

Thr

1235

124 0

1245

-216CZ 296806 B6

AAA CTG TTA GAC CGT 3792

ATA AGA GAT

AAC TAT GAA GGT GAG TTT TAT TGG

Ile

Arg Asp 1255

Asn

Tyr Glu

Gly Glu Phe 1260

Tyr

Trp

Lys Leu Leu 1250

Asp

Arg

AGA TAT

TTT

GCT

TTT

ATA

GCT

GAT

GCT

TTA

ATA

ACA

ACA

TTA

AAA

CCA

3840

Arg Tyr

Phe

Ala

Phe

Ile

Ala

Asp

Ala

Leu

Ile

Thr

Thr

Leu

Lys

Pro

1265

1270

1275

1280

AGA TAT

GAA

GAT

ACT

AAT

ATA

AGA

ATA

AAT

TTA

GAT

AGT

AAT

ACT

AGA

3888

Arg Tyr

G1U

Asp

Thr

Asn

Ile

Arg

Ile

Asn

Leu

Asp

Ser

Asn

Thr

Arg

1285

1290

1295

AGT TTT

ATA

GTT

CCA

ATA

ATA

ACT

ACA

GAA

TAT

ATA

AGA

GAA

AAA

TTA

3936

Ser Phe

Ile

val

Pro

Ile

Ile

Thr

Thr

Glu

Tyr

Ile

Arg

Glu

Lys

Leu

1300

1305

1310

TCA TAT

TCT

TTC

TAT

GGT

TCA

GGA

GGA

ACT

TAT

GCA

TTG

TCT

CTT

TCT

3984

Ser Tyr

Ser

Phe

Tyr

Gly

Ser

Gly

Gly

Thr

Tyr

Ala

Leu

Ser

Leu

Ser

1315

1320

1325

CAA TAT

AAT

ATG

GGT

ATA

AAT

ATA

GAA

TTA

AGT

GAA

AGT

GAT

GTT

TGG

4032

Gin Tyr

Asn

Met

Gly

Ile

Asn

Ile

Glu

Leu

Ser

Glu

Ser

Asp

Val

Trp

1330

1335

1340

ATT ATA

GAT

GTT

GAT

AAT

GTT

GTG

AGA

GAT

GTA

ACT

ATA

GAA

TCT

GAT

4080

Ile Zle

Asp

Val

Asp

Asn

Val

Val

Arg

Asp

Val

Thr

Ile

Glu

Ser

Asp

1345

1350

1355

1360

AAA ATT

AAA

AAA

GGT

GAT

TTA

ATA

GAA

GGT

ATT

TTA

TCT

ACA

CTA

AGT

4128

Lys Ile

Lys

Lys

Gly Asp

Leu

Ile

Glu

Gly

Ile

Leu

Ser

Thr

Leu

Ser

1365

1370

1375

ATT GAA

GAG

AAT

AAA

ATT

ATC

TTA

AAT

AGC

CAT

GAG

ATT

AAT

TTT

TCT

4176

Ile Glu

Glu

Asn

Lys

Ile

Ile

Leu

Asn

Ser

His

Glu

Ile

Asn

Phe

Ser

13B0

1385

1390

GGT GAG

GTA

AAT

GGA

AGT

AAT

GGA

TTT

GTT

TCT

TTA

ACA

TTT

TCA

ATT

4224

Gly Glu

Val

Asn

Gly

Ser

Asn

Gly

Phe

Val

Ser

Leu

Thr

Phe

Ser

Ile

1395

1400

1405

TTA GAA

GGA

ATA

AAT

GCA

ATT

ATA

GAA

GTT

GAT

TTA

TTA

TCT

AAA

TCA

4272

Leu Glu

Gly

Ile

Asn

Ala

Ile

Ile

Glu

Val

Asp

Leu

Leu

Ser

Lys

Ser

1410

1415

1420

TAT AAA

TTA

CTT

ATT

TCT

GGC

GAA

TTA

AAA

ATA

TTG

ATG

TTA

AAT

TCA

4320

Tyr Lys

Leu

Leu

Ile

Ser

Gly

Glu

Leu

Lys

Ile

Leu

Met

Leu

Asn

Ser

1425

1430

1435

1440

AAT CAT

ATT

CAA

CAG

AAA

ATA

GAT

TAT

ATA

GGA

TTC

AAT

AGC

GAA

TTA

4368

Asn His

Ile

Gin

Gin

Lys

Ile

Asp

Tyr

Ile

Gly

Phe

Asn

Ser

G1U

Leu

1445

1450

1455

CAG AAA

AAT

ATA

CCA

TAT

AGC

TTT

GTA

GAT

AGT

GAA

GGA

AAA

GAG

AAT

4416

Gin Lys

Asn

Ile

Pro Tyr

Ser

Phe

Val

Asp

Ser

Glu

Gly

Lys

Glu

Asn

1460

1465

1470

-217CZ 296806 B6

GGT TTT 4464 Gly Phe

ATT AAT Ile Asn 1475

GGT Gly

TCA Ser

ACA Thr

AAA GAA Lys Glu 1480

GGT Gly

TTA Leu

TTT Phe

GTA TCT Val ser 1485

GAA Glu

TTA Leu

CCT GAT

GTA

GTT

CTT

ATA

AGT

AAG

GTT

TAT

ATG

GAT

GAT

AGT

AAG

CCT

4512

Pro Asp

Val

Val

Leu

Ile

Ser

Lys

val

Tyr

Met

Asp

Asp

Ser

Lys

Pro

1490

1495

1500

TCA TTT

GGA

TAT

TAT

AGT

AAT

AAT

TTG

AAA

GAT

GTC

AAA

GTT

ATA

ACT

4560

Ser Phe

Gly

Tyr

Tyr

Ser

Asn

Asn

Leu

Lys

Asp

Val

Lys

Val

Ile

Thr

1505

1510

ISIS

1520

AAA GAT

AAT

GTT

AAT

ATA

TTA

ACA

GGT

TAT

TAT

CTT

AAG

GAT

GAT

ATA

4606

Lys Asp

Asn

Val

Asn

Ile

Leu

Thr

Gly

Tyr

Tyr

Leu

Lys

Asp

Asp

Ile

1525

1530

1535

AAA ATC

TCT

CTT

TCT

TTG

ACT

CTA

CAA

GAT

GAA

AAA

ACT

ATA

AAG

TTA

4656

Lys Ile

Ser

Leu

Ser

Leu

Thr

Leu

Gin

Asp

Glu

Lys

Thr

Ile

Lys

Leu

1540

1545

1550

AAT AGT

GTG

CAT

TTA

GAT

GAA

AGT

GGA

GTA

GCT

GAG

ATT

TTG

AAG

TTC

4704

Asn Ser

Val

His

Leu

Asp

Glu

Ser

Gly

Val

Ala

Glu

Ile

Leu

Lys

Phe

1555

1560

1565

ATG AAT

AGA

AAA

GGT

AAT

ACA

AAT

ACT

TCA

GAT

TCT

TTA

ATG

AGC

TTT

4752

MeC Asn

Arg

Lys

Gly

Asn

Thr

Asn

Thr

Ser

Asp

Ser

Leu

Met

Ser

Phe

1570

1575

1580

TTA GAA

AGT

ATG

AAT

ATA

AAA

AGT

ATT

TTC

GTT

AAT

TTC

TTA

CAA

TCT

4600

Leu Glu

Ser

Met

Asn

Ile

Lys

Ser

Ile

Phe

Val

Asn

Phe

Leu

Gin

Ser

1585

1590

1595

1600

AAT ATT

AAG

TTT

ATA

TTA

GAT

GCT

AAT

TTT

ATA

ATA

AGT

GGT

ACT

ACT

4848

Asn Ile

Lys

Phe

Ile

Leu

Asp

Ala

Asn

Phe

Ile

Ile

Ser

Gly

Thr

Thr

1605

1610

1615

TCT ATT

GGC

CAA

TTT

GAG

TTT

ATT

TGT

GAT

GAA

AAT

GAT

AAT

ATA

CAA

4696

Ser Ile

Gly

Gin

Phe

Glu

Phe

Ile

cys

ASp

Glu

Asn

Asp

Asn

Ile

Gin

1620

1625

1630

CCA TAT

TTC

ATT

AAG

TTT

AAT

ACA

CTA

GAA

ACT

AAT

TAT

ACT

TTA

TAT

4944

Pro Tyr

phe

Ile

Lys

Phe

Asn

Thr

Leu

Glu

Thr

Asn

Tyr

Thr

Leu

Tyr

1635

1640

1645

GTA GGA

AAT

AGA

CAA

AAT

ATG

ATA

GTG

GAA

CCA

AAT

TAT

GAT

TTA

GAT

4992

Val Gly

Asn

Arg

Gin

Asn

Met

Ile

val

Glu

Pro

Asn

Tyr

Asp

Leu

Asp

1650

1655

1660

GAT TCT

GGA

GAT

ATA

TCT

TCA

ACT

GTT

ATC

AAT

TTC

TCT

CAA

AAG

TAT

5040

Asp Ser

Gly

Asp

Ile

Ser

Ser

Thr

Val

Ile

Asn

Phe

Ser

Gin

Lys

Tyr

1665

1670

1675

1680

CTT TAT

GGA

ATA

GAC

AGT

TGT

GTT

AAT

AAA

GTT

GTA

ATT

TCA

CCA

AAT

5088

Leu Tyr

Gly

Ile

Asp

Ser

cys

Val

Asn

Lys

Val

Val

Ile

Ser

Pro

Asn

1685

1690

1695

-218

ATT TAT ACA GAT GAA

ATA AAT ATA ACG CCT GTA TAT GAA ACA AAT AAT

5136 Ile Tyr Thr

Asp Glu 1700

Ile

Asn

Ile

Thr Pro 1705

Val Tyr Glu Thr Asn 1710

Asn

ACT TAT

CCA

GAA

GTT

ATT

GTA

TTA

GAT

GCA

AAT

TAT

ATA

AAT

GAA

AAA

5184 Thr Tyr

Pro

Glu

Val

Ile

Val

Leu

ASp

Ala

Asn

Tyr

Ile

Asn

Glu

Lys

1715

1720

1725

ATA AAT

GTT

AAT

ATC

AAT

GAT

CTA

TCT

ATA

CGA

TAT

GTA

TGG

AGT

AAT

5232 Ile Asn

Val

Asn

Ile

Asn

Asp

Leu

Ser

Ile

Arg

Tyr

Val

Trp

Ser

Asn

1730

1735

1740

GAT GGT 52 8 0

AAT

GAT

TTT

ATT

CTT

ATG

TCA

ACT

AGT

GAA

GAA

AAT

AAG

GTG

Asp Gly

Asn

Asp

Phe

Ile

Leu

Met

Ser

Thr

Ser

Glu

Glu

Asn

Lys

Val

1745

1750

1755

1760

TCA CAA

GTT

AAA

ATA

AGA

TTC

GTT

AAT

GTT

TTT

AAA

GAT

AAG

ACT

TTG

5328 Ser Gin

Val

Lys

Ile

Arg

Phe

Val

Asn

Val

Phe

Lys

Asp

Lys

Thr

Leu

1765

1770

1775

GCA AAT

AAG

CTA

TCT

TTT

AAC

TTT

AGT

GAT

AAA

CAA

GAT

GTA

CCT

GTA

5376 Ala Asn

Lys

Leu

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Asp

Lys

Gin

Asp

Val

Pro

Val

1780

1785

1790

AGT GAA

ATA

ATC

TTA

TCA

TTT

ACA

CCT

TCA

TAT

TAT

GAG

GAT

GGA

TTG

5424 Ser Glu

Ile

Ile

Leu

Ser

Phe

Thr

Pro

Ser

Tyr

Tyr

Glu

Asp

Gly

Leu

1795

1800

1805

ATT GGC 5472

TAT

GAT

TTG

GGT

CTA

GTT

TCT

TTA

TAT

AAT

GAG

AAA

TTT

TAT

Ile Gly

Tyr

Asp

Leu

Gly

Leu

Val

Ser

Leu

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

Tyr

1810

1815

1820

ATT AAT

AAC

TTT

GGA

ATG

ATG

GTA

TCT

GGA

TTA

ATA

TAT

ATT

AAT

GAT

5520 Ile Asn

Asn

Phe

Gly

Met

Met

Val

ser

Gly

Leu

Ile

Tyr

Ile

Asn

Asp

1825

1830

1835

1840

TCA TTA

TAT

TAT

TTT

AAA

CCA

CCA

GTA

AAT

AAT

TTG

ATA

ACT

GGA

TTT

5568 Ser Leu

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Pro

Pro

val

Asn

Asn

Leu

Ile

Thr

Gly

Phe

184!

1850

1B5S

GTG ACT 5616

GTA

GGC

GAT

GAT

AAA

TAC

TAC

TTT

AAT

CCA

ATT

AAT

GGT

GGA

Val Thr

Val

Gly Asp

Asp

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Ile

Asn

Gly

Gly

1860 1865 1870

GCT GCT

TCA

ATT

GGA

GAG

ACA

ATA

ATT

GAT

GAC

AAA

AAT

TAT

TAT

TTC

5664 Ala Ala

Ser Ile 1875

Gly

Glu

Thr

Ile Ile 1880

Asp

ASp

Lys

Asn Tyr 1885

Tyr

Phe

AAC CAA

AGT

GGA

GTG

TTA

CAA

ACA

GGT

GTA

TTT

AGT

ACA

GAA

GAT

GGA

5712 Asn Gin Ser 1890

Gly

Val

Leu

Gin Thr 1895

Gly

Val

Phe

Ser Thr 1900

Glu

Asp

Gly

TTT AAA

TAT

TTT

GCC

CCA

GCT

AAT

ACA

CTT

GAT

GAA

AAC

CTA

GAA

GGA

5760 Phe Lys 1905

Tyr

Phe

Ala

Pro Ala 1910

Asn

Thr

Leu

Asp Glu 1915

Asn

Leu

Glu

Gly 1920

-219CZ 296806 B6

GAA GCA 5608 Glu Ala

ATT Ile

GAT Asp

TTT ACT Phe Thr 1925

GGA Gly

AAA Lys

TTA Leu

ATT ATT Ile Ile 1930

GAC Asp

GAA Glu

AAT Asn

ATT TAT Ile Tyr 1935

TAT TTT

GAT

GAT

AAT

TAT

AGA

GGA

GCT

GTA

GAA

TGG

AAA

GAA

TTA

GAT

5856

Tyr Phe

Asp

Asp

Asn

Tyr

Arg

Gly

Ala

Val

Glu

Trp

Lys

Glu

Leu

Asp

1940

1945

1950

GGT GAA

ATG

CAC

TAT

TTT

AGC

CCA

GAA

ACA

GGT

AAA

GCT

TTT

AAA

GGT

5904

Gly Glu

Met

His

Tyr

Phe

Ser

Pro

Glu

Thr

Gly

Lys

Ala

Phe

Lys

Gly

1955

1960

1965

CTA AAT

CAA

ATA

GGT

GAT

TAT

AAA

TAC

TAT

TTC

AAT

TCT

GAT

GGA

GTT

5952

Leu Asn

Gin

Ile

Gly

Asp

Tyr

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Ser

Asp

Gly

Val

1970

1975

1980

ATG CAA

AAA

GGA

TTT

GTT

AGT

ATA

AAT

GAT

AAT

AAA

CAC

TAT

TTT

GAT

6000

Met Gin

Lys

Gly

Phe

Val

Ser

Ile

Asn

Asp

Asn

Lys

HiS

Tyr

Phe

Asp

1985

1990

1995

2000

GAT TCT

GGT

GTT

ATG

AAA

GTA

GGT

TAC

ACT

GAA

ATA

GAT

GGC

AAG

CAT

6048

Asp Ser

Gly

Val

Met

Lys

Val

Gly

Tyr

Thr

Glu

Ile

Asp

Gly

Lys

His

2005

2010

2015

TTC TAC

TTT

GCT

GAA

AAC

GGA

GAA

ATG

CAA

ATA

GGA

GTA

TTT

AAT

ACA

6096

Phe Tyr

Phe

Ala

Glu

Asn

Gly

Glu

Met

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Asn

Thr

2020

2025

2030

GAA GAT

GGA

TTT

AAA

TAT

TTT

GCT

CAT

CAT

AAT

GAA

GAT

TTA

GGA

AAT

6144

Glu Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

His

His

Asn

G1U

Asp

Leu

Gly

Asn

2035 2040 2045

GAA GAA GGT GAA GAA ATC TCA TAT TCT 6192

GGT ATA TTA AAT

TTC AAT AAT

Phe

Asn Asn

Glu Glu Gly 2050

Glu Glu

Ile

Ser Tyr 2055

Ser

Gly

Ile

Leu Asn 2060

AAA ATT 6240

TAC

TAT

TTT

GAT

GAT

TCA

TTT

ACA

GCT

GTA

GTT

GGA

TGG

AAA

Lys Ile 2065

Tyr

Tyr

Phe

Asp Asp 207 0

Ser

Phe

Thr

Ala Val 2 075

Val

Gly

Trp

Lys 2080

GAT TTA 6288

GAG

GAT

GGT

TCA

AAG

TAT

TAT

TTT

GAT

GAA

GAT

ACA

GCA

GAA

Asp Leu

Glu

Asp

Gly Ser 2085

Lys

Tyr

Tyr

Phe Asp 2090

Glu

Asp

Thr

Ala Glu 2095

GCA TAT 6336

ATA

GGT

TTG

TCA

TTA

ATA

AAT

GAT

GGT

CAA

TAT

TAT

TTT

AAT

Ala Tyr

Ile

Gly Leu 2100

Ser

Leu

Ile

Asn Asp 2105

Gly

Gin

Tyr

Tyr Phe 2110

Asn

GAT GAT 6384

GGA

ATT

ATG

CAA

GTT

GGA

TTT

GTC

ACT

ATA

AAT

GAT

AAA

GTC

Asp Asp

Gly Ile 2115

Met

Gin

Val

Gly Phe 2120

Val

Thr

Ile

Asn Asp 2125

Lys

Val

TTC TAC 6432

TTC

TCT

GAC

TCT

GGA

ATT

ATA

GAA

TCT

GGA

GTA

CAA

AAC

ATA

Phe Tyr

Phe

Ser

Asp

Ser

Gly

Ile

Ile

Glu

Ser

Gly

Val

Gin

Asn

Ile

2130 2135 2140

-220CZ 296806 B6

GAT GAC

AAT

TAT

TTC

TAT ATA

GAT

GAT

AAT

GGT ATA

GTT

CAA

ATT

GGT

6480

Asp Asp

Asn

Tyr

Phe

Tyr Ile

Asp

Asp

Asn

Gly Ile

Val

Gin

Ile

Gly

2145

2150

2155

2160

GTA TTT 652Θ Val Phe

GAT ACT TCA GAT

GGA TAT AAA TAT TTT GCA CCT GCT AAT ACT

Asp

Thr

Ser Asp 2165

Gly Tyr

Lys Tyr Phe 2170

Ala

Pro

Ala Asn Thr 2175

GTA AAT

GAT

AAT

ATT

TAC

GGA

CAA

GCA

GTT

GAA

TAT

AGT

GGT

TTA

GTT

6576

Val Asn

Asp

Asn

Ile

Tyr

Gly

Gin

Ala

Val

Glu

Tyr

Ser

Gly

Leu

Val

2180

2185

2190

AGA GTT

GGG

GAA

GAT

GTA

TAT

TAT

TTT

GGA

GAA

ACA

TAT

ACA

ATT

GAG

6624

Arg Val

Gly Glu

ASp

val

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Glu

Thr

Tyr

Thr

Ile

Glu

2195

2200

2205

ACT GGA

TGG

ATA

TAT

GAT

ATG

GAA

AAT

GAA

AGT

GAT

AAA

TAT

TAT

TTC

6672

Thr Gly

Trp

Ile

Tyr

Asp

Met

Glu

Asn

Glu

Ser

Asp

Lys

Tyr

Tyr

Phe

2210

2215

2220

AAT CCA

GAA

ACT

AAA

AAA

GCA

TGC

AAA

GGT

ATT

AAT

TTA

ATT

GAT

GAT

6720

Asn Pro

Glu

Thr

Lys

Lys

Ala

Cys

Lys

Gly

Ile

Asn

Leu

Ile

Asp

Asp

2225

2230

2235

2240

ATA AAA

TAT

TAT

TTT

GAT

GAG

AAG

GGC

ATA

ATG

AGA

ACG

GGT

CTT

ATA

6768

Ile Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys

Gly

Ile

Met

Arg

Thr

Gly

Leu

Ile

2245

2250

2255

TCA TTT

GAA

AAT

AAT

AAT

TAT

TAC

TTT

AAT

GAG

AAT

GGT

GAA

ATG

CAA

6816

Ser Phe

Glu

Asn

Asn

Asn

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Glu

Asn

Gly

Glu

Met

Gin

2260

2265

2270

TTT GGT

TAT

ATA

AAT

ATA

GAA

GAT

AAG

ATG

TTC

TAT

TTT

GGT

GAA

GAT

6864

Phe Gly

Tyr

Ile

Asn

Ile

Glu

Asp

Lys

Met

Phe

Tyr

Phe

Gly

Glu

Asp

2275

2280

2285

GGT GTC

ATG

CAG

ATT

GGA

GTA

TTT

AAT

ACA

CCA

GAT

GGA

TTT

AAA

TAC

6912

Gly Val

Met

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Asn

Thr

Pro

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

2290

2295

2300

TTT GCA

CAT

CAA

AAT

ACT

TTG

GAT

GAG

AAT

TTT

GAG

GGA

GAA

TCA

ATA

6960

Phe Ala

His

Gin

Asn

Thr

Leu

Asp

Glu

Asn

Phe

Glu

Gly

Glu

Ser

Ile

2305

2310

2315

2320

AAC TAT

ACT

GGT

TGG

TTA

GAT

TTA

GAT

GAA

AAG

AGA

TAT

TAT

TTT

ACA

7008

Asn Tyr

Thr

Gly

Trp

Leu

Asp

Leu

Asp

Glu

Lys

Arg

Tyr

Tyr

Phe

Thr

2325

2330

2335

GAT GAA

TAT

ATT

GCA

GCA

ACT

GGT

TCA

GTT

ATT

ATT

GAT

GGT

GAG

GAG

7056

Asp Glu

Tyr

Ile

Ala

Ala

Thr

Gly

Ser

Val

Ile

Ile

Asp

Gly

Glu

Glu

2340

2345

2350

TAT TAT

TTT

GAT

CCT

GAT

ACA

GCT

CAA

TTA

GTG

ATT

AGT

GAA

7098

Tyr Tyr

Phe

Asp

Pro

Asp

Thr

Ala

Gin

Leu

Val

Ile

Ser

Glu

2355

2360

2365

-221 CZ 296806 B6

TAG

7101 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:10:

(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2366 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:

Met 1

Ser Leu Val Asn 5

Arg

Lys Gin

Leu Glu Lys Met Ala Asn Val

Arg

10

15

Phe

Arg

Thr

Gin

Glu

Asp

Glu

Tyr

Val

Ala

Ile

Leu

Asp

Ala

Leu

Glu

20

25

30

Glu

Tyr

His

Asn

Met

Ser

Glu

Asn

Thr

Val

Val

Glu

Lys

Tyr

Leu

Lys

35

40

45

Leu

Lys

Asp

Ile

Asn

Ser

Leu

Thr

ASp

Ile

Tyr

ile

Asp

Thr

Tyr

Lys

50

55

60

Lys

Ser

Gly

Arg

Asn

Lys

Ala

Leu

Lys

Lys

Phe

Lys

Glu

Tyr

Leu

Val

65

70

75

80

Thr

Glu

Val

Leu

Glu

Leu

Lys

Asn

Asn

Asn

Leu

Thr

Pro

Val

Glu

Lys

85

90

95

Asn

Leu

His

Phe

Val

Trp

Ile

Gly Gly

Gin

Ile

Asn

Asp

Thr

Ala

Ile

100

105

110

Asn

Tyr

Ile

Asn

Gin

Trp

Lys

Asp

Val

Asn

Ser

Asp

Tyr

Asn

Val

Asn

115

120

125

Val

Phe

Tyr

Asp

Ser

Asn

Ala

Phe

Leu

Ile

Asn

Thr

Leu

Lys

Lys

Thr

130

135

140

Val

Val

Glu

Ser

Ala

Ile

Asn

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

Phe

Arg

Glu

Asn

145

150

155

160

Leu

Asn

Asp

Pro

Arg

Phe

Asp

Tyr

Asn

Lys

Phe

Phe

Arg

Lys

Arg

Met

165

170

175

Glu

Ile

Ile

Tyr

Asp

Lys

Gin

Lys

Asn

Phe

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Ala

180

185

190

Gin

Arg

Glu

Glu

Asn

Pro

Glu

Leu

Ile

Ile

Asp

Asp

Ile

Val

Lys

Thr

195

200

205

Tyr

Leu

Ser

Asn

Glu

Tyr

Ser

Lys

Glu

Ile

Asp

Glu

Leu

Asn

Thr

Tyr

210

215

220

Ile

Glu

Glu

Ser

Leu

Asn

Lys

Ile

Thr

Gin

Asn

Ser

Gly

Asn

Asp

Val

225

230

235

240

Arg

Asn

Phe

Glu

Glu

Phe

Lys

Asn

Gly

Glu

Ser

Phe

Asn

Leu

Tyr

Glu

245

250

255

Gin

Glu

Leu

Val

Glu

Arg

Trp

Asn

Leu

Ala

Ala

Ala

Ser

Asp

Ile

Leu

260

265

270

Arg

Ile

Ser

Ala

Leu

Lys

Glu

Ile

Gly Gly

Met

Tyr

Leu

Asp

Val

Asp

275

280

285

Met

Leu

Pro

Gly

Ile

Gin

Pro

Asp

Leu

Phe

Glu

Ser

Ile

Glu

Lys

Pro

290

295

300

-222CZ 296806 B6

Ser 305

Ser

Val

Thr

Val

Asp 310

Phe

Trp

Glu

Met

Thr 315

Lys

Leu

Glu

Ala

Ile 320

Met

Lys

Tyr

Lys

Glu 325

Tyr

Ile

Pro

Glu

Tyr 330

Thr

Ser

Glu

His

Phe 335

Asp

Met

Leu

Asp

Glu 340

Glu

Val

Gin

Ser

Ser 345

Phe

Glu

Ser

Val

Leu 350

Ala

Ser

Lys

Ser

Asp 355

Lys

Ser

Glu

Ile

Phe 360

Ser

Ser

Leu

Gly

Asp 365

Met

Glu

Ala

Ser

Pro 370

Leu

G1U

Val

Lys

Ile 375

Ala

Phe

Asn

Ser

Lys 380

Gly

Ile

Ile

Asn

Gin 385

Gly

Leu

Ile

Ser

Val 390

Lys

Asp

Ser

Tyr

Cys 395

Ser

Asn

Leu

Ile

Val 400

Lys

Gin

Ile

Glu

Asn 405

Arg

Tyr

Lys

Ile

Leu 410

Asn

Asn

Ser

Leu

Asn 415

Pro

Ala

Ile

Ser

Glu 420

Asp

Asn

Asp

Phe

Asn 425

Thr

Thr

Thr

Asn

Thr 430

Phe

Ile

Asp

Ser

Ile 435

Met

Ala

Glu

Ala

Asn 440

Ala

Asp

Asn

Gly

Arg 445

Phe

Met

Met

Glu

Leu 4S0

Gly

Lys

Tyr

Leu

Arg 455

Val

Gly

Phe

Phe

Pro <60

Asp

Val

Lys

Thr

Thr 465

Ile

Asn

Leu

Ser

Gly 470

Pro

GlU

Ala

Tyr

Ala 475

Ala

Ala

Tyr

Gin

Asp 480

Leu

Leu

Met

Phe

Lys 485

Glu

Gly

Ser

Met

Asn 490

Ile

His

Leu

Ile

Glu 495

Ala

Asp

Leu

Arg

Asn 500

Phe

G1U

Ile

Ser

Lys 505

Thr

Asn

Ile

Ser

Gin 510

Ser

Thr

Glu

Gin

Glu 515

Met

Ala

Ser

Leu

Trp 520

Ser

Phe

Asp

Asp

Ala 525

Arg

Ala

Lys

Ala

Gin 530

Phe

Glu

Glu

Tyr

Lys 535

Arg

Asn

Tyr

Phe

Glu 54 0

Gly

Ser

Leu

Gly

Glu 545

Asp

Asp

Asn

Leu

Asp 550

Phe

Ser

Gin

Asn

Ile 555

Val

Val

Asp

Lys

Glu 560

Tyr

Leu

Leu

Glu

Lys 565

Ile

Ser

Ser

Leu

Ala 570

Arg

Ser

Ser

Glu

Arg 575

Gly

Tyr

Ile

His

Tyr 580

Ile

Val

Gin

Leu

Gin 585

Gly

Asp

Lys

Ile

Ser 590

Tyr

Glu

Ala

Ala

Cys 595

Asn

Leu

Phe

Ala

Lys 600

Thr

Pro

Tyr

Asp

Ser 605

Val

Leu

Phe

Gin

Lys 610

Asn

Ile

Glu

Asp

Ser 615

G1U

Ile

Ala

Tyr

Tyr 62 0

Tyr

Asn

Pro

Gly

Asp 625

Gly

Glu

Ile

Gin

Glu 630

Ile

Asp

Lys

Tyr

Lys 635

Ile

Pro

Ser

Ile

Ile 640

Ser

Asp

Arg

Pro

Lys 645

Ile

Lys

Leu

Thr

Phe 650

Ile

Gly

His

Gly

Lys 655

Asp

-223CZ 296806 B6

Glu Phe Asn Thr

Asp

Ile

Phe Ala Gly 665

Fhe

Asp Val Asp

Ser 670

Leu Ser

660

Thr

Glu

Ile 675

Glu

Ala

Ala

Ile

Asp 680

Leu Ala

Lys

Glu

Asp 685

Ile

Ser

Pro

Lys

Ser 690

Ile

Glu

Ile

Asn

Leu 695

Leu

Gly

Cys

Asn

Met 700

Phe

Ser

Tyr

Ser

Ile 705

Asn

Val

Glu

Glu

Thr 710

Tyr

Pro

Gly

Lys

Leu 715

Leu

Leu

Lys

Val

Lys 720

Asp

Lys

Ile

Ser

Glu 725

Leu

Met

Pro

Ser

Ile 730

Ser

Gin

Asp

Ser

Ile 735

Ile

Val

Ser

Ala

Asn 740

Gin

Tyr

Glu

Val

Arg 74 5

Ile

Asn

Ser

Glu

Gly 750

Arg

Arg

Glu

Leu

Leu 755

Asp

His

Ser

Gly

Glu 760

Trp

Ile

Asn

Lys

Glu 765

Glu

Ser

Ile

Ile

Lys 770

Asp

Ile

Ser

Ser

Lys 775

Glu

Tyr

Ile

Ser

Phe 780

Asn

Pro

Lys

Glu

Asn 785

Lys

Ile

Thr

Val

Lys 790

Ser

Lys

Asn

Leu

Pro 795

Glu

Leu

Ser

Thr

Leu 800

Leu

Gin

Glu

Ile

Arg 805

Asn

Asn

Ser

Asn

Ser 810

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu 815

Glu

Glu

Lys

Val

Met B20

Leu

Thr

Glu

Cys·

Glu 825

Ile

Asn

Val

Ile

Ser 830

Asn

Ile

Asp

Thr

Gin 835

Ile

Val

Glu

Glu

Arg 840

Ile

Glu

Glu

Ala

Lys 845

Asn

Leu

Thr

Sei

Asp 850

Ser

Ile

Asn

Tyr

Ile 855

Lys

Asp

Glu

Phe

Lys 860

Leu

Ile

Glu

Ser

Ile 865

Ser

Asp

Ala

Leu

Cys 870

Asp

Leu

Lys

Gin

Gin 875

Asn

Glu

Leu

Glu

Asp 880

Ser

His

Phe

Ile

Ser 885

Phe

Glu

Asp

Ile

Ser 890

Glu

Thr

Asp

Glu

Gly 895

Phe

Ser

Ile

Arg

Phe 900

Ile

Asn

Lys

Glu

Thr 905

Gly

Glu

Ser

Ile

Phe 910

Val

Glu

Thr

Glu

Lys 915

Thr

Ile

Phe

Ser

Glu 920

Tyr

Ala

Asn

His

Ile 925

Thr

Glu

Glu

Ile

Ser 930

Lys

Ile

Lys

Gly

Thr 93S

Ile

Phe

Asp

Thr

Val 940

Asn

Gly

Lys

Leu

Val 945

Lys

Lys

Val

Asn

Leu 950

Asp

Thr

Thr

His

Glu 955

Val

Asn

Thr

Leu

Asn 960

Ala

Ala

Phe

Phe

Ile 965

Gin

ser

Leu

Ile

Glu 970

Tyr

Asn

Ser

Ser

Lys 975

Glu

Ser

Leu

Ser

Asn 900

Leu

Ser

Val

Ala

Met 985

Lys

Val

Gin

Val

Tyr 990

Ala

Gin

-224

Leu	Phe	ser 995	Thr Gly Leu	Asn	Thr Ile Thr 1000	Asp Ala	Ala Lys 1005	Val	Val
Glu	Leu	Val	Ser Thr Ala	Leu	Asp Glu Thr	Ile Asd	Leu Leu	Pro	Thr
	1010		1015	1020
Leu	Ser	Glu	Gly Leu Pro	Ile	Ile Ala Thr	Ile ile	Asp Gly	Val	Ser
1025		1030		1035			1040
Leu	Gly	Ala	Ala Ile Lys	Glu	Leu Ser Glu	Thr Ser	Asp Pro	Leu	Leu
			1045		1050		1055
Arg	Gin	Glu	Ile Glu Ala	Lys	Ile Gly Ile	Met Ala	Val Asn	Leu	Thr
			1060		1065		1070
Thr	Ala	Thr	Thr Ala Ile	Ile	Thr Ser Ser	Leu Gly	Ile Ala	Ser	Gly
		1075		1080		1085
Phe	Ser	Ile	Leu Leu Val	Pro	Leu Ala Gly	Ile Ser	Ala Gly	Ile	Pro
	1090		1095	1100
Ser	Leu	Val	Asn Asn Glu	Leu	Val Leu Arg	Asp Lys	Ala Thr	Lys	Val
1105		1110		1115			1120
Val	Asp	Tyr	Phe Lys His	Val	Ser Leu Val	Glu Thr	Glu Gly	Val	Phe
			1125		1130		1135
Thr	Leu	Leu	Asp Asp Lys	Ile	Met Met Pro	Gin Asp	Asp Leu	Val	Ile
			1140		1145		1150
Ser	Glu	Ile	Asp Phe Asn	Asn	Asn Ser Ile	Val Leu	Gly Lys	Cys	Glu
		1155		1160		1165
Ile	Trp	Arg	Met Glu Gly	Gly	Ser Gly His	Thr Val	Thr Asp	Asp	Ile
	1170		1175	1180
Asp	His	Phe	Phe Ser Ala	Pro	Ser Ile Thr	Tyr Arg	Glu Pro	His	Leu
1185		1190		1195			1200
Ser	Ile	Tyr	Asp Val Leu	Glu	Val Gin Lys	Glu Glu	Leu Asp	Leu	Ser
			1205		1210		1215
Lys	Asp	Leu	Met Val Leu	Pro	Asn Ala Pro	Asn Arg	Val Phe	Ala	Trp
			1220		1225		1230
Glu	Thr	Gly	Trp Thr Pro	Gly	Leu Arg Ser	Leu Glu	Asn Asp	Gly	Thr
		1235		1240		1245
Lys	Leu	Leu	Asp Arg Ile	Arg	Asp Asn Tyr	Glu Gly	Glu Phe	Tyr	Trp
	1250		1255	1260
Arg	Tyr	Phe	Ala Phe Ile	Ala	Asp Ala Leu	Ile Thr	Thr Leu	Lys	Pro
1265		1270		1275			1280
Arg	Tyr	Glu	Asp Thr Asn	Ile	Arg Ile Asn	Leu Asp	Ser Asn	Thr	Arg
			1285		1290		1295
Ser	Phe	Ile	Val Pro Ile	Ile	Thr Thr Glu	Tyr Ile	Arg Glu	Lys	Leu
			1300		1305		1310
Ser	Tyr	Ser	Phe Tyr Gly	Ser	Gly Gly Thr	Tyr Ala	Leu Ser	Leu	Ser
		1315		1320		1325

-225 CZ 296806 B6

Gin Tvr Asn 1330	Met	Gly Ile ASn Ile Glu Leu Ser Glu Ser	Asp	Val	Trp
1335	1340
Ile Ile Asp	Val	Asp Asn Val Val	Arg Asp Val Thr Ile	Glu	Ser	Asp
1345		1350	1355			1360
Lys Ile Lys	Lys	Gly Asp Leu Ile	Glu Gly Ile Leu Ser	Thr	Leu	Ser
		1365	13 70		1375
Ile Glu Glu	Asn	Lys Ile Ile Leu	Asn Ser His Glu Ile	Asn	Phe	Ser
	1380	13B5	1390
Gly Glu Val	Asn	Gly Ser Asn Gly	Phe Val Ser Leu Thr	Phe	Ser	Ile
1395	1400 1405
Leu Glu Gly	Ile	Asn Ala Ile Ile	Glu Val Asp Leu Leu	Ser	Lys	Ser
1410		1415	1420
Tyr Lys Leu	Leu	Ile Ser Gly Glu	Leu Lys Ile Leu Met	Leu	Asn	Ser
1425		1430	1435			1440
Asn His Ile	Gin	Gin Lys Ile Asp	Tyr Ile Gly Phe Asn	Ser	Glu	Leu
		1445	1450		1455
Gin Lys Asn	Ile	Pro Tyr Ser Phe	Val Asp Ser Glu Gly	Lys	Glu	Asn
	1460	1465	1470
Gly Phe Ile	Asn	Gly Ser Thr Lys	Glu Gly Leu Phe Val	Ser	Glu	Leu
1475	1480 1485
Pro Asp Val	Val	Leu Ile Ser Lys	Val Tyr Met Asp Asp	Ser	Lys	Pro
1490		1495	1500
Ser Phe Gly	Tyr	Tyr Ser Asn Asn	Leu Lys Asp Val Lys	Val	Ile	Thr
1505		1510	1515			1520
Lys Asp Asn	Val	Asn Ile Leu Thr	Gly Tyr Tyr Leu Lys	Asp	Asp	Ile
		1525	1530		1535
Lys Ile Ser	Leu	Ser Leu Thr Leu	Gin Asp Glu Lys Thr	Ile	Lys	Leu
	1540	1545	1550
Asn Ser Val	His	Leu Asp Glu Ser	Gly Val Ala Glu Ile	Leu	Lys	Phe
1555	1560 1565
Met Asn Arg	Lys	Gly Asn Thr Asn	Thr Ser Asp Ser Leu	Met	Ser	Phe
1570		1575	15B0
Leu Glu Ser	Met	Asn Ile Lys Ser	Ile Phe Val Asn Phe	Leu	Gin	Ser
1585		1590	1595			1600
Asn Ile Lys	Phe	Ile Leu Asp Ala	Asn Phe Ile Ile Ser	Gly	Thr	Thr
		1605	1610		1615
Ser Ile Gly	Gin	Phe Glu Phe Ile	Cys Asp Glu Asn Asp	Asn	Ile	Gin
	1620	1625	1630
Pro Tyr Phe	Ile	Lys Phe Asn Thr	Leu Glu Thr Asn Tyr	Thr	Leu	Tyr
1635	1640 1645
Val Gly Asn	Arg	Gin Asn Met Ile	Val Glu Pro Asn Tyr Asp	Leu	Asp
1650		1655	1660

-226CZ 296806 B6

Asp Ser 1665	Gly	Asp Ile Ser Ser 1670	Thr	Val	Ile	Asn Phe Ser Gin Lys Tyr
1675	1680
Leu Tyr	Gly	Ile Asp Ser Cys	Val	Asn	Lys	Val Val	Ile Ser Pro Asn
		1685			1690	1695
Ile Tyr	Thr	Asp Glu Ile Asn	Ile	Thr	Pro	Val Tyr	Glu Thr Asn Asn
		1700		1705		1710
Thr Tyr	Pro	Glu Val Ile Val	Leu	Asp	Ala	Asn Tyr	Ile Asn Glu Lys
	1715	1720			1725
Ile Asn	Val	Asn Ile Asn Asp	Leu	Ser	Ile	Arg Tyr	Val Trp Ser Asn
173 0	1735			1740
Asp Gly	Asn	Asp Phe Ile Leu	Met	Ser	Thr	Ser Glu	Glu Asn Lys Val
1745		1750				17 55	1760
Ser Gin	Val	Lys Ile Arg Phe	Val	Asn	Val	Phe Lys	Asp Lys Thr Leu
		176 5			1770	1775
Ala Asn	Lys	Leu Ser Phe Asn	Phe	Ser	Asp	Lys Gin	Asp Val Pro Val
		17B0		1785		1790
Ser Glu	Ile	Ile Leu Ser Phe	Thr	Pro	Ser	Tyr Tyr	Glu Asp Gly Leu
	1795	1B00			1805
Ile Gly	Tyr	Asp Leu Gly Leu	Val	Ser	Leu	Tyr Asn	Glu Lys Phe Tyr
íeio	1815			1820
Ile Asn	Asn	Phe Gly Met Met	Val	Ser	Gly	Leu Ile	Tyr Ile Asn Asp
1825		1B30				1835	1840
Ser Leu	Tyr	Tyr Phe Lys Pro	Pro	Val	Asn	Asn Leu	Ile Thr Gly Phe
		1845			1B50	1855
Val Thr	Val	Gly Asp Asp Lys	Tyr	Tyr	Phe	Asn Pro	Ile Asn Gly Gly
		186 0		1865		1670
Ala Ala	Ser	Ile Gly Glu Thr	Ile	Ile	Asp	Asp Lys	Asn Tyr Tyr Phe
	1675	1BB0			1885
Asn Gin	Ser	Gly Val Leu Gin	Thr	•Gly	val	Phe Ser	Thr Glu Asp Gly
1890	1895			1900
Phe Lys	Tyr	Phe Ala Pro Ala	Asn	Thr	Leu	Asp Glu	Asn Leu Glu Gly
1905		1910				1915	1920
Glu Ala	Ile	Asp Phe Thr Gly	Lys	Leu	Ile	Ile Asp	Glu Asn Ile Tyr
		1925			1930	1935
Tyr Phe	Asp	Asp Asn Tyr Arg	Gly	Ala	Val	Glu Trp	Lys Glu Leu Asp
		1940		1945		1950
Gly Glu	Met	His Tyr Phe Ser	Pro	Glu	Thr	Gly Lys	Ala Phe Lys Gly
	1955	1960			1965
Leu Asn	Gin	Ile Gly Asp Tyr	Lys	Tyr	Tyr	Phe Asn	Ser Asp Gly Val
1970	1975			1980
Met Gin	Lys	Gly Phe Val Ser	Ile	Asn	Asp	Asn Lys	His Tyr Phe Asp
1985		1990				1995	2000

-227CZ 296806 B6

Asp Ser	Gly Val	Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His
2005	2010	2015
Phe Tyr	Phe Ala	Glu Asn	Gly Glu Met Gin Ile	Gly Val Phe Asn Thr
	2020	2025	2030
Glu Asp	Gly Phe	Lys Tyr	Phe Ala His His Asn	Glu Asp Leu Gly Asn
	2035		2040	2045
Glu Glu	Gly Glu	Glu Ile	Ser Tyr Ser Gly Xle	Leu Asn Phe Asn Asn
2050		2055	2060
Lys Ile	Tyr Tyr	Phe Asp	Asp Ser Phe Thr Ala	Val Val Gly Trp Lys
2065		2070 2075 2080
Asp Leu	Glu Asp	Gly Ser	Lys Tyr Tyr Phe Asp	Glu Asp Thr Ala Glu
		2085	2090	2095
Ala Tyr	Ile Gly	Leu Ser	Leu Ile Asn Asp Gly	Gin Tyr Tyr Phe Asn
	2100	2105	2110
Asp Asp	Gly Ile	Met Gin	Val Gly Phe Val Thr	Ile Asn Asp Lys Val
	2115		2120	2125
Phe Tyr	Phe Ser	Asp Ser	Gly Ile Ile Glu Ser	Gly Val Gin Asn Ile
2130		2135	2140
Asp Asp	Asn Tyr	Phe Tyr	Ile Asp Asp Asn Gly	Ile Val Gin Ile Gly
2145		2150 2155 2160
Val Phe	Asp Thr	Ser Asp	Gly Tyr Lys Tyr Phe	Ala Pro Ala Asn Thr
		2165	2170	2175
Val Asn	Asp Asn	Ile Tyr	Gly Gin Ala Val Glu	Tyr Ser Gly Leu Val
	2180	2185	2190
Arg Val	Gly Glu	Asp Val	Tyr Tyr Phe Gly Glu	Thr Tyr Thr Ile Glu
	2195		2200	2205
Thr Gly	Trp Ile	Tyr Asp	Met Glu Asn Glu Ser	Asp Lys Tyr Tyr Phe
2210		2215	2220
Asn Pro	Glu Thr	Lys Lys	Ala Cys Lys Gly Ile	Asn Leu Ile Asp Asp.
2225		2230 2235 2240
Ile Lys	Tyr Tyr	Phe Asp	Glu Lys Gly Ile Met	Arg Thr Gly Leu Ile
		2245	2250	2255
Ser Phe	Glu Asn	Asn Asn	Tyr Tyr Phe Asn Glu	Asn Gly Glu Met Gin
	2260	2265	2270
Phe Gly	Tyr Ile	Asn Ile	Glu Asp Lys Met Phe	Tyr Phe Gly Glu Asp
	2275		2280	2285
Gly val	Met Gin	Ile Gly	Val Phe Asn Thr Pro	Asp Gly Phe Lys Tyr
2290		2295	2300
Phe Ala	His Gin	Asn Thr	Leu Asp Glu Asn Phe	Glu Gly Glu Ser Ile
2305		2310 2315 2320
Asn Tyr	Thr Gly	Trp Leu	Asp Leu Asp Glu Lys	Arg Tyr Tyr Phe Thr
		2325	2330	2335

-228 CZ 296806 B6

Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu 2340 2345 2350

Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gin Leu Val Ile Ser Glu 2355 2360 (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (Xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

TAGAAAAAAT GGCAAATGT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:

TTTCATCTTG TAGAGTCAAA G (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

GATGCCACAA GATGATTTAG TG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

CTAATTGAGC TGTATCAGGA TC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-229CZ 296806 B6 (A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:

CGGAATTCCT AGAAAAAATG GCAAATG (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 páru bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:

GCTCTAGAAT GACCATAAGC TAGCCA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA; 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:

CGGAATTCGA GTTGGTAGAA AGGTGGA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:

CGGAATTCGG TTATTATCTT AAGGATG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová)

-230CZ 296806 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:

CGGAATTCTT GATAACTGGA TTTGTGAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 511 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý

ÍD) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein

(Xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20:

Leu

Ile

Thr

Gly

Phe

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Asp

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Pro

Ile

Asn

Gly

Gly

Ala

Ala

Ser

Ile

Gly

Glu

Thr

Ile

Ile

Asp

Asp

20

25

30

Lys

Asn

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Gin

Ser

Gly

Val

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Phe

35

40

45

Ser

Thr

Glu

Asp

cly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Leu

Asp

50

55

60

Glu

Asn

Leu

Glu

Gly

Glu

Ala

Ile

Asp

Phe

Thr

Gly

Lys

Leu

Ile

Ile

65

70

75

80

Asp

Glu

Asn

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asp

Asn

Tyr

Arg

Gly

Ala

Val

Glu

85

90

95

Trp

Lys

Glu

Leu

Asp

Gly

Glu

Met

His

Tyr

Phe

Ser

Pro

Glu

Thr

Gly

100

105

110

Lys

Ala

Phe

Lys

Gly

Leu

Asn

Gin

Ile

Gly

Asp

Tyr

Lys

Tyr

Tyr

Phe

115

120

125

Asn

Ser

Asp

Gly

Val

Met

Gin

Lys

Gly

Phe

Val

Ser

Ile

Asn

Asp

Asn

130

135

140

Lys

His

Tyr

Phe

Asp

Asp

Ser

Gly

Val

Met

Lys

Val

Gly

Tyr

Thr

Glu

14S

150

155

160

Ile

Asp

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

Ala

Glu

Asn

Gly

Glu

Met

Gin

Ile

165

170

175

Gly

Val

Phe

Asn

Thr

Glu

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

His

His

Asn

180

185

190

Glu

Asp

Leu

Gly

Asn

Glu

Glu

Gly

Glu

Glu

Ile

Ser

Tyr

Ser

Gly

Ile

195

200

205

Leu

Asn

Phe

Asn

Asn

Lys

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asp

Ser

Phe

Thr

Ala

210

215

220

Val

Val

Gly

Trp

Lys

Asp

Leu

Glu

Asp

Gly

Ser

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

225

230

235

240

-231 CZ 296806 B6

Glu

Asp Thr Ala

G1U 245

Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu Ile Asn Asp Gly

250

255

Gin

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Asp

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

Val

Gly

Phe

Val

Thr

260

265

270

Ile

Asn

Asp

Lys

Val

Phe

Tyr

Phe

Ser

Asp

Ser

Gly

Ile

Ile

Glu

Ser

275

280

285

Gly

Val

Gin

Asn

Ile

Asp

Asp

Asn

Tyr

Phe

Tyr

Ile

Asp

Asp

Asn

Gly

290

295

300

Ile

Val

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Asp

Thr

Ser

Asp

Gly

Tyr

Lys

Tyr

Phe

305

310

315

320

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Val

Asn

Asp

Asn

Ile

Tyr

Gly

Gin

Ala

Val

Glu

325

330

335

Tyr

Ser

Gly

Leu

Val

Arg

Val

Gly

Glu

Asp

Val

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Glu

340

345

350

Thr

Tyr

Thr

Ile

Glu

Thr

Gly

Trp

Ile

Tyr

ASp

Met

Glu

Asn

Glu

Ser

355

360

365

Asp

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Glu

Thr

Lys

Lys

Ala

Cys

Lys

Gly

Ile

370

375

380

Asn

Leu

Ile

Asp

Asp

Ile

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys

Glv

Ile

Met

385

390

395

400

Arg

Thr

Gly

Leu

Ile

Ser

Phe

Glu

Asn

Asn

Asn

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Glu

405

410

415

Asn

Gly

Glu

Met

Gin

Phe

Gly

Tyr

Ile

Asn

Ile

Glu

Asp

Lys

Met

Phe

420

425

430

Tyr

Phe

Gly

Glu

Asp

Gly

Val

Met

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Asn

Thr

Pro

435

440

445

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

His

Gin

Asn

Thr

Leu

Asp

Glu

Asn

Phe

450

455

460

Glu

Gly

Glu

Ser

Ile

Asn

Tyr

Thr

Gly

Trp

Leu

Asp

Leu

Asp

Glu

Lys

465

470

475

480

Arg

Tyr

Tyr

Phe

Thr

Asp

Glu

Tyr

Ile

Ala

Ala

Thr

Gly

Ser

Val

Ile

485

490

4 9S

Ile

Asp

Gly

Glu

Glu

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Pro

Asp

Thr

Ala

Gin

Leu

500

505

510

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:21;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 608 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein

-232CZ 296806 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

Ser Glu Glu Asn Lys

Val Ser Gin

Val Lys 10

Ile

Arg Phe Val

Asn 15

Val

1

5

Phe

Lys

Asp

Lys

Thr

Leu

Ala

Asn

Lys

Leu

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Asp

20

25

30

Lys

Gin

Asp

Val

Pro

Val

Ser

Glu

Ile

Ile

Leu

Ser

Phe

Thr

Pro

Ser

35

40

45

Tyr

Tyr

Glu

Asp

Gly

Leu

Ile

Gly

Tyr

Asp

Leu

Gly

Leu

Val

Ser

Leu

50

55

60

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

Tyr

Ile

Asn

Asn

Phe

Gly

Met

Met

Val

Ser

Gly

65

70

75

80

Leu

Ile

Tyr

Ile

Asn

Asp

Ser

Leu

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Pro

Pro

Val

Asn

8 5

90

95

Asn

Leu

Ile

Thr

Gly

Phe

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Asp

Lys

Tyr

Tyr

Phe

100

105

110

Asn

Pro

Ile

Asn

Gly

Gly

Ala

Ala

Sér

Ile

Gly

Glu

Thr

Ile

Ile

Asp

115

120

125

Asp

Lys

Asn

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Gin

Ser

Gly

Val

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

130

135

14 0

Phe

Ser

Thr

Glu

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Leu

145

150

155

160

Asp

Glu

Asn

Leu

Glu

Gly

Glu

Ala

Ile

Asp

Phe

Thr

Gly

Lys

Leu

Ile

165

170

175

Ile

Asp

Glu

Asn

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asp

Asn

Tyr

Arg

Gly

Ala

Val

180

185

190

Glu

Trp

Lys

Glu

Leu

Asp

Gly

Glu

Met

His

Tyr

Phe

Ser

Pro

Glu

Thr

195

200

205

Gly

Lys

Ala

Phe

Lys

Gly

Leu

Asn

Gin

Ile

Gly

Asp

Tyr

Lys

Tyr

Tyr

210

215

220

Phe

Asn

Ser

Asp

Gly

Val

Met

Gin

Lys

Gly

Phe

Val

Ser

Ile

Asn

Asp

225

230

235

240

Asn

Lys

His

Tyr

Phe

Asp

Asp

Ser

Gly

Val

Met

Lys

Val

Gly

Tyr

Thr

245

250

255

Glu

Ile

Asp

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

Ala

Glu

Asn

Gly

Glu

Met

Gin

260

265

270

Ile

Gly

Val

Phe

Asn

Thr

Glu

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

His

His

275

280

285

Asn

Glu

Asp

Leu

Gly

Asn

Glu

Glu

Gly

Glu

Glu

Ile

Ser

Tyr

Ser

Gly

290

295

300

Ile

Leu

Asn

Phe

Asn

Asn

Lys

lle

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asp

Ser

Phe

Thr

305

310

315

320

Ala

Val

Val

Gly

Trp

Lys

Asp

Leu

Glu

Asp

Gly

Ser

Lys

Tyr

Tyr

Phe

325

330

335

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Glu

Ala

Tyr

Ile

Gly

Leu

Ser

Leu

Ile

Asn

Asp

340

345

350

Gly

Gin

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Asp

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

Val

Gly

Phe

Val

355

360

365

-233 CZ 296806 B6

Thr	Ile 370	Asn	Asp	Lys	Val	Phe 375	Tyr
Ser 385	Gly	Val	Gin	Asn	Ile 390	Asp	Asp
Gly	Ile	Val	Gin	Ile 405	Gly	Val	Phe
Phe	Ala	Pro	Ala 420	Asn	Thr	Val	Asn
Glu	Tyr	Ser 435	Gly	Leu	Val	Arg	Val 440
Glu	Thr 450	Tyr	Thr	Ile	Glu	Thr 45 5	Gly
Ser 465	Asp	Lys	Tyr	Tyr	Phe 470	Asn	Pro
Ile	Asn	Leu	Ile	Asp 485	Asp	Ile	Lys
Met	Arg	Thr	Glv 500	Leu	Ile	Ser	Phe
Glu	Asn	Gly 515	Glu	Met	Gin	Phe	Gly 520
Phe	Tyr 530	Phe	Gly	Glu	Asp	Gly 535	Val
Pro 545	Asp	Gly	Phe	Lys	Tyr 550	Phe	Ala
Phe	Glu	Gly	Glu	Ser 565	Ile	Asn	Tyr
Lys	Arg	Tyr	Tyr 580	Phe	Thr	Asp	Glu
Ile	Ile	Asp 595	Gly	Glu	Glu	Tyr	Tyr 600

Phe	Ser	Asp	Ser 380	Gly	Ile	Ile	Glu
Asn	Tyr	Phe 395	Tyr	Ile	Asp	Asp	Asn 400
Asp	Thr 410	Ser	Asp	Gly	Tyr	Lys 415	Tyr
Asp 425	Asn	Ile	Tyr	Gly	Gin 430	Ala	Val
Gly	Glu	Asp	Val	Tyr 445	Tyr	Phe	Gly
Trp	Ile	Tyr	Asp 460	Met	Glu	Asn	Glu
Glu	Thr	Lys 475	Lys	Ala	Cys	Lys	Gly 480
Tyr	Tyr 490	Phe	Asp	Glu	Lys	Gly 4 95	Ile
Glu 505	Asn	Asn	Asn	Tyr	Tyr 510	Phe	Asn
Tyr	Ile	Asn	Ile	Glu 525	Asp	Lys	Met
Met	Gin	Ile	Gly 540	Val	Phe	Asn	Thr
His	Gin	Asn 555	Thr	Leu	Asp	Glu	Asn 560
Thr	Gly 570	Trp	Leu	Asp	Leu	Asp 575	Glu
Tyr 585	Ile	Ala	Ala	Thr	Gly 590	Ser	Val
Phe	Asp	Pro	Asp	Thr 605	Ala	Gin	Leu

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1330 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..1314

(xi) POPIS

1 SEKVENCE:

SEQ

ID NO:22:

ATG

GCT

CGT

CTG

CTG

TCT

ACC

TTC

ACT

GAA

TAC

ATC

AAG

AAC

ATC

ATC

48

Met

Ala

Arg

Leu

Leu

Ser

Thr

Phe

Thr

Glu

Tyr

Ile

Lys

Asn

Ile

Ile

1

5

10

15

AAT

ACC

TCC

ATC

CTG

AAC

CTG

CGC

TAC

GAA

TCC

AAT

CAC

CTG

ATC

GAC

96 Asn

Thr

Ser

Ile

Leu

Asn

Leu

Arg

Tyr

Glu

Ser

Asn

His

Leu

Ile

Asp

20

25

30

-234CZ 296806 B6

CTG TCT CGC TAC 144

Leu Ser Arg Tyr 35

GAT CCG ATC GAC 192

Asp Pro Ile Asp 50

AAA ATC GAA GTT 240

Lys Ile Glu Val 65

GAA AAC TTC TCC

280

Glu Asn Phe Ser

TCC ATC TCT CTG

336

Ser Ile Ser Leu

100

AAT TCT GGT TGG

384

Asn Ser Gly Trp

115

CTG CAG GAC ACT

432

Leu Gin Asp Thr 13 0

CAG ATG ATC AAC 4B0

Gin Met Ile Asn

145

ATC ACC AAC AAT

528

Ile Thr Asn Asn

CTG ATC GAC CAG 576

Leu Ile Asp Gin

180

AAT AAC ATC ATG

624

Asn Asn Ile Met

195

ATC TGG ATC AAA

672

Ile Trp Ile Lys

210

GAA ATC AAA GAC

720

Glu Ile Lys Asp

225

GAC TTC TGG GGT

768

Asp Phe Trp Gly

GCT TCC AAA ATC

Ala Ser Lys Ile

AAG AAT CAG ATC

Lys Asn Gin Ile

ATC CTG AAG AAT

Ile Leu Lys Asn

ACC TCC TTC TGG

Thr Ser Phe Trp 85

AAC AAT GAA TAC

Asn Asn Glu Tyr

AAA GTA TCT CTG

Lys Val Ser Leu

120

CAG GAA ATC AAA

Gin Glu Ile Lys

135

ATC TCT GAC TAC

Ile Ser Asp Tyr

150

CGT CTG AAT AAC

Arg Leu Asn Asn

165

AAA CCG ATC TCC

Lys Pro Ile Ser

TTC AAA CTG GAC

Phe Lys Leu Asp

200

TAC TTC AAT CTG

Tyr Phe Asn Leu

215

CTG TAC GAC AAC

Leu Tyr Asp Asn

230

GAC TAC CTG CAG

Asp Tyr Leu Gin

245

AAC ATC GGT TCT

Asn Ile Gly Ser

CAG CTG TTC AAT

Gin Leu Phe Asn

GCT ATC GTA TAC

Ala Ile Val Tyr

ATC CGT ATC CCG

Ile Arg Ile Pro

ACC ATC ATC AAC

Thr Ile Ile Asn

105

AAC TAC GGT GAA

Asn Tyr Gly Glu

CAG CGT GTT GTA

Gin Arg Val Val

140

ATC AAT CGC TGG

Ile Asn Arg Trp ¹⁵⁵

TCC AAA ATC TAC

Ser Lvs Ile Tyr

170

AAT CTG GGT AAC

Asn Leu Gly Asn

185

GGT TGT CGT GAC

Gly Cys Arg Asp

TTC GAC AAA GAA

Phe Asp Lys Glu

220

CAG TCC AAT TCT

Gin Ser Asn Ser

235

TAC GAC AAA CCG

Tyr Asp Lys Pro

250

AAA GTT AAC TTC

Lys Val Asn Phe 45

CTG GAA TCT TCC

Leu Glu Ser Ser

AAC TCT ATG TAC

Asn Ser Met Tyr

AAA TAC TTC AAC

Lys Tyr Phe Asn

TGC ATG GAA AAC

Cys Met Glu Asn

110

ATC ATC TGG ACT

Ile Ile Trp Thr

125

TTC AAA TAC TCT

Phe Lys Tyr Ser

ATC TTC GTT ACC

Ile Phe Val Thr

160

ATC AAC GGC CGT

Ile Asn Glv Arg 17*5

ATC CAC GCT TCT

Ile His Ala Ser

190

ACT CAC CGC TAC

Thr His Arg Tyr

205

CTG AAC GAA AAA

Leu Asn Glu Lys

GGT ATC CTG AAA

Gly Ile Leu Lys

240

TAC TAC ATG CTG

Tyr Tyr Met Leu

255

-235 CZ 296806 B6

AAT CTG 816

TAC GAT

CCG Pro

AAC AAA TAC GTT GAC GTC AAC AAT GTA GGT ATC

Tyr

Asp 260

Asn

Leu

Asn Lys

Tyr

Val Asp Val Asn Asn Val

Gly Ile

265

270

CGC

GGT

TAC

ATG

TAC

CTG

AAA

GGT

CCG

CGT

GGT

TCT

GTT

ATG

ACT

ACC

864

Arg

Gly

Tyr

Met

Tyr

Leu

Lys

Gly

Pro

Arg

Gly

ser

Val

Met

Thr

Thr

275

280

285

AAC

ATC

TAC

CTG

AAC

TCT

TCC

CTG

TAC

CGT

GGT

ACC

AAA

TTC

ATC

ATC

912

Asn

Ile

Tyr

Leu

Asn

Ser

Ser

Leu

Tyr

Arg

Gly

Thr

Lys

Phe

Ile

Ile

290

295

300

AAG

AAA

TAC

GCG

TCT

GGT

AAC

AAG

GAC

AAT

ATC

GTT

CGC

AAC

AAT

GAT

960

Lys

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gly

Asn

Lys

Asp

Asn

Ile

Val

Arg

Asn

Asn

Asp

305

310

315

320

CGT

GTA

TAC

ATC

AAT

GTT

GTA

GTT

AAG

AAC

AAA

GAA

TAC

CGT

CTG

GCT

1008

Arg Val

Tyr

Ile

Asn 325

Val

Val

Val

Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu

Ala

330

335

ACC AAT 1056

GCT

TCT

CAG

GCT

GGT

GTA

GAA

AAG

ATC

TTG

TCT

GCT

CTG

GAA

Thr Asn

Ala

Ser 340

Gin

Ala

Gly

val

Glu 345

Lys

ile

Leu

Ser

Ala 350

Leu

Glu

ATC CCG 1104

GAC

GTT

GGT

AAT

CTG

TCT

CAG

GTA

GTT

GTA

ATG

AAA

TCC

AAG

Ile Pro

Asp 355

Val

Gly

Asn

Leu

Ser 360

Gin

Val

Val

Val

Met 365

Lys

Ser

Lys

AAC GAC 1152

CAG

GGT

ATC

ACT

AAC

AAA

TGC

AAA

ATG

AAT

CTG

CAG

GAC

AAC

Asn Asp 370

Gin

Gly

Ile

Thr

Asn 375

Lys

Cys

Lys

Met

Asn 380

Leu

Gin

ASp

Asn

AAT GGT 12C0

AAC

GAT

ATC

GGT

TTC

ATC

GGT

TTC

CAC

CAG

TTC

AAC

AAT

ATC

Asn Gly 385

Asn

Asp

Ile

Gly 390

Phe

Ile

Gly

Phe

His 395

Gin

Phe

Asn

Asn

Ile 400

GCT AAA 1248

CTG

GTT

GCT

TCC

AAC

TGG

TAC

AAT

CGT

CAG

ATC

GAA

CGT

TCC

Ala Lys

Leu

Val

Ala 405

Ser

Asn

Trp

Tyr

Asn 410

Arg

Gin

Ile

Glu

Arg 415

Ser

TCT CGC 1296

ACT

CTG

GGT

TGC

TCT

TGG

GAG

TTC

ATC

CCG

GTT

GAT

GAC

GGT

Ser Arg

Thr

Leu

Gly

Cys

Ser

Trp

Glu

Phe

Ile

Pro

Val

Asp

Asp

Gly

420 425 430

TGG GGT GAA CGT CCG CTG TAACCCGGGA AAGCTT 1330

Trp Gly Glu Arg Pro Leu

435 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:23;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 438 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:

-236CZ 296806 B6

Met Ala Arg Leu Leu Ser Thr

Phe Thr

Glu 10

Tyr Ile Lys

Asn

Ile 15

Ile

1

5

Asn

Thr

Ser

Ile 20

Leu

Asn

Leu

Arg

Tyr 25

Glu

Ser

Asn

His

Leu 30

Ile

Asp

Leu

Ser

Arg 35

Tyr

Ala

Ser

Lys

Ile 40

Asn

Ile

Gly

Ser

Lys 45

Val

Asn

Phe

Asp

Pro 50

Ile

Asp

Lys

Asn

Gin 55

Ile

Gin

Leu

Phe

Asn 60

Leu

Glu

Ser

Ser

Lys 65

Ile

Glu

Val

Ile

Leu 70

Lys

Asn

Ala

Ile

Val 75

Tyr

Asn

Ser

Met

Tyr 80

Glu

Asn

Phe

Ser

Thr 85

Ser

Phe

Trp

Ile

Arg 90

Ile

Pro

Lys

Tyr

Phe 95

Asn

Ser

Ile

Ser

Leu 100

Asn

Asn

Glu

Tyr

Thr 105

Ile

Ile

Asn

Cys

Met 110

Glu

Asn

Asn

Ser

Gly 11S

Trp

Lys

Val

Ser

Leu 12 0

Asn

Tyr

Gly

Glu

Ile 125

Ile

Trp

Thr

Leu

Gin 130

Asp

Thr

Gin

Glu

Ile 135

Lys

Gin

Arg

Val

Val 140

Phe

Lys

Tyr

Ser

Gin 145

Met

Ile

Asn

Ile

Ser 150

Asp

Tyr

Ile

Asn

Arg 155

Trp

Ile

Phe

val

Thr 160

Ile

Thr

Asn

Asn

Arg 165

Leu

Asn

Asn

Ser

Lys 170

Ile

Tyr

Ile

Asn

Gly 175

Arg

Leu

Ile

Asp

Gin 180

Lys

Pro

Ile

Ser

Asn 1B5

Leu

Gly

Asn

Ile

His 190

Ala

Ser

Asn

Asn

Ile 195

Met

Phe

Lys

Leu

Asp 200

Gly

Cys

Arg

Asp

Thr 205

His

Arg

Tyr

Ile

Trp 210

Ile

Lys

Tyr

Phe

Asn 215

Leu

Phe

Asp

Lys

Glu 220

Leu

Asn

Glu

Lys

Glu 225

Ile

Lys

Asp

Leu

Tyr 230

Asp

Asn

Gin

Ser

Asn 235

Ser

Gly

Ile

Leu

Lys 240

Asp

Phe

Trp

Gly

Asp 245

Tyr

Leu

Gin

Tyr

Asp 250

Lys

Pro

Tyr

Tyr

Met 255

Leu

Asn

Leu

Tyr

Asp 260

Pro

Asn

Lys

Tyr

Val 265

Asp

Val

Asn

Asn

Val 270

Gly

Ile

Arg

Gly

Tyr 275

Met

Tyr

Leu

Lys

Gly 280

Pro

Arg

Gly

Ser

Val 285

Met

Thr

Thr

Asn

Ile 290

Tyr

Leu

Asn

Ser

Ser 295

Leu

Tyr

Arg

Gly

Thr 300

Lys

Phe

Ile

Ile

Lys 305

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gly 310

Asn

Lys

Asp

Asn

Ile 315

Val

Arg

Asn

Asn

Asp 320

Arg

Val

Tyr

Ile

Asn 325

Val

Val

Val

Lys

Asn 330

Lys

Glu

Tyr

Arg

Leu 335

Ala

Thr

Asn

Ala

Ser 340

Gin

Ala

Gly

Val

Glu 345

Lys

Ile

Leu

Ser

Ala 350

Leu

Glu

Ile

Pro

Asp 355

Val

Gly

Asn

Leu

Ser 360

Gin

Val

Val

Val

Met 365

Lys

Ser

Lys

Asn

Asp

Gin

Gly

Ile

Thr

Asn

Lys

Cys

Lys

Met

Asn

Leu

Gin

Asp

Asn

-237CZ 296806 B6

370 37S 380

Asn 3Θ5

Gly

Asn

Asp

Ile

Gly 390

Phe

Ile

Gly

Phe

His 395

Gin

Phe

Asn

Asn

Ile 400

Ala

Lys

Leu

Val

Ala 405

Ser

Asn

Trp

Tyr

Asn 410

Atg

Gin

Ile

Glu

Arg 415

Ser

Ser

Arg

Thr

Leu 420

Gly

Cys

Ser

Trp

Glu 425

Phe

Ile

Pro

Val

Asp 430

Asp

Gly

Trp

Gly

Glu

Arg

Pro

Leu

435 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 15 10 15

Ile Glu Gly Arg His Met Ala (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1402 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..1386 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:

ATG 48 Met 1

GGC Gly

CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT

CAT CAT CAC

AGC AGC GGC

CAT His

His

His

His 5

His

His

His

His

His 10

His His

Ser

Ser

Gly 15

ATC 96

GAA

GGT

CGT

CAT

ATG

GCT

AGC

ATG

GCT

CGT

CTG

CTG

TCT

ACC

TTC

Ile

Glu

Gly

Arg 20

His

Met

Ala

Ser

Met 25

Ala

Arg

Leu

Leu

Ser 30

Thr

Phe

ACT 144

GAA

TAC

ATC

AAG

AAC

ATC

ATC

AAT

ACC

TCC

ATC

CTG

AAC

CTG

CGC

Thr

Glu

Tyr 35

Ile

Lys

Asn

Ile

Ile 40

Asn

Thr

ser

Ile

Leu 4Ξ

Asn

Leu

Arg

TAC 192

GAA

TCC

AAT

CAC

CTG

ATC

GAC

CTG

TCT

CGC

TAC

GCT

TCC

AAA

ATC

Tyr

Glu 50

Ser

Asn

His

Leu

Ile 55

Asp

Leu

Ser

Arg

Tyr 60

Ala

Ser

Lys

Ile

AAC 240

ATC

GGT

TCT

AAA

GTT

AAC

TTC

GAT

CCG

ATC

GAC

AAG

AAT

CAG

ATC

-238 CZ 296806 B6

Asn 65

Ile

Gly Ser

Lys

Val 70

Asn

Phe

Asp

Pro

Ile 75

Asp

Lys

Asn

Gin

Ile 80

CAG 288

CTG

TTC

AAT

CTG

GAA

TCT

TCC

AAA

ATC

GAA

GTT

ATC

CTG

AAG

AAT

Gin

Leu

Phe

Asn

Leu 85

Glu

Ser

Ser

Lys

Ile 90

Glu

Val

Ile

Leu

Lys 95

Asn

GCT 336

ATC

GTA

TAC

AAC

TCT

ATG

TAC

GAA

AAC

TTC

TCC

ACC

TCC

TTC

TGG

Ala

Ile

Val

Tyr 100

Asn

Ser

Met

Tyr

Glu 105

Asn

Phe

Ser

Thr

Ser 110

Phe

Trp

ATC 384

CGT

ATC

CCG

AAA

TAC

TTC

AAC

TCC

ATC

TCT

CTG

AAC

AAT

GAA

TAC

Ile

Arg

Ile 115

Pro

Lys

Tyr

Phe

Asn 120

Ser

Ile

Ser

Leu

Asn 125

Asn

Glu

Tyr

ACC 432

ATC

ATC

AAC

TGC

ATG

GAA

AAC

AAT

TCT

GGT

TGG

AAA

GTA

TCT

CTG

Thr

Ile 130

Ile

Asn

Cys

Met

Glu 135

Asn

Asn

Ser

Gly

Trp 140

Lys

Val

Ser

Leu

AAC 480

TAC

GGT

GAA

ATC

ATC

TGG

ACT

CTG

CAG

GAC

ACT

CAG

GAA

ATC

AAA

Asn 145

Tyr

Gly

Glu

Ile

Ile 150

Trp

Thr

Leu

Gin

Asp 155

Thr

Gin

Glu

Ile

Lys 160

CAG 528

CGT

GTT

GTA

TTC

AAA

TAC

TCT

CAG

ATG

ATC

AAC

ATC

TCT

GAC

TAC

Gin

Arg

Val

Val

Phe 165

Lys

Tyr

Ser

Gin

Met 170

Ile

Asn

Ile

Ser

Asp 175

Tyr

ATC 576

AAT

CGC

TGG

ATC

TTC

GTT

ACC

ATC

ACC

AAC

AAT

CGT

CTG

AAT

AAC

Ile

Asn

Arg

Trp 180

Ile

Phe

Val

Thr

ile 185

Thr

Asn

Asn

Arg

Leu 190

Asn

Asn

TCC 624

AAA

ATC

TAC

ATC

AAC

GGC

CGT

CTG

ATC

GAC

CAG

AAA

CCG

ATC

TCC

Ser

Lys

Ile 195

Tyt

Ile

Asn

Gly

Arg 200

Leu

Ile

Asp

Gin

Lys 205

Pro

Ile

Ser

AAT 672

CTG

GGT

AAC

ATC

CAC

GCT

TCT

AAT

AAC

ATC

ATG

TTC

AAA

CTG

GAC

Asn

Leu 210

Gly

Asn

Ile

His

Ala 215

Ser

Asn

Asn

Ile

Met 220

Phe

Lys

Leu

Asp

GGT 720

TGT

CGT

GAC

ACT

CAC

CGC

TAC

ATC

TGG

ATC

AAA

TAC

TTC

AAT

CTG

Gly 225

Cys

Arg

Asp

Thr

His 230

Arg

Tyr

Ile

Trp

Ile 235

Lys

Tyr

Phe

Asn

Leu 240

TTC 768

GAC

AAA

GAA

CTG

AAC

GAA

AAA

GAA

ATC

AAA

GAC

CTG

TAC

GAC

AAC

Phe

Asp

Lys

Glu

Leu 245

Asn

Glu

Lys

Glu

Ile 250

Lys

Asp

Leu

Tyr

Asp 255

Asn

CAG 816

TCC

AAT

TCT

GGT

ATC

CTG

AAA

GAC

TTC

TGG

GGT

GAC

TAC

CTG

CAG

Gin

Ser

Asn

Ser 260

Gly

Ile

Leu

Lys

Asp 265

Phe

Trp

Gly

Asp

Tyr 270

Leu

Gin

TAC

GAC

AAA

CCG

TAC

TAC

ATG

CTG

AAT

CTG

TAC

GAT

CCG

AAC

AAA

TAC

864 Tyr

Asp

Lys 275

Pro

Tyr

Tyr

Met

Leu 280

Asn

Leu

Tyr

Asp

Pro 285

Asn

Lys

Tyr

GTT

GAC

GTC

AAC

AAT

GTA

GGT

ATC

CGC

GGT

TAC

ATG

TAC

CTG

AAA

GGT

912

-239CZ 296806 B6

Val

Asp 290

Val Asn

Asn

Val

Gly Ile Arg Gly Tyr Met

Tyr

Leu

Lys

Gly

295

300

CCG

CGT

GGT

TCT

GTT

ATG

ACT

ACC

AAC

ATC

TAC

CTG

AAC

TCT

TCC

CTG

960

Pro

Arg

Gly

Ser

Val

Met

Thr

Thr

Asn

Ile

Tyr

Leu

Asn

Ser

Ser

Leu

305

310

315

320

TAC

CGT

GGT

ACC

AAA

TTC

ATC

ATC

AAG

AAA

TAC

GCG

TCT

GGT

AAC

aag

100Θ

Tyr

Arg

Gly

Thr

Lys

Phe

Ile

Ile

Lys

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gly

Asn

Lys

325

330

335

GAC

AAT

ATC

GTT

CGC

AAC

AAT

GAT

CGT

GTA

TAC

ATC

AAT

GTT

GTA

GTT

1056

Asp

Asn

Ile

Val

Arg

Asn

Asn

Asp

Arg

val

Tyr

Ile

Asn

Val

Val

Val

340

345

350

AAG

AAC

AAA

GAA

TAC

CGT

CTG

GCT

ACC

AAT

GCT

TCT

CAG

GCT

GGT

GTA

1104

Lys

Asn

Lys

Glu

Tyr

Arg

Leu

Ala

Thr

Asn

Ala

Ser

Gin

Ala Gly

Val

355

360

365

GAA

AAG

ATC

TTG

TCT

GCT

CTG

GAA

ATC

CCG

GAC

GTT

GGT

AAT

CTG

TCT

1152

Glu

Lys

Ile

Leu

Ser

Ala

Leu

Glu

Ile

Pro

Asp

Val

Gly

Asn

Leu

Ser

370

375

380

CAG

GTA

GTT

GTA

ATG

AAA

TCC

AAG'

AAC

GAC

CAG

GGT

ATC

ACT

AAC

AAA

1200

Gin

Val

Val

Val

Met

Lys

Ser

Lys

Asn

Asp

Gin

Gly

Ile

Thr

Asn

Lys

385

390

395

400

TGC

AAA

ATG

AAT

CTG

CAG

GAC

AAC

AAT

GGT

AAC

GAT

ATC

GGT

TTC

ATC

1248

Cys

Lys

Met

Asn

Leu

Gin

Asp

Asn

Asn

Gly

Asn

Asp

Ile

Gly

Phe

Ile

405

410

415

GGT

TTC

CAC

CAG

TTC

AAC

AAT

ATC

GCT

AAA

CTG

GTT

GCT

TCC

AAC

TGG

1296

Gly

Phe

His

Gin

Phe

Asn

Asn

Ile

Ala

Lys

Leu

Val

Ala

Ser

Asn

Trp

420

425

430

TAC

AAT

CGT

CAG

ATC

GAA

CGT

TCC

TCT

CGC

ACT

CTG

GGT

TGC

TCT

TGG

1344

Tyr

Asn

Arg

Gin

Ile

Glu

Arg

Ser

Ser

Arg

Thr

Leu

Gly

Cys

Ser

Trp

435

440

445

GAG

TTC

ATC

CCG

GTT

GAT

GAC

GGT

TGG

GGT

GAA

CGT

CCG

CTG

1386

Glu

Phe

Ile

Pro

Val

Asp

Asp

Gly

Trp

Gly

Glu

Arg

Pro

Leu

450 4S5 460

TAACCCGGGA AAGCTT

1402 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 462 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:

Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His š 10 15

-240CZ 296806 B6

Ile

Glu Gly Arg 20

His Met Ala

Ser Met Ala Arg 25

Leu

Leu Ser 30

Thr

Phe

Thr

Glu

Tyr

Ile

Lys

Asn

Ile

Ile

Asn

Thr

Ser

Ile

Leu

ASn

Leu

Arg

35

40

45

Tyr

Glu

Ser

Asn

His

Leu

Ile

Asp

Leu

Ser

Arg

Tyr

Ala

Ser

Lys

Ile

50

55

60

Asn

Ile

Gly

Ser

Lys

Val

Asn

Phe

Asp

Pro

Ile

Asp

Lys

Asn

Gin

Ile

65

70

75

80

Gin

Leu

Phe

Asn

Leu

Glu

Ser

Ser

Lys

Ile

Glu

Val

Ile

Leu

Lys

Asn

85

90

95

Ala

Ile

Val

Tyr

Asn

Ser

Met

Tyr

Glu

Asn

phe

Ser

Thr

Ser

Phe

Trp

100

105

110

Ile

Arg

Ile

Pro

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ser

Ile

Ser

Leu

Asn

Asn

Glu

Tyr

115

120

125

Thr

Ile

Ile

Asn

Cys

Met

Glu

Asn

Asn

Ser

Gly

Trp

Lys

Val

Ser

Leu

130

135

140

Asn

Tyr

Gly

Glu

Ile

Ile

Trp

Thr

Leu

Gin

Asp

Thr

Gin

Glu

Ile

Lys

145

150

155

160

Gin

Arg

Val

Val

Phe

Lys

Tyr

Ser

Gin

Met

Ile

Asn

Ile

Ser

Asp

Tyr

165

170

175

Ile

Asn

Arg

Trp

Ile

Phe

Val

Thr

Ile

Thr

Asn

Asn

Arg

Leu

Asn

Asn

180

185

190

Ser

Lys

Ile

Tyr

Ile

Asn

Gly

Arg

Leu

Ile

Asp

Gin

Lys

Pro

Ile

Ser

195

200

205

Asn

Leu

Gly

Asn

Ile

His

Ala

Ser

Asn

Asn

Ile

Met

Phe

Lys

Leu

Asp

210

215

220

Gly

Cys

Arg

Asp

Thr

His

Arg

Tyr

Ile

Trp

Ile

Lys

Tyr

Phe

Asn

Leu

225

230

235

240

Phe

Asp

Lys

Glu

Leu

Asn

Glu

Lys

Glu

Ile

Lys

Asp

Leu

Tyr

Asp

Asn

245

250

2S5

Gin

Ser

Asn

Ser

Gly

Ile

Leu

Lys

Asp

Phe

Trp

Gly

Asp

Tyr

Leu

Gin

250

265

270

Tyr

Asp

Lys

Pro

Tyr

Tyr

Met

Leu

Asn

Leu

Tyr

Asp

Pro

Asn

Lys

Tyr

275

280

285

Val

Asp

Val

Asn

Asn

Val

Gly

Ile

Arg

Gly

Tyr

Met

Tyr

Leu

Lys

Gly

290

295

300

Pro

Arg

Gly

Ser

Val

Met

Thr

Thr

Asn

Ile

Tyr

Leu

Asn

Ser

Ser

Leu

305

310

315

320

Tyr

Arg

Gly

Thr

Lys

Phe

Ile

Ile

Lys

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gly

Asn

Lys

325

330

335

Asp

Asn

Ile

Val

Arg

Asn

Asn

Asp

Arg

Val

Tyr

Ile

Asn

Val

Val

val

340

345

350

Lys

Asn

Lys

Glu

Tyr

Arg

Leu

Ala

Thr

Asn

Ala

Ser

Gin

Ala

Gly

Val

355

360

365

-241

Glu Lys

Ile

Leu Ser Ala

Leu Glu Ile 375

Pro

Asp

Val Gly Asn Leu Ser 300

370

Gin

Val

Val

Val

Met

Lvs

Ser

Lys

Asn

Asp

Gin

Gly

Ile

Thr

Asn

Lys

305

390

395

400

Cys

Lys

Met

Asn

Leu

Gin

Asp

Asn

Asn

Gly

Asn

Asp

Ile

Gly

Phe

Ile

405

410

415

Gly

Phe

His

Gin

Phe

Asn

Asn

Ile

Ala

Lys

Leu

Val

Ala

Ser

Asn

Trp

420

425

430

Tyr

Asn

Arg

Gin

Ile

Glu

Arg

Ser

Ser

Arg

Thr

Leu

Gly

Cys

Ser

Trp

435

440

445

Glu

Phe

Ile

Pro

Val

Asp

Asp

Gly

Trp

Gly

Glu

Arg

Pro

Leu

450

455

460

(2)

INFORMACE PRO SEQ ID NO:27

(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3891 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) RYS:

(A) (B)

NÁZEV/KLÍČ:

CDS 3888

POLOHA:

1. .

(xi) POPIS SEKVENCE:

SEQ

ID ]

NO:27:

ATG

CAA

TTT

GTT

AAT

AAA

CAA

TTT

AAT

TAT

AAA

GAT

CCT

GTA

AAT

GGT

48

Met

Gin

Phe

Val

Asn

Lys

Gin

Phe

Asn

Tyr

Lys

Asp

Pro

Val

Asn

Gly

1

5

10

15

GTT

GAT

ATT

GCT

TAT

ATA

AAA

ATT

CCA

AAT

GTA

GGA

CAA

ATG

CAA

CCA

96

Val

Asp

Ile

Ala

Tyr

Ile

Lys

Ile

Pro

Asn

Val

Gly

Gin

Met

Gin

Pro

20

25

30

GTA

AAA

GCT

TTT

AAA

ATT

CAT

AAT

AAA

ATA

TGG

GTT

ATT

CCA

GAA

AGA

144

Val

Lys

Ala

Phe

Lys

Ile

His

Asn

Lys

Ile

Trp

Val

Ile

Pro

Glu

Arg

35

40

45

GAT

ACA

TTT

ACA

AAT

CCT

GAA

GAA

GGA

GAT

TTA

AAT

CCA

CCA

CCA

GAA

192

Asp

Thr

Phe

Thr

Asn

Pro

Glu

Glu

Gly

Asp

Leu

Asn

Pro

Pro

Pro

Glu

50

55

60

GCA

AAA

CAA

GTT

CCA

GTT

TCA

TAT

TAT

GAT

TCA

ACA

TAT

TTA

AGT

ACA

240

Ala

Lys

Gin

Val

Pro

Val

Ser

Tyr

Tyr

Asp

Ser

Thr

Tyr

Leu

Ser

Thr

6 5

70

75

80

GAT

AAT

GAA

AAA

GAT

AAT

TAT

TTA

AAG

GGA

GTT

ACA

AAA

TTA

TTT

GAG

280

Asp

Asn

Glu

Lys

Asp

Asn

Tyr

Leu

Lys

Gly

Val

Thr

Lys

Leu

Phe

Glu

85

90

95

AGA

ATT

TAT

TCA

ACT

GAT

CTT

GGA

AGA

ATG

TTG

TTA

ACA

TCA

ATA

GTA

336

Arg

Ile

Tyr

Ser

Thr

Asp

Leu

Gly

Arg

Met

Leu

Leu

Thr

Ser

Ile

Val

100 105 110

-242CZ 296806 B6

AGG GGA ATA CCA TTT

TGG GGT

GGA AGT ACA ATA GAT

ACA GAA Thr Glu 125

TTA AAA Leu Lys

384 Arg

Gly Ile 115

Pro

Phe

Trp

Gly

Gly Ser 120

Thr

Ile

Asp

GTT 432

ATT

GAT

ACT

AAT

TGT

ATT

AAT

GTG

ATA

CAA

CCA

GAT

GGT

AGT

TAT

Val

Ile 130

Asp

Thr

Asn

Cys

Ile 135

Asn

Val

Ile

Gin

Pro 140

Asp

Gly

Ser

Tyr

AGA 400

TCA

GAA

GAA

CTT

AAT

CTA

GTA

ATA

ATA

GGA

CCC

TCA

GCT

GAT

ATT

Arg 145

Ser

Glu

Glu

Leu

Asn 150

Leu

Val

Ile

Ile

Gly 155

Pro

Ser

Ala

Asp

Ile 160

ATA 528

CAG

TTT

GAA

TGT

AAA

AGC

TTT

GGA

CAT

GAA

GTT

TTG

AAT

CTT

ACG

Ile

Gin

Phe

Glu

Cys 165

Lys

Ser

Phe

Gly

His 170

Glu

val

Leu

Asn

Leu 175

Thr

CGA 576

AAT

GGT

TAT

GGC

TCT

ACT

CAA

TAC

ATT

AGA

TTT

AGC

CCA

GAT

TTT

Arg

Asn

Gly

Tyr 180

Gly

Ser

Thr

Gin

Tyr 185

Ile

Arg

Phe

Ser

Pro 190

Asp

Phe

ACA 624

TTT

GGT

TTT

GAG

GAG

TCA

CTT

GAA

GTT

GAT

ACA

AAT

CCT

CTT

TTA

Thr

Phe

Gly 195

Phe

Glu

Glu

Ser

Leu 200

Glu

val

Asp

Thr

Asn 205

Pro

Leu

Leu

GGT 672

GCA

GGC

AAA

TTT

GCT

ACA

GAT

CCA

GCA

GTA

ACA

TTA

GCA

CAT

GAA

Gly

Ala 210

Gly

Lys

Phe

Ala

Thr 215

Asp

Pro

Ala

Val

Thr 220

Leu

Ala

His

Glu

CTT 720

ATA

CAT

GCT

GGA

CAT

AGA

TTA

TAT

GGA

ATA

GCA

ATT

AAT

CCA

AAT

Leu 225

Ile

His

Ala

Gly

His 230

Arg

Leu

Tyr

Gly

Ile 235

Ala

Ile

Asn

Pro

Asn 240

AGG 768

GTT

TTT

AAA

GTA

AAT

ACT

AAT

GCC

TAT

TAT

GAA

ATG

AGT

GGG

TTA

Arg

Val

Phe

Lys

Val 245

Asn

Thr

Asn’

Ala

Tyr 250

Tyr

Glu

Met

Ser

Gly 2SS

Leu

GAA 816

GTA

AGC

TTT

GAG

GAA

CTT

AGA

ACA

TTT

GGG

GGA

CAT

GAT

GCA

AAG

Glu

Val

Ser

Phe 260

Glu

Glu

Leu

Arg

Thr 265

Phe

Gly Gly

His

Asp 270

Ala

Lys

TTT 864

ATA

GAT

AGT

TTA

CAG

GAA

AAC

GAA

TTT

CGT

CTA

TAT

TAT

TAT

AAT

Phe

Ile

Asp 275

Seř

Leu

Gin

Glu

Asn 280

Glu

Phe

Arg

Leu

Tyr 285

Tyr

Tyr

Asn

AAG 912

TTT

AAA

GAT

ATA

GCA

AGT

ACA

CTT

AAT

AAA

GCT

AAA

TCA

ATA

GTA

Lys

Phe 290

Lys

Asp

Ile

Ala

Ser 295

Thr

Leu

Asn

Lys

Ala 300

Lys

Ser

Ile

Val

GGT 960

ACT

ACT

GCT

TCA

TTA

CAG

TAT

ATG

AAA

AAT

GTT

TTT

AAA

GAG

AAA

Gly 305

Thr

Thr

Ala

Ser

Leu 310

Gin

Tyr

Met

Lys

Asn 315

Val

Phe

Lys

Glu

Lys 320

TAT

CTC

CTA

TCT

GAA

GAT

ACA

TCT

GGA

AAA

TTT

TCG

GTA

GAT

AAA

TTA

1008

Tyr Leu Leu šer Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325	330	335

-243CZ 296806 B6

ΆΛΑ TTT

GAT AAG TTA

TAC AAA

ATG Met

TTA ACA GAG ATT TAC ACA GAG GAT

1056

Leu 345

Thr

Glu

Ile

Tyr Thr 350

Glu

Asp

Lys Phe

Asp

Lys 340

Leu

Tyr

Lys

AAT TTT 11Ó4

GTT

AAG

TTT

TTT

AAA

GTA

CTT

AAC

AGA

AAA

ACA

TAT

TTG

AAT

Asn Phe

Val 355

Lys

Phe

Phe

Lys

Val 360

Leu

Asn

Arg

Lys

Thr 365

Tyr

Leu

Asn

TTT GAT 1152

AAA

GCC

GTA

TTT

AAG

ATA

AAT

ATA

GTA

CCT

AAG

GTA

AAT

TAC

Phe Asp 370

Lys

Ala

Val

Phe

Lys 375

Ile

Asn

Ile

Val

Pro 380

Lys

Val

Asn

Tyr

ACA ATA 1200

TAT

GAT

GGA

TTT

AAT

TTA

AGA

AAT

ACA

AAT

TTA

GCA

GCA

AAC

Thr Ile 3B5

Tyr

Asp

Gly

Phe 390

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr 3 95

Asn

Leu

Ala

Ala

Asn 400

TTT AAT 1248

GGT

CAA

AAT

ACA

GAA

ATT

AAT

AAT

ATG

AAT

TTT

ACT

AAA

CTA

Phe Asn

Gly

Gin

Asn 405

Thr

Glu

Ile

Asn

Asn 410

Met

Asn

Phe

Thr

Lys 415

Leu

AAA AAT 1296

TTT

ACT

GGA

TTG

TTT

GAA

TTT

TAT

AAG

TTG

CTA

TGT

GTA

AGA

Lys Asn

Phe

Thr 420

Gly

Leu

Phe

Glu

Phe 425

Tyr

Lys

Leu

Leu

cys 430

Val

Arg

GGG ATA .1344

ATA

ACT

TCT

AAA

ACT

AAA

TCA

TTA

GAT

AAA

GGA

TAC

AAT

AAG

Gly Ile

Ile 435

Thr

Ser

Lys

Thr

Lys 440

Ser

Leu

Asp

Lys

Gly 445

Tyr

Asn

Lys

GCA TTA 1392

AAT

GAT

TTA

TGT

ATC

AAA

GTT

AAT

AAT

TGG

GAC

TTG

TTT

TTT

Ala Leu 450

Asn

Asp

Leu

Cys

Ile 455

Lys

Val

Asn

Asn

Trp 460

Asp

Leu

Phe

Phe

AGT CCT 1440

TCA

GAA

GAT

AAT

TTT

ACT

AAT

GAT

CTA

AAT

AAA

GGA

GAA

GAA

Ser Pro 465

Ser

Glu

Asp

ASn 470

Phe

Thr'

Asn

Asp

Leu 475

Asn

Lys

Gly

Glu

Glu 480

ATT ACA 1488

TCT

GAT

ACT

AAT

ATA

GAA

GCA

GCA

GAA

GAA

AAT

ATT

AGT

TTA

Ile Thr

Ser

Asp

Thr 485

Asn

Ile

Glu

Ala

Ala 490

Glu

Glu

Asn

Ile

Ser 495

Leu

GAT TTA 1536

ATA

CAA

CAA

TAT

TAT

TTA

ACC

TTT

AAT

TTT

GAT

AAT

GAA

CCT

Asp Leu

Ile

Gin 500

Gin

Tyr

Tyr

Leu

Thr 505

Phe··

Asn

Phe

Asp

Asn 510

Glu

Pro

GAA AAT 1584

ATT

TCA

ATA

GAA

AAT

CTT

TCA

AGT

GAC

ATT

ATA

GGC

CAA

TTA

Glu Asn

Ile 515

Ser

Ile

Glu

Asn

Leu 520

Ser

Ser

Asp

Ile

Ile 525

Gly

Gin

Leu

GAA CTT 1632

ATG

CCT

AAT

ATA

GAA

AGA

TTT

CCT

AAT

GGA

AAA

AAG

TAT

GAG

Glu Leu 530

Met

Pro

Asn

Ile

Glu 535

Arg

Phe

Pro

Asn

Gly 540

Lys

Lys

Tyr

Glu

TTA GAT

AAA

TAT

ACT

ATG

TTC

CAT

TAT

CTT

CGT

GCT

CAA

GAA

TTT

GAA

1680 Leu Asp 545

Lys

Tyr

Thr

Met 550

Phe

His

Tyr

Leu

Arg 555

Ala

Gin

Glu

Phe

Glu 560

-244CZ 296806 B6

CAT GGT AAA TCT AGG ATT GCT

TTA ACA AAT TCT GTT AAC GAA GCA TTA

1728 His Gly

Lys

Ser

Arg 565

Ile

Ala

Leu

Thr

Asn 570

Ser Val

Asn Glu Ala 575

Leu

TTA AAT 1776

CCT

AGT

CGT

GTT

TAT

ACA

TTT

TTT

TCT

TCA

GAC

TAT

GTA

AAG

Leu Asn

Pro

Ser 580

Arg

Val

Tyr

Thr

Phe 585

Phe

Ser

Ser

Asp

Tyr 590

Val

Lys

AAA GTT 1824

AAT

AAA

GCT

ACG

GAG

GCA

GCT

ATG

TTT

TTA

GGC

TGG

GTA

GAA

Lys val

Asn S95

Lys

Ala

Thr

Glu

Ala 600

Ala

Met

Phe

Leu

Gly 605

Trp

Val

Glu

CAA TTA 1872

GTA

TAT

GAT

TTT

ACC

GAT

GAA

ACT

AGC

GAA

GTA

AGT

ACT

ACG

Gin Leu 610

Val

Tyr

Asp

Phe

Thr 615

Asp

Glu

Thr

Ser

Glu 620

Val

Ser

Thr

Thr

GAT AAA 1920

ATT

GCG

GAT

ATA

ACT

ATA

ATT

ATT

CCA

TAT

ATA

GGA

CCT

GCT

Asp Lys 625

Ile

Ala

Asp

Ile 630

Thr

Ile

Ile

Ile

Pro 635

Tyr

Ile

Gly

Pro

Ala 640

TTA AAT 1968

ATA

GGT

AAT

ATG

TTA

TAT

AAA

GAT

GAT

TTT

GTA

GGT

GCT

TTA

Leu Asn

Ile

Gly

Asn 645

Met

Leu

Tyr

Lys

Asp 650

Asp

Phe

Val

Gly

Ala 655

Leu

ATA TTT 2016

TCA

GGA

GCT

GTT

ATT

CTG

TTA

GAA

TTT

ATA

CCA

GAG

ATT

GCA

Ile Phe

Ser

Gly 660

Ala

Val

Ile

Leu

Leu 665

Glu

Phe

Ile

Pro

Glu 670

Ile

Ala

ATA CCT 2064

GTA

TTA

GGT

ACT

TTT

GCA

CTT

GTA

TCA

TAT

ATT

GCG

AAT

AAG

Ile Pro

Val 675

Leu

Gly

Thr

Phe

Ala 680

Leu

Val

Ser

Tyr

Ile 685

Ala

Asn

Lys

GTT CTA 2112

ACC

GTT

CAA

ACA

ATA

GAT

AAT

GCT

TTA

AGT

AAA

AGA

AAT

GAA

Val Leu 690

Thr

Val

Gin

Thr

Ile 695

Asp Asn

Ala

Leu

Ser 700

Lys

Arg

Asn

Glu

AAA TGG 2160

GAT

GAG

GTC

TAT

AAA

TAT

ATA

GTA

ACA

AAT

TGG

TTA

GCA

AAG

Lys Trp 705

Asp

Glu

Val

Tyr 710

Lys

Tyr

Ile

Val

Thr 715

Asn

Trp

Leu

Ala

Lys 720

GTT AAT 2208

ACA

CAG

ATT

GAT

CTA

ATA

AGA

AAA

AAA

ATG

AAA

GAA

GCT

TTA

Val Asn

Thr

Gin

Ile 725

Asp

Leu

Ile

Arg

Lys 730

Lys

Met

Lys

Glu

Ala 735

Leu

GAÁ AAT 2256

CAA

GCA

GAA

GCA

ACA

AAG

GCT

ATA

ATA

AAC

TAT

CAG

TAT

AAT

Glu Asn

Gin

Ala 740

Glu

Ala

Thr

Lys

Ala 745

Ile

Ile

Asn

Tyr

Gin 750

Tyr

Asn

CAA TAT 2304

ACT

GAG

GAA

GAG

AAA

AAT

AAT

ATT

AAT

TTT

AAT

ATT

GAT

GAT

Gin Tyr

Thr 755

Glu

Glu

Glu

Lys

Asn 760

Asn

Ile

Asn

Phe

Asn 765

Ile

Asp

Asp

TTA AGT 2352

TCG

AAA

CTT

AAT

GAG

TCT

ATA

AAT

AAA

GCT

ATG

ATT

AAT

ATA

Leu Ser 770

Ser

Lys

Leu

Asn

G1U 775

Ser

Ile

Asn

Lys

Ala 780

Met

Ile

Asn

Ile

-245CZ 296806 B6

AAT AAA TTT

TTG AAT CAA TGC TCT GTT

TCA TAT TTA ATG AAT TCT ATG

2400 Asn Lys 785

Phe

Ser

Tyr Leu Met Asn Ser Met

Leu

Asn

Gin 790

Cvs

Ser

Val

795

800

ATC CCT 2448

TAT

GGT

GTT

AAA

CGG

TTA

GAA

GAT

TTT

GAT

GCT

AGT

CTT

AAA

Ile Pro

Tyr

Gly

Val 805

Lys

Arg

Leu

Glu

Asp 810

Phe

Asp

Ala

Ser

Leu 815

Lys

GAT GCA 2496

TTA

TTA

AAG

TAT

ATA

TAT

GAT

AAT

AGA

GGA

ACT

TTA

ATT

GGT

Asp Ala

Leu

Leu 820

Lys

Tyr

Ile

Tyr

Asp 825

Asn

Arg

Gly

Thr

Leu 830

Ile

Gly

CAA GTA 2544

GAT

AGA

TTA

AAA

GAT

AAA

GTT

AAT

AAT

ACA

CTT

AGT

ACA

GAT

Gin Val

Asp 835

Arg

Leu

Lys

Asp

Lys 840

Val

Asn

Asn

Thr

Leu 845

Ser

Thr

Asp

ATA CCT 2592

TTT

CAG

CTT

TCC

AAA

TAC

GTA

GAT

AAT

CAA

AGA

TTA

TTA

TCT

Ile Pro 850

Phe

Gin

Leu

Ser

Lys 855

Tyr

Val

Asp

Asn

Gin 860

Arg

Leu

Leu

Ser

ACA TTT 2640

ACT

GAA

TAT

ATT

AAG

AAT

ATT

ATT

AAT

ACT

TCT

ATA

TTG

AAT

Thr Phe 865

Thr

Glu

Tyr

Ile 870

Lys

Asn

Ile

Ile

Asn 875

Thr

Ser

Ile

Leu

Asn 880

TTA AGA 2688

TAT

GAA

AGT

AAT

CAT

TTA

ATA

GAC

TTA

TCT

AGG

TAT

GCA

TCA

Leu Arg

Tyr

Glu

Ser 885

Asn

His

Leu

Ile

Asp 890

Leu

Ser

Arg

Tyr

Ala B95

Ser

AAA ATA 273 6

AAT

ATT

GGT

AGT

AAA

GTA

AAT

TTT

GAT

CCA

ATA

GAT

AAA

AAT

Lys Ile

Asn

Ile 900

Gly

Ser

Lys

Val

Asn 905

Phe

Asp

Pro

Ile

Asp 910

Lys

Asn

CAA ATT 2784

CAA

TTA

TTT

AAT

TTA

GAA

AGT

AGT

AAA

ATT

GAG

GTA

ATT

TTA

Gin Ile

Gin 915

Leu

Phe

Asn

Leu

Glu 920

Ser

Ser

Lys

Ile

Glu 925

Val

Ile

Leu

AAA AAT 2832

GCT

ATT

GTA

TAT

AAT

AGT

ATG

TAT

GAA

AAT

TTT

AGT

ACT

AGC

Lys Asn 930

Ala

Ile

Val

Tyr

Asn 935

Ser

Met

Tyr

Glu

Asn 94 0

Phe

Ser

Thr

Ser

TTT TGG 2880

ATA

AGA

ATT

CCT

AAG

TAT

TTT

AAC

AGT

ATA

AGT

CTA

AAT

AAT

Phe Trp 945

Ile

Arg

Ile

Pro 950

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ser 955

ile

Ser

Leu

Asn

Asn 960

GAA TAT 2928

ACA

ATA

ATA

AAT

TGT

ATG

GAA

AAT

AAT

TCA

GGA

TGG

AAA

GTA

Glu Tyr

Thr

Ile

Ile 965

Asn

Cys

Met

Glu

Asn 970

Asn

Ser

Gly

Trp

Lys 975

Val

TCA CTT 2976

AAT

TAT

GGT

GAA

ATA

ATC

TGG

ACT

TTA

CAG

GAT

ACT

CAG

GAA

Ser Leu

Asn

Tyr 980

Gly

Glu

Ile

Ile

Trp 985

Thr

Leu

Gin

Asp

Thr 990

Gin

Glu

ATA AAA 3024

CAA

AGA

GTA

GTT

TTT

AAA

TAC

AGT

CAA

ATG

ATT

AAT

ATA

TCA

Ile Lys

Gin 995

Arg

Val

Val

Phe

Lys Tyr 1000

Ser

Gin

Met

Ile Asn 1005

Ile

Ser

-246CZ 296806 B6

GAT TAT ATA 3072 Asp Tyr Ile 1010

AAC Asn

AGA Arg

TGG Trp

ATT TTT Ile Phe 1015

GTA Val

ACT Thr

ATC Ile

ACT AAT Thr Asn 1020

AAT Asn

AGA Arg

TTA Leu

AAT AAC 3120

TCT

AAA

ATT

TAT

ATA

AAT

GGA

AGA

TTA

ATA

GAT

CAA

AAA

CCA

Asn Asn 1025

Ser

Lys

Ile

Tyr Ile 1030

Asn

Gly Arg

Leu Ile 1035

Asp

Gin

Lys

Pro 1040

ATT TCA 3168

AAT

TTA

GGT

AAT

ATT

CAT

GCT

AGT

AAT

AAT

ATA

ATG

TTT

AAA

Ile Ser

Asn

Leu

Gly Asn 1045

Ile

His

Ala

Ser Asn 1050

Asn

ile

Met

Phe Lys 1055

TTA GAT 3215

GGT

TGT

AGA

GAT

ACA

CAT

AGA

TAT

ATT

TGG

ATA

AAA

TAT

TTT

Leu Asp

Gly

Cys Arg 1060

Asp

Thr

His

Arg Tyr 1065

Ile

Trp

Ile

Lys Tyr 1070

Phe

AAT CTT 3264

TTT

GAT

AAG

GAA

TTA

AAT

GAA

AAA

GAA

ATC

AAA

GAT

TTA

TAT

Asn Leu

Phe Asp 1075

Lys

Glu

Leu

Asn Glu 1080

Lys

Glu

Ile

Lys Asp 1085

Leu

Tyr

GAT AAT 3312

CAA

TCA

AAT

TCA

GGT

ATT

TTA

AAA

GAC

TTT

TGG

GGT

GAT

TAT

Asp Asn Gin 1090

Ser

Asn

Ser

Gly Ile 1095

Leu

Lys

Asp

Phe Trp 1100

Gly

Asp

Tyr

TTA CAA 3360

TAT

GAT

AAA

CCA

TAC

TAT

ATG

TTA

AAT

TTA

TAT

GAT

CCA

AAT

Leu Gin 1105

Tyr

Asp

Lys

Pro Tyr Tyr 1110

Met

Leu

Asn Leu 1115

Tyr

Asp

Pro

Asn 1120

AAA TAT 3408

GTC

GAT

GTA

AAT

AAT

GTA

GGT

ATT

AGA

GGT

TAT

ATG

TAT

CTT

Lys Tyr

Val

Asp

Val Asn 1125

Asn

Val

Gly

Ile Arg 1130

Gly

Tyr

Met

Tyr Leu 1135

AAA GGG 3456

CCT

AGA

GGT

AGC

GTA

ATG

ACT

ACA

AAC

ATT

TAT

TTA

AAT

TCA

Lys Gly

Pro

Arg Gly 1140

Ser

val

Met

Thr Thr 1145

Asn

Ile

Tyr

Leu Asn 1150

Ser

AGT TTG 3504

TAT

AGG

GGG

ACA

AAA

TTT

ATT

ATA

AAA

AAA

TAT

GCT

TCT

GGA

Ser Leu

Tyr Arg 1155

Gly

Thr

Lys

Phe Ile 1160

Ile

Lys

Lys

Tyr Ala 1165

Ser

Gly

AAT AAA 3552

GAT

AAT

ATT

GTT

AGA

AAT

AAT

GAT

CGT

GTA

TAT

ATT

AAT

GTA

Asn Lys

Asp

Asn

Ile

Val

Atg

Asn

Asn

Asp

Arg

Val

Tyr

Ile

Asn

Val

1170 1175 1180

GTA GTT

AAA

AAT

AAA

GAA

TAT

AGG

TTA

GCT

ACT

AAT

GCA

TCA

CAG

GCA

3600 Val Val 11B5

Lys

Asn

Lys

Glu Tyr 1190

Arg

Leu

Ala

Thr Asn 1195

Ala

Ser

Gin

Ala 1200

GGC GTA

GAA

AAA

ATA

CTA

AGT

GCA

TTA

GAA

ATA

CCT

GAT

GTA

GGA

AAT

3648 Gly Val

Glu

Lys

Ile Leu 1205

Ser

Ala

Leu

Glu Ile 1210

Pro

Asp

Val

Gly Asn 1215

CTA AGT

CAA

GTA

GTA

GTA

ATG

AAG

TCA

AAA

AAT

GAT

CAA

GGA

ATA

ACA

3696 Leu Ser

Gin

Val Val 1220

Val

Met

Lys

Ser Lys 1225

Asn

Asp

Gin

Gly Ile 1230

Thr

-247CZ 296806 B6

AAT AAA

TGC

AAA

ATG

AAT

TTA

CAA

GAT

AAT

AAT

GGG

AAT

GAT

ATA

GGC

3744

Asn Lys

Cys

Lys

Met

Asn

Leu

Gin Asp

Asn

Asn

Gly

Asn

Asp

Ile

Gly

1235

1240

1245

TTT ATA

GGA

TTT

CAT

CAG

TTT

AAT

AAT

ATA

GCT

AAA

CTA

GTA

GCA

AGT

3792

Phe Ile

Gly

Phe

His

Gin

Phe

Asn

Asn

Ile

Ala

Lys

Leu

Val

Ala

Ser

1250

1255

1260

AAT TGG

TAT

AAT

AGA

CAA

ATA

GAA

AGA

TCT

AGT

AGG

ACT

TTG

GGT

TGC

3840

Asn Trp

Tyr

Asn

Arg

Gin

Ile

Glu

Arg

Ser

Ser

Arg

Thr

Leu

Gly

Cys

1265

1270

1275

1280

TCA TGG

GAA

TTT

ATT

CCT

GTA

GAT

GAT

GGA

TGG

GGA

GAA

AGG

CCA

CTG

388 8

Ser Trp

Glu

Phe

Ile

Pro

Val

Asp

Asp

Gly

Trp

Gly

Glu

Arg

Pro

Leu

1285 1290 1295

TAA

3891 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1296 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28:

Met Gin 1

Phe Val Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro

Val

Asn 15

Gly

5

10

Val

Asp

Ile

Ala

Tyr

Ile

Lys

Ile

Pro

Asn

Val

Gly

Gin

Met

Gin

Pro

20

25

30

Val

Lvs

Ala

Phe

Lys

Ile

His

Asn

Lys

Ile

Trp

Val

Ile

Pro

Glu

Arg

3 5

40

45

Asp

Thr

Phe

Thr

Asn

Pro

Glu

Glu

Gly

Asp

Leu

Asn

Pro

Pro

Pro

Glu

50

55

60

Ala

Lys

Gin

Val

Pro

Val

Ser

Tyr

Tyr

Asp

Ser

Thr

Tyr

Leu

Ser

Thr

65

70

75

80

Asp

Asn

Glu

Lys

Asp

Asn

Tyr

Leu

Lys

Gly

Val

Thr

Lys

Leu

Phe

Glu

B5

9Ó

95

Arg

Ile'

Tyr

Ser

Thr

Asp

Leu

Gly

Arg

Met

Leu

Leu

Thr

Ser

Ile

Val

100

105

110

Arg

Gly

Ile

Pro

Phe

Trp

Gly Gly

Ser

Thr

Ile

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

115

120

125

Val

Ile

Asp

Thr

Asn

Cys

Ile

Asn

Val

Ile

Gin

Pro

Asp

Gly

Ser

Tyr

130

135

140

Arg

Ser

Glu

Glu

Leu

Asn

Leu

Val

Ile

Ile

Gly

Pro

Ser

Ala

Asp

Ile

145

150

155

160

Ile

Gin

Phe

Glu

Cys

Lys

Ser

Phe

Gly

His

Glu

Val

Leu

Asn

Leu

Thr

165

170

175

Arg

Asn

Gly

Tyr

Gly

Ser

Thr

Gin

Tyr

Ile

Arg

Phe

Ser

Pro

Asp

Phe

180

18S

190

-248

Thr

Phe

Gly 195

Phe

Glu G1U

Ser

Leu 200

Glu Val

Asp

Thr

Asn 205

Pro

Leu

Leu

Gly

Ala

Gly

Lys

Phe

Ala

Thr

Asp

Pro

Ala

Val

Thr

Leu

Ala

His

Glu

210

215

220

Leu

Ile

His

Ala

Gly

His

Arg

Leu

Tyr

Gly

Ile

Ala

Ile

Asn

Pro

Asn

225

230

235

240

Arg

Val

Phe

Lys

Val

Asn

Thr

Asn

Ala

Tyr

Tyr

Glu

Met

Ser

Gly

Leu

245

250

255

Glu

Val

Ser

Phe

Glu

Glu

Leu

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

His

Asp

Ala

Lys

260

265

270

Phe

Ile

Asp

Ser

Leu

Gin

Glu

Asn

Glu

Phe

Arg

Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Asn

275

280

285

Lys

Phe

Lys

Asp

Ile

Ala

Ser

Thr

Leu

Asn

Lys

Ala

Lys

Ser

Ile

Val

290

295

300

Gly

Thr

Thr

Ala

Ser

Leu

Gin

Tyr

Met

Lys

Asn

Val

Phe

Lys

Glu

Lys

305

310

315

320

Tyr

Leu

Leu

Ser

Glu

Asp

Thr

Ser

Gly

Lys

Phe

Ser

Val

Asp

Lys

Leu

325

330

335

Lys

Phe

Asp

Lys

Leu

Tyr

Lys

Met

Leu

Thr

Glu

Ile

Tyr

Thr

Glu

Asp

340

345

350

Asn

Phe

Val

Lys

Phe

Phe

Lys

Val

Leu

Asn

Arg

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

355

360

365

Phe

Asp

Lys

Ala

Val

Phe

Lys

Ile

Asn

Ile

Val

Pro

Lys

Val

Asn

Tyr

370

375

380

Thr

Ile

Tyr

Asp

Gly

Phe

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Asn

Leu

Ala

Ala

Asn

385

390

395

400

Phe

Asn

Gly

Gin

Asn

Thr

Glu

Ile

Asn

Asn

Met

Asn

Phe

Thr

Lys

Leu

405

410

415

Lys

Asn

Phe

Thr

Gly

Leu

Phe

Glu

Phe

Tyr

Lys

Leu

Leu

Cys

Val

Arg

420

425

430

Gly

Ile

Ile

Thr

Ser

Lys

Thr

Lys

Ser

Leu

Asp

Lys

Gly

Tyr

Asn

Lys

435

440

445

Ala

Leu

Asn

Asp

Leu

Cys

Ile

Lys

Val

Asn

Asn

Trp

Asp

Leu

Phe

Phe

450

455

460

Ser

Pro

Ser

Glu

Asp

Asn

Phe

Thr

Asn

Asp

Leu

Asn

Lys

Gly

Glu

Glu

465

470

475

480

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Asn

Ile

Glu

Ala

Ala

Glu

Glu

Asn

Ile

Ser

Leu

485

490

49S

Asp

Leu

Ile

Gin

Gin

Tyr

Tyr

Leu

Thr

Phe

Asn

Phe

Asp

Asn

Glu

Pro

500

505

510

Glu

Asn

Ile

Ser

Ile

Glu

Asn

Leu

Ser

Ser

Asp

Ile

Ile

Gly

Gin

Leu

515

520

525

Glu

Leu

Met

Pro

Asn

Ile

Glu

Arg

Phe

Pro

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Glu

530

535

540

Leu

Asp

Lys

Tyr

Thr

Met

Phe

His

Tyr

Leu

Arg

Ala

Gin

Glu

Phe

Glu

545

550

555

560

His

Gly

Lys

Ser

Arg

Ile

Ala

Leu

Thr

Asn

Ser

Val

Asn

Glu

Ala

Leu

-249

565 570 575

Leu Asn Pro

Ser 580

Arg

Val

Tyr Thr

Phe Phe 585

Ser Ser

Asp

Tyr 590

Val

Lys

Lys

Val

Asn 595

Lys

Ala

Thr

Glu

Ala 600

Ala

Met

Phe

Leu

Gly 605

Trp

Val

Glu

Gin

Leu 610

Val

Tyr

Asp

Phe

Thr 615

Asp

Glu

Thr

Ser

Glu 620

Val

Ser

Thr

Thr

Asp 625

Lys

Ile

Ala

Asp

Ile 630

Thr

Ile

Ile

Ile

Pro 635

Tyr

Ile

Gly

Pro

Ala 640

Leu

Asn

Ile

Gly

Asn 645

Met

Leu

Tyr

Lys

Asp 650

Asp

Phe

Val

Gly

Ala 655

Leu

Ile

Phe

Ser

Gly 660

Ala

Val

Ile

Leu

Leu 665

Glu

Phe

Ile

Pro

Glu 670

Ile

Ala

Ile

Pro

Val 675

Leu

Gly

Thr

Phe

Ala 6 80

Leu

Val

Ser

Tyr

Ile 685

Ala

Asn

Lys

Val

Leu 690

Thr

Val

Gin

Thr

Ile 695

Asp

Asn

Ala

Leu

Ser 700

Lys

Arg

Asn

Glu

Lys 705

Trp

Asp

Glu

Val

Tyr 710

Lys

Tyr

Ile

Val

Thr 715

Asn

Trp

Leu

Ala

Lys 720

Val

Asn

Thr

Gin

Ile 725

Asp

Leu

Ile

Arg

Lys 730

Lys

Met

Lys

Glu

Ala 735

Leu

Glu

Asn

Gin

Ala 74 0

Glu

Ala

Thr

Lys

Ala 745

Ile

Ile

Asn

Tyr

Gin 750

Tyr

Asn

Gin

Tyr

Thr 755

Glu

Glu

Glu

Lys

Asn 760

Asn

Ile

Asn

Phe

Asn 765

Ile

Asp

Asp

Leu

Ser 770

Ser

Lys

Leu

Asn

Glu 775

Ser

Ile

Asn

Lys

Ala 780

Met

Ile

Asn

Ile

Asn 785

Lys

Phe

Leu

Asn

Gin 790

Cys

Ser

Val

Ser

Tyr 795

Leu

Met

Asn

Ser

Met 800

Ile

Pro

Tyr

Gly

Val 805

Lys

Arg

Leu

Glu

Asp Bio

Phe

Asp

Ala

Ser

Leu 815

Lys

Asp

Ala

Leu

Leu 820

Lys

Tyr

Ile

Tyr

Asp 825

Asn

Arg

Gly

Thr

Leu 830

Ile

Gly

Gin

Val

Asp 835

Arg

Leu

Lys

Asp

Lys 840

Val

Asn

Asn

Thr

Leu 845

Ser

Thr

Asp

Ile

Pro 850

Phe

Gin

Leu

Ser

Lys 855

Tyr

Val

Asp

Asn

Gin 860

Arg

Leu

Leu

Ser

Thr 865

Phe

Thr

Glu

Tyr

Ile 870

Lys

Asn

Ile

Ile

Asn 875

Thr

Ser

Ile

Leu

Asn 680

Leu

Arg

Tyr

Glu

Ser 885

Asn

His

Leu

Ile

Asp 890

Leu

Ser

Arg

Tyr

Ala 8 95

Ser

Lys

Ile

Asn

Ile 900

Gly

Ser

Lys

Val

Asn 905

Phe

Asp

Pro

Ile

Asp 910

Lys

Asn

Gin

Ile

Gin 915

Leu

Phe

Asn

Leu

Glu 920

Ser

Ser

Lys

Ile

Glu 925

Val

Ile

Leu

Lys

Asn 930

Ala

Ile

Val

Tyr

Asn 935

Ser

Met

Tyr

Glu

Asn 940

Phe

Ser

Thr

Ser

-250CZ 296806 B6

Phe 945	Trp	Ile Arg Ile	Pro 950	Lys	Tyr Phe	Asn Ser 955	Ile	Ser	Leu	Asn	Asn 960
Glu	Tyr	Thr Ile Ile	Asn	Cys	Met Glu	Asn Asn	Ser	Gly	Trp	Lys	Val
		965				970				975
Ser	Leu	Asn Tyr Gly	Glu	Ile	Ile Trp	Thr Leu	Gin	Asp	Thr	Gin	Glu
		980			985				990
Ile	Lys	Gin Arg Val	Val	Phe	Lys Tyr	Ser Gin	Met	Ile	Asn	Ile	Ser
		995			1000			1005
Asp	Tyr	Ile Asn Arg	Trp	Ile	Phe Val	Thr Ile	Thr	Asn	Asn	Arg	Leu
	1010		1015		1020
Asn	Asn	Ser Lys Ile	Tyr	Ile	Asn Gly	Arg Leu	Ile	Asp	Gin	Lys	Pro
1025		1030		1035				104 0
Ile	Ser	Asn Leu Gly	Asn	Ile	His Ala	Ser Asn	Asn	Ile	Met	Phe	Lys
		1045			1050				1055
Leu	Asp	Gly Cys Arg	Asp	Thr	His Arg	Tyr Ile	Trp	Ile	Lys	Tyr	Phe
		1060			1065			107 0
Asn	Leu	Phe Asp Lys	Glu	Leu	Asn Glu	Lys Glu	Ile	Lys	Asp	Leu	Tyr
		1075			1080			1085
Asp	Asn	Gin Ser Asn	Ser	Gly	Ile Leu	Lys Asp	Phe	Trp	Gly	Asp	Tyr
	1090		1095		1100
Leu	Gin	Tyr Asp Lys	Pro	Tyr	Tyr Met	Leu Asn	Leu	Tyr	Asp	Pro	Asn
110 5		1110		1115				1120
Lys	Tyr	Val Asp Val	Asn	Asn	Val Gly	Ile Arg	Gly	Tyr	Met	Tyr	Leu
		1125			1130				1135
Lys	Gly	Pro Arg Gly	Ser	Val	Met Thr	Thr Asn	Ile	Tyr	Leu	Asn	Ser
		1140			1145			1150
Ser	Leu	Tyr Arg Gly	Thr	Lys	Phe Ile	Ile Lys	Lys	Tyr	Ala	Ser	Gly
		1155			1160			1165
Asn	Lys	Asp Asn Ile	Val	Arg	Asn Ásn	Asp Arg	val	Tyr	Ile	Asn	Val
	1170		1175		1180
Val	Val	Lys Asn Lys	Glu	Tyr	Arg Leu	Ala Thr	Asn	Ala	Ser	Gin	Ala
1185		1190		1195				1200
Gly	Val	Glu Lys Ile	Leu	Ser	Ala Leu	Glu Ile	Pro	Asp	Val	Gly	Asn
		1205			1210				1215
Leu	Ser	Gin Val Val	Val	Met.	Lys ser	Lys Asn	Asp	Gin	Gly	Ile	Thr
		1220			1225			1230
Asn	Lys	Cys Lys Met	Asn	Leu	Gin Asp	Asn. Asn	Gly	Asn	Asp	Ile	Gly
		1235			1240			1245
Phe	Ile	Gly Phe His	Gin	Phe	Asn Asn	Ile Ala	Lys	Leu	Val	Ala	Ser
	1250		1255		1260
Asn	Trp	Tyr Asn Arg	Gin	Ile	Glu Arg	Ser Ser	Arg	Thr	Leu	Gly	Cys
1265		1270		1275				1280
Ser	Trp	Glu Phe Ile	Pro	Val	Asp Asp	Gly Trp Gly Glu	Arg	Pro	Leu
		1285			1290				1295

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 812 aminokyselin

-251 CZ 296806 B6 (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:

Thr

Ser

Tyr

Lys

Ile

Ile

Asn

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

Asn

Asn

Asp

1

5

10

15

Gly

Val

Met

Gin

Leu

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asp

Gly

Phe

Glu

Tyr

20

25

30

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Gin

Asn

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

35

40

45

Val

Tyr

Gin

Ser

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

50

55

60

Asp

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Arg

Ile

Ile

Asn

Asn

Glu

65

70

75

80

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Asn

Asn

Ala

Ile

Ala

Ala

Val

Gly

Leu

Gin

85

90

95

Val

Ile

Asp

Asn

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Asp

Thr

Ala

Ile

Ile

100

10S

110

Ser

Lys

Gly

Trp

Gin

Thr

Val

Asn

Gly

Ser

Arg

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Thr

115

120

125

Asp

Thr

Ala

Ile

Ala

Phe

Asn

Gly

Tyr

Lys

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

His

130

135

140

Phe

Tyr

Phe

Asp

Ser

Asp

Cys

Val

Val

Lys

Ile

Gly

Val

Phe

Ser

Thr

145

150

155

160

Ser

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Tyr

Asn

Asn

Asn

165

170

175

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Val

Tyr

Gin

Ser

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

1B0

1B5

190

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Leu

195

200

205

Gin

Thr

Ile

Asp

Ser

Lys

Lys

Tyt

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala

Glu

210

215

220

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

225

230

235

240

Thr

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

245

250

255

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala

Ile

Ala

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

260

265

270

Ile

Ile

Asn

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

275

280

285

Ile

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

290

295

300

Asn

Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Leu

Tyr

Gin

Asn

305

310

315

320

G1U

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Ser

Asp

Ser

325

330

33S

-252CZ 296806 B6

Lys Ala Val Thr

Gly Trp

Arg

Ile

Ile 345

Asn Asn Lys

Lys

Tyr 350

Tyr

Phe

340

Asn

Pro

Asn 355

Asn

Ala

Ile

Ala

Ala 360

Ile

His

Leu

Cys

Thr 365

Ile

Asn

Asn

Asp

Lys 370

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Tyr 375

Asp

Gly

Ile

Leu

Gin 380

Asn

Gly

Tyr

Ile

Thr 385

Ile

Glu

Arg

Asn

Asn 390

Phe

Tyr

Phe

Asp

Ala 395

Asn

Asn

Glu

ser

Lys 400

Met

Val

Thr

Gly

Val 405

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn 410

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe 415

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr 420

His

Asn

Asn

Asn

Ile 425

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile 430

Val

Tyr

Gin

Asn

Lys 435

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn 440

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr 445

Phe

Asp

Asn

Asp

Ser 450

Lys

Ala

Val

Thr

Gly 455

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp 460

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr 465

Phe

Asn

Leu

Asn

Thr 470

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr 475

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile 480

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr 485

Tyr

Phe

Asn

Leu

Asn 490

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala 495

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr 500

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys 505

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr 510

Asn

Thr

Phe

Ile

Ala 515

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr 520

Ser

Ile

Asn

Gly

Lys 525

His

Phe

Tyr

Phe

Asn 530

Thr

Asp

Gly

Ile

Met S35

Gin

Ile

Gly

Val

Phe 540

Lys

Gly

Pro

Asn

Gly 54S

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala 550

Pro

Ala

Asn

Thr

Asp 555

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu 560

Gly

Gin

Ala

Ile

Leu 565

Tyr

Gin'

Asn

Lys

Phe 570

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly 575

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe 580

Gly

Ser

Asp

Ser

Lys 585

Ala

Val

Thr

Gly

Leu 590

Arg

Thr

Ile

Asp

Gly 595

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe 600

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala 605

Val

Ala

Val

Thr

Gly 610

Trp

Gin

Thr

Ile

Asn 615

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr 620

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr 625

Ser

Ile

Ala

Ser

Thr 630

Gly

Tyr

Thr

Ile

Ile 635

Ser

Gly

Lys

His

Phe 640

Tyr

Phe

Asn

Thr

ASp 645

Gly

Ile

Met

Gin

Ile 650

Gly

Val

Phe

Lys

Gly 655

Pro

Asp

Gly

Phe

Glu 660

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala 665

Asn

Thr

Asp

Ala

Asn 670

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin 675

Ala

Ile

Arg

Tyr

Gin 680

Asn

Arg

Phe

Leu

Tyr 685

Leu

His

Asp

Asn

Ile 690

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Asn 695

Asn

Ser

Lys

Ala

Ala 700

Thr

Gly

Trp

Val

Thr

Ile

Asp

Gly

Asn

Arg

Tyr

Tyr

Phe

Glu

Pro

Asn

Thr

Ala

Met

Gly

-253 CZ 296806 B6

705					710
Ala	Asn	Gly	Tyr	Lys 725	Thr	Ile	Asp
Gly	Leu	Pro	Gin 740	Ile	Gly	Val	Phe
Phe	Ala	Pro 755	Ala	Asn	Thr	Asp	Ala 760
Arg	Tyr 770	Gin	Asn	Arg	Phe	Leu 775	His
Gly 785	Asn	Asn	Ser	Lys	Ala 790	Val	Thr
val	Tyr	Tyr	Phe	Met 805	Pro	Asp	Thr

		715					720
Asn	Lys 730	Asn	Phe	Tyr	Phe	Arg 735	Asn
Lys 745	Gly	Ser	Asn	Gly	Phe 750	Glu	Tyr
Asn	Asn	Ile	Glu	Gly 765	Gin	Ala	Ile
Leu	Leu	Gly	Lys 780	Ile	Tyr	Tyr	Phe
Gly	Trp	Gin 795	Thr	Ile	Asn	Gly	Lys 800
Ala	Met BIO	Ala	Ala

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) (B) (C) (D)

DÉLKA; 609 aminokyselin TYP: aminokyselina ŘETĚZEC; neznámý

TOPOLOGIE:

lineární

(ii) TYP MOLEKULY

: protein

(xi) POPIS SEKVENCE:

SEQ

ID NO:30:

Thr

Ser

Glu

Glu

Asn

Lys

Val

Ser

Gin

Val

Lys

Ile

Arg

Phe

Val

Asn

1

5

10

15

Val

Phe

Lys

Asp

Lys

Thr

Leu

Ala

Asn

Lys

Leu

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

20

25

30

Asp

Lys

Gin

Asp

Val

Pro

Val

Ser

Glu

Ile

Ile

Leu

Ser

Phe

Thr

Pro

35

40

45

Ser

Tvr

Tyr

Glu

Asp

Gly

Leu

Ile

Gly

Tyr

Asp

Leu

Gly

Leu

Val

Ser

50

55

60

Leu

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

Tyr

Ile

Asn

Asn

Phe

Gly

Met

Met

Vál

Ser

65

70

75

80

Gly

Leu

Ile

Tyr

Ile

Asn

Asp

Ser

Leu

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Pro

Pro

Val

85

90

95

Asn

Asn

Leu

Ile

Thr

Gly

Phe

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Asp

Lys

Tyr

Tyr

100

105

110

Phe

Asn

Pro

Ile

Asn

Gly

Gly

Ala

Ala

Ser

Ile

Gly

Glu

Thr

Ile

Ile

11S

120

125

Asp

Asp

Lys

Asn

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Gin

Ser

Gly

Val

Leu

Gin

Thr

Gly

130

135

14 0

Val

Phe

Ser

Thr

Glu

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

14 5

150

155

160

Leu

Asp

Glu

Asn

Leu

Glu

Gly

Glu

Ala

Ile

Asp

Phe

Thr

Gly

Lys

Leu

165

170

175

-254CZ 296806 B6

Ile

Ile

Asn Glu 180

Asn

Ile

Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr Arg

Gly

Ala

185

190

Val

Glu

Trp 195

Lys

Glu

Leu

Asp

Gly 200

Glu

Met

His

Tyr

Phe 205

Ser

Pro

Glu

Thr

Gly 210

Lys

Ala

Phe

Lys

Gly 215

Leu

Asn

Gin

Ile

Gly 220

Asp

Tyr

Lys

Tyr

Tyr 225

Phe

Asn

Ser

Asp

Gly 230

Val

Met

Gin

Lys

Gly 235

Phe

Val

Ser

Ile

Asn 240

Asp

Asn

Lys

His

Tyr 245

Phe

Asp

Asp

Ser

Gly 250

Val

Met

Lys

Val

Gly 255

Tyr

Thr

Glu

Ile

Asp 260

Gly

Lys

His

Phe

Tyr 265

Phe

Ala

Glu

Asn

Gly 270

Glu

Met

Gin

Ile

Gly 275

Val

Phe

Asn

Thr

Glu 280

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr 285

Phe

Ala

His

His

Asn 290

Glu

Asp

Leu

Gly

Asn 295

Glu

Glu

Gly

Glu

Glu 300

Ile

Ser

Tyr

Ser

Gly 305

Ile

Leu

Asn

Phe

Asn 310

Asn

Lys

Ile

Tyr

Tyr 315

Phe

Asp

Asp

Ser

Phe 320

Thr

Ala

Val

Val

Gly 325

Trp

Lys

Asp

Leu

Glu 330

Asp

Gly

Ser

Lys

Tyr 335

Tyr

Phe

Asp

Glu

Asp 340

Thr

Ala

Glu

Ala

Tyr 345

Ile

Gly

Leu

Ser

Leu 350

Ile

Asn

Asp

Gly

Gin 355

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Asp 360

Asp

Gly

Ile

Met

Gin 365

Val

Gly

Phe

Val

Thr 370

Ile

Asn

Asp

Lys

Val 375

Phe

Tyr

Phe

Ser

Asp 380

Ser

Gly

Ile

Ile

Glu 385

Ser

Gly

Val

Gin

Asn 390

Ile

Asp

Asp

Asn

Tyr 39S

Phe

Tyr

Ile

Asp

Asp 400

Ašn

Gly

Ile

Val

Gin 405

Ile

Gly'Val

Phe

Asp 410

Thr

Ser

Asp

Gly

Tyr 415

Lys

Tyr

Phe

Ala

Pro 420

Ala

Asn

Thr

Val

Asn 425

Asp

Asn

Ile

Tyr

Gly 430

Gin

Ala

Val

Glu

Tyr 435

Ser

Gly

Leu

Val

Arg 440

Val

Gly

Glu

Asp

Val 445

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Glu 450

Thr

Tyr

Thr

Ile

Glu 455

Thr

Gly

Trp

Ile

Tyr 460

ASp

Met

Glu

Asn

Glu 465

Ser

Asp

Lys

Tyr

Tyr 470

Phe

Asn

Pro

Glu

Thr 475

Lys

Lys

Ala

Cys

Lys 480

Gly

Ile

Asn

Leu

Ile 485

Asp

Asp

Ile

Lys

Tyr 490

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys 495

Gly

Ile

Met

Arg

Thr 500

Gly

Leu

Ile

Ser

Phe 505

Glu

Asn

Asn

Asn

Tyr 510

Tyr

Phe

-255 CZ 296806 B6

Asn Glu

Met Phe

530

Thr Pro

545

Asn Phe

Glu Lys

Val Ile

Leu

Asn Gly

515

Tyr Phe

Asp Gly

Glu Gly

Arg Tyr

580

Ile Asp

595

Glu Met

Gly Glu

Phe Lys

550

Glu Ser

565

Tyr Phe

Gly Glu

Gin Phe

520

Asp Gly

535

Tyr Phe

Ile Asn

Thr Asp

Glu Tyr

600

Gly Tyr

Val Met

Ala His

Tyr Thr

570

Glu Tyr

585

Tyr Phe

Ile Asn

Gin Ile

540

Gin Asn

555

Gly Trp

Ile Ala

Asp Pro

Ile Glu

525

Gly Val

Thr Leu

Leu Asp

Ala Thr

590

Asp Thr

605

Asp Lys

Phe Asn

Asp Glu

560

Leu Asp

575

Gly Ser

Ala Glň

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rozpustný fúzní protein, zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část toxinu typu A Clostridium botulinum, přičemž tato část toxinu typu A Clostridium botulinum zahrnuje část sekvence SEQ ID NO:28 o alespoň čtyřech aminokyselinách.
2. 2. Fúzní protein podle nároku 1, kde uvedená část sekvence toxinu typu A Clostridium botulinum zahrnuje SEQ ID NO: 23.
3. 3. Fúzní protein podle nároku 1, kde uvedená netoxinová sekvence zahrnuje polyhistidinový úsek.
4. 4. Fúzní protein podle nároku 3, který zahrnuje SEQ ID NO:26.
5. 5. Fúzní protein podle nároku 1, kde tento fúzní protein jev podstatě prostý endotoxinů.
6. 6. Bakteriální hostitelská buňka, obsahující rekombinantní expresní vektor, kde tento vektor kóduje fúzní protein podle nároku 1 a kde uvedená buňka je schopna exprimovat uvedený protein v této buňce jako rozpustný protein v hladině vyšší nebo rovné 0,75 % celkového buněčného proteinu.
7. 7. Hostitelská buňka podle nároku 6, kde uvedená část toxinu zahrnuje SEQ ID NO:23.
8. 8. Hostitelská buňka podle nároku 6, kde uvedený fúzní protein zahrnuje SEQ ID NO:26.
9. 9. Hostitelská buňka podle nároku 6, kde uvedená hostitelská buňka je schopna exprimovat uvedený protein v této buňce v hladině vyšší nebo rovné 20 % celkového buněčného proteinu.
10. 10. Fúzní protein podle nároku 1, kde část toxinu typu A Clostridium botulinum je napojena na polyhistidinový úsek.
11. 11. Způsob výroby rozpustného rekombinantního botulinového toxinu, vyznačující se tím, že se rekombinantně exprimují fúzní protein podle nároku 1 v aerobní hostitelské buňce a z aerobní hostitelské buňky se získá tento fúzní protein, přičemž toxin je v rozpustné formě.